ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ОЦЕНКА И ЛЕЧЕНИЕ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЛИ ПРИОБРЕТЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ИНГИБИТОРАМ ALK Российский патент 2016 года по МПК G01N33/15 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Тирозинкиназы - класс ферментов, катализирующих фосфорилирование остатков тирозина в белковых субстратах путем переноса концевой фосфатной группы с аденозинтрифосфата. Во многих случаях тирозинкиназы играют центральную роль в передаче сигнала для целого ряда функций клетки, включая пролиферацию клеток, канцерогенез и дифференцировку клеток.

EML4-ALK - гибридный белок с протеинтирозинкиназной активностью, который присутствует в ≈ 5% случаев немелкоклеточного рака легких (НМКРЛ) и образуется в результате малой инверсии в коротком плече 2-ой хромосомы человека (Soda, М. et al. (2007) Nature 448:561-566; Mano, H. (2008) Cancer Sci. 99:2349-2355). EML4-ALK подвергается конститутивной димеризации в результате взаимодействия между суперспирализованным доменом в участке EML4 каждого мономера, и вследствие этого приобретает выраженную онкогенную активность. У трансгенных мышей, которые экспрессируют EML4-ALK, в частности в клетках эпителия легких, образуются сотни аденокарциномных узелков в обоих легких вскоре после рождения, а пероральное введение специфического ингибитора тирозинкиназной активности ALK приводит к исчезновению таких узелков в легких (Soda, М. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:19893-19897). Перечисленные результаты указывают на важную роль EML4-ALK в канцерогенезе НМКРЛ, ассоциированного с этой гибридной киназой, и они дают дополнительное подтверждение применимости нацеленной на молекулы терапии ингибиторами ALK при данном раковом заболевании. Например, в настоящее время проводятся клинические исследования ингибитора тирозинкиназной активности ALK и MET - PF-02341066 в лечении EML4-ALK-положительного НМКРЛ, и промежуточные результаты указанных исследований являются многообещающими (Kwak, E.L. et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27(suppl):15s (abstract 3509)). Однако подгруппа EML4-ALK-положительных опухолей не реагирует на указанный ингибитор, и молекулярная природа такого неуспеха лечения не известна.

Было показано, что наряду с PF-02341066 у пациентов с раком выраженной терапевтической активностью обладают и другие ингибиторы тирозинкиназ (ИТК). Например, иматиниб мезилат - ИТК, действующий на ABL1 и KIT, значительно улучшает исход заболевания у людей с хронической миелоидной лейкемией, положительной по гибридной киназе BCR-ABL1 или со стромальными опухолями желудочно-кишечного тракта, положительными по KIT (Druker, B.J. et al. (2001) N. Engl. J. Med. 344:1031-1037; Heinrich, M.C. et al. (2008) J. din. Oncol. 26:5360-5367). Далее, гефитиниб и элотиниб, которе оба являются ИТК, действующими на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), эффективны при лечении НМРКЛ, ассоциированного с активацией EGFR (Mok, T.S. et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27:5080-2087; Mok, T.S. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 361:947-957). К сожалению, существует подгруппа целевых опухолей, либо устойчивыз к соответствующим ИТК с начала лечения, либо приобритающих устойчивость к ним после первоначального ответа. В некоторых случаях неуспешного лечения были выявлены вторичные мутации в киназах-мишенях, которые напрямую или аллостерически влияют на форму АТФ-связывающего кармана, приводя к блокировке связывания ИТК (Deininger, М. et al. (2005) Blood 105:2640-2653; Kobayashi, S. et al. (2005) N. Engl. J. Med 352:786-792; Pao, W. et al. (2005) PLoS Med. 2:e73; Shah, N.P. et al. (2002) Cancer Cell 2:117-125). Соответственно, существует выраженая необходимость в идентификации мутаций, обуславливающих устойчивость тирозинкиназ, таких как EML4-ALK, с целью более успешной разработки композиций, наборов и способов идентификации, оценки, предупреждения и лечения нарушений, связанных с их аберрантной экспрессией и/или активностью.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены по меньшей мере композиция, способы и наборы для идентификации, оценки и лечения рака на основе идентификации новых мутаций в киназе анапластической лимфомы (ALK), придающих устойчивость к известным ингибиторам ALK. Такие мутации в ALK также имеют клиническую значимость для идентификации фармацевтических композиций, которые способны подходить по конфигурации анормальному АТФ-связывающему карману, формирующемуся вследствие новых мутаций в ALK, и ингибировать активность ALK.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ идентификации субъекта, страдающего раковым заболеванием или имеющего риск развития ракового заболевания, имеющего овышенный риск нечувствительности к лечению ингибитором ALK, включающий отбор пробы у пациента и анализа указанной пробы на присутствие одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK, причем присутствие одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK указывает на то, что указанный субъект имеет повышенный риск нечувствительности к лечению ингибитором ALK.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ выявления у субъекта рака или риска развития ракового заболевания, обладающего повышенным риском нечувствительности к лечению ингибитором ALK, включающий отбор пробы у пациента и анализа указанной пробы, при котором определяют уровень экспрессии, структуру и/или активность одного или более полипептидов мутантных ALK, причем присутствие одного или более полипептидов мутантных ALK указывает на то, что указанный субъект имеет повышенный риск нечувствительности к лечению ингибитором ALK.

Согласно некоторым вариантам реализации любого из аспектов настоящего изобретения указанный субъект ранее не подвергался лечению ингибитором ALK, или подвергался ранее лечению ингибитором ALK, и у него развилась по меньшей мере частичная устойчивость к ингибитору ALK (например, PF-02341066, PDD, 2-метил-11-(2-метилпропил)-4-оксо-4,5,6,11,12,13-гексагидро-2H-индазол[5,4-a]пиррол[3,4-с]карбазол-8-ил[4-(диметиламино)бензил]карбамат, (1S,2S,3R,4R)-3-({5-хлор-2-[(1-этил-2,3,4,5-тетрагидро-6-метокси-2-оксо-1Н-1-бензазепин-7-ил)амино]-4-пиримидинил}амино)бицикло[2,2,1]гепт-5-ен-2-карбоксамид и NVP-TAE684). Согласно другим вариантам реализации указанное раковое заболевание выбирают из группы, состоящей из анапластической крупноклеточной лимфомы, нейробластомы, рака молочной железы, рака прямой и ободочной кишки, воспалительных миофибробластных опухолей и немелкоклеточного рака легких. Согласно другим вариантам реализации указанную пробу отбирают из группы, состоящей из мокроты, бронхоальвеолярного смыва, плеврального выпота, ткани, цельной крови, сыворотки, плазмы, соскоба слизистой щеки, слюны, спинномозговой жидкости, мочи, кала, циркулирующих клеток опухоли, циркулирующих нуклеиновых кислот и костного мозга. Согласно еще одному варианту реализации указанная проба включает клетки или ткани. Согласно некоторым вариантам реализации молекулы полинуклеотидов или одного или более полипептидов мутантных ALK выбирают из группы, состоящей из молекул полинуклеотидов мутантных ALK или полипептидов мутантных ALK, приведенных в таблице 1. Согласно другим вариантам реализации одну или более мутаций в ALK оценивают путем теста на гибридизацию нуклеиновых кислот. Согласно другим вариантам реализации одну или более мутаций в ALK оценивают посредством полимеразной цепной реакции. Согласно другим вариантам реализации уровень экспрессии полипептидов одной или более ALK определяют с использованием реагента, который специфически связывается с полипептидами одной или более ALK (например, антитело, производное антитела и фрагмент антитела). Согласно другим вариантам реализации количество, структуру и/или активность одного или более полипептидов мутантных ALK сравнивают с контрольным образцом. Согласно некоторым другим вариантам реализации мутации в одной или более ALK оценивают в первый момент времени и по меньшей мере в один последующий момент времени. Согласно другим вариантам реализации указанная проба содержит эмбриональную или соматическую геномную ДНК.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения пациента, страдающего раковым заболеванием, или с риском развития ракового заболевания, включающий отбор пробы у указанного пациента, анализа указанной пробы с целью выявления присутствия одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK, как указано в Таблице 1, и введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора ALK. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор ALK выбирают из группы, состоящей из PF-02341066, PDD, 2-метил-11-(2-метилпропил)-4-оксо-4,5,6,11,12,13-гексагидро-2H-индазол[5,4-а]пиррол[3,4-с]карбазол-8-ил [4-(диметиламино)бензил]карбамата, (1 S,2S,3R,4R)-3-({5-хлор-2-[(1-этил-2,3,4,5-тетрагидро-6-метокси-2-оксо-1H-1-бензазепин-7-ил)амино]-4-пиримидинил}амино)бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-карбоксамида и NVP-TAE684. Согласно другим вариантам реализации указанный субъект ранее не подвергался лечению ингибитором ALK, или ранее подвергался лечению ингибитором ALK, и у него развилась по меньшей мере частичная устойчивость к указанному ингибитору ALK.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен набор для определения хемочувствительности пациента с раковым заболеванием к лечению ингибитором ALK, включающий: реагент, который специфически связывается с молекулами полинуклеотидов или полипептидами одной или более мутантных ALK; и инструкцию по применению. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает дополнительно ингибитор ALK. Согласно другим вариантам реализации указанный реагент включает один или более полинуклеотидных зондов, каждый из которых содержит полинуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности нуклеотида, представленной в Таблице 1, или комплементарную последовательности нуклеотида, кодирующего полипептид, представленный в Таблице 1 (например, олигонуклеотиды, молекулы кДНК, молекулы РНК и синтетические генные зонды, содержащие нуклеотидные основания). Согласно некоторым другим вариантам реализации указанные зонды включают полинуклеотиды длиной от 50 до 10⁷ нуклеотидов. Согласно другим вариантам реализации указанный реагент включает антитело и производное антитела, и фрагмент антитела к полипептиду, кодируемому одной или более последовательностями полинуклеотидов, приведенными в Таблице 1.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ определения того, модулирует ли исследуемое соединение активность одного или более полипептидов мутантных ALK, включающий осуществление контакта клеток млекопитающих, трансфецированных конструкцией, кодирующей один или более полипептидов мутантных ALK, с тестируемым соединением и оценку активности одного или более полипептидов мутантных ALK в указанных клетках млекопитающих, причем в случае значительной модуляции активности в присутствии тестируемого соединения по сравнению с контрольным экспериментом тестируемое соединение идентифицируют как модулятор одного или более полипептидов мутантных ALK. Согласно некоторым вариантам реализации молекулы полинуклеотидов или одного или более полипептидов мутантных ALK выбирают из группы, состоящей из молекул полинуклеотидов или полипептидов мутантных ALK, приведенных в таблице 1. Согласно другому варианту реализации указанный контроль включает клетки млекопитающего, экспрессирующие полипептид ALK дикого типа, выбранный из группы, состоящей из полипептидов, приведенных в Таблице 1. Согласно некоторым другим вариантам реализации активность одного или более полипептидов мутантных ALK выбирают из группы, состоящей из связывания АТФ, тирозинкиназной активности, пролиферации раковых клеток, роста опухоли, количества опухолей, апоптоза и метастазирования опухоли. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанный контрольный эксперимент включает клетки млекопитающего, экспрессирующие один или более полипептидов мутантных ALK в отсутствие исследуемого соединения, причем экспрессию пределяют, например, по активности одного или более полипептидов мутантных ALK (например, связывание АТФ, тирозинкиназную активность, пролиферацию раковых клеток, рост опухоли, количество опухолей, апоптоз и метастазирование опухоли).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 показаны новые мутации в ALK согласно настоящему изобретению, ассоциированные с устойчивостью к ингибиторам тирозинкиназ ALK. На Фигуре 1 представлено схематическое изображение белка EML4-ALK. Указаны положения двух мутаций de novo в киназном домене, положения для праймеров ПЦР для амплификации киназного домена или гибридной ДНК показаны закрашенными и незакрашенными стрелками выше, соответственно. На Фигуре 1 показаны результаты глубокого секвенирования кДНК киназного домена в ALK. Продукты ПЦР длиной ~1000 п.о. из линии клеток НМКРЛ Н2228 или из образца с идентификационными номерами J-#1, J-#12, J-#113, J-#127 или LK-#33 секвенировали с использованием системы GAII. Значения, указывающие общее количество считываний (Total) и некомплементарных считываний (Mismatch), показаны в каждом положении киназного домена кДНК синими и красными ромбами, соответственно. На вкладках в увеличенном масштабе показана 5'-область кДНК для J-#1 и J-#113 (обозначены зелеными прямоугольниками). На Фигуре 1 показаны электрофореграммы для клонов кДНК ALK, окружающих положения G4374 и С4493. ПЦР проводили с кДНК, приготовленными из мокроты, полученной перед лечением (начальное состояние), и из клеток плеврального выпота, полученных после рецидива (Рецидив). Замененные нуклеотиды А показаны красным.

На Фигуре 2 показаны геномные последовательности, окружающие положения, соответствующие G4374 и С4493 в кДНК ALK. Геномную ДНК, выделенную из клеток в плевральном выпоте пациента, подвергали 35 циклам ПЦР при 94°С в течение 15 с, при 60°С в течение 30 с и при 68°C в течение 2 мин, с применением ДНК-полимеразы Taq с платиной («Invitrogen», Карлсбад, Калифорния) и следующих праймеров (5'-GGTAAGAAGTGGCTCACTCTTGAG-3' и 5'-CACAACAACTGCAGCAAAGACTGG-3'), и продукты лигировали в плазмиду pT7Blue-2 («Takara Bio»), Вставки плазмид затем секвенировали на устройстве Genetic Analyzer 3130×1, в результате чего были идентифицированы клоны ПЦР, содержащие изменения в G4374A (левая панель) или С4493А (правая панель). Замененные нуклеотиды А показаны красным.

На Фигуре 3 показаны результаты обработки клеток BA/F3 ингибитором PF-02341066. Клетки BA/F3, экспрессирующие EML4-ALK (дикого типа), EML4-ALK(C1156Y), EML4-ALK(L1196M) или двойной мутантный EML4-ALK(C1156Y/L1196M), инкубировали в присутствии указанных концентраций PF-02341066 в течение 48 ч, после чего оценивали морфологию клеток при помощи фазово-контрастной микроскопии. Масштабная метка 20 мкм.

На Фигуре 4 показаны свойства новых мутаций ALK согласно настоящему изобретению, ассоциированные с устойчивостью к ингибиторам тирозинкиназы ALK. На Фигуре 4А указано число клеток BA/F3, экспрессирующих EML4-ALK (дикого типа), EML4-ALK(C1156Y), EML4-ALK(L1196M) или EML4-ALK(C1156Y/L1196M) с двойной мутацией, определенное после инкубации 5×10⁵ клеток в течение 48 ч с указанными концентрациями PF-02341066. Процент жизнеспособных клеток указан относительно числа клеток BA/F3, экспрессирующих EML4-ALK дикого типа. Данные представлены как среднее ± СО (стандартное отклонение) для трех отдельных экспериментов. На Фигуре 4В показано действие PF-02341066 на фосфорилирование тирозина в диком типе или в мутантных формах EML4-ALK. Клетки BA/F3, экспрессирующие EML4-ALK дикого типа или его мутанты с меткой FLAG, подвергали воздействию указанных концентраций PF-02341066 в течение 15 ч, после чего EML4-ALK подвергали иммунопреципитации из лизатов клеток и проводили иммуноблоттинг с антителами, специфичными к Tyr¹⁶⁰⁴-фосфорилированному ALK или к эпитопу FLAG (ALK). В качестве отрицательного контроля исследовали клетки, экспрессировавшие неактивный мутантный EML4-ALK (КМ). На Фигуре 4С показан анализ киназной активности in vitro для EML4-ALK дикого типа или его мутантных вариантов с меткой FLAG, иммунопреципитированных из лизата клеток BA/F3 (не обработанных ингибитором ALK). Указанные иммунопреципитаты инкубировали с [γ-³²Р]АТФ, синтетическим пептидом и указанными концентрациями PF-02341066. Фосфорилирование преципитатов пептидных субстратов оценивали раздельно методом иммуноблоттинга с антителами к FLAG (нижняя панель).

На Фигуре 5 показана модель трехмерной структуры киназного домена ALK. Положения аминокислот в ALK были перенесены на кристаллическую структуру рецептора инсулина со связанным аналогом АТФ ((ID «lir3» в Японской Базе данных структур белков, доступен на международном интернет-сайте pdbj.org/index.html). На правой панели показана структура белка, наблюдаемая с левой стороны модели на левой панели. α-Спирали и β-слои показаны малиновым и оранжевым, соответственно. Также указаны положения спирали аС, Cys¹¹⁵⁶ и Leu¹¹⁹⁶.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, по крайней мере частично, на идентификации определенных областей генома, включая, например, мутации в киназе анапластической лимфомы (ALK), ассоциированные с прогнозированием эффективности лечения рака ингибиторами ALK. В частности, в настоящей заявке были идентифицированы мутации в гене ALK (например, мутации в гене, кодирующем полипептид EML4-ALK), которые могут приводить к образованию полипептидов, по меньшей мере частично устойчивых к терапии ингибиторами ALK. Также согласно настоящему изобретению предложены способы идентификации таких специфических областей в геноме при помощи технологий, известных в технике, включая микрочипы на основе олигонуклеотидов (Brennan, et al. (2004) Cancer Res. 64(14):4744-8; Lucito, et al. (2003) Genome Res. 13:2291-2305; Bignell et al. (2004) Genome Res. 14:287-295; Zhao, et al (2004) Cancer Research, 64(9):3060-71), но не ограничиваясь ими, и другие способы, описанные в настоящей заявке, включая, например, способы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и прямом секвенировании. Также согласно настоящему изобретению предложены диагностические наборы для применения в указанных способах.

Разные аспекты настоящего изобретения описаны более подробно в следующих подразделах.

I. Определения

Формы единственного числа в настоящей заявке относятся к одному или более обозначенным грамматическим объектам. В качестве примера, «элемент» означает один элемент или более одного элемента.

Термин «измененное количество» или «измененный уровень» маркера относится к повышенному или пониженному числу копий маркера или участка хромосомы, таких как мутации гена ALK и/или продукта гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1), и/или повышенный или пониженный, по сравнению с уровнем экспрессии или числом копий в контрольном образце, уровень экспрессии маркерного гена или генов в образце рака. Термин «измененное количество» маркера также включает повышенный или пониженный уровень белка - маркера в пробе, например, в пробе рака, по сравнению с уровнем белка - маркера в нормальном, контрольном образце.

Термин «измененный уровень экспрессии» мутаций гена ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) относится к уровню экспрессии или числу копий маркера в тестируемом образце, таком как образец, отобранный у пациента, страдающего раковым заболеванием, которые выше или ниже стандартной ошибки способа анализа, применяемого для оценки экспрессии или числа копий, и может по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре, по меньшей мере в пять или по меньшей мере в десять раз или более превышать уровень экспрессии или число копий мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) в контрольном образце (например, в образце от здорового субъекта, не страдающего ассоциированным заболеванием), или средний уровень экспрессии или число копий мутированного гена ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) для нескольких контрольных образцов. Измененный уровень экспрессии больше или меньше стандартной ошибки способа анализа, применяемого для оценки экспрессии или числа копий, и может по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре, по меньшей мере в пять или по меньшей мере в десять раз или более превышать уровень экспрессии или число копий мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) в контрольном образце (например, в образце от здорового субъекта, не страдающего ассоциированным заболеванием), или средний уровень экспрессии или число копий мутированного гена ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) для нескольких контрольных образцов.

Термин «измененная активность» маркера относится к активности маркера, которая повышена или понижена при заболевании, например, в пробах раковой опухоли, по сравнению с активностью указанного маркера в норме, в контрольной пробе. Измененная активность может быть, например, результатом измененной экспрессии маркера, измененного уровня белка - маркера, измененной структуры маркера или, например, измененного взаимодействия с другими белками, участвующими в том же или другом пути передачи сигнала в качестве маркера.

Термин «измененная структура» маркера относится к наличию мутации или мутаций в гене маркера или в белке - маркере, например, мутаций, которые влияют на экспрессию или активность маркера, по сравнению с нормальным геном или белком дикого типа. Например, мутации включают мутации типа межхромосомных и внутрихромосомных перестроек, замен, делеций и вставок. Мутации могут иметь место в кодирующей или некодирующей области указанного маркера.

Термин «киназа анапластической лимфомы» или «ALK» взаимозаменяемо применяется в настоящей заявке и относится к нативной киназе анапластической лимфомы, а также к определенным ее вариантам и мутантам, полученным из одного источника (например, грызуны, люди и другие млекопитающие). Согласно некоторым вариантам реализации белок ALK соответствует идентификационному номеру NCBI Ref Seq NP_004295. Если не указано иное, данные термины относятся к белку человека. Также аббревиатура «ALK» в настоящей заявке может относиться к гену, кодирующему ALK. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность нуклеотидов ALK соответствует идентификационному номеру NCBI Ref Seq NP_004304.3 и номеру доступа в системе GenBank 29029631, причем специалист в данной области техники может без труда идентифицировать в указанной системе значимые последовательности (например, кодирующие, 5'UTR, 3'UTR, инициацию транскрипции, инициацию трансляции, терминацию транскрипции, терминацию трансляции и др. последовательности).

