ПОЛИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ С ПРЕИМУЩЕСТВАМИ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ: C АНТИОКСИДАНТНЫМ ЭФФЕКТОМ, СНИЖЕНИЕМ КОНЦЕНТРАЦИИ ХОЛЕСТЕРИНА, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ ЭФФЕКТОМ И ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ БИОАКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ, ИНГИБИРУЮЩИХ АНГИОТЕНЗИН-КОНВЕРТИРУЮЩИЙ ФЕРМЕНТ Российский патент 2017 года по МПК A61K35/747 C07K14/47 C12N1/20 A61P37/02 A61P39/06 A61P9/12 A61P9/02 A61P1/14 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологий и, в частности, к полученным с их помощью пробиотическим штаммам молочнокислых бактерий и полибактериальному препарату. Это изобретение также относится к комплексу преимущественных эффектов для здоровья, которым обладает препарат, и к его применению в качестве пищевой добавки для предотвращения различных заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Пробиотики являются живыми пищевыми микроорганизмами, которые оказывают положительный эффект на здоровье человека. Большая часть пробиотиков представляют собой молочнокислые бактерии и/или бифидобактерии. Это непатогенные бактерии, которые способны колонизировать желудочно-кишечный тракт. Показано, что молочнокислые бактерии и бифидобактерии являются основным компонентом кишечной микрофлоры (микробиоты). Представители обоих родов могут населять слизистую оболочку кишечника и влиять на поддержание гомеостаза кишечной экосистемы. Их присутствие оказывает положительные эффекты на здоровье организма, такие как подавление болезнетворных микроорганизмов, улучшение пищеварения, иммуностимулирующий эффект, снижение непереносимости лактозы, снижение сывороточного холестерина, предотвращение диареи и др. Некоторые штаммы молочнокислых бактерий вырабатывают биоактивные пептиды, которые работают как антигипертензивные средства, а также абсорбируют кальций и магний. Пробиотические эффекты, как правило, не являются общими для родов Lactobacillus и Bifidobacterium, но являются специфическими для каждого штамма. Во время исследований проводят точное определение видов и штаммов для подтверждения их способности оказывать положительное воздействие. После приема продуктов, содержащих пробиотические штаммы, наблюдается много разных положительных эффектов. Ниже перечислены самые важные из них.

Положительное воздействие на кишечную микрофлору за счет стимулирования полезных бактерий и подавления болезнетворных микроорганизмов

Некоторые штаммы молочнокислых бактерий вырабатывают бактериоцины, которые уничтожают болезнетворные микроорганизмы, такие как Clostridium tyrobutiricum, St. aureus, Listeria monocytogenes и другие.

Выработка короткоцепочечных жирных кислот

В организме здорового человека вырабатывается приблизительно 400 мМ короткоцепочечных жирных кислот в сутки, самыми значимыми из которых являются: уксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота. Они оказывают положительное воздействие на pH кишечника. Обнаружено, что бутират снижает риск развития рака толстого кишечника путем ингибирования генотоксического эффекта нитрозаминов и пероксида водорода. Кроме того, масляная кислота индуцирует апоптоз в опухолевых клетках кишечника. Жирная кислота снижает экспрессию провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β, IL-6.

Стимулирование иммунного ответа путем иммуномодуляции и усиления наследственного иммунитета

Пробиотические бактерии регулируют тонкий баланс между необходимым и чрезмерным иммунным ответом. Пробиотические штаммы, стимулирующие индукцию IL-10, являются подходящими для людей, страдающих воспалительными заболеваниями кишечника. Иммуномодулирующий эффект является штаммоспецифическим. Исследованы некоторые штаммы молочнокислых бактерий и бифидобактерий, ведущие к снижению TNF-α и к повышению IL-10 (McCarthy, 2003).

Улучшение всасывания питательных веществ в макроорганизме

Молочнокислые бактерии и бифидобактерии обладают бета-галактозидазной активностью, снижая, таким образом, концентрацию лактозы. Это является преимуществом для людей, страдающих непереносимостью лактозы. Важным фактором является указанная выше выработка некоторыми штаммами бифидобактерий витаминов B-группы. Молочнокислые бактерии вносят вклад в деградацию белков с помощью своих протеолитических комплексов и, таким образом, участвуют в процессе абсорбции белков человеческим организмом. Некоторые бифидобактерии способны ассимилировать неорганический азот и, соответственно, снижать концентрацию аммиака, который при достижении высоких уровней может быть канцерогенным.

Антиоксидантный эффект

Повышенное накопление радикалов кислорода в тканях может нанести вред клеткам. Образование активного кислорода может быть связано с такими факторами, как прием определенных лекарственных средств, повышенное употребление алкоголя, стресс и др. Увеличение уровней окисления может быть связано с определенными нарушениями пищеварительной системы, а также с возрастом, атеросклерозом, раковыми заболеваниями и т.п. У организма есть несколько видов систем защиты от токсического кислорода, но для улучшения функционирования этих систем важно употреблять антиоксиданты. Некоторые микроорганизмы вырабатывают антиоксидантные ферменты, такие как СОД (супероксиддисмутазы), каталазы, глутатионредуктазы и другие.

Снижение сывороточного холестерина

Холестерин синтезируется в клетках кишечника и высвобождается в кишечный тракт. Часть холестерина поставляется из желчи и пищи. Микрофлора влияет на уровень холестерина. Некоторые микроорганизмы разлагают соли желчных кислот, утилизируя таурин и глицин. Из-за этого циркуляция солей желчных кислот нарушается, и печень начинает вырабатывать дополнительный холестерин для синтеза новых солей желчных кислот, что приводит к повышению сывороточного холестерина. Gilliland et al. (1985) изучали способность штамма L. Acidophilus к ассимиляции холестерина.

