Способ определения токсичности почвы и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, методом биотестирования Российский патент 2022 года по МПК G01N33/24 G01N33/42 C12Q1/02 

Изобретение относится к области экологии и дорожного строительства и может быть использовано для определения токсичности почв и техногенно загрязненных грунтов методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii. Способ включает экстракцию образца почвы или техногенного материала водой, фильтрацию с получением прозрачного раствора и экспресс-оценки токсичности образца по тест-реакции инфузорий.

Известен способ определения токсичности почвы методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg (Патент RU 2482478, МПК G01N 33/24, опубл. 20.05.2013, Бюл. №14). По данному способу в культуру инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg вносят исследуемый токсин в различных разведениях, выдерживают в течение трех минут при комнатной температуре, подсчитывают число сокращений выделительных вакуолей за 1 мин и определяют токсическое воздействие бактериального антигена по степени угнетения выделительной функции инфузорий, и за токсическую концентрацию принимают концентрацию антигена, снижающую на 50% число сокращений выделительных вакуолей инфузорий по сравнению с контролем. Способ включает экстракцию почвенного образца водой, фильтрацию с получением прозрачного раствора с рН 7,0-8,2. Приготовление шкалы разведений экстракта и определение токсичности образца по тест-реакции инфузорий. Далее почву повторно экстрагируют водным раствором ацетона. Проводят фильтрование, экстрагируют гексаном, сливают нижнюю гексановую фракцию и повторяют переэкстракцию новой порцией гексана.

Недостатком данного способа является то, что по нему подсчитывают число сокращений выделительных вакуолей у 6-7 неподвижных клеток и далее с учетом количества сокращений 7-8 в минуту, определяют степень токсичности испытуемого экстракта, принимая за токсическую дозу 50% уменьшение скорости сокращений, что очень затруднительно технически и не обеспечивает возможность определения токсичности почвогрунта или техногенных материалов по категориям их токсичности.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ (прототип) оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов (Патент RU 2049994, опубл. 10.12.1995 г.) путем их измельчения, приготовления на их основе питательной среды, введение в нее тест-объекта инфузорий стилонихий Stylonichia mytilus, для этого готовят предварительно ацетоновый или спиртовой экстракт пробы при концентрации растворителя 0,6 1,3% и 0,4 0,8% соответственно, культуру инфузорий вносят в среду с продуктом в количестве 20-40 шт/мл, выдерживают в течение 1-1,5 ч, в качестве физиологического параметра оценивают процент выживших особей и при 81-100% выживших особей от их исходного числа считают исследуемый продукт нетоксичным, при 50-80% выживших особей слаботоксичным, а при меньшем количестве выживших особей токсичным. Экстракция данными растворителями обеспечивает максимально полное извлечение токсических веществ из продуктов по сравнению с их извлечением только водной фазой.

Недостатком этого способа является то, что согласно данному способу определяют выживаемость особей инфузорий, а не токсичность почвогрунта или техногенных материалов и при этом физиологическими параметрами токсичности исследуемых продуктов ограничивают только нетоксичными, слаботоксичными и токсичными.

Цель изобретения - определения токсичности почвогрунта или техногенных материалов по категориям их токсичности.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка практически выполнимого способа определения токсичности почвогрунта и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii.

Поставленная задача достигается тем, что для определения токсичности почв и техногенных грунтов используют инфузории Colpoda steinii, для этого образец почвы, загрязненного техногенными материалами, экстрагируют водой или ацетоном, фильтруют с получением прозрачного раствора и проводят оценку токсичности образца по тест-реакции инфузорий, а токсичность почвенного образца определяют по выживаемости инфузорий за 1 час для анализа водного раствора 1% ацетонового экстракта и 3 часа для анализа водного экстракта почвы. При этом анализируемые материалы по токсичности относят на практически не токсичные (токсичность в пределах 20%), малотоксичные (токсичность в пределах 21-40%), умеренно токсичные (токсичность в пределах 41-60%), опасно-токсичные (токсичность в пределах 61-80%), высоко-опасно токсичные (токсичность в пределах 81-100%).

