Изобретение относится к получению и приготовлению желатинирующей коллагеновой композиции, которая непосредственно образует коллагеновый матрикс, а также к средству для его получения и к его применению, в частности, в рамках терапии.
Вследствие дегенеративных или травматических заболеваний суставов в теле человека или животного образуются дефекты хрящей в виде недостающего изношенного хрящевого материала. Поврежденный суставной хрящ имеет лишь ограниченную способность к саморегенерации. Для лечения требуется "заполнить" дефект хряща, чтобы заменить недостающий хрящевой материал. Это осуществляют путем инвазивных хирургических вмешательств. Как известно, дефекты хряща лечат путем пересадки в место дефекта хрящеобразующих, в частности аутологичных, клеток, как хондроциты, благодаря чему там должно инициироваться новое образование гиалинового хряща (трансплантаты хряща). Другие, в частности бесклеточные, способы используют определенные материалы и композиции материалов, которые могут служить искусственным хрящом (имплантат хряща). Известные имплантаты хряща образуют матрикс или каркас, в который могут переместиться хрящевые клетки окружающей неповрежденной хрящевой ткани, чтобы таким образом создать новую хрящевую структуру.
Из DE 10026789 A1 известен биоматрикс на основе коллагена и способ его получения. Биоматрикс получают из коллагена, выделенного из сухожилий крысиных хвостов. Для этого кислый после экстракции раствор коллагена нейтрализуют на холоде содержащим сыворотку буфером и, при необходимости в присутствии клеток, выливают в коллагеновый гель, который позднее желатинируют или сшивают, то есть отверждают, с получением коллагенсодержащего биоматрикса, который можно получить в виде готового бесклеточного имплантата коллагена или в виде содержащего клетки трансплантата коллагена с введенными хондроцитами.
В известных хирургических терапевтических способах хрящевые дефекты сначала препарируют, причем в известных случаях уже поврежденную хрящевую ткань намеренно удаляют. Образуется полость, которую затем нужно целенаправленно заполнить хрящевым имплантатом. Тесный контакт между хрящевым имплантатом и окружающей тканью позволяет внедрение хрящевых клеток и, тем самым, регенерацию хряща. Для этого известные имплантаты хряща, которые предоставляются готовыми, во время операции сначала должны дополнительно нарезаться надлежащим образом и подгоняться к препарированной полости. В частности, края имплантата хряща должны входить в контакт с краями полости таким образом, чтобы достичь устойчивого закрепления имплантата в суставном хряще. Подгонка готового имплантата к полости трудоемка и занимает много времени. Из-за этих трудоемких мер повышается риск загрязнений или осложнений во время операции. Далее, так как при низких оперативных затратах нельзя достичь полной подгонки, возникает риск послеоперационных осложнений или отсутствие успеха лечения. Поэтому прежние способы и средства лечения дефектов хрящей требуют усовершенствования.
Перед изобретением стоит задача разработать способ и устройство нового типа для получения матрикса на основе коллагена, который можно применять, в частности, для лечения дефектов хряща в организме человека или животного, и благодаря которому можно избежать недостатков, известных из уровня техники.
В качестве решения изобретение дает способ, которым из жидкого концентрированного раствора коллагена в комбинации с жидким буферным раствором получают непосредственно желатинирующую коллагеновую композицию. Ее предпочтительно можно вводить инъекцией непосредственно в полость дефекта хряща, где она непосредственно отверждается до коллагенового матрикса, который в таком случае образует хрящевой имплантат непосредственно in situ. При этом введение жидкой желатинирующей коллагеновой композиции в полость позволяет улучшить подгонку к форме полости, и еще жидкая коллагеновая композиция может войти в прямой контакт с краями полости и ее дном.
Согласно изобретению, способ включает по меньшей мере следующие стадии: подготовленные отдельно друг от друга концентрированный жидкий раствор коллагена и жидкий буферный раствор, которые, в частности, до этого хранились на холоде, термостатируют вместе при температуре от 20 до примерно 37°C, предпочтительно при примерно 30°C; предпочтительно сразу после этого термостатированный раствор коллагена и термостатированный буферный раствор смешивают, причем образуется способная желатинировать коллагеновая композиция, которая сразу же начинает желатинировать и может отвердиться до коллагенового биоматрикса.