Кроме того, термины «киназа анапластической лимфомы» или «ALK» в настоящей заявке также могут включать гибридные киназы ALK и их варианты, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Такие гибридные киназы ALK и их варианты обладают активностью киназы ALK и могут содержать мутации, описываемые в настоящей заявке, придающие киназе ALK устойчивость к ингибиторам ALK. К репрезентативным примерам можно отнести EML4-ALK Вариант 1 (АВ274 722.1; BAF73611.1), EML4-ALK Вариант 2 (АВ275889.1; BAF73612.1), EML4-ALK Вариант За (АВ374361.1; BAG55003.1), EML4-ALK Вариант 3b (AB374362.1; BAG55004.1), EML4-ALK Вариант 4 (АВ374363.1; BAG75147.1), EML4-ALK Вариант 5а (АВ374364.1; BAG75148.1), EML4-ALK Вариант 5b (AB374365.1; BAG75149.1), EML4-ALK Вариант 6 (АВ462411.1; ВАН57335.1), EML4-ALK Вариант 7 (АВ462412.1; ВАН57336.1), KIF5B-ALK (AB462413.1; ВАН57337.1), NPM-ALK, TPM3-ALK, TFGXL-ALK, TFGL-ALK, TFGS-ALK, ATIC-ALK, CLTC-ALK, MSN-ALK, TPM4-ALK, MYH9-ALK, RANBP2-ALK, AL017-ALK и CARS-ALK (см. например, публикацию Pulford et al., (2004) J. Cell. Physiol. 199:330-358, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полную версию). Кроме того, специалист в данной области технике должен понимать, что варианты киназы ALK могут возникать в зависимости от конкретного события объединения киназы ALK и ее партнера по слиянию (например EML4 может объединять в себе по меньшей мере экзон 2, 6а, 6b, 13, 14 и/или 15, как описано, например в публикации Horn and Рао, (2009) J. Clin. Oncol. 27:4247-4253, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полную версию). Например, репрезентативные последовательности ALK, предложенные в настоящем изобретении, следующие:

Последовательность кДНК дикого типа с мутацией в кодоне TGC (4373-4375), кодирующей аминокислоту, отличную от цистеина, или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность кДНК дикого типа с мутацией в кодоне СТО (4493-4495), кодирующей аминокислоту, отличную от лейцина, или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность кДНК дикого типа с мутацией G4374A или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность кДНК дикого типа с мутацией С4493А или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность белка дикого типа с мутацией Cysll56Xaa, где Хаа - это аминокислота, отличная от цистеина, или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность белка дикого типа с мутацией Leull96Xaa, где Хаа - это аминокислота, отличная от лейцина, или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность белка дикого типа с мутацией Cysll56Tyr или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность белка дикого типа с мутацией Leull96Met mutation или с соответствующей мутацией в его гомологе

Термин «мутации ALK» относится к изменениям последовательности нуклеиновой кислоты и/или белка относительно эталонной последовательности киназы анапластической лимфомы. Однако согласно некоторым вариантам реализации термин «мутации ALK» может относиться к специфическим мутациям киназы анапластической лимфомы, являющимся прогностическими в отношении ответа на лечение ингибиторами ALK (например, PF-02341066 и/или PDD). Например, мутации аминокислоты цистеина в положении 1156 (С1156) и/или аминокислоты лейцина в положении 1196 (L1196) в белке ALK дикого типа (NP_004295) с их заменой на другую аминокислоту согласно настоящему описанию придает устойчивость к ингибиторам ALK. Согласно одному варианту реализации в положении С1156 находится аминокислота тирозин и/или в положении L1196 находится аминокислота метионин. Также специалисты в данной области техники должны понимать, что положения аминокислот, соответствующие мутациям «С1156» и «L1196» в белке ALK дикого типа, будут иметь номера, отличные от номеров в эталонной последовательности (например, гомологи ALK, гибридные белки ALK и др.), что не должно влиять на их прогностическую ценность в отношении ответа на лечение ингибиторами ALK (например, PF-02341066 и/или PDD). Специалист в данной области техники также должен понимать, что существует установленное и четко определенное соответствие между последовательностью аминокислот в конкретном белке и последовательностью нуклеотидов, которая может кодировать указанный белок, что определяется генетическим кодом (приводится ниже). Аналогично, существует установленное и четко определенное соответствие между последовательностью нуклеотидов в конкретной нуклеиновой кислоте и последовательностью аминокислот, кодируемой указанной нуклеиновой кислотой, что определяется генетическим кодом.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Аланин(Аlа, A) GCA, GCC, GCG, GCT Аргинин(Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT Аспарагин (Asn, N) ААС, ААТ Аспарагиновая кислота(Asp, D) GAC, GAT Цистеин(Cys, С) TGC, TGT Глутаминовая кислота(Glu, E) GAA, GAG Глутамин(Gin, Q) CAA, CAG Глицин(Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT Гистидин(His, Н) САС, CAT Изолейцин(Ilе, I) АТА, АТС, АТТ Лейцин(Leu, L) СТА, СТС, CTG, CTT, ТТА, TTG Лизин(Lys, К) ААА, AAG Метионин(Met, М) ATG Фенилаланин(Phe, F) ТТС, ТТТ Пролин(Pro, Р) ССА, ССС, CCG, ССТ Серин(Ser, S) AGC, AGT, ТСА, ТСС, TCG, ТСТ Треонин (Thr, Т) АСА, АСС, ACG, ACT Триптофан (Trp, W) TGG Тирозин (Tyr, Y) ТАС, ТАТ Валин (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT Сигнал терминации (стоп-кодон) ТАА, TAG, TGA

Важным и хорошо известным свойством генетического кода является его избыточность, что значит, что для большинства аминокислот, применяемых при построении белков, может применяться более одного триплета (например, как проиллюстрировано выше). Следовательно, несколько разных последовательностей нуклеотидов может кодировать конкретную последовательность аминокислот. Такие последовательности нуклеотидов считаются функционально эквивалентными, поскольку они приводят к образованию одной и той же последовательности аминокислот во всех организмах (хотя определенные организмы могут транслировать некоторые последовательности более эффективно, чем другие). Кроме того, иногда в конкретной последовательности нуклеотидов может находиться метилированный вариант пурина или пиримидина. Такое метилирование не влияет на взаимосвязь кодирования между кодоном из трех нуклеотидов и соответствующей аминокислотой. Кроме того, специалист в данной области техники также должен понимать на основании соответствующей таблицы кодонов, как мутировать нуклеотиды в специфическом кодоне, чтобы специфически изменить кодируемую аминокислоту. Например, кодон для Cys-1156 - «TGC», а кодон для Tyr может быть «ТАТ» или «ТАС». Таким образом, замена одного нуклеотида с G на А во 2-ом положении указанного кодона приведет к кодированию тирозина вместо цистеина. Специалист в данной области техники может провести аналогичные манипуляции и разработать другие мутации.

Термин «связывающее соединение» должен относиться к связывающей композиции, такой как малая молекула, антитело, пептид, пептидный или непептидный лиганд, белок, олигонуклеотид, аналог олигонуклеотида, такой как нуклеиновая кислота пептид, лектин или любая другая молекула, которая способна специфически связываться с целевым белком или молекулой, или образовывать стабильный комплекс с анализируемым веществом, такой как комплекс с белками.

Термин «связывающая частица» относится к любой молекуле, к которой можно напрямую или не напрямую присоединить молекулярные метки, которые способны специфически связываться с анализируемым веществом. Связывающие частицы включают, без ограничений, антитела, связывающие антитела композиции, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты и органические молекулы, обладающие молекулярной массой приблизительно до 1000 Дальтон и содержащие атомы, выбранной из группы, состоящей из водорода, углерода, кислорода, азота, серы и фосфора.

Термин «биомаркер» или «маркер» означает ген, мРНК или белок, который может подвергаться изменению, причем указанное изменение ассоциировано с раком. Указанное изменение может касаться количества, структуры и/или активности в ткани или клетках раковой опухоли в сравнении с количеством, структурой и/или активностью в нормальной или здоровой ткани или клетках (например, в контроле), и ассоциировано с заболеванием, таким как рак, например, маркер согласно настоящему изобретению, который ассоциирован с раком или является прогностическим фактором в отношении чувствительности к противораковым средствам, может содержать измененную последовательность нуклеотидов, хромосомную транслокацию, внутрихромосомную инверсию, измененное число копий, уровень экспрессии, уровень белка, активность белка или статус метилирования, в ткани или клетках раковой опухоли по сравнению с нормальной, здоровой тканью или клетками. Кроме того, термин «маркер» включает молекулу, структура которой изменена, например, мутирована (содержит мутации), например, отличается от последовательности дикого типа на уровне нуклеотидов или аминокислот, например, вследствие замены, делеции или вставки, когда присутствует в ткани или клетках, ассоциированных с заболеванием, таким как рак.

Термин «рак» или «опухоль» относится к наличию клеток, обладающих свойствами, типичными для клеток, вызывающих рак, такими как неконтролируемая пролиферация, бессмертность, потенциал метастазирования, высокая скорость роста и пролиферации и некоторые характерные морфологические особенности. Раковые клетки часто существуют в форме опухоли, но такие клетки могут существовать в организме животного и по отдельности, или могут быть не образующие опухоли раковые клетки, такие как клетки лейкемии. Применяемый в настоящей заявке термин «рак» включает как предраковые, так и раковые состояния. Рак включает в себя рак В-клеток, например, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезни тяжелых цепей, например, болезнь альфа-цепей, болезнь гамма-цепей, болезнь мю-цепей, доброкачественную моноклональную гаммапатию, амилоидоз иммуноцитов, меланомы, рак молочной железы, рак легких (такой как немелкоклеточная карцинома легких или НМКРЛ), рак бронхов, рак прямой и ободочной кишки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак мозга или центральной нервной системы, рак периферической нервной системы, рак пищевода, рак шейки матки, рак матки или эндометрия, рак ротовой полости или глотки, рак печени, рак почек, рак яичек, рак желчных протоков, рак тонкой кишки или червеобразного отростка, рак слюнных желез, рак щитовидной железы, рак надпочечников, остеосаркому, хондросаркому, рак органов кроветворения, аденокарциномы, воспалительные опухоли из фибробластов, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST), рак ободочной кишки, множественную миелому (ММ), миелодиспластический синдром (МДС), миелопролиферативные расстройства (МПР), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), истинную полицитемию, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому (НХЛ), саркому мягких тканей, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, остеолитическая саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, плоскоклеточный рак, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, цистаденокарциному, медуллярный рак, бронхогенный рак, гипернефрому, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональный рак, нефрому, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, гранулобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, невриному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, нейробластому, ретинобластому, фолликулярную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, печеночно-клеточную карциному, рак щитовидной железы, рак желудка, рак головы и шеи, разновидности мелкоклеточного рака, идиопатическую тромбоцитопению, агногенную миелоидная метаплазия, синдром гиперэозинофилии, системный мастоцитоз, системную гиперэозинофилию, хронический эозинофильный лейкоз, разновидности нейроэндокринного рака, карциноиды и подобные, но не ограничиваясь ими.

Термин «химиотерапевтический препарат» относится к химическому веществу, такому как цитотоксический или цитостатический препарат, который применяют для лечения патологического состояния, например, рака.

Термин «комплементарный» относится к широкой концепции комплементарности последовательностей между областями двух цепей нуклеиновых кислот или между областями одной и той же цепи нуклеиновой кислоты. Известно, что остаток аденина первой области нуклеиновой кислоты может образовывать специфические водородные связи («спаривание оснований») с остатком второй области нуклеиновой кислоты, который антипараллелен первой области, если указанный остаток - это тимин или урацил. Аналогично, известно, что остаток цитозина первой области нуклеиновой кислоты может образовать пару с остатком второй области нуклеиновой кислоты, который антипараллелен первой области, если указанный остаток - это гуанин. Первая область нуклеиновой кислоты комплементарна второй области той же или другой нуклеиновой кислоты, если при антипараллельном совмещении двух указанных областей по меньшей мере один остаток нуклеотида первой области может образовать пару с остатком второй области. Согласно некоторым вариантам реализации указанная первая область содержит первую часть, а вторая часть содержит вторую часть, причем при антипараллельном совмещении двух указанных областей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95% остатков нуклеотидов первой части могут образовать пару с остатками нуклеотидов во второй части. Согласно другим вариантам реализации все остатки нуклеотидов первой части могут образовать пару с остатками нуклеотидов во второй части.

Термин «число копий гена» или «число копий маркера» относится к числу последовательностей ДНК в клетке, кодирующих продукт определенного гена. Обычно для конкретного гена у млекопитающего присутствует две копии каждого гена. Однако число копий можно увеличить путем амплификации или дупликации генов или же уменьшить посредством делеции.

Маркер «иммобилизован» на субстрате, если он ковалентно или нековалентно связан с субстратом, так что указанный субстрат можно смыть жидкостью (например, стандартным физиологическим раствором с цитратом, рН 7,4) без диссоциации существенного количества маркера с указанного субстрата.

В настоящей заявке термин «отношение рисков» относится к статистическому способу, применяемому для генерирования оценки относительного риска. «Отношение рисков» - это отношение прогнозируемого риска для одной группы и для другой группы. Например, популяции пациентов, получающие ингибитор ALK и не получающие ингибитора ALK, можно оценивать, чтобы определить, эффективен ли ингибитор ALK в увеличении времени до системного рецидива заболевания, в частности в зависимости от статуса мутаций ALK. Например, лечение субъектов, обладающих мутациями ALK в ткани раковой опухоли, описываемыми в настоящей заявке, приводит к повышению терапевтической пользы от ингибиторов ALK по сравнению с субъектами, не обладающими мутациями ALK в ткани раковой опухоли.

В настоящей заявке термин «препарат, ингибирующий ALK» или «ингибитор ALK» относится к соединению, которое может подавлять биологическую активность ALK. Типы биологической активности также могут включать ответ пациента, как определено в настоящей заявке. Примеры препаратов, ингибирующих ALK, включают PF-02341066, PDD, 2-метил-11-(2-метилпропил)-4-оксо-4,5,6,11,12,13-гексагидро-2H-индазоло[5,4-a]пирроло[3,4-с]карбазол-8-ил [4-(диметиламино) бензил]карбамат, (1S,2S,3R,4R)-3-({5-xnop-2-[(l-этил-2,3,4,5-тетрагидро-6-метокси-2-оксо-1Н-1-бензазепин-7-л)амино]-4-пиримидинил}амино)бидикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-карбоксамид и NVP-ТАЕ684, но не ограничиваясь ими (например см. PNAS 104:270-275, 2007; Choi, Y.L. et al. (2008) Cancer Res. 68:4971-2976; и Biochemistry 48:3600-3609, 2009, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки на их полную версию).

Применяемые в настоящей заявке взаимозаменяемые термины «гомология» или «идентичность» относятся к сходству между двумя последовательностями полинуклеотидов или между двумя последовательностями полипептидов, причем идентичность относится к более строгому сравнению. Фразы «процент идентичности или гомологии» и «% идентичности или гомологии» относятся к проценту сходства последовательностей, обнаруживаемого при сравнении двух или более последовательностей полинуклеотидов или двух или более последовательностей полипептидов. Термин «сходство последовательностей» относится к проценту сходства в последовательности пар оснований (определяемого любым подходящим способом) между двумя или более последовательностями полинуклеотидов. Две или более последовательности могут быть где-либо сходны на 0-100%, или на целые значения, лежащие между ними. Идентичность или сходство можно определять путем сравнения положения в каждой последовательности, которое можно выравнивать в целях сравнения. Если какое-либо положение в сравниваемой последовательности занято тем же нуклеотидным основанием или аминокислотой, то по данному положению указанные молекулы идентичны. Степень сходства или идентичности между последовательностями полинуклеотидов является функцией от числа идентичных или соответствующих нуклеотидов в положениях, общих для указанных последовательностей нуклеотидов. Степень идентичности последовательностей полипептидов является функцией от числа идентичных аминокислот в положениях, общих для указанных последовательностей полипептидов. Степень гомологии или сходства последовательностей полипептидов является функцией от числа аминокислот в положениях, общих для указанных последовательностей полипептидов. Применяемый в настоящей заявке термин «существенная гомология» относится к гомологии по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или более.

Рак «подавляется», если по меньшей мере один симптом рака облегчается, прекращается, замедляется или предотвращается. Применяемый в настоящей заявке термин «подавление» рака также относится к сокращению, замедлению, отсрочиванию или предотвращению рецидива или метастазирования указанного рака.

«Нуклеиновая кислота - маркер» или «нуклеиновая кислота - биомаркер» - это нуклеиновая кислота (например, ДНК, мРНК, кДНК), кодируемая маркером согласно настоящему изобретению или соответствующая маркеру согласно настоящему изобретению. Например, такие молекулы нуклеиновых кислот-маркеров включают ДНК (например, геномную ДНК и кДНК), содержащую полную последовательность или часть последовательности любой нуклеиновой кислоты, указанной в Таблице 1, или комплементарную цепь, или гибридизующийся фрагмент такой последовательности. Указанная нуклеиновая кислота - маркер также включает РНК, содержащую полную последовательность или часть последовательности любой нуклеиновой кислоты, указанной в Таблице 1, или комплементарную цепь, или гибридизующийся фрагмент такой последовательности, причем все остатки тимидина замещены остатками уридина. «Белок - маркер» это белок, кодируемый маркером согласно настоящему изобретению или соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению. Белок-маркер включает полную последовательность или часть последовательности белка, кодируемого или соответствующего последовательностям, указанным в Таблице 1, или его фрагмента. Термины «белок» и «полипептид» в настоящей заявке взаимозаменяемы.

«Нормальное» число копий маркера или «нормальный» уровень экспрессии маркера - это уровень экспрессии, количество копий маркера в биологической пробе, например, пробе, содержащей мокроту, бронхоальвеолярный смыв, плевральный выпот, ткань, цельную кровь, сыворотку, плазму, соскоб со слизистой оболочки щеки, слюну, спинномозговую жидкость, мочу, кал и костный мозг из организма субъекта, например, человека, не страдающего раковым заболеванием.

Термин «гиперэкспрессия» или «существенно повышенные уровень экспрессии, количество копий и/или активность» мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеров, описанных в Таблице 1) относится к уровню экспрессии, числу копий и/или активности в тестируемой пробе, которые превышают стандартную ошибку анализа, применяемого для оценки экспрессии или числа копий, и могут по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре, по меньшей мере в пять или по меньшей мере в десять или более рак превышать уровень экспрессии или число копий мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеров, описанных в Таблице 1) в контрольной пробе (например в пробе из организма здорового субъекта, не страдающего раковым заболеванием), или средний уровень экспрессии или число копий мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеров, описанных в Таблице 1) для нескольких контрольных проб.

Термин «зонд» относится к любой молекуле, которая способна селективно связываться со специально предназначенной молекулой-мишенью, например, с маркером согласно настоящему изобретению. Зонды либо может синтезировать специалист в данной области техники, либо их можно получить из соответствующих биологических препаратов. В целях определения молекулы-мишени можно разрабатывать специальные зонды с меткой, как описано в настоящей заявке. Примеры молекул, которые можно применять в качестве зондов, включают РНК, ДНК, белки, антитела и органические мономеры, но не ограничиваются ими.

Аббревиатура «RECIST» расшифровывается как «Критерии Оценки Ответа при Солидных Опухолях» и означает опубликованный свод правил определения, когда состояние пациента с раком улучшилось (пациент «отвечает на лечение»), осталось неизменным («стабилен») или ухудшилось («прогрессирование») в ходе лечения. Определение ответа на лечение согласно критериям RECIST было опубликовано, например, at Journal of the National Cancer Institute, Vol.92, No.3, Feb. 2, 2000, и критерии RECIST могут включать другие похожие опубликованные определения и установленные правила. Специалист в данной области техники должен понимать определения, установленные в критериях RECIST и применяемые в настоящей заявке, такие как «PR (частичная ремиссия)», «CR (полная ремиссия)», «SD (стабильное заболевание)» и «PD (прогрессирование заболевания)».

«Чувствительность», «отвечать» на лечение и другие формы данного слова, применяемые в настоящей заявке, относятся к реакции субъекта на лечение ингибиторами ALK. В качестве примера, субъект отвечает на лечение ингибиторами ALK, если рост опухоли замедляется приблизительно на 10%, приблизительно на 20%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90% или более. Согласно другому примеру субъект отвечает на лечение ингибиторами ALK, если опухоль у субъекта сокращается приблизительно на 5%, приблизительно на 10%, приблизительно на 20%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50% или более, что определяют по соответствующему показателю, например, по массе или по размеру. Согласно другому примеру субъект отвечает на лечение ингибиторами ALK, если продолжительность жизни указанного субъекта увеличивается приблизительно на 5%, приблизительно на 10%, приблизительно на 20%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50% или более по сравнению с продолжительностью жизни, прогнозируемой в отсутствие лечения. Согласно еще одному примеру субъект отвечает на лечение ингибиторами ALK, если у указанного субъекта увеличивается выживаемость без признаков заболевания, общая выживаемость или увеличивается время до прогрессирования. Для определения, отвечает ли субъект на лечение, можно применять несколько способов, включая критерии RECIST, как было определено выше.

Термины «проба», «проба ткани», «проба пациента», «проба клеток или ткани пациента» или «образец» относятся к совокупности аналогичных клеток, полученных из ткани субъекта или пациента. Источником пробы ткани может быть паренхима из свежего, замороженного и/или законсервированного органа, проба ткани, биопсия или аспират; кровь или любые компоненты крови; жидкие среды организма, такие как спинномозговая жидкость, околоплодная жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость; или клетки, отобранные на любой стадии беременности или развития субъекта. Указанная проба ткани может содержать соединения, которые в природе не примешиваются к ткани, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксаторы, питательные вещества, антибиотики или подобные.

Количество маркера, например, экспрессия или число копий мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеров описанных в Таблице 1), у субъекта «существенно» выше или ниже, чем нормальное количество маркера, если количество указанного маркера больше или меньше, соответственно, чем нормальный уровень на количество, превышающее стандартную ошибку способа анализа, применяемого для оценки количества, или по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре, по меньшей мере в пять, по меньшей мере в десять или более раз превышает это количество. В качестве альтернативы, количество маркера у указанного субъекта может считаться «существенно» выше или ниже, чем нормальное количество, если указанное количество по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре или по меньшей мере в пять раз выше или ниже, нормального количества маркера, соответственно.

Применяемый в настоящей заявке термин «значимое явление» должен относиться к явлению в течении заболевания субъекта, которое важно по мнению специалиста в данной области техники. Примеры значимых явлений, например, включают, без ограничений, первичную диагностику, летальный исход, рецидив, определение того, что заболевание пациента метастазирует, обострение заболевания пациента или прогрессирование заболевания пациента из одной из вышеперечисленных стадий в другую. Значимым явлением может быть любое важное явление, применяемое для оценки OS, TTP и/или применения критериев RECIST или других критериев ответа по мнению специалиста в данной области техники.

Применяемые в настоящей заявке термины «субъект» и «пациент» взаимозаменяемы. Применяемые в настоящей заявке термины «субъект» и «субъекты» относятся к животному, например, млекопитающему, включая не приматов (например, корову, свинью, лошадь, осла, козу, верблюда, кошку, собаку, морскую свинку, крысу, мышь, овцу) и приматов (например, обезьяну, такую как яванский макак, горилла, шимпанзе и человека).

Применяемый в настоящей заявке термин «временной ход» должен относиться к количеству времени между начальным явлением и последующим явлением. Например, применительно к раку пациента, термин «временной ход» может относиться к заболеванию пациента, и его можно оценить путем отметки значимых явлений в течении указанного заболевания, причем первое явление может быть постановкой диагноза, а второе явление может быть, например, метастазированием.

Термин «время до прогрессирования» или «ТТР» относится к времени, прошедшему от начала лечения до прогрессирования рака или момента оценки статуса. Оценка статуса может проходить вследствие окончания исследования или изменения режима лечения. Также время до прогрессирования может выражаться как вероятность, например, на кривой Каплана-Мейера, на которой время до прогрессирования может отражать вероятность того, что определенный период времени у пациента не будет прогрессирования, то время, которое пройдет между началом лечения и прогрессированием или оценкой статуса.

«Транскрибированный полинуклеотид» - это полинуклеотид (например, РНК, кДНК или аналог одной из РНК или кДНК), который комплементарен или гомологичен на всем протяжении или частично зрелой РНК, образованной при транскрипции маркера согласно настоящему изобретению и нормальной посттранскрипционной обработке транскрипта (например, сплайсинг), если таковая имеет место, и обратной транскрипции указанного транскрипта.

«Лечить», «лечение» и другие формы данного слова относятся к введению ингибитора ALK с целью предотвращения роста раковой опухоли, сокращения раковой опухоли в размере или по массе, увеличения ожидаемого времени выживания субъекта или времени до прогрессирования опухоли, или подобное.

Термины «низкая экспрессия» или «существенно сниженный уровень экспрессии, числа копий и/или активности» мутированных генов ALK и/или продуктов генов (например, маркеров, указанных в Таблице 1) относятся к уровню экспрессии или числу копий в тестируемой пробе, которые отклоняются более чем на стандартную ошибку способа анализа, применяемого для оценки экспрессии или числа копий, например, по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре, по меньшей мере в пять или по меньшей мере в десять раз или более ниже, чем уровень экспрессии или число копий мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) в контрольном образце (например, в образце от здорового субъекта, не страдающего раковым заболеванием), или средний уровень экспрессии или число копий мутированного гена ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) для нескольких контрольных проб.

II. Примеры способов согласно настоящему изобретению

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, основано на идентификации специфических областей генома, включая, например, мутации в ALK, ассоциированной с прогнозированием эффективности ингибиторов ALK при лечении рака. Анализ экспрессии последовательностей гена ALK позволил идентифицировать новые мутации в полипептидах ALK (например, в биологических маркерах, приведенных в таблице 1, включая полипептиды EML4-ALK), которые могут придавать указанным полипептидам по меньшей мере частичную устойчивость к терапии ингибиторами ALK. Соответственно, присутствие и/или отсутствие одного или более таких биологических маркеров в разных способах, описываемых в настоящей заявке, попадают в область настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации способы согласно настоящему изобретению можно применять для отслеживания прогрессирования рака у субъекта, причем, если в пробе, взятой у субъекта, присутствует одна или более мутантных форм ALK (например, мутантные формы EML4-ALK), идентифицируемых в настоящей заявке, во время прогрессирования рака, например, в первый момент времени и в последующие моменты времени, то указанное раковое заболевание с меньшей вероятностью отвечает на опосредованное ингибиторами ALK лечение, и наоборот. Согласно еще одному варианту реализации между первым моментом времени и каким-либо последующим моментом времени субъект подвергается лечению, например, химиотерапии, лучевой терапии, операции или любым другим терапевтическим процедурам, нужным для подавления рака, завершает лечение или входит в состояние ремиссии.