Техническим результатом изобретения является определение токсичности почвогрунта и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii с распределением анализируемых материалов по категориям их токсичности.

Сопоставительный анализ с ближайшим аналогом позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ определения токсичности почвы и техногенных материалов методом биотестирования с использованием инфузорий отличается тем, что для биотестирования токсичных соединений в почве применяют выращенную в лабораторных условиях культуру инфузорий типа Colpoda Steinii, токсичность почвенного образца определяют по выживаемости инфузорий за 1 час для анализа водного раствора 1% ацетонового экстракта и 3 часа для анализа водного экстракта почвы по формуле:

где: Q_об - общее начальное количество инфузорий, штук;

Q_ж -количество выживших инфузорий по окончании опыта, штук.

При этом анализируемые материалы по токсичности относят на практически не токсичные (токсичность в пределах 20%), малотоксичные (токсичность в пределах 21-40%), умеренно токсичные (токсичность в пределах 41-60%), опасно-токсичные (токсичность в пределах 61-80%), высоко-опасно токсичные (токсичность в пределах 81-100%).

Ранее предлагаемое техническое решение не заявлялось и способ определения токсичности почвы и техногенных материалов с использованием инфузорий Colpoda steinii при биотестировании почвенного образца не применялся для оценки токсичности почвы, загрязненных техногенными материалами, применяемыми в дорожном строительстве. Следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критерию "новизна".

Предлагаемый способ определения токсичности почвы и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, позволяет в условиях Сибири идентифицировать анализируемые техногенные материалы методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii на основе их выживаемости в тестируемых растворах по категориям их токсичности.

Предлагаемое изобретение придает способу определения токсичности почвы и техногенных материалов новое техническое решение способа, основанное на применении в качестве тестируемого вида инфузории Colpoda steinii, при этом токсичность загрязненного техногенными материалами почвенного образца определяют по выживаемости инфузорий за 1 час для анализа водного раствора 1% ацетонового экстракта и 3 часа для анализа водного экстракта почвы, а анализируемые материалы по токсичности относят на практически не токсичные (токсичность в пределах 20%), малотоксичные (токсичность в пределах 21-40%), умеренно токсичные (токсичность в пределах 41-60%), опасно-токсичные (токсичность в пределах 61-80%), высоко-опасно токсичные (токсичность в пределах 81-100%). Это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию "изобретательский уровень".

При применении отходов производства в дорожном строительстве, необходимо подтвердить отсутствие токсичных веществ, способных к миграции в сопредельные среды из материалов для дорожных одежд в почвогрунт. Следует учитывать их агрессивность и токсичность по отношению к окружающей природной среде по категориям токсичности. В практике токсикологических лабораторий в Сибирском регионе для биотестирования используют инфузорию Colpoda steinii, но применение данных инфузорий для тестирования техногенных материалов в дорожном строительстве ранее не применялось.

Способ заключается в изучении тест-реакции инфузорий при извлечении с помощью водной экстракции соединений, обладающих высокой подвижностью и биологической активностью из техногенного грунта или почвы и последующего биотестирования на инфузориях Colpoda steinii по тест-реакции и выживаемости данных инфузорий. Инфузории, являясь одноклеточными микроскопическими организмами, в силу своих размеров, поглощают в основном растворенные вещества. Это делает их ценными тест-объектами для первичного экспресс определения острой токсичности техногенных материалов и грунтов на их основе.

Внедрение данного способа экспресс-биотестрирования и выявление токсикантов, позволит получить быстрый предварительный результат и скорректировать дальнейший ход строительства дорожных одежд и предотвратить загрязнение почвогрунта и окружающей среды. При этом на первом же этапе исследования позволит исключить высокотоксичные образцы техногенных материалов и из устройства дорожного полотна как потенциально непригодные к использованию.

