СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОСЕНСОРНОЙ ПОТЕРИ СЛУХА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2017 года по МПК A61K38/18 A61P27/16 

Группа изобретений относится к биохимии, а именно к области контроля экспрессии генов, и может быть использована в отоларингологии в качестве препаратов для лечения нейросенсорной потери слуха (глухоты и тугоухости различных стадий).

Для лечения нейросенсорной тугоухости известно применение нейротропных комплексов мильгамма и мильгамма композитум, содержащих комбинацию синергично действующих нейротропных витаминов B1, В6 и В12 («Эффективная фармакотерапия. Пульмонология и оториноларингология», 2011, №4, стр. 2-6).

Улучшение слуха при лечении данными препаратами объясняется стимулированием естественного механизма восстановления нервных тканей, в частности спирального ганглия, однако восстановления волосковых клеток ушной улитки данные препараты не обеспечивают.

Известно использование нейротрофического фактора линии глиальных клеток (GDNF) в составе фармацевтической композиции для профилактики заболеваний внутреннего уха и/или лечения волосковых клеток и клеток спирального ганглия. Данный белковый продукт GDNF можно вводить во внутреннее ухо посредством операции или через кохлеарный имплантат. Помимо этого данный продукт также может представлять собой ушные капли, масло для втирания или лекарства для перорального приема, например таблетки или суспензию (IL 121790 А, A61K 38/18, 14.08.2002).

Сущность описанного изобретения состоит в том, что волосковые клетки внутреннего уха и слуховые нейроны в присутствии GDNF способны сопротивляться воздействию таких ототоксичных веществ, как цисплатин и неомицин, однако остается неизвестным, возможны ли в его присутствии также восстановление и пролиферация поврежденных волосковых клеток. Кроме того, описанные в патенте опыты были проведены непосредственно с извлеченными клетками убитых подопытных животных, в связи с чем нет вещественного подтверждения, что данный препарат в виде лекарства для внутреннего или наружного применения может быть эффективен.

Известен способ лечения нейросенсорной тугоухости глюкокортикостероидами на фоне сосудистой терапии, при котором в случае внезапного возникновения нейросенсорных нарушений глюкокортикостероиды, например преднизолон, назначают укороченным курсом в течение 6-8 суток, начиная с ударной дозы с постепенным ее уменьшением (RU 2188642 С1, A61K 31/573, 10.09.2002).

Описанная схема лечения может рассматриваться как патогенетическая терапия, оказывающая сильное противовоспалительное действие, при этом она не способна ни устранить причины заболевания, ни восстановить поврежденные волосковые клетки. Незначительный эффект действительного восстановления волосковых клеток, а не снятия симптома потери слуха, может наблюдаться лишь при оперативном вмешательстве и введении глюкокортикостероидов непосредственно во внутреннее или хотя бы в среднее ухо.

Известно применение винпоцетина (кавинтона), пентоксифиллина, церебролизина, пирацетама (ноотропила) для комплексного лечения нейросенсорной тугоухости (http://otolaryngologist.ru/530, 29.05.2014).

Однако положительный эффект при лечении данными препаратами заключается в улучшении кровоснабжения внутреннего уха, при этом устраняются лишь симптомы заболевания.

Известен способ генерации дифференцированных волосковых клеток внутреннего уха, включающий достаточную для роста указанных клеток инактивацию или снижение экспрессии гена Rb. С этой целью было предложено использовать Rb-связывающие молекулы, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, RNAi ми-РНК (двухцепочечные РНК-вирусы), внутриклеточные антитела, аденовирусы Е1А или SV40 Т-антигена. Также с этой целью было предложено использовать активаторы циклин-зависимых киназ, фосфорилирующих белок pRb, либо ингибиторы ингибиторов циклин-зависимых киназ, например, гистон ацетилтрансферазу (HAT). Молекула ми-РНК может быть основана на матрице плазмида (US 2006024278 A1, A61K 48/00, 02.02.2006).

Данный способ предусматривает непосредственную инактивацию белка ретинобластомы с помощью труднодоступных соединений. Некоторые из них могут принести организму непоправимый вред. Так, например, известно, что белок аденовируса Е1А стимулирует апоптоз. Наряду с инактивацией белка ретинобластомы, который предупреждает возникновение рака, существует большая вероятность, что ускоренный апоптоз в данных условиях может привести к быстрому росту злокачественной опухоли сетчатки глаза - ретинобластомы, причем в такой степени, что прием любых противоопухолевых препаратов может оказаться бесполезным. Использование гистона ацетилтрансферазы (HAT), участвующей в активации транскрипции ДНК, может привести к сверхэкспрессии некоторых генов.

Наиболее близким аналогом является средство для лечения нейросенсорной потери слуха, представляющее собой белок Shh в смеси с ингибитором Shh-циклопамином. Данное средство применяли в способе инактивации Rb1, описанном в /Na Lu, Yan Chen "Sonic hedgehog initiates cochlear hair cell regeneration through downregulation of retinoblastoma protein", Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 430, Issue 2, 11 January 2013: column 1, paragraph 3 on the page 701/, посредством его введения в колонию волосковых клеток. Проведенный опыт включал в себя следующие стадии. Вначале под анестезией вскрывали нейроэпителий ушной улитки крыс на 2-й постнатальный день, переносили сосудистую полоску, нейроэпителий и часть нервного волокна в чашку с питательной средой, добавляли неомицин в течение 24 часов для умерщвления волосковых клеток. Далее в течение следующих 5 дней добавляли поочередно вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog - белок Shh (5 нмоль, производитель "R&D Systems"), и циклопамин (2,5 мкмоль, производитель "Sigma-Aldrich"). Для определения степени пролиферации к среде добавляли бромдезоксиуридин (BrdU) до конечной концентрации 10 мкг/мл. Опыт показал, что данный способ провоцирует пролиферацию волосковых клеток.

