Способ неинвазивной диагностики фиброза миокарда у реципиентов донорского сердца Российский патент 2021 года по МПК G01N33/68 C12N15/113 C12Q1/6881 C12Q1/6851 C12Q1/686 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении реципиентов сердца для диагностики фиброза миокарда трансплантата.

Успешное развитие программы трансплантации сердца содействовало решению новых задач - обеспечение длительного выживания и улучшения качества жизни пациентов с трансплантированным сердцем. Патологические процессы, протекающие в трансплантированном сердце, впоследствии могут приводить к разрастанию соединительной ткани - развитию фиброза миокарда. У реципиентов сердца в отдаленные сроки после трансплантации может развиться субклиническая хроническая сердечная недостаточность, возникающая вследствие совокупности различных патологических механизмов (артериальная гипертензия, острое отторжение и васкулопатия трансплантата, а также ряд сопутствующих заболеваний, в том числе наличие сахарного диабета, метаболического синдрома и прочее), приведших к формированию фиброза миокарда трансплантата.

Разработка малоинвазивных методов выявления осложнений в посттрансплантационном периоде - поиск новых биомаркеров - проводится с целью улучшения доклинической диагностики и увеличения продолжительности жизни реципиентов и трансплантатов.

В настоящее время ведутся активные исследования биологических агентов, способных быть индикаторами риска негативных событий, приводящих к дисфункции трансплантированного сердца. Отдельную группу сигнальных молекул, рассматриваемых в качестве перспективных кандидатов на роль таких биомаркеров, составляют МикроРНК. МикроРНК - это семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушении обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов.

Показан диагностический потенциал оценки уровня экспрессии ряда микроРНК в образцах крови пациентов в отношении развития и течения сердечной недостаточности [The diagnostic value of circulating microRNAs in heart failure / Huang YM, Li WW, Wu J, Han M, Li ВН. // Exp Ther Med. - 2019. - 17(3): 1985-2003]. В ряде работ отмечается участие микроРНК-27 в качестве ингибитора воспалительных реакций миокарда [MiR-27 alleviates myocardial cell damage induced by hypoxia/reoxygenation via targeting TGFBR1 and inhibiting NF-κΒ pathway / Xue-Lian Zhang, Bai-Fu An, Guang-Cheng Zhang. // Kaohsiung J Med Sci. - 2019. - Vol. 35(10). - P. 607-614], а также miR-27b, как член семейства микроРНК-27, может играть антифибротическую роль в левом предсердии и расцениваться в качестве новой терапевтической мишени в отношении сердечной недостаточности [Atrial overexpression of microRNA-27b attenuates angiotensin II-induced atrial fibrosis and fibrillation by targeting ALK5 / Yanshan Wang, Heng Cai, Hongmei Li, Zhisheng Gao et al. // Hum Cell. - 2018. - Vol. 31(3). - P. 251-260].

Показан диагностический потенциал измерения концентрации галектина-3 в образцах крови пациентов в отношении развития фиброза миокарда трансплантированного сердца [RU 2709193, С1], однако данная методика эффективна в отношении диагностики фиброза миокарда только в отдаленные сроки после трансплантации; при этом диагностическая эффективность способа имеет место при условии наличия у реципиентов эпизодов острого отторжения в анамнезе.

На сегодняшний день объективным методом верификации степени и характера острого отторжения трансплантированного сердца, васкулопатии и фиброза миокарда трансплантата является эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) и коронографическое исследование [Клинические рекомендации. Трансплантация сердца, наличие трансплантированного сердца, отмирание и отторжение трансплантата сердца. / Профессиональная ассоциация: Общероссийская общественная организация трансплантологов «Российское трансплантологическое общество». - 2020.] - (прототип). ЭМБ выполняются в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированного сердца.

Однако ЭМБ имеет ряд ограничений и рисков, свойственных инвазивным методам диагностики. Кроме того, при получении биоптата исследуют локальный участок, который не всегда может отражать состояние целого трансплантированного органа. Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода. В связи с его трудоемкостью существует очевидная необходимость в разработке нового неинвазивного диагностического средства, которое может не только выявить наличие фиброза миокарда трансплантата, но и контролировать лечение реципиента.

Нами поставлена задача - разработать доступный, достоверный способ неинвазивной диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца у реципиентов сердца.

Технический результат заключается в обеспечении доступности и неинвазивности диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверной диагностики в любые сроки после трансплантации, а также в повышении выживаемости реципиентов сердца и улучшении результатов трансплантации за счет своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии путем определения уровня экспрессии микроРНК-27 в плазме периферической крови реципиентов сердца.

