ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области медицины и иммунологии. В частности, изобретение позволяет проводить анализ характеристик, в частности характеристик изотипического состава, иммунных комплексов при диагностике и лечении различных заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунные комплексы, или комплексы антиген-антитело - макромолекулярные структуры, образующиеся в результате специфического взаимодействия антигенов с бивалентными или мультивалентными антителами в биологических жидкостях организма. Данные комплексы, представляющие собой крупные молекулярные образования, состоящие из множества молекул антигена и антител, формируются как при эквивалентных соотношениях антигена или антитела, так при умеренном избытке антигена. Образование и удаление иммунных комплексов происходит в ходе развития гуморального иммунного ответа, что является одной из важных защитных реакций организма.

Содержание иммунных комплексов повышается в сыворотке крови и других биологических жидкостях при различных системных нарушениях, в том числе и при таких заболеваниях, как ревматологические и аутоиммунные заболевания, аллергические заболевания, вирусные, бактериальные и паразитарные инфекции, новообразования и аллергические реакции.

В области техники известны способы обнаружения иммунных комплексов, возникающих в плазме крови и других биологических жидкостях.

Существующие способы анализа иммунных комплексов дают возможность определять лишь общее содержание указанных комплексов и не позволяют анализировать распределение иммунных комплексов по составу изотипов иммуноглобулинов, которые в них входят.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, раскрытый в патенте SU 1833818, включающий применение квазиупругого (динамического) светорассеяния для детекции продукта реакции связывания антигена со специфичными антителами. Описанный способ реализуют следующим образом. Специфичные к антигену антитела ковалентно связывают с частицами альдоенолдекстрана строго определенного молекулярного веса 500000 Да. Способом динамического светорассеяния (лазерной корреляционной спектроскопии - ЛКС) определяют коэффициент диффузии частиц альдоенолдекстрана с иммобилизованными на них антителами, который зависит от гидродинамического радиуса R_h указанных частиц. Поскольку размер частиц альдоенолдекстрана во много раз больше размера антител, иммобилизованных на нем, можно считать R_h альдоенолдекстрана с иммобилизованными на нем антителами равным R_h самого альдоенолдекстрана. Кроме того, поскольку вклад частиц определенного размера в суммарное рассеяние образца пропорционален 6 степени размера частиц и антитела, иммобилизованные на частицах декстрана, добавляют в исследуемый раствор в избытке, вкладами всех остальных фракций исследуемого раствора, в том числе и антигена можно пренебречь. Таким образом, использование частиц декстрана позволяет рассматривать биологическую жидкость, представляющую собой полидисперсную систему, как монодисперсную систему. В случае монодисперсной системы увеличивается точность обнаружения различий коэффициента диффузии образованного комплекса иммобилизованных антител с антигеном от коэффициента диффузии одного из субстратов - иммобилизованных на частицах альдоенолдекстрана антител. О присутствии антигена судят по увеличению размера частиц в реакционной смеси в результате связывания антигена с иммобилизованными на частицах альдоенолдекстрана антителами.

Иммобилизация антител на частицах альдоенолдекстрана позволяет отслеживать изменения коэффициента диффузии в полученной монодисперсной системе и детектировать взаимодействия антител с антигеном по появлению в образце агрегатов частиц декстрана, связанных с антигеном. Такой подход обеспечивает высокую чувствительность способа обнаружения наличия антигена в биологической жидкости, в частности, минимальная детектируемая концентрация антигена составляет приблизительно 4 пг/мл, что в 100-1000 раз меньше, чем концентрация, детектируемая способами иммуноферментного анализа или радиоаллергосорбентного теста.

Таким образом, указанный способ позволяет обнаруживать наличие в биологической жидкости определенного антигена, но не дает возможность получить информацию о присутствии в биологической жидкости иммунных комплексов, отслеживать изменение их количества при воздействии внешних факторов, а также не позволяет определять изотипы иммуноглобулинов, образующих эти комплексы.

Задачей настоящего изобретения является повышение диагностической и прогностической информативности способа выявления значимых для медицинских целей антигенов в биологических жидкостях путем получения сведений не только об образовании иммунных комплексов с присутствующими в исследуемых биологических жидкостях антителами, но и о наборе изотипов антител, связывающих указанные антигены.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее краткое описание предлагает краткое описание настоящего изобретения, предназначенное для того, чтобы в сжатой форме обозначить предмет и сущность изобретения. Краткое описание представляют с пониманием того, что его не следует применять для толкования или ограничения объема или смыслового содержания формулы изобретения.