Секреция биоактивных пептидов с антигипертензивной активностью и пептидов, повышающих абсорбцию кальция и магния

Разлагая молочные белки, молочнокислые бактерии образуют пептиды с низкой молекулярной массой. Было обнаружено, что некоторые из них вырабатывают ангиотензин-конвертирующий фермент (АКФ). АКФ разрезает дипептид ангиотензина I, преобразуя его в ангиотензин II (вазоконстриктор, индуцирующий выработку альдостерона), что ведет к повышению концентрации ионов натрия и к повышению артериального давления. Лучше всего изучен антигипертензивный эффект олигопептидов Ile-Pro-Pro и Val-Pro-Pro, которые высвобождаются вследствие протеолитической активности определенных штаммов L. helveticus. Они вызывают сильное ингибирование АКФ. Антигипертензивный эффект подтвержден клиническими испытаниями.

В настоящее время существует несколько успешно применяющихся коммерческих пробиотиков, таких как L. rhamnosus GG (Saxelin M., Lactobacillus GG - a human probiotic strain with thorough clinical documentation. Food Rev Int 1997, 13:293-313). Другим коммерческим пробиотиком является L. Fermentum 39, который используют для стабилизации кишечной микрофлоры в период дисбактериоза (1).

Бактериальный штамм Lactobacillus fermentum ME3 обладает СОД-активностью и отрицательно воздействует на патогены (Mikelsaar et al., 2007).

Важней задачей является определение и выбор пробиотических штаммов молочнокислых бактерий и применение их при получении полибактериального препарата с рядом полезных свойств, таких как повышенная жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте, антиоксидантные эффекты, сильная адгезия к эпителиальному слою кишечника, способность снижать холестерин, иммуномодулирующие и противовоспалительные эффекты и способность ингибировать АКФ.

Описание изобретения

Задачей настоящего изобретения является определение и выбор штаммов молочнокислых бактерий с преимущественными для здоровья свойствами, которые будут использовать для получения пробиотического средства, обладающего рядом функциональных эффектов.

Пробиотический препарат, который относится к настоящему изобретению, представляет собой полибактериальную комбинацию, состоящую из трех пробиотических штаммов молочнокислых бактерий: Lactobacillus gasseri 7/12, депонированный под номером 8720 в National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures (NBIMCC), Lactobacillus plantarum F12, депонированный под номером 8722 в NBIMCC, и Lactobacillus helveticus A1, депонированный под номером 8721 в NBIMCC. Продукт обладает рядом благоприятных для здоровья свойств: антиоксидантным эффектом; способностью снижать концентрацию холестерина вследствие гидролиза солей желчных кислот и непосредственной абсорбции холестерина; противовоспалительным иммуномодулирующим воздействием за счет снижения уровня провоспалительного цитокина IL-8; способностью высвобождать биоактивные пептиды, ингибирующие ферменты (АКФ), вызывающие высокое артериальное давление.

Настоящее изобретение также относится к новым штаммам Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720, Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No. 8722 и Lactobacillus helveticus A1 NBIMCC No. 8721 и их благоприятным свойствам.

Пробиотический штамм Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No. 8722 обладает как антиоксидантной активностью, так и способностью к значительной адгезии к эпителиальным клеткам.

Пробиотический штамм Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720 обладает рядом следующих полезных свойств: высокой жизнеспособностью в желудочно-кишечном тракте, способностью к значительной адгезии к эпителиальному слою кишечника, способностью снижать уровень холестерина, противовоспалительным воздействием за счет снижения уровня провоспалительного цитокина IL-8.

Пробиотический штамм Lactobacillus helveticus A1 NBIMCC No. 8721 обладает сильным анти-АКФ эффектом.

Настоящее изобретение относится к применению новых пробиотических штаммов и пробиотического полибактериального препарата в фармацевтической и пищевой промышленностях в целях предотвращения социально значимых заболеваний, таких как: гипертензия, атеросклероз и гиперхолестеринемия, сниженный иммунитет, воспалительные процессы кишечного тракта и нарушение баланса кишечной микрофлоры.

Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720 и Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No. 8722 выделяли из кишечных трактов здоровых добровольцев. Штамм Lactobacillus helveticus A1 NBIMCC No. 8721 выделяли из домашнего белого сыра, что подтверждает его статус GRAS (т.е. он признан безопасным). Подтверждение видовой и штаммовой принадлежности данных трех штаммов проводили путем применения методик точного анализа ДНК (2), секвенирования 16S рибосомальных генов, рестрикционного анализа амплифицированной рибосомальной ДНК, пульс-электрофореза и анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов.

Фенотипическую идентификацию трех штаммов проводили с использованием API 50 CHL System (BioMerieux, Франция).

Штаммы определяли молекулярными методиками путем анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов и пульс-электрофореза. Две основные методики, которые использовали для идентификации трех штаммов и для получения штаммоспецифических ДНК профилей, описаны в указанной выше статье (Dimitrov Zh. et al., 2008). На фиг.1 представлен пульс-электрофоретический профиль ДНК Lactobacillus plantarum F12, NBIMCC No. 8722, на фиг.2 представлен пульс-электрофоретический профиль ДНК Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720, на фиг.3 представлен пульс-электрофоретический профиль ДНК Lactobacillus helveticus A1 NBIMCC No. 8721.

Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No. 8722 формирует белые S-колонии размером 1-2 мм. Бактериальные клетки короткие (от 0,9 до 1,2×3-8 мкм), с закругленными углами. Основной средой для культивирования является бульон и агар MRS (OXOID). Идентификацию штамма проводят согласно Bergey's Manual (2009), используя онлайн базу данных Api (API 50CHL strips) и базу данных MicroLog M5.1.1 (Biolog AN Microplate). Профиль по рестрикционному анализу амплифицированной рибосомальной ДНК является типичным для штаммов L. plantarum. Профиль растворимых клеточных белков идентичен профилю L. plantarum (ATCC). Lactobacillus gasseri 7/12 выращивали на бульоне MRS после инокуляции 0,1%. Культивирование проводят при 37°C в течение приблизительно 18-24 часов. Среда и атмосферный воздух не нуждаются в предварительной анаэробизации для культивирования. Штамм развивается в течение 48 часов в анаэробных условиях на агаре MRS.

Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720 формирует белые S-колонии размером 1-2 мм. Бактериальные клетки короткие (0,6-0,8×3,0-5,0 мкм), с закругленными углами. Основной средой для культивирования является бульон и агар MRS (OXOID). Идентификацию штамма проводят согласно Bergey's Manual (2009), используя онлайн базу данных Api (API 50CHL strips) и базу данных MicroLog M5.1.1 (Biolog AN Microplate). Профиль по рестрикционному анализу амплифицированной рибосомальной ДНК является типичным для штаммов L. gasseri. Профиль растворимых клеточных белков идентичен профилю L. gasseri 33323 (ATCC). Lactobacillus gasseri 7/12 выращивали на бульоне MRS после инокуляции 0,1%. Культивирование проводят при 37°C в течение приблизительно 18-24 часов. Среда и атмосферный воздух не нуждаются в предварительной анаэробизации для культивирования. Штамм развивается в течение 48 часов в анаэробных условиях на агаре MRS.

Lactobacillus helveticus A1 NBIMCC No. 8721 формирует белые R-колонии размером 1-2 мм. Бактериальные клетки имеют длину 3,0-5,0 мкм. Базовыми средами для культивирования являются бульон и агар MRS (OXOID) и стерильное обезжиренное молоко для микробиологических исследований, с 10% сухого вещества (OXOID). Идентификацию штамма проводят согласно Bergey's Manual (2009), используя онлайн базу данных Api (API 50CHL strips) и базу данных MicroLog M5.1.1 (Biolog AN Microplate). Профиль по рестрикционному анализу амплифицированной рибосомальной ДНК является типичным для штаммов L. helveticus. Профиль растворимых клеточных белков идентичен профилю L. helveticus 33323 (ATCC). Lactobacillus helveticus A1 растет на бульоне MRS после инокуляции 0,1%. Культивирование проводят при 37°C в течение приблизительно 18-24 часов. Среда и атмосферный воздух не нуждаются в предварительной анаэробизации для культивирования. Штамм развивается в течение 48 часов в анаэробных условиях на агаре MRS. Штамм развивается на стерильном обезжиренном молоке после инокуляции 0,1%, его культивируют при 37°C в течение 18-24 часов.

Функциональные свойства штамма Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No. 8722

Выявление антиоксидантного эффекта

Штамм L. plantarum F12 обладает антиоксидантными свойствами и благодаря этому был выбран из более чем 400 молочнокислых бактерий. Для того чтобы выбрать штаммы по признаку наличия антиоксидантных свойств, штаммы инкубируют в бульоне MRS в течение 24 часов и центрифугируют при 3500 g в течение 10 минут при 4°C. После отмывания физиологическим раствором клетки ресуспендируют в 1,15% KCl до концентрации 1×109 клеток на 1 мл. Клетки в суспензии подвергают разрушению ультразвуком (Branson B-12 Sonic Power Company) в течение 5 минут на ледяной бане, после чего оставляют на 10 минут при -20°C. Суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант используют в качестве внеклеточного экстракта. Определяют три типа активности.

Полная антиоксидантная активность ORAC

Главным способом выявления полной антиоксидантной активности является ORAC (способность абсорбировать радикалы кислорода). Результаты представлены в эквивалентах TROLOX для 109 бактериальных клеток. Применяли способ The Cao et al. (1995). Его принцип состоит в следующем: субстрат OI-фикоэритрин (Sigma Chemical Co.) подвергают оксидантной атаке генератором радикалов 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорида (AAPH; Waco Chemical USA). Стандартный раствор TROLOX (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота, Trolox; Олдрич) получают растворением 5 мг вещества в 200 мл 0,2M фосфатного буфера (базовый раствор). Рабочий раствор получают путем смешивания 1 мл базового раствора с 9 мл фосфатного буфера.

В присутствии образца с антиоксидантным свойствами окисление фикоэритрина снижается до некоторого уровня. Относительную флуоресценцию измеряют в течение 60 минут, используя длину волн 535 нм для возбуждения и 595 нм для эмиссии, соответственно. Используют следующую формулу:

Значение ORAC=X K(S_{образец}-S_{контроль})/(S_trolox-S_{контроль})

где X - объем образца в микролитрах, и K - коэффициент растворения, S - площадь под кривой флуоресценции.

Полная антирадикальная активность

Наличие веществ, захватывающих свободные радикалы, выявляют в каждом штамме на основании уровня снижения интенсивности окраски соединения 1,1-дифенил-2-пикрилгидразина (DPPH). Мера активности захвата радикалов пропорциональна уровню обесцвечивания фиолетового цвета DPPH. Молоко, ферментированное соответствующим штаммом, центрифугируют, и супернатант экстрагируют простым диэтиловым эфиром. Затем слой простого эфира выпаривают и растворяют остаток в метаноле. 0,1 мл полученного раствора смешивают с 1,4 мл раствора DPPH (40 мкг/мл в метаноле). Активность захвата радикалов определяют как разницу между оптической плотностью на 517 нм между пустым образцом и исследуемым образцом [A517 (пустой)-A517 (образец)].

Активность СОД

Тест выполняют в соответствии с Chang и Hasan, 1997. Штаммы выращивают на бульоне (М17 для стрептококков, MRS для молочнокислых бактерий) и после инкубации культуры центрифугируют, отмывают фосфатным буфером с 0,1 мМ EDTA, pH 7,8, ресуспендируют в том же буфере и затем разрушают ультразвуком. Центрифугируют при 17000 g и проводят диализ против указанного выше фосфатного буфера в течение 24 часов. Снова центрифугируют при 20000 g. Общую концентрацию белков внеклеточного экстракта определяют согласно способу Лоури. Оба вида ферментативной активности определяют с использованием специальных тестовых наборов (SIGMA) по инструкциям производителя. СОД определяют способом, связанным с цитохромом C, в системе конъюгированных ферментов с ксантиноксидазой. Принцип состоит в следующем: ксантиноксидаза окисляет ксантин, при этом восстанавливается цитохром C. В присутствии образца с активностью СОД восстановление цитохрома C частично ингибируется, поскольку два протона связываются с супероксидным радикалом из СОД вместо того, чтобы осуществить переход на цитохром C.