Согласно проведенному опыту, можно предположить, что лечение с помощью белка Shh (5 нмоль, производитель "R&D Systems") и циклопамина (2,5 мкмоль, производитель "Sigma-Aldrich") возможно только оперативным методом, поскольку не показано воздействие данного лекарства на волосковые клетки, например, при приеме внутрь. Кроме того, инактивацию Rb1 в прототипе проводят с помощью добавления белка Shh фирмы "R&D Systems", который является труднодоступным. Использование циклопамина может повлечь серьезные нарушения. Данное соединение нарушает эмбриональное развитие плода и приводит к циклопии. Помимо этого оно может ингибировать рост одновременно и базальноклеточной карциномы на коже и медуллабластомы в головном мозге. Отсутствие на данный момент возможности устранить эти недостатки не позволяют использовать средство-прототип для лечения нейросенсорной потери слуха.

Таким образом, проанализировав известный уровень техники, можно сделать вывод, что, несмотря на актуальность проблемы нейросенсорной потери слуха, связанной с повреждением или отмиранием волосковых клеток, на текущий момент не существует эффективного средства для лечения этой болезни.

Задачей предложенной группы изобретений является разработка средств для лечения нейросенсорной потери слуха, не содержащих опасного для здоровья соединения циклопамина и состоящих из более доступных компонентов, нежели входящих в состав средств, непосредственно инактивирующих Rb (не через активацию клеточного сигнального пути Sonic hedgehog).

Технический результат предложенной группы изобретений заключается в обеспечении регенерации поврежденных волосковых клеток внутреннего уха, в том числе их пролиферации, без опасности возникновения в организме рака, в частности ретинобластомы, а также расширение методов применения средства для лечения нейросенсорной потери слуха.

Для достижения технического результата предложено средство для лечения нейросенсорной потери слуха, включающее вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog, при этом оно дополнительно содержит по меньшей мере один противоопухолевый агент, а вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog, представляет собой витронектин.

Вышеуказанное средство может дополнительно содержать по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы: винпоцетин, пентоксифиллин и пирацетам.

Вышеуказанное средство может дополнительно содержать ламинин.

Вышеуказанное средство может дополнительно содержать пальмитиновую кислоту.

Для достижения технического результата также предложено средство для лечения нейросенсорной потери слуха, включающее вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog, при этом оно дополнительно содержит по меньшей мере один противоопухолевый агент, по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы: винпоцетин, пентоксифиллин и пирацетам, а вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog, представляет собой смесь витронектина и по меньшей мере одного глюкокортикоида.

Вышеуказанное средство может дополнительно содержать пальмитиновую кислоту.

Вышеуказанное средство может дополнительно содержать ламинин.

Большинство проблем со слухом возникает из-за повреждения структур внутреннего уха. Так, сенсоневральная потеря слуха занимает 90% от всех случаев тугоухости и глухоты.

Типичными причинами этого являются: чрезмерное воздействие шума, токсическое действие лекарств, аллергические реакции, процесс естественного старения организма и травмы головы. Происходит повреждение тонких волосковых клеток, выполняющих функцию преобразования механической энергии в электрическую и передающих сигналы к слуховому нерву. До сих пор считалось, что в большинстве случаев такие нарушения являются необратимыми из-за отсутствия у волосковых клеток млекопитающих функции восстановления, и единственное, с помощью чего удавалось компенсировать сенсоневральную глухоту, так это использованием слуховых аппаратов.

Нейросенсорное нарушение слуха происходит из-за потери чувствительности спирального органа улитки внутреннего уха или нарушений в работе слуховых нервов. Такие нарушения могут приводить к тугоухости всех степеней - от легкой до тяжелой и даже к полной глухоте.

В большинстве случаев нейросенсорная потеря слуха у людей вызвана аномалиями волосковых клеток в кортиевом органе улитки. Иногда встречается нейросенсорная потеря слуха, вызванная нарушениями в VIII-м черепно-мозговом нерве (преддверно-улитковом) или в отделах мозга, отвечающих за слух. В крайне редких случаях такого типа нарушений слуха страдают только слуховые центры мозга (центральное нарушение слуха), в случае чего больной слышит звуки с обычной громкостью, но их качество настолько плохое, что он не в состоянии разобрать речь.

Аномалии волосковых клеток могут быть врожденными или приобретенными при жизни самим индивидуумом. Они могут представлять собой как генетические аномалии, так и травмы от интенсивного шума и поражения вследствие инфекционных заболеваний.

Известным является факт, что в то время как у млекопитающих нейросенсорная потеря слуха является неизлечимым заболеванием, клетки внутреннего уха у рыб, птиц и рептилий имеют возможность самовосстановления. Это позволило предположить наличие у млекопитающих определенного гена, являющегося молекулярным переключателем, который блокирует восстановление данных клеток и за счет этого параллельно выполняет некую другую функцию, необходимую для нормального функционирования организма.

