СПОСОБ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ТОКСИЧНОСТИ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОЧВОГРУНТОВ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/24 

Изобретение относится к области экологических исследований и оценки качества почв и почвогрунтов урбанизированных и промышленных территорий; может быть использовано при биомониторинге состояния почв в естественных и антропогенно нарушенных экосистемах.

В почвенном покрове урбанизированных и промышленных ландшафтов широко представлены деградированные почвы и техногенные поверхностные образования, которые существенно отличаются от природных почв. Пониженная биологическая активность и токсичность деградированных почв и почвоподобных образований может быть обусловлена как их неблагоприятными агрохимическими и агрегатными свойствами, так и содержанием разнообразных загрязнителей (тяжелые металлы, соли, нефтепродукты), что делает экологическую оценку их состояния весьма трудоемкой, длительной и дорогостоящей.

Преимущества использования биологических показателей для определения состояния почв и почвогрунтов по сравнению с химическим анализом состоят в возможности комплексной оценки безопасности среды обитания.

Стандартизованные методики биотестирования загрязненных почв основаны на реакции гидробионтов: низших ракообразных, зеленых протококковых водорослей, равноресничных инфузорий (ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06; ФР 1.39.2007.03222; ФР.1.39.2007.03221; ФР.1.39.2007.03223; ФР.1.39.2006.02506; ПНД Ф Т 14.1:2:3.13-06; ФР 1.39.2006.0250; ПНД Ф Т 14.1:2.14-06; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.10-04; ПНД Ф Т 16.2:2.2-98).

Для оценки загрязненных почв используются также стандартизованные методики биотестирования по реакции бактерий: изменению интенсивности бактериальной люминисценции (ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.11-04), ферментативной активности (ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.1-96).

В основе всех вышеуказанных методик находится тестирование почвенных водных вытяжек, что имеет лишь опосредованное отношение к состоянию трехфазной почвенной системы. Реальная токсичность почв может быть значительной из-за нерастворимых в воде загрязнителей.

Способ оценки степени загрязнения почвы тяжелыми металлами (SU 1092412, G01N 33/24; опубл. 15.05.1984) позволяет диагностировать степень загрязнения по изменению состава и структуры микробного сообщества почвы, при этом учитываются буферные свойства отдельных типов почв, а также природа загрязнителя и форма его попадания в почву.

Однако более значимой при тестировании почв является реакция высших растений, т.к. они создают фотосинтезирующий покров на поверхности, являющейся основой трофических отношений в биоценозах. В урбанизированных и техногенных ландшафтах растительный покров играет средообразующую роль, обеспечивает чистоту воздуха и природных вод. Поэтому при оценке биологической активности и токсичности почв и почвогрунтов приоритет следует отдать высшей растительности.

Экспресс-метод оценки пригодности почвы для выращивания сельскохозяйственных растений (РФ 2113712, G01N 33/24, A01G 7/00, опубл. 20.06.1998) оценивает степень пригодности почвы для данного вида растений по редукции функциональной активности корневой системы. В этом методе потеря воды включает не только поглощенную растением воду (корневая десукция), но и неучтенную физически испарившуюся воду. Доля физически испарившейся воды значительна и будет варьировать в зависимости от структурного состояния разных почв.

В комплексном способе оценки почв, загрязненных тяжелыми металлами и нефтью (RU 2501009 C1, G01N 33/24, опубл. 13.08.2012), наряду с микробиологическими и биохимическими показателями используется всхожесть семян редиса. Однако всхожесть семян не отражает способность растений к автотрофному питанию в условиях загрязненной корневой среды, а выполнение микробиологических и биохимических оценок требует высоких профессиональных навыков.