Как далее описано в настоящей заявке, один или более биологических маркеров согласно настоящему изобретению (например, мутированные ALK, включая мутированные EML4-ALK) можно специфически идентифицировать по наличию в геномной последовательности (например, в эмбриональной или соматической) при сравнении ее с эталонной последовательностью, такой как SEQ ID №1. Например, способы, описываемые в настоящей заявке, могут включать определение биологических маркеров согласно настоящему изобретению путем проведения реакции амплификации целевой нуклеиновой кислоты в отношении фрагмента секвенирования ДНК, содержащего одну или более мутаций, приведенных в таблице 1, и анализа амплифицированной целевой нуклеиновой кислоты на присутствие одной или более мутаций.

В технике известны разные способы амплификации нуклеиновых кислот, такие как ПЦР (полимеразная цепная реакция), описанная в Патенте США №4683195 (включен в настоящую заявку посредством ссылки). Патенте США №4683202 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и Патенте США №4800159 (включен в настоящую заявку посредством ссылки), а также ее альтернатива - ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией), особенно в ее одностадийной форме, раскрываемой в Патенте ЕР-В-0.569.272, ЛЦР (лигазная цепная реакция), которая описана, например, в заявке на патент ЕР-А-0.201.184, РЦР (репаративная цепная реакция), раскрываемая, например, в заявке на международный патент WO-A-90/01069 (включена в настоящую заявку посредством ссылки), 3SR (самоподдерживающаяся репликация последовательностей), описанная, например, в заявке на патент WO-A-90//06995 (включена в настоящую заявку посредством ссылки), NASBA (амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот), описанная, например, в ЕР-В-0.397.269 и в Патенте США №5 466586 (включены в настоящую заявку посредством ссылки), с применением в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, и ТМА (опосредованная транскрипцией амплификация), описанная, например, в Патенте США №5399491 (включена в настоящую заявку посредством ссылки).

Определение присутствия одной или более мутаций в амплифицированном продукте можно проводить разными путями, которые хорошо известны в технике, такие как методы секвенирования ДНК, например, секвенирование по Сенгеру и глубокое секвенирование, применение рестриктаз, аллель-специфичная амплификация, ПЦР, опосредованная пептидами-нуклеиновыми кислотами (PNA-опосредованная), определение различий в конформации, такое как анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) и денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) с определением ступеней на мембранах (дот-блоттинг) с применением меченных олигонуклеотидных зондов, анализ с определением ступеней на титрационных микропланшетах, такой как обратная гибридизация, лигирование олигонулеотидных зондов (OLA, MLPA), технология замены первого нуклеотида (FNC), технология перекрестных сшивок, ПЦР ускоренного цикла и одновременный флуоресцентный анализ (например, 5'-нуклеаза /Taqman) и ПЦР с последующим минисеквенирование с применением масс-спектрометрии или капиллярного электрофореза.

III. Примеры изолированных молекул нуклеиновых кислот

Один аспект настоящего изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновых кислот, которые соответствуют биологическому маркеру согласно настоящему изобретению, включая нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид, соответствующему маркеру согласно настоящему изобретению или часть такого полипептида. Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению включают те молекулы нуклеиновых кислот, которые принадлежат к геномным областям ALK или родственным ALK (например, эмбриональным и/или соматическим), идентифицированным в настоящей заявке, и/или кодируют полипептиды ALK или родственные ALK (например, EML4-ALK). Согласно некоторым вариантам реализации молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению содержат, по существу состоят или включают последовательности нуклеотидов, или их фрагменты, которые представлены в Таблице 1. Изолированные молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению также включают молекулы нуклеиновых кислот, которые соответствуют маркеру согласно настоящему изобретению, включая молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению, и фрагменты молекул таких нуклеиновых кислот, например, подходящие для применения в качестве праймеров для ПЦР при амплификации или мутировании молекул нуклеиновых кислот. Предполагается, что применяемый в настоящей заявке термин «молекула нуклеиновой кислоты» включает молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК), а также аналоги ДНК и РНК, сгенерированные с применением аналогов нуклеотидов. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной; согласно некоторым вариантам реализации молекула нуклеиновой кислоты представляет собой двухцепочечную ДНК.

Под «изолированной» молекулой нуклеиновой кислоты понимают молекулу, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, присутствующих в природном источнике указанной молекулы нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации «изолированная» молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательностей (таких как последовательности, кодирующие белки), которые в естественных условиях фланкируют указанную нуклеиновую (например, последовательности, расположенные на 5' и 3'-концах указанной нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК того организма, из которого получена указанная нуклеиновая кислота.

Например, согласно разным вариантам реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать менее чем приблизительно 5 кБ, менее чем приблизительно 4 кБ, менее чем приблизительно 3 кБ, менее чем приблизительно 2 кБ, менее чем приблизительно 1 кБ, менее чем приблизительно 0,5 кБ или менее чем приблизительно 0,1 кБ последовательностей нуклеотидов, которые в естественных условиях фланкируют указанную нуклеиновую кислоту в геномной ДНК клетки, из которой получена указанная нуклеиновая кислота. Кроме того, «изолированная» молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может по существу не содержать другого клеточного материала или питательной среды, когда ее получают при помощи рекомбинантных технологий, или по существу не содержать химических предшественников или других химических веществ, в случае, если ее получают в ходе химического синтеза.

Фраза «по существу не содержит клеточного материала или питательной среды» включает препараты молекулы нуклеиновой кислоты, в которых указанная молекула отделена от компонентов той клетки, из которой ее выделили или получили рекомбинантным способом. Так, молекула нуклеиновой кислоты, которая по существу не содержит клеточного материала, включает препараты молекулы нуклеиновой кислоты, в которых присутствует менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10% или менее чем приблизительно 5% (от сухого веса) клеточного материала или питательной среды.

Молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, например мутированные гены ALK, указанные в Таблице 1), можно выделять при помощи стандартных молекулярно-биологических способов и информации о последовательностях в базах данных, описываемых в настоящей заявке. При помощи всех или части таких последовательностей нуклеиновых кислот молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению можно выделить посредством стандартных способов гибридизации и клонирования (например, как описано в Sambrook et al., ed.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению можно амплифицировать, применяя кДНК, мРНК или геномной ДНК (например, эмбриональной или соматической геномной ДНК) в качестве матрицы и соответствующие олигонуклеотидные праймеры в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированные таким образом молекулы нуклеиновых кислот можно клонировать в соответствующий вектор и охарактеризовать путем секвенирования ДНК. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие всей молекуле нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или ее части, можно получить при помощи стандартных способов синтеза, например, при помощи автоматического синтезатора ДНК.

Согласно другому варианту реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая обладает последовательностью нуклеотидов, комплементарной последовательности нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, соответствующей маркеру согласно настоящему изобретению, или последовательности нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, который соответствует маркеру согласно настоящему изобретению. Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна данной последовательности нуклеотидов, - это молекула, которая комплементарна данной последовательности нуклеотидов в достаточной степени для того, чтобы она могла гибридизоваться в данную последовательность нуклеотидов, образовав при этом стабильный дуплекс.

Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может содержать только часть последовательности нуклеиновой кислоты, причем полноразмерная последовательность нуклеиновой кислоты содержит маркер согласно настоящему изобретению или кодирует полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению. Такие молекулы нуклеиновых кислот можно применять, например, в качестве зонда или праймера. Зонд/праймер обычно применяют в форме одного или более по существу очищенных олигонуклеотидов. Обычно указанный олигонуклеотид включает область последовательности нуклеотидов, которая гибридизуется при строгих условиях с образованием по меньшей мере приблизительно 7, по меньшей мере приблизительно 8, по меньшей мере приблизительно 9, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 11, по меньшей мере приблизительно 12, по меньшей мере приблизительно 13, по меньшей мере приблизительно 14, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 16, по меньшей мере приблизительно 17, по меньшей мере приблизительно 18, по меньшей мере приблизительно 19, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 21, по меньшей мере приблизительно 22, по меньшей мере приблизительно 23, по меньшей мере приблизительно 24, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 26, по меньшей мере приблизительно 27, по меньшей мере приблизительно 28, по меньшей мере приблизительно 29, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 31, по меньшей мере приблизительно 32, по меньшей мере приблизительно 33, по меньшей мере приблизительно 34, по меньшей мере приблизительно 35, по меньшей мере приблизительно 36, по меньшей мере приблизительно 37, по меньшей мере приблизительно 38, по меньшей мере приблизительно 39, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 45, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 55 по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 65, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 75, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 85, по меньшей мере приблизительно 90, по меньшей мере приблизительно 95, по меньшей мере приблизительно 100 или более идущих подряд нуклеотидов нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

Зонды на основе последовательности молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению можно применять для определения транскриптов или геномных последовательностей, соответствующих одному или более маркеров согласно настоящему изобретению. Указанный зонд содержит группу-метку, с присоединенным к ней, например, радиоизотопом, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента. Такие зонды можно применять как часть набора для диагностического исследования, проводимого в целях идентификации клеток или тканей, у которых экспрессия указанного белка неадекватна, такого как измерение уровня молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок в пробе клеток, взятой у субъекта, например, определение уровня мРНК или определение, был ли мутирован или делегирован ген, кодирующий указанный белок.

Также настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, которые по существу гомологичны мутантным генам ALK и/или продуктам таких генов (например, маркеры, указанные в Таблице 1) так, что они совпадают по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или более. Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение также включает молекулы нуклеиновых кислот, которые по существу гомологичны мутантным генам ALK и/или продуктам таких генов (например, маркеры, указанные в Таблице 1) так, что они различаются всего лишь по меньшей мере на 1, по меньшей мере на 2, по меньшей мере на 3, по меньшей мере на 4, по меньшей мере на 5, по меньшей мере на 6, по меньшей мере на 7, по меньшей мере на 8, по меньшей мере на 9, по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 11, по меньшей мере на 12, по меньшей мере на 13, по меньшей мере на 14, по меньшей мере на 15, по меньшей мере на 16, по меньшей мере на 17, по меньшей мере на 18, по меньшей мере на 19, по меньшей мере на 20, по меньшей мере на 21, по меньшей мере на 22, по меньшей мере на 23, по меньшей мере на 24, по меньшей мере на 25, по меньшей мере на 26, по меньшей мере на 27, по меньшей мере на 28, по меньшей мере на 29, по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 31, по меньшей мере на 32, по меньшей мере на 33, по меньшей мере на 34, по меньшей мере на 35, по меньшей мере на 36, по меньшей мере на 37, по меньшей мере на 38, по меньшей мере на 39, по меньшей мере на 40, по меньшей мере на 45, по меньшей мере на 50, по меньшей мере на 55, по меньшей мере на 60, по меньшей мере на 65, по меньшей мере на 70, по меньшей мере на 75, по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 100 нуклеотидов или на любое число, попадающее в диапазон между ними.

Термин «однонуклеотидный полиморфизм» (SNP) относится к полиморфному сайту, занимаемому одним нуклеотидом, который представляет собой сайт различия между последовательностями аллелей. Обычно впереди или позади указанного сайта идут высоко консервативные последовательности указанного аллеля (например, последовательности, которые варьируют менее чем у 1/100 или 1/1000 членов популяции). Обычно SNP возникает вследствие замены одного нуклеотида на другой в указанном полиморфном сайте. Также SNP могут возникать из-за делеции нуклеотида или вставки нуклеотида относительно эталонного аллеля. Обычно указанный полиморфный сайт занят основанием, отличным от эталонного основания. Например, если эталонный аллель содержит в полиморфном сайте основание «Т» (тимидин), измененный аллель может содержать в полиморфном сайте «С» (цитидин), «G» (гуанин) или «А» (аденин). SNP могут возникать в кодирующих белки последовательностях нуклеиновых кислот, и в этом случае они могут приводить к образованию дефективного или другим образом измененного белка или генетического заболевания. Такие SNP могут изменять кодирующую последовательность указанного гена и, следовательно, задавать другую аминокислоту («миссенс» SNP), или SNP могут приводить к введению стоп-кодона («нонсенс» SNP). Когда SNP не приводит к изменению последовательности аминокислот в белке, такой SNP называют «молчащим». Также SNP могут возникать в некодирующих областях последовательности нуклеотидов. Это может приводить к экспрессии дефективного белка, например, в результате альтернативного сплайсинга, или это может не оказывать никакого действия на функцию белка.

Согласно другому варианту реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению обладает длиной по меньшей мере 7, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450, по меньшей мере 550, по меньшей мере 650, по меньшей мере 700, по меньшей мере 800, по меньшей мере 900, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 1200, по меньшей мере 1400, по меньшей мере 1600, по меньшей мере 1800, по меньшей мере 2000, по меньшей мере 2200, по меньшей мере 2400, по меньшей мере 2600, по меньшей мере 2800, по меньшей мере 3000, по меньшей мере 3500, по меньшей мере 4000, по меньшей мере 4500 или более нуклеотидов и гибридизуется при строгих условиях с образованием молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующей маркеру согласно настоящему изобретению или с образованием молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению. Применяемый в настоящей заявке термин «гибридизуется при строгих условиях» должен описывать условия гибридизации и отмывки, при которых последовательности нуклеотидов, идентичные друг другу по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, or по меньшей мере на 85%, обычно гибридизуются друг с другом. Такие строгие условия известны специалистам в данной области техники, и их описание можно найти в разделах 6.3.1-6.3.6 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Другой неограничивающий пример строгих условий гибридизации включает гибридизацию в 6Х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) приблизительно при 45°С, после которой проводят одну или более отмывок в 0.2Х SSC, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) при 50-65°С.

Также настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот молекулярных маяков, содержащие по меньшей мере одну область, которая комплементарна молекуле нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению так, что указанный молекулярный маяк применим при количественном определении присутствия в пробе молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота «молекулярного маяка» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащей пару комплементарных областей, а также флуорофор и тушитель флуоресценции, ассоциированные с ними. Указанные флуорофор и тушитель флуоресценции ассоциированы с разными областями указанной нуклеиновой кислоты в такой ориентации, что когда комплементарные области соединяются друг с другом, флуоресценция указанного флуорофора подавляется указанным тушителем. Когда указанные комплементарные области молекул нуклеиновых кислот не соединяются друг с другом, флуоресценция указанного флуорофора подавляется указанным тушителем в меньшей степени. Молекулы нуклеиновых кислот молекулярного маяка описаны, например, в Патенте США 5876930 (включен в настоящую заявку посредством ссылки).

IV. Примеры изолированных белков и антител

Один аспект настоящего изобретения относится к изолированным белкам, которые соответствуют отдельным маркерам согласно настоящему изобретению, и биологически активным их частям. Согласно одному варианту реализации нативный полипептид, соответствующий маркеру, можно выделить из клеток или тканей посредством соответствующей схемы очистки с применением стандартных способов очистки белков. Согласно другому варианту реализации полипептиды, соответствующие маркеру согласно настоящему изобретению, получают при помощи технологий рекомбинантных ДНК. Как альтернатива рекомбинантной экспрессии, полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению, можно синтезировать химически с применением стандартных способов синтеза пептидов.

«Изолированный» или «очищенный» белок или биологически активная его часть по существу не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клеток или ткани, из которых получают указанный белок, или по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ в случае, если указанный белок синтезируют химически. Фраза «по существу не содержит клеточного материала» включает препараты белка, в которых указанный белок отделен от компонентов той клетки, из которой ее выделили или получили рекомбинантным способом. Так, белок, который по существу не содержит клеточного материала, включает препараты белка, в которых присутствует менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10% или менее чем приблизительно 5% (от сухого веса) гетерологичного белка (также называемого в настоящей заявке «загрязняющим белком»). Когда указанный белок или его биологически активную часть получают рекомбинантным способом, он может по существу не содержать питательной среды, т.е. питательная среда составляет менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10% или менее чем приблизительно 5% от объема препарата указанного белка. Когда указанный белок получают в ходе химического синтеза, он может по существу не содержать химических предшественников или других химических веществ, т.е., он отделен от химических предшественников или других химических веществ, которые участвуют в синтезе указанного белка. Соответственно, такие препараты указанного белка содержат менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 5% (от сухого веса) химических предшественников или других соединений, отличных от рассматриваемого белка.

Биологически активные части полипептида, соответствующего маркеру согласно настоящему изобретению, включают полипептиды, содержащие последовательности аминокислот, в достаточной степени идентичные или полученные из последовательности аминокислот белка, соответствующего мутированным генам ALK и/или продуктам указанных генов (например, маркеры, указанные в Таблице 1) согласно настоящему изобретению, которые содержат меньше аминокислот, чем полноразмерный белок, и проявляют по меньшей мере один тип активности соответствующего полноразмерного белка. Обычно биологически активные части содержат домен или мотив по меньшей мере с одним типом активности соответствующего полноразмерного белка. Биологически активной частью белка согласно настоящему изобретению может быть полипептид, который, например, обладает длиной 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более аминокислот. Кроме того, другие биологически активные части, в которых делегированы другие области указанного белка, можно получить посредством рекомбинантных способов и оценивать на присутствие одного или более типов функциональной активности, присущих нативной форме полипептида согласно настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид обладает последовательностью аминокислот белка, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты, приведенной в Таблице 1. Другие применимые белки по существу идентичны (например, по меньшей мере на 60, по меньшей мере на 65, по меньшей мере на 70, по меньшей мере на 75, по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 86, по меньшей мере на 87, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 89, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 91, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 93, по меньшей мере на 94, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98, по меньшей мере на 99, по меньшей мере на 99,5% или более одной из указанных последовательностей и сохраняют функциональную активность (например, придание устойчивости или чувствительности к ингибитору ALK) соответствующего полноразмерного белка, уже отличающегося по последовательности аминокислот.

Чтобы определить процент идентичности двух последовательностей аминокислот или двух нуклеиновых кислот, указанные последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, в первую последовательность аминокислот или нуклеиновую кислоту можно ввести пропуски для оптимального выравнивания со второй последовательностью аминокислот или нуклеиновой кислотой). Затем сравнивают остатки аминокислот или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Если положение в первой последовательности занято остатком той же аминокислоты или тем же нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, значит указанные молекулы идентичны по данному положению. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа положений, идентичных для указанных последовательностей (т.е., % идентичности = число идентичных положений/общее число положений (т.е., перекрывающихся положений) × 100). Согласно одному варианту реализации две указанные последовательности имеют одинаковую длину.

Определение процента идентичности между двумя последовательностями может сопровождаться применением математического алгоритма. Другой, неограничивающий, пример математического алгоритма, применяемого при сравнении двух последовательностей, - это алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, модифицированный Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST, созданные Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Поиск нуклеотидов посредством BLAST (средство поиска основного локального выравнивания) можно проводить в программе NBLAST, показатель = 100, длина слова = 12, для получения последовательности нуклеотидов, гомологичной молекулам нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Поиск белка посредством BLAST можно проводить в программе XBLAST, показатель = 50, длина слова = 3, для получения последовательностей аминокислот, гомологичных молекулам белка согласно настоящему изобретению. Чтобы добиться выравнивания последовательностей с пропусками в целях их сравнения можно применять BLAST с пропусками, как описано у Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. В качестве альтернативы, можно применять PSI-Blast для проведения итерационного поиска, который позволяет выявить отдаленные взаимодействия между молекулами. В случае применения программ BLAST, BLAST с пропусками и PSI-Blast можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST) (см. интернет-сайт NCBI на международном сайте ncbi.nlm.nih.gov). Другой неограничивающий пример математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей - это алгоритм Myers и Miller, (1988) Comput Appi Biosci, 4:11-7. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью программного пакета для выравнивания GCG. При применении программы ALIGN для сравнения последовательностей аминокислот можно пользоваться таблицей весов остатков РАМ 120, штраф за удлинение пропуска 12 и штраф за удлинение пропуска 4. Еще одним полезным алгоритмом для идентификации областей локального сходства последовательностей и выравнивания является алгоритм FASTA, описанный у Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448. При применении алгоритма FASTA для сравнения последовательностей нуклеотидов или аминокислот можно пользоваться, например, таблицей весов остатков РАМ 120 со значением k-строки 2.

Процент идентичности между двумя последовательностями можно определять с применением способов, аналогичных тем, которые были описаны выше, допускающих или не допускающих пропуски. При расчете идентичности подсчитывается только полное соответствие.

Изолированный полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению или фрагменту такого маркера, можно применять в качестве иммуногена для генерирования антител при помощи стандартных способов получения поликлональных и моноклональных антител. Можно применять полноразмерный полипептид или белок, или, в качестве альтернативы, согласно настоящему изобретению предложены антигенные пептидные фрагменты для применения в качестве иммуногенов. Антигенный пептид в белке согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере 8 (или по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или по меньшей мере 30 или более) остатков аминокислот из последовательности аминокислот одного из полипептидов согласно настоящему изобретению, и заключает в себе эпитоп указанного белка, такой что антитело на указанный пептид образует специфический иммунный комплекс с маркером согласно настоящему изобретению, которому соответствует указанный белок. К примерам эпитопов, включенных в состав антигенного пептида, можно отнести области, которые расположены на поверхности белка, например, гидрофильные области. Для идентификации гидрофильных областей можно применять анализ гидрофобности последовательностей, анализ гидрофильности последовательностей или сходные виды анализа.

Иммуноген обычно применяют для получения антител посредством иммунизации подходящего (например, иммунокомпетентного) субъекта, такого как кролик, коза, мышь или другое млекопитающее или позвоночное животное. Соответствующий иммуногенный препарат может содержать, например, экспрессированный рекомбинантным способом или химически синтезированный полипептид. Также указанный препарат может включать адъювант, такой как полный или неполный адъювант Фрейнда, или аналогичный иммуностимулирующий агент.

Соответственно, другой аспект настоящего изобретения относится к антителам против полипептида согласно настоящему изобретению. Применяемые в настоящей заявке термины «антитело» и «вещество антитела» взаимозаменяемы и относятся к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулинов, т.е., молекулам, которые содержат антиген-связывающий сайт, который специфически связывается с антигеном, такой как полипептид согласно настоящему изобретению. Молекула, которая специфически связывается с данным полипептидом согласно настоящему изобретению, - это молекула, которая связывается с полипептидом, но по существу не связывается с другими молекулами в пробе, например, биологической пробе, которая по природе содержит указанный полипептид. Примеры иммунологически активных частей молекул иммуноглобулина включают фрагменты F(ab) и F(ab')₂, которые можно генерировать посредством обработки антитела таким ферментом, как пепсин. Согласно настоящему изобретению предложены поликлональные и моноклональные антитела. Применяемый в настоящей заявке термин «моноклональное антитело» или «композиция моноклональных антител» относится к популяции молекул антител, которые содержат антиген-связывающий сайт только одного вида, способный иммунологически реагировать с конкретным эпитопом.

Поликлональные антитела можно получить, как описано выше, путем иммунизации подходящего субъекта полипептидом согласно настоящему изобретению в качестве иммуногена. Титр указанного антитела у иммунизированного субъекта можно отслеживать во времени при помощи стандартных способов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с применением иммобилизованного полипептида. При желании молекулы антител можно выделить или изолировать из организма указанного субъекта (например, из крови или сыворотки указанного субъекта) и подвергнуть дальнейшей очистке посредством хорошо известных способов, таких как хроматография с белком А, для получения фракции IgG. Через соответствующее время после иммунизации, например, когда титр специфического антитела будет максимален, у указанного субъекта можно выделить антителообразующие клетки и применить их для получения моноклональных антител при помощи стандартных способов, таких как технология гибридом, первоначально описанная у Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497, технология В-клеточных гибридом (см. Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72), технология EBV-клеточных гибридом (см. Cole et al., pp.77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) или технология триом. Технология получения гибридом хорошо известна (для общей информации см. Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994). Клетки-гибридомы, вырабатывающие моноклональные антитела согласно настоящему изобретению, определяют путем скрининга надосадочной жидкости культуры гибридом на присутствие антител, которые связываются с рассматриваемым полипептидом, например посредством стандартного анализа ELISA.