В таблице 1 представлены результаты выявления разных антиоксидантных активностей: общая антиоксидантная активность на основании теста ORAC, общая антирадикальная активность и активность СОД.

Таблица 1 Активность Интактные клетки Внеклеточный экстракт Общая антиоксидантная активность ORAC, эквив. trolox/10⁹ клеток 1488±72
n=5 1764±110
n=5 Общая антирадикальная активность,
A517(пустой)-A517(образец) 0,19±0,02
n=5 0,32±0,04
n=5 Активность супероксиддисмутазы 3,84±2,4
ед./мг белка
n=3

Существенная общая антиоксидантная активность обнаружена как в интактных клетках штамма L. plantarum F12, так и во внеклеточном экстракте. По активности СОД внеклеточный экстракт данного штамма опережает все протестированные виды молочнокислых бактерий.

Выявление адгезии к эпителиальным клеткам

Эпителиальные клеточные линии Caco-2 и HT29 культивируют в виде монослоя на среде DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла, Gibco, Великобритания), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку в насыщенной водой атмосфере, содержащей 5% CO₂. После заполнения приблизительно 90% поверхности монослоем клетки подвергают пассированию инкубацией с раствором, содержащим 0,25% трипсина и 10 мМ EDTA, в течение 10 минут при 37°C. Для того чтобы выявить степень адгезии, эукариотические клетки высевают в 6-луночный планшет для культивирования при концентрации 2×10⁵ клеток/мл. Среду заменяют каждые 2 суток в течение 10 суток, пока создается монослой (3-4 суток) и развиваются клеточные рецепторы. После адгезии монослои дважды отмывают буфером PBS. Бактерии, культивированные при концентрации 10⁸ клеток/мл в 2 мл DMEM без антибиотиков, добавляют к монослоям. Проводят инкубацию в течение 60 минут при 37°C в насыщенной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Лунки отмывают пять раз PBS и фиксируют метанолом в течение 3 минут. Далее проводят окрашивание по Граму и анализ адгезии способами микроскопии. Считают количество бактерий, прикрепившихся к 20 эпителиальным клеткам. Тестирование включает оценку 10 зон.

На фиг.4 представлена фотография адгезии штамма L. plantarum F12 к эпителиальным клеткам Caco-2. Результаты по адгезии штамма, выраженные в среднем числе бактерий, прикрепившихся к эукариотической клетке, представлены в таблице 2. Тестирование проводили три раза для того, чтобы оценить адгезию к обоим клеточным линиям Caco-2 и HT-29, соответственно, и результаты были усреднены.

Таблица 2 Штамм Среднее число бактерий, прикрепившихся к эукариотической клетке Caco-2 Среднее число бактерий, прикрепившихся к эукариотической клетке HT-29 L. plantarum F12 25 29

Выявление адгезии к эпителиальным клеткам

Способ показан выше. На фиг.5 представлена фотография адгезии штамма L. gasseri 7/12 к эпителиальным клеткам Caco-2. Результаты по адгезии штамма, выраженные в среднем числе бактерий, прикрепившихся к эукариотической клетке, представлены в таблице 3. Тестирование проводили три раза для того, чтобы оценить адгезии к обоим клеточным линиям Caco-2 и HT-29, соответственно, а результаты были усреднены.

Таблица 3 Штамм Среднее число бактерий, прикрепившихся к эукариотической клетке Caco-2 Среднее число бактерий, прикрепившихся к эукариотической клетке HT-29 L. gaseri 7/12 20 22

Выявление противовоспалительного иммуномодулирующего эффекта

Усиление выработки воспалительных цитокинов крайне нежелательно для людей, страдающих воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК). Синтез воспалительных цитокинов ингибируется сигнальным пептидом интерлейкином-10 (IL-10), который вырабатывается необученными Т-лейкоцитами или макрофагами. Подтверждено, что клеточная линия моноцитов человека U-937 является подходящей не только для оценки индукции цитотоксических TNF-α и IL-1, но также для выявления индукции сигнального пептида IL-10.

Количественная оценка экспрессии двух сигнальных пептидов TNF-α и IL-10 антигенпрезентирующих клеток используется для оценки иммуномодулирующего эффекта: дифференцированные макрофаги клеточной линии моноцитов человека U-937 (ATCC). Клеточную линию поддерживают при 37°C и 5% CO₂ в среде RPMI 1640 (ATCC 30-2001), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (ATCC 30-2020), 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Концентрация поддерживается в диапазоне от 2×10⁵ до 1×10⁶ клеток на миллилитр. По достижении плотности приблизительно 1×10⁶ клетки центрифугируют и среду обновляют. Содержание клеток, определенное с использованием цитометра, составляет 2×10⁵. На 48-луночном планшете для культивирования 1×10⁶ клеток на миллилитр (5×105 на лунку) можно дифференцировать в макрофаги с помощью 5 мкг/мл PMA (форбол 12-миристат-13-ацетат, SIGMA), который добавляют в среду для выращивания в течение 48 часов в инкубаторе CO₂. Дифференцированные прикрепившиеся макрофаги дважды отмывают буфером PBS (забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко, GibcoBRL) и инкубируют со свежей средой в течение 48 часов без PMA. После удаления среды в каждую лунку с прикрепившимися макрофагами добавляют 0,5 мл бактериальных клеток с концентрацией 1×106 на мл и суспендируют в среде для выращивания макрофагов. Клетки инкубируют в течение 24 часов в инкубаторе CO₂.

Индукцию сигнального пептида TNF-α молочнокислыми бактериями исследуют с помощью сэндвич-анализа ELISA. Под конец инкубации супернатант собирают и центрифугируют для удаления бактериальных и человеческих клеток. 200 мкл итоговых супернатантов используют для выявления TNF-α с использованием специального набора R&D Systems (Human TNF-α/TNFSFIA Immunoassay, Cat. # DTA00C), по инструкциям производителя. Кратко: лунки покрывают моноклональным антителом против человеческого TNF-α, которое специальным образом связывается с TNF-α. После отмывания лунки обрабатывают поликлональным антителом против TNF-α, которое связано с ферментом пероксидаза хрена. Затем добавляют субстраты, пероксид водорода и тетраметилбензидин, и после ферментативной реакции при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте добавляют 2-нормальную серную кислоту. Уровень абсорбции измеряют при 450 нм. Для вычисления концентрации TNF-α используют стандартные образцы и строят стандартную кривую.