Предусмотрено, в частности, что раствор коллагена и буферный раствор смешиваются только при применении, то есть, в частности, во время применения коллагеновой композиции, и только во время применения образуется желатинирующая коллагеновая композиция, сначала еще жидкая. Таким образом, согласно изобретению желатинирующая, но еще жидкая коллагеновая композиция применяется в момент образования, и может затем отвердиться в месте приложения.
Дается концентрированный раствор коллагена и буферный раствор, которые могут храниться не смешанными, но вместе в одной таре, а именно известным способом на холоде, в частности, при температурах от примерно 0 до примерно 4°C. В рамках способа по изобретению их термостатируют только незадолго до применения для получения коллагенового биоматрикса, например, при комнатной температуре, то есть, в частности, при 20°C или выше, или при температуре тела, то есть, в частности, при примерно 30°C, но не при денатурирующих температурах выше 37°C.
В частности, термостатирование раствора коллагена и буферного раствора проводится одновременно, а именно только непосредственно перед смешением и выдачей согласно изобретению. Оно может проводиться путем кратковременного выдерживания в термостате или, при необходимости, путем разогрева в руке. В частности, изобретение предусматривает не допускать температуру коллагеновой композиции выше 37°C.
Согласно изобретению, термостатированные растворы смешивают только к моменту или в момент применения в полости или в другом месте использования, чтобы образовать при этом коллагеновую композицию, которая сразу при введении начинает становиться студенистой и желатинирует, то есть отверждается, в месте применения.
Как раствор коллагена, так и буферный раствор перед применением или введением находятся в жидкой форме. Их низкая вязкость позволяет с выгодой их прямое смешение без дополнительных денатурирующих мер, таких как нагрев. Динамическая вязкость буферного раствора предпочтительно лежит в области вязкости воды или легко подвижных водных растворов, то есть примерно от 1 до 5 мПа⋅с. Динамическая вязкость концентрированного раствора коллагена предпочтительно составляет по порядку величины примерно от 101 до 105 мПа⋅с.
Раствор коллагена и буферный раствор сначала готовят отдельно друг от друга, предпочтительно в одном многокамерном шприце; они термостатируются внутри шприца по отдельности друг от друга и при выдаче из шприца смешиваются непосредственно. Предусмотрено, в частности, чтобы соединение и смешение раствора коллагена и буферного раствора осуществлялось путем выдавливания растворов из камер шприца и совместным проведением потоков раствора внутри шприца в сопряженное со шприцем смесительное устройство, причем свежеполученная коллагеновая композиция выходит из выхода смесительного устройства.
Изобретение позволяет получить коллагенсодержащий биоматрикс или коллагеновый имплантат с высокой долей не денатурированного, способного сшиваться коллагена природной структуры. Оказалось, что хрящевые клетки особенно хорошо пролиферируют в коллагеновом биоматриксе и при этом сами синтезируют коллаген с высокой скоростью, если в биоматриксе содержится высокая доля природного коллагена. Таким образом, изобретение избегает денатурирующих коллаген мер.
Изобретением предпочтительно предусматривается, что концентрированный раствор коллагена, полученный в связи со способом по изобретению, мог получаться непосредственно и без денатурирующих этапов из коллагенсодержащей ткани. Предпочтительной коллагенсодержащей тканью являются препарированные сухожилия крысиных хвостов. Коллаген извлекают из них предпочтительно с помощью экстракции кислотой, в частности уксусной кислотой. В качестве концентрированного раствора коллагена готовят кислый раствор коллагена, который имеет содержание коллагена (концентрацию коллагена) более 8 мг/мл, в частности, примерно 9 мг/мл и больше, или предпочтительно до примерно 16 мг/мл. Концентрированный раствор коллагена является кислым, прежде всего для того, чтобы получить его вязкость. При этом величина pH концентрированного раствора коллагена (в расчете на 21°C) составляет 6 или меньше, в частности от pH 5 до pH 3,5.
В одном частном варианте осуществления концентрированный раствор коллагена не содержит никаких дополнительных добавок или вспомогательных веществ, таких как клетки, составные части клеток, факторы роста, как цитокины, иммуностимуляторы, антибиотики или стабилизаторы, как полисахариды. В альтернативном варианте осуществления раствор коллагена содержит по меньшей мере одну такую добавку или вспомогательное вещество.