Как альтернатива получению секретирующих моноклональные антитела гибридом, моноклональное антитело к полипептиду согласно настоящему изобретению можно идентифицировать и выделить посредством скрининга в библиотеке рекомбинантных комбинаторных иммуноглобулинов (например, библиотека фагового дисплея антител) с рассматриваемым полипептидом. Наборы для генерирования и скрининга в библиотеках фагового дисплея есть в продаже (например, система рекомбинантных антител фагов «Pharmacia», каталожный №27-9400-01; и набор фагового дисплея SurfZAP «Stratagene», каталожный №240612). Кроме того, примеры способов и реагентов, особенно полезных для генерирования и скрининга библиотеки дисплея антител можно найти, например, в Патенте США №5 223 409 (включен посредством ссылки); Публикации РСТ № WO 92/18619 (включена посредством ссылки); Публикации РСТ № WO 91/17271 (включена посредством ссылки); РСТ Publication No.WO 92/20791 (включена посредством ссылки); Публикации РСТ № WO 92/15679 (включена посредством ссылки); Публикации РСТ № WO 93/01288 (включена посредством ссылки); Публикации РСТ № WO 92/01047 (включена посредством ссылки); Публикации РСТ № WO 92/09690 (включена посредством ссылки); Публикации РСТ № WO 90/02809 (включена посредством ссылки); Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734.

Кроме того, рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие и часть человеческого, и часть нечеловеческого антитела, которые можно получить при помощи стандартных технологий рекомбинантных ДНК, входят в область настоящего изобретения. Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получить при помощи технологий рекомбинантных ДНК, известных в технике, например, с применением способов, описанных в Публикации РСТ № WO 87/02671 (включена посредством ссылки); заявке на Европейский патент 184,187; заявке на Европейский патент 171,496; заявке на Европейский патент 173,494; РСТ Publication No. WO 86/01533 (включена посредством ссылки); Патент США №4816 567 (включена посредством ссылки); заявке на Европейский патент 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214;

U.S. Patent 5,225,539 (incorporated by reference); Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; и Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Полностью человеческие антитела особенно желательны для терапевтического применения у людей. Такие антитела можно получить посредством применения трансгенных мышей, которые не способны к экспрессии генов тяжелой и легкой цепи эндогенных иммуноглобулинов, но которые могут экспрессировать продукт генов тяжелой и легкой цепи человека. Указанных трансгенных мышей иммунизируют обычным способом выбранным антигеном, например, полным или частью полипептида, соответствующего маркеру согласно настоящему изобретению. Моноклональные антитела к указанному антигену можно получить при помощи стандартной технологии гибридом. Трансгены иммуноглобулинов человека, находящиеся в организме трансгенных мышей, перестраиваются в ходе дифференцировки В-клеток, и впоследствии подвергаются переключению изотипов и соматической мутации. Так, при помощи такой технологии, можно получать применимые для терапевтических целей антитела типа IgG, IgA и IgE. Для обзора по указанной технологии получения антител см. Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Более подробное обсуждение технологии получения антител человека и моноклональных антител человека, а также протоколы получения таких антител, можно найти, например, в Патенте США 5625126 (включен посредством ссылки); Патенте США 5633425 (включен посредством ссылки); Патенте США 5569825 (включен посредством ссылки); Патенте США 5661016 (включен посредством ссылки); и в Патенте США 5545806 (включен посредством ссылки). Кроме того, такие компании как «Abgenix, Inc.» (Фримонт, Калифорния) могут поставлять антитела человека к избранному антигену, получая их при помощи технологий, аналогичным тем, что описаны выше.

Полностью человеческие антитела, которые распознают избранный эпитоп, можно сгенерировать при помощи технологии, называемой «направленной селекцией». При указанном подходе избранное нечеловеческое моноклональное антитело, например, антитело мыши, применяют для управления селекцией полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп (Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903).

Антитело к полипептиду, соответствующему маркеру согласно настоящему изобретению (например, моноклональное антитело), можно применять для выделения указанного полипептида при помощи стандартных технологий, таких как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Кроме того, такое антитело можно применять для выявления маркера (например, в лизате клеток или надосадочной жидкости культуры клеток) в целях оценки уровня и характера экспрессии указанного маркера. Также указанные антитела можно применять для отслеживания уровня белка в тканях или жидких средах организма (например, в жидкой среде организма, содержащей клетки опухоли), как часть процедуры клинической диагностики, например, для определения эффективности данного режима лечения. Определение можно облегчить путем присоединения указанного антитела к детектируемому веществу. Примеры детектируемых веществ включают, без ограничений, разные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают, без ограничений, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают, без ограничений, стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают, без ограничений, умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритин; примеры люминесцентных материалов включают, без ограничений, люциферазу, люциферин и акварин, а примеры соответствующих радиоактивных материалов включают, без ограничений, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S или ³Н.

V. Примеры рекомбинантных векторов экспрессии и клеток-хозяев

Еще один аспект настоящего изобретения относится к векторам, таким как векторы экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению (или часть такого полипептида). Применяемый в настоящей заявке термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, к которой она была присоединена. Одним типом вектора является «плазмида», которая представляет собой кольцевую двухцепочечную петлю ДНК, в которую могут быть вшиты дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, причем в геном вируса могут быть вшиты дополнительные сегменты ДНК. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, обладающие бактериальной точкой начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при их введении в указанную клетку-хозяина, и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы, а именно векторы экспрессии, способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. В целом, векторы экспрессии, применимые при реализации технологии рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид (векторов). Однако, предполагается, что настоящее изобретение включает такие другие формы векторов экспрессии, как вирусные векторы (например, ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы с дефектной репликацией), которые выполняют эквивалентную функцию.

Рекомбинантные векторы экспрессии согласно настоящему изобретению содержат нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению в форме, пригодной для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Это означает, что указанные рекомбинантные векторы экспрессии включают одну или более регуляторных последовательностей, выбираемых в зависимости от клетки-хозяина, которую будут применять для экспрессии, функционально связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты, которую требуется экспрессировать. Применительно к рекомбинантному вектору экспрессии фраза «функционально связан» должна означать, что рассматриваемая последовательность нуклеотидов связана с регуляторной последовательностью (последовательностями) таким образом, что возможна экспрессия указанной последовательности нуклеотидов (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине, когда указанный вектор вводят в клетку-хозяина). Термин «регуляторная последовательность» должен включать промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, у Goeddel, Methods in Enzymology: Gene Expression Technology vol.185, Academic Press, San Diego, CA (1991). Регуляторные последовательности включают последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией последовательности нуклеотидов в клетках-хозяевах многих типов, и последовательности, которые управляют экспрессией последовательности нуклеотидов только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалист в данной области техники должен понимать, что дизайн вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которую будут трансформировать, желаемый уровень экспрессии белка и подобные. Векторы экспрессии согласно настоящему изобретению можно вводить в клетки-хозяева для получения белков или пептидов, включая гибридные белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, описываемыми в настоящей заявке.

Можно сконструировать рекомбинантные вектора экспрессии согласно настоящему изобретению для экспрессии полипептида, соответствующего маркеру согласно настоящему изобретению, в клетках прокариот (например, Е. соli) или эукариот (например, клеток насекомых {с применением векторов экспрессии на основе бакуловируса}, клеток дрожжей или клеток млекопитающих). Подходящие клетки-хозяева также обсуждаются в Goeddel, выше. В качестве альтернативы, рекомбинантный вектор экспрессии можно транскрибировать и транслировать in vitro, например, при помощи регуляторной последовательности промотора Т7 и полимеразы Т7.

Экспрессию белков прокариот чаще всего осуществляют в клетках E.coli с применением векторов экспрессии, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией либо гибридных, либо негибридных белков. Вектора для гибридных белков добавляют несколько аминокислот к белку, кодируемому им, обычно к N-концу указанного гибридного белка. Такие векторы для гибридных белков обычно служат для трех целей: 1) повысить экспрессию рекомбинантного белка; 2) повысить растворимость указанного рекомбинантного белка; и 3) облегчить очистку указанного рекомбинантного белка, выступая как лиганд при аффинной очистке. Часто в векторах экспрессии гибридных белков сайт протеолитического расщепления вводят в место соединения гибридного компонента и рекомбинантного белка, чтобы в дальнейшем сделать возможным разделение рекомбинантного белка и гибридного компонента при очистке гибридного белка. Такие ферменты и их последовательности когнатного распознавания включают Фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Типичные векторы экспрессии гибридных белков включают pGEX («Pharmacia Biotech Inc»; Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL («New England Biolabs», Беверли, Массачусетс) и pRIT5 («Pharmacia», Пискатавэй, Нью-Джерси), которые объединяют глутатион-S-трансферазу (GST), Мальтоза-Е-связывающий белок или белок А, соответственно, с целевым рекомбинантным белком.

Примеры подходящих индуцибельных векторов экспрессии не-гибридных белков в клетках E.coli включают pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69:301-315) и рЕТ 1 Id (Studier et al., p.60-89, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol.185. Academic Press, San Diego, CA, 1991). Экспрессия целевого гена с вектора pTrc основана на транскрипции РНК-полимеразы хозяина с гибридного промотора trp-lac. Экспрессия целевого гена с вектора рЕТ lid основана на транскрипции с гибридного промотора Т7 gn10-lac, опосредуемой экспрессируемой параллельно вирусной РНК-полимеразой (Т7 gn1). Указанная вирусная полимераза поставляется штаммами хозяина BL21 (DE3) или HMS174(DE3) из «резидентного» профага, содержащего ген Т7 gnl под транскрипционным контролем промотора lacUV 5.

Одна из стратегий по максимизации экспрессии рекомбинантного белка в клетках Е. Coli, состоит в том, чтобы экспрессировать белок в бактерии-хозяине со сниженной способностью к протеолитическому расщеплению рекомбинантного белка (Gottesman, p.119-128, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol.185, Academic Press, San Diego, CA, 1990). Другая стратегия состоит в том, чтобы изменить последовательность нуклеиновой кислоты, которую планируется ввести в вектор экспрессии, так, чтобы индивидуальные кодоны для каждой аминокислоты могли быть такими, какие использует E.coli (Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Такое изменение последовательностей нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению можно осуществить при помощи стандартных технологий синтеза ДНК.

Согласно другому варианту реализации вектором экспрессии является вектор экспрессии для клеток дрожжей. Примеры векторов для экспрессии у дрожжей S. cerevisiae включают pYepSecl (Baldari et al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 («Invitrogen Corporation», Сан-Диего, Калифорния) и pPicZ ((«Invitrogen Corporation», Сан-Диего, Калифорния).

В качестве альтернативы вектором экспрессии является вектор экспрессии на основе бакуловируса. Имеются векторы на основе бакуловируса для экспрессии белков в культуре клеток насекомых (например, клетки Sf 9), и они включают серии рАс (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) и серии pVL (Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39).

Согласно еще одному варианту реализации нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению экспрессируют в клетках млекопитающих при помощи вектора экспрессии для клеток млекопитающих. Примеры векторов экспрессии для клеток млекопитающих включают pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329:840) и рМТ2РС (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195). При применении в клетках млекопитающих регуляторные функции указанных векторов экспрессии обеспечиваются вирусными регуляторными элементами. Например, часто применяемые промоторы получают из вируса полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса и вируса обезьян 40. Информацию о других подходящих системах экспрессии для клеток и прокариот, и эукариот можно найти в главах 16 и 17 Sambrook et al., выше.

Согласно еще одному варианту реализации рекомбинантный вектор экспрессии для клеток млекопитающих способен к управляемой экспрессии указанной нуклеиновой кислоты в конкретном типе клеток (например, для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты применяют тканеспецифичные регуляторные элементы). Тканеспецифичные регуляторные элементы известны в технике. Неограничивающие примеры подходящих тканеспецифичных промоторов включают промотор альбумина (специфичный для печени; Pinkert et al., 1987, Genes Dev.1:268-277), промоторы, специфичные для лимфоидной ткани (Calame and Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), такие как промоторы рецепторов Т-клеток (Winoto and Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733) и иммуноглобулинов (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33:741-748), нейрон-специфичные промоторы (e.g., например, промотор нейрофиламентов; Byme and Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), промоторы, специфичные для поджелудочной железы (Ediund et al., 1985, Science 230:912-916) и промоторы, специфичные для молочных желез (например, промотор молочной сыворотки, Патент США №4873316 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и Заявка на Европейский патент №264166). Также рассматриваются промоторы, регулируемые стадиями развития, например, hox-промоторы мыши (Kessel and Gruss, 1990, Science 249:374-379) и промоторы α-фетопротеина (Camper and Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546).

Также согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий молекулу ДНК согласно настоящему изобретению, клонированную в указанный вектор экспрессии в антисмысловой ориентации. То есть, указанная молекула ДНК функционально связана с регуляторной последовательностью таким образом, чтобы была возможна экспрессия (путем транскрипции указанной молекулы ДНК) молекулы РНК, которая является антисмысловой к мРНК, кодирующей полипептид согласно настоящему изобретению. Можно выбрать регуляторные последовательности, функционально связанные с нуклеиновой кислотой, клонированной в антисмысловой ориентации, которые регулируют непрерывную экспрессию молекулы указанной антисмысловой РНК в разных типах клеток, например, промоторы и/или энхансеры вирусов, или можно выбрать регуляторные последовательности, которые регулируют конститутивную, тканеспецифичную или специфичную для типа клеток экспрессию антисмысловой РНК. Вектор экспрессии антисмысловой нуклеиновой кислоты может быть в форме рекомбинантной плазмиды, фагмиды или ослабленного вируса, в которых антисмысловые нуклеиновые кислоты образуются под контролем высокоэффективной регуляторной области, активность которой может определяться в зависимости от типа клеток, в которые вводят указанный вектор. Обсуждение регуляции экспрессии генов при помощи антисмысловых генов можно найти в Weintraub et al., 1986, Trends in Genetics, Vol.1(1).

Еще один аспект настоящего изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые вводят рекомбинантный вектор экспрессии согласно настоящему изобретению. В настоящей заявке термины «клетка-хозяин» и «рекомбинантная клетка-хозяин» применяют взаимозаменяемо. Следует понимать, что такие термины относятся не только к клеткам конкретных субъектов, но и к потомству или потенциальному потомству таких клеток. Поскольку в последующих поколениях могут возникать определенные модификации либо вследствие мутаций, либо вследствие влияния окружающей среды, такое потомство может фактически не быть идентичным родительским клеткам, тем не менее, они включены в указанный термин, когда его применяют в настоящей заявке.

Клеткой-хозяином может быть любая клетка прокариот (например, E.coli) или эукариот (например, клетки насекомых, дрожжей или млекопитающих).

ДНК-вектор можно ввести в клетки прокариот или эукариот посредством традиционных способов трансформации или трансфекции. В настоящей заявке термины «трансформация» и «трансфекция» должны относиться к целому ряду принятых в данной области техники технологий для введения чужеродной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, включая совместное осаждение с фосфатом кальция или хлоридом кальция, диэтиламиноэтил-декстран-опосредованную трансфекцию, липофекцию или электропорацию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти в Sambrook, et al. (выше), и в других лабораторных руководствах.

Известно, что для стабильной трансфекции в клетках млекопитающих, в зависимости от применяемых вектора экспрессии и технологии трансфекции, только небольшой процент клеток может интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Чтобы идентифицировать и отобрать такие интегранты, обычно в клетку-хозяин вводят ген, кодирующий селектируемый маркер (например, для устойчивости к антибиотикам) вместе с рассматриваемым геном. Примеры селектируемых маркеров включают маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным препаратам, таким как G418, гигромицин и метотрексат. Клетки, стабильно трансфецированные введенной нуклеиновой кислотой, можно идентифицировать посредством селекции на лекарственном препарате (например, клетки, у которых встроился ген селектируемого маркера, будут выживать, а другие клетки погибнут).

Клетку-хозяин согласно настоящему изобретению, такую как прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин в культуре, можно применять для получения полипептида, соответствующего маркеру согласно настоящему изобретению. Соответственно, согласно настоящему изобретению также предложены способы получения полипептида, соответствующего маркеру согласно настоящему изобретению, с применением клетки-хозяина согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации указанный способ включает культивирование клетки-хозяина согласно настоящему изобретению (в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий полипептид согласно настоящему изобретению) в подходящей среде такой, чтобы получить указанный маркер. Согласно другому варианту реализации указанный способ также включает выделение указанного полипептида-маркера из указанной среды или клетки-хозяина.

Клетки-хозяева согласно настоящему изобретению также можно применять для получения трансгенных животных, отличных от людей. Например, согласно одному варианту реализации клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению является оплодотворенный ооцит или эмбриональная стволовая клетка, в которую была введена последовательность, кодирующая полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению. Затем такие клетки-хозяева можно применять для создания трансгенных животных, отличных от людей, у которых в геном будет введена экзогенная последовательность, кодирующая белок-маркер согласно настоящему изобретению, или гомологичных рекомбинантных животных, у которых эндогенный ген (гены), кодирующий полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению, будет изменен. Такие животные применимы для изучения функции и/или активности полипептида, соответствующего маркеру согласно настоящему изобретению, для идентификации и/или оценки модуляторов полипептида, соответствующего маркеру согласно настоящему изобретению, а также для доклинических исследований терапевтических или диагностических молекул, для открытия или оценки маркеров, например, открытия или оценки терапевтических или диагностических маркеров, или в качестве имитаторов для оценки эффективности и специфичности.

В настоящей заявке термин «трансгенное животное» относится к отличному от человека животному, такому как грызун, например, крыса или мышь, причем одна или более клеток указанного животного содержит трансген. Другие примеры трансгенных животных включают низших приматов, овец, собак, коров, коз, куриц, амфибий и др. Трансген - это экзогенная ДНК, которая интегрирована в геном клетки, из которой развивается трансгенное животное, и которая сохраняется в геноме зрелого животного, управляя экспрессией кодируемого указанным геном продукта в одном или нескольких типах клеток или тканей указанного трансгенного животного. В настоящей заявке термин «гомологичное рекомбинантное животное» относится к животному, отличному от человека, такому как млекопитающее, например, мышь, у которого эндогенный ген был изменен посредством гомологичной рекомбинации между эндогенным геном и молекулой экзогенной ДНК, введенной в клетку указанного животного, например, эмбриональную клетку указанного животного, перед развитием этого животного. Также в понятие «трансгенные животные» входят трансгенные животные, такие как описаны, например, у Chan I.T., et al. (2004) J Clin Invest. 113(4):528-38 and Chin L. et al (1999) Nature 400(6743):468-72.

Трансгенное животное согласно настоящему изобретению можно получить путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению, в пронуклеус оплодотворенного ооцита, например, путем микроинъекции, инфицирования ретровирусом, и дать указанному ооциту развиться в организме псевдобеременной самки, которой приживили данный ооцит. Также в трансген можно включать интронные последовательности и сигнал полиаденилирования, чтобы повысить эффективность экспрессии указанного трансгена. С трансгеном можно функционально связывать тканеспецифичные регуляторные последовательности для управления экспрессией полипептида согласно настоящему изобретению в конкретных клетках. Способы генерирования трансгенных животных посредством манипуляций и микроинъекций на зародышах, в частности таких животных, как мыши, стали традиционными в технике и описаны, например, в Патенте США №4736866 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и 4870009 (включен в настоящую заявку посредством ссылки), в Патенте США №4873191 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и у Hogan, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986. Аналогичные способы применяют для получения других трансгенных животных. Трансгенных животных-основателей можно идентифицировать по наличию трансгена в их геноме и/или по экспрессии мРНК, кодирующей указанный трансген в тканях или клетках указанных животных. Затем трансгенных животных-основателей можно применять для выведения дополнительных животных, несущих указанный трансген. Кроме того, трансгенных животных, несущих указанный трансген, можно также скрещивать с другими трансгенными животными, несущими другие трансгены.

Для получения гомологичных рекомбинантных животных готовят вектор, который содержит по меньшей мере часть гена, кодирующего полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению, в котором была сделана делеция, вставка или замена для изменения, например, для нарушения функции, указанного гена. Согласно еще одному варианту реализации указанный вектор конструируют так, что при гомологичной рекомбинации, функция эндогенного гена нарушается (например, он больше не кодирует функциональный белок; также называют «нокаут-вектором»). В качестве альтернативы, указанный вектор можно сконструировать так, что при гомологичной рекомбинации, эндогенный ген мутирует или изменяется другим образом, но все еще кодирует функциональный белок (например, может изменяться регуляторная область, расположенная выше, что приводит к изменению экспрессии эндогенного белка). В векторе гомологичной рекомбинации измененная часть гена фланкирована на его 5' и 3'-концах дополнительной нуклеиновой кислотой гена, что делает возможной гомологичную рекомбинацию между экзогенным геном, переносимьм указанньм вектором, и эндогенным геном в эмбриональной стволовой клетке. Дополнительные фланкирующие последовательности нуклеиновых кислот должны обладать достаточной длиной для успешной гомологичной рекомбинации с эндогенным геном. Обычно в указанный вектор включают ДНК из нескольких тысяч пар оснований (как на 5', так и на 3'-конце) (описание векторов гомологичной рекомбинации см., например, у Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51:503). Указанный вектор вводят в линию эмбриональных стволовых клеток (например, посредством электропорации), и отбирают клетки, в которых введенный ген подвергся гомологичной рекомбинации с эндогенным геном (см., например, Li et al., 1992, Cell 69:915). Отобранные клетки затем инъецируют в зародышевый пузырь животного (например, мыши) с целью получения агрегационных химер (см. например, Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, Ed., IRL, Oxford, 1987, pp.113-152). Затем химерный эмбрион можно имплантировать в организм псевдобеременной самки, и дать эмбриону прижиться. Потомство, содержащее гомологично рекомбинированную ДНК в своих эмбриональных клетках, можно применять для воспроизведения животных, у которых все клетки организма будут содержать гомологично рекомбинированную ДНК вследствие эмбрионального переноса трансгена. Способы конструирования векторов гомологичной рекомбинации и гомологичные рекомбинантные животные описаны более подробно у Bradley (1991) Current Opinion in Bio/Technology 2:823-829 и в Публикациях РСТ № WO 90/11354 (включена посредством ссылки), WO 91/01140 (включена посредством ссылки), WO 92/0968 (включена посредством ссылки) и WO 93/04169 (включена посредством ссылки).

Согласно другому варианту реализации можно получить трансгенных животных, отличных от людей, которые будут содержать избранные системы, создающие возможность регулируемой экспрессии указанного трансгена. Один пример такой системы - это система на основе рекомбиназы cre/loxP бактериофага Р1. Описание системы рекомбиназы cre/loxP можно найти, например, у Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236. Другой пример системы на основе рекомбиназы - это система на основе рекомбиназы FLP Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al., 1991, Science 251:1351-1355). Если систему на основе рекомбиназы cre/loxP применяют для регулирования экспрессии трансгена, требуются животные, содержащие трансгены, кодирующие и рекомбиназу Сге, и избранный белок. Таких животных можно получить посредством конструирования «двойных» трансгенных животных, например, путем скрещивания двух трансгенных животных, одно из которых содержит трансген, кодирующий избранный белок, а другое - трансген, кодирующий рекомбиназу.

Клоны трансгенных животных, отличных от людей, описываемые в настоящей заявке, также можно получить в соответствии со способами, описанными у Wilmut et al. (1997) Nature 385:810-813 и в Публикациях заявок РСТ № WO 97/07668 (включена посредством ссылки) и WO 97/07669 (включена посредством ссылки).

