СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ IN VITRO Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/34 C12Q1/68 G01N33/48 G01N23/83 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии, радиобиологии, экологии для определения биологической активности веществ на антирадикальную активность по способности взаимодействия их с радикалами ОН.

Тестирование биологически активных веществ по способности взаимодействовать с радикалами ОН - актуальный подход для изучения свойств, понимания механизмов фармакологического действия биологически активных веществ (БАВ) и скрининга веществ - потенциальных радиопротекторов. Радикал ОН является наиболее активным из активированных форм кислорода (АФК: О-2

, ¹О₂, ОН, HO₂•, RО^•₂, RO^• , R^• ), играет ведущую роль в ряде патологических процессов, предполагается его ответственность за некоторые генетические заболевания, он играет важную роль в старении организма, является основным повреждающим агентом при действии ионизирующей радиации.

Присутствие БАВ, способных к активному перехвату радикалов ОН, должно модифицировать результат повреждающего действия этих радикалов. Направленность же модифицирующего эффекта и его величина в значительной мере определяются также свойствами образующихся радикальных состояний молекулы БАВ: нейтральны ли они по отношению к основным мишеням действия радикалов ОН в организме, либо способны с ними взаимодействовать. Например, относительно действия ионизирующей радиации вещества, обладающие антирадикальной активностью к радикалам ОН и образующие при этом продукты, нейтральные к мишеням, могут рассматриваться как потенциальные радиопротекторы.

Антирадикальную активность веществ оценивают на различных моделях с использованием в качестве тест-объекта подопытных животных. Так изучали влияние исследуемого вещества на интенсивность процессов перекисного окисления липидов /пат. РФ № 2066319/. Для этого использовали модель отравления крыс карбофосом. Контрольной группе крыс карбофос вводили однократно в дозе ЛД₅₀ (260 мг/кг внутрижелудочно). Животных опытных групп лечили атропином (5 мг/кг) и дипироксином (25 мг/кг) внутрибрюшинно через 5 мин, 3 и 6 часов после отравления. Действие исследуемого препарата сравнивали с эффективностью ионола в дозе 120 мг/кг. На 14-е сутки после отравления регистрировали биохимические показатели. Объектом биохимических исследований служили миокард и полушария головного мозга крыс. В липидных экстрактах миокарда и полушарий головного мозга определяли продукты окисления липидов (ПОЛ). Экстракцию липидов проводили по методу Фолча. Пробы гомогенизировали на холоду в продутых аргоном реагентах. Липиды определяли гравиметрически, упаривая растворитель на вакуумном роторном испарителе при 50° С. Продукты ПОЛ - диеновые конъюгаты определяли спектрофотометрически. Липиды в концентрации 1 мг/кг растворяли в системе метанол - гептан в соотношении 3:1, спектр поглощения снимали на спектрофотометре СФ-16 в ультрафиолетовой области (максимум поглощения 232 нм). Различия результатов в сериях “опыт-контроль” считали достоверными при уровне вероятности различий 95%.

Известен экспресс-метод определения антирадикальной активности, основанный на определении спектрофотометрически способности исследуемых веществ реагировать с дифенилпикрилгидразилом (ДФПГ) - стабильным радикалом /пат.РФ № 2141331/. ДФПГ взаимодействует с соединениями, которые обладают подвижным атомом водорода, например тиолы, фенолы, амины, амиды и др., изменяя свою окраску; он устойчив к действию кислорода воздуха. Реакции проводили в спиртовом растворе, исследуемые вещества присутствовали в эквимолярных количествах. Спиртовой раствор ДФПГ и препарата смешивали и определяли на спектрофотометре оптическую плотность при 250 нм сразу после смешивания, затем через 10, 30 и 60 мин. Антирадикальную активность рассчитывали по изменению оптической плотности раствора ДФПГ при взаимодействии его с исследуемыми препаратами.

