Способ дооперационного прогнозирования острого клеточного отторжения трансплантированного сердца Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12Q1/686 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов, ожидающих и перенесших трансплантацию сердца, для прогнозирования острого отторжения трансплантированного сердца.

Острое отторжение трансплантата является одним из основных факторов, ограничивающих выживаемость реципиентов сердца. Риск развития острого отторжения трансплантированного сердца более высок в раннем послеоперационном периоде, хотя кризы острого отторжения могут возникать в любые сроки после трансплантации. Поздние кризы отторжения чаще возникают при назначении недостаточных доз иммуносупрессивной терапии и несоблюдении реципиентами предписанного врачом режима приема лекарственных средств, а также возникшими вирусными инфекциями, приводящими к активации иммунной системы пациента.

Разработка малоинвазивных методов выявления осложнений в посттрансплантационном периоде и поиск новых биомаркеров, сигнализирующих о риске их развития после трансплантации сердца проводится с целью улучшения доклинической диагностики и увеличения продолжительности жизни реципиентов.

В настоящее время ведутся активные исследования биологических агентов, способных быть индикаторами риска негативных событий, связанных с развитием острого отторжения, приводящего к дисфункции трансплантированного сердца. Отдельную группу сигнальных молекул, рассматриваемых в качестве перспективных кандидатов на роль таких биомаркеров, составляют МикроРНК. МикроРНК - это семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушении обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов.

Показан диагностический потенциал оценки уровня экспрессии ряда микроРНК в образцах крови пациентов в отношении развития и течения сердечной недостаточности [The diagnostic value of circulating microRNAs in heart failure / Huang YM, Li WW, Wu J, Han M, Li ВН. // Exp Ther Med. - 2019. - 17(3): 1985-2003].

В работе Sukma Dewi et al. было показано различие уровней экспрессии микроРНК, в том числе микроРНК-101, у реципиентов с острым отторжением трансплантата и реципиентов без отторжения, на основании чего высказано только предположение о возможной диагностической роли микроРНК-101 при остром отторжении трансплантированного сердца без определения диагностической эффективности метода и значимых пороговых значений экспрессии, позволяющих выявлять реципиентов группы риска [Association of Serum MiR-142-3р and MiR-101-3р Levels with Acute Cellular Rejection after Heart Transplantation / Sukma Dewi I, Hollander Z, Lam KK, et al. // PLoS One. - 2017. - 12(1): e0170842].

При этом в качестве материала исследования была выбрана сыворотка крови реципиентов, что осложняет процесс работы с образцами в отличие от использования плазмы венозной крови.

На сегодняшний день объективным методом верификации степени и характера острого отторжения трансплантированного сердца является эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) и коронографическое исследование [Веревкин А.А., Славинский А.А., Космачева Е.Д. и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2017. - 24 (6). - С. 17-21] (прототип). ЭМБ выполняются в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированного сердца.

Однако ЭМБ имеет ряд ограничений и рисков, свойственных инвазивным методам диагностики. Кроме того, при получении биоптата исследуют локальный участок, который не всегда может отражать состояние целого трансплантированного органа [Ставенчук Т.А., Космачева Д.В., Шелестова Е.Д. и др. Оценка предикторов отторжения миокарда у пациентов после ортотопической трансплантации сердца с помощью трансторакальной эхокардиографии и методики speckle tracking echocardiography // Креативная кардиология. - 2015. - №3. - С. 56-66]. Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода. В связи с его трудоемкостью существует очевидная необходимость в разработке нового неинвазивного диагностического средства, которое может не только выявить наличие острого отторжения трансплантата, но и контролировать лечение реципиента.

Раннее прогнозирование нежелательных событий у пациентов трансплантологических отделений может стать определяющим в вопросах улучшения результатов трансплантации и оценке возможных рисков послеоперационного периода.

Так описаны способы дооперационного прогнозирования осложненного течения раннего послеоперационного периода, проявляющегося дисфункцией трансплантата, после трансплантации печени детям раннего возраста с врожденными заболеваниями гепатобилиарной системы путем измерения инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1) и соматотропного гормона (СТГ) количественным иммуноферментным методом и при наличии у пациента до операции индекса ниже -1,7 прогнозируют осложненное течение раннего послеоперационного периода, проявляющееся дисфункцией трансплантата [RU 2541803, С1].

Изучена роль ряда протеомных маркеров (sCD40L, РАРР-А и PLGF) в прогнозировании развития васкулопатии (хронического отторжения) сердечного трансплантата, развивающееся в отдаленные сроки после трансплантации [Орлова О.В. Роль маркеров воспаления, тромбообразования, неоангиогенеза и апоптоза в прогнозировании и развитии васкулопатии трансплантированного сердца. 2009. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук]. Однако, данный способ не позволяет прогнозировать риск острого отторжения трансплантированного сердца, которое может развиваться с самых ранних сроков после трансплантации и требует экстренной коррекции терапии.

Показана диагностическая эффективность микроРНК-101 в отношении развития острого отторжения трансплантата у реципиентов трансплантированного сердца [RU 2758994 С1], однако в представленном способе отражены диагностические свойства измерения экспрессии микроРНК-101 у пациентов в отношении развития острого отторжения клеточного и гуморального вида, не позволяя дифференцировать оба этих процесса. Вместе с этим, диагностика данным способом представляется возможной у пациентов только после трансплантации сердца и не позволяет оценить риск развития осложнения на дооперационном этапе.

