Способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации сердца для диагностики отторжения трансплантированного сердца.

Трансплантация сердца (ТС) является эффективным методом лечения пациентов в терминальной стадии застойной сердечной недостаточности. За последние 5 лет число операций ТС многократно увеличилось, при этом улучшились показатели продолжительности и качества жизни.

Несмотря на значительные достижения и существенный прогресс в лечении реципиентов сердца, различные виды отторжения трансплантированного сердца являются главными причинами потери трансплантата на ранних и отдаленных сроках после операции.

Объективным отражением системности процессов, происходящих в организме реципиентов, является изменение концентрации в крови ряда специфических молекул - биомаркеров. Выявление лабораторных биомаркеров для диагностики осложнений после ТС - сложная задача, поскольку тесты на большинство предполагаемых биомаркеров имеют недостаточную чувствительность и специфичность.

Факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) - мощные ангиогенные факторы, которые продуцируются макрофагами, фибробластами, гепатоцитами, эндотелиальными и другими клетками сосудов и участвуют в активации, пролиферации, миграции и дифференцировке клеток эндотелия кровеносных и лимфатических сосудов. При этом упомянутые факторы взаимодействуют с сосудами через специфические тирозинкиназные рецепторы.

Плацентарный фактор роста, как и другие представители семейства VEGF, участвует в регуляции роста эндотелия сосудов и инициирует воспалительный процесс в сосудистой стенке, привлекая из кровотока циркулирующие моноциты и макрофаги в зону повреждения или в область атеросклеротической бляшки, а также усиливая пролиферацию гладкомышечных клеток и стимулируя макрофаги к выбросу моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1) и фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α) [Плацентарный фактор роста и коронарный неоангиогенез при ишемической болезни сердца / М.В. Туликов, О.П. Шевченко, А.О. Шевченко и др. // Клиницист. - 2013. - №1. - С. 4-9; Accomero F. Placental growth factor as a protective paracrine effector in the heart / F. Accornero, J.D. Molkentin // Trends in Cardiovascular Medicine. - 2011. - Vol. 21. - №8. - P. 220-224; Mechanism of monocyte activation and expression of proinflammatory cytochemokines by placenta growth factor / S.K. Selvaraj, R.K. Giri, N. Perelman et al. // Blood. - 2003. - Vol. 102. - P. 1515; Proteolytic processing regulates placental growth factor activities / D.C. Hoffmann, S. Willenborg, M. Koch et al. // The Journal of Biological Chemistry. - 2013. - Vol. 288. - №25. - P. 17976-89]. Показано, что PlGF повышает экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины -1, -8 (ИЛ-1, ИЛ-8), а также других факторов роста эндотелия сосудов [Carnevale D. Placental growth factor and cardiac inflammation / D. Carnevale, G. Lembo // Trends in cardiovascular medicine. - 2012. - Vol.22. - №8. - P. 209-212; Dewerchin M. PlGF: a multitasking cytokine with disease-restricted activity / M. Dewerchin, P. Carmeliet // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2012. - Vol.2. - №8; PlGF repairs myocardial ischemia trough mechanisms of angiogenesis, cardioprotection and recruitment of myo-angiogenic competent marrow progenitors / H. Iwasaki, A. Kawamoto, M. Tjwa et al. // PLoS ONE. - 2011. - Vol.6. - №9. - P. 1-14].

Клинические исследования показали, что отсутствие плацентарного фактора роста в крови при таких патологических состояниях, как рак, ишемия, воспаление или заживление ран, приводит к нарушению процесса ангиогенеза [Dewerchin M. PlGF: a multitasking cytokine with disease-restricted activity / M. Dewerchin, P. Carmeliet // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2012. - Vol. 2. - №8; Proteolytic processing regulates placental growth factor activities / D.C. Hoffmann, S. Willenborg, M. Koch et al. // The Journal of Biological Chemistry. - 2013. - Vol. 288. - №25. - P. 17976-89]. Уровень PlGF в плазме крови повышается при различных патологических состояниях, включая заживление ран, образование и развитие опухоли [de Falco S. The discovery of placenta growth factor and its biological activity / S. de Falco // Experimental & Molecular Medicine. - 2012. - №44. - P. 1-9].

