Флуоресцентный оптический ДНК-биосенсор Российский патент 2017 года по МПК G01N21/64 G01N33/53 

Описание патента на изобретение RU2616879C1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к оптическим биосенсорам, предназначенным для определения белковых молекул в малых концентрациях.

Известна композиция модифицированных полупроводников, которая содержит, по крайней мере, один полупроводниковый материал, имеющий пористую текстуру, и, по крайней мере, один элемент распознавания, модифицирующий указанный полупроводниковый материал, и обеспечивающая, по крайней мере, одну первую люминесцентную реакцию в диапазоне приблизительно 200-800 нм при освещении композиции электромагнитным излучением, по крайней мере, одной длиной волны в диапазоне приблизительно 100-1000 нм. Композиция формирует систему сенсора (патент RU 2255326 С2, Ятроквест Корпорэйшн, СА 27.06.2005).

Недостатком этой композиции является 1) использование пористых полупроводниковых материалов, требующих сложной подготовки к проведению анализа, 2) биосенсор при формировании химической связи пористая подложка-агент распознавания становится одноразовым.

Также известен биологический сенсор, состоящий из подложки, на поверхность которой нанесена металлическая пленка, на внешней поверхности которой расположен промежуточный связующий слой с адсорбированным на его поверхность биоспецифическим слоем, отличающийся тем, что промежуточный связующий слой выполнен из тонкой пленки из графена толщиной 0,3-2000 нм, или тонкой пленки из однослойных или многослойных углеродных нанотрубок толщиной 0,4-2000 нм, или тонкой пленки из оксида графена толщиной 0,7-2000 нм, а биоспецифический слой расположен на поверхности промежуточного связующего слоя конформно и однородно и выполнен с возможностью осуществления избирательного химического взаимодействия с анализируемыми биологическими молекулами (патент RU 2527699 С1, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский физико-технический институт (государственный университет), 10.09.2014).

К недостаткам данного биосенсора, выбранного в качестве ближайшего аналога, относятся 1) использование в качестве подложки пленки из углеродных нанотрубок, или оксида графена, или металлических пленок благородных металлов, 2) использование промежуточного слоя гидрогеля, состоящего из полисахаридов, 3) химические взаимодействия компонентов биологического сенсора. Перечисленные недостатки приводят к потере чувствительности биосенсора и возможности его повторного использования.

Техническим результатом изобретения является разработка флуоресцентного оптического ДНК-биосенсора, обладающего возможностью многократного его использования без потери чувствительности, в частности, при определении белковых молекул в малых концентрациях.

Технический результат достигается тем, что флуоресцентный оптический ДНК-биосенсор состоит из подложки и адсорбированной на подложке тонкой пленки комплекса ДНК-белок, при этом подложка выполнена из монокристаллического кремния с ориентацией поверхности (100), размером 18×18 мм и толщиной 380±20 мкм, шероховатость рабочей поверхности ≤0,06, а содержание белка в тонкой пленке составляет от 10-15 до 10-9 моль/л.

Изобретение позволяет детектировать белковые молекулы в системе ДНК-белок, сформированной на подложке из монокристаллического кремния, при малых концентрациях белковых молекул.

Краткое описание таблиц

Таблица 1. Изменение интегральной интенсивности флуоресценции предложенного устройства в зависимости от концентрации определяемого белка - иммуноглобулина.

Таблица 2. Изменение интегральной интенсивности флуоресценции предложенного устройства в зависимости от концентрации определяемого белка - гемоглобина человека.

Таблица 3. Изменение интегральной интенсивности флуоресценции предложенного устройства в зависимости от концентрации определяемого белка - сывороточного альбумина человека.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Флуоресценция подложки из монокристалла кремния до и после нанесения слоя молекул ДНК

Использовали образцы кремния с ориентацией поверхности (100), толщиной 380±20 мкм, шероховатость рабочей поверхности ≤0,06. Наблюдаемая люминесценция образцов монокристаллического кремния без добавления ДНК или белка является люминесценцией оксидной пленки на поверхности монокристаллического образца, связанной с излучением одиночных и агрегатных центров окраски (F-центров) в оксидной матрице. Так, при возбуждении светом длиной волны 260 нм (полоса поглощения ДНК) максимум полосы флуоресценции подложки наблюдали при 364 нм. Плечи в областях 355-360 и 370-375 нм свидетельствуют о различном размере кластеров в SiO2 - оксидной пленке.

При нанесении на подложку однокомпонентной пленки ДНК (1,7 мг/мл) изменение положения максимума полосы флуоресценции незначительно, при этом интенсивность флуоресценции возрастает почти в 4 раза.