Известные способы определения антирадикальной активности не информативны относительно радикалов ОН, т.к. в используемых системах инициируются либо многие из АФК, либо органические пероксидные радикалы, либо используется вещество, существующее в радикальной форме.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому методу является способ определения антирадикальной активности веществ in vitro, заключающийся в γ -облучении исследуемого вещества и эталона сравнения и определении количественных характеристик исследуемого вещества /Храпова Н.Г. Определение антирадикальной активности веществ природного происхождения методом хемилюминесценции. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo. М.: Наука, 1992. С.8-15/. При этом вычисляют константы скорости реакции взаимодействия перекисных радикалов этилбензола с молекулами изучаемых соединений (k₇). Данный метод относится к хемилюминесценции (ХЛ). В качестве инициатора окисления этилбензола используется дициклопероксикарбонат при 20-40° С и азобис-изо-бутиронитрил при 50-80° С. При инициированном окислении углеводородов в результате рекомбинации перекисных радикалов образуются возбужденные молекулы ацетофенона, способные испускать свечение в видимой области спектра (ХЛ). Через этилбензол в присутствии инициатора окисления и усилителя интенсивности свечения (9,10-дибромантрацен) пропускается воздух и с помощью специальной аппаратуры прописывается свечение этой среды. Затем в ячейку шприцем вводят исследуемые вещества в растворе этилбензола и снимают кинетические кривые изменения интенсивности свечения. По зависимости остаточного свечения от концентрации введенного вещества или по величине максимальной скорости изменения интенсивности свечения, экстраполированной к нулевой концентрации введенного ингибитора, определяют величину константы скорости реакции введенного вещества с радикалами RO₂•

(k₇).

Недостатком данного способа является невозможность оценки свойств образующихся радикальных состояний веществ или стабильных продуктов их превращений: нейтральны они к биомишеням или сами способны их повреждать.

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в создании высокоэффективного способа определения БАВ, обладающих антирадикальной активностью (к радикалам ОН) за счет расширения информативности способа и повышения достоверности выводов о свойствах исследуемого вещества.

Поставленная цель достигается за счет использования способа определения антирадикальной активности веществ in vitro, заключающегося в γ -облучении исследуемого вещества и эталона сравнения и определении количественных характеристик исследуемого вещества. При этом в качестве эталона сравнения используют водный раствор р-нитрозодиметиланилина, методом конкурентной кинетики определяют константу скоростей реакции веществ с радикалами ОН (k_OH) и при получении константы скорости реакции исследуемого вещества выше (4-5)xl0⁹л/мoль· c методом конкурентной кинетики последовательно определяют соотношения равноповреждающих доз при облучении в присутствии испытуемого вещества и без него в сравнении с трипсином по снижению его ферментативной активности, в сравнении с ДНК по снижению характеристической вязкости двунитевой ДНК и в сравнении с эритроцитами по снижению оптической плотности эритроцитов, затем полученные экспериментальные величины сравнивают с рассчетными и оценивают свойства радикальных состояний исследуемых веществ.

В радиационно-химических исследованиях установлено, что модификаторы повреждающего действия ионизирующей радиации являются активными перехватчиками радикальных продуктов радиолиза воды, в частности радикалов ОН, их константы скоростей реакций с радикалами ОН имеют величины, близкие к значениям, предельным для реакций, контролируемых диффузией. Различия же в эффектах определяются свойствами продуктов реакции: протекторы дают продукты, не участвующие в дальнейших реакциях, а сенсибилизаторы образуют активный продукт, который повреждает молекулы мишени более эффективно, чем продукты радиолиза воды.

Авторами данного изобретения был разработан метод комплексной оценки антирадикальных свойств БАВ, включающий непосредственное определение величины константы скорости реакции веществ с радикалами ОН и испытания на биотест-объектах, соответствующих основным мишеням действия этих радикалов в организме: белок (трипсин), ДНК и природный белково-липидный комплекс (эритроциты), с последующим сопоставлением эффективности защиты биотест-объектов от повреждения радикалами ОН, наблюдаемой в эксперименте с полученной расчетным путем, исходя из величины k_OH.

Использование предложенного способа позволило получить 1) количественную оценку антирадикальной активности БАВ, а именно величину константы скорости реакции БАВ с радикалами ОН, 2) данные о свойствах вторичных радикалов БАВ (реактивны они относительно биомишеней или нет), 3) возможность сопоставить антирадикальные и антиоксидантные эффекты БАВ.