В настоящее время PlGF рассматривают как показатель нестабильного течения атеросклероза. Более высокие уровни плацентарного фактора роста в плазме крови больных ишемической болезнью сердца связаны с неблагоприятным отдаленным прогнозом [Шевченко А.О. Новые лабораторные маркеры ангиогенеза и повреждения атеросклеротической бляшки / А.О. Шевченко // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №6. - С. 23-34; Elevated concentration of placental growth factor (PlGF) and long term risk in patients with acute coronary syndrome in the PROVE IT-TIMI 22 trial / A.H. Bui, M.P. Bonaca, M.S. Sabatine et al. // The Journal of Thrombosis and Thrombolysis. - 2012. - Vol. 34. - №2. - P. 222-228].

Как показали Selvaraj S.К. и соавт., PlGF оказывает прямое действие на моноциты, активируя их посредством рецепторов VEGFR-1 (flt-1). Активация этих рецепторов на поверхности моноцитов приводит к активации моноцитарной PI3 киназы, что приводит к повышению выброса провоспалительных цитокинов и матриксных металлопротеиназ, обладающих способностью дестабилизировать атеросклеротическую бляшку [Mechanism of monocyte activation and expression of proinflammatory cytochemokines by placenta growth factor / S.K. Selvaraj, R.K. Giri, N. Perelman et al. // Blood. - 2003. - Vol. 102. - P. 1515].

У реципиентов сердца в отдаленные сроки после трансплантации (один год и более) с ангиографическими признаками васкулопатии трансплантата уровень плацентарного фактора роста в плазме крови достоверно выше, чем у пациентов без васкулопатии трансплантата. Показано, что у пациентов с трансплантированным сердцем маркер является предиктором развития сердечно-сосудистых осложнений: повышенный уровень PlGF в плазме крови реципиентов в первый год после трансплантации связан с развитием осложнений в более поздние сроки [Клиническое значение маркера неоартериогенеза - плацентарного фактора роста PlGF у реципиентов трансплантированного сердца / О.П. Шевченко, О.В. Орлова, С. Эль-Бустани и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2009. - №3. - С. 88-95].

Проблема диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца является актуальной ввиду того, что в настоящее время в клинике диагностика производится по результатам инвазивных методов - эндомиокардиальной биопсии [Белецкая Л.В., Баранова Ф.С., Куприянова А.Г. и др. C4d-компонент комплемента как один из маркеров отторжения гуморального типа // Вестник трансплант. и искусств. органов. 2003. №4. С. 72-777 - (прототип)]. Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода.

Нами поставлена задача - разработать доступный, неинвазивный, достоверный способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении простоты, доступности, неинвазивности диагностики, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверного диагностического скрининга острого клеточного отторжения как в раннем, так и в отдаленном посттрансплантационных периодах у реципиентов сердца, а также в улучшении результатов ТС, повышении выживаемости реципиентов путем своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии, коронароангиографии и уточнения тактики ведения больных путем определения уровня концентрации PlGF-1 в сыворотке крови.

Нами эмпирически установлен достоверный скрининговый диагностический показатель острого клеточного отторжения трансплантированного сердца, основанный на оценке концентрации PlGF-1 у реципиентов сердца в сыворотке крови, который оказался информативным в любые сроки после трансплантации. Использование предлагаемого прогностического маркера позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение эндомиокардиальной биопсии для уточнения диагноза острого клеточного отторжения трансплантированного сердца.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца в сыворотке крови определяют концентрацию PlGF-1 и при уровне PlGF-1 выше 5,33 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования концентрации биомаркера используют сыворотку крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную сыворотку переносят в эппендорф и замораживают в случае необходимости. Образцы сыворотки необходимо хранить при температуре -20°С.

Концентрация PlGF-1 может быть измерена, например, с использованием технологии хМАР и реагентов Simplex ProcartaPlex™ (Affymetrix, США). Цифровая обработка сигналов может быть произведена на проточном флуоресцентном анализаторе Luminex (Luminex Corporation, США). Обслуживание прибора и обработку результатов анализа проводят с помощью программного обеспечения xΡΟΝΕΝΤ 3.1.

Определение проводят в соответствии с инструкцией. Анализ выполняют с помощью устройства Hand-Held Magnetic для фиксирования магнитных частиц на дне планшета.

Процедура анализа включает несколько этапов.