V. Примеры наборов

Набором является любое изделие (например, пакет или контейнер), включающий по меньшей мере один реагент, например, зонд для специфического определения маркера согласно настоящему изобретению, изделие, которое предполагается рекламировать, распространять и продавать как устройство для осуществления способов согласно настоящему изобретению. Когда композиции, наборы и способы согласно настоящему изобретению применяют для осуществления способов согласно настоящему изобретению, мутированные гены ALK и/или продукты указанных генов (например, маркеры, указанные в Таблице 1) согласно настоящему изобретению можно выбирать таким образом, чтобы положительный результат удавалось получить по меньшей мере приблизительно у 20%, по меньшей мере приблизительно у 40%, по меньшей мере приблизительно у 60%, по меньшей мере приблизительно у 80%, по меньшей мере приблизительно у 90%, по меньшей мере приблизительно у 95%, по меньшей мере приблизительно у 99% или по меньшей мере приблизительно у 100% субъектов, страдающих раком определенной стадии, степени, гистологического типа или доброкачественной/предраковой/злокачественной природы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный маркер или спектр маркеров согласно настоящему изобретению можно выбрать так, чтобы достигнуть PPV (прогностическая ценность положительного результата) выше, чем приблизительно 10% для популяции в целом (например, в совокупности со специфичностью анализа более 99,5%).

Когда в композициях, наборах и способах согласно настоящему изобретению применяют множество мутированных генов ALK и/или продуктов указанных генов (например, маркеры, указанные в Таблице 1) согласно настоящему изобретению, количество, структура и/или активность каждого маркера или уровень экспрессии, или число копий можно сравнивать с нормальными количеством, структурой и/или активностью каждого из указанного множества маркеров или с уровнем экспрессии, или с числом копий в пробах того же типа от субъектов, не страдающих раком, либо в одной реакционной смеси (т.е., с применением реагентов, таких как разные флуоресцентные зонды, для каждого маркера) или в индивидуальных реакционных смесях, соответствующих одному или более мутированньм генам ALK и/или продуктам указанных генов (например, маркеры, указанные в Таблице 1). Если применяют множество мутированных генов ALK и/или продуктов указанных генов (например, маркеры, указанные в Таблице 1), можно применять или идентифицировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более индивидуальных маркеров.

Настоящее изобретение включает композиции, наборы и способы анализа раковых клеток в пробе (например, архивные образцы тканей или пробы, взятые у субъекта). Указанные композиции, наборы и способы по существу те же, которые были описаны выше, за исключением того что при необходимости указанные композиции, наборы и способы адаптируют к применению в определенных типах проб.

Также настоящее изобретение включает набор для оценки присутствия раковых клеток, обладающих или вероятно обладающих чувствительностью к ингибиторам ALK (например, в такой пробе, как проба, взятая у субъекта). Указанный набор может включать один или более реагентов, позволяющих идентифицировать мутированные гены ALK и/или продукты указанных генов (например, маркеры, указанные в Таблице 1) согласно настоящему изобретению, например, специфически связывающихся с нуклеиновой кислотой или полипептидом, соответствующими мутированным генам ALK и/или продуктам указанных генов (например, маркерам, указанным в Таблице 1) согласно настоящему изобретению. Подходящие реагенты для связывания с полипептидом, соответствующим маркеру согласно настоящему изобретению, включают антитела, производные антител, фрагменты антител и подобные. Подходящие реагенты для связывания с нуклеиновой кислотой (например, геномной ДНК, мРНК, сплайсированной мРНК, кДНУ или подобной) включают комплементарные нуклеиновые кислоты. Например, реагенты на основе нуклеиновых кислот могут включать олигонуклеотиды (меченные или немеченные), иммобилизованные на субстрате, меченные олигонуклеотиды, не связанные с субстратом, пары праймеров для ПЦР, зонды типа «молекулярных маяков» и подобные. Согласно некоторым вариантам реализации указанные наборы могут включать реагенты, применимые для осуществления способов, описываемых в настоящей заявке, таких как способы, включающие по меньшей мере одну пару праймеров, распознающих и гибридизующихся с участками нуклеиновой кислоты, окружающими по меньшей мере один участок нуклеиновой кислоты, содержащий по меньшей мере одну мутацию из приведенных в таблице 1, и средства определения амплифицированной целевой нуклеиновой кислоты на присутствие указанной мутации.

Набор согласно настоящему изобретению может необязательно включать дополнительные компоненты, применимые при осуществлении способов согласно настоящему изобретению. В качестве примера, указанный набор может включать жидкости (например, SSC буфер), подходящие для отжига комплементарных нуклеиновых кислот или для связывания антитела с белком, с которым оно специфически связывается, одну или более ячеек для проб, инструкцию, в которой описано осуществление способа согласно настоящему изобретению, пробу, содержащую нормальные клетки, пробу, содержащую раковые клетки, и подобное.

Набор согласно настоящему изобретению может включать реагент, применимый при определении уровня белка или активности белка-маркера. Согласно еще одному варианту реализации набор согласно настоящему изобретению может включать реагент для определения изменений в структуре маркера, например, присутствия мутации.

VI. Предсказательная медицина

Также настоящее изобретение относится к области предсказательной медицины, в которой для целей прогнозирования применяют диагностические пробы, фармакогеномику и мониторинг клинических исследований, чтобы затем производить профилактику в индивидуальном порядке. Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к пробам для определения количества, структуры и/или активности полипептидов или нуклеиновых кислот, соответствующих одному или более маркерам согласно настоящему изобретению, с целью определения, будет ли субъект, страдающий раком или с риском развития ракового заболевания, с большей вероятностью отвечать на лечение на основе ингибиторов ALK.

Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к способу определения, есть ли вероятность того, что субъект с раком будет реагировать на лечение ингибитором ALK. Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к способу прогнозирования течения заболевания. Согласно еще одному аспекту указанный способ относится к способу прогнозирования вероятности значимого явления в течении указанного заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает определение биологического маркера или сочетания биологических маркеров, ассоциированных с чувствительностью к лечению ингибитором ALK (например, мутанты ALK), как описано в настоящей заявке, и определение, вероятно ли, что указанный субъект будет отвечать на лечение указанным ингибитором ALK.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают цитогенетический скрининг проб тканей, взятых у пациента, у которого был диагностирован или предполагается рак (например, имеют место симптомы рака) с целью определения мутантов ALK (например, тех, которые описаны в Таблице 1).

Результаты указанного скрининга и их интерпретация позволяют прогнозировать ответ пациента на лечение ингибиторами ALK (например, PF-02341066 и/или PDD). В соответствии с настоящим изобретением присутствие мутанта ALK позволяет прогнозировать, что лечение ингибиторами ALK (например, PF-02341066 и/или PDD) принесет более выраженную терапевтическую пользу в отношении указанных раковых клеток по сравнению с пациентами, не содержащими мутантов ALK.

Согласно одному варианту реализации способы согласно настоящему изобретению включают осуществление контакта пробы ДНК, например, пробы, содержащей эмбриональную и/или соматическую ДНК, такой как проба хромосом, полученная из клеток, выделенных у пациента, с полинуклеотидными зондами, которые специфичны и гибридизуются при строгих условиях с геномной ДНК в областях хромосом, ассоциированных с цитогенетическими аномалиями (например, мутации ALK, описываемые в настоящей заявке), в целях определения присутствия или отсутствия одной или более аномалий (например, мутаций) в клетках указанного пациента. Результаты такого анализа позволяют прогнозировать вероятность ответа указанного пациента на лечение лекарственными препаратами, в частности агентами, которые ингибируют ALK (например, PF-02341066 и/или PDD).

Согласно еще одному варианту реализации течение заболевания оценивают посредством измерения времени между значимьми явлениями и в течение заболевания пациента, причем указанный показатель позволяет прогнозировать, будет ли у пациента длительное течение заболевания. Согласно еще одному варианту реализации значимое явление - это прогрессирование от первичной постановки диагноза до летального исхода. Согласно еще одному варианту реализации значимое явление - это прогрессирование от первичной постановки диагноза до метастазирования опухоли. Согласно еще одному варианту реализации значимое явление - это прогрессирование от первичной постановки диагноза до рецидива. Согласно еще одному варианту реализации значимое явление - это прогрессирование от метастазирования опухоли до летального исхода. Согласно еще одному варианту реализации значимое явление - это прогрессирование от метастазирования опухоли до рецидива. Согласно еще одному варианту реализации значимое явление - это прогрессирование от рецидива до летального исхода. Согласно некоторым вариантам реализации течение заболевания оценивают относительно показателя общей выживаемости, времени до прогрессирования и/или применяя критерии RECIST или другие критерии ответа.

Согласно некоторым вариантам реализации создают заранее установленный показатель, разделяя выборку пациентов по меньшей мере на две подгруппы. Согласно некоторым вариантам реализации количество подгрупп составляет две, так чтобы выборку пациентов разделить на подгруппу пациентов, содержащих мутанты ALK, и подгруппу пациентов, не содержащих мутантов ALK. Согласно некоторым вариантам реализации статус мутантов ALK у субъекта сравнивают либо с подгруппой, содержащей мутанты ALK, либо с подгруппой, не содержащей мутанты ALK; если указанный пациент содержит мутанты ALK, то он маловероятно будет отвечать на лечение ингибитором ALK (например, PF-02341066 и/или PDD), и/или у указанного пациента будет длительное течение заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации число подгрупп больше двух, включая, без ограничений, три подгруппы, четыре подгруппы, пять подгрупп и шесть подгрупп, в зависимости от ранжирования прогнозируемой эффективности ингибитора ALK, коорелирующей с конкретными мутантами ALK. Согласно некоторым вариантам реализации вероятность ответа на лечение оценивают относительно показателя общей выживаемости, времени до прогрессирования и/или применяя критерии RECIST. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитором ALK является PF-02341066 и/или PDD.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к способу определения, с какой вероятностью субъект с положимтельным по мутантам ALK раком будет отвечать на лечение ингибитором ALK например, PF-02341066 и/или PDD), и/или насколько длительным будет течение заболевания. Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к способу прогнозирования течения заболевания у субъекта с положимтельным по мутантам ALK раком. Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к способу прогнозирования вероятности значимого явления у субъекта с положимтельным по мутантам ALK раком.

1 Способы определения мутантов ALK

Способы оценки мутированных генов ALK и/или продуктов указанных генов (например, маркеров, указанных в Таблице 1) хорошо известны специалистам в данной области техники, включая способы анализа на основе гибридизации. Например, один из способов оценки числа копий кодирующей нуклеиновой кислоты в пробе включает применение Саузерн-Блоттинга. При Саузерн-Блоттинге геномную ДНК (обычно фрагментированную и разделенную на геле в ходе электрофореза) гибридизуют с зондом, специфическим для целевой области. Сравнение интенсивности сигнала гибридизации от зонда для целевой области и сигнала от контрольного зонда, полученного при анализе нормальной геномной ДНК (например, неамплифицированной части тех же или родственных клетки, ткани, органа и др.) позволяет определить присутствие/отсутствие и относительное число копий целевой нуклеиновой кислоты. В качестве альтернативы для оценки числа копий кодирующей нуклеиновой кислоты в пробе можно применять Нозерн-блоттинг. При Нозерн-блоттинге мРНК гибридизуют с зондом, специфичным к целевой области. Сравнение интенсивности сигнала гибридизации от зонда для целевой области и сигнала от контрольного зонда, полученного при анализе нормальной мРНК (например, неамплифицированной части тех же или родственных клетки, ткани, органа и др.) позволяет определить присутствие/отсутствие и относительное число копий целевой нуклеиновой кислоты.

Альтернативным средством определения числа копий является гибридизация in situ (например, Angerer (1987) Meth. Enzymol 152: 649). Обычно гибридизация in situ включает следующие этапы: (1) фиксацию ткани или биологической структуры, которые требуется анализировать; (2) обработка указанной биологической структуры перед гибридизацией для увеличения доступности целевой ДНК и снижения неспецифического связывания; (3) гибридизация смеси нуклеиновых кислот с нуклеиновой кислотой в указанной биологической структуре или ткани; (4) отмывка после гибридизации с целью удаления фрагментов нуклеиновых кислот, не связавшихся при гибридизации и (5) определение гибридизованных фрагментов нуклеиновых кислот. Реагент, применяемый на каждом из перечисленных этапов, и условия варьируют в зависимости от конкретной области применения.

Примеры проб на основе гибридизации включают традиционные способы «прямых зондов», такие как Саузерн-Блоттинг или гибридизация in situ (например, FISH и FISH плюс SKY/спектральное кариотипирование/), и способы «сравнительных зондов», такие как сравнительная геномная гибридизация (CGH), например, СОН на основе кДНК или на основе олигонуклеотидов, но не ограничиваясь ими. Указанные способы можно применять в широком спектре форматов, включая способы со связанным субстратом (например, на мембране или стекле) или подходы на основе матриц, но не ограничиваясь ими.

Согласно одному аспекту применяют FISH. Пробы клеток отбирают у пациентов в соответствии со способами, хорошо известными в технике, чтобы протестировать их при помощи способов цитогенетического исследования, известных в технике, например, посредством способа FISH. Согласно одному варианту реализации FISH можно проводить в соответствии с системой Vysis™ («Abbott Molecular»), протоколы производителя которой включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Применяют зонды, которые содержат сегменты ДНК, по существу комплементарные последовательности оснований в ДНК, существующих в разных частях хромосом. Примеры зондов, применимых согласно настоящему изобретению, а также процедура мечения и гибридизации зондов с пробами описаны в двух Патентах США, выданных компании «Vysis, Inc.» - №5491224 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и 6277569224 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) авторам Bittner, et al.

Хромосомные зонды содержат обычно от 50 до 10⁵ нуклеотидов. Более длинные зонды обычно состоят из более мелких фрагментов приблизительно от 100 до приблизительно 500 нуклеотидов длиной. В продаже существуют зонды, которые гибридизуются с центромерной ДНК и локус-специфичной ДНК, например у компании «Vysis, Inc.» (Даунерз Грув, Иллинойс), «Molecular Probes, Inc.» (Юджин, Орегон) или у компании «Cytocell» (Оксфордшир, Соединенное Королевство). В качестве альтернативы, зонды можно получить не из коммерческих источников, создав их из хромосомной или геномной ДНК посредством стандартных технологий. Например, источники ДНК, которые можно применять, включают геномную ДНК, клонированные последовательности ДНК, гибриды соматических клеток, которые содержат одну хромосому или часть одной хромосомы (например, хромосому человека) вместе с нормальным набором хромосом хозяина, и хромосомы, очищенные при помощи проточной цитометрии или микродиссекции. Рассматриваемую область можно выделить посредством клонирования или посредством сайт-специфичной амплификации с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Например, см. Nath and Johnson, Biotechnic Histochem., 1998, 73(1):6-22, Wheeless et al., Cytometry 1994, 17:319-326, и Патент США №5 491 224 (включен в настоящую заявку посредством ссылки).

Зонды, которые предполагается применять, гибридизуют со специфической областью хромосомы в целях определения, присутствует ли в данной области цитогенетическая аномалия. Одним типом цитогенетических аномалий является делеция. Хотя могут возникать делеции одной или более целых хромосом, обычно делеции касаются утраты части одной или более хромосом. Если целая область хромосомы, которая содержится в зонде, делегирована из клетки, гибридизации такого зонда с ДНК из указанной клетки в норме происходить не будет, и на данной хромосоме сигнала не будет. Если область хромосомы, которая частично содержится в зонде, из клетки делегирована, гибридизации такого зонда с ДНК из указанной клетки все же может происходить, но сигнал будет меньше. Например, утрату сигнала сравнивают с гибридизацией зонда с ДНК из контрольных клеток, которые не содержат генетических аномалий, на определение которых направленные указанные зонды. Согласно некоторым вариантам реализации анализируют сигнал по меньшей мере в 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более клетках для определения присутствия указанной цитогенетической аномалии.

Цитогенетические аномалии, которые требуется определять, могут включать нереципрокные транслокации, внутрихромосомные инверсии, точечные мутации, делеции, изменение числа копий генов, изменение уровня экспрессии генов и эмбриональные мутации, но не ограничиваются ими. В частности, одним типом цитогенетических аномалий является дупликация. Дупликации могут охватывать целые хромосомы или области, меньшие чем целая хромосома. Если область хромосомы, которая содержится в зонде, в клетке дуплицирована, гибридизация такого зонда с ДНК из указанной клетки в норме будет приводить к получению по меньшей мере еще одного сигнала по сравнению с количеством сигналов, регистрируемых в контрольных клетках без аномалии в области хромосомы, содержащейся в указанном зонде. На самом деле можно применять любые зонды, которые позволяют определять хромосому человека 2р23 или ее ортолог, или любую область хромосомы, содержащую транслокацию с геном ALK в 2р23 или его ортологом. Подходящие зонды хорошо известны в технике (например, продаются компанией «Vysis, Inc.» ((Даунерз Грув, Иллинойс).

К хромосомным зондам присоединяют метки так, чтобы можно было определять указанную область хромосомы, с которой они гибридизуются. Обычно зонды метят непосредственно флуорофором - органической молекулой, которая флуоресцирует после поглощения света с меньшей длиной волны/большей энергией. Указанный флуорофор позволяет визуализировать указанный зонд без вторичной молекулы-детектора. После ковалентного присоединения флуорофора к нуклеотиду, указанный нуклеотид можно непосредственно включить в указанный зонд при помощи стандартных технологий, таких как ник-трансляция, случайное примирование и ПЦР-мечение. В качестве альтернативы, нуклеотиды дезоксицитидина в указанном зонде можно переаминировать с линкером.

Затем указанный флуорофор ковалентно присоединяют к переаминированным нуклеотидам дезоксицитидина. См. Патент США №5491224 (включен в настоящую заявку посредством ссылки).

В Патенте США №5491224 описано мечение зондов, при котором несколько остатков цитозина, содержащих флуоресцентную метку, ковалентно связывается с ним. Число оснований цитозина с флуоресцентной меткой достаточно для того, чтобы генерировать различимый флуоресцентный сигнал, тогда как отдельные меченные таким образом сегменты ДНК по существу сохраняют свои свойства специфического комплементарного связывания (гибридизации) в отношении хромосомы или области хромосомы, которые требуется определять. Такие зонды получают путем взятия сегмента немеченного ДНК-зонда, переаминирования с применением линкерной группы нескольких нуклеотидов дезоксицитидина в указанном сегменте, ковалентного связывания флуоресцентной метки по меньшей мере с частью переаминированных оснований дезоксицитидина. Также к зондам можно присоединить метку посредством ник-трансляции, мечения случайными праймерами или ПЦР-мечения. Мечение проводят с применением нуклеотидов, либо меченных флуоресцентной меткой (прямое мечение), либо меченных гаптенами (непрямое мечение). Репрезентативные, не ограничивающие, примеры меток включают АМКА-6-дУТФ (аминометилкумаринацетат-6-дезоксиуридин-трифосфат), КаскадБлю-4-дУТФ, флуоресцеин-12-дУТФ, родамин-6-дУТФ, Су3-6-дУТФ, Су5-6-дУТФ, Биотин(БИО)-11-дУТФ, дигоксигенин(ДИГ)-11-дУТФ или динитрофенил-(ДНФ)-11-дУТФ.

Также можно проводить непрямое мечение зондов с применением биотина или дигоксигенина или мечение радиоактивными изотопами, такими как ³²Ри ³H, хотя для визуализации указанных зондов требуются вторичные молекулы-детекторы или последующая обработка. Например, зонд, меченный биотином, можно определять по авидину, конъюгированному с детектируемым маркером. Например, авидин можно конъюгировать с ферментным маркером, таким как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена. Ферментные маркеры можно определять в стандартных колориметрических реакциях с применением субстрата и/или катализатора для указанного фермента. Катализаторы для щелочной фосфатазы включают 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитросиний тетразолий. В качестве катализатора для пероксидазы хрена можно применять диаминобензоат.

Зонды также можно приготовить таким образом, чтобы флуоресцентная или другая метка не были частью ДНК до гибридизации или во время нее, а добавлялась после гибридизации, чтобы определять зонд, гибридизованный с хромосомой. Например, можно применять зонды, которые содержат антигенные молекулы, включенные в указанную ДНК. После гибридизации такие антигенные молекулы определяют при помощи специфических антител, реагирующих с указанными антигенными молекулами. Такие антитела могут сами по себе входить в состав флуорохрома, или их можно определять при помощи вторичного антитела с присоединенным флуорохромом.

Обработанный или модифицированный ДНК-зонд, как правило, очищают в целях удаления непрореагировавших, остаточных продуктов (например, молекул флуорохрома, не включенных в ДНК) перед применением для гибридизации.

Перед гибридизацией хромосомные зонды денатурируют в соответствии со способами, хорошо известными в технике. В общем, этапы гибридизации включают добавление избытка блокирующей ДНК к композиции меченного зонда, осуществление контакта блокированной композиции зонда при условиях гибридизации с областью хромосомы, которую требуется определить, например, в препарате, где указанная ДНК была денатурирована, отмывку негибридизованного зонда и определение связывания композиции зонда с указанной хромосомой или областью хромосомы.

Зонды гибридизуют или отжигают с хромосомной ДНК при гибридизующих условиях. Термин «гибридизующие условия» обозначает условия, которые облегчают отжиг между зондом и целевой хромосомной ДНК. Поскольку отжиг разных зондов может варьировать в зависимости от длины зонда, концентрации оснований и подобных факторов, отжиг облегчают путем варьирования концентрации зонда, температуры гибридизации, концентрации солей и других факторов, хорошо известных в технике.

Условия гибридизации модифицируют для облегчения гибридизации путем варьирования концентраций, состава оснований, сложности и длины зондов, а также концентрации солей, температур и длительности инкубации. Например, гибридизацию in situ обычно проводят в буфере для гибридизации, содержащем 1-2х SSC, 50-65% формамида и блокирующую ДНК для подавления неспецифической гибридизации. Обычно условия гибридизации, описанные выше, включают температуру приблизительно 25°-55°С, и длительности инкубации от приблизительно 0,5 часов до приблизительно 96 часов.

Неспецифическое связывание хромосомных зондов с ДНК вне целевой области можно удалить посредством серии отмывок. Температуру и концентрацию солей при каждой отмывке варьируют под контролем строгости промывки. Например, для условий высокой строгости отмывки можно проводить при приблизительно от 65°С приблизительно до 80°C, с применением 0,2х до приблизительно 2х SSC и от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% неионного детергента, такого как Нонидет Р-40 (NP40). Строгость можно снизить, уменьшив температуру отмывки или увеличив концентрацию соли в растворе для отмывки. Согласно некоторым способам применения необходимо блокировать способность к гибридизации повторяющихся последовательностей. Так, согласно некоторым вариантам реализации для блокирования неспецифической гибридизации применяют тРНК, геномную ДНК человека или Cot-I ДНК.

После отмывки указанному препарату дают стечь и сушат на воздухе, затем на препарат наносят среду для заливки, контр-краситель, такой как ДАПИ (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид) и накрывают покровным стеклом. Препараты можно просматривать сразу же или хранить при -20°С до проведения анализа.

Для флуоресцентных зондов, применяемых при технологии флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), флуоресценцию можно анализировать на флуоресцентном микроскопе, оснащенном соответствующим фильтром для каждого флуорофора, или применяя наборы двух- или трехполосных фильтров для наблюдения нескольких флуорофоров. Например, см. Патент США №5776588 (включен в настоящую заявку посредством ссылки). В качестве альтернативы для анализа характера гибридизации указанных хромосомных зондов можно применять такие технологии, как проточная цитометрия. FISH можно применять для определения числа копий хромосом или реаранжировки областей хромосом. Указанные зонды гибридизуются, или связываются с комплементарной ДНК и, поскольку они содержат флуоресцентные метки, исследователи могут увидеть локализацию таких последовательностей ДНК при помощи флуоресцентного микроскопа. В отличие от большинства других технологий, применяемых для исследования хромосом, для которых требуется, чтобы клетки активно делились, FISH также можно проводить на неделящихся клетках, что делает данную процедуру весьма универсальной. Следовательно, FISH можно проводить с применением клеток в интерфазе, или клеток в метафазе клеточного цикла. Многие технологии, включающие анализ FISH, описаны в Патенте США №5477841 (включен в настоящую заявку посредством ссылки), выданном Gray и Pinkel.