Индукцию сигнального пептида IL-6 молочнокислыми бактерии исследуют с применением сэндвич-анализа ELISA. Принцип детекции аналогичен указанному выше способу. Во время исследования используют аналитический набор ELISA и проводят количественный анализ согласно инструкциям производителя.

Индукцию сигнального пептида IL-10 молочнокислыми бактерии исследуют с применением сэндвич-анализа ELISA. Во время исследования используют аналитический набор ELISA и проводят количественный анализ согласно инструкциям производителя.

Анализ пяти цитокинов TGF-β, IL-8, IL-6, IL-10 и TNF-α для каждого изолята штаммов проводят три раза. В таблице 4 приведены средние результаты по индукции для пяти цитокинов. Штамм L. gasseri 7/12, который обладает средней способностью к адгезии, проявляет самую большую противовоспалительную активность среди всех исследуемых объектов. Уровень корреляции между IL-10 и TNF-α у него высокий, существенно снижение IL-8 и TGF-β, но значительной индукции IL-6 не наблюдается. Провоспалительный цитокин IL-8 синтезируется эпителиальными клетками. Для исследования использовали клеточные линии Caco-2 и HT-29. Повышение уровня IL-8 может вести к увеличению активности нейтрофильных клеток и, таким образом, к увеличению воспалительных процессов в кишечнике. Открытие штаммов, которые способны снижать уровень IL-8, играет огромную роль для разработки бактериальных препаратов для предотвращения воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Штамм L. gasseri 7/12, в связи с этим, особенно ценен. Результаты стимуляции эпителиальных клеток L. gasseri 7/12 представлены в таблице 5.

Таблица 4 Штамм IL-10 нг/мл TNF-α нг/мл TGF-β нг/мл IL-6 нг/мл Контроль (U-937) 0,10 1,2 0,88 27,2 L. gasseri 7/12 2,3 0,7 0,82 28,7

Таблица 5 Штамм IL-8 нг/мл TGF-β нг/мл Контроль (HT-29) 8,7 0,37 L. gasseri 7/12 6,2 0,30

Анализ способности к снижению уровня холестерина

Активность гидролазы желчных солей (BSH)

Штаммы выращивают в оптимальных условиях на бульонных средах, как указано выше, но в бульоны добавляют две самые важные соли желчных кислот: таурохолат натрия (TCA) и гликохолат натрия (GCA). Концентрация солей составляет 1 мМ. Их добавляют после стерилизации бульона путем микрофильтрации. Инокулят составляет 1%, и время инкубации составляет 24 часа. Неинокулированный бульон используют в качестве контроля. Активность BSH измеряют в деконъюгированных наномолях TCA и GCA за 1 минуту. Способом определения является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Используют колонки Ultrasphere ODS, 80 ангстрем, 15 см, с зернами наполнителя диаметром 3 мкм. Для SHIMADZU УФ-детектора используют настройку 210 нм. Свободные и конъюгированные желчные кислоты выявляют методом обратно-фазовой градиентной хроматографии. Растворителем A является 65% метанол в 0,03M ацетате натрия с pH 4,3, который доводят фосфорной кислотой. Растворителем B является метанол качества ВЭЖХ. Схема элюирования составляет изократическую ступень в течение 8 минут при 15% элюировании и последующего элюирования при градиентном режиме при 85% в течение 17 минут. Затем следует изократическая ступень в течение 5 минут при 85%. Объем введения составляет 10 мкл. Активность BSH выражают в микромолях холевой кислоты (ХА), вырабатываемых 10¹⁰ клетками в минуту после 24 часов инкубации.

Непосредственное снижение холестерина

Штаммы инокулируют при концентрации 1% в указанную ниже среду на 24 часа. Бульонная среда содержит 0,3% Oxgal и 100 мкг водорастворимого холестерина на миллилитр (cholesterol-PEG600, SIGMA). После инкубации клетки осаждают центрифугированием, и 0,5 мл супернатанта обрабатывают 4 мл метанольного 2M KOH при нагревании в течение 20 минут до 80°C. Затем его экстрагируют 5 мл гексана и 4 мл гексанового слоя переносят в тестовые пробирки и выпаривают в атмосфере азота при 60°C. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл изопропанола и определяют содержание в нем холестерина с использованием аналитического набора Boeringer Manhaim. Уровень снижения холестерина определяют путем сравнения с неинокулированной контрольной средой.

Два главных исследуемых вида активности, имеющих отношение к снижению холестерина, это непосредственное снижение уровня холестерина и непрямое снижение уровня холестерина в сыворотке как следствие деконъюгирующей активности по отношению к солям желчных кислот (BSH). При прямом снижении холестерина, происходящем, как правило, вследствие абсорбции в компоненты клеточных стенок микроорганизмов, остаточный холестерин определяют, как указано в описанном выше способе. Измерение концентрации холестерина проводят с применением ферментативного теста. Измерения проводят три раза и результаты усредняют. В таблице 6 представлены результаты прямой антихолестериновой активности, выраженной в процентном снижении уровня холестерина.

Таблица 6 Штамм Снижение холестерина в % L. gasseri 7/12 36,2

Деконъюгирующая BSH активность косвенным образом влияет на уровень холестерина в сыворотке. Штаммы с BSH активностью гидролизуют соли желчных кислот, а затем деконъюгированные соли желчных кислот переносятся к выходу из кишечного тракта. Соли желчных кислот в организме возобновляются, и, как следствие снижения их концентрации в печени, часть холестерина направляется на синтез желчных кислот и, соответственно, солей желчных кислот (соединений желчных кислот с аминокислотами таурином и глицином). Уровень холестерина в сыворотке, таким образом, должен снижаться. В таблице 7 представлены результаты BSH активности в L. gasseri 7/12 после троекратного тестирования и усреднения результатов.