В ряде методик загрязненные почвы тестируют на основе реакции проростков растений. Так, способ оценки состояния загрязненных почв (RU 2006108153/12 А, А01В 79/00, опубл. 10.10.2007) основан на изменении длины корня и стебля растений. Но извлечение корня, очистка его от почвы сопровождается опасностью разрыва корней. Эту проблему решает применение вертикальных прозрачных контейнеров в запатентованном способе (RU 2460071 С2, G01N 33/24, опубл. 27.08.2012), при котором токсическое и стимулирующее действие оценивают по длине корней проростков. Однако при тестировании почв в контейнере не исключены ошибки, обусловленные малым объемом пробы, малым числом испытуемых растений. Методика не учитывает влияние агрегатного состояния почв.

Наиболее близкими к заявленному способу оценки состояния почв и почвогрунтов является методика выполнения измерений всхожести семян и длины корней проростков высших растений для определения токсичности техногенно загрязненных почв (ФР.1.39.2006.02264 М-П-2006). Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 22030:2005 «Качество почвы. Биологические методы. Хроническая токсичность высших растений» (ISO 22030:2005 «Soil quality. Biological methods. Chronic toxicity in higher plants»).

Эта методика не лишена недостатков, она сопоставляет загрязненные почвы с контролем, однако выбор контроля в природно-техногенных ландшафтах, как правило, затруднен. Загрязненные и незагрязненные почвы должны быть полностью идентичны по комплексу свойств, исключая загрязнитель; но в случае изучения состояния почвогрунтов задача становится не решаемой. Предлагаемый в методике способ подготовки контроля путем смешивания разных грунтов не дает эталона для сравнения, т.к. составляющие могут сильно отличаться по свойствам, будут невоспроизводимыми в другом эксперименте. Длительное культивирование растений (до образования семян) выдвигает на первое место обеспеченность питательными веществами, что становится неучтенным фактором при тестировании разных почвогрунтов.

Задачей создания изобретения является разработка простого, достоверного по результатам способа оценки биологической активности и токсичности почв и почвогрунтов, свободного от недостатков прототипа.

Поставленная задача решается с помощью признаков, указанных в формуле изобретения, общих с прототипом, таких как способ оценки биологической активности и токсичности почв и техногенных почвогрунтов с использованием высших растений, которые выращивают на почвенных пробах, и отличительных существенных признаков, таких как в качестве тест культуры используют растения кресс-салата Lepidium sativum L., культивируемого на вермикулите с раствором Кнопа, растения выращивают в течение 10-12 дней, проводят замеры высоты и массы, в растительном экстракте определяют редокс-активность, при отсутствии достоверных различий с тест-контролем по высоте, массе и редокс-активности делают вывод о хорошей биологической активности и отсутствии токсичности почвы по следующим критериям: при снижении показателей развития кресс-салата на 10-30% состояние почвы или почвогрунта по сравнению с вермикулитом считать удовлетворительным; при снижении на 30-50% - неудовлетворительным; а при уровне снижения показателей более 50% считать экологически опасным или при повышении редокс-активности растительного экстракта на 10-30% относительно тест-контроля считать почву или почвогрунт умеренно токсичным; при повышении на 30-50% - сильно токсичным; а при уровне повышения показателя более 50% считать экологически опасным.

Предлагаемый способ фитотестирования устраняет недостатки прототипа. Основой «изобретательского шага» предлагаемого решения является выбор культуры для оценки биологической активности и токсичности почв и почвогрунтов, выбор воспроизводимого тест-контроля, выбор показателей тест-культуры, которые комплексно отражают экологическое состояние оцениваемого объекта.

Техническим результатом вышеперечисленной совокупности существенных признаков является упрощения процесса, снижение времени тестирования и обеспечение точности результатов на основе выбора тест-культуры, воспроизводимого тест-контроля и статистической обработки данных.

Преимуществом заявляемого способа является расширение сферы его применения в отношении разных техногенных почвогрунтов, выполняющих функции почв на урбанизированных и промышленных территориях.

Изобретение иллюстрируется экспериментальными данными, которые нашли отражение в графиках на Фиг. 1-16 описания.