В использованных нами образцах монокристаллического кремния была обнаружена собственная флуоресценция с максимумами при 688 и 722 нм. Существует модель, объясняющая возникновение фотолюминесценции свойствами границы Si-SiOx, насыщенной дефектами. На образцах пористого кремния показано, что положение полос фотолюминесценции может заметно (1,75-2 эВ) меняться при старении образцов.

Пример 2. Определение иммуноглобулина с помощью предложенного сенсора

Использовали материалы: ДНК из тимуса теленка, IgG кролика. Навеску ДНК обрабатывали ультразвуком на сонификаторе Branson 1510 (42 кГц) 40 минут в 0,1 моль/л растворе NaCl. Раствор ДНК (1,7 мг/мл) смешивали с раствором белка различных концентраций в 0,1 моль/л NaCl в соотношении 9:1 так, чтобы концентрация белка в растворе для нанесения на положку составляла от 10-9 до 10-15 моль/л.

Пленку получали методом спинкоатинга на подложке монокристаллического кремния (18×18 мм) на установке на основе центрифуги «Элекон» ЦЛМН-Р 10-02 (Россия) при скорости вращения подложки 2000 об/мин. Объем наносимого раствора - 20 мкл.

Результаты определения иммуноглобулина с помощью предложенного сенсора представлены в таблице 1.

Пример 3. Определение гемоглобина человека с помощью предложенного сенсора

Использовали материалы: ДНК из тимуса теленка, гемоглобин человека. Навеску ДНК обрабатывали ультразвуком на сонификаторе Branson 1510 (42 кГц) 40 минут в 0,1 моль/л растворе NaCl. Раствор ДНК (1,7 мг/мл) смешивали с раствором белка различных концентраций в 0,1 моль/л NaCl в соотношении 9:1 так, чтобы концентрация белка в растворе для нанесения на положку составляла от 10-9 до 10-15 моль/л.

Пленку получали методом спинкоатинга на подложках монокристаллического кремния (18×18 мм) на установке на основе центрифуги «Элекон» ЦЛМН-Р 10-02 (Россия) при скорости вращения подложки 2000 об/мин. Объем наносимого раствора - 20 мкл.

Результаты определения гемоглобина человека с помощью предложенного сенсора представлены в таблице 2.

Пример 4. Определение сывороточного альбумина человека с помощью предложенного сенсора.

Использовали материалы: ДНК из тимуса теленка, сывороточный альбумин человека (САЧ). Навеску ДНК обрабатывали ультразвуком на сонификаторе Branson 1510 (42 кГц) 40 минут в 0,1 моль/л растворе NaCl. Раствор ДНК (1,7 мг/мл) смешивали с раствором белка различных концентраций в 0,1 моль/л NaCl в соотношении 9:1 так, чтобы концентрация белка в растворе для нанесения на положку составляла от 10-9 до 10-15 моль/л.

Пленку получали методом спинкоатинга на подложках монокристаллического кремния (18×18 мм) на установке на основе центрифуги «Элекон» ЦЛМН-Р 10-02 (Россия) при скорости вращения подложки 2000 об/мин. Объем наносимого раствора - 20 мкл.

Результаты определения сывороточного альбумина человека с помощью предложенного сенсора представлены в таблице 3.

Возбуждение в полосу поглощения белка (λех=280 нм) не изменяет существенно формы спектра и кремниевой подложки, и однокомпонентной пленки ДНК на ней, приводя лишь к снижению интенсивности флуоресценции в обоих случаях по сравнению с интенсивностью, наблюдаемой при возбуждении светом с длиной волны 260 нм.

Таким образом, созданный биосенсор позволяет определять наличие белковых молекул в низких концентрациях, при этом при снижении концентрации белка в тонкой пленке наблюдали существенное усиление флуоресценции от 2,5 до 23 раз.