Таблица 7 Штамм Деконъюгация желчных солей в % L. gasseri 7/12 60,1

Функциональные свойства штамма L. helveticus A1 NBIMCC No. 8721

Определение способности к секреции биоактивных АКФ-ингибирующих пептидов

АКФ-ингибирующая активность

Очищенные штаммы с инокулятом 0,1% инкубируют в течение 18 часов в 9% обезжиренном молоке при 37°С. После доведения pH до 4,3 50% молочной кислотой образцы центрифугируют (5000 g, 10 минут). Супернатант помещают на обратно-фазовый картридж и отмывают водой. Затем следует элюирование 60% ацетонитрилом с 0,1% трифторуксусной кислотой и выпаривание, и растворение полученного экстракта. Экстракт и его растворы анализируют на ингибирующую активность АКФ.

Получают общий белковый экстракт. Ферментативную реакцию проводят с помощью традиционного тестирования, но используя разные разведения экстракта пептидов объемом по 20 мкл. Ферментный раствор составлял 40 мкл и обладал активностью 0,1 ед./мл. Субстрат гипурил-гистидил-лейцин растворяют в боратном буфере с pH 8,3 и получают объем 190 мкл. Конечная концентрация субстрата составляет 6 мМ, и конечная концентрация хлорида натрия составляет 300 мМ. Реакцию проводят при 37°C в течение 30 минут. Схватывание проводят с использованием 100 мкл 4-нормальной HCl, и экстракцию высвобожденной гипурровой кислоты проводят 1 мл этилацетата. После выпаривания растворителя остаток растворяют в 1 мл воды и проводят спектрофотометрический анализ при 228 нм.

Уровень ингибирования АКФ получают согласно следующей формуле:

В-А * 100 В-с

где A - оптическая плотность образца после проведения вышеуказанных процедур, C - оптическая плотность без фермента, B - оптическая плотность без участия пептидных экстрактов.

По оси абсцисс построенных графиков отложено количество пептидного экстракта в микролитрах - 20, 10, 5, по оси ординат отложен уровень ингибирования в процентах. Уровень ингибирующего воздействия оценивают с помощью графиков, измеряя объем пептидного экстракта, вызывающего 50% ингибирование АКФ. Чем меньше данный объем, тем больше АКФ-ингибирующая активность продукта. В таблице 8 представлены важные пептидазные активности штамма L. helveticus A1, которые, как правило, являются следствием способности штамма вырабатывать биоактивные пептиды. В таблице 9 представлены данные по АКФ-ингибирующей активности L. helveticus A1 в процентах ингибирования АКФ, округленные до ближайшего целого.

Таблица 8 Штамм Аминопептидаза N (PepN) X-пролиламинопептидаза (PepX) Глутамиламинопептидаза (PepA) Пролилиминопептидаза (PIP) Олигопептидаза Эндопептидаза Протеаза L. helveticus A1 690 405 3 14 7 2 10

Таблица 9 Штамм АКФ-ингибирование в % L. helveticus A1 88

Для L. helveticus A1 представлен график (фиг.5), описывающий ингибирующее действие разведений 1/2 и 1/4 исследуемых супернатантов. Основной задачей является определение силы оказываемого на разведенные образцы анти-АКФ эффекта. По оси абсцисс отложено количество используемого в эксперименте супернатанта в микролитрах, по оси ординат показан уровень ингибирования АКФ в процентах.

Результаты показывают, что штамм L. helveticus A1 обладает сильным анти-АКФ эффектом.

Определение последовательности АКФ-ингибирующих пептидов в штамме L. helveticus A1

Получение концентрированного пептидного экстракта

Супернатанты каждого штамма подвергают ультрацентрифугированию с помощью специальных картриджей для ультрафильтрации, с молекулярным массовым порогом 5000 Да. Низкая молекулярная масса гидрофобных пептидов малой и средней молекулярной массы, среди которых, как правило, ищут анти-АКФ представителей, концентрируются на обратно-фазовых картриджах. Например, после ультрафильтрации к образцам добавляют трифторуксусную кислоту до 0,1%, и пропускают смесь сквозь картриджи. Пептиды задерживаются на них. После отмывания 0,1% ТФК проводят элюирование пептидов с низкой молекулярной массой 60% ацетонитрилом в 0,1% ТФК. После выпаривания пептиды ресуспендируют в 10% ацетонитриле в 0,1% ТФК и помещают в обратно-фазовую препаративную колонку для ВЭЖХ Nucleosil C18. Прибор для высокоэффективной жидкостной хроматографии SHIMADZU оборудован двумя насосами, модулем с ВЭЖХ колонкой, который способен поддерживать определенную температуру, детектором абсорбции и коллектором для фракций.

Все препараты подвергают анализу на анти-АКФ активность для получения соответствующих данных по активности.

Грубое фракционирование концентратов пептида после хроматографического разделения

Образцы вносят в колонку ВЭЖХ, как указано выше, и подвергают обратно-фазовому градиентному фракционированию. Градиент ацетонитрила составляет от 0% до 80% в 0,1% ТФК. Пептиды определяют при длине волны 214 нм. С помощью коллектора фракций собирают фракции по 1 мл. После грубого фракционирования эти фракции испаряют в вакуумной центрифуге и ресуспендируют в 0,1% ТФК. Анти-АКФ активность фракций исследуют для того, чтобы отобрать те фракции, у которых она проявится. На фиг.6 представлены хроматограммы, демонстрирующие грубое фракционирование пептидных концентратов штамма L. helveticus A1.

Рефракционирование выбранных фракций для получения очищенных пептидов после высокоэффективной жидкостной хроматографии

Тонкое методическое фракционирование проводят по той же схеме, как и грубое фракционирование, то есть обратно-фазовым способом, но угол наклона градиента меньше. Градуирование фракций штамма L. helveticus A1 проводят в 25-35% ацетонитриле. Используют полупрепаративную колонку Nucleodur Sphinx.