Предлагаемый способ позволяет повысить выживаемость пациентов с трансплантированным сердцем и улучшить результаты трансплантации сердца за счет своевременного определения показаний к внеплановой ЭМБ путем определения уровня экспрессии микроРНК-27 в плазме периферической крови.

Нами эмпирически установлен достоверный диагностический показатель развития фиброза миокарда трансплантированного сердца, основанный на оценке уровня экспрессии микроРНК-27 в плазме периферической крови реципиентов сердца.

Использование предполагаемого маркера позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение ЭМБ для уточнения диагноза фиброза миокарда трансплантированного сердца.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца у реципиента в плазме периферической крови определяют уровень экспрессии микроРНК-27 по формуле:

Э=log₂(2^-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-27,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-27,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.

При величине Э более -4,33 диагностируют наличие фиброза миокарда трансплантата.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования величины экспрессии микроРНК используется плазма периферической крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.

Уровень экспрессии микроРНК-27 определяют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).

Определение проводится в соответствии с инструкцией к наборам. РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляется 1,6×10⁸ копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.

Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируются путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t°=37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняется ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПНР: 15 минут при t°=95°C с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t°=94°C, 30 секунд при t°=55°C и 30 секунд при t°=70°C в амплификаторе.

Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы периферической крови выражают в относительных единицах (отн.ед.) и рассчитывают по формуле:

Э=lоg₂(2^-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-27, отн. ед.

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-27 (то есть значение порогового цикла микроРНК-27 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).

У реципиентов сердца с величиной экспрессии микроРНК-27 Э выше -4,33 отн. ед. в плазме периферической крови определяют наличие фиброза миокарда трансплантированного сердца.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1.

Пациенту Ш., 54 лет, выполнена ортопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко (с первых суток и до двух лет после трансплантации). Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме. Измеренный на 36 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-27 в плазме крови составил -3,37 относительных единиц. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагнастирован фиброз миокарда трансплантата. Методом ЭМБ диагноз подтвержден: был установлен выраженный диффузно-очаговый фиброз миокарда.

Пример 2.

Пациенту Г., 23 лет, выполнена ортопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко (с первых суток и до семи лет после трансплантации). Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме. Измеренный на 2376 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-27 в плазме крови составил -2,48 относительных единиц. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагнастирован фиброз миокарда трансплантата. Методом ЭМБ диагноз подтвержден: выявлен диффузный фиброз миокарда.

Пример 3.

Пациенту К., 57 года, выполнена ортопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко (с первых суток и до двух лет после трансплантации). Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме лечения. Измеренный на 397 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-27 в плазме крови составил -6,43 относительных единиц. По данным ЭМБ признаков фиброза миокарда трансплантата не обнаружено.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на реципиентах сердца в различные сроки после трансплантации (с первых суток и до семи лет после трансплантации). Уровень экспрессии микроРНК-27 после трансплантации выше установленного нами порогового значения наблюдался у 36 пациентов в ранние и/или отдаленные сроки после трансплантации сердца, из них в 30 (83,3%) случаях результатами ЭМБ был верифицирован фиброз миокарда трансплантированного сердца различного типа (диффузный, очаговый, диффузно-очаговый).

Специфичность предложенного способа диагностики составляет 77,8%.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность диагностировать наличие фиброза миокарда трансплантированного сердца в любые сроки после трансплантации.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца. В плазме периферической крови реципиента определяют уровень экспрессии микроРНК-27 по формуле: Э=log₂(2^-(Ctl-Ct2)), где Э - уровень экспрессии микроРНК-27, Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-27, Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39. При величине Э выше -4,33 диагностируют наличие фиброза миокарда трансплантированного сердца. Способ обеспечивает возможность доступности и неинвазивности диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца, сокращение времени ее проведения при одновременном достижении достоверной диагностики в любые сроки после трансплантации, а также повышении выживаемости реципиентов сердца и улучшении результатов трансплантации, за счет своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии путем определения уровня экспрессии микроРНК-27 в плазме периферической крови реципиентов сердца. 3 пр.

Способ диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца, отличающийся тем, что в плазме периферической крови реципиента определяют уровень экспрессии микроРНК-27 по формуле:

Э=log₂(2^-(Ctl-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-27,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-27,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39,

и при величине Э выше -4,33 диагностируют наличие фиброза миокарда трансплантированного сердца.