Биотест-объекты выбраны, исходя из требований, предъявляемых к первичному скринингу: доступность и сравнительно несложная процедура тестирования. Использованы: трипсин - протеолитический фермент, ДНК высокомолекулярная (12× 10⁶ Да) селезенки крупного рогатого скота или тимуса теленка, эритроциты - суспензия свежевыделенных отмытых эритроцитов крови крысы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Используемое оборудование:

1. Источник γ - излучения (¹³⁷Cs или ⁶⁰Со) с мощностью дозы 1,5-0,03 Гр/с, с дозиметрией радиационного поля.

2. Низкоградиентный многошариковый (4- или 3-шариковый) капиллярный вискозиметр типа Оствальда с градиентами скорости, например, 0=18, 30, 50 сек^-1 для 1хССЦ, или ротационные низкоградиентные вискозиметры коммерческого производства (например, вискозиметр Зимма).

3. Спектрофотометр с регистрацией поглощения в УФ - и видимой областях спектра, ультратермостат для наружного термостатирования; термостат водяной со встряхиванием пробирок; желательно автоматические пипетки для отбора проб. Используемые материалы:

1. р-Нитрозодиметиланилин - эталон сравнения с известной константой скорости реакции с радикалами ОН.

2. Белок - трипсин бычий панкреатический, лиофилизованный, свободный от солей. М.м. 23800 Да.

3. ДНК высокомолекулярная лиофилизованная тимуса теленка или селезенки крупного рогатого скота. М.м. (12-18)x10⁶ Да, содержание белка в РНК не более 3%, Г.Э. 37-40%, содержание ГЦ-пар - 42%.

4. Эритроциты, свежевыделенные из стабилизированной крови беспородных крыс-самцов (200-250 г).

Описание предлагаемого способа.

1-й этап способа - р-нитрозодиметиланилин (ПНДА), разрушение которого радикалами ОН, инициируемыми в водном растворе действием γ -квантов, можно регистрировать спектрофотометрически. Экспериментально определяется разрушение ПНДА без добавления БАВ и в его присутствии. Соотношение выходов разрушения ПНДА подчиняется линейной зависимости от молярных соотношений конкурентов в водном растворе, по наклону которой находят искомую k_OH.

2, 3, 4-ые этапы способа - биотест-объекты выбраны с постепенным усложнением структуры: белок (трипсин), высокомолекулярная ДНК и функционирующий белково-липидный комплекс мембраны в виде безъядерных клеток зрелых эритроцитов. На этих этапах оценивали противолучевую активность исследуемого вещества. Для этого сопоставляли разрушение биотест-объекта в водном растворе без вещества и в его присутствии: на трипсине - по тесту нарушения ферментативной активности, на ДНК тестом является появление двунитевых разрывов, определяемых вискозиметрически, на эритроцитарной системе тест повреждения - гемолиз с регистрацией снижения светорассеяния.

При использовании заявляемого способа определяли противолучевую активность БАВ по фактору увеличения дозы облучения (ФУД), который применяют в радиобиологии для оценки эффективности защитного действия и рассчитывают по соотношению равноповреждающих доз при облучении в присутствии испытуемого вещества и без него.

Выбранные для тестирования условия облучения (насыщенные воздухом разбавленные водные буферные растворы с рН, близкими к нейтральным) таковы, что из образующихся активных продуктов радиолиза воды (e_ag. ОН, Н, НO₂) лишь радикалы ОН осуществляют повреждение моделей, а остальные активные частицы образуются с меньшим (в 4-6 раз) выходом и на 1-2 порядка менее активны, либо дезактивизируются кислородом воздуха.

Образующиеся радикальные продукты БАВ (БАВ• ) могут быть инертны по отношению к мишени, тогда наблюдается эффект защиты, а могут быть активными и повреждать молекулу-мишень, тогда наблюдается снижение защиты.

Значение ФУД, определенное в эксперименте, сопоставляется с величиной ФУД, полученной известным расчетным путем /Амирагова М.И., Жеребченко П.Г., Комар В.Е. и др. Пределы модифицируемости лучевого поражения. М.: Атомиздат, 1978, 216 с./.