Известны основные свойства почв, обеспечивающие максимальную продуктивность природных фитоценозов и культурных растений: реакция среды, близкая к нейтральной, высокое содержание и благоприятный состав гумуса, доступность питательных элементов, водопрочная зернистая или комковатая структура и т.д.

Отличительной особенностью предлагаемого решения является использование кресс-салата Lepidium sativum L. для тестирования почв. Неблагоприятные почвенные свойства способствовала снижению высоты и массы кресс-салата. Данная культура показала положительную реакцию на содержание гумуса (фиг. 1) и питательных веществ (фиг. 2, 3), сумму оснований (фиг. 4); отрицательную реакцию - на щелочную и кислую среду (фиг. 5), на подвижность тяжелых металлов (фиг. 6, 7), присутствие солей, на избыток фракции крупного песка (фиг. 8). Подобные зависимости проявились и при оценке состояния городских почв; коэффициенты корреляции массы и высоты кресс-салата с гумусом, рН_сол, подвижными фосфатами и калием составляли 0,75-0,98. Одновременно растение показало повышенную отзывчивость на почвенные свойства по сравнению с показателями биохимической активности (интенсивность дыхания, активность каталазы).

Неблагоприятные почвенные условия вызывают в растениях развитие окислительного стресса; адаптация идет путем активизации внутриклеточной антиоксидантной системы. В экспериментах с кресс-салатом при подкислении, засолении, подщелачивании и загрязнении тяжелыми металлами корневой среды установлено повышение редокс-активности экстрактов этих растений (фиг. 9, 10), установленной методом Петта-Прокашева (Практикум по физиологии растений, изд. «Колос» М., 1972, с. 198).

Для практического применения метода фитотестирования требуется наличие эталона сравнения - тест-контроля, относительно которого будет оцениваться состояние трансформированных почв и почвоподобных образований. Свойства зональных типов почв (дерново-подзолистые, подзолистые, подзолы) не способны обеспечить высокую продуктивность фитоценозов. Другой отличительной особенностью предлагаемого решения является то, что тест-контролем служит корневой субстрат, представляющий собой вермикулит с питательным раствором Кнопа. Вермикулит не образует нерастворимых соединений со всеми компонентами питательного раствора, при правильном применении не пересыхает и не переувлажняется. Раствор Кнопа содержит необходимые элементы питания. На тест-контроле растения 10-дневного возраста по массе и высоте превысили растения, культивированные на черноземе и темно-серой почве (фиг. 11, 12).

Редокс-активность растений существенно возросла на пробе из гумусово-элювиального горизонта серой почвы (фиг. 13); в данном случае может иметь место реакция растений на избыток протонов либо в кислой почве повышены подвижность и токсичность алюминия и марганца.

Пример осуществления изобретения.

Операции по определению биологической активности и токсичности почв и техногенных почвогрунтов состоят в следующем.

Отбирают пробы почвы или почвогрунта в трехкратной повторности, для каждой повторности отбирают средневзвешенный образец из пяти точек методом конверта.

Исследуемые почвы и почвогрунты для удаления крупных фрагментов должны быть просеяны сквозь сито с отверстиями размером 5 мм и тщательно перемешаны. При необходимости почва может быть перед просеиванием высушена на воздухе без подогрева. У почв определяют полную влагоемкость. В качестве тест-контроля применяют вермикулит.

Вегетационными сосудами являются полистироловые контейнеры (высота - 50 мм, площадь нижнего поперечного сечения (дна) - 50 мм ×80 мм и площадь верхнего поперечного сечения - 70 мм ×95 мм). Просеянную навеску почвы (100 г) помещают в контейнер, уплотнение достигается путем постукивания контейнера с почвой о поверхность стола. Почву полить, не допуская размыва поверхности; норма полива - 60% полной влагоемкости. Уровень заполнение стакана вермикулитом - не достигая 20 мм до края; в стакан с вермикулитом добавить 25 мл раствора Кнопа.