Результаты FISH можно интерпретировать путем сравнения с контрольными клетками, о которых известно, что они не содержат специфической цитогенетической аномалии, на определение которой направлен данный зонд. Характер FISH гибридизации между указанным зондом и ДНК из контрольных клеток сравнивают с гибридизацией того же зонда с ДНК из клеток, которые подвергаются исследованию или анализу на присутствие специфической цитогенетической аномалии. Когда зонд разрабатывают для определения делеции хромосомы или области хромосомы, обычно гибридизация зонда с ДНК из тестируемых клеток менее выражена, чем с ДНК из контрольных клеток. Обычно в тестируемых клетках сигнал от зонда отсутствует, что указывает на утрату области хромосомы, с которой в норме гибридизуется указанный зонд. Когда зонд разрабатывают для определения дупликации или добавления хромосомы, обычно гибридизация зонда с ДНК из тестируемых клеток выражена сильнее, чем с ДНК из контрольных клеток. Обычно в клетках добавляется определенный сигнал от зонда, который указывает на присутствие дополнительной области хромосомы, с которой в норме гибридизуется указанный зонд.

При осуществлении способов CGH к первому набору нуклеиновых кислот (например, из пробы, например, вероятная опухоль) присоединяют первую метку, а ко второму набору нуклеиновых кислот (например, контроль, например, из здоровой клетки/ткани) присоединяют вторую метку. Отношение гибридизации указанных нуклеиновых кислот определяют по соотношению связывания двух (первой и второй) меток с каждым волокном в указанной матрице. Там, где есть делеции или умножение хромосом, будут определяться различия в отношении сигналов от двух указанных меток, и указанное отношение будет служить показателем числа копий. Матричную CGH также можно проводить с одноцветньм мечением (в противоположность мечению контрольной пробы и пробы из вероятной опухоли двумя разньми красителями и их смешиванию перед гибридизацией, что приводит к отношению, связанному с конкурентной гибридизацией зондов на указанным матрицах). При CGH с одним красителем контроль метят и гибридизуют с одной матрицей, и считывают абсолютный сигнал, а пробы из вероятной опухоли метят и гибридизуют со второй матрицей (с идентичным содержанием), и считывают абсолютный сигнал. Различие в числе копий рассчитывают на основании абсолютных сигналов от двух указанных матриц.

Протоколы гибридизации, подходящие для применения совместно со способами согласно настоящему изобретению, описаны, например, у Albertson (1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142; EPO Pub. No. 430,402; Metbods in Molecular Biology, Vol.33: In situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1994), etc. Согласно одному варианту реализации, применяют протокол гибридизации Pinkel, et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211, или Kallioniemi (1992) Proc. Nati Acad Sci USA 89:5321-5325 (1992). Матричная CGH описана в Патенте США №6455258, содержание каждого из которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно еще одному варианту реализации для измерения присутствия/отсутствия и числа копий можно применять анализ, основанный на амплификации. При таком основанном на амплификации анализе последовательности нуклеиновых кислот выступают в качестве матрицы в реакции амплификации (например, полимеразной цепной реакции (ПЦР)). При количественной амплификации количество продукта амплификации должно быть пропорционально количеству матрицы в исходной пробе. Сравнение с соответствующими контролями, например, здоровой тканью, позволяет оценить число копий.

Способы «количественной» амплификации хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, количественная ПЦР включает одновременную совместную амплификацию известного количества контрольной последовательности с применением тех же праймеров. Это позволяет получить внутренний стандарт, который можно применять для калибровки реакции ПЦР.Подробные протоколы количественной ПЦР приведены у Innis, et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.). Измерение числа копий ДНК в локусах микросателлитной ДНК посредством количественного анализа ПЦР описано у Ginzonger, et al. (2000) Cancer Research 60:5405-5409. Чтобы специалист в данной области техники смог стандартным способом выбрать праймеры для амплификации какой-либо части гена, достаточно знать последовательность нуклеиновой кислоты указанных генов. Также при осуществлении способов согласно настоящему изобретению можно применять флуорогенную количественную ПЦР.При флуорогенной количественной ПЦР количественный анализ основан на количестве сигналов флуоресценции, например, от TaqMan и sybr green.

Другие подходящие способы амплификации включают лигазную цепную реакцию (ЛЦР), (см. Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077, и Barringer et al. (1990) Gene 89: 117), амплификацию с транскрипцией (Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), дот-ПЦР и ПЦР с адаптерами линкеров и др.

Также для идентификации областей умножения или делеций можно применять картирование потери гетерозиготности (LOH) (Wang, Z.C., et al. (2004) Cancer Res 64(1):64-71; Seymour, А. В., et al. (1994) Cancer Res 54, 2761-4; Hahn, S. A., et al. (1995) Cancer Res 55, 4670-5; Kimura, M., et al. (1996) Genes Chromosomes Cancer 17, 88-93).

2. Способы оценки экспрессии генов

Также можно оценивать уровень экспрессии маркера. Экспрессию маркера согласно настоящему изобретению можно оценивать при помощи одного из широкого спектра хорошо известных в технике способов определения экспрессии транскрибируемой молекулы или белка. Неограничивающие примеры таких способов включают иммунологические способы определения секретируемых, поверхностных, цитоплазматических или ядерных белков клетки, способы очистки белков, анализ функции или активности белков, способы гибридизации нуклеиновых кислот, способы обратной транскрипции нуклеиновых кислот и способы амплификации нуклеиновых кислот.

Согласно некоторым вариантам реализации активность конкретного гена характеризуют по количеству транскрипта гена (например, мРНК), по количеству транслируемого белка или по активности продукта гена. Экспрессию маркера можно отслеживать разными способами, включая определение уровня мРНК, уровня белка, активности белка, любой из которых можно измерить при помощи стандартных технологий. Определение может быть основано на количественном анализе уровня экспрессии гена (например, геномной ДНК, кДНК, мРНК, белка или ферментативной активности), или, в качестве альтернативы, может быть основано на качественной оценке уровня экспрессии гена, в частности, путем сравнения с контрольным уровнем. Тип уровня, который следует измерять, будет ясен из контекста.

Способы определения и/или количественного анализа транскрипта гена (мРНК или кДНК, образующегося с него) с применением технологий гибридизации нуклеиновых кислот известны специалистам в данной области техники (см. Sambrook et al. выше). Например, один из способов оценки присутствия, отсутствия или количества кДНК, основан на Саузерн-блоттинге, описанном выше. Вкратце, мРНК выделяют (например, с применением способа кислой экстракции в гуанидин-фенол-хлороформе, Sambrook et al. выше) и подвергают обратной транскрипции с получением кДНК. Затем кДНК необязательно расщепляют и загружают на гель в буфере, и переносят на мембраны. Затем проводят гибридизацию с применением зондов на основе нуклеиновых кислот, специфичных к целевой кДНК.

Общий принцип такого диагностического и прогностического анализа основан на приготовлении пробы или реакционной смеси, которая может содержать маркер, и зонд, при определенных условиях и в течение времени, достаточного для того, чтобы указанный маркер и зонд провзаимодействовали и связались, образовав комплекс, который можно удалить и/или определить в реакционной смеси. Такой анализ можно осуществлять разными способами.

Например, один из способов проведения такого анализа может быть основан на заякоривании указанного маркера на твердофазной подложке, также называемой субстратом, и определении комплекса целевой маркер/зонд, заякоренного на твердой фазе, в конце реакции. Согласно одному варианту реализации такого способа пробу, взятую у субъекта, у которого следует проверить присутствие/отсутствие и/или концентрацию маркера, можно заякорить на носителе или твердофазной подложке. Согласно другому варианту реализации возможна обратная ситуация, при которой указанный зонд можно заякорить на твердой фазе, а пробе, взятой у субъекта, дать прореагировать, как незаякоренному компоненту анализируемой смеси.

Существует множество известных способов заякоривания компонентов анализируемой смеси на твердой фазе. Они включают, без ограничений, молекулы маркера или зонда, которые иммобилизуют посредством конъюгации с биотином или стрептавидином. Такие биотинилированные компоненты анализируемой смеси можно приготовить из биотин-NHS (N-гидрокси-сукцинимида) с применением технологий, известных в технике (например, набор для биотинилирования «Pierce Chemicals», Рокфорд, Иллинойс) и иммобилизовать в лунках планшетов на 96 лунок, покрытых стрептавидином («Pierce Chemicals»). Согласно некоторым вариантам реализации поверхности с иммобилизованными компонентами анализируемой смеси можно приготовить заранее и хранить.

Другие подходящие носители или твердофазные подложки для такого анализа включают любой материал, который может связываться с тем классом молекул, к которому принадлежат указанный маркер или зонд. К широко известным подложкам или носителям можно отнести стекло, полистирол, нейлон, полипропилен, полиэтилен, декстран, амилазы, природную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, габбро и магнетит.

Для проведения анализа посредством перечисленных выше способов неиммобилизованный компонент добавляют к твердой фазе, на которой заякорен второй компонент. После завершения реакции не образовавшие комплекс компоненты удаляют (например, посредством отмывки) при таких условиях, что любые образовавшиеся комплексы остаются иммобилизованными на твердой фазе. Определение комплексов маркер/зонд, заякоренных на указанной твердой фазе, можно провести при помощи нескольких способов, описанных выше.

Согласно еще одному варианту реализации к указанному зонду, когда он является незаякоренным компонентов анализируемой смеси, в целях определения и считывания результатов анализа, либо прямо, либо не прямо можно присоединять детектируемые метки, обсуждаемые в настоящей заявке, которые хорошо известны специалисту в данной области техники.

Также можно напрямую определять образование комплекса маркер/зонд без дополнительных манипуляций или мечения какого-либо из компонентов (маркера или зонда), например, посредством применения технологии переноса энергии флуоресценции (см., например, Lakowicz et al., Патент США №5631169 (включен в настоящую заявку посредством ссылки); Stavrianopoulos, et al., Патент США №4868103 (включен в настоящую заявку посредством ссылки)). Метку-флуорофор на первой, «донорской», молекуле выбирают так, чтобы при возбуждении падающим светом с соответствующей длиной волны, энергия вызванной им флуоресценции поглощалась флуоресцентной меткой второй «акцепторной» молекулы, которая, в свою очередь, способна флуоресцировать благодаря поглощению указанной энергии. В качестве альтернативы молекула «донорского» белка может просто использовать энергию естественной флуоресценции остатков триптофана. Выбирают такие метки, которые испускают свет с разными длинами волн, так чтобы молекулу-«акцептор» можно было отличить от молекулы «донора». Поскольку эффективность переноса энергии между указанными метками зависит от расстояния между молекулами, можно оценить пространственные соотношения между молекулами. В ситуации, когда между указанными молекулами возникает связывание, излучение флуоресценции метки молекулы-«акцептора» в анализируемой смеси должно быть максимальным. Событие связывания фторэтил-L-тирозина можно без труда измерить при помощи стандартных флуорометрических средств, хорошо известных в технике (например, при помощи флуориметра).

Согласно еще одному варианту реализации определение способности зонда к распознаванию маркера можно произвести без мечения какого-либо из компонентов анализируемой смеси (зонда или маркера) посредством применения такой технологии, как Анализ взаимодействия биомолекул в режиме реального времени (BIA) (например, см. Sjolander, S. and Urbaniczky, С., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Применяемый в настоящей заявке термин «BIA» или «поверхностный плазменный резонанс» относится к технологии изучения биоспецифических взаимодействий в режиме реального времени, без мечения какого-либо из взаимодействующих веществ (например, BIAcore). Изменения массы на поверхности связывания (указывающие на событие связывания) приводят к изменениям коэффициента преломления света вблизи указанной поверхности (оптический феномен поверхностного плазменного резонанса (SPR)), что позволяет зарегистрировать различимый сигнал, который можно применять как показатель реакции между биологическими молекулами в реальном времени.

В качестве альтернативы, согласно еще одному варианту реализации можно проводить аналогичный диагностический и прогностический анализ с маркером и зондом в форме веществ, растворяющихся в жидкой фазе. При таком типе анализа образовавшие комплекс маркер и зонд отделяют от необразовавших комплекс компонентов при помощи любой из множества технологий, включая, без ограничений: дифференциальное центрифугирование, хроматографию, электрофорез и иммунопреципитацию. При дифференциальном центрифугировании комплексы маркер/зонд можно отделить от необразовавших комплекс компонентов посредством последовательных этапов центрифугирования, на основании разного равновесного осаждения комплексов, зависящего от их разных размеров и плотностей (например, см. Rivas, G., and Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7). Также для разделения образовавших комплекс молекул и не образовавших комплекс компонентов можно применять стандартные хроматографические технологии. Например, гель-фильтрация позволяет разделить молекулы по их размеру, и при применении соответствующей смолы для гель-фильтрации в формате колонки, например, можно разделить относительно более крупные комплексы и относительно мелкие не образовавшие комплекс компоненты. Аналогично, относительно различный заряд комплекса маркер/зонд и не образовавших комплекс компонентов можно использовать для различения комплекса и не образовавших комплекс компонентов, например, посредством применения смол для ионообменной хроматографии. Такие смолы и хроматографические технологии хорошо известны специалистам в данной области техники (например, см. Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., и Tweed, S.A. J Chromatogr В Biomed Sci Appi 1997 Oct 10;б99 (1-2):499-525). Также для отделения образовавших комплекс компонентов от несвязанных компонентов можно применять гель-электрофорез (например, см. Ausubel et al., ed.. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999). При данной технологии комплексы белков или нуклеиновых кислот разделяют, например, на основании их размера или заряда. Чтобы сохранить взаимодействие, лежащее в основе связывания, во время процесса электрофореза, обычно применяют неденатурирующие материалы геля и условия с отсутствием восстановителей. Соответствующие условия для конкретного типа анализа и компоненты, нужные для него, хорошо известны специалистам в данной области техники.

Согласно конкретному варианту реализации уровень мРНК, соответствующей маркеру, можно определить в форме in situ и in vitro в биологической пробе при помощи способов, известных в технике. Предполагается, что термин «биологическая проба» включает ткани, клетки, биологические жидкости и их изоляты, выделенные у субъекта, а также ткани, клетки, биологические жидкости, присутствующие в организме субъекта. Многие способы определения экспрессии основаны на оценке изолированной РНК. Для способов in vitro для очищения РНК из клеток можно применять любую технологию выделения РНК, которая не направлена на выделение только мРНК (например, см. Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999). Кроме того, большое число проб тканей можно без труда подвергнуть обработке с применением технологий, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как, например, одностадийный процесс выделения РНК по Chomczynski (1989, Патент США №4843155 (включен в настоящую заявку посредством ссылки)).

Выделенную нуклеиновую кислоту можно применять при анализе, основанном на гибридизации или амплификации, который включает, без ограничений, Саузерн-Блоттинг или Нозерн-Блоттинг, полимеразную цепную реакцию и матрицы зондов. Один из способов диагностики, основанных на определении уровня мРНК, включает осуществление контакта изолированной мРНК с молекулой нуклеиновой кислоты (зонд), которая может гибридизоваться с мРНК, кодируемой геном, который определяют. Нуклеиновой кислотой-зондом может быть, например, полноразмерная кДНК или ее часть, такая как олигонуклеотид, состоящий по меньшей мере из 7, 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов, достаточный для специфической гибридизации с мРНК или геномной ДНК, кодирующей маркер согласно настоящему изобретению, при строгих условиях. Другие зонды, подходящие для применения при диагностическом анализе согласно настоящему изобретению, описаны в настоящей заявке. Гибридизация мРНК с указанным зондом указывает на то, что рассматриваемый маркер экспрессируется.

Согласно одному формату указанную мРНК иммобилизуют на твердой поверхности и дают ей контактировать с зондом, например, путем загрузки изолированной мРНК на агарозный гель и переноса указанной мРНК с геля на мембрану, такую как нитроцеллюлозная мембрана. Согласно альтернативному формату, указанный зонд (зонды) иммобилизуют на твердой поверхности, и дают мРНК контактировать с указанным зондом (зондами), например, на матрице генных чипов Affymetrix. Специалисты в данной области техники могут без труда адаптировать известные способы определения мРНК для применения при определении уровня мРНК, кодируемой маркером согласно настоящему изобретению.

Указанные зонды могут быть полноразмерной или менее чем полноразмерной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок. Более короткие зонды тестируют эмпирически на специфичность. Примеры нуклеиновых кислот-зондов состоят из 20 оснований (см., например Sambrook et al., где описаны способы отбора последовательностей нуклеиновых кислот-зондов для применения при гибридизации нуклеиновых кислот). Визуализация гибридизованных частей позволяет качественно определить присутствие или отсутствие кДНК.

Альтернативный способ определения уровня транскрипта, соответствующего маркеру согласно настоящему изобретению, в пробе основан на процессе амплификации нуклеиновых кислот, например, посредством ртПЦР (экспериментальный вариант реализации, описанный у Mullis, 1987, Патент США №4683202 (включен в настоящую заявку посредством ссылки)), лигазной цепной реакции (Вагапу, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), самоподдерживающейся репликации последовательностей (Guatelli, et al. (1990)-Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), системы транскрипционной амплификации (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-бета-репликазы (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), репликации по типу "катящегося кольца" (Lizardi et al., Патент США 5 854 033 (включен в настоящую заявку посредством ссылки)) или любого другого способа амплификации нуклеиновых кислот, после которого проводят определение амплифицированных молекул при помощи технологий, хорошо известных специалистам в данной области техники. При флуорогенной ртПЦР количественный анализ основан на количестве сигналов флуоресценции, например TaqMan и sybr green. Указанные схемы определения особенно применимы при определении молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень малом количестве. В настоящей заявке термин «праймеры амплификации» относятся к паре молекул нуклеиновых кислот, которые могут отжигаться на 5' или 3'-области гена (положительной и отрицательной цепи, соответственно, или наоборот) и заключают короткую область между собой. Обычно праймеры амплификации содержат приблизительно от 10 до 30 нуклеотидов и фланкируют область длиной приблизительно от 50 до 200 нуклеотидов. При соответствующих условиях и в присутствии соответствующих реагентов такие праймеры позволяют провести амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеотидов, фланкированную указанными праймерами.

В случае способов in situ, мРНК перед определением не требуется выделять из клеток. При осуществлении таких способов пробу клеток или ткани готовят/обрабатывают посредством хорошо известных гистологических способов. Пробу затем иммобилизуют на подложке, обычно на предметном стекле, и затем дают указанной пробе вступить в контакт с зондом, который может гибридизоваться с мРНК, кодирующей указанный маркер.

В качестве альтернативы проведения определения, основанного на абсолютном уровне экспрессии указанного маркера, определение может быть основано на нормированном уровне экспрессии указанного маркера. Уровень экспрессии нормируют путем коррекции абсолютного уровня экспрессии маркера, сравнивая его экспрессию с экспрессией гена, который не является маркером, например гена домашнего хозяйства, экспрессируемого конститутивно. Подходящие гены для нормирования включают гены домашнего хозяйства, такие как ген актина или гены, специфичные для клеток эпителия. Такое нормирование позволяет сравнить уровень экспрессии в одной пробе, например, в пробе субъекта, с уровнем в другой пробе, например, нераковой пробе, или провести сравнение между пробами из разных источников.

В качестве альтернативы уровень экспрессии можно выражать как относительный уровень экспрессии. Для определения относительного уровня экспрессии маркера, уровень экспрессии указанного маркера определяют для 10 или более проб клеток из нормальных изолятов относительно раковых изолятов, или даже для 50 или более проб, перед определением уровня экспрессии для рассматриваемой пробы. Средний уровень экспрессии каждого из анализируемых генов определяют в большем числе проб, и его применяют в качестве исходного уровня экспрессии указанного маркера. Уровень экспрессии указанного маркера, определенный в тестируемой пробе (абсолютный уровень экспрессии), затем делят на средний показатель экспрессии, полученный для данного маркера. Это позволяет вывести относительный уровень экспрессии.

Согласно определенному варианту реализации пробы, применяемые при определении исходного уровня, взяты из раковых клеток или из нормальных клеток ткани того же типа. Применение уровня экспрессии, выявленного в нормальных тканях, в качестве среднего показателя экспрессии позволяет проверить, является ли анализируемый маркер специфичным для той ткани, из которой были получены указанные клетки (по сравнению с нормальными клетками). Кроме того, если накапливается больше данных, можно перепроверять средний уровень экспрессии, что дает более точные показатели средней экспрессии на основании объединенных данных. Данные об экспрессии, полученные для нормальных клеток, дают среднее для ранжирования тяжести состояния при раке.

Согласно другому варианту реализации экспрессию маркера оценивают путем приготовления геномной ДНК или мРНК/кДНК (т.е., транскрибируемого полинуклеотида) из клеток в пробе субъекта, и путем гибридизации указанной геномной ДНК или мРНК/кДНК с эталонным полинуклеотидом, который комплементарен полинуклеотиду, содержащему указанный маркер, и его фрагментам. Перед гибридизацией с эталонным полинуклеотидом кДНК необязательно можно амплифицировать с применением любого из многочисленных способов полимеразной цепной реакции. Экспрессию одного или более маркеров можно определять подобным образом при помощи количественной ПЦР (КПЦР), оценивая уровень экспрессии указанного маркера (маркеров). В качестве альтернативы для определения существования мутированного маркера у субъекта можно применять любой из многих известных способов определения мутаций (например, делеций одиночных нуклеотидов).

Согласно похожим вариантам реализации смесь транскрибированных нуклеотидов, полученных из указанной пробы, вступает в контакт с субстратом, к которому, кроме того, присоединен полинуклеотид, комплементарный или гомологичный по меньшей мере части маркера согласно настоящему изобретению (например, комплементарность или гомологичность охватывает по меньшей мере 7, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 500 или более остатков нуклеотидов). Если полинуклеотиды, комплементарные или гомологичные маркеру согласно настоящему изобретению, можно определять на указанном субстрате дифференциально (например, можно определять при помощи разных хромофоров или флуорофоров, или фиксировать в разных избранных положениях), то уровни экспрессии множества маркеров можно оценивать одновременно с применением одного субстрата (например, микроматрица «генных чипов», состоящая из полинуклеотидов, иммобилизованных в избранных положениях). Когда применяют способ оценки экспрессии маркера, который основан на гибридизации одной нуклеиновой кислоты с другой, указанную гибридизацию можно проводить при строгих условиях гибридизации.

Согласно другому варианту реализации применяют сочетание способов оценки экспрессии маркера.

Поскольку композиции, наборы и способы согласно настоящему изобретению основаны на определении различий уровня экспрессии или числа копий одного или более маркеров согласно настоящему изобретению, при некоторых вариантах реализации уровень экспрессии или число копий указанного маркера должны быть значительно выше, чем нижний предел определения способа, применяемого для оценки экспрессии или числа копий по крайней мере в одной из здоровых клеток и раковых клеток.

3. Способы оценки экспрессируемого белка

Активность или уровень белка-маркера можно также определять и/или оценивать количественно путем определения или количественной оценки экспрессируемого полипептида. Указанный полипептид можно определять и оценивать его количество при помощи любого из многих способов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Они могут включать аналитические биохимические способы, такие как электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), супердиффузионная хроматография и подобные, или разные иммунологические способы, такие как реакция преципитации в жидкости или геле, иммунодиффузия (одиночная или двойная), иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализ (РИА), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммунофлуоресцентный анализ, Вестерн-блоттинг, иммуногистохимические способы и подобные. Специалист в данной области техники может без труда адаптировать известные способы определения белков/антител для применения при определении, экспрессируют ли клетки маркер согласно настоящему изобретению.

Еще одним агентом для определения полипептида согласно настоящему изобретенпию является антитело, способное связываться с полипептидом, соответствующим маркеру согласно настоящему изобретению, например, антитело с поддающейся определению меткой. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Можно применять интактное антитело или его фрагмент (например, Fab or F(ab')₂). Термин «меченный» применительно к зонду или антителу должен включать прямое мечение указанного зонда или антитела посредством присоединения (т.е., образования физической связи) определяемого вещества к указанному зонду или антителу, а также непрямое мечение указанного зонда или антитела посредством реагирования с другим реагентом, который подвергли непосредственному мечению. Примеры непрямого мечения включают определение первичного антитела при помощи меченного флуоресцентной меткой вторичного антитела и конечного мечения ДНК-зонда биотином такого, что его можно было бы определить по стрептавидину с флуоресцентной меткой.