Характеристики используемых биотест-объектов и условий работы с ними:

р-Нитрозодиметиленанилин - использовали как акцептор радикалов ОН для определения констант скоростей реакции веществ с радикалами ОН в условиях стационарного облучения. Для этого применяли растворы ПНДА концентрации (2-5)x10^-5 М в 0,001 М фосфатном буфере с необходимым значение рН, соотношение молекулярных концентраций БАВ и ПНДА варьируется от 0,02 до 12 в зависимости от реакционной способности БАВ к радикалам ОН. Для облучения использовали дозы 50%-ной деструкции ПНДА в буфере без добавления вещества. Спектрофотометрически наблюдали за разрушением хромофора ПНДА. Определяли убыль оптической плотности ПНДА при облучении без БАВ и в его присутствии. Величина k_OH больше 1× 10⁹ л/моль· с свидетельствует о достаточно высокой активности вещества к перехвату радикалов ОН. Радиопротекторы имеют k_OH больше (4-5)· 10⁹ л/моль· с.

Трипсин - классическая белковая модель. Для исследования радиопротекторной активности применяли растворы трипсина 0,2 мг/мл (4,2× 10^-6 М) в 0,01 М фосфатном буфере с рН 6,0. Молярное соотношение (БАВ: трипсин) варьировалось от 0,02 до 40 в зависимости от свойств БАВ. Дозовые зависимости инактивации трипсина определяли без БАВ и в его присутствии. Использовали дозу облучения, дающую 50%-ную остаточную активность трипсина в контроле. Полученные результаты сравнивали с рассчетными, исходя из значений k_OH+БАВ, найденных в опытах с ПНДА, и величины k_OH для трипсина (3,75+0,1)x10 л/моль· с.

ДНК. Для работы готовили из препарата ДНК основной концентрированный раствор (1 мг/мл). Лиофилизованный препарат ДНК растворяли в растворителе с низкой ионной силой: натрий-цитратном буфере -0,1× ССЦ с рН 7,0-7,2. После диализа и осветления центрифугированием ионную силу раствора повышали до 0,2 М по Na⁺ с помощью NaCl.

Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически (А47мкг/мл260

=1,0). Для облучения готовили раствор ДНК 200 мкг/мл в 0,1× ССЦ с 0,2М NaCl, концентрация БАВ (0,5-1,0)x10^-3 M. Определяли дозовые зависимости радиационной деградации ДНК в присутствии БАВ и без него по снижению характеристической вязкости двунитевой ДНК, применяя низкоградиентную вискозиметрию на трехшариковых вискозиметрах типа Оствальда с экстраполяцией к нулевому градиенту или ротоционном вискозиметре типа Зимма. Для измерений вязкости растворы ДНК разбавляли раствором 1× ССЦ до 25 мкг/мл. Определяли ФУД равноэффективной деструкции в пределах 50%-ной деградации ДНК.

Эритроциты. Стабилизированную (нитратную или оксалатную) кровь центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин, осадок эритроцитов четырежды промывали буферным физиологическим раствором с рН 7,4 (0,15 М NaCl в 0,01 М фосфатном буфере). Отмытые от сыворотки эритроциты разводят таким же физраствором. Для облучения готовили суспензию эритроцитов 0,6-0,7 опт.ед. (λ =670 нм). Определяли дозовые зависимости гемолиза эритроцитов в присутствии БАВ (1,5× 10^-5 M) и без него, регистрируя снижение оптической плотности суспензии при λ =670 нм, по дозам 50%-ного гемолиза вычисляли ФУД.

Условия облучения. Насыщенные воздухом растворы облучали при Т=10-15° С:

- ПНДА - дозы 150 и 300-350 Гр в зависимости от концентрации ПНДА, мощность дозы 1,3 Гр/с,

- трипсин - дозы от 50 до 600 Гр (при снятии дозовых зависимостей) и 200 Гр при однократном облучении (мощность дозы 1,3 Гр/с),

- ДНК - дозы от 10 до 300 Гр и выше (мощность 0,3 Гр/с),

- Эритроциты - дозы от 150 Гр до 2,4 кГр (мощность дозы 1,3 Гр).

Различия в диапазонах доз связаны с различиями в радиочувствительности биотест-объектов, а мощность дозы определяется оптимальной длительностью облучения с учетом свойств тест-объектов.

Обработка и анализ результатов сведены в таблицу.