Нами поставлена задача - разработать достоверный способ прогнозирования острого клеточного отторжения сердечного трансплантата, позволяющий еще до выполнения трансплантации выделять пациентов с высоким риском развития острого клеточного отторжения трансплантированного сердца.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в

- возможности неинвазивного достоверного дооперационного прогнозирования острого клеточного отторжения трансплантированного сердца за счет возможности вынесения суждения с учетом показателя, отражающего состояние организма пациента перед трансплантацией;

- потенциальном сокращении частоты инвазивных диагностических вмешательств после трансплантации;

- расширении возможностей персонифицированного подхода к тактике посттрансплантационного ведения реципиентов сердца;

- возможности планирования и заблаговременной коррекции схемы иммуносупрессивной терапии у пациентов высокого риска;

- улучшении клинических результатов трансплантации за счет повышения эффективности иммуносупрессии и снижении риска повреждения трансплантата.

Предлагаемый способ позволяет повысить выживаемость пациентов с трансплантированным сердцем и улучшить результаты трансплантации сердца за счет своевременного определения рисков развития отторжения на этапе подготовки к трансплантации и возможных показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии и коррекции иммуносупрессивной терапии путем определения уровня экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови.

Нами эмпирически установлен достоверный прогностический показатель развития острого отторжения трансплантированного сердца, основанный на оценке уровня экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови реципиентов сердца.

Использование предполагаемого маркера позволяет ограничить круг пациентов, ожидающих трансплантацию сердца и предрасположенных к развитию кризов острого отторжения трансплантата, которым потребуется проведение эндомиокардиальной биопсии для уточнения диагноза острого отторжения трансплантированного сердца после трансплантации.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для прогнозирования острого клеточного отторжения трансплантированного сердца в плазме венозной крови пациентов перед трансплантацией сердца определяют уровень экспрессии микроРНК-101 по формуле:

Э=log₂(2^-(Ct1-Ct2)),где

Э - уровень экспрессии микроРНК-101,

Ct1 - значение порогового цикла ПНР для образца микроРНК-101,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.

При величине Э ниже -9,73 прогнозируют развитие острого отторжения трансплантата после трансплантации сердца.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования величины экспрессии микроРНК используется плазма венозной крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.

Уровень экспрессии микроРНК-101 определяют методом полимеразной цепной реакции, например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).

Определение проводится в соответствии с инструкцией к наборам. РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляется 1,6×10⁸ копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.

Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируются путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t°=37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняется полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПЦР: 15 минут при t°=95°С с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t°=94°C, 30 секунд при t°=55°C и 30 секунд при t°=70°C в амплификаторе.

Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы венозной крови выражают в относительных единицах (отн.ед.) и рассчитывают по формуле:

Э=log₂(2^-(Ct1-Ct2), где

Э - уровень экспрессии микроРНК-101, отн.ед.

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-101 (то есть значение порогового цикла микроРНК-101 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).

У пациентов, ожидающих трансплантацию сердца с величиной экспрессии микроРНК-101 Э ниже -9,73 отн. ед. в плазме венозной крови определяют риск развития острого отторжения сердечного трансплантата после проведения трансплантации.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1. Пациенту А., 32 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Измеренный за сутки до операции уровень экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови составил Э=-11,79 отн. ед. В соответствии с предлагаемым способом у пациента спрогнозировано развитие острого отторжения трансплантата. По данным морфологического исследования образца ЭМБ диагноз подтвержден: на 90-е сутки после трансплантации выявлен агрессивный очаг воспаления в интерстиции с деструкцией кардиомиоцитов, что соответствует степени R1G острого клеточного отторжения по классификации ISHLT-2014. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.

Пример 2. Пациенту Е., 70 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал без осложнений. В течение периода наблюдения, с первых суток и до 1 года после трансплантации, у пациента данных о воспалительных процессах не получено. Измеренный за сутки до операции уровень экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови составил Э = -6,94 отн. ед. По данным морфологического исследования образца ЭМБ признаков острого клеточного отторжения трансплантата не выявлено.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на 14 пациентах, ожидающих трансплантацию сердца, среди них у 8 наблюдалось острое клеточное отторжение после трансплантации, что было подтверждено при ЭМБ образца. Специфичность предлагаемого способа составляет 100,0%. Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность прогнозировать риск развития острого отторжения трансплантата у потенциальных реципиентов сердца на дотрансплантационном этапе.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования острого клеточного отторжения трансплантированного сердца. Перед трансплантацией в плазме венозной крови пациента определяют уровень экспрессии микроРНК-101 по формуле Э=log₂(2^-(Ct1-Ct2)). При величине Э менее -9,73 прогнозируют развитие острого клеточного отторжения трансплантата. Способ обеспечивает возможность неинвазивного достоверного дооперационного прогнозирования острого клеточного отторжения трансплантированного сердца; сокращение частоты инвазивных диагностических вмешательств после трансплантации; расширение возможностей персонифицированного подхода к тактике посттрансплантационного ведения реципиентов сердца; возможность планирования и заблаговременной коррекции схемы иммуносупрессивной терапии у пациентов высокого риска; улучшение клинических результатов трансплантации за счет дооперационного определения уровня экспрессии микроРНК-101 в плазме венозной крови реципиентов сердца. 2 пр.

Способ прогнозирования острого клеточного отторжения трансплантированного сердца, в котором у пациента перед трансплантацией в плазме венозной крови определяют уровень экспрессии микроРНК-101 по формуле:

Э=log₂(2^-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-101,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-101,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39,

и при величине Э менее -9,73 прогнозируют развитие острого клеточного отторжения трансплантата.