СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ПОЛИРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2017 года по МПК A61N5/67 A61K31/409 A61P31/06 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии, и может быть использовано для угнетения роста полирезистентных штаммов микобактерий туберкулеза.

В последние годы повсеместно отмечается широкое распространение антибиотикорезистентных штаммов туберкулезной палочки [Lipin M.Y., Stepanshina V.N., Shemyakin I.G., Shinnick T.M. Association of specific mutations in katG, rpoB, rpsL and rrs genes with spoligotypes of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Russia. Clin. Microbiol. Infect. 2007. 13. 620-626; Ali Chaudhry L., Rambhala N., Al-Shammri A.S., Al-Tawfiq J.A. Patterns of antituberculous drug resistance in Eastern Saudi Arabia: a 7-year surveillance study from 1/2003 to 6/2010. J. Epidemiol. Glob. Health. 2012. 2(1). 57-60; Areeshi M.Y., Bisht S.C., Mandal R.K., Haque S. Prevalence of drug resistance in clinical isolates of tuberculosis from GCC: a literature review from January 2002 to March 2013. J. Infect. Dev. Ctries. 2014. 12. 8 (9). 1137-1147]. Последнее диктует необходимость изыскания новых немедикаментозных способов подавления роста данного микроорганизма.

Весьма эффективным способом подавления роста микробных клеток является фотодинамическая терапия (ФДТ), суть которой сводится к предварительному воздействию на бактериальные клетки особого светочувствительного вещества - фотосенсибилизатора, избирательно поглощающегося микробной клеткой, с последующим облучением бактерий светом низкоинтенсивного лазера. Молекула сенсибилизатора, поглощая свет, возбуждается и при этом происходит образование синглетного кислорода, губительно действующего на микробы. ФДТ успешно апробирована и при воздействии на микобактерии туберкулеза [O'Riordan K., Sharlin D.S., Gross J. et al. Photoinactivation of mycobacteria in vitro and in a new murine model of localized Mycobacterium bovis BCG-induced granulomatous infection. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2006. 50. 5. 1828-1834; Chang J.E., Oak C.H., Sung N., Jheon S. The potential application of photodynamic therapy in drug-resistant tuberculosis. J. Photochem. Photobiol. B. 2015. 150. 60-65].

Наиболее близким к предлагаемому является способ ФДТ, описанный Sung N., Back S., Jung J. et al. (Inactivation of multidrug resistant (MDR)- and extensively drug resistant (XDR)-Mycobacterium tuberculosis by photodynamic therapy. Photodiagnosis Photodyn. Ther. 2013. 10. 4. 694-702). Однако в приводимом исследовании в качестве сенсибилизаторов использовались радахлорин или DH-I-180-3, а облучение микробов проводилось светом красного лазера с длиной волны 670 нм при плотности мощности 100 мВт/см² и энергетической плотности - 30 Дж/см².

Нами предлагается новый способ угнетения роста культуры микобактерий туберкулеза, заключающийся в предварительной сенсибилизации микробных клеток фотодитазином с последующим облучением культуры микробных клеток светом низкоинтенсивного красного лазера в малых дозах. Способ реализуется следующим образом.

Препарат фотодитазин, выпускаемый фирмой "Вета-Гранд" (Россия), представляет собой диметилглюкаминовую соль хлорина Е6 и используется в настоящее время в качестве фотосенсибилизатора для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии злокачественных опухолей [Рагулин Ю.А., Капинус Н.В., Каплан М.А. и др. Возможности фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором фотодитазин в лечении центрального рака легких. Российский биотерапевтический журнал. 2005. 3. 58-61; Белый Ю.А., Терещенко А.В., Володин П.Л. и др. Лечение меланом сосудистой оболочки глаза большого размера методом фотодинамической терапии с препаратом фотодитазин (клинический случай). Российский биотерапевтический журнал. 2008. 4. 53-56; Странадко Е.Ф., Волгин В.Н., Ламоткин М.В. и др. Фотодинамическая терапия базально-клеточного рака кожи с фотосенсибилизатором фотодитазином. Российский биотерапевтический журнал. 2008. 4. 7-11].

Нами впервые установлено ингибирующее влияние фотодитазина на рост полирезистентных штаммов микобактерий туберкулеза (Брилль Г.Е., Скворцова В.В., Манаенкова Е.В. Фотосенсибилизатор фотодитазин как средство, угнетающее размножение микобактерий туберкулеза // В сб. научных трудов НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии СГМУ «Актуальные проблемы фундаментальной и клинической уронефрологии» / Под ред. В.М. Попкова. Вып. VI. - Саратов: Изд-во Сарат. гос. мед. ун-та. 2015. С. 125-128).