Настоящее изобретение основано, в частности, на применении динамического светорассеяния и агентов, специфично взаимодействующих с иммуноглобулинами, например с иммуноглобулинами определенных изотипов. Характеристики иммунных комплексов (ИК) в биологической жидкости определяют с помощью динамического светорассеяния (ДСР) без их выделения из указанного образца. Такой подход позволяет получать новую информацию о функционировании системы гуморального иммунного ответа и создать новые, более информативные, способы диагностики заболеваний, связанных с аномалиями функционирования иммунной системы. Настоящее изобретение обеспечивает увеличение точности измерений и улучшение качества и надежности диагностики различных заболеваний и состояний.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов в результате агрегации указанных комплексов при специфичном связывании с агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации возникновения иммунных комплексов в результате взаимодействия иммуноглобулинов в указанном образце с агентом, который специфично взаимодействует с указанными иммуноглобулинами.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации увеличения размеров иммунных комплексов в результате взаимодействия иммуноглобулинов в указанном образце с агентом, который специфично взаимодействует с указанными иммуноглобулинами.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют после удаления части ИК из образца с применением агента, специфично взаимодействующего с иммуноглобулинами, например с иммуноглобулинами определенных изотипов.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов в результате агрегации указанных комплексов при взаимодействии с моноклональными антителами к различным изотипам антител, входящих в состав иммунных комплексов.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, например с иммуноглобулинами различных изотипов.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения приведение указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, приводит к удалению указанных иммуноглобулинов из образца.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, что приводит к удалению указанных иммуноглобулинов из образца.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения вклада в светорассеяние иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения вклада в светорассеяние иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, например с иммуноглобулинами различных изотипов.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения вклада в светорассеяние иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, что приводит к удалению указанных иммуноглобулинов из образца.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающий:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество, с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ диагностики заболевания или состояния у субъекта, включающий определение характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости субъекта, причем иммунные комплексы с указанной характеристикой изотипического состава присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании или состоянии, при этом указанную характеристику изотипического состава в образце биологической жидкости определяют с помощью способа по любому из соответствующих вариантов реализации настоящего изобретения.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения под характеристикой изотипического состава иммунных комплексов, с использованием которой осуществляют диагностику некоторого состояния или заболевания субъекта и которая является характерной для указанного заболевания или состояния, понимают, например, определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, входящих в состав иммунных комплексов, или, например, отклонения от соотношения изотипов иммуноглобулинов, входящих в состав иммунных комплексов, наблюдаемого при норме, или, например, изменения относительных количеств иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ диагностики заболевания или состояния у субъекта, включающий определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании или состоянии (характерны для указанного заболевания или состояния), при этом присутствие указанных иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ диагностики заболевания или состояния у субъекта, включающий определение характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости субъекта, причем иммунные комплексы с указанной характеристикой изотипического состава присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании или состоянии, при этом указанную характеристику изотипического состава в образце биологической жидкости определяют с помощью способа по любому из соответствующих вариантов реализации настоящего изобретения.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава представляет собой присутствие в указанном образце биологической жидкости иммунных комплексов, содержащих определенный изотип иммуноглобулинов или определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава, определяемая с помощью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой размер иммунного комплекса, содержащего иммуноглобулины одного или нескольких изотипов согласно, который присутствует в указанном исходном образце.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава, определяемая с помощью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой вклад в светорассеяние иммунного комплекса, который присутствует в указанном исходном образце.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава, определяемая с помощью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в иммунных комплексах в указанном исходном образце.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава, определяемая с помощью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в иммунных комплексах в указанном исходном образце в определенном соотношении по сравнению с другими изотипами антител, входящими в состав указанного иммунного комплекса.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ оценки эффективности лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании (характерны для указанного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ оценки риска развития патологического состояния у субъекта, включающий определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном патологическом состоянии (характерны для указанного патологического состояния), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение спектра ДСР указанного образца, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения обеспечение исходного образца биологической жидкости включает отбор некоторого объема указанной биологической жидкости у субъекта.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения обеспечение исходного образца биологической жидкости включает удаление из указанного образца по меньшей мере части ИК, присутствующих в указанной биологической жидкости у субъекта с применением любого подходящего способа.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения обеспечение исходного образца биологической жидкости включает удаление из указанного образца по меньшей мере части ИК, присутствующих в указанной биологической жидкости у субъекта, с помощью фильтрации и/или центрифугирования.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный субъект представляет собой млекопитающее.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения млекопитающее представляет собой человека.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное вещество, которое специфически связывает иммуноглобулин, выбрано из: антитела против иммуноглобулина конкретного изотипа, бактериального белка, специфически связывающего иммуноглобулин, антигенного материала.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанные иммунные комплексы образовались в образце биологической жидкости спонтанным образом, т.е. присутствовали в образце биологической жидкости до его отбора у указанного субъекта.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанные иммунные комплексы образовались в образце биологической жидкости в результате добавления антигенного материала.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения определяют размер иммунного комплекса, который присутствует в указанном исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения определяют вклад в светорассеяние иммунного комплекса, который присутствует в указанном исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, определяют присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в указанном исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения определяют присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в составе иммунного комплекса в указанном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения определяют комбинацию иммуноглобулинов определенного изотипа в составе иммунного комплекса в указанном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения для получения спектра ДСР указанного образца применяют гетеродинную схему детекции динамического светорассеяния.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения обработанный образец получают посредством удаления комплекса вещества, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином на стадии с помощью одного или более из: иммуно-аффинной хроматографии, фильтрации, центрифугирования, например ультрацентрифугирования.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения вещество, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, представляет собой антитело животного, принадлежащего к виду, отличному от того, от которого получен исходный образец биологической жидкости.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения исходный образец биологической жидкости представляет собой любую биологическую жидкость, содержащую иммуноглобулины. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения исходный образец биологической жидкости представляет собой любую биологическую жидкость, содержащую ИК.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения исходный образец биологической жидкости представляет собой любую биологическую жидкость, например цельную кровь, плазму крови, сыворотку крови, лимфу, слюну, сперму, спинномозговую жидкость, молоко, молозиво, мокроту, амниотическую жидкость, мочу, гной, слизь, выпот, асцитическую жидкость или плевральную жидкость.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при обработке исходного образца добавляют несколько веществ, каждое из которых специфично к иммуноглобулину определенного изотипа.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, соответствующий частицам большего размера, чем размеры частиц, присутствующих в исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце отсутствует пик, соответствующий частицам определенного размера, присутствующим в исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения у субъекта, от которого получен образец биологической жидкости, диагностируют присутствие или определяют степень тяжести заболевания или состояния.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние представляет собой одно или более из: ревматологического заболевания, аутоиммунного заболевания, реакции гиперчувствительности, аллергического заболевания, аллергической реакции, иммунной реакции на экзогенные материалы, используемые в трансплантологии и стоматологии, реакции отторжения трансплантата, вирусной инфекции, бактериальной инфекции, паразитарной инфекции, инфекционного заболевания, новообразования, злокачественного новообразования, опухоли, рака.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние выбрано из: реакции гиперчувствительности, аллергического заболевания, аутоиммунного заболевания, иммунной реакции на экзогенный материал, например иммунной реакции на экзогенный материал, используемые в трансплантологии и стоматологии, инфекционного заболевания, воспаления, рака.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние представляет собой туберкулез.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние представляет аллергию.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние связано со злокачественным перерождением клеток иммунной системы, например представляет собой лимфому.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние связано с присутствием в образце биологической жидкости указанного субъекта иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов.

Также в соответствии с настоящим изобретением предложен набор для осуществления способа, описанного в настоящей заявке, включающий по меньшей мере одно вещество, которое специфически связывает иммуноглобулин определенного изотипа; инструкцию по осуществлению способа и, возможно, один или несколько реагентов для осуществления способа согласно настоящему изобретению.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен набор для осуществления способа, описанного в настоящей заявке, включающий по меньшей мере одно вещество, которое специфически связывает иммуноглобулин определенного изотипа; инструкцию.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное по меньшей мере одно вещество в наборе представляет собой антитело, специфичное к иммуноглобулину определенного изотипа.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное по меньшей мере одно антитело представляет собой моноклональное антитело.

Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из нижеследующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Гистограммы субфракционного состава частиц в аликвотах исходной плазмы (А), аликвоты после обработки белком А (Б), после добавления антигена (В), после добавления антигена и антисыворотки к IgE (Г).

Фигура 2. Гистограммы субфракционного состава частиц: обнаружение свободноциркулирующих иммунных комплексов (А) и индуцированных стандартным аллергеном смеси пыльцы деревьев иммунных комплексов (В) и определение изотипического состава (G1 - М и G1 Е) иммунных комплексов в плазме крови пациентки с аллергическим риноконъюнктивитом.

Фигура 3. Гистограммы субфракционного состава частиц в аликвотах исходной плазмы (А) и аликвоты после обработки белком А (Б) у пациентки с сезонным аллергическим риноконъюнктивитом.

Фигура 4. Гистограммы субфракционного состава частиц в аликвотах исходной плазмы (А), аликвоты после фильтрования через мембрану с диаметром пор 100 нм (Б) и аликвоты после добавления антигена домашней пыли (В) пациента с аллергическим риноконъюнктивитом.

Фигура 5. Гистограммы субфракционного состава частиц в аликвотах фильтрованной плазмы (А), ГСС той же плазмы с циклоцитрулином (Б), ГСС плазмы с циклоцитрулином и антителами к IgG3 (В), ГСС плазмы с циклоцитрулином и смесью антител a IgG1 и IgG3 (Г) и ГСС плазмы с циклоцитрулином и смесью антител a IgG3 и IgE (Д) пациента с ревматоидным артритом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретения относится к способу определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающему:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики заболевания у субъекта, включающем определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании (характерны для указанного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающем:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество, с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, посредством чего определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению способа динамического светорассеяния для определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению способа динамического светорассеяния для определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов, при этом указанный способ включает:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество, с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

