Комплексное соединение 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с янтарной кислотой, проявляющее мембраностабилизирующую активность, и способ его получения Российский патент 2017 года по МПК C07D239/60 A61P39/02 A61P39/06 

Группа изобретений относится к органической химии, конкретно к новому комплексному соединению 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с янтарной кислотой, проявляющему мембраностабилизирующую и антирадикальную активность, и способу его получения.

Наиболее близким аналогом изобретения является известный препарат мексидол (2-этил-6-метил-оксипиридин сукцинат) - сукцинат эмоксипина, который относится к классу «мембранопротекторы» [Кожока Т.Г. Лекарственные средства в фармакотерапии патологии клетки, проблемы производства и обеспечения населения. М., 2007. - 15 с.; Котляров А.А., Куркина Н.В., Смирнова Л.Э., Балыкова Л.А. Исследование влияния мексидола, эмоксипина и димефосфона на электрофизиологические эффекты нибентана // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2002. - №2. - С. 27-30; Лукьянова Л.Д. Современные проблемы гипоксии // Вестник РАМН. - 2000. - №9. - С. 3-12] в чистом виде или в виде смеси: диосмин микронизированный 165 мг, троксерутин/троксевазин 100 мг, экстракт Гинкго билоба 40 мг, диосмин 165 мг + эсцин 20 или 30 мг [Кожока Т.Г. Лекарственные средства в фармакотерапии патологии клетки, проблемы производства и обеспечения населения. М., 2007. - 15 с.]. Препарат усиливает антигипоксический эффект эмоксипина, значительно увеличивая его антиоксидантные свойства [Котляров А.А., Куркина Н.В., Смирнова Л.Э., Балыкова Л.А. Исследование влияния мексидола, эмоксипина и димефосфона на электрофизиологические эффекты нибентана // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2002. - №2. - С. 27-30; Михайлов И.Б. Клиническая фармакология - основа рациональной фармакотерапии. Руководство для врачей. СПб: Фолиант, 2013. - 959 с.].

Мексидол является антиоксидантом, антигипоксантом прямого энергезирующего действия, мембранопротектором, ингибирующим свободные радикалы, уменьшающим активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) в дозах от 200 до 500 мг в сутки [Михайлов И.Б. Клиническая фармакология - основа рациональной фармакотерапии. Руководство для врачей. СПб: Фолиант, 2013. - 959 с.].

Единая задача, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, заключается в расширении арсенала биологически активных веществ.

Технический результат при использовании группы изобретений - повышение мембраностабилизирующей активности, уменьшение токсичности.

Заявляемое соединение и его свойства в литературе не описаны.

Комплексное соединение 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с янтарной кислотой формулы:

получают путем смешивания эквимолярных количеств 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с янтарной кислотой в органическом растворителе с последующим нагреванием реакционной смеси в течение 1 часа при температуре 70°C, охлаждением реакционной смеси и фильтрацией выпавших кристаллов. Выход целевого продукта составляет 58%.

Острая токсичность соединения (1) определялась на беспородных белых мышах массой 22±2 г при однократном введении его внутрибрюшинно и внутрь. Изучаемое соединение исследовано в диапазоне доз 750-6000 мг/кг. Результаты опытов представлены в табл.1. Среднесмертельная доза (ЛД₅₀), рассчитанная по методу Литчфильда-Уилкоксона, равна 1850 мг/кг при внутрибрюшинном способе введения в организм мышей. В то же время введение соединения (1) внутрь мышам в дозах 3000-5000 мг/кг не вызывало летальных исходов.

Мембраностабилизирующая и антирадикальная активность соединения (1) изучалась на крысах-самцах, массой 180-230 г. Исследовали влияние изучаемого соединения на интенсивность процессов перекисного окисления липидов. Использована модель острого отравления крыс карбофосом. Контрольной группе крыс карбофос вводили однократно в дозе ЛД₅₀ (260 мг/кг внутрижелудочно). Животных в опытных группах лечили антидотами атропином (5 мг/кг) и карбоксимом (25 мг/кг) внутрибрюшинно: через 0,5 мин, 3 и 6 ч после отравления, или помимо антидотов на 2, 3 и 4 сутки вводили соединение (1) в дозе 25 мг/кг. Его действие сравнивали с эффектом мексидола в дозе 100 мг/кг.