Учеными из массачусетского университета был обнаружен ген, отвечающий за эту функцию. Ему дали название Rbl (Charles Q. Choi "Hope for Fixing Gene Defects", SCIENTIFIC AMERICAN, Volume 293, Number 6, December 2005, page 65). Ген Rb1 экспрессирует белок ретинобластомы (pRb), который предотвращает чрезмерный рост клеток путем ингибирования клеточного цикла до тех пор, пока клетки не будут готовы к делению. Когда клетка готова к делению, pRb фосфорилируется, становится неактивным и позволяет прогрессировать клеточному циклу.

На основании вышесказанного можно сделать вывод, что своевременная инактивация гена Rb1 может обеспечить восстановление волосковых клеток ушной улитки.

Белок ретинобластомы в организме фосфорилируется определенными циклин-зависимыми киназами и таким образом становится неактивным. Подавление Rb возможно за счет активации сигнального пути Sonic hedgehog (Shh), в ходе которого сам белок ретинобластомы фосфорилируется, а транскрипция соответствующего гена снижается (Na Lu, Yan Chen "Sonic hedgehog initiates cochlear hair cell regeneration through downregulation of retinoblastoma protein", Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 430, Issue 2, 11 January 2013: 6-7 lines of the abstract on the page 700; column 1, paragraph 2 on the page 701).

У млекопитающих ген Shh входит в группу генов семейства Hedgehogs (Hh) - Sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) и Desert hedgehog (Dhh). Секретируемые гликопротеины Hedgehogs действуют посредством трансмембранных белков Patched 1 (Ptc1) и Smoothened (Smo), чтобы активировать внутриклеточный путь передачи сигналов.

Исследователями научно-исследовательского центра нейробиологии в Испании - Института нейробиологии им. Сантьяго Рамон-и-Кахаля (Institute de Neurobiologia Ramon у Cajal) была впервые обнаружена взаимосвязь между активностью сигнального пути Shh и витронектином.

В статье /Martinez-Morales JR, Barbas JA, Marti E, Bovolenta P, Edgar D, Rodriguez-Tebar A. «Vitronectin is expressed in the ventral region of the neural tube and promotes the differentiation of motor neurons». Development. 1997 Dec; 124(24): pages 5139-5147/ была описана способность витронектина стимулировать дифференцировку двигательных нейронов в пробирке и в естественных условиях, было сделано заключение, что витронектин может действовать либо как нижележащий эффектор в сигнальном каскаде, вызванном Shh, либо как синэнергетический фактор, увеличивающий Shh-индуцированную дифференцировку двигательных нейронов.

В статье /Pons S, Marti Е. «Sonic hedgehog synergizes with the extracellular matrix protein vitronectin to induce spinal motor neuron differentiation». Development. 2000 Jan; 127(2): pages 333-342/ было показано, что дифференцировка двигательных нейронов усиливается за счет синергетического действия N-Shh и витронектина и что витронектин может быть необходим для доставки морфогена N-Shh к клеткам-мишеням - дифференцирующимся двигательным нейронам.

В статье /Pons S, Trejo JL, Martinez-Morales JR, Marti E. «Vitronectin regulates Sonic hedgehog activity during cerebellum development through CREB phosphorylation». Development. 2001 May; 128(9): pages 1481-1492/ приводились результаты исследования процесса развития мозжечка посредством фосфорилирования транскрипционного фактора CREB. Вместе с тем, как и в исследованиях дифференцировки двигательных нейронов, было выявлено взаимодействие между Shh и компонентами внеклеточного матрикса - гликопротеинами (в первую очередь витронектином), регулирующее последующие этапы развития гранулярных клеток - нейронов малого размера, встречающихся в гранулярном слое мозжечка. Таким образом, было установлено, что дифференцировка гранулярных клеток регулируется витронектин-индуцированным фосфорилированием CREB, критическое событие которого завершается Shh-опосредованной пролиферацией данных клеток и делает возможным осуществление программы дифференцировки клеток в данный тип.

Учеными кафедры клеточной биологии из Университета Вандербильта (США) во время исследований индуцирования двигательных нейронов посредством изменения активности сигнального пути Shh также было выявлено увеличение активности Shh под воздействием витронектина, облегчение транспортировки Shh к клеткам-мишеням (статья Litingtung Y, Chiang С.«Control of Shh activity and signaling in the neural tube». Developmental dynamics. 2000 Oct; 219(2): pages 143-154).

Относительно механизма активации сигнального пути Shh известно, что он может быть спровоцирован увеличением ядерной концентрации Gli (Gli2 и Gli3). Секретируемые гликопротеины Hh (Shh, Ihh и Dhh) действуют посредством трансмембранных белков Patched 1 (Ptc1) и Smoothened (Smo), чтобы активировать замысловатый внутриклеточный путь передачи сигналов. Hh связывает белок Ptcl с 12-ю трансмембранными доменами, что обусловливает базовую репрессию, которую Ptcl оказывает на белок Smo с 7-ю трансмембранными доменами, который является гомологом G-protein-coupled рецепторов. Внутри клетки мультимолекулярный комплекс, включающий Costal2 (Cos2), Fused (Fu) и suppressor of Fused (Su(Fu)), отвечает на активацию Smo таким образом, чтобы модифицировать активность белков Gli (Stecca В, Ruiz i Altaba A. «The therapeutic potential of modulators of the Hedgehog-Gli signaling pathway». J Biol. 2002 Nov 6; 1(2): pages 9).