В одном из вариантов реализации настоящее изобретение относится к способу определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающему:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (в), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(д) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (г), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения стадии в)-д) описанного выше способа согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере два раза.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава, при этом указанный способ включает определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании (характерны для указанного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости определяют с помощью способа определения изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество, с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики заболевания, выбранного из: ревматологического заболевания, аутоиммунного заболевания, реакции гиперчувствительности, аллергического заболевания, аллергической реакции, иммунной реакции на экзогенные материалы, используемые в трансплантологии и стоматологии, реакции отторжения трансплантата, вирусной инфекции, бактериальной инфекции, паразитарной инфекции, инфекционного заболевания, новообразования, злокачественного новообразования, опухоли, рака.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения указанное инфекционное заболевание представляет собой заболевание, вызванное бактерией или вирусом.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики инфекционного заболевания, выбранного из группы, состоящей из, но не ограничиваясь перечисленными: ангины, аскаридоза, аспергиллеза, бактериальной пневмонии, бактериального вагиноза, бешенства, бластоцитоза, болезни Лайма, болезни Шагаса, ботулизма, ветрянки, вирусной пневмонии, ВИЧ-инфекции, газовой гангрены, гепатита А, гепатита В, гепатита С, гепатита D, гепатита Е, гонореи, гриппа, дифтерии, иерсиниоза, кандидоза, кератита, клещевого энцефалита, клонорхоза, коклюша, кори, краснухи, лепры (проказы), лептоспироза, лямблиоза, малярии, мелиоидоза, менингита, нематодоза, ОРЗ, орнитоза, оспы, папилломавируса человека, парагонимоза, парагриппа, педикулеза тела, пищевого отравления, пневмонии, полиомиелита, простого герпеса, простуды, риккетсий, риновирусной инфекции, ротавирусной инфекции, сальмонеллеза, свинки, сепсиса, сибирско язвы, сифилиса, стафилококковой инфекции, столбняка, сыпного тифа, токсоплазмоза, ТОРС (тяжелого острого респираторного синдрома), туберкулеза, уреаплазмоза, хеликобактериоза, хламидиоза, холеры, цитомегаловируса, чесотки, чумы, шистосомоза, шигеллеза, дизентерии, энтеробиоза, энтеровирусной инфекции.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики аутоиммунного заболевания, выбранного из группы, состоящей из, но не ограничиваясь перечисленными: ревматоидного артрита, рассеянного склероза, сахарного диабета первого типа, аутоиммунного панкреатита, васкулита, волчанки, пузырчатки, гемолитической анемии, болезни Грейвса, миастении, склеродермии, болезни Бехчета, полиомиозита, синдрома Шегрена, антифосфолипидного синдрома, спондилоартропатии, синдрома Гиена-Баре, язвенного колита, болезни Крона, целиакии, витилиго, псориаза, аутоиммунной крапивницы, алопеции, саркоидоза, миокардита, дерматомиозита, фибромиалгии, миозита.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики гемобластоза, в частности лимфомы или лейкоза.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава, при этом указанный способ включает определение присутствия иммунных комплексов, в которых преобладает IgG3, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при аутоиммунном заболевании (характерны для аутоиммунного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество, с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава, при этом указанный способ включает определение присутствия иммунных комплексов, в которых преобладает IgE, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при аллергической реакции (характерны для аллергической реакции), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава, при этом указанный способ включает определение присутствия иммунных комплексов, в составе которых присутствует комбинация иммуноглобулинов изотипов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при инфекционном заболевании (характерны для инфекционного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество, с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения подходящим способом согласно настоящему изобретению определяют, что в образце биологической жидкости субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой туберкулез.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения подходящим способом согласно настоящему изобретению определяют, что в образце биологической жидкости субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой реакцию на возбудителя, резистентного к антибиотику.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения подходящим способом согласно настоящему изобретению определяют, что в образце биологической жидкости субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой реакцию на инфекционного агента.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, способом, описанным в настоящей заявке, определяют присутствие иммунного комплекса, в составе которого антитела изотипа IgE составляют по меньшей мере приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% от суммарного содержания всех изотипов антител в указанном комплексе.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, способом, описанным в настоящей заявке, определяют присутствие иммунного комплекса, в составе которого процент содержания антител изотипа IgE больше, чем процент содержания каждого из других изотипов антител по отдельности.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, способом, описанным в настоящей заявке, определяют присутствие иммунного комплекса, в составе которого антитела изотипа IgG3 составляют по меньшей мере приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% от содержания всех изотипов антител в указанном комплексе.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, способом, описанным в настоящей заявке, определяют присутствие иммунного комплекса, в составе которого процент содержания антител изотипа IgG3 больше, чем процент содержания каждого из других изотипов антител по отдельности.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанное вещество, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, специфически связывается с константными частями указанных иммуноглобулинов.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере два раза. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере три раза. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) перечисленных способов осуществляют по меньшей мере четыре раза. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере пять раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере шесть раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере семь раз. В одном из вариантов реализации стадии настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере восемь раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере девять раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере десять раз.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, проба биологической жидкости представляет собой пробу любой биологической жидкости, полученной от субъекта. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения биологическая жидкость представляет собой любую жидкость, производимую субъектом. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения биологическая жидкость представляет собой любую жидкость, производимую субъектом, при этом указанная биологическая жидкость содержит иммунные комплексы. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения биологическая жидкость выбрана из цельной крови, плазмы крови, сыворотки крови, лимфы, слюны, спермы, спинномозговой жидкости, молока, молозива, мокроты, амниотической жидкости, мочи, гноя, слизи, выпота, асцитической жидкости или плевральной жидкости.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, субъект представляет собой млекопитающие. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения млекопитающее представляет собой человека.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение пробы биологической жидкости включает в себя получение пробы указанной жидкости от субъекта стандартными способами получения пробы указанного типа биологической жидкости.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор, достаточным для удаления нежелательных частиц из указанной пробы биологической жидкости. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор от 10 нм до 100 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 10-50 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 50-100 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 100-200 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 200-300 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 300-400 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 400-500 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 500 нм - 1 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 1-10 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 10-50 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 50-100 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 100 нм.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем центрифугирования, например ультрацентрифугирования. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем центрифугирования с ускорением, достаточным для удаления нежелательного осадка из указанной пробы биологической жидкости. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100 до приблизительно 15000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100 до приблизительно 1000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 5000 до приблизительно 10000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 50G до приблизительно 15000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 50G до приблизительно 100G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100G до приблизительно 1000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 1000G до приблизительно 5000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 5000G до приблизительно 10000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 10000G до приблизительно 15000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет приблизительно 1500G.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца буфером. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 6 до приблизительно 8. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 6 до приблизительно 6,5. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 6,5 до приблизительно 7. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7 до приблизительно 7,5. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 8. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7 до приблизительно 7,1. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,2. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,2 до приблизительно 7,3. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,3 до приблизительно 7,4. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,4 до приблизительно 7,5. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН приблизительно 7,2.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца физиологическим раствором.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца изотоническим раствором.

Еще одним вариантом буфера согласно настоящему изобретению является буфер с добавлением натриевой соли ЭДТА. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 5 мМ до приблизительно 10 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 30 мМ до приблизительно 40 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации приблизительно 10 мМ.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца в степени, достаточной для проведения последующего анализа указанного образца. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 1-1000 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 1-5 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 5-10 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 10-20 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 30-40 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 40-50 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 50-100 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 100-500 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 500-1000 раз.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на аликвоты одинакового или разного объема.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 2 аликвоты. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 3 аликвоты. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 4 аликвоты. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 5 аликвот. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 6-10 аликвот. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 10-20 аликвот. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 20-30 аликвот. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы по меньшей мере на 30 аликвот.

Способ динамического светорассеяния (ДСР) основан на взаимодействии монохроматического когерентного излучения со светорассеивающими частицами исследуемой жидкости. Информация обо всех динамических процессах в изучаемой системе содержится в спектре флуктуаций света, рассеянного на частицах в растворе. Спектр флуктуаций фототока на выходе фотоприемника (или корреляционная функция) совпадает со спектром рассеянного света и описывается лоренцианом (или в случае корреляционной функции указанный спектр описывается экспонентой). Полуширина кривой прямо пропорциональна среднему коэффициенту диффузии - D. Зная величину среднего коэффициента диффузии, по формуле Эйнштейна-Стокса можно определить средний гидродинамический радиус частиц - R_h. Спектр флуктуаций фототока рассеивающих частиц разных размеров, содержащихся в полидисперсных биологических жидкостях, представляет собой сумму лоренцианов, полуширина которых характеризует гидродинамический радиус частиц, а амплитуда - вклад частиц данного размера в суммарное рассеяние образца. Решение обратной задачи методом регуляризации позволяет восстановить из спектра флуктуаций фототока гистограмму распределения по размерам частиц, вносящих вклад в светорассеяние. Такая гистограмма состоит из столбцов, высота которых отражает процентное соотношение вклада в светорассеяние компонентов анализируемой биологической жидкости. Методология предполагает, что вклад в светорассеяние остальных макромолекул и частиц считается пренебрежимо малым. Современная измерительная техника позволяет достаточно точно измерить спектр флуктуаций интенсивности фототока в полосе частот от приблизительно единиц Гц до приблизительно 20-50 кГц, что в свою очередь позволяет оценить размеры частиц в диапазоне от приблизительно единиц нанометров (например, приблизительно 2-5 нм) до приблизительно десятков микрометров.

Непосредственно измеряемой в данном подходе величиной является спектр (либо корреляционная функция) флуктуации фототока на выходе фоторегистрирующего прибора. Этот спектр представляет собой результат биений гармоник электромагнитных полей друг с другом и сосредоточен в низкочастотной области, т.е. там, где его очень удобно анализировать современными мощными радиотехническими методами. Уже на этом уровне, а именно на уровне классификации регистрируемых фотодетектором гармоник электромагнитных полей, существует два варианта измерения:

- на фотодетектор попадает лишь свет, рассеянный изучаемой системой, в этом варианте реализуется гомодинный метод измерения;

- вместе с рассеянным на фотодетектор попадает и часть нерассеянного (опорного) излучения, этот вариант получил название гетеродинирования.