Изобретение относится к области экологии и дорожного строительства и может быть использовано для определения токсичности почв и техногенно загрязненных грунтов методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii. Способ включает экстракцию образца почвы или техногенного материала водой, фильтрацию с получением прозрачного раствора и экспресс-оценки токсичности образца по тест-реакции инфузорий.

Известен способ определения токсичности почвы методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg (Патент RU 2482478, МПК G01N 33/24, опубл. 20.05.2013, Бюл. №14). По данному способу в культуру инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg вносят исследуемый токсин в различных разведениях, выдерживают в течение трех минут при комнатной температуре, подсчитывают число сокращений выделительных вакуолей за 1 мин и определяют токсическое воздействие бактериального антигена по степени угнетения выделительной функции инфузорий, и за токсическую концентрацию принимают концентрацию антигена, снижающую на 50% число сокращений выделительных вакуолей инфузорий по сравнению с контролем. Способ включает экстракцию почвенного образца водой, фильтрацию с получением прозрачного раствора с рН 7,0-8,2. Приготовление шкалы разведений экстракта и определение токсичности образца по тест-реакции инфузорий. Далее почву повторно экстрагируют водным раствором ацетона. Проводят фильтрование, экстрагируют гексаном, сливают нижнюю гексановую фракцию и повторяют переэкстракцию новой порцией гексана.

Недостатком данного способа является то, что по нему подсчитывают число сокращений выделительных вакуолей у 6-7 неподвижных клеток и далее с учетом количества сокращений 7-8 в минуту, определяют степень токсичности испытуемого экстракта, принимая за токсическую дозу 50% уменьшение скорости сокращений, что очень затруднительно технически и не обеспечивает возможность определения токсичности почвогрунта или техногенных материалов по категориям их токсичности.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ (прототип) оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов (Патент RU 2049994, опубл. 10.12.1995 г.) путем их измельчения, приготовления на их основе питательной среды, введение в нее тест-объекта инфузорий стилонихий Stylonichia mytilus, для этого готовят предварительно ацетоновый или спиртовой экстракт пробы при концентрации растворителя 0,6 1,3% и 0,4 0,8% соответственно, культуру инфузорий вносят в среду с продуктом в количестве 20-40 шт. /мл, выдерживают в течение 1-1,5 ч, в качестве физиологического параметра оценивают процент выживших особей и при 81-100% выживших особей от их исходного числа считают исследуемый продукт нетоксичным, при 50-80% выживших особей слаботоксичным, а при меньшем количестве выживших особей токсичным. Экстракция данными растворителями обеспечивает максимально полное извлечение токсических веществ из продуктов по сравнению с их извлечением только водной фазой.

Недостатком этого способа является то, что согласно данному способу определяют выживаемость особей инфузорий, а не токсичность почвогрунта или техногенных материалов и при этом физиологическими параметрами токсичности исследуемых продуктов ограничивают только нетоксичными, слаботоксичными и токсичными.

Цель изобретения - определения токсичности почвогрунта или техногенных материалов по категориям их токсичности.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка практически выполнимого способа определения токсичности почвогрунта и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii.

Поставленная задача достигается тем, что для определения токсичности почв и техногенных грунтов используют инфузории Colpoda steinii, для этого образец почвы, загрязненного техногенными материалами, экстрагируют водой или ацетоном, фильтруют с получением прозрачного раствора и проводят оценку токсичности образца по тест-реакции инфузорий, а токсичность почвенного образца определяют по выживаемости инфузорий за 1 час для анализа водного раствора 1% ацетонового экстракта и 3 часа для анализа водного экстракта почвы. При этом анализируемые материалы по токсичности относят на практически не токсичные (токсичность в пределах 20%), малотоксичные (токсичность в пределах 21-40%), умеренно токсичные (токсичность в пределах 41-60%), опасно-токсичные (токсичность в пределах 61-80%), высоко-опасно токсичные (токсичность в пределах 81-100%).