Чтобы получить желатинирующую коллагеновую композицию, концентрированный кислый раствор коллагена смешивают с нейтрализующим буфером. Нейтрализующий буфер в простейшем случае является известным раствором буферной соли, благодаря чему достигается величина pH коллагеновой композиции в нейтральном диапазоне, в частности, от pH 7,0 до pH 7,5 (в расчете на 21°C). Предпочтительно используется забуференный посредством HEPES солевой раствор с pH 8,3, который можно получить известным образом. Кроме того, буферный раствор служит, согласно изобретению, для разбавления концентрированного раствора коллагена, чтобы достичь конечной концентрации в желатинирующей коллагеновой композиции. Буферная композиция, в зависимости от предусмотренного соотношения в смеси с концентрированным раствором коллагена, предпочтительно имеет по меньшей мере вдвое большую концентрацию (при отношении 1:1), предпочтительно максимально в десять раз большую концентрацию (при 9:1).
В одном частном варианте осуществления буферный раствор не содержит никаких добавок или вспомогательных веществ, таких как клетки, составные части клеток, факторы роста, как цитокины, иммуностимуляторы или стабилизаторы, как полисахариды. В альтернативном варианте осуществления буферный раствор содержит клетки и при необходимости по меньшей мере одну дополнительную добавку или вспомогательное вещество, которые при смешении, согласно изобретению, с концентрированным раствором коллагена образуют содержащую клетки желатинирующую коллагеновую композицию, отверждающуюся с получением содержащего клетки коллагенового трансплантата. В одном частном варианте трансплантата клетки являются хондроцитами, главным образом аутологичными клетками и стволовыми клетками.
Предпочтительно предусматривается смешивать раствор коллагена и буферный раствор в объемном отношении от 1:1 до 9:1 (коллаген к буферному раствору). Предпочтительное отношение компонентов в смеси равно 4:1, то есть четыре части раствора коллагена на одну часть буферного раствора. Соответственно содержание коллагена с полученной коллагеновой композиции предпочтительно составляет по меньшей мере 6 мг/мл или больше, в частности от 6 до 12 мг/мл. В одном предпочтительном варианте его содержание в коллагеновой композиции составляет примерно 8 мг/мл.
Предпочтительно используется многокамерный шприц. В частности, он является известным одноразовым шприцем. В одном предпочтительном варианте шприц выполнен с известным статическим миксером в качестве смесительного устройства. Кроме того, специалисту известны и другие встроенные смесительные устройства, которые позволяют смешение разделенных растворов при применении. В альтернативных конструктивных формах такие другие конфигурации также являются объектом изобретения.
Если раствор коллагена и буферного раствора готовят в многокамерном шприце, он имеет, в частности, объемы камер от примерно 0,5 до примерно 5 мл. При этом, согласно изобретению, термостатирование растворов происходит внутри шприца, равно как и перемешивание раствора коллагена и буферного раствора при выдаче раствора из шприца. Предпочтительно предусматривается, что смесительное устройство шприца является известным статическим миксером. Специалисту известны альтернативные смесительные устройства, какие можно применять вместе со шприцами. Процесс выхода должен длиться, в зависимости от объема шприца и скорости выпуска, примерно от 1 до 60 секунд. Продолжительность перемешивания составляет, согласно изобретению, для каждой из выходящей из обеих камер бесконечно малой объемной доли предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 2 секунд.
Образующаяся композиция начинает сразу желатинировать, а именно в пределах 10 секунд после смешения, предпочтительно в пределах 5 секунд. Желатинирующая композиция еще является жидкой и, главное, еще текучей. Процесс желатинирования завершается, когда коллагеновая композиция отверждается до твердого биоматрикса. Отверждение до биоматрикса завершается предпочтительно в пределах 2-4 мин. Например, отверждение нанесенной в полость хрящевого дефекта коллагеновой композиции, сначала еще текучей, происходит только в самой полости, так что именно там непосредственно образуется подогнанный к полости имплантат хряща.