В первом случае регистрируется лишь один, рассеянный, луч. Во второй схеме предполагается совмещение фронтов двух лучей на фотоприемнике (рассеянного и нерассеянного). Именно по первой, более упрощенной, схеме работают почти все коммерческие спектрометры ДСР. Согласно настоящему изобретению схема гетеродинирования имеет ряд преимуществ, связанных с большей, чем в гомодинной схеме, концентрационной чувствительностью и устойчивостью к присутствию посторонних сильных рассеивателей в исследуемом образце. Это позволяет избегать искажений измерений, связанных с присутствием посторонних рассеивателей.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при выборе режимов измерений (полоса спектра и количество циклов накопления) руководствуются соображениями о максимально достоверном восстановлении размера частиц в интересующем диапазоне. Измерения проводят в полосе 2048 Гц или 8096 Гц. Наиболее точно восстанавливают размеры частиц, когда полоса измерений составляет не менее чем 10 полуширин лоренциана, с другой. Для частиц, размеры которых колеблются в диапазоне 0,1-1,5 мкм, полуширина лоренцианов лежит в пределах от 20 до 500 Гц, оптимальной будет полоса 8096 Гц при разрешении 4 Гц на канал (2048 точек спектра). Приведенные выше условия требуют, чтобы «негладкость» спектра составляла не более 0,03. Так как флуктуации экспериментальных точек в спектре практически всегда носят случайный характер, то можно допустить, что величина «негладкости» обратно пропорциональна квадратному корню из количества копий суммарного спектра. Таким образом, количество копий накопления должно быть не менее 1000. Для исключения неизвестных факторов выбрали эту величину равной 2000. При таких параметрах измерений время, затраченное на исследование одного образца, составляет приблизительно 15 минут

В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению для получения спектра ДСР используют гетеродинную схему детекции.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, измеренный способом динамического светорассеяния спектр флуктуаций света, рассеянного на частицах биологической жидкости в пробе, математически преобразуют в гистограммы субфракционного состава частиц (ГСС), где по оси X - размер частиц в нм, по оси Y - доля вклада в рассеяние света частицами данного размера от совокупного рассеяния измеряемого образца.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, путем сравнения ГСС исходной пробы и с ГСС обработанной пробы идентифицируют пик, соответствующий продукту реакции антиген-антитело, то есть иммунному комплексу. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанный пик соответствует частицам большего размера, чем индивидуальные иммуноглобулины на исходной гистограмме, и обязан отсутствовать на ГСС пробы, из которой удалены иммунные комплексы одним из подходящих способов в соответствии с настоящим изобретением.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, иммобилизовано на носителе, в частности на твердофазном носителе. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, иммобилизовано на микросферах.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, представляет собой бактериальный белок. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, представляет собой белок А Staphilococcus aureus, антитела, против указанных глобулинов или другие известные в данной области техники связывающие иммуноглобулины агенты. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанные антитела против иммуноглобулинов согласно настоящему изобретению представляют собой антитела, специфически связывающие иммуноглобулины конкретного изотипа.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, выбрано из: антигенного агента, антитела против иммуноглобулина конкретного изотипа, бактериального белка, специфически связывающего иммуноглобулины, например бактериального белка, специфически связывающего константные области иммуноглобулинов.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения вещество, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, представляет собой антитело животного, принадлежащего к виду, отличному от того, от которого получен исходный образец биологической жидкости. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения вещество, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, представляет собой антитело животного, принадлежащего к виду, выбранному из: мыши, кролика, козы, крысы, свиньи, лошади, овцы, обезьяны, осла.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, для детекции используют поликлональные антитела. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, для детекции используют моноклональные антитела.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обработанный образец согласно настоящему изобретению получают путем удаления из образца биологической жидкости комплекса вещества, специфически связывающего иммуноглобулины согласно настоящему изобретению и представляющего интерес иммуноглобулина. Согласно одному из вариантов реализации, указанный комплекс удаляют путем фильтрации через мембрану с диаметром пор, достаточным для элиминации (удаления) указанного комплекса из раствора. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор от 10 нм до 100 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 10-50 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 50-100 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 100-200 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 200-300 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 300-400 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 400-500 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 500 нм - 1 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 1-10 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 10-50 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 50-100 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 100 нм.

Согласно одному из вариантов реализации указанный комплекс удаляют путем центрифугирования с ускорением, достаточным для удаления указанного комплекса из пробы биологической жидкости. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100 до приблизительно 15000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100 до приблизительно 1000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 5000 до приблизительно 10000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 50G до приблизительно 15000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 50G до приблизительно 100G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100G до приблизительно 1000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 1000G до приблизительно 5000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 5000G до приблизительно 10000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 10000G до приблизительно 15000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет приблизительно 1500G.

Согласно одному из вариантов реализации указанный комплекс удаляют путем иммуноаффинной хроматографии. Антитела, специфичные к определенному изотипу или изотипам антител, иммобилизуют на подходящем носителе для получения иммуносорбента, после чего с иммуносорбентом приводят в контакт образец, содержащий комплексы антиген-антитело, за счет чего представляющие интерес комплексы связываются с иммуносорбентом и тем самым указанные комплексы удаляют из образца. Для реализации данного аспекта настоящего изобретения могут быть использованы стандартные методики проведения иммуноаффинной хроматографии, известные в данной области техники.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, используют и/или детектируют антитела класса IgG, IgA, IgM, IgE или IgD или комбинации указанных классов. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, используют и/или детектируют антитела изотипов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM или IgD или комбинации указанных изотипов.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения вещество, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, представляет собой антигенный материал. Антигенный материал согласно настоящему изобретению представляет собой любой материал, который способен специфически связываться с антителом биологической жидкости субъекта. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, антигенный материал представляет собой материал, который вызывает реакцию гиперчувствительности у субъекта. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанная реакция гиперчувствительности представляет собой аллергическую реакцию. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение антигенного материала включает его выделение или получение известными в данной области техники способами. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, антигенный материал представляет собой материал, полученный от субъекта. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, антигенный материал представляет собой материал, выбранный из экзогенного, эндогенного или аутоантигенного материала. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, антигенный материал представляет собой циклоцитруллин.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, добавление к указанной пробе антигенного материала приводит к образованию в указанной пробе иммунных комплексов, которые детектируют и исследуют способами согласно настоящему изобретению.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, добавление к указанной пробе вещества, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, приводит к образованию в указанной пробе агрегатов большего размера, чем размер отдельного иммунного комплекса.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, добавление к указанной пробе вещества, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, приводит к образованию в указанной мегаагрегатов большего размера, чем размер отдельного иммунного комплекса или агрегата.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, соответствующий частицам большего размера, чем размеры частиц, присутствующих в исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, соответствующий частицам приблизительно такого же размера, чем размеры частиц, присутствующих в исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце отсутствует пик, соответствующий частицам определенного размера, присутствующим в исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, отсутствующий в исходном образце.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, отсутствующий в исходном образце, при этом размер указанного пика соответствует предполагаемому размеру иммунных комплексов в указанной пробе.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, отсутствующий в исходном образце, при этом размер указанного пика соответствует предполагаемому размеру иммунных комплексов, агрегатов или мегаагрегатов в указанной пробе.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ

При использовании в настоящем описании термина «белок А» (protein А) указанный термин обозначает белок с молекулярной массой приблизительно 40-60 кДа, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus). Белок А связывает многие иммуноглобулины млекопитающих, предпочтительно иммуноглобулины класса G. Белок А связывает Fc-участок антител, взаимодействуя при этом с тяжелыми цепями. При этом сайт связывания антитела не изменяется. Белок А с высокой аффинностью связывает IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, а также IgG2a, IgG2b и IgG3 мыши; с умеренной аффинностью - IgM, IgA и IgE человека.