Лекарственно устойчивые штаммы микобактерий туберкулеза были получены при посеве респираторного материала (мокрота), полученного от больных, проходящих лечение в ГБУЗ «Тамбовский областной клинический противотуберкулезный диспансер». Профили лекарственной устойчивости (ЛУ) были получены с использованием стандартной методики оценки лекарственной устойчивости микобактерий на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Иенсена, не содержащей крахмал (HiMedia, Индия), методом абсолютных концентраций (приказ МЗ РФ от 21 марта 2003 г. N 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»), а ЛУ к рифампицину и изониазиду дополнительно оценивали с помощью постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующей гибридизации генетического материала М. tuberculosis на биочипах «ТБ-БИОЧИП» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия) по методике, рекомендованной производителем. Все штаммы М. tuberculosis были множественно лекарственно устойчивыми (МЛУ), т.е. резистентными к основным противотуберкулезным препаратам - изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу и чувствительными к пиразинамиду. Устойчивость к рифампицину была обусловлена мутацией кодона гена rpoВ 531 (аминокислотная замена Ser→Leu), к изониазиду - кодона гена katG 315 (аминокислотная замена Ser→Thr(1)).

Фотодитазин разводили в дистиллированной воде до конечной концентрации 4*10^-5 моль/л. Бактериальную взвесь М. tuberculosis с титром 100000 КОЕ/мл питательной среды Middlebrook 7Н9 смешивали с раствором фотосенсибилизатора в соотношении 1:9 (итоговый объем образца равен 5 мл) в пластиковых чашках Петри диаметром 10 см и инкубировали в течение 15 мин при температуре 37°С. В качестве контроля использовали взвесь М. tuberculosis каждого штамма, которую вместо раствора сенсибилизатора разводили дистиллированной водой, сохраняя объемное соотношение 1:9.

После инкубирования культуры микробных клеток с фотосенсибилизатором (в контроле - с дистиллированной водой) образцы в чашках Петри облучали низкоинтенсивным лазером в течение 40 мин. Использовали полупроводниковый лазер Азор-2К-02 (Россия) с выходной мощностью излучения 25 мВт, излучающий в постоянном режиме в красном диапазоне спектра (λ=660 нм). Параметры облучения: плотность мощности - 0,32 мВт/см², энергетическая плотность - 0,76 Дж/см².

Посев производили на жидкую питательную среду Middlebrook 7Н9 в индикаторные пробирки MGIT автоматизированной системы ВАСТЕС™ MGIT™ 960 (Becton Dickinson, Sparks, MD). В каждую пробирку вносили по 0,5 мл каждого образца из чашек Петри. Выполняли по пять повторных посевов, учитывая возможность случайных колебаний роста культур микобактерий. Наблюдения проводили в течение месяца. Результат фиксировался автоматической системой при достижении стандартного титра микобактерий в пробирке и выражался в сутках после посева.

Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с использованием программы GraphPad Prism-5. Различия с контролем признавались достоверными при p<0,001.

Результаты наблюдений представлены в таблице.

Как видно из таблицы, низкоинтенсивное лазерное облучение бактериальной культуры в течение 40 минут не оказывает заметного влияния на ее рост. Сам фотодитазин оказывает отчетливое бактериостатическое действие на рост полирезистентных штаммов микобактерий туберкулеза, замедляя рост бактериальной культуры. Лазерное облучение клеточной культуры предварительно обработанной фотодитазином, оказывает дополнительный ингибиторный эффект, вызывая усиление бактериостатического эффекта.

Следовательно, применение в качестве фотосенсибилизатора фотодитазина с последующим облучением низкоинтенсивным лазером красного диапазона спектра оказывает отчетливый фотодинамический эффект, ингибируя рост культуры Mycobacterium tuberculosis в эксперименте.

Способ не дорог, прост, надежен и эффективен.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для подавления роста полирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis в эксперименте. Для этого осуществляют фотодинамическое воздействие. В качестве фотосенсибилизатора используют фотодитазин в концентрации 4*10^-5 моль/л. Облучение проводят низкоинтенсивным лазером «Азор-2К-02» с длиной волны 660 нм, выходной мощностью 25 мВт, излучающим в постоянном режиме в течение 40 минут при плотности мощности 0,32 мВт/см² и энергетической плотности 0,76 Дж/см². Способ обеспечивает простое, надёжное и эффективное угнетение роста культуры микобактерий туберкулёза за счёт дополнительного ингибиторного эффекта и усиления бактериостатического эффекта лазерного облучения клеточной культуры, обработанной фотосенсибилизатором. 1 табл.

Способ подавления роста полирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis в эксперименте, включающий фотодинамическое воздействие, отличающийся тем, что в качестве фотосенсибилизатора используют фотодитазин в концентрации 4*10^-5 моль/л и облучают низкоинтенсивным лазером «Азор-2К-02» с длиной волны 660 нм, выходной мощностью 25 мВт, излучающим в постоянном режиме в течение 40 минут при плотности мощности 0,32 мВт/см² и энергетической плотности 0,76 Дж/см².