Благодаря тому, что способ согласно изобретению позволяет доставить полученную коллагеновую композицию к месту применения, например, полость, еще в жидкой форме, требуется меньший доступ к месту. Это благоприятствует операции в рамках артроскопического или эндоскопического доступа. Становится ненужной необходимая прежде доставка известного уже отвержденного упакованного хрящевого имплантата, благодаря эндоскопическому доступу к месту. Изобретение позволяет улучшенную атроскопическую, соответственно минимально инвазивную хирургию и, тем самым, снижает травмы, вызванные оперативным вмешательством.
В этой связи изобретение дает также готовый наполненный шприц, в частности, в форме одноразового шприца как набор, причем шприц содержит по меньшей мере две раздельные камеры, которые заканчиваются в сопряженное со шприцем впрыскивающее устройство, через которое содержимое каждой камеры может выдаваться, предпочтительно одновременно. Согласно изобретению, шприц отличается по меньшей мере тем, что по меньшей мере одна первая камера наполнена жидким концентрированным раствором коллагена, и по меньшей мере одна отделенная от нее вторая камера наполнена буферным раствором. Кроме того, в шприце можно предусмотреть такие дополнительные камеры, которые могут быть наполнены добавками или вспомогательными веществами. Шприц, наполненный по меньшей мере раствором коллагена согласно изобретению и буферным раствором, представляет собой набор, который может применяться для получения непосредственно желатинирующей коллагеновой композиции.
Наряду с этим, изобретение не ограничено применением способа в рамках наполненного многокамерного шприца. Возможны другие конструктивные формы, которые позволяют раздельное хранение концентрированного раствора коллагена и буферного раствора и последующее непосредственное смешение этих растворов для получения желатинирующей коллагеновой композиции. Одним альтернативным конструктивным решением является, в частности, многокамерная смесительная капсула одноразового применения, которая может применяться вместе с известным капсульным смесителем.
Объектом изобретения является также применение наполненного согласно изобретению шприца в области медицинской терапии. Одним частым применением является профилактическая или терапевтическая обработка дефектов хрящей в теле человека или животного. Такие дефекты хрящей встречаются, в частности, в суставах. Однако применение не ограничено дефектами суставных хрящей. Напротив, изобретение может применяться для лечения других дефектов хрящей и других тканей организма человека или животного.
Следующие медицинские применения способа по изобретению или шприца, наполненного согласно изобретению, относятся к терапии потери ткани в ядре после выпадения межпозвоночного диска и к лечению дефектов мягкой ткани в коже, дефектов костей и сухожилий, а также к устранению дефектов десен и к другим применениям в области челюстно-зубной медицины, а также к применению в пластической хирургии, особенно когда речь идет о заполнении дефектов или полостей.
Следующим объектом изобретения является также немедицинское применение способа по изобретению и шприца, наполненного согласно изобретению, для получения коллагенсодержащего биоматрикса для тканевой культуры. В одной частной форме осуществления способом по изобретению можно непосредственно получить биоматрикс для клеточной культуры. Это особенно хорошо подходит для получения сэндвичевых культур, где клетки или ткань должны переслаиваться с коллагенсодержащим биоматриксом, чтобы ввести в него клетки или ткань. Наряду с другими медицинскими, имеется также множество немедицинских возможностей применения, в которых требуется простое и надежное получение непосредственно желатинирующего коллагенового геля.
Изобретение подробнее описывается на фигурах и следующих примерах осуществления, которые, однако, не следует понимать как ограничительные.
Фиг.1 показывает схематическое изображение одного варианта осуществления наполненного согласно изобретению шприца как средства осуществления способа по изобретению.
В показанном варианте осуществления в едином сосуде образованы две раздельные параллельные цилиндрические камеры (11, 12) для приема раствора коллагена, с одной стороны, и буферного раствора, с другой стороны. Обе камеры заканчиваются с передней стороны в общий выпускной канал (18), содержащий статический миксер (16) с отражательными перегородками. Для опорожнения камер (11, 12) для введения и получения коллагеновой композиции предусмотрены спаренные поршни (14) шприца. Оба они образуют с задней стороны границы объема камер; известным образом можно путем приложения давления на поршень (14) одновременно выдавить содержимое из обеих камер (11, 12). В зависимости от отношения задаваемых конструкцией объемов камер (11, 12), при выдавливании происходит однородное перемешивание находящейся в камерах (11, 12) жидкости в этом объемном отношении. В показанной конструктивной форме отношение объемов камер (11, 12) равно 1:1.