Похожие патенты RU2616879C1

название год авторы номер документа
Флуоресцентный оптический ДНК-сенсор 2018
  • Бутусов Леонид Алексеевич
  • Курилкин Владимир Васильевич
  • Наговицын Илья Анатольевич
  • Чудинова Галина Константиновна
RU2684276C1
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РН 2014
  • Белоусов Всеволод Вадимович
  • Матлашов Михаил Егорович
  • Загайнова Елена Вадимовна
  • Ермакова Юлия Геннадьевна
  • Лукьянов Сергей Анатольевич
RU2603060C2
БИОСЕНСОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ИЗМЕНЕНИЯМ pH 2009
  • Белоусов Всеволод Вадимович
RU2434943C2
КРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ 2013
  • Белоусов Всеволод Вадимович
  • Ермакова Юлия Геннадиевна
  • Ениколопов Григорий Николаевич
RU2535336C1
ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БИОСЕНСОР, КАССЕТА ЭКСПРЕССИИ, КЛЕТКА ПРОДУЦИРУЮЩАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БИОСЕНСОР, ВЫДЕЛЕННЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БИОСЕНСОР 2012
  • Билан Дмитрий Сергеевич
  • Белоусов Всеволод Вадимович
  • Лукьянов Сергей Анатольевич
RU2515903C2
ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА, КАССЕТА ЭКСПРЕССИИ, КЛЕТКА, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ БИОСЕНСОР, ВЫДЕЛЕННЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА, ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БИОСЕНСОР, ОПЕРАТИВНО СЛИТАЯ С НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ, КОДИРУЮЩЕЙ СИГНАЛ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ 2011
  • Билан Дмитрий Сергеевич
  • Белоусов Всеволод Вадимович
  • Лукьянов Сергей Анатольевич
RU2493260C2
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ОСНОВАННЫЙ НА FRET ДАЛЬНЕ-КРАСНЫЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ КАСПАЗЫ 3 ВНУТРИ КЛЕТОК 2013
  • Лукьянов Константин Анатольевич
  • Злобовская Ольга Анатольевна
RU2535981C1
СПОСОБ СОЗДАНИЯ РЕГЕНЕРИРУЕМОГО БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСА ФОТОННОГО КРИСТАЛЛА С АФФИННЫМИ МОЛЕКУЛАМИ 2015
  • Довженко Дмитрий Сергеевич
  • Билан Регина Станиславовна
  • Самохвалов Павел Сергеевич
  • Вохминцев Кирилл Владимирович
  • Суханова Алена Владимировна
  • Набиев Игорь Руфаилович
RU2618606C1
ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК, ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ БИОСЕНСОРОМ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОЙ ДЕТЕКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА И ФОСФАТИДИЛИНОЗИТОЛ-3,4,5-ТРИФОСФАТА, НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ТАКОЙ БЕЛОК, КАССЕТА ЭКСПРЕССИИ И ЭУКАРИОТИЧЕСКАЯ КЛЕТКА-ХОЗЯИН 2012
  • Белоусов Всеволод Вадимович
  • Мишина Наталия Михайловна
  • Чудаков Дмитрий Михайлович
RU2498996C1
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО СЕНСОРА НА ОСНОВЕ ОКСИДА ГРАФЕНА И БИОЛОГИЧЕСКИЙ СЕНСОР НА ГИБКОЙ ПОДЛОЖКЕ 2018
  • Комаров Иван Александрович
  • Стручков Николай Сергеевич
  • Антипова Ольга Михайловна
  • Калинников Александр Николаевич
  • Нелюб Владимир Александрович
  • Бородулин Алексей Сергеевич
RU2697701C1

Реферат патента 2017 года Флуоресцентный оптический ДНК-биосенсор

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к оптическим биосенсорам, предназначенным для определения белковых молекул в малых концентрациях. Заявленный флуоресцентный оптический ДНК-биосенсор состоит из подложки, адсорбированной на подложке тонкой пленки комплекса ДНК-белок, причем подложка выполнена из монокристаллического кремния с ориентацией поверхности (100), размером 18×18 мм и толщиной 380±20 мкм, шероховатость рабочей поверхности ≤0,06, а содержание белка в тонкой пленке составляет от 10-15 до 10-9 моль/л. Технический результат - разработка флуоресцентного оптического ДНК-биосенсора, обладающего возможностью многократного его использования без потери чувствительности, в частности, при определении белковых молекул в малых концентрациях. 3 табл.

Формула изобретения RU 2 616 879 C1

Флуоресцентный оптический ДНК-биосенсор, состоящий из подложки, адсорбированной на подложке тонкой пленки комплекса ДНК-белок, отличающийся тем, что подложка выполнена из монокристаллического кремния с ориентацией поверхности (100), размером 18×18 мм и толщиной 380±20 мкм, шероховатость рабочей поверхности ≤0,06, а содержание белка в тонкой пленке составляет от 10-15 до 10-9 моль/л.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2616879C1

БИОЛОГИЧЕСКИЙ СЕНСОР И СПОСОБ СОЗДАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО СЕНСОРА 2013
  • Стебунов Юрий Викторович
  • Арсенин Алексей Владимирович
RU2527699C1
RU 2015102212 A, 26.07.2013
US 2009116020 A1, 07.05.2009
WO 2015188215 A1, 17.12.2015
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДЛОЖЕК С МНОНОСЛОЙНЫМ ПОКРЫТИЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОКАПСУЛ, СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ 2011
  • Фомкина Мария Григорьевна
  • Монтрель Александр Михайлович
  • Минкабирова Гульчачак Мавлетовна
RU2567320C2

RU 2 616 879 C1

Авторы

Бутусов Леонид Алексеевич

Наговицын Илья Анатольевич

Курилкин Владимир Васильевич

Чудинова Галина Константиновна

Даты

2017-04-18Публикация

2016-03-04Подача