Техническим результатом изобретения является определение токсичности почвогрунта и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii с распределением анализируемых материалов по категориям их токсичности.

Сопоставительный анализ с ближайшим аналогом позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ определения токсичности почвы и техногенных материалов методом биотестирования с использованием инфузорий отличается тем, что для биотестирования токсичных соединений в почве применяют выращенную в лабораторных условиях культуру инфузорий типа Colpoda Steinii, токсичность почвенного образца определяют по выживаемости инфузорий за 1 час для анализа водного раствора 1% ацетонового экстракта и 3 часа для анализа водного экстракта почвы по формуле:

где: Q_об - общее начальное количество инфузорий, штук;

Q_ж -количество выживших инфузорий по окончании опыта, штук.

При этом анализируемые материалы по токсичности относят на практически не токсичные (токсичность в пределах 20%), малотоксичные (токсичность в пределах 21-40%), умеренно токсичные (токсичность в пределах 41-60%), опасно-токсичные (токсичность в пределах 61-80%), высоко-опасно токсичные (токсичность в пределах 81-100%).

Ранее предлагаемое техническое решение не заявлялось и способ определения токсичности почвы и техногенных материалов с использованием инфузорий Colpoda steinii при биотестировании почвенного образца не применялся для оценки токсичности почвы, загрязненных техногенными материалами, применяемыми в дорожном строительстве. Следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критерию "новизна".

Предлагаемый способ определения токсичности почвы и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, позволяет в условиях Сибири идентифицировать анализируемые техногенные материалы методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii на основе их выживаемости в тестируемых растворах по категориям их токсичности.

Предлагаемое изобретение придает способу определения токсичности почвы и техногенных материалов новое техническое решение способа, основанное на применении в качестве тестируемого вида инфузории Colpoda steinii, при этом токсичность загрязненного техногенными материалами почвенного образца определяют по выживаемости инфузорий за 1 час для анализа водного раствора 1% ацетонового экстракта и 3 часа для анализа водного экстракта почвы, а анализируемые материалы по токсичности относят на практически не токсичные (токсичность в пределах 20%), малотоксичные (токсичность в пределах 21-40%), умеренно токсичные (токсичность в пределах 41-60%), опасно-токсичные (токсичность в пределах 61-80%), высоко-опасно токсичные (токсичность в пределах 81-100%). Это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию "изобретательский уровень".

При применении отходов производства в дорожном строительстве, необходимо подтвердить отсутствие токсичных веществ, способных к миграции в сопредельные среды из материалов для дорожных одежд в почвогрунт. Следует учитывать их агрессивность и токсичность по отношению к окружающей природной среде по категориям токсичности. В практике токсикологических лабораторий в Сибирском регионе для биотестирования используют инфузорию Colpoda steinii, но применение данных инфузорий для тестирования техногенных материалов в дорожном строительстве ранее не применялось.

Способ заключается в изучении тест-реакции инфузорий при извлечении с помощью водной экстракции соединений, обладающих высокой подвижностью и биологической активностью из техногенного грунта или почвы и последующего биотестирования на инфузориях Colpoda steinii по тест-реакции и выживаемости данных инфузорий. Инфузории, являясь одноклеточными микроскопическими организмами, в силу своих размеров, поглощают в основном растворенные вещества. Это делает их ценными тест-объектами для первичного экспресс определения острой токсичности техногенных материалов и грунтов на их основе.

Способ определения токсичности почвы и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, методом биотестирования с использованием инфузорий осуществляли следующим образом.

Для проведения исследования готовили одновременно водный экстракт и водный раствор ацетонового экстракта одной и той же анализируемой пробы, в которые помещали инфузории. Автоматической пипеткой с заменяемым наконечником отбирали по 20 мкл среды с инфузориями и помещали в каждый из пяти микроаквариумов или лунок предметного стекла. Затем туда же автоматической пипеткой с чистым наконечником вносили по 20 мкл экстракта исследуемого образца пробы. Водную вытяжку из почвы для биотестирования готовили в соотношении: 1 часть почвы и 4 частей дистиллированной воды (pH 7,0 - 7,5). Для подготовки усредненную пробу испытуемого образца измельчали до прохода через сито с ячейками диаметром 1 мм. Полученный таким образом однородный образец использовали для получения водной вытяжки.