При использовании в настоящем описании термина «пациент» указанный термин обозначает любое животное, включая, но не ограничиваясь этим, людей, приматов, собак, кошек, грызунов и тому подобных, которые получают определенное лечение.

При использовании в настоящем описании термина «эффективное количество» указанный термин обозначает количество средства, достаточное для достижения желаемого результата.

При использовании в настоящем описании термина «специфическое связывание» указанный термин означает, что одно средство, вещество или агент, например полипептид, реагирует или соединяется с другим средством, веществом или агентом, например полипептидом, более часто, более быстро, с большей длительностью или с большей аффинностью или с определенными комбинациями перечисленного, чем альтернативные средства, вещества или агенты. Специфическое связывание не во всех случаях предполагает эксклюзивное связывание. Термин «связывание» обычно, но не обязательно, обозначает специфическое связывание.

В настоящем описании под «иммуноглобулином определенного изотипа» понимают иммуноглобулин типа IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, иммуноглобулин с типом каппа или лямбда легкой цепи или их варианты. При этом под веществом, которое специфически связывает иммуноглобулин определенного изотипа, понимают любое вещество, например антитело, такое как моноклональное антитело, которое селективно связывает иммуноглобулин любого определенного изотипа или ограниченную комбинацию иммуноглобулинов некоторых определенных изотипов.

В настоящем описании термин «антитело» относится к иммуноглобулину, специфически связывающемуся с конкретным антигеном. Термин охватывает иммуноглобулины естественного происхождения, то есть выработанные организмом в результате контакта с антигеном, а также те, что были искусственно синтезированы или сконструированы. В некоторых вариантах реализации термин охватывает любые полипептиды со структурными элементами иммуноглобулинов, достаточными для обеспечения специфического связывания. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антитело может быть членом любого класса иммуноглобулинов, включая любой из классов иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA и IgD. Подходящие под определение антитела включают антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифичные антитела, гуманизированные антитела (включающие участки антител человека), конъюгированные антитела (т.е. антитела, конъюгированные или слитые с другими белками, радиоактивными метками, цитотоксинами), малые модульные иммунофармацевтические (Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPsTM")) белки, одноцепочечные антитела, камелоидные антитела (антитела верблюдовых) или любые фрагменты антител. В настоящем документе термин "антитело" также включает в себя интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, однодоменные антитела (например, однодоменные антитела акулы (например, IgNAR или их фрагменты), мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность.

В настоящем документе термин «фрагмент антитела» подразумевает часть интактного антитела, такую как, например, антиген-связывающий или вариабельный домен антитела. Примеры фрагментов антитела включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; триатела; тетратела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Термин "фрагмент антитела" также включает в себя любые синтетические или сконструированные белки, действующие как антитела, связываясь со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антител, содержащие изолированные фрагменты, фрагменты "Fv", состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, рекомбинантных одноцепочечных белковых молекул, в которых вариабельные области тяжелых и легких цепей соединены белковым линкером ("белки ScFv"), и минимальные распознаваемые единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельную область.

Термин «моноклональное антитело» в данной заявке относится к гомогенной популяции антител, участвующих в высокоспецифичном распознавании и связывании отдельной антигенной детерминанты или эпигона. Напротив, поликлональные антитела обычно содержат смесь различных антител, направленных против множества различных антигенных детерминант. В объем термина «моноклональное антитело» входят как интактные и полноразмерные моноклональные антитела, так и фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) антитела, слитые белки, содержащие часть антитела, и любая другая модифицированная молекула иммуноглобулина, содержащая сайт распознавания антигена (сайт связывания антигена). Более того, «моноклональное антитело» относится к таким антителам, которые получены с помощью любого количества способов, включая, но не ограничиваясь перечисленными, продуцирование гибридомой, селекцию фагов, рекомбинантную экспрессию и трансгенных животных.

В настоящем описании термином «иммунный комплекс» обозначена макромолекулярная структура, образующаяся в результате специфического взаимодействия антигенов с бивалентными или мультивалентными антителами в биологических жидкостях организма.

В настоящем описании «антиген» или «антигенный материал» представляет собой молекулу или объект, с которым связывается антитело. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой полипептид или его часть. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой часть инфекционного агента, распознаваемую антителами.

В рамках настоящего описания под характеристикой изотипического состава иммунного комплекса понимают одно или более из следующего: размер иммунного комплекса, содержащего иммуноглобулины одного или нескольких конкретных изотипов; присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в определенном соотношении по сравнению с другими изотипами антител, входящих в состав указанного иммунного комплекса; вклад в светорассеяние иммунного комплекса(комплексов), содержащего иммуноглобулин определенного изотипа или комбинацию иммуноглобулинов определенных изотипов, который(которые) присутствует в образце биологической жидкости, или любую другую особенность иммунного комплекса, который содержится в исследуемом образце, которую определяют одновременно с получением информации об изотипе по меньшей мере одного иммуноглобулина, входящего в состав указанного иммунного комплекса. В частности, характеристика может представлять собой характеристику изотипического состава, т.е. информацию о совокупности иммуноглобулинов, которые присутствуют в иммунном комплексе.

В рамках настоящего описания под понятием «диагностика» понимают определение степени тяжести или выраженности заболевания или состояния, в том числе при отслеживании результатов терапевтического воздействия. В частности, под диагностикой понимают процесс установления диагноза, то есть заключения о наличии и/или сущности болезни и состоянии пациента.

В рамках настоящего описания под понятием «преобладающий изотип» и/или «изотип преобладает» понимают, что процент содержания антител (иммуноглобулинов) указанного преобладающего изотипа больше, чем процент содержания каждого из других изотипов антител по отдельности. В частности, антитела указанного преобладающего изотипа могут составлять по меньшей мере приблизительно 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% от суммарного содержания всех изотипов антител в указанном комплексе. В частности, иммунный комплекс может содержать только антитела (иммуноглобулины) указанного преобладающего изотипа.

В настоящем документе термин «приблизительно» или «примерно», применяемый к одной или более рассматриваемым величинам, относится к величине, значение которой сходно со значением указанной величины. В некоторых вариантах реализации термин "приблизительно" или "примерно" относится к диапазону значений, которые входят в 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее с отклонением в любую сторону (больше или меньше) от указанной величины, если не указано иное, или если иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое значение превышает 100% от возможной величины).

При использовании в настоящем описании и формуле форма единственного числа включает множественное число, если в контексте явно не указано другое.

Следует понимать, что, если одни варианты воплощения изобретения описываются в настоящем описании термином «включает», допустимо также, что другие аналогичные варианты реализации изобретения описываются термином "содержит" и/или "обязательно содержит".

Термин «и/или» при использовании в настоящем описании в такой фразе, как «А и/или В», подразумевает включение как А, так и В; А или В; А (единственно) и В (единственно).

ПРИМЕРЫ

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, предложенный способ осуществляют следующим образом. Готовят пробу биологической жидкости обследуемого пациента. Клеточные элементы и крупные белковые агрегаты удаляют с помощью центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге при скорости 10-15 тыс. оборотов в минуту. Надосадочную жидкость разбавляют физиологически приемлемым буфером, таким как фосфатный, ацетатный или фосфатно-ацетатный буфер со значением рН от приблизительно 6.0 до приблизительно 8.0, например изотоническим фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением натриевой соли ЭДТА (10 тМ) до концентраций, удобных для измерения на исследуемом приборе, в случае плазмы или сыворотки крови производят разведение в 5-10 раз.