Согласно еще одному варианту реализации к указанному антителу присоединяют метку, например, антитело, меченное радиоактивным веществом, хромофором, флуорофором или меткой-ферментом. Согласно еще одному варианту реализации применяют производное антитела (например, антитело, конъюгированное с субстратом, с белком или с лигандом из пары белок-лиганд {например, биотин-стрептавидин}) или фрагмент антитела (например, одноцепочечное антитело, изолированный гипервариабельный домен антитела, др.), которые связываются специфически с белком, соответствующим указанному маркеру, таким, как белок, кодируемый открытой рамкой считывания, соответствующей указанному маркеру, или таким, как белок, который подвергся полностью или частично своим обычным пострансляционным модификациям.

Термин «иммуногистохимия» или «ИГХ» относится к способу локализации антигенов (например, белков) в клетках среза ткани с применением принципа специфического связывания антител с антигенами в биологических тканях. Иммуногистохимическое окрашивание широко применяют при диагностическом выявлении аномальных клеток, таких как клетки, обнаруживаемые в раковых опухолях. Специфические молекулярные маркеры характерны для конкретных клеточных событий, таких как пролиферация или гибель клетки (апоптоз). ИГХ широко применяют для того, чтобы получать представление о распределении и локализации биологических маркеров и дифференциальной экспрессии белков в разных частях биологической ткани. Визуализации взаимодействия антитело-антиген можно достигнуть несколькими путями. Самый распространенный вариант таков, что антитело конъюгируют с ферментом, таким как пероксидаза, который может катализировать дающую окраску реакцию. В качестве альтернативы, к указанному антителу также можно присоединять метку-флуорофор, такую как флуоресцеин, родамин, DyLight Fluor или Alexa Fluor.

Белки из клеток можно выделять при помощи технологий, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Применяемые способы выделения белков могут быть, например, такие, как описаны у Harlow and Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Согласно одному формату антитела, или фрагменты антител, можно применять при осуществлении способов, таких как Вестерн-блоттинг или флуоресцентные технологии, для определения экспрессируемых белков. При таких вариантах применения можно иммобилизовать либо антитело, либо белки на твердой подложке. Подходящие твердофазные подложки или носители включают любую подложку, которая способна связываться с антигеном или с антителом. К хорошо известным подложкам или носителям можно отнести стекло, полистирол, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, габбро и магнетит.

Специалист в данной области техники должен знать многие другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, и сможет адаптировать такую подложку для применения в рамках настоящего изобретения. Например, белок, выделенный из клетки, можно загрузить на полиакриламидный гель для электрофореза и иммобилизовать на твердофазной подложке, такой как нитроцеллюлоза. Затем указанную подложку отмывают подходящим буфером, после чего обрабатывают антителом с поддающейся определению меткой. Затем указанную подложку можно отмыть повторно указанным буфером, чтобы удалить несвязавшееся антитело. Количество связанной метки на твердой подложке затем можно определять традиционными способами. Способы определения белков с применением технологий электрофореза хорошо известны специалистам в данной области техники (для общего обзора см. R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol.182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).

Согласно еще одному варианту реализации для определения и количественного анализа присутствия полипептида в пробе применяют Вестерн-блоттинг. Данная технология, как правило, включает разделение белков в пробе посредством гель-электрофореза в зависимости от их молекулярной массы, перенос разделенных белков на твердую подложку (такую как фильтр из нитроцеллюлозы, фильтр из нейлона или фильтр из производных нейлона) и инкубирование указанной пробы с антителами, которые специфически связываются с полипептидом. Антитела к полипептиду специфически связываются с указанным полипептидом на твердой подложке. К указанным антителам можно присоединять метку напрямую или, в качестве альтернативы, их можно впоследствии определять при помощи меченных антител (например, меченные античеловеческие антитела овцы), которые специфически связываются с анти-полипептидом.

Согласно еще одному варианту реализации указанный полипептид определяют при помощи иммунологического анализа. Применяемый в настоящей заявке термин «иммунологический анализ» относится к анализу, при котором применяют антитело для специфического связывания с анализируемым веществом. Иммунологический анализ, таким образом, характеризуется определением специфического связывания полипептида с анти-антителом, в противоположность применению других физических и химических свойств для выделения, направления и количественной оценки анализируемого вещества.

Указанный полипептид определяют и/или проводят его количественный анализ с применением разных хорошо известных вариантов анализа иммунологического связывания (см., например. Патент США №4366241 (включен в настоящую заявку посредством ссылки), 4376110 (включен в настоящую заявку посредством ссылки), 4517288 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и 4837168 (включен в настоящую заявку посредством ссылки)). Для обзора по общим принципам иммунологического анализа см. также Asai (1993) Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. New York; Stites & Terr (1991) Basic and Clinical Immunology 7th Edition.

При анализе иммунологического связывания (или иммунологическом анализе) обычно применяют «агент захвата» для специфического связывания с анализируемым веществом (полипептидом или последующим продуктом) и, часто, для его иммобилизации. Агент захвата представляет собой частицу, которая специфически связывается с анализируемым веществом. Согласно еще одному варианту реализации агентом захвата является антитело, которое специфически связывается с полипептидом. Указанное антитело (анти-пептид) можно получить любым из множества способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.

Также часто при иммунологическом анализе применяют агент для мечения для специфического связывания и мечения комплекса, образуемого при связывании агента захвата и анализируемого вещества. Агент для мечения может быть сам одной из частиц, содержащих комплекс антитело/анализируемое вещество. Так, агентом для мечения может быть меченный полипептид или меченное антитело. В качестве альтернативы агентом-меткой может быть третья частица, такая как другое антитело, которое специфически связывается с комплексом антитело/полипептид.

Согласно одному варианту реализации агентом для мечения может быть второе антитело человека, содержащее метку. В качестве альтернативы указанное второе антитело может не содержать метки, но оно может в свою очередь быть связано с третьим меченным антителом, специфичным к антителам того вида, из которого было получено второе антитело. Второе антитело можно модифицировать поддающимся определению веществом, например, биотином, с которым может специфически связываться третья меченная молекула, такая как меченный ферментом стрептавидин.

В качестве агента для мечения также можно применять другие белки, способные к специфическому связыванию константных областей иммуноглобулинов, такие как белок А и белок G. Указанные белки в норме являются компонентами клеточной стенки стрептококковых бактерий. Они проявляют высокую неиммуногенную активность в отношении константных областей иммуноглобулинов из разных видов (для общего обзора см. Kronval, et al. (1973) J. Immunol., 111: 1401-1406, и Akerstrom (1985) J. Immunol., 135:2589-2542).

Как указывалось выше, иммунологический анализ, направленный на определение и/или количественный анализ полипептида, может принимать разные формы, хорошо известные специалистам в данной области техники.

Например, иммунологический анализ, направленный на определение полипептида, может быть конкурентным или неконкурентным. Неконкурентный иммунологический анализ - это анализ, при котором количество захваченного анализируемого вещества определяют напрямую. Например, при «сэндвич-анализе» агент захвата (антитело к пептиду) может связываться непосредственно с твердым субстратом, на котором он иммобилизован. Такие иммобилизованные антитела затем захватывают полипептид, присутствующий в тестируемой пробе. Иммобилизованный таким образом полипептид затем связывается агентом для мечения, таким как второе антитело человека, содержащее метку.

При конкурентном анализе количество анализируемого вещества (полипептида), присутствующего в пробе, измеряют косвенно на основании измеренного количества добавляемого (экзогенного) анализируемого вещества (полипептида), замещаемого (или вытесняемого) на агенте захвата (антитела к пептиду) анализируемым веществом, присутствующим в указанной пробе. При одном варианте конкурентного анализа известное количество, в данном случае, полипептида добавляют в пробу, и затем проба контактирует с агентом захвата. Количество полипептида, связавшегося с указанным антителом, обратно пропорционально концентрации полипептида, присутствующего в указанной пробе.

Согласно еще одному варианту реализации указанное антитело иммобилизуют на твердом субстрате. Количество полипептида, связавшегося с указанным антителом, можно определить, измерив количество полипептида, присутствующего в комплексе полипептид/антитело, или, в качестве альтернативы, измерив количество оставшегося не образовавшего комплекс полипептида. Количество полипептида можно определить путем получения меченного полипептида.

При осуществлении вариантов анализа, описываемых в настоящей заявке, подсчет результатов (как положительный, или отрицательный, или количество полипептида) проводят в соответствии со стандартными способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Конкретный способ подсчета зависит от формата анализа и выбора метки. Например, при Вестерн-блоттинге подсчет результатов можно проводить путем визуализации окрашенного продукта, полученного при присоединении ферментной метки. Явно видная окрашенная полоса или пятно на соответствующей молекулярной массе засчитывается как положительный результат, а отсутствие явно видной полосы или пятна засчитывается как отрицательный результат. Интенсивность указанных полосы или пятна может дать количественную меру уровня полипептида.

Антитела для применения в разных вариантах иммунологического анализа, описываемых в настоящей заявке, можно получить, как описано в настоящей заявке.

Согласно еще одному варианту реализации уровень (активность) оценивают путем измерения ферментной активности продукта указанного гена. Способы оценки активности ферментов хорошо известны специалисту в данной области техники.

Технологии определения in vivo белка-маркера включают введение субъекту меченного антитела, направленного против указанного белка. Например, указанное антитело можно пометить радиоактивным маркером, присутствие и локализация которого у субъекта можно определить при помощи стандартных технологий.

Определенные маркеры, идентифицируемые при помощи способов согласно настоящему изобретению, могут быть секретируемыми белками. Специалисту в данной области техники будет несложно определить, является ли конкретный белок-маркер секретируемьм белком. Чтобы это определить, указанный белок-маркер экспрессируют, например, в клетке млекопитающего, например в линии клеток человека, отбирают внеклеточную жидкость и оценивают присутствие или отсутствие указанного белка во внеклеточной жидкости (например, при помощи меченного антитела, которое специфически связывается с указанным белком).

Далее приводится пример способа, который можно применять для определения секреции белка. Приблизительно 8×10⁵ клеток 293Т инкубируют при 37°С в лунках, содержащих питательную среду (модифицированную по способу Дульбекко среду Игла {DMEM} с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки) в атмосфере с 5% (объемные проценты) СО₂ и 95% воздуха до приблизительно 60-70% слияния. Затем указанные клетки трансфецируют стандартной смесью для трансфекции, содержащей 2 микрограмма ДНК, включающей вектор экспрессии, кодирующей указанный белок, и 10 микролитров LipofectAMINE™ («GIBCO/BRL», каталожный номер 18342-012) на лунку. Смесь для трансфекции выдерживают приблизительно 5 часов, а затем заменяют свежей питательной средой в воздушной атмосфере. Каждую лунку аккуратно промывают дважды средой DMEM, не содержащей метионина или цистеина («DMEM-MC»; ICN каталожный номер 16-424-54). В каждую лунку добавляют приблизительно 1 миллилитр среды DMEM-MC и приблизительно 50 микрокюри реагента Trans-³⁵S™ («ICN», каталожный номер 51006). Лунки инкубируют при атмосфере с 5% СО₂, как было описано выше, и инкубируют при 37°С в течение избранного периода. После инкубации 150 микролитров кондиционированной среды отбирают и центрифугируют с целью удаления свободно плавающих клеток и остатков. Присутствие указанного белка в надосадочной жидкости указывает на то, что данный белок секретируется.

Следует принимать во внимание, что пробы, взятые у субъекта, например, проба, содержащая мокроту, бронхоальвеолярный смыв. плевральный выпот, ткань, цельную кровь, сыворотку, плазму, соскоб со слизистой щеки, слюну, спинномозговую жидкость, мочу, кал и костный мозг, может содержать в себе клетки, особенно когда указанные клетки раковые, и, более конкретно, когда указанное раковое заболевание метастазирует, и, таким образом, их можно применять при осуществлении способов согласно настоящему изобретению. Конечно, пробу указанных клеток можно подвергнуть разным хорошо известным технологиям подготовки и хранения после ее отбора (например, экстракция нуклеиновых кислот и/или белков, фиксация, хранение, замораживание, ультрафильтрация, концентрирование, выпаривание, центрифугирование и др.) перед проведением оценки уровня экспрессии указанного маркера в пробе. Так, композиции, наборы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для определения экспрессии маркеров, соответствующих белкам, включающим по меньшей мере одну часть, которая экспонируется на поверхности клетки, когда клетка экспрессирует данные белки. Специалист в данной области техники может без труда определить, содержит ли белок, соответствующий конкретному маркеру, поверхностный белок. Например, для определения таких белков на целых клетках можно применять иммунологические способы, или применять хорошо известные способы компьютерного секвенирования (например, программу SIGNALP; Nielsen et al., 1997, Protein Engineering, 10:1-6) для прогнозирования присутствия по меньшей мере одного внеклеточного домена (т.е., включая и секретируемые белки, и белки, обладающие по меньшей мере одним поверхностным доменом). Экспрессию маркера, соответствующего белку, обладающему по меньшей мере одной частью, экспонируемой на поверхности клетки, которая его экспрессирует, можно определять без лизирования указанной клетки (например, с применением меченного антитела, которое специфически связывается с поверхностным доменом белка).

Также настоящее изобретение включает наборы для определения полипептида или нуклеиновой кислоты, соответствующих маркеру согласно настоящему изобретению, в биологической пробе, например, в пробе, содержащей мокроту, бронхоальвеолярный смыв, плевральный выпот, ткань, цельную кровь, сыворотку, плазму, соскоб со слизистой оболочки щеки, слюну, спинномозговую жидкость, мочу, кал и костный мозг. Такие наборы можно применять для определения, страдает ли субъект раком, или есть ли у него повышенный риск развития ракового заболевания. Например, указанный набор может содержать меченное соединение или агент, позволяющий определить полипептид или мРНК, кодирующую полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению, в биологической пробе, и средства для определения количества указанного полипептида или мРНК в указанной пробе (например, антитело, которое связывается с указанным полипептидом или олигонуклеотидный зонд, который связывается с ДНК или мРНК, кодирующими указанный полипептид). Также наборы могут включать инструкции по интерпретированию результатов, полученных при помощи указанного набора.

В случае наборов, основанных на антителах, указанные наборы могут включать, например: (1) первое антитело (например, присоединенное к твердой подложке), которое связывается с полипептидом, соответствующим маркеру согласно настоящему изобретению; и, необязательно (2) второе, отличное от первого, антитело, которое связывается либо с указанным полипептидом, либо с первым антителом, и конъюгировано с меткой, поддающейся определению.

В случае наборов, основанных на олигонуклеотидах, указанные наборы могут включать, например: (1) олигонуклеотид, например, олигонуклеотид с поддающейся определению меткой, который гибридизуется с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, соответствующий маркеру согласно настоящему изобретению, или (2) пару праймеров, применимых при амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующей маркеру согласно настоящему изобретению. Также указанный набор может включать, например, буфер, консервант или стабилизатор белков. Дополнительно указанный набор может содержать компоненты, необходимые для определения поддающейся определению метки (например, фермента или субстрата). Также указанный набор может содержать контрольную пробу или серию контрольных проб, которые можно оценивать и сравнивать с тестируемой пробой. Каждый компонент указанного набора может быть заключен в отдельный контейнер, и все указанные контейнеры могут находиться в одной упаковке, вместе с инструкцией по интерпретации результатов анализа, проводимого при помощи указанного набора.

4. Способы оценки структурных изменений

Также согласно настоящему изобретению предложен способ оценки присутствия структурного изменения, например, мутации.

Еще одним способом определения является аллель-специфичная гибридизация с применением зондов, перекрывающихся с полиморфным сайтом и содержащих приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 25 или приблизительно 30 нуклеотидов вокруг полиморфной области. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения несколько зондов, способных к специфической гибридизации с мутациями, присоединят к твердой подложке, например, «чип». Олигонуклеотиды можно присоединить к твердой подложке при помощи разных способов, включая литографию. Например, чипы, которые могут удерживать до 250000 олигонуклеотидов («GeneChip», Affymetrix™), также называемые «матрицами ДНК-зондов», описаны у Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244. Согласно одному варианту реализации чип содержит все мутации по меньшей мере одной полиморфной области гена. Указанная твердофазная подложка затем вступает в контакт с тестируемой нуклеиновой кислотой, и определяют гибридизацию со специфическими зондами. Соответственно, можно идентифицировать сущность нескольких мутаций одного или более генов в простом эксперименте с гибридизацией. Например, в одном эксперименте с гибридизацией можно определить сущность мутации нуклеотидного полиморфизма в 5'-вышележащем регуляторном элементе.

При осуществлении других способов определения перед идентификацией мутации необходимо сначала амплифицировать по меньшей мере часть маркера. Амплификацию можно проводить, например, посредством ПЦР и/или ЛЦР (см. Wu and Wallace (1989) Genomics 4:560), в соответствии со способами, известными в технике. Согласно одному варианту реализации геномную ДНК подвергают действию двух праймеров для ПЦР и амплификации с числом циклов, достаточным для получения требуемого количества амплифицированной ДНК. Согласно некоторым вариантам реализации указанные праймеры располагаются на расстоянии от 150 до 350 пар оснований.

Альтернативные способы амплификации включают: самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli, J.C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), системы транскрипционной амплификации (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-бета-репликазу (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197) и самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli, J.C. et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 87:1874), а также амплификацию, основанную на нуклеиновых кислотах (NABSA) или любой другой способ амплификации нуклеиновых кислот, после которого проводят определение амплифицированных молекул при помощи технологий, хорошо известных специалистам в данной области техники. Такие схемы определения особенно применимы при определении молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень малых количествах.

Согласно одному варианту реализации можно применять любую из множества реакций секвенирования, известных в технике, для прямого определения последовательности по меньшей части маркера и определения мутаций путем сравнения последовательности из пробы с соответствующей эталонной (контрольной) последовательностью. Примеры реакций секвенирования включают реакции, основанные на технологиях, разработанных Maxam and Gilbert (Proc. Natl Acad Sci USA (1977) 74:560) или Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci 74:5463). Также предполагается, что при проведении анализа пробы субъекта можно применять любую из множества процедур автоматического секвенирования (Biotechniques (1995) 19:448), включая секвенирование на основе масс-спектрометрии (например, см. Патент США №5547835 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и Публикацию заявки на международный патент WO 94/16101 (включена в настоящую заявку посредством ссылки) под названием «DNA Sequencing by Mass Spectrometry» автора H. Koster; Патент США №5547835 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и Публикацию заявки на международный патент WO 94/21822 (включена в настоящую заявку посредством ссылки) под названием «DNA Sequencing by Mass Spectrometry Via Exonuclease Degradation» автора Н. Koster, а также Патент США №5605798 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) и Публикацию заявки на международный патент PCT/US96/03651 (включена в настоящую заявку посредством ссылки) под названием «DNA Diagnostics Based on Mass Spectrometry» автора Н. Koster; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; and Griffin et al. (1993) Appi Biochem Biotechnol 38:147-159). Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что для определенных вариантов реализации требуется определить существование только одного, двух или трех оснований нуклеиновой кислоты в реакции секвенирования. Например, можно получать А-сигнал или подобный, при котором определяют только один нуклеотид.

Некоторые другие способы секвенирования раскрываются, например, в Патенте США №5580732 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) под названием «Method of DNA sequencing employing a mixed DNA-polymer chain probe» и в Патенте США №5571676 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) под названием «Method for mismatch-directed in vitro DNA sequencing».

В некоторых случаях присутствие специфического аллеля маркера в ДНК, взятой у субъекта, можно показать при помощи рестрикционного анализа. Например, специфический нуклеотидный полиморфизм может приводить к тому, что последовательность нуклеотидов будет содержать сайт рестрикции, который отсутствует в последовательности нуклеотидов с другой мутацией.

Согласно дополнительному варианту реализации для определения оснований, спаренных вопреки принципу комплементарности, в РНК/РНК, ДНК/ДНК или в гетеродуплексах РНК/ДНК можно применять защиту от расщепляющих агентов (таких как нуклеаза, гидроксиламин или тетраоксид осмия с пиперидином) (Myers, et al. (1985) Science 230:1242). Обычно технологию «расщепления ошибочно спаренных нуклеотидов» начинают осуществлять с получения гетеродуплексов, образованных при гибридизации контрольной нуклеиновой кислоты, которая может необязательно быть меченной, например, РНК или ДНК, содержащей последовательность нуклеотидов маркера мутации, с тестируемой нуклеиновой кислотой, например, РНК или ДНК, полученной из пробы ткани. Указанные двухцепочечные дуплексы обрабатывают агентом, который расщепляет одноцепочечные области указанного дуплекса, такие, как дуплексы, образованные в местах ошибочного спаривания оснований между контрольной и тестируемой нитями. Например, дуплексы РНК/ДНК можно обрабатывать рибонуклеазой, и гибриды ДНК/ДНК обрабатывают нуклеазой S1 в целях ферментативного расщепления областей ошибочного спаривания. Согласно другим вариантам реализации дуплексы либо ДНК/ДНК, либо РНК/РНК можно обрабатывать гидроксиламином или тетраоксидом осмия с пиперидином в целях расщепления областей ошибочного спаривания. После расщепления областей ошибочного спаривания образовавшийся материал затем разделяют по размеру в денатурирующем полиакриламидном геле, чтобы определить, содержат ли контрольная и тестируемая нуклеиновые кислоты идентичные последовательности нуклеотидов, или по каким нуклеотидам они различаются. Например, см. Cotton et al (1988) Proc. Nati Acad Sci USA 85:4397; Saleeba et al (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. Согласно еще одному варианту реализации к контрольной и тестируемой нуклеиновой кислоте в целях определения присоединяют метки.

Согласно еще одному варианту реализации мутацию можно идентифицировать посредством денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ДВЭЖХ) (Oefher and Underbill, (1995) Am. J. Human Gen. 57:Suppl. A266). ДВЭЖХ основана на ион-парной хроматографии с обращенной фазой, направленной на определение гетеродуплексов, которые генерируются в ходе амплификации при ПЦР фрагментов от субъектов, являющихся гетерозиготами по конкретному нуклеотидному локусу в данном фрагменте (Oefher and Underbill (1995) Am. J. Human Gen. 57:Suppl. A266). Обычно продукты ПЦР получают при помощи праймеров для ПЦР, фланкирующих рассматриваемую ДНК. Проводят анализ ДВЭЖХ, и полученные хроматограммы анализируют с целью идентификации изменений или делеций пар оснований на основании специфических хроматографических профилей (см. O'Donovan et al. (1998) Genomics 52:44-49).

Согласно другому варианту реализации для идентификации типа мутации в маркере оценивают изменения электрофоретической подвижности. Например, одноцепочечный конформационный полиморфизм (SSCP) можно применять для определения различий электрофоретической подвижности между мутантной нуклеиновой кислотой и нуклеиновой кислотой дикого типа (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766, также см. Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; и Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appi 9:73-79). Одноцепочечные фрагменты ДНК тестируемой и контрольной нуклеиновых кислот денатурируют и дают им ренатурировать. Вторичная структура одноцепочечных нуклеиновых кислот варьирует в зависимости от последовательности, и итоговое изменение электрофоретической подвижности позволяет определить замены даже одного нуклеотида. К указанным фрагментам ДНК можно присоединять метки или определять их при помощи зондов с метками. Чувствительность указанного анализа можно повысить, применяя РНК (вместо ДНК), у которой вторичная структура более чувствительна к изменениям в последовательности. Согласно еще одному варианту реализации применяемый способ основан на анализе гетеродуплексов с разделением молекул двухцепочечных гетеродуплексов на основе изменений электрофоретической подвижности (Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).