Для приготовления водного экстракта исследуемого образца массой 50 г вносили в колбу вместимостью 500 мл и заливали 200 мл дистиллированной воды. Колбы с содержимым встряхивали на аппарате в течение 20 мин, после чего смесь фильтровали через бумажный фильтр или центрифугировали с частотой вращения 1000 об/мин в течение 5 мин и отделяли надосадочную жидкость.

Для приготовления ацетонового экстракта измельченную пробу исследуемого образца массой Юг помещали в стеклянную колбу объемом 50 мл и заливали в нее ацетон в таким образом, чтобы толщина слоя ацетона над пробой исследуемого образца была не менее 2 мм и, закрыв колбу притертой крышкой, экстрагировали при энергичном встряхивании в течение 2 минут. Экстракт отстаивали 15 минут и отделяли надосадочную жидкость автоматической пипеткой 0,5мл и переносили ее в колбу для анализа. Раствор фильтровали через бумажный фильтр.

Каждую пробу анализировали пять раз. При помещении тест-объекта количество культуральной жидкости в лунке не должно было превышать 0,02 см. Пять лунок использовали в качестве контрольных. Отмечали время начала биотестирования и подсчитывали под микроскопом количество особей в каждой лунке. По истечении этого времени просматривали весь объем микроаквариума или лунки и учитывали наличие живых инфузории под микроскопом. Выжившими считались инфузории, которые свободно перемещались в толще воды. Обездвиженных особей относили к погибшим.

Токсичность образцов определяли на примере почвы, отобранной на удалении от объекта техногенного загрязнения почвы. В качестве объекта техногенного загрязнения почвы была взята автодорога Красноярск-Сосновоборск, построенная с применением техногенных материалов (нефелиновых шламов). Почвенные образцы для определения токсичности отбирали на различном удалении от дорожного полотна (5,10,20,25,50м от края дорожной одежды). Токсичность проб почвы (в %) определяли по заявляемой формуле и затем каждой пробе устанавливали категорию токсичности. Примеры применения заявляемого способа приведены в табл.1.

Для сравнения были проведены опыты с инфузориями Stylonichia mytilus и по условиям согласно способу, принятому за прототип. Степень токсичности испытуемого продукта по данному способу определяли по выживаемости инфузорий после 3 ч экспозиции в водном экстракте и 1ч в 1% ацетоновом экстракте. Результаты опытов по прототипу приведены в табл.2.

Проведенные опыты показали, что предлагаемый способ определения токсичности почвы, загрязненной техногенными материалами наиболее информативен по категориям токсичности по сравнению со способом, принятым за прототип, по которому токсичность исследуемых проб ограничивается только нетоксичными, слаботоксичными и токсичными. При этом для первых трех проб почвы на удалении от автодорожного полотна на 5, 10 и 20 м получены данные, что почва относится к категории токсичной

(табл.2 опыты 1, 2, 3), а проба на расстоянии 25 м от автодороги отнесена к категории слаботоксичная.

Согласно предлагаемого способа получены более точные данные по токсичности почвы, так проба почвы, отобранная на удалении 10 м от автодорожного полотна, считается умеренно токсичная (табл.1 опыт 1), на 20 м соответственно малотоксичной, а на удалении 25 и 50 м считается не токсичной (табл.1 опыты 4 и 5). В ходе проведения эксперимента было установлено, что ни один из испытуемых почвенных образцов, отобранных на удалении 25 и 50 м не является токсичным для почвенных инфузорий и даже через три часа водной вытяжки во всех опытных образцах тест-объекты выжили. В качестве примера определения токсичности техногенных материалов были взяты пробы различных образцов этих материалов, применяемых в дорожном строительстве. Экстракты пробы исследуемых техногенных материалов готовили согласно вышеприведенной методике и затем определяли их токсичность в водной и водно-ацетоновой вытяжке с использованием инфузорий Colpoda steinii. Результаты опытов с образцами техногенных материалов приведены в табл.3.