Заявляемый способ тестирования был опробован на БАВ растительного происхождения, некоторых S-содержащих соединениях и известном радиопротекторе - мексамине /Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т.1, с.292, Харьков, Торсинг,1997/. Полученные результаты представлены в таблице. Результаты для всех тест-объектов вычисляли как среднее данных не менее 3-4 опытов с двумя параллельными определениями в каждом, приведены среднеквадратичные ошибки средней.

При k_он+БАВ&λτ;_{1× 10⁹ л/моль· с исследуемое вещество обладает низкой антирадикальной активностью и дальнейшие исследования на биотест-объектах не проводятся, т.к.практически не защищают биотест-объекты от радикалов ОН (№11 в табл.), везде ФУД=1. При kOH+БАВ≥(4-5)x10⁹ тестирование следует проводить. У ряда веществ kOH+БАВ достигает максимально возможных величин: № 10-12× 10⁹ и № 1-4 - (23-20)xl0⁹ л/мoль· c. Представленные в таблице данные демонстрируют возможность различного влияния исследуемых веществ на повреждение биотест-объектов:}

1) ФУД_эксп=ФУД_расч на всех биотест-объектах (№ 12) означает, что радикалы БАВ* и их стабильные продукты нейтральны ко всем биомишеням (обозначены в таблице “+”).

2) ФУД_эксп&λτ;_{ФУДрасч для любого тест-объекта свидетельствует о повреждающем действии БАВ• или стабильных продуктов их превращений на биомишени, т.е. имеет место эффект “скрытой” сенсибилизации (№ 7-10 на трипсине, № 5,7,8 - на ДНК, № 6 - на эритроцитах) (обозначение в таблице “+”). При ФУДэкс≤1 - явная сенсибилизация (обозначение в таблице "-").}

3) ФУД_эксп&γτ;_{ФУДрасч, объяснение различно для разных биотест-объектов в связи с особенностями их структуры, свойств и функции в клетке:}

а) для ДНК это свидетельство взаимодействия БАВ• и ДНК с образованием ковалентных сшивок (внутритяжевых или межтяжевых), что следует расценивать как отрицательный эффект, т.к. сшивки могут мешать редупликации и функционированию ядерной ДНК (обозначение в таблице ⊘ );

б) для других биомишеней это означает наложение дополнительных механизмов защиты (напр., адсорбционной - для белка и антиоксидантной - для эритроцитов) (обозначение в таблице ⊕ ).

Принцип отбора исследуемых веществ по результатам тестирования их антирадикальных свойств определяется поставленной задачей. В графе "Выводы" таблицы результаты тестирования обозначены значками:

+ для п.1, ± для п.2, ⊘ для п.3а, ⊕ для п.3б.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения антирадикальной активности веществ по способности взаимодействия их с радикалами ОН. Определение величины константы скорости реакции вещества с радикалами ОН (k_OH) проводят в условиях γ-облучения, в качестве эталона сравнения используют водный раствор р-нитрозодиметиланилина. Отбирают вещества с k_OH выше (4-5)х10⁹ л/моль·с. Затем определяют последовательно соотношения равноповреждающих доз при γ-облучении для трипсина, ДНК и эритроцитов в присутствии отобранного вещества и без него и оценивают антирадикальную активность исследуемого вещества путем сравнительного анализа. Изобретение позволяет количественно оценить антирадикальную активность БАВ, получить данные о свойствах вторичных радикалов БАВ, сопоставить антирадикальные и антиоксидантные эффекты БАВ и сделать достоверные выводы о свойствах исследуемых БАВ. 1 табл.

Способ определения антирадикальной активности веществ in vitro, предусматривающий взаимодействие исследуемого вещества и эталона сравнения со свободными радикалами и определение величины константы скорости реакции вещества с радикалами, отличающийся тем, что в качестве эталона сравнения используют водный раствор р-нитрозодиметиланилина, а определение величины константы скорости реакции исследуемого вещества с радикалами ОН (k_OH) проводят в условиях γ-облучения, отбирают вещества с k_OH выше (4-5)·10⁹л/моль·с, затем определяют последовательно соотношения равноповреждающих доз при γ-облучении для трипсина, ДНК и эритроцитов в присутствии исследуемого вещества и без него и оценивают антирадикальную активность исследуемого вещества путем сравнительного анализа.