Если интерес представляют иммунные комплексы, изначально присутствующие в исследуемой жидкости, то пробу делят на две части. Производят измерение спектров флуктуаций света, рассеянного на частицах биологической жидкости в аликвоте 1, способом динамического светорассеяния и математическое преобразование полученных спектров в гистограммы субфракционного состава частиц (ГСС_исх) по оси X - размер частиц в нм, по оси Y - доля вклада в рассеяние света частицами данного размера от совокупного рассеяния измеряемого образца. Из аликвоты 2 с помощью иммуноаффинного связывания белком А Staphylococcus aureus или антителами против иммуноглобулинов человека, иммобилизованными на частицах-носителях, удаляют иммуноглобулины и образуемые ими иммунные комплексы. Удаление осуществляется осаждением путем центрифугирования этих иммуноаффинных сорбентов, предварительно добавленных в пробу. Затем производят измерение спектра флуктуаций света, рассеянного на частицах биологической жидкости в супернатанте аликвоты 2, и получают гистограмму субфракционного состава частиц (ГСС_прА). Путем сравнения ГСС_исх с ГСС_прА идентифицируют пик, соответствующий продукту реакции антиген-антитело (иммунные комплексы). Пик должен соответствовать частицам большего размера, чем индивидуальные иммуноглобулины на исходной гистограмме (Фиг. 1А), и обязан отсутствовать на ГСС_прА. (Фиг. 1Б). Обычно гидродинамический радиус иммунных комплексов составляет приблизительно 50 нм или более. При определении изотипического состава иммуноглобулинов, входящих в иммунные комплексы, к исходной пробе добавляют моноклональные антитела, специфичные к определенным типам антител или их комбинации, после чего производят измерения. Добавленные антиизотипические антитела приводят к дополнительной агрегации и, соответственно, к избирательному увеличению размера комплексов, содержащих антитела данного изотипа. По увеличению размеров иммунных комплексов на ГСС можно судить о присутствии данной разновидности иммуноглобулинов в составе иммунных комплексов, а по отношению вклада в рассеяние более крупных иммунных комплексов к суммарному вкладу всех иммунных комплексов - о доле иммунных комплексов, содержащих иммуноглобулины данного изотипа (Фиг. 1Г). Добавление к биологической жидкости моноклональных антител к иммуноглобулинам различных изотипов приводит к специфическому связыванию между собой иммунных комплексов, содержащих иммуноглобулины данного изотипа, и образованию еще более крупных, чем изначальные иммунные комплексы, агрегатов. Появление таких крупных агрегатов свидетельствует о наличии в составе иммунных комплексов иммуноглобулинов соответствующего изотипа, а величина вклада в рассеяние позволяет примерно оценить количество (долю) данного изотипа. В случае добавления к биологической жидкости смеси моноклональных антител против нескольких различных изотипов появление более крупных агрегатов, чем при добавлении антител к отдельным изотипам, свидетельствует о гетерогенном составе иммунных комплексов и содержании в них одновременно нескольких разных изотипов антител. По приведенным данным увеличение иммуноглобулинов после добавления антигена составляет 28.5% (Фиг. 1В). Вклад IgE в суммарное рассеяние иммунных комплексов составляет 42.1%. Вклад IgG3 составляет 43.8%.

Если интерес представляют иммунные комплексы, образуемые при взаимодействии предсуществующих в биологической жидкости антител с экзогенным антигеном, то при приготовлении образца для измерений все предсуществующие иммунные комплексы и другие макромолекулярные агрегаты удаляют путем фильтрования через фильтр с диаметром пор 100 нм. Таким образом, при анализе таких образцов не регистрируют частицы большего чем 100 нм размера. При добавлении к образцу исследуемого антигена или аллергена могут образовываться иммунные комплексы большего размера, которые с высокой чувствительностью могут быть зарегистрированы с помощью динамического рассеяния. Образование их возможно лишь в случае наличия в исследуемой жидкости антител, специфически связывающих добавляемый антиген. Анализ распределения этих иммунных комплексов по изотипическому составу входящих в них антител осуществляется тем же способом, что описан выше.

Пример 1

Пациентка КАА. Диагноз - сезонный аллергический риноконъюнктивит средней тяжести. Симптомы: заложенность носа, кашель, нарушения сна. Ингаляционный провокационный тест со стандартным аллергеном смеси пыльцы деревьев положительный. Общий IgE - 740 кЕ/л.

Исследование предложенным способом показало наличие в плазме крови пациентки свободно циркулирующих иммунных комплексов (Фиг. 2, Табл. 1). Данное заключение сделано на основании отсутствия пика на ГСС плазмы крови, обработанной белком А (Фиг. 2Б), и наличия соответствующего пика на ГСС исходной плазмы (Фиг 4А черный цвет). Добавление стандартного аллергена смеси пыльцы деревьев приводит к увеличению количества иммунных комплексов по вкладу в рассеяние в среднем в 2.2 раза (с 13.47% до 29.74% (Табл. 1)).

В иммунных комплексах, связавших стандартный аллерген, присутствуют иммуноглобулины только двух изотипов: IgG1 (Фиг. 2 G1) и IgE (Фиг. 2 Е). Остальные изотипы иммуноглобулинов в составе иммунных комплексов отсутствуют (Фиг. 2, Табл.1).

Добавление смеси антител к иммуноглобулинам классов G1 и Е приводит к образованию незначительного количества (менее 2.5%, см. Табл. 1) очень крупных агрегатов (размером порядка микрона). Эти макроагрегаты образуют иммунные комплексы со смешанным составом изотипов IgG1 и IgE. Остальные иммунные комплексы однородны по своему составу и в подавляющем большинстве (более 27%, см. Табл. 1) содержат иммуноглобулины изотипа IgE. Таким образом можно с уверенностью утверждать, что сезонный аллергический риноконъюнктивит у данной пациентки имеет аллергическую природу.

Пример 2

Пациентка К, 44 года. Диагноз - сезонный аллергический риноконъюнктивит средней тяжести. Симптомы: заложенность носа, кашель, нарушения сна. Ингаляционный провокационный тест со стандартным аллергеном смеси пыльцы деревьев положительный. Общий IgE - 740 кЕ/л.

Образец плазмы крови пациентки разводили в 5 раз изотоническим фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением натриевой соли ЭДТА (10 мМ) и проводили измерения по стандартной процедуре, описанной выше.

Исследование предложенным способом показало наличие в плазме крови пациентки значительного количества свободно циркулирующих иммунных комплексов (Фиг. 3А). При сравнении гистограмм отмечают отсутствие пика на ГСС плазмы крови, обработанной белком А (Фиг. 3Б), и наличие соответствующего пика на ГСС исходной плазмы (Фиг. 3А, темный цвет). На основании этого делают вывод о присутствии в плазме крови пациентки циркулирующих иммунных комплексов.

Пример 3

Пациент Б., 52 года. Диагноз - аллергический риноконъюнктивит средней тяжести. Симптомы: отек слизистой носа, кашель, зуд. Скарификационный тест со стандартным аллергеном домашней пыли положительный. Общий IgE - 560 кЕ/л.

Перед исследованием плазму крови пациента разводили в 5 раз изотоническим фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением натриевой соли ЭДТА (10 мМ) и фильтровали через фильтр Millipor™ PWDF с диаметром пор 100 нм. Данная процедура позволяла убрать все частицы с R_h более 50 нм, в том числе и крупные иммунные комплексы. Измерения проводили по стандартной процедуре. Как видно из приведенного на фигуре 4, число таких частиц падает с 30% в исходном образце плазмы (Фиг. 4А) до нуля (Фиг. 4Б). Добавление к 0.2 мл образца 200 единиц PNU стандартного аллергена домашней пыли вызывает образование крупных иммунных комплексов с R_h более 100 нм, вклад в рассеяние которых составляет более 20%. (Фиг. 4В). На данном основании может быть подтверждено наличие у пациента аллергии на домашнюю пыль.

Пример 4

Пациентка Ш., 50 лет. Отек десен. Жалобы на дискомфорт при приеме пищи. Предположительный диагноз - аллергическая реакция на один или несколько компонентов пломбировочного материала.

Приготовление растворов тестируемых веществ

Так как большинство используемых в стоматологии веществ не растворимы или плохо растворимы в воде, необходимо экстрагировать водорастворимые компоненты, поскольку только они могут быть иммуногенны. С этой целью исследуемые материалы в течение суток вымачивали в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) при 45°С, который широко используют как универсальный растворитель в биологических исследованиях. Объем используемого ДМСО должен в 10 раз превышать объем исследуемого вещества. Вслед за этим к исследуемому образцу добавляли 10-кратный объем щелочного физиологического раствора с рН 11,5 и выдерживали образцы еще сутки. Затем рН снижали до 6,0 добавлением концентрированного буфера (обычно используют органический буфер HEPES 1М). Полученный экстракт центрифугировали при 13000 оборотов в минуту в течение 20 мин для удаления возможных микрочастиц, которые могли бы мешать проведению измерений способом динамического светорассеяния. Полученный экстракт хранят и используют в качестве концентрированного раствора для тестирования иммуногенности.