Таблица 3. Примеры определения токсичности техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве по заявляемому способу с применением инфузорий Colpoda steinii

Анализ табл.3 показывает, что влажный нефелиновый шлам глиноземного производства АО «РУСАЛ Ачинск», применяемый в качестве техногенного материала дорожной смеси для устройства нижнего слоя основания, имел категорию опасно токсичную, определяемую по заявляемому способу. Гидратированный нефелиновый шлам после хранения на шламохранилище 30 суток переходил в категорию умеренно токсичную. Аналогичную категорию токсичности имели дорожная смесь из нефелинового шлама (30 мас.%) и щебня (70 мас.%), а также пробы золошлаковых отходов, отобранные на промлощадке АО «РУСАЛ Ачинск». Практически не токсичными были определены пробы щебня и вскрышной породы из карьера Мазульского известнякового рудника.

Точность определения токсичности почвы по категориям по заявляемому способу подтверждают дополнительно проведенные опыты другим способом биотестирования почвы и техногенных материалов по тест-культурам в соответствии с «Методикой выполнения измерений всхожести семян и длины корней проростков высших растений для определения токсичности техногенно загрязненных почв». В качестве тест-культур в этом случае использовались пшеница мягкая яровая (Triticum vulgarе L.) сорт Новосибирская 29 и кресс-салат (Lepidium sativum) сорт Донской. Проведенные опыты с данными тест-культурами показали полную идентичность полученных результатов по токсичности с инфузориями Colpoda steinii согласно заявляемого способа.

Изобретение относится к области экологии и дорожного строительства и может быть использовано для определения токсичности почв и техногенных грунтов методом биотестирования с использованием инфузорий Colpoda steinii. Образец почвы, загрязненного техногенными материалами, экстрагируют водой или ацетоном, фильтруют с получением прозрачного раствора и проводят оценку токсичности образца по тест-реакции инфузорий, а токсичность почвенного образца определяют по выживаемости инфузорий за 1 час для анализа водного раствора 1% ацетонового экстракта или за 3 часа для анализа водного экстракта почвы по формуле:

где: Q_oб - общее начальное количество инфузорий, штук; Q_ж - количество выживших инфузорий по окончании опыта, штук. При этом анализируемые материалы по токсичности относят на практически не токсичные с токсичностью в пределах 20%, малотоксичные с токсичностью в пределах 21-40%, умеренно токсичные с токсичностью в пределах 41-60%, опасно токсичные с токсичностью в пределах 61-80%, высоко-опасно токсичные с токсичностью в пределах 81-100%. Достигается повышение информативности и надежности определения. 3 табл.

Способ определения токсичности почвы и техногенных материалов, применяемых в дорожном строительстве, методом биотестирования с использованием выращенной в лабораторных условиях культуры инфузорий типа Colpoda Steinii, включающий отбор пробы, измельчение, экстракцию почвенного образца водой или ацетоном, фильтрацию с получением прозрачного раствора и определение токсичности пробы по выживаемости инфузорий за 1 час для анализа водного раствора 1% ацетонового экстракта или за 3 часа для анализа водного экстракта почвы по формуле:

где: Q_oб - общее начальное количество инфузорий, штук;

Q_ж -количество выживших инфузорий по окончании опыта, штук,

при этом анализируемые материалы по токсичности относят на практически не токсичным с токсичностью в пределах 20%, малотоксичным с токсичностью в пределах 21-40%, умеренно токсичным с токсичностью в пределах 41-60%, опасно токсичным с токсичностью в пределах 61-80%, высоко-опасно токсичным с токсичностью в пределах 81-100%.