Фиг.2 показывает результаты реологических исследований коллагеновых гелей: модуль упругости в зависимости от тестовой частоты (среднее значение и стандартное отклонение) для двухкамерных шприцев, предварительно термостатированных в разных условиях.
Пример 1: Получение непосредственно желатинирующей коллагеновой композиции
Для получения концентрированного раствора коллагена крысиные хвосты хранят при примерно минус 20°C и затем в течение нескольких минут поверхностно дезинфицируют в спирте крепостью около 70%. Кожу снимают и сухожилия разделяют на отдельные коллагеновые волокна. Коллагеновые волокна еще раз поверхностно дезинфицируют в спирте, затем промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), затем переводят в примерно 0,1%-ный (0,5 моль/л) раствор уксусной кислоты и там инкубируют. Коллагеновые волокна перемешивают в растворе уксусной кислоты в течение по меньшей мере 7 дней на холоде (при примерно 0-4°C). После отделения нерастворимых фракций коллагена в конце периода инкубации коллаген фильтруют и осаждают. Осадок промывают буферным раствором, замораживают и затем сушат вымораживанием. Высушенный вымораживанием коллаген определенно вводится в 0,1% уксусной кислоты, так что получают содержание коллагена от 9 до 16 мг/мл. Величина pH концентрированного раствора коллагена составляет примерно 4,0.
Для смешения четырех частей раствора коллагена с одной частью нейтрализующего буферного раствора (4:1) готовят в пять раз более концентрированный буферный раствор. В качестве пятикратно сконцентрированного буферного раствора для этого готовится, в частности, раствор 35,6 г NaCl в 937,5 мл сверхчистой воды с 62,5 мл 3 моль/л раствора HEPES. Перед применением pH буферного раствора устанавливают на значение 8,3 посредством NaOH.
Раствором коллагена и буферным раствором наполняют отдельные камеры многокамерного шприца, имеющие отношение объемов камер 1:4, и до последующего применения хранят на холоде, при примерно -15°C или ниже.
Для получения коллагенсодержащего биоматрикса многокамерный шприц на короткое время помещают в термостат или водяную баню, в результате чего буферный раствор и раствор коллагена нагреваются до температуры примерно 30°C. Для смешения обоих растворов их выдавливают из многокамерного шприца спаренными поршнями шприца. При этом оба раствора проводятся через соединенное с камерами смесительное устройство. Из шприца выходит перемешанная, непосредственно жалатинирующая коллагеновая композиция. Ее еще в жидкой форме вводят в форму для отливки. После выхода коллагеновая композиция заполняет форму для отливки полностью, и в течение нескольких минут она отверждается до твердого коллагенсодержащего биоматрикса. При содержании коллагена в полученной смешением коллагеновой композиции примерно 8 мг/мл и температуре примерно 30°C композиция полностью отверждается в пределах 2 мин.
Пример 2: Желатинирование коллагеновой композиции
Коллагеновые композиции, полученные согласно примеру 1, подвергали реологическим исследованиям. Двухкамерный шприц (например, фирма Medmix Systems, Швейцария) наливали раствор коллагена (10 мг/мл) и буферный раствор согласно примеру 1 (камера коллагена: 4 части раствора коллагена, 2 мл; камера буфера: 1 часть пятикратно концентрированного буфера, 0,5 мл) и замораживали.
После одночасового щадящего размораживания при комнатной температуре (20,5°C) следовало десятиминутное термостатирование шприцев в водяной бане при разных температурах в диапазоне от 20 до 40°C (таблица 1).
(температурный диапазон [°C])
Для смешения обоих компонентов после термостатирования заглушку шприца заменяли на переходник к смесителю и содержимое осторожно выдавали в лунку 12-луночного планшета с тканевой культурой, при этом две вышедшие первыми капли выбрасывали.
Полное желатинирование коллагеновой композиции (8 мг/мл коллагена), то есть отверждение до твердого геля, происходило за 15 мин при 20,5°C. Затем проводилась визуальная оценка консистенции (таблица 2).
Наконец, определяли модули упругости геля вне лунок частотным методом (Bohlin CVO R 150, фирма Malvern Instruments GmbH, Германия) (фиг.2).