Таким образом, можно предположить, что витронектин активирует сигнальный путь Shh посредством того, что в его присутствии количество транскрипционных факторов Gli увеличивается.

В процессе фибронолиза витронектин способен регулировать активацию плазминогена. Он имеет два участка связывания с ингибитором активатора плазминогена-1 (PAI-1). Главный из них расположен с N-конца - соматомедин В-подобный домен. С помощью него витронектин связывает и стабилизирует молекулу PAI-1 (Zhou A, Huntington JA, Pannu NS, Carrell RW, Read RJ «How vitronectin binds PAI-1 to modulate fibrinolysis and cell migration». Nat Struct Biol. 2003 Jul; 10(7): pages 541-544).

Вполне вероятно, аналогичным образом витронектин связывает некоторые гомеопротеины, репрессирующие Gli.

На основании вышеописанных известных исследований в отношении влияния витронектина на активацию сигнального пути Shh в двигательных нейронах и гранулярных клетках было выдвинуто предположение, что аналогичный эффект может проявляться и в отношении волосковых клеток.

Общеизвестным является факт, что, несмотря на то, что каждая клетка организма имеет один и тот же геном, все они представляют собой клетки различного типа и обладают индивидуальными особенностями, в частности выраженными той или иной реакцией на одни и те же условия и вещества.

С целью исследования реакции волосковых клеток внутреннего уха на витронектин, изучения факторов, которые могли бы служить причиной иного их поведения под воздействием витронектина, нежели поведение двигательных нейронов и гранулярных клеток, были исследованы морфологические изменения конкретно волосковых клеток под его воздействием. Так, электронная растровая и конфокальная микроскопии продемонстрировали восстановление, в частности пролиферацию, данного типа клеток.

Был проведен количественный анализ экспрессии генов методом высокопроизводительного параллельного секвенирования РНК (RNA-Seq) с использованием программы Scripture, который показал, что витронектин потенциирует активность гена Shh в культуре волосковых клеток ушной улитки серой крысы. Быстрая инактивация Rb1 при этом объясняется свойством витронектина диффундировать белок Shh и доставлять его к клеткам-мишеням, что является существенным преимуществом по сравнению с использованием в качестве инактивирующего Rb1 вещества в виде смеси белка Shh и ингибитора Shh циклопамина (прототипа), в отношении которого данное свойство обнаружено не было.

Описанные выше исследования позволяют утверждать, что активность гена Shh повышается в присутствии витронектина не только в двигательных нейронах и гранулярных клетках, но и волосковых клетках ушной улитки.

Таким образом, учитывая ранее описанные научные публикации Массачусетского технологического института и Научно-исследовательского института слуха г.Шанхай о возможности восстановления волосковых клеток ушной улитки за счет активации сигнального пути Sonic hedgehog (Shh), можно сделать вывод, что предложенные средства обеспечивают регенерацию волосковых клеток ушной улитки за счет активации указанного сигнального пути.

Фармакологически эффективные дозы витронектина зависят от степени нейросенсорной потери слуха, индивидуальных особенностей пациента (вид, возраст, масса и т.д.), лекарственной формы препарата (капли, крем, масло, бальзам, таблетки, раствор, суспензия, порошок) и способа его применения. Так, например, при оперативном лечении небольшого животного необходимые дозы могут составлять менее 0,001 г/мл клеточной среды, а при пероральном приеме средства пожилым человеком они должны быть на несколько порядков больше.

Витронектин является гликопротеином, в больших количествах присутствующим в животной сыворотке и в тромбах. Также он входит в состав внеклеточного матрикса многих тканей.

Раствор витронектина может быть выделен из сыворотки человека с использованием моноклональных антител.

Известен несложный способ получения витронектина из человеческой плазмы путем аффинной хроматографии с гепарином. Сыворотку получают из плазмы путем добавления кальция, а затем центрифугирования. Гепарин, связывающий активный витронектин, в сыворотке крови человека можно активировать с помощью мочевины. Активированный витронектин специфически связывается с гепарин-сефарозой в мочевине и элюирует в растворе 0,5 моль/л NaCl, содержащем 8 моль/л мочевины. В результате данной процедуры из 100 мл плазмы человека в течение 2-х суток возможно получить 3-6 мг чистого витронектина (Takemi Yatohgo, Masako Izumi at al. "Novel Purification of Vitronectin from Human Plasma by Heparin Affinity Chromatography", Cell structure and function, volume 13, pages 281-292, 1988).

Аналогичным образом возможно получать витронектин из бычьей сыворотки (И.Г. Швыкова, Т.А. Муранова «Протеолитическая специфичность плазмина по отношению к адгезионным белкам», Биоорганическая химия, том 26, №5, страница 353, колонка 1, абзац 3, 2000).

Для того чтобы потенцировать активность белка Shh, необходимо активировать его N-конец. Этого можно достигнуть с помощью пальмитиновой кислоты, которая посредством модификации N-конца потенцирует функцию белка Shh, при этом ограничивая его диффузию.