0,2 мл плазмы крови тестируемого пациента разбавляли в 5 раз 10 мМ раствором этилен-диамин-тетрауксусной к-ты (ЭДТА) в физиологическом растворе рН 7,2. Полученный раствор фильтровали через фильтр Millipor™ PWDF с диаметром пор 100 нм. Затем к 0,2 мл фильтрата добавляли 20 мкл (10% от объема) экстракта тестируемого вещества. Измерения проводили по стандартной процедуре.

Как и в предыдущем примере, о степени аллергической реакции на пломбировочный материал судили по появлению иммунных комплексов (частиц с Rh крупнее 100 нм) в ответ на действие экстракта пломбировочного материала. Было протестировано 10 образцов широко используемых пломбировочных материалов. Результаты приведены в таблице 2. Как видно из приведенных в таблице данных, наиболее пригодным пломбировочным материалом для данной пациентки является Нейлон, вообще не вызывающий образование ИК.

Пример 5

Пациент К, диагноз - ревматоидный артрит. Целью исследования было зафиксировать изменения в изотипическом составе ИК в ходе проведения терапевтического лечения. В качестве стандартного антигена использовали раствор циклоцитрулина. Образцы плазмы готовили, как описано в примере 3, с тем отличием, что, кроме циклоцитрулина, к образцам добавляли по 20 мкл моноклональных антител к иммуноглобулинам человека различных изотипов как в чистом виде, так и в различных сочетаниях. В данном случае в образцы фильтрованной плазмы с циклоцитрулином добавляли антитела к иммуноглобулинам IgG1, IgG3, IgG4, IgE и смеси антител к IgG1 и антител к IgG3, антител к IgG1 и антител к IgE, антител к IgG3 и антител к IgE. Общее количество образцов было равно 10.

На фигуре 5 выборочно представлены только наиболее характерные ГСС: ГСС фильтрованной плазмы (А), ГСС той же плазмы с циклоцитрулином (Б), ГСС плазмы с циклоцитрулином и антителами к IgG3 (В), ГСС плазмы с циклоцитрулином и смесью антител a IgG1 и IgG3 (Г) и ГСС плазмы с циклоцитрулином и смесью антител a IgG3 и IgE (Д). Как видно из приведенных гистограмм, после добавления в фильтрованную плазму пациента циклоцитрулина происходит образование иммунных комплексов, о чем свидетельствует появление пика на ГСС с R_h порядка 100 нм (Фиг. 5Б). Если образовавшиеся иммунные комплексы содержат иммуноглобулины интересующего изотипа (в данном конкретном случае IgG3 - Фиг. 5В), на ГСС появляется еще один пик с большим R_h порядка 200 нм. Вклад данных частиц в рассеяние позволяет примерно оценить долю иммуноглобулинов данного изотипа в общем пуле иммуноглобулинов. Однако эта оценка не может быть строго количественной в силу сильной нелинейности вклада в рассеяние частиц от их размера. В случае использования смесей антител к различным иммуноглобулинам картина носит еще более сложный характер. Если иммунные комплексы гомогенны по своему составу, при добавлении смеси антител картина будет похожа на описанную выше (Фиг. 5Д). Отличия от ГСС на Фиг. 5В заключаются в заметно большем вкладе в рассеяние крупных агрегатов, так как они образуются из иммунных комплексов, содержащих иммуноглобулины обоих изотипов. Если иммунные комплексы гетерогенны и содержат иммуноглобулины обоих изотипов, происходит образование еще более крупных мегаагрегатов с R_h порядка 400 нм (Фиг. 5Г). В силу упомянутой выше нелинейности зависимости вклада в рассеяние от размера частиц в данном случае можно только зафиксировать гетерогенность комплексов, но нет возможности сделать вывод о доле таких гетерогенных ИК в общем пуле. Пик с R_h порядка 100 нм в этом случае характеризует иммунные комплексы, не содержащие иммуноглобулины, антитела к которым добавлены в образец.

После анализа данных по всем 10 вариантам можно сделать заключение, что в данном конкретном случае иммуноглобулины изотипов IgG1 и IgG3 образуют гетерогенные иммунные комплексы, а иммунные комплексы, содержащие иммуноглобулин изотипа IgE, - гомогенны. Содержание иммуноглобулинов остальных изотипов находится на уровне ошибки определения (вклад в рассеяние таких ИК менее 1%).

Изменение изотипического состава иммунных комплексов у данного пациента в процессе лечения представлено в Табл. 3. Из данных таблицы видно, что изотипический состав ИК в процессе лечения претерпевает существенные изменения: если вначале (1 срок) картина не отличается от исходной и в плазме пациента содержатся иммунные комплексы, образованные исключительно иммуноглобулинами типа IgG3, то начиная со 2 срока, в составе иммунных комплексов появляются иммуноглобулины типа IgE. Начиная с 3 срока, в составе иммунных комплексов появляются иммуноглобулины типа IgG1, при этом он образует гетерогенные комплексы с иммуноглобулином IgG3. Комплексы, содержащие иммуноглобулин IgE, остаются однородными. На последнем сроке иммуноглобулин IgG1 становится основным в составе иммунных комплексов.

Пример 6

Оценка чувствительности способа. Для оценки чувствительности предлагаемого подхода к образцам культуральной среды RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 5 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому церулоплазмину добавляли церулоплазмин в различных концентрациях. Или же к такой же среде, содержащей 5 мкг на мл церулоплазмина, добавляли различные количества моноклональных антител мыши, специфически связывающих церулоплазмин. Появление иммунных комплексов измеряли с помощью динамического светорассеяния. Вклад таких комплексов в общее светорассеяние образцов, выраженный в процентах, приведен в таблицах 4 и 5.

В исходных образцах сыворотки иммунные комплексы отсутствуют. При добавлении к тестируемым образцам церулоплазмина в конечной концентрации 1000 нг/мл резко увеличивается вклад частиц с гидродинамическим радиусом приблизительно 100 нм (Табл. 4). Поскольку такие комплексы не образуются в образцах, которые не содержат антител, связывающих церулоплазмин, то резонно полагать, что они представляют собой иммунные комплексы, составленные множественными молекулами церулоплазмина, связанными между собой специфичными к нему молекулами антител. Уменьшение концентрации церулоплазмина приводит к снижению доли вклада в рассеяние иммунных комплексов и при концентрациях менее 80 пг/мл они вообще перестают регистрироваться. Аналогичная картина наблюдается при титровании сыворотки с церулоплазмином моноклональными антителами к церулоплазмину (Таблица 5).

Полученные результаты показывают, что способ согласно настоящему изобретению позволяет регистрировать антиген вплоть до концентрации указанного антигена в несколько нанограмм на мл и определять наличие специфических антител вплоть до концентрации менее 100 пг/мл.

Должно быть очевидно, что примеры и варианты реализации, описанные в данной заявке, приведены исключительно с целью пояснения и что специалистам в данной области техники будут предложены их различные модификации или изменения, которые должны быть включены в сущность и область настоящей заявки.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта. Для этого проводят: (а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта; (б) Получение для указанного образца спектра динамического светорассеяния (ДСР), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце; (в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце; (г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество с получением обработанного образца; (д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце; (е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристику изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости. Также предложена диагностика заболевания или состояния у субъекта на основании определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, и набор для данной диагностики. Группа изобретений обеспечивает повышение диагностической и прогностической информативности выявления значимых для медицинских целей антигенов в биологических жидкостях. 3 н. и 32 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Способ определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающий:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;