На фиг.7 приведена хроматограмма тонкого обратно-фазового рефракционирования образцов из заранее выбранных грубых фракций штамма L. helveticus A1. Фракция с анти-АКФ активностью, подтвержденной ферментативным тестированием на ингибирование АКФ, помечена жирной линией. Последним шагом очистки выбранных пептидных фракций является очистка с использованием ионно-обменной ВЭЖХ колонки. Колонкой является высококислотная катионообменная колонка с бензолсульфонатным ионно-активными группами в литиевых формах. Элюирование достигается за счет градиента pH в цитратном буфере от pH 3,0 до pH 9,0.

На фиг.7 приведена хроматограмма ионно-обменной обработки заранее выбранной фракции с анти-АКФ активностью штамма L. helveticus A1. Жирной линией выделен единственный пептид с анти-АКФ активностью.

Секвенирование пептида

Принципом секвенирования служит классическая схема ручного секвенирования с фенилизотиоцианатом, начиная с фенилизотиоцианата: начальная дериватизация N-конца пептида; отрезание деривативной N-концевой аминокислоты (CA) при использовании 100% трифторуксусной кислоты (ТФК); отделение путем экстракции деривативной N-концевой аминокислоты от остального пептида; конверсия N-концевой аминокислоты в фенилтиогидантоиновое производное путем обработки 40% ТФК; ВЭЖХ анализ ФТГ-аминокислоты; повторение цикла для новой N-концевой аминокислоты. В случае малых гидрофобных пептидов шаг экстракции с отделением деривативной N-концевой аминокислоты от остального пептида невозможен. Его можно осуществить путем предварительной фиксации C-концевого пептида на ариламин-PVDF мембрану. Таким образом, пептид может быть секвенирован до конечной C-концевой аминокислоты, начиная с N-конца. Фиксация пептида с С-конца возможна после активации С-конца путем обработки его EDC (этилдиметиламинопропилкарбодиимидом) и последующего взаимодействия активированной карбоксильной группы с молекулой ариламина мембраны. В таблице 10 представлена последовательность анти-АКФ пептидов, вырабатываемых штаммом L. helveticus A1

Таблица 10 Штамм Анти-АКФ-активность Последовательность пептида L. helveticus A1 78,0 Ala-Leu-Pro-Met

Описание фигур

Фиг.1: Пульс-электрофоретический штаммоспецифический ДНК профиль L. plantarum F12 после гидролиза ферментом XhoI, импульсы 1 сек-12 сек в течение 24 часов при 5 вольтах/сантиметр. Молекулярный маркер - λ-DNA HindIII (0,1-200 т.п.н.).

Фиг.2: Пульс-электрофоретический штаммоспецифический ДНК профиль L. gasseri 7/12 после гидролиза ферментом ApaI, импульсы 2 сек-28 сек в течение 24 часов при 5 вольтах/сантиметр. Молекулярный маркер - λ-Ladder ДНК (50-1000 т.п.н.).

Фиг.3: Пульс-электрофоретический штаммоспецифический ДНК профиль L.helveticus A1 после гидролиза ферментом SmaI, импульсы 5 сек-30 сек в течение 26 часов при 5,2 вольтах/сантиметр. Молекулярный маркер - λ-Ladder DNA (50-1000 т.п.н.) и λ-DNA HindIII (0,1-200 т.п.н.).

Фиг.4: Адгезия L. plantarum F12 к эпителиальным клеткам Caco-2.

Фиг.5: График АКФ-ингибирующего воздействия L. helveticus A1. По оси абсцисс отложено количество пептидного экстракта в микролитрах, по оси ординат - уровень АКФ-ингибирования в процентах.

Фиг.6: Грубое фракционирование пептидного концентрата пептид L. helveticus A1.

Фиг.7: Тонкая обратно-фазовая очистка полученной предварительным фракционированием фракции пептида штамма L. helveticus A1 с самой высокой анти-АКФ активностью.

Фиг.8: Ионно-обменная очистка активной полученной предварительной очисткой фракции активного пептида штамма L. helveticus A1.

Способ осуществления изобретения

Полибактериальный препарат содержит лиофилизированые штаммы Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720, Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No. 8722 и Lactobacillus helveticus A1 NBIMCC No. 8721. Три штамма выращивают раздельно в лабораторных ферментативных камерах, каждая имеет объем 5 литров, биомасса аккумулируется в них в молочной среде, гидролизованной щелочной протеазой, за счет добавления 0,2% автолизата дрожжей в качестве питания, причем объем инокулята составляет 1%, и pH поддерживают на уровне 5,7 гидроксидом натрия. Инкубацию продолжают до начала стационарной фазы. Три культуры на данной стадии представляют собой обогащенную биомассу, включающую приблизительно 109 клеток Lactobacillus plantarum F12 и Lactobacillus helveticus A1, и 2×l0⁸ клеток Lactobacillus gasseri 7/12; в молочную среду, гидролизованную щелочной протеазой, с добавлением 0,2% автолизата дрожжей в качестве питания, инокулируют промышленный ферментирующий агент, объем инокулята составляет 2%. pH поддерживают на уровне 5,7 с использованием гидроксида натрия. Полученные биологические смеси трех штаммов помещают в промышленный лиофилизатор. Сублимационную сушку проводят при температуре от -28 до -29°C. Конечное нагревание осуществляют до 30°C. Остаточная влага составляет 4%. Смесь пакуют в инертной (азотной) атмосфере. Принимают специальные меры для снижения смертности штаммов во время технологических циклов. Условия ферментации, лиофилизации и упаковки оптимизированы. Жизнеспособность и активность штаммов контролируют методами современной молекулярной биологии (ПЦР в реальном времени). Присутствие и мощность пробиотических эффектов выявляют, применяя высокоточные технологии высокоэффективной жидкостной хроматографии (гидролиз солей желчных кислот, анализ биоактивных пептидов), газовой хроматографии (выявление снижающей холестерин активности), ПЦР в реальном времени (выявление жизнеспособности и размера штаммов), спектрального анализа (определение антиоксидантной активности и выявление иммуномодулирующих активностей).