Однако ограничение диффузии белка Shh пальмитиновой кислотой компенсируется наличием витронектина, который в противоположность может диффундировать данный белок.

Поскольку пальмитиновая кислота может поступать в организм человека вместе с некоторыми продуктами питания (сливки, сметана, сливочное масло, сыр и т.д.), ее наличие в вариантах предложенного средства, предназначенных для применения внутрь, не обязательно.

Вместе с тем стоит отметить, что в отсутствии витронектина пальмитиновая кислота не способна воздействовать на волосковые клетки внутреннего уха по той причине, что модифицируя N-конец белка Shh, она ограничивает его диффузию, и таким образом белок не достигает клеток-мишеней (волосковых клеток). Кроме того, наличие витронектина обязательно, как упоминалось выше, из-за способности потенцировать активность гена Shh и провоцировать запуск сигнального пути Shh.

Также стоит отметить, что наряду с этим витронектина, присутствующего в крови, сильно недостаточно для запуска сигнального пути Shh, и, по всей вероятности, ввиду этого волосковые клетки не могут восстанавливаться только лишь под действием присутствующего в крови витронектина и поступающей в организм с продуктами питания пальмитиновой кислоты.

Исследования мышей с недостатком ядерного гормонального рецептора витамина D3 (VDR), а также эксплантатов мышиной кожи показали, что слабая экспрессия гена VDR приводит к увеличению экспрессии нескольких компонентов пути Hh, таких как Shh, Smo, Gli1, Gli2 и Ptch1.

Из /Медицинская иммунология, том 16, №6, страница 504, 1-ая колонка, 2-й абзац, 2014/ известно, что связанный VDR подавляет транскрипцию гена VDR по механизму отрицательной обратной связи.

Экспрессию VDR во всех тканях способны снижать глюкокортикоиды, основными представителями которых являются такие вещества, как фуроат флутиказона, мометазон, фуроат мометазона, метилпреднизолона ацепонат, триамцинолон, гидрокортизон, бетаметазон, будесонид, алклометазон, беклометазон, дексаметазон, метилпреднизолон, метилпреднизолона ацепонат, флунизолид, клобетазол, гидрокортизон, кортизон, флуметазон, преднизолон, флуоцинолона ацетонид.

Таким образом, глюкокортикоиды в смеси с витронектином могут образовывать вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog в большей степени, нежели отдельно витронектин, что повысит эффективность средства. Однако применение отдельно глюкокортикоидов не дает видимого лечебного результата в отношении волосковых клеток и представляет собой скорее патогенетическую терапию, оказывающую сильное противовоспалительное действие. Это может быть связано с недостаточной изученностью условий для повышения степени инактивации Rb1 глюкокортикоидами посредством VDR-механизма, отсутствием их диффузии в поврежденные волосковые клетки и также недостаточной диффузией белка Shh к клеткам-мишеням. При этом незначительный эффект действительного восстановления волосковых клеток, а не только снятие симптома потери слуха, наблюдается лишь при оперативном вмешательстве и введении глюкокортикоидов непосредственно во внутреннее или хотя бы в среднее ухо. Эти обстоятельства на данный момент не позволяют использовать глюкокортикоиды как самостоятельное действенное средство лечения нейросенсорной потери слуха.

Эффективность предложенного средства также повышает наличие пальмитиновой кислоты.

Для дальнейшего увеличения его эффективности посредством стимулирования активации сигнального пути Shh в волосковых клетках необходимо улучшить микроциркуляцию в области ушной улитки, что можно обеспечить наличием в лекарстве таких доступных и эффективных компонентов, как винпоцетин, пентоксифиллин и пирацетам.

Осуществляемая предложенным средством через активацию сигнального пути Shh инактивация Rb, который предупреждает возникновение рака, создает вероятность возникновения злокачественной опухоли, в частности ретинобластомы. Во избежание этого в состав средства необходимо ввести по меньшей мере один противоопухолевый агент (алкилирующие антинеопластические препараты, антиметаболиты, алкалоиды растительного происхождения, противоопухолевые антибиотики, соединения платины - цисплатин, оксоплатин, карбоплатин, оксалиплатин, циклоплатам, противоопухолевые гормональные препараты). Можно вводить такие соединения, как мелфалан, хлорамбуцил, бендамустин, проспидин, спиробромин, манномустин, преднимустин, эстрамустин, новэмбихин, пафенцил, лофенал, циклофосфамид, ифосфамид, мафосфамид, трофосфамид, азацитидин, капецитабин, кармофур, цитарабин, децитабин, флоксуридин, 5-фторурацил.

Стоит отметить, что инактивация Rb не во всех случаях приводит к ретинобластоме. Конечно, большинство лекарственных форм предложенных средств, включая все предназначенные для приема внутрь, должны содержать противоопухолевый агент, предупреждающий именно развитие ретинобластомы, но лекарственные формы, например, для оперативного лечения, когда отсутствует воздействие средства на сетчатку глаза, в качестве противоопухолевого агента могут содержать такие вещества, например, как алкалоиды (элиптицин, винбластин, винкристин), имеющие природное происхождение, или же противоопухолевые антибиотики, причем в намного меньших концентрациях. Вместе с тем наличие противоопухолевого агента, предупреждающего развитие именно ретинобластомы, все же предпочтительно, так как в любом случае возникновение любого рака при активации сигнального пути Shh будет связано с инактивацией гена Rb1. Тем не менее в зависимости от способа лечения и индивидуальных особенностей пациента (предрасположенности к раку) в качестве противоопухолевого агента могут применяться абсолютно разные вещества.