(б) Получение для указанного образца спектра динамического светорассеяния (ДСР), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество, с получением обработанного образца;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристику изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадии в)-е) осуществляют по меньшей мере два раза.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой млекопитающее.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что млекопитающее представляет собой человека.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный иммуноглобулин определенного изотипа представляет собой иммуноглобулин IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, иммуноглобулин с типом каппа или лямбда легкой цепи.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное вещество, применяемое на стадии (в), выбрано из: антигенного агента, антитела против иммуноглобулина конкретного изотипа, бактериального белка, специфически связывающего иммуноглобулины, например, бактериального белка, специфически связывающего константные области иммуноглобулинов.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное вещество, применяемое на стадии (в), иммобилизовано на носителе.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные иммунные комплексы образовались в образце биологической жидкости спонтанным образом.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные иммунные комплексы образовались в образце биологической жидкости в результате добавления антигенного материала.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная характеристика изотипического состава, определяемая на стадии (е), представляет собой размер иммунного комплекса, содержащего иммуноглобулины одного или нескольких изотипов согласно (в), который присутствует в указанном исходном образце.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная характеристика изотипического состава, определяемая на стадии (е), представляет собой вклад в светорассеяние иммунного комплекса, который присутствует в указанном исходном образце.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная характеристика изотипического состава, определяемая на стадии (е), представляет собой присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в иммунных комплексах в указанном исходном образце.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная характеристика изотипического состава, определяемая на стадии (е), представляет собой присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в иммунных комплексах в указанном исходном образце в определенном соотношении по сравнению с другими изотипами антител, входящими в состав указанного иммунного комплекса.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения спектра ДСР применяют гетеродинную схему детекции динамического светорассеяния.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что комплекс указанного вещества с указанным иммуноглобулином на стадии (г) удаляют с помощью одного или более из: иммуно-аффинной хроматографии, фильтрации, центрифугирования.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вещество, используемое на стадии (в), представляет собой антитело животного, принадлежащего к виду, отличному от того, от которого получен исходный образец биологической жидкости.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вещество, используемое на стадии (в), представляет собой моноклональное антитело.

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный исходный образец биологической жидкости представляет собой: цельную кровь, плазму крови, сыворотку крови, лимфу, слюну, сперму, спинномозговую жидкость, молоко, молозиво, мокроту, амниотическую жидкость, мочу, гной, слизь, выпот, асцитическую жидкость или плевральную жидкость.

19. Способ по п. 1 или 12, отличающийся тем, что на стадии (в) добавляют несколько веществ (антител), каждое из которых специфично к иммуноглобулину определенного типа.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что при сопоставлении спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, соответствующий частицам большего размера, чем размеры частиц, присутствующих в исходном образце.

21. Способ диагностики заболевания или состояния у субъекта, включающий определение характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости субъекта, причем иммунные комплексы с указанной характеристикой изотипического состава присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании или состоянии, при этом указанную характеристику изотипического состава в образце биологической жидкости определяют с помощью способа по любому из пп. 1-20.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что указанная характеристика изотипического состава представляет собой присутствие в указанном образце биологической жидкости иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов.

23. Способ по п. 21, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой млекопитающее.

24. Способ по п. 22 или 23, отличающийся тем, что млекопитающее представляет собой человека.

25. Способ по п. 21 или 23, отличающийся тем, что указанное заболевание или состояние выбрано из: реакции гиперчувствительности, аллергического заболевания, аутоиммунного заболевания, иммунной реакции на экзогенный материал, например, иммунной реакции на экзогенный материал, используемый в трансплантологии и стоматологии, инфекционного заболевания, воспаления.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что в образце биологической жидкости указанного субъекта присутствуют иммунные комплексы, в которых преобладает IgE, а заболевание представляет собой аллергию.

27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что в образце биологической жидкости указанного субъекта присутствуют иммунные комплексы, в которых преобладает IgG3, а заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.

28. Способ по п. 25, отличающийся тем, что в образце биологической жидкости указанного субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой инфекционное заболевание.

29. Способ по п. 25, отличающийся тем, что в образце биологической жидкости указанного субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой туберкулез.

30. Способ по п. 25, отличающийся тем, что в образце биологической жидкости указанного субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой реакцию на возбудителя, резистентного к антибиотику.

31. Способ по п. 25, отличающийся тем, что в образце биологической жидкости указанного субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой реакцию на инфекционного агента.

32. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанное инфекционное заболевание представляет собой заболевание, вызванное бактерией или вирусом.

33. Набор для осуществления способа по п. 21, включающий:

по меньшей мере одно вещество, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в биологическом образце, и инструкцию по применению указанного вещества в способе по п. 21.

34. Набор по п. 33, отличающийся тем, что указанное по меньшей мере одно вещество представляет собой антитело, специфичное к иммуноглобулину определенного изотипа.

35. Набор по п. 34, отличающийся тем, что указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.

название	год	авторы	номер документа
Способ прогнозирования развития туберкулеза у здоровых лиц	2018	Старшинова Анна Андреевна Зинченко Юлия Сергеевна Истомина Евгения Викторовна Филатов Михаил Валентинович Денисова Нина Владимировна Павлова Мария Васильевна Сапожникова Надежда Валентиновна Яблонский Петр Казимирович Бурдаков Владимир Станиславович Чурилов Леонид Павлович	RU2707571C1
АНТИПНЕВМОКОККОВЫЙ ГИПЕРИММУННЫЙ ГЛОБУЛИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ	2018	Монд Джеймс Гроссман Адам С.	RU2795769C1
БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К CD25 И Fc ГАММА-РЕЦЕПТОРУ ДЛЯ ЭЛИМИНАЦИИ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ КЛЕТОК	2017	Кезада, Серхио Пеггс, Карл Арсе Варгас, Фредерик	RU2759970C2
АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА CCR7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА	2006	Муньос Калльеха Сесилия Альфонсо Перес Мануэль Хесус Лопес Хираль Сониа	RU2404808C2
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИММУНОДЕФИЦИТА	2015	Гроссман Адам С. Гроссман Джерролд Б. Монд Джеймс Голдстейн Дов А.	RU2724058C2
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЁЗА	2015	Авдиенко Вадим Григорьевич Андриевская Ирина Юрьевна Бабаян Сурен Суренович Гергерт Владислав Яковлевич Ларионова Елена Евгеньевна Онян Анастасия Витальевна Черноусова Лариса Николаевна	RU2594063C1
АНТИТЕЛА К РОДСТВЕННОЙ РАКОВО-ЭМБРИОНАЛЬНОМУ АНТИГЕНУ МОЛЕКУЛЕ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ (СЕАСАМ)	2012	Маркел Гал Бен Моши Техила Сапир Яр Мендел Илана Шахтер Якоб Ортенберг Рона	RU2650869C2
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА	2016	Ван Влеркен-Исла Лилиан Эмилиа Херт Элейн Мари	RU2729396C2
ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ОЦЕНКА И ЛЕЧЕНИЕ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЛИ ПРИОБРЕТЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ИНГИБИТОРАМ ALK	2011	Мано Хироюки Чой Янг Л. Сода Манабу	RU2589834C2
СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОТИПА АНТИТЕЛ ПРОТИВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ	2011	Ван Шуй Лун Ормунд Линда Хауенштайн Скотт Сингх Шарат	RU2574976C2

Способ выявления антигенов в биологических жидкостях	1990	Дробченко Светлана Николаевна Ваврин Ростислав Зиновьевич Носкин Валентин Алексеевич Омельченко Виктор Станиславович Банников Анатолий Иванович Киселев Олег Иванович Яковлев Алексей Авенирович	SU1833818A1
СПОСОБ МНОГОПРОФИЛЬНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ В ЖИДКИХ ОБРАЗЦАХ	2003	Полтавченко Александр Георгиевич Кривенчук Николай Андреевич Серпинский Олег Игоревич Тюнников Георгий Иванович	RU2296995C2
М.В
ФИЛАТОВ и др
Исследование экзосом, секретируемых различными нормальными и злокачест венными трансформированными кле тками in vitro и in vivo
// Клиническая лабораторная диагностика, 2010, N 12, с.35, реферат
Л.Б
КОРОЛЕВСКАЯ
Метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов
Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н., Пермь, 2010, с.5-16
OHYAMA K
et al
Immune complexome analysis
Adv Clin Chem
Многоступенчатая активно-реактивная турбина	1924	Ф. Лезель	SU2013A1

Описание патента на изобретение RU2634861C9

Похожие патенты RU2634861C9

Иллюстрации к изобретению RU 2 634 861 C9

Реферат патента 2017 года СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗОТИПИЧЕСКОГО СОСТАВА ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКЕ

Формула изобретения RU 2 634 861 C9

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2634861C9

RU 2 634 861 C9