Взять навески семян по 0,5 г кресс-салата Lepidium sativum L. В каждой коробочке навеска семян распределяется равномерно по поверхности почвы. Затем семена засыпать сухой почвой (или вермикулитом на тест-контроле) слоем 0,5-0,7 мм. Плоским уплотнителем слегка прижать семена к влажной почве. Взвесить стаканы, прикрыть не плотно крышкой и оставить до начала прорастания семян; затем снять крышку и поместить в освещаемые условия.

Температура, влажность и освещение должны быть нормальными для роста тест-культуры Lepidium sativum L (температура 23±3°С, световой день - около 16 часов). Испытания проводят в фитотроне, камере для прорастания или теплице.

Если количество всходов на опытном образце оказалось значительно меньше, чем на тест-контроле, следует равномерно удалить часть растений на вермикулите (осторожно вырезать под корень). Учесть низкую всхожесть семян как проявление токсичности и низкой биоактивности почвы (почвогрунта). Следующий полив приурочить к периоду получения всходов; норму полива рассчитать по потере воды (в том числе на тест-контроле). В дальнейшем все варианты поливать водой очень умеренно, не допуская увядания растений.

Через 10-12 дней роста кресс-салата Lepidium sativum L провести замеры его высоты и массы (на весах с точностью до 0,001 г) 20-30-ти растений, срезая их на уровне поверхности почвы (вермикулита).

Для определения редокс-активности 2 г листьев поместить в фарфоровую ступку и растереть с 20 мл 5%-ного раствора метафосфорной кислоты до состояния однородной кашицы, которую переносят в мерную колбу на 50 мл, смывая ступку остатком кислоты. Доводят колбу до метки дистиллированной водой. Перемешивают, настаивают 5 мин, затем взбалтывают и фильтруют через сухой складчатый фильтр в сухую колбу. Наливают 10 мл фильтрата в колбочку на 50 мл, добавляют 2-3 капли 15%-ного KI, 5 капель 1%-ного раствора крахмала и титруют из бюретки 0,001 н. раствором KIO₃ до слабо синего окрашивания, сохраняющегося одну минуту. Для каждого варианта опыта провести не менее 3 определений (повторностей).

При большом количестве вариантов опыта растительную массу для определения редокс-активности лучше зафиксировать в лиофильной сушке, далее работать с фиксированным материалом. Расчет редокс-активности:

общая редокс-активность (мл 0,001 н. раствора KIO₃) = b * M * 100 / m * n, где b - количество йодата калия (мл), израсходованного на титрование; М - общий объем экстракта (мл), m - объем экстракта, взятого на титрование (мл); n - навеска растительного материала (г).

В результате проведенного эксперимента получены три показателя (высота одного растения, масса одного растения и редокс-активность растительного экстракта) с определенной повторностью. Результаты опыта подвергают математической обработке. Отличие средней массы и средней высоты одного растения, выращенного на почвенных пробах, от тест-контроля обосновать параметрическими и/или непараметрическими тестами. Оценку достоверности различий редокс-активности растений, выращенных на почве или почвогрунте, с тест-контролем проводят на основе дисперсионного анализа.

Критерии оценки биологической активности и токсичности исследуемого почвенного материала основаны на том, что по сравнению с вермикулитом растения на черноземе (самая плодородная почва в регионе) имели высоту и массу ниже на 30%, чем тест-контроль. Поэтому при снижении показателей развития кресс-салата на 10-30% состояние почвы или почвогрунта считать удовлетворительным; при снижении на 30-50% - неудовлетворительным; а при уровне снижения показателей более 50% считать экологически опасным.