При умеренных дозах витронектина и не длительных курсах лечения в качестве противоопухолевых агентов рекомендуется применять безвредные алкалоиды растительного происхождения, такие как элиптицин.

В состав средства также можно ввести ламинин, который способствует пролиферации клеток.

Предложенное средство можно вводить во внутреннее ухо посредством операции или через кохлеарный имплантат. Оно также может представлять собой ушные капли, крем, масло или бальзам для втирания или же лекарство для приема внутрь (таблетки, раствор, суспензия, порошок).

При тяжелых стадиях нейросенсорной потери слуха в независимости от вида применения (внутрь, наружное, посредством оперативного вмешательства) средство должно содержать смесь витронектина и по меньшей мере одного глюкокортикоида, противоопухолевый(-е) агент(-ы) и по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы: винпоцетин, пентоксифиллин и пирацетам.

Необходимость добавления в средство пальмитиновой кислоты зависит от рациона пациента, поскольку, с одной стороны, нежелательно допустить переизбытка в организме данной кислоты, а с другой - ее наличие является желательным для активации сигнального пути Shh.

Достижение необходимого результата с помощью предложенного средства продемонстрировано на фиг. 1-6.

На фиг. 1 приведено сравнение компьютерных аудиограмм, снятых с помощью аудиометра автоматизированного АА-02, слуховой системы собаки до курса лечения и спустя 3 дня после окончания курса лечения.

Кривая 1-AD представляет собой аудиограмму правого уха собаки, страдающей нейросенсорной тугоухостью, снятой до курса лечения.

Кривая 1-AS представляет собой аудиограмму левого уха собаки, страдающей нейросенсорной тугоухостью, снятой до курса лечения.

Кривая 2-AD представляет собой аудиограмму правого уха собаки, снятой после курса лечения по примеру 1.

Кривая 2-AS представляет собой аудиограмму левого уха собаки, снятой после курса лечения по примеру 1.

На фиг. 2 приведено сравнение компьютерных аудиограмм, снятых с помощью аудиометра автоматизированного АА-02, слуховой системы человека до курса лечения и спустя 3 дня после окончания курса лечения.

Кривая 3-AD представляет собой аудиограмму правого уха человека, страдающего нейросенсорной глухотой, снятой до курса лечения.

Кривая 3-AS представляет собой аудиограмму левого уха человека, страдающего нейросенсорной глухотой, снятой до курса лечения.

Кривая 4-AD представляет собой аудиограмму правого уха человека, снятой после курса лечения по примеру 2.

Кривая 4-AS представляет собой аудиограмму левого уха человека, снятой после курса лечения по примеру 2.

На фиг. 3 приведена фотография нейроэпителия ушной улитки серой крысы, страдавшей явно выраженной сенсоневральной тугоухостью, сделанная при помощи растрового электронного микроскопа.

На фиг. 4 приведена фотография нейроэпителия ушной улитки серой крысы после 5-дневного воздействия витронектин-содержащего средства, сделанная при помощи растрового электронного микроскопа.

На фиг. 5 приведена фотография нейроэпителия ушной улитки серой крысы, страдавшей явно выраженной сенсоневральной тугоухостью, сделанная методом конфокальной микроскопии после добавления иммуногистохимического маркера бромдезоксиуридина.

На фигуре 6 приведена фотография нейроэпителия ушной улитки серой крысы после 5-дневного воздействия витронектин-содержащего средства, сделанная методом конфокальной микроскопии после добавления иммуногистохимического маркера бромдезоксиуридина.

Примеры осуществления

Из сыворотки, полученной из размороженной плазмы бычьей крови, путем аффинной хроматографии с гепарин-сефаразой выделяли витронектин.

Пример 1.

Готовили 420 мл водного раствора предложенного средства посредством смешения компонентов в следующем соотношении, мг/100 мл раствора:

витронектин 520 винпоцетин 50 пальмитиновая кислота 55 пафенцил (противоопухолевый агент) 480

Приготовленный раствор был испытан на собаке (масса 43 кг, возраст 9 лет), страдавшей нейросенсорной тугоухостью средней степени.

Три раза в день ей давали небольшой кусок мяса, пропитанный 10 мл раствора предложенного средства.

Продолжительность курса лечения составила 14 дней.

На фиг. 1 приведено сравнение компьютерных аудиограмм, снятых с помощью аудиометра автоматизированного АА-02, слуховой системы собаки до лечения (кривая 1-AD - для правого уха, кривая 1-AS - для левого уха) и спустя 3 дня после окончания лечения (кривая 2-AD - для правого уха, кривая 2-AS - для левого уха).

Непрямолинейность кривых 1-AD и 1-AS, а также низкий порог слышимости, который они отображают, указывают на выраженную сенсоневральную тугоухость.

Наряду с этим кривые 2-AD и 2-AS носят практически прямолинейный характер и отображают нормальный порог слышимости.

Эти данные позволяют сделать вывод о восстановлении слуха за счет излечения от сенсоневральной тугоухости.