1. Подготовка калибраторов

Для построения калибровочной кривой используют четыре готовых стандартных набора калибраторов (А, В, С и Е), содержащих исследуемый аналит. В первый стандарт (А) добавляют 250 мкл универсального буфера и инкубируют на льду в течение 10 минут, затем осторожно перемешивают при помощи магнитной мешалки в течение 30 секунд. Все содержимое переносят во второй флакон с другим стандартом (В) и процедуру повторяют еще три раза для растворения стандартов всех 4-х флаконов. Далее для построения калибровочной кривой, состоящей из 8 точек, готовят серию четырехкратных разведений с использованием универсального буфера.

2. Детекторные антитела

Все детекторные антитела в наборе находятся в виде концентрата (50х), требующего последующего разведения в 50 раз. Смесь детекторных антител (1х) готовят в соответствии со следующими расчетами: 25 мкл смеси детекторных антител (1х) на одну лунку. Пипетируют 1/50 конечного объема каждого концентрата детекторных антител (1x) (Simplex) во флакон с этикеткой «Смесь детекторных антител (1х)»; до конечного объема доводят растворителем для детекторных антител.

3. Подготовка планшета

Во все лунки планшета вносят смесь микросфер с нагруженными на них антителами объемом 50 мкл, далее планшет устанавливают в устройство Hand-Held Magnetic для фиксации магнитных сфер, что позволяет проводить отмывку микросфер.

В первый и второй стрипы вносят подготовленные калибраторы, каждый образец повторяется дважды. В оставшиеся лунки вносят по 25 мкл буфера и 25 мкл исследуемых образцов.

Время инкубации составляет 2 часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании (500 об/мин в планшетном термостате). После трехкратного отмывания микросфер от несвязавшихся компонентов реакции во все лунки добавляют по 25 мкл детекторных антител.

Время инкубации составляет 30 минут. После 3-кратной промывки микросфер с помощью устройства Hand-Held Magnetic в каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора стрептавидина-фикоэритрина для детекции комплекса антиген-антитело.

Для построения калибровочных кривых, обработки и расчета результатов используют программное обеспечение xΡΟΝΕΝΤ 3.1.

При уровне PlGF-1 выше 5,33 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1

Пациенту Е., 40 лет, с диагнозом: ишемическая болезнь сердца, выполнена ортотопическая ТС. Послеоперационный период протекал гладко. Иммуносупрессивная терапия была назначена по стандартной схеме. Однако измеренный на 43 сутки после операции уровень PlGF-1 в сыворотке крови составил 21,61 пг/мл. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано острое клеточное отторжение трансплантированного сердца. Методом эндомиокардиальной биопсии диагноз подтвержден: было установлено острое клеточное отторжение типа 1В.

Пример 2

Пациент Б., 67 лет, поступил с диагнозом: дилатационная кардиомиопатия. Пациенту выполнена операция - ортотопическая ТС. Послеоперационный период протекал гладко. Иммуносупрессивная терапия была назначена по стандартной схеме. Измеренный уровень PlGF-1 в сыворотке крови на 592 сутки после ТС составил 0,66 пг/мл. В течение периода наблюдения (с первых суток до двух лет после ТС) клинически, а также по данным эндомиокардиальных биопсий не было обнаружено морфологических и иммуногистохимических признаков острого клеточного отторжения сердечного трансплантата.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на 98 пациентах. Острое клеточное отторжение, подтвержденное эндомиокардиальной биопсией, развилось у 11 реципиентов сердца, у всех уровень PlGF-1 был выше установленного нами порогового значения - 5,33 пг/мл.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность достоверно диагностировать острое клеточное отторжение на ранних этапах его развития, произвести отбор пациентов, которым показано специальное дообследование для подтверждения диагноза.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации сердца для диагностики отторжения трансплантированного сердца. Сущность способа: в сыворотке крови определяют концентрацию PlGF-1 и при уровне P1GF-1 выше 5,33 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение. Преимущество изобретения заключается в обеспечении простоты, доступности, неинвазивности диагностики, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверного диагностического скрининга острого клеточного отторжения как в раннем, так и в отдаленном посттрансплантационных периодах у реципиентов сердца, а также в улучшении результатов трансплантации сердца, повышении выживаемости реципиентов путем своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии, коронароангиографии и уточнения тактики ведения больных путем определения уровня концентрации PlGF-1 в сыворотке крови. 2 пр.

Способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца, характеризующийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию плацентарного фактора роста -1 (PlGF-1) и при уровне PlGF-1 выше 5,33 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.