Информацию о токсичности почв следует уточнять на основе редокс-активности растительных экстрактов. Достоверное превышение относительно тест-контроля позволяет утверждать о токсичности почвенного объекта, вызывающего активизацию антиоксидантной системы растений. При повышении редокс-активности растительного экстракта на 10-30% считать почву или почвогрунт умеренно токсичным; при повышении на 30-50% - сильно токсичным; а при уровне повышения показателя более 50% считать экологически опасным. При этом следует учитывать, что при очень сильном угнетении растений (по высоте и массе) редокс-активность может не возрастать, как это установлено при высоком загрязнении почв тяжелыми металлами. В этом случае растения не справлялись со сверхпродукцией активных форм кислорода, их антиоксидантная система была подавлена.

При фитотестировании почвенного покрова жилого района многоэтажной застройки г. Перми установлено, что выращенный на городских почвах кресс-салат Lepidium sativum L отличался от тест-контроля только в сторону ухудшения показателей развития (фиг. 14, 15). Понижение высоты растений в 3 вариантах (пробы 4, 5, 12) и понижение массы в 6 вариантах (пробы 4, 5, 12, 20, 22, 33) показало неудовлетворительный уровень экологического состояния почв (понижение в пределах 33-50%).

В соответствии с редокс-активностью растительных экстрактов в 12 вариантах проявилась токсичность почв, из них в 5-ти - сильная токсичность; а в 7-ми вариантах показатель был повышен на 53-75%, что позволяет утверждать о накоплении в почвах загрязнителей (тяжелые металлы, соли, нефтепродукты) до экологически опасного уровня.

Данное описание рассматривается как материал, иллюстрирующий изобретение, сущность которого и объем патентных притязаний определены в нижеследующей формуле изобретения, совокупностью существенных признаков и их эквивалентами.

Изобретение относится к области экологии, а именно используется при биомониторинге состояния почв в естественных и экологически неблагоприятных экосистемах, вызванных разнообразными загрязнениями. Для этого проводят оценку биологической активности и токсичности почвы по состоянию кресс-салата Lepidium sativum L., выращенного на пробах почв и тест-контролем на вермикулите с питательным раствором Кнопа. Оценку проводят по показателям развития 10-12-дневных растений, при этом сравнивают высоту и массу растений, а также редокс-активность растительного экстракта, которая повышается при токсичности корневой среды. При этом снижение показателей кресс-салата или повышение редокс-активности растительного экстракта на 10-30% характеризует удовлетворительное состояние почвы, снижение на 30-50% - неудовлетворительное, при уровне ниже 50% - экологически опасное. Изобретение обеспечивает упрощение способа оценки, снижение времени тестирования и обеспечение точности результатов для статистической обработки данных для оценки качества почв и почвогрунтов урбанизированных и промышленных территорий разных техногенных почвогрунтов, выполняющих функции почв на урбанизированных и промышленных территориях. 16 ил., 1 пр.

Способ оценки биологической активности и токсичности почв и техногенных почвогрунтов с использованием высших растений, которые выращивают на почвенных пробах, отличающийся тем, что в качестве тест-культуры используют растения кресс-салата Lepidium sativum L., культивируемого на вермикулите с раствором Кнопа, растения выращивают в течение 10-12 дней, проводят замеры высоты и массы, в растительном экстракте определяют редокс-активность, при отсутствии достоверных различий с тест-контролем по высоте, массе и редокс-активности делают вывод о хорошей биологической активности и отсутствии токсичности почвы по следующим критериям: при снижении показателей развития кресс-салата на 10-30% состояние почвы или почвогрунта по сравнению с вермикулитом считать удовлетворительным; при снижении на 30-50% - неудовлетворительным; а при уровне снижения показателей более 50% - считать экологически опасным или при повышении редокс-активности растительного экстракта на 10-30% относительно тест-контроля считать почву или почво-грунт умеренно токсичным; при повышении на 30-50% - сильно токсичным; а при уровне повышения показателя более 50% - считать экологически опасным.