(температурный диапазон [°C])
Из фиг.2 видно, что самые высокие установленные средние значения модуля упругости достигаются в температурном диапазоне от 20 до 30°C. Кривая коллагена, нагретого до 37°C, проходит несколько ниже, однако и эти гели при визуальном осмотре обнаруживают твердую консистенцию. При нагревании до 38°C гели были лишь полутвердыми и при осцилляционных измерениях имели очень низкие значения с большими колебаниями. Коллаген, нагретый до 40°C, больше не желатинирует.
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к наполненному шприцу для терапевтического введения жидкой желатинирующей коллагеновой композиции в полость хрящевого дефекта тела человека или животного, где шприц содержит по меньшей мере две отдельные камеры, где по меньшей мере одна первая камера заполнена жидким раствором природного коллагена с концентрацией от более 8 до 16 мг/мл, имеющего рН при 21°С, равный 6 или менее и, где по меньшей мере одна вторая камера заполнена нейтрализующим буферным раствором и, где по меньшей мере две отдельные камеры открываются в статический миксер, связанный с указанным шприцом, обеспечивая одновременное смешивание содержимого камер и выдачу из шприца, а также к способу профилактической или терапевтической обработки хрящевых дефектов суставов или органов тела человека или животного и к способу лечения дефектов мягкой ткани в коже, дефектов костей и сухожилий, дефектов десен с использованием указанного шприца. Группа изобретений обеспечивает контролируемое и мгновенное гелеобразование при дозировании коллагеновой композиции. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл., 2 ил.
1. Способ профилактической или терапевтической обработки хрящевых дефектов суставов или органов тела человека или животного, в котором жидкая желатинирующая коллагеновая композиция применяется в отношении полости хрящевого дефекта с помощью заполненного шприца, содержащего по меньшей мере две отдельные камеры, которые открываются в статический миксер, связанный со шприцом, через который содержимое каждой камеры выдавливается одновременно, отличающийся тем, что по меньшей мере одна первая камера заполнена жидким раствором природного коллагена, имеющим содержание коллагена от более 8 до 16 мг/мл, в котором рН, при расчете на 21°С, составляет 6 или менее и по меньшей мере одна отделенная от нее вторая камера наполнена нейтрализующим буферным раствором, в котором по меньшей мере две отдельные камеры открываются в статический миксер, связанный с указанным шприцом, обеспечивая одновременное смешивание содержимого камер и выдачу из шприца.
2. Способ лечения дефектов мягкой ткани в коже, дефектов костей и сухожилий, а также дефектов десен, с использованием жидкой желатинирующей коллагеновой композиции с помощью заполненного шприца, содержащего по меньшей мере две отдельные камеры, которые открываются в статический миксер, связанный со шприцом, через который содержимое каждой камеры выдавливается одновременно, отличающийся тем, что по меньшей мере одна первая камера заполнена жидким раствором природного коллагена, имеющим содержание коллагена от более 8 до 16 мг/мл, в котором рН, при расчете на 21°С, составляет 6 или менее, и по меньшей мере одна отделенная от нее вторая камера наполнена нейтрализующим буферным раствором, в котором по меньшей мере две отдельные камеры открываются в статический миксер, связанный с указанным шприцом, обеспечивая одновременное смешивание содержимого камер и выдачу из шприца.
3. Способ по п. 1, в котором полученная коллагеновая композиция, выдаваемая из шприца, имеет содержание коллагена 6 мг/мл или более.
4. Наполненный шприц для терапевтического введения жидкой желатинирующей коллагеновой композиции в полость хрящевого дефекта тела человека или животного, где шприц содержит по меньшей мере две отдельные камеры, где по меньшей мере одна первая камера заполнена жидким раствором природного коллагена с концентрацией от более 8 до 16 мг/мл, имеющего рН при 21°С, равный 6 или менее и, где по меньшей мере одна вторая камера заполнена нейтрализующим буферным раствором и, где по меньшей мере две отдельные камеры открываются в статический миксер, связанный с указанным шприцом, обеспечивая одновременное смешивание содержимого камер и выдачу из шприца.
5. Шприц по п. 4, где полученная коллагеновая композиция, выдаваемая из шприца, имеет содержание коллагена 6 мг/мл или более.
| EP 1221937 B1, 15.12.2004 | |||
| US 2009254104 A1, 08.10.2009 | |||
| US 20030211793 A1, 13.11.2003. |