Магнитно-резонансная томография и ультразвуковое исследование, проведенные спустя 1 и 3 месяца с момента завершения курса лечения, не выявили признаков возникновения ретинобластомы, а также других видов рака.

Пример 2.

Поскольку опыт по примеру 1 предполагает лишь регенерацию волосковых клеток под действием предложенного препарата, для выяснения также возможности их пролиферации было проведено клиническое испытание на пожилом человеке (масса 71 кг, возраст 64 года), страдающем сенсоневральной глухотой.

Пациент некоторое время носил кохлеарный имплантат, который передавал звуковую информацию в виде электрических сигналов, поступающих непосредственно к слуховому нерву, минуя поврежденные/погибшие волосковые клетки улитки, однако впоследствии это привело к воспалительным процессам в местах прохождения имплантата. Поскольку его ношение позволяло пациенту слышать, можно сделать заключение, что сенсоневральная потеря слуха была связана именно с гибелью волосковых клеток улитки, а их гибель, в свою очередь, говорит о невозможности восстановления слуха лишь за счет регенерации поврежденных, но не отмерших клеток.

Для лечения заболевания после выделения витронектина из сыворотки, полученной из размороженной плазмы бычьей крови, путем аффинной хроматографии с гепарин-сефаразой была приготовлена порошковая смесь компонентов предложенного средства с фармацевтически приемлемым носителем. Из порошковой смеси было изготовлено 84 таблетки массой 1,5 г каждая.

Одна таблетка содержала, мг:

витронектин 180 алклометазон 8 винпоцетин 8 пирацетам 12 элиптицин (противоопухолевый агент) 170 5-фторурацил (противоопухолевый агент) 80 ламинин 110

Пациент принимал три раза в день по одной таблетке. Продолжительность курса лечения составила 28 дней.

На фиг. 2 приведено сравнение компьютерных аудиограмм, снятых с помощью аудиометра автоматизированного АА-02, слуховой системы пациента до лечения (кривая 3-AD - для правого уха, кривая 3-AS - для левого уха) и спустя 3 дня после окончания лечения (кривая 4-AD - для правого уха, кривая 4-AS - для левого уха).

Непрямолинейность кривых 3-AD и 3-AS, а также низкий порог слышимости в диапазоне частот звука 125-4000 Гц и практически полная глухота в диапазоне 4000-8000 Гц указывают на явно выраженную у пациента сенсоневральную глухоту, обусловленную поражением волосковых клеток.

Наряду с этим кривые 4-AD и 4-AS носят практически прямолинейный характер и отображают нормальный порог слышимости.

Эти данные позволяют сделать вывод о восстановлении слуха за счет излечения от сенсоневральной глухоты.

Если же сенсоневральная глухота заключалась в поражении волосковых клеток ушной улитки пациента, о чем говорил положительный эффект от ношения кохлеарного имплантата пациентом, то это также подтверждает их пролиферацию, поскольку в противном случае невозможно восстановление слуха после полной сенсоневральной глухоты.

Магнитно-резонансная томография и ультразвуковое исследование, проведенные спустя 1 и 3 месяца с момента завершения курса лечения, не выявили признаков возникновения ретинобластомы, а также других видов рака. Самочувствие пациента было нормальным.

Пример 3.

Поскольку ранее было доказано восстановительное воздействие витронектина на волосковые клетки, а характер аудиограмм пациентов до и после лечения, описанного в примерах 1 и 2, свидетельствует именно об излечении от сенсоневральной потери слуха, из этого следует, что вероятнее всего предложенные средства излечивают в слуховой системе именно волосковые клетки. Об этом также говорит положительный эффект от ношения кохлеарного имплантата пациентом, проходившего курс лечения по примеру 2. Кроме того, в большинстве случаев сенсоневральная потеря слуха связана с поражением именно данного типа клеток. Вместе с тем, чтобы достоверно убедиться в этом и вместе с тем понять действительную причину улучшения слуха, необходимо было провести изучение их морфологических изменений.

С этой целью были исследованы волосковые клетки ушной улитки погибшей серой крысы, которая до этого проживала на стройке в местах, где шум от ремонтных работ был продолжительным и часто превышал 120 дБ.

В начале произвели вскрытие внутреннего уха. Из кортиева органа была извлечена сосудистая полоска (капиллярная сеть) вместе с расположенным на ней нейроэпителием и помещена в питательную среду.

После удаления текториальной мембраны, с помощью сканирующего электронного микроскопа было изучено строение колонии волосковых клеток. На фиг. 3 видно, что большинство из них погибли либо находились в критическом состоянии, их стереоцилии были сильно повреждены. Этиология данного заболевания была ясна: длительное пребывание в местах, где шум превышает допустимые нормы, очень часто приводит к нейросенсорной потере слуха.

С целью проверки колонии клеток на пролиферацию в их среду добавляли бромдезоксиуридин до концентрации на единицу объема клеточной среды 0,00002 г/мл, после чего они были изучены при помощи конфокального микроскопа Nikon A1+/A1R+. Признаков пролиферации волосковых клеток не наблюдалось (фиг. 5).

Была приготовлена водная суспензия для лечения нейросенсорной потери слуха, содержащая, г/мл:

витронектин 0,4 пальмитиновая кислота 0,03 проспидия хлорид (противоопухолевый агент) 0,07

Данную суспензию добавляли в колонию клеток в течение 5 дней каждые 12 часов в количестве 0,001-0,0015 г/мл клеточной среды.