На 14-е сутки после отравления регистрировали биохимические показатели. Объектом биохимических исследований служили миокард и полушария головного мозга крыс.

Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли в липидных экстрактах миокарда и полушарий головного мозга. Результаты опытов представлены в табл. 2. Они свидетельствуют о значительном увеличении содержания ДК в полушариях мозга (в 2-6 раз выше нормы) и миокарде (в 3,2 раза выше нормы) крыс на 14 сутки после отравления карбофосом. Лечение атропином и карбоксимом снизило уровень ДК в органах крыс по сравнению с контролем (нелечеными крысами), в то же время он был достоверно выше, чем у здоровых крыс. Лечение мексидолом и соединением (1) дополнительно к антидотам было более эффективным по сравнению с лечением только антидотами. Лечебные эффекты соединения (1) и мексидола были равноэффективными, что подтверждается полной нормализацией уровня ДК в мозге и сердце у леченых препаратами крыс. В тоже время, эффективная доза соединения (1) в 4 раза меньше, чем у мексидола (25 мг/кг против 100 мг/кг), что указывает на его преимущество перед референтным препаратом.

Методом хемилюминесценции исследована антирадикальная активность двух препаратов путем вычисления константы К₇ скорости реакции взаимодействия перекисных радикалов этилбензола с молекулами изучаемых соединений [Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников Л.Н. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов. - М.: Наука, 1966. - 300 с.].

Результаты опытов даны в табл. 3.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Синтез соединения (1).

К 7,9 г (0,05 моль) 5-гидрокси-3,6-диметилурацила в 100 мл этанола и 350 мл воды присыпают 6,1 г (0,05 моль) янтарной кислоты. Реакционную смесь нагревают на водяной бане до кипения спирта (70°C) и перемешивают 1 час. Выпавшие при охлаждении кристаллы отфильтровывают и получают 8,0 г (58%) соединения (1).

ИК-спектр, (ν см^-1): 3228, 3248, 3216, 3192, 3176, 3152, 3064, 3032, 2960, 2880, 2856, 1720, 1704, 1696, 1656, 1632, 1624, 1600, 1592, 1568, 1560, 1530, 1520, 1504, 1464, 1420, 1400, 1392, 1376, 1332, 1290, 1272, 1256, 1224, 1204, 1096, 1048, 836, 760, 728, 644, 544.

Найдено, %: C 44,20; H 5,30; N 10,90; C₁₀H₁₄N₂O₇. Вычислено, %: C 43,80; H 5,15; N 10,77.

Пример 2. Изучение токсичности соединения (1).

Острую токсичность соединения (1) исследовали на беспородных белых мышах массой 22±2 г.

а) Группе животных однократно в желудок через зонд вводили соединение (1) в дозах 4000, 5000 и 6000 мг/кг. Контрольным мышам вводили адекватное количество дистиллированной воды. Наблюдение за животными вели в течение 2 недель. Отсутствие гибели животных в данных условиях эксперимента свидетельствует о малой токсичности соединения (1) (в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76). Доза, вызывающая 50%-ную гибель мышей для янтарной кислоты составляет 4800 мг/кг, а для мексидола - 1800 мг/кг [ГОСТ 12.1.007-76. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. Государственный комитет стандартов. М., 1976].

б) Токсичность соединения (1) и референтных препаратов - мексидола и янтарной кислоты при внутрибрюшинном способе введения препаратов изучали в экспериментах на белых мышах-самцах массой 20±3 г. Статистическая группа состояла из 8 особей. Действие препаратов на организм мышей оценивали по смертельному эффекту, а результаты обрабатывали с использованием пробит-анализа по методу Литчфилда-Уилкоксона. В результате исследования определена доза 1850 мг/кг соединения (1), которая вызывает 50%-ную гибель мышей. У референтных препаратов мексидола и янтарной кислоты соответствующий 50%-ный летальный эффект находится на уровне 430 мг/кг и 870 мг/кг [Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном введении. Справочник. М.: Медицина, 1977. - 240 с.].

Пример 3. Изучение мембраностабилизирующей и антирадикальной активности соединения (1).