Готовый к использованию лиофилизированный полибактериальный препарат содержит живые бактерии (число живых клеток указывается на 1 г) трех пробиотических штаммов в количестве, по меньшей мере: 10⁹ клеток Lactobacillus gasseri 7/12, 2×l0⁹ клеток Lactobacillus helveticus A1, 9×l0⁹ клеток Lactobacillus plantarum F12.

В таблице 11 приведены результаты выявления специфических антиоксидантных активностей, таких как: общая антиоксидантная активность, общая антирадикальная активность, активность СОД итогового продукта.

Таблица 11 Активность Прикрепившиеся клетки Внеклеточный экстракт Общая антиоксидантная активность ORAC, эквив. Trolox/10⁹ клеток 1105±68
n=3 1320±95
n=3 Общая антирадикальная активность
А₅₁₇(пустой)-А₅₁₇(образец) 0,12±0,02
n=3 0,22±0,03
n=3 Активность супероксиддисмутазы 21,2±2,0
ед./мг белка
n=3

В таблице 12 и таблице 13 приведены уровни содержания цитокинов после индукции человеческих клеточных линий U-937 и HT-29 10⁸/мл бактериальными клетками препарата.

Таблица 12 Продукт IL-10 нг/мл TNF-α нг/мл TGF-β нг/мл IL-6 нг/мл Контроль (U-937) 0,11 0,22 0,90 25,1 Полибактериальный препарат 1,1 0,24 0,87 18,1

Таблица 13 Продукт IL-8 нг/мл TGF-β нг/мл Контроль (HT-29) 8,9 0,40 Полибактериальный препарат 7,7 0,35

В таблице 14 приведены уровни антихолестериновой активности полибактериального препарата, зависящие от его способности к гидролизу солей желчных кислот и снижению холестерина в процентном соотношении.

Таблица 14 Продукт Снижение холестерина в % Деконъюгация желчных солей в % Полибактериальный препарат 21,0 42,4

В таблице 15 приведены данные по АКФ-ингибирующей активности препарата.

Таблица 15 Продукт АКФ-ингибирование в % Полибактериальный препарат 65

Промышленная применимость

Полибактериальный препарат является лиофилизированной пищевой добавкой с уникальным сочетанием пробиотических свойств, подходящих для предотвращения социально значимых заболеваний, таких как гипертензия, атеросклероз и гиперхолестеринемия, сниженный иммунитет и воспалительные процессы в кишечном тракте, а также нарушение баланса кишечной микрофлоры. Для получения данного продукта необходимо применение сочетания сложного промышленного оборудования и высокотехнологичного исследовательского оборудования. Принцип получения продукта описан в примере.

Источники информации

1. PCT/SU89/00264, C12N1/20, A61K35/74, University of Tartu, 1991.

2. Dimitrov Zh. et al., 2008. Comparative evaluation of three molecular typing methods in their applicability to differentiate Lactobacillus strains with human origin. World Journal of Microbiology and Biotechnology 24: 1305-1312.

Группа изобретений относится к полибактериальному пробиотическому препарату, включающему новые штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720, Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No 8722 и Lactobacillus helveticus A1, NBIMCC No 8721, обладающему противовоспалительной иммуномодулирующей, гипохолестеринемической, антиоксидантной и антигипертензивной активностью. Группа изобретений относится также к применению препарата в качестве пробиотического средства, а также средства, обладающего противовоспалительной иммуномодулирующей, гипохолестеринемической, антиоксидантной и антигипертензивной активностью. Пищевые добавки, пищевые и функциональные продукты, фармацевтические препараты, включающие данный препарат, оказывают благотворное влияние на состояние здоровья людей и животных. 4 и 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 15 табл.

1. Полибактериальный пробиотический препарат, включающий комбинацию штаммов Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720, Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No. 8722, Lactobacillus helveticus Al NBIMCC No. 8721, и обладает противовоспалительной иммуномодулирующей активностью, гипохолестеринемической активностью, антиоксидантной активностью и антигипертензивной активностью.

2. Полибактериальный препарат по п. 1, содержащий живые клетки в следующем количестве, измеряемом в КОЕ/г для: Lactobacillus gasseri 7/12 - по меньшей мере 10⁹, Lactobacillus helveticus Al - по меньшей мере 2×10⁹ и Lactobacillus plantarum F12 - по меньшей мере 9×10⁹.

3. Полибактериальный препарат по п. 1, представленный в форме лиофилизата или жидкой культуры.

4. Способ получения полибактериального препарата по п. 1, включающий выращивание Lactobacillus gasseri 7/12 NBIMCC No. 8720, Lactobacillus plantarum F12 NBIMCC No. 8722 и Lactobacillus helveticus Al NBIMCC No. 8721 раздельно в молочной среде, гидролизованной щелочной протеазой, с добавлением 0,2% автолизата дрожжей в качестве питания, причем объем инокулята составляет 1%, и рН поддерживают на уровне 5,7 с помощью гидроксида натрия, и последующим культивированием комбинации трех монокультур, содержащих обогащенные биомассы Lactobacillus plantarum F12, Lactobacillus helveticus Al и Lactobacillus gasseri 7/12 в молочной среде, гидролизованной щелочной протеазой, с добавлением 0,2% автолизата дрожжей в качестве питания, причем объем инокулята составляет 2%, и рН поддерживают на уровне 5,7 с помощью гидроксида натрия.

5. Применение полибактериального препарата по п. 1 в качестве пробиотического средства.

6. Применение полибактериального препарата по п. 5 в качестве пищевой добавки и/или включения в любую форму пищи для людей и животных.

7. Применение полибактериального препарата по п. 5 для получения стартовых культур для пищевой промышленности.

8. Применение полибактериального препарата по п. 5 в сочетании с функциональными продуктами и фармацевтическими препаратами, предназначенными для влияния на состояние здоровья людей и животных.

9. Применение полибактериального препарата по п. 1 в качестве препарата с антиоксидантной активностью, противовоспалительной иммуномодулирующей активностью, гипохолестеринемической активностью и антигипертензивной активностью.