На фиг. 4 видно, что по истечении данного срока многие клетки восстановились, появились новые, их стереоцилии были полноценными.

После добавления бромдезоксиуридина в количестве 0,00002 г/мл клеточной среды колония была изучена при помощи конфокального микроскопа Nikon A1+/A1R+. Иммуногистохимическое окрашивание отдельных участков нейроэпителия, изображенное на фиг. 6, явно свидетельствует о наличии пролиферирующих клеток.

Следует отметить, что двадцатидневное наблюдение не выявило признаков канцерогенеза в нейроэпителии, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.

Таким образом, было впервые установлено, что витронектин или его смесь с одним или более глюкокортикоидов позволяют активировать сигнальный путь Shh конкретно в волосковых клетках внутреннего уха и таким образом регенерировать их, в частности, посредством активации процесса их пролиферации, при этом за счет его облегченной диффузии не только при оперативном вмешательстве и непосредственном воздействии на них, как в прототипе, но и другими (не оперативными) способами, что значительно расширяет методы применения предложенных средств. Способность витронектина диффундировать также белок Shh и доставлять его к клеткам-мишеням обеспечивает ощутимый эффект восстановления волосковых клеток, в отличие от применения глюкокортикоидов, у которых эта способность не была обнаружена. Данные факты позволяют сделать вывод о соответствии предложенных изобретений условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Предложенные средства являются первыми и на данный момент единственными эффективными средствами лечения сенсоневральной потери слуха, связанной с повреждением волосковых клеток. До их разработки в медицине был широко известен факт, что «волосковые клетки человека никаким образом восстановить невозможно» (статья /Ч. Либерман «Скрытая потеря слуха». В мире науки. 2015 октябрь; №10: страница 59, столбец 2, абзац 3/; статья /Edge AS, Chen ZY (2008). «Hair cell regeneration». Current Opinion in Neurobiology 18 (4): pages 377-382/; интернет-публикация http://sbio.info/news/newsmed/stvolovye_kletki_izbavja, 05.04.2009).

Компоненты для приготовления различных вариантов предложенных средств являются легкодоступными, а для труднодоступного витронектина, как упоминалось выше, существует несколько известных и несложных способов получения.

Дальнейшее освоение области контроля экспрессии генов откроет новые возможности для восстановления организма. Помимо гена Rbl существует также много и других генов, играющих двойную роль: как их экспрессия, так и их подавление для определенных частей и функций организма играют положительную роль и одновременно для других частей и функций - отрицательную. По аналогии с тем, как грамотным подавлением гена Rb1 можно поспособствовать восстановлению волосковых клеток и вместе с тем не спровоцировать при этом образование злокачественных опухолей, таким же образом в живом организме можно восстановить и все остальное, включая зрение, чувствительность, движения, пищеварительную систему, мозг, зубы. Кроме того, управлением активностью генов можно даже восстановить потерянные конечности и органы, однако данная сфера практически не изучена. Внести ясность в данный вопрос поможет изучение генофонда рептилий, птиц и рыб, у которых помимо волосковых клеток внутреннего уха также могут восстанавливаться конечности, зубы и зрение, в связи с чем существует предположение, что именно эти факторы обеспечивали некоторым видам динозавров весьма большую продолжительность жизни.

Одним из наиболее важных аспектов данной области также является доскональное изучение всех функций того или иного гена и экспрессируемых им белков, поскольку, как отмечалось выше, активация или подавление определенного гена с целью восстановления одной функции организма может привести к необратимым и разрушительным последствиям, связанным с изменением или отключением других функций организма.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована в отоларингологии для лечения нейросенсорной потери слуха (тугоухости и глухоты) различных стадий. Для этого предложены варианты средства лечения, включающие компонент, активирующий клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog. В качестве такого компонента в первом варианте средства используют витронектин. При этом оно дополнительно содержит по меньшей мере один противоопухолевый агент. Во втором варианте средства в качестве такого компонента используют смесь витронектина и по меньшей мере одного глюкокортикоида. В отличие от первого средства оно также дополнительно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы: винпоцетин, пентоксифиллин и пирацетам. Технический результат - обеспечение регенерации поврежденных волосковых клеток внутреннего уха, в том числе их пролиферации, без опасности возникновения в организме рака, в частности ретинобластомы, а также расширение методов применения средства для лечения нейросенсорной потери слуха. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 пр.

1. Средство для лечения нейросенсорной потери слуха, включающее вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит по меньшей мере один противоопухолевый агент, а вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog, представляет собой витронектин.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы: винпоцетин, пентоксифиллин и пирацетам.

3. Средство по п. 1 или 2, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит ламинин.

4. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит пальмитиновую кислоту.

5. Средство для лечения нейросенсорной потери слуха, включающее вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит по меньшей мере один противоопухолевый агент, по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы: винпоцетин, пентоксифиллин и пирацетам, а вещество, активирующее клеточный сигнальный путь Sonic hedgehog, представляет собой смесь витронектина и по меньшей мере одного глюкокортикоида.

6. Средство по п. 5, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит пальмитиновую кислоту.

7. Средство по п. 5 или 6, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит ламинин.