Мембраностабилизирующая и антирадикальная активности соединения (1) изучали в экспериментах на крысах-самцах массой 180-230 г. Использована модель острого отравления крыс карбофосом [Мышкин В.А., Еникеев Д.А. Антиоксидантная коррекция отравлений. Уфа, 2009. - 404 с.]. Показателем активности препаратов являлось их влияние на процессы перекисного окисления липидов в органах-мишенях: полушариях головного мозга и миокарде крыс.

Контрольной группе крыс вводили карбофос однократно внутрь в дозе ЛД₅₀ (260 мг/кг). Крыс в опытных группах лечили антидотами - атропином (5 мг/кг) и карбоксимом (25 мг/кг) внутрибрюшинно через 0,5 минут, 3 и 6 часов после отравления или, помимо антидотов, на 2, 3, 4 сутки вводили соединение (1) в дозе 25 мг/кг. Его действие сравнивали с эффектом мексидола, который вводили крысам в дозе 100 мг/кг. На 14 сутки после отравления регистрировали биохимические показатели. Объектом биохимических исследований служили полушария головного мозга и миокард крыс.

Продукты ПОЛ определяли в липидных экстрактах полушарий головного мозга и миокарда крыс. Экстракцию липидов производили по методу Фолча смесью метанол-хлороформ в соотношении 1:2. Пробы гомогенизировали на холоду в продутых аргоном реактивах. Липиды определяли гравиметрически, упаривая растворитель на вакуумном роторном испарителе при 50°C.

Продукты ПОЛ - диеновые конъюгаты (ДК) определяли спектрофотометрически. Липиды в концентрации 1 мг/мл растворяли в системе метанол-гептан в соотношении 3:1, спектр поглощения снимали на спектрофотометре СФ-16 в ультрафиолетовой области (при максимуме поглощения 232 нм).

Различия в сериях «опыт-контроль» считали достоверными при уровне вероятности различий 95% (p<0.05).

Результаты представлены в таблице 2. Они свидетельствуют о значительном увеличении содержания ДК в полушариях мозга (в 2-6 раз выше нормы) и миокарде (в 3,2 раза выше нормы) крыс на 14 сутки после отравления карбофосом. Лечение атропином и карбоксимом снизило уровень ДК в органах крыс по сравнению с контролем (нелечеными крысами), в то же время он был достоверно выше, чем у здоровых крыс. Лечение мексидолом и соединением (1) дополнительно к антидотам было более эффективным по сравнению с лечением только антидотами. Лечебные эффекты соединения (1) и мексидола были равноэффективными, что подтверждается полной нормализацией уровня ДК в мозге и сердце у леченых препаратами крыс. В то же время, эффективная доза соединения (1) в 4 раза меньше, чем у мексидола (25 мг/кг против 100 мг/кг), что указывает на его преимущество перед референтным препаратом.

Пример 4. Изучение антирадикальной активности соединения (1).

Антирадикальная активность соединения (1) и мексидола исследована методом хемилюминесценции в модельной системе этилбензол : ледяная уксусная кислота путем вычисления константы К₇ - скорости взаимодействия перекисных радикалов этилбензола с молекулами изучаемых соединений. Результаты опытов представлены в таблице 3.

Они свидетельствуют о выраженной антирадикальной активности соединения (1), превосходящей антирадикальную активность мексидола и сопоставимой с активностью ионола.

Таким образом, соединение (1) обладает выраженной мембраностабилизирующей активностью in vivo. Действующая доза препарата в 4 раза меньше, чем у мексидола.

Изобретение относится к новому комплексному соединению - 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с янтарной кислотой, соответствующему нижеуказанной структурной формуле. Соединение обладает мембраностабилизирующей и антирадикальной активностью, а также уменьшенной токсичностью по сравнению с известными соединениями идентичного назначения:

Комплексное соединение получают путем смешивания эквимолярных количеств 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с янтарной кислотой в органическом растворителе, с последующим нагреванием реакционной смеси в течение 1 часа при температуре 70°C, охлаждением реакционной смеси и фильтрацией выпавших кристаллов. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

1. Комплексное соединение 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с янтарной кислотой формулы:

2. Способ получения комплексного соединения 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с янтарной кислотой по п. 1, заключающийся том, что 5-гидрокси-3,6-диметилурацил подвергают взаимодействию с эквимолярным количеством янтарной кислоты в органическом растворителе с последующим нагреванием реакционной смеси до 70°C, охлаждением и выделением продукта.