Согласно еще одному варианту реализации сущность мутации полиморфной области определяют путем анализа подвижности нуклеиновой кислоты, содержащей указанную полиморфную область, в полиакриламидном геле с градиентом денатурирующего агента, такой анализ называется денатурирующим градиентным гель-электрофорезом (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Когда в качестве способа анализа применяют DGGE, ДНК следует модифицировать, чтобы она не денатурировала полностью, например, путем добавления посредством ПЦР «GC-зажима», состоящего из приблизительно 40 по высокоплавкой богатой GC области ДНК. Согласно дополнительному варианту реализации вместо градиента денатурирующего агента для идентификации различий в подвижности контрольной и тестируемой ДНК применяют градиент температуры (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:1275).

Примеры технологий определения различий по меньшей мере по одном у нуклеотиду между двумя нуклеиновыми кислотами включают селективную гибридизацию олигонуклеотидов, селективную амплификацию или селективное удлинение праймеров, но не ограничиваются ими. Например, можно приготовить олигонуклеотидные зонды, в которых известный полиморфный нуклеотид расположен в центре (аллель-специфичные зонды), и затем гибридизовать их с целевой ДНК при условиях, которые допускают гибридизацию, только если найдено полное соответствие (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al (1989) Proc. Nati Acad. Sci USA 86:6230; и Wallace et al. (1979) Nucl. Acids Res. 6:3543). Такие технологии гибридизации аллель-специфичных олигонуклеотидов можно применять для одновременного определения нескольких замен нуклеотидов в разных полиморфных областях маркера. Например, олигонуклеотиды, содержащие последовательности нуклеотидов специфических мутаций, присоединяют к гибридизующей мембране, и затем указанную мембрану гибридизуют с меченной тестируемой нуклеиновой кислотой. Анализ сигнала гибридизации позволяет выявить сущность нуклеотидов в тестируемой нуклеиновой кислоте.

В качестве альтернативы совместно с настоящим изобретением можно применять технологию аллель-специфичной амплификации, которая зависит от селективной ПЦР-амплификации. Олигонуклеотиды, применяемые в качестве праймеров для специфичной амплификации, могут содержать рассматриваемую мутацию в центре молекулы (так, чтобы амплификация зависела от дифференциальной гибридизации) (Gibbs et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) или на самой дальней точке 3'-конца одного праймера, где при соответствующих условиях ошибочное спаривание может прервать или уменьшить полимеразное удлинение (Prossner (1993) Tibtech 11:238; Newton et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2503). Также данную технологию называют «PROBE» или «Probe Oligo Base Extension». Кроме того, может быть желательно ввести новый сайт рестрикции в область указанной мутации для возможности определения на основании расщепления (Gasparini et al (1992) Mol. Cell Probes 6:1).

Согласно еще одному варианту реализации идентификацию указанной мутации осуществляют посредством лигирования олигонуклеотидных зондов (OLA), как описано, например, в Патенте США №4998617 и у Landegren, U. et al., (1988) Science 241:1077-1080. В протоколе OLA применяют два олигонуклеотида, которые разработаны так, чтобы была возможна их гибридизация со смежными последовательностями одной цепи целевой молекулы. Один из указанных олигонуклеотидов соединяют с маркером разделения, например, биотинилируют, а к другому присоединяют поддающуюся определению метку. Если в целевой молекуле обнаруживается полностью комплементарная последовательность, указанные олигонуклеотиды будут гибридизоваться так, что их концы соединяться и образуют субстрат лигирования. Затем лигирование позволяет восстановить меченный олигонуклеотид при помощи авидина или другого лиганда биотина. Nickerson, D. А. et al. описали способ определения нуклеиновых кислот, который сочетает в себе признаки ПЦР и OLA (Nickerson, D. A. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:8923-8927). Согласно указанному способу ПЦР применяют для достижения экспоненциальной амплификации целевой ДНК, которую затем определяют при помощи OLA.

Также согласно настоящему изобретению предложены способы определения однонуклеотидных полиморфизмов в маркере. Поскольку однонуклеотидные полиморфизмы входят в состав сайтов изменения, фланкированных областями с неизмененной последовательностью, их анализ требует только лишь определения сущности одного нуклеотида, находящегося в сайте изменения, и нет необходимости определять полную последовательность гена для каждого субъекта. Было разработано несколько способов для облегчения анализа таких однонуклеотидных полиморфизмов.

Согласно одному варианту реализации полиморфизм одного основания можно определить при помощи специализированного устойчивого к экзонуклеазе нуклеотида, как раскрывается, например, у Mundy, C.R. (Патент США №4656127 (включен в настоящую заявку посредством ссылки)). В соответствии с указанным способом праймеру, комплементарному аллельной последовательности непосредственно с 3'-конца до полиморфного сайта, позволяют гибридизоваться с целевой молекулой, взятой у конкретного животного или человека. Если конкретный полиморфный сайт в целевой молекуле содержит нуклеотид, который комплементарен производному конкретного устойчивому к экзонуклеазе нуклеотиду, то такое производное будет включено в конец гибридизованного праймера. Такое включение придает праймеру устойчивость к экзонуклеазе, что делает возможным его определение. Поскольку сущность устойчивого к экзонуклеазе производного в пробе известна, тот факт, что прайме? приобрел устойчивость к экзонуклеазам, указывает на то, что нуклеотид, присутствующий в полиморфном сайте целевой молекулы, был комплементарен производному нуклеотида, применявшемуся в указанной реакции. Указанный способ обладает тем преимуществом, что он не требует определения больших количеств данных о посторонних последовательностях.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения для определения сущности нуклеотида полиморфного сайта применяют способ, основанный на решении (Cohen, D. et al. Французский патент 2650840; Заявка РСТ № WO91/02087 (включена в настоящую заявку посредством ссылки)). Как и в способе Mundy, описанном в Патенте США №4656127 (включен в настоящую заявку посредством ссылки), применяют праймер, который комплементарен последовательности аллеля непосредственно с 3'-конца до полиморфного сайта. Указанный способ позволяет определить сущность нуклеотида такого сайта при помощи меченных производных дидезоксинуклеотидов, которые, если они комплементарны указанному нуклеотиду в полиморфном сайте, включают в конец указанного праймера.

Альтернативный способ, известный как генетический бит-анализ или GBA, описан у Goelet, Р.et al. (Заявка РСТ №92/15712 (включена в настоящую заявку посредством ссылки). В способе Goelet, P. et al. применяют смеси меченных терминаторов и праймер, который комплементарен указанной последовательности с 3'-конца до полиморфного сайта. Меченный терминатор, который включается, таким образом определяется и комплементарен нуклеотиду, присутствующему в указанном полиморфном сайте целевой молекулы, которую анализируют. В отличие от этого, способ Cohen et al. (Французский патент 2650840; Заявка РСТ № WO91/02087 (включена в настоящую заявку посредством ссылки)) представляет собой анализ гетерогенных фаз, при котором праймер или целевая молекула иммобилизованы на твердой фазе.

Были описаны несколько способов управляемого праймерами включения нуклеотидов для оценки полиморфных сайтов в ДНК (Komher, J. S. et al., (1989) Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784; Sokolov, В. Р., (1990) Nucl. Acids Res. 18:3671; Syvanen, A. - C., et al., (1990) Genomics 8:684-692; Kuppuswamy, M. N. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147; Prezant, T. R. et al., (1992) Hum. Mutat. 1:159-164; Ugozzoli, L. et al., (1992) GATA 9:107-112; Nyren, P. (1993) et al., Anal. Biochem. 208:171-175). Указанные способов отличаются от GBA тем, что все они основаны на включении меченных дезкосинуклеотидов для определения различий между основаниями в полиморфном сайте. При таком формате, поскольку указанный сигнал пропорционален количеству включенных дезоксинуклеотидов, полиморфизмы, которые возникают при проведении циклов с тем же нуклеотидом, могут приводить к обнаружению сигнала, пропорционального длительности цикла (Syvanen, А.С. , et al., (1993) Атпег. J. Hum. Genet. 52:46-59).

Для определения сущности мутации полиморфной области, расположенной в кодирующей области маркера, можно применять и некоторые другие способы, которые были описаны выше. Например, идентификацию мутации, которая кодирует мутантный маркер, можно проводить при помощи антитела, специфически распознающего указанный мутантный белок, например, при иммуногистохимическом способе или иммунопреципитации. Антитела к маркерам дикого типа или мутантным формам маркеров можно получить в соответствии со способами, известными в технике.

В качестве альтернативы, можно измерить активность маркера, такую как связывание с лигандом маркера. Анализ связывания известен в технике и основан, например, на получении клеток у субъекта и проведении экспериментов по связыванию с меченным лигандом с целью определения, отличается ли связывание с мутантной формой белка от связывания с указанным белком дикого типа.

VI. Примеры способов скрининга, основанных на ингибировании ALK

Также согласно настоящему изобретению предложены способы идентификации веществ, которые ингибируют полипептиды ALK (например, полипептиды EML4-ALK), тем самым подавляя пролиферацию, рост, дифференцировку, апоптоз и/или метастазирование раковых клеток. Указанные способы включают осуществление контакта тестируемого соединения с полипептидом ALK (например, полипептидами, приведенными в Таблице 1). Согласно некоторьм вариантам реализации полипептид ALK включает вариант (например, полипептиды, перечисленные в Таблице 1), который повышает риск частичного ингибирования или нечувствительности к ингибированию одним или более ингибиторами ALK. Соединение, которое является ингибитором метастазирования опухоли, можно идентифицировать путем определения эффекта тестируемого соединения на активность варианта полипептида ALK (включая, например, связывание лиганда, такое как связывание АТФ и/или тирозинкиназная активность). В частном примере тестируемое вещество, которое ингибирует тирозинкиназную активность, по сравнению с активностью в отсутствие указанного тестируемого соединения, позволяют идентифицировать указанное тестируемое вещество как ингибитор метастазирования опухоли. Если указанное соединение ингибирует активность варианта ALK, также можно оценивать его способность к подавлению роста опухоли и метастазирования.

В частности, активирующие тирозинкиназу мутанты, включая новые биологические маркеры согласно настоящему изобретению, перечисленные в Таблице 1 (например, мутанты ALK), применимы для идентификации соединений, которые можно применять при лечении, облегчении или профилактике новообразований, например, путем подавления или предупреждения пролиферации, роста, дифференцировки, апоптоза и/или метастазирования раковых клеток. В технике известен скрининг библиотек химических веществ с целью поиска молекул, которые могли бы модулировать, например, ингибировать, выступать в качестве антагонистов или агонистов, или имитировать действие. Указанные библиотеки химических веществ, например, могут представлять собой библиотеки пептидов, пептидомиметиков, библиотеки химически синтезированных соединений, рекомбинантных молекул, например, библиотеки фагового дисплея, и библиотеки веществ, транслируемых in vitro, библиотеки непептидных синтетических органических соединений.

Скрининг или создание, идентификация и селекция соответствующих высокоаффинных ингибиторов новых биологических маркеров согласно настоящему изобретению, приведенных в таблице 1 (например, мутантов ALK) можно провести при помощи разных способов. В общих чертах, они могут включать два основных принципа, но не ограничиваются ими. Один из принципов состоит в применении знаний о структуре целевого белка для разработки молекулы-кандидата, с которой он мог бы тесно взаимодействовать. Примером может служить компьютерное молекулярное проектирование, в частности, основанное на новой информации о структуре и функции, раскрываемое в настоящей заявке на Фигуре 6. Второй принцип состоит в применении комбинаторных или других библиотек молекул, на основании которых в большой библиотеке молекул проводят скрининг на аффинность к соответствующему целевому ферменту, или на способность к ингибированию активности целевого фермента. В еще одном примере можно проводить скрининг в панели антител на способность к ингибированию целевого фермента.

Некоторые варианты реализации, приводимые в настоящей заявке, основаны на определении способности конкретного соединения к ингибированию нового биологического маркера согласно настоящему изобретению, перечисленного в Таблице 1 (например, мутантов ALK). Тестируемое соединение можно оценивать на их возможную способность к лечению новообразований, либо прямо, либо косвенно путем сравнения их активности с активностью соединений с установленной полезностью при лечении новообразований. Например, способность тестируемого соединения к ингибированию связывания лиганда, такого как связывание АТФ и/или тирозинкиназная активность, в отношении новых биологических маркеров согласно настоящему изобретению, приведенных в таблице 1 (например, мутантов ALK) можно сравнивать со способностью известных ингибиторов ALK, таких как PF-02341066 and/or PDD. Согласно одному варианту реализации такие тестируемые соединения могут обладать ингибирующей способностью, которая составляет по меньшей мере 100%, по меньшей мере 99,9%, по меньшей мере 99,8%, по меньшей мере 99,7%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,5%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,3%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,1%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 97,5%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 96,5%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 95,5%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 93,5%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 92,5%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 91,5%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 90,5%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 89,5%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 88,5%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 87,5%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 86,5%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 85,5%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 84,5%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 83,5%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 82,5%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 81,5%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 80,5%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 74%, по меньшей мере 73%, по меньшей мере 72%, по меньшей мере 71%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 69%, по меньшей мере 68%, по меньшей мере 67%, по меньшей мере 66%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 64%, по меньшей мере 63%, по меньшей мере 62%, по меньшей мере 61%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 59%, по меньшей мере 58%, по меньшей мере 57%, по меньшей мере 56%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 54%, по меньшей мере 53%, по меньшей мере 52%, по меньшей мере 51%, по меньшей мере 50% или любое значение в данном диапазоне в отношении ингибирования нового биологического маркера согласно настоящему изобретению, перечисленного в Таблице 1 (например, мутантов ALK) по сравнению с активностью известного ингибитора ALK при тех же условиях анализа. Согласно некоторым вариантам реализации клетки можно трансфецировать конструкцией, кодирующей новый биологический маркер согласно настоящему изобретению, перечисленный в Таблице 1 (например, мутанты ALK), дать им вступить в контакт с тестируемым соединением с присоединенным поддающимся определению маркером и анализировать на присутствие связанного тестируемого соединения. Согласно некоторым вариантам реализации в указанных трансфецированных клетках наблюдается связывание тестируемого соединения по сравнению с клетками, которые не были трансфецированы новым биологическим маркером согласно настоящему изобретению, перечисленным в Таблице 1 (например, мутанты ALK), и это указывает на то, что тестируемое соединение связывается с новым биологическим маркером согласно настоящему изобретению, перечисленным в Таблице 1 (например, мутанты ALK), экспрессируемым в указанных клетках. Обычно связывание указанного соединения определяют при помощи широкого спектра способов анализа, известных в технике, таких как ELISA, РИА и/или BIAcore.

Можно проводить скрининг соединений по ингибированию или другим эффектам на активность нового биологического маркера согласно настоящему изобретению, перечисленного в Таблице 1 (например, мутантов ALK) с применением экспрессируемой рекомбинантной версии указанного фермента, гомолога или ортолога, выделенных из других видов. В качестве альтернативы клетки, экспрессируеющие один из новых полипептидов-биологических маркеров, можно обрабатывать тестируемым соединением, и можно определять эффект тестируемого соединения на фосфорилирование специфической мишени, например, при помощи одной из технологий, описываемых в настоящей заявке. В одном примере определяют тирозинкиназную активность. Способы определения активности, влияющей на фосфорилирование тирозинкиназы (например, ингибирование) хорошо известны специалистам в данной области техники. В некоторых примерах тирозинкиназную активность можно определять путем оценки включения меченного фосфата (такого как ³²Р-меченный фосфат) в субстрат, который может быть фосфорилирован новым биологическим маркером согласно настоящему изобретению, перечисленным в Таблице 1 (например, мутанты ALK) (например, белок или фрагмент пептида, особенно, из компонентов, стоящих ниже в сигнальном пути). Согласно другим вариантам реализации тирозинкиназную активность можно измерить при помощи универсального набора для определения тирозинкиназной активности (например, Универсальный набор для определения тирозинкиназной активности («Takara Bio, Inc.», Мэдисон, Висконсин); набор для анализа тирозинкиназной активности («Millipore», Биллерика, Массачусетс)).

Согласно еще одному варианту реализации предложены способы скрининга, которые основаны также на определении того, сокращает ли указанное соединение рост клеток опухоли, например, рост клеток с установленной экспрессией мутанта активированной тирозинкиназы, такого как новый биологический маркер согласно настоящему изобретению, перечисленный в Таблице 1 (например, мутанты ALK). Можно применять разные линии клеток, которые можно отбирать в зависимости от ткани, которую требуется тестировать, которые хорошо известны специалистам в данной области техники (например, клетки BA/F3). Например, хорошо охарактеризованы многие линии клеток, и их применяют, например, в Национальном институте онкологии США (NCI) в своей программе скрининга новых противораковых препаратов.

Значительное и статистически значимое подавление роста клеток опухоли, такое, как возникающее при более чем приблизительно 50% дозы 100 мкМ, 90 мкМ, 80 мкМ, 70 мкМ, 60 мкМ, 50 мкМ, 40 мкМ, 30 мкМ, 20 мкМ, 10 мкМ, 9 мкМ, 8 мкМ, 7 мкМ, 6 мкМ, 5 мкМ, 4.5 мкМ, 4 мкМ, 3.5 мкМ, 3 мкМ, 2.5 мкМ, 2 мкМ, 1.5 мкМ, 1 мкМ, 900 нМ, 850 нМ, 800 нМ, 750 нМ, 700 нМ, 650 нМ, 600 нМ, 550 нМ, 500 нМ, 450 нМ, 400 нМ, 350 нМ, 300 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 95 нМ, 90 нМ, 85 нМ, 80 нМ, 75 нМ, 70 нМ, 65 нМ, 60 нМ, 55 нМ, 50 нМ, 45 нМ, 40 нМ, 35 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее, также указывает на то, что указанное соединение применимо при лечении новообразований. Можно определять значение ИКзо (концентрация, приводящая к 50% ингибированию) и применять его в целях сравнения. Данное значение равно концентрации препарата, необходимой для угнетения роста клеток опухоли на 50% относительно контроля.

Также данные значения можно применять к другим критериям. Например, согласно другим вариантам реализации, способы скрининга, предложенные в настоящей заявке, основаны также на определении того, вызывает ли тестируемое соединение апоптоз в культурах клеток опухоли. На основании морфологических и биохимических критериев можно выделить два типа гибели клеток: некроз и апоптоз. Некроз сопровождается повышенной проницаемостью плазматической мембраны, при которой происходит отек клеток и разрыв мембраны в течение нескольких минут. Апоптоз характеризуется образованием пузырьков на мембране, конденсацией цитоплазмы и активацией эндогенных эндонуклеаз.

Апоптоз возникает в природе во время нормального жизненного цикла тканей и во время эмбрионального развития органов и тканей. Также апоптоз можно вызвать разными стимулами, включая цитотоксические Т-лимфоциты и естественные киллеры, ионизирующие излучениеми определенные химиотерапевтические препараты. Предполагают, что неадекватная регуляция апоптоза играет важную роль в развитии многих патологических состояний, включая рак, СПИД или болезнь Альцгеймера и др.

Скрининг тестируемых соединений можно проводить по индукции апоптоза с применением культур клеток опухоли, выдерживаемых при условиях, описанных выше. В некоторых примерах таких способов скрининга обработка клеток тестируемым соединением основано на применении либо преконфлюентных, либо постконфлюентных культур, и обработке в течение одного - семи дней разными концентрациями тестируемых соединений. Апоптотические клетки можно измерять как в присоединенной, так и в «плавающей» части указанных культур. Обе части отбирают путем удаления надосадочной жидкости, обработки присоединенных клеток трипсином и объединения обоих препаратов после этапа центрифугирования в целях отмывки (10 минут, 2000 об/мин). После обработки тестируемым соединением культуры можно оценивать на присутствие апоптоза и некроза, например, при помощи флуоресцентной микроскопии после мечения акридиновым оранжевым и бромидом этидия. Специалистам в данной области техники известны многие способы измерения апоптотических клеток; например, один способ измерения числа апоптотических клеток был описан Duke & Cohen (Curr. Prot. Immuno., Coligan et al., eds., 3.17.1-3.17.1, 1992). Например, плавающие и присоединенные клетки отбирают посредством обработки трипсина и трижды промывают в ФСБ (фосфатно-солевом буфере). Затем аликвоты клеток центрифугируют. Полученные гранулы повторно суспендируют в среде, в ФСБ готовят смесь красителей, содержащую акридиновый оранжевый и бромид этидия и тщательно смешивают клетки с указаннолй смесью. Затем указанную смесь можно поместить на предметное стекло и просматривают в поисках морфологических признаков апоптоза. Также можно количественно оценивать апоптоз путем измерения увеличения фрагментации ДНК в клетках, которые были обработаны тестируемыми соединениями. В продаже есть фотометрический иммуноферментный анализ (ИФА) для количественного определения in vitro гистон-ассоциированных фрагментов ДНК в цитоплазме (моно- и олигонуклеотидов), например, ELISA для определения клеточной гибели, «Boehringer Mannheim»).

Согласно дополнительному варианту реализации способы скрининга, предложенные в настоящей заявке, также включают определение того, снижает ли тестируемое соединение метастазирование опухоли, например, в модели метастазирования на животных. Способы оценки метастазирования опухоли известны специалистам в данной области техники (см., например, Khanna and Hunter, Carcinogenesis 26:513-523, 2005). Одна из моделей метастазирования основана на ксенотрансплантатах человек-мышь, в случае которых линии клеток рака или ткани человека трансплантируют мышам с иммунной недостаточностью (таким как мыши с ТКИД (тяжелый комбинированный иммунодефицит) или безтимусные мыши). В случае аналогичных способов линию клеток, которая была разработана с целью экспрессии новый биологический маркер согласно настоящему изобретению, перечисленный в Таблице 1 (например, мутанты ALK) можно трансплантировать мыши с иммунной недостаточностью. В одном примере клетки опухоли или линии клеток вводят непосредственно в системный кровоток. Участок инъекции в значительной мере ограничивает собой участок, в котором развиваются метастазы в данных экспериментальных системах. Наиболее частым участком введения клеток опухоли, применяемым в экспериментальных моделях метастазирования, является латеральная хвостовая вена у мыши, что преимущественно приводит к метастазам в легких. В отличие от этого, внутриселезеночное введение или введение в воротную вену клеток опухоли чаще всего применяют с целью развития метастазов в печени, а внутрисердечное введение клеток может приводить к метастазам в нескольких участках, включая кости. После введения клеток опухоли или других линий клеток в кровоток развитие метастазов в рассматриваемом участке (таком, как легкие) отслеживают в течение нескольких дней или недель. В другой модели оценки метастазирования опухоли применяют ортотопную трансплантацию, при которой раковые клетки трансплантируют в анатомическую область или ткань, из которой возникла данная опухоль (например, путем прямой инъекции или хирургической имплантации фрагментов опухоли). Спонтанные метастазы, которые возникают из ортотопной опухоли, можно оценивать в течение нескольких дней или недель. Способность тестируемого соединения к сокращению или предупреждению метастазирования опухоли можно оценивать путем введения тестируемого соединения животному после подкожной, внутримышечной инъекции, введения в кровоток или ортотопной трансплантации клеток опухоли. Можно оценивать количество, размер или время развития метастазов. Соединение, которое подавляет метастазирование опухоли, может сокращать количество метастазов, например, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95 или даже на 100% по сравнению с контрольной пробой. Соединение, которое подавляет метастазирование опухоли, может уменьшать размер метастазов по сравнению с контрольной пробой. Аналогично, соединение, которое подавляет метастазирование опухоли, может отсрочивать начало развития метастазов, например, по меньшей мере на одну неделю, на две недели, на один месяц, шесть месяцев, один год или даже на неопределенный период времени.

VII. Примеры ингибиторов ALK

Способы, раскрываемые в настоящей заявке, включают идентификацию субъекта в качестве кандидата на лечение ингибитором нового биологического маркера согласно настоящему изобретению, перечисленного в Таблице 1 (например, мутанты ALK) с целью индукции гибели клеток опухоли, сокращения роста опухоли или снижения риска метастазирования опухоли. Полипептиды - ингибиторы ALK известны специалистам в данной области техники. Например, PF-02341066, PDD, 2-метил-11-(2-метилпропил)-4-оксо-4,5,6,11,12,13-гексагидро-2H-индазол[5,4-а]пиррол[3,4-с]карбазол-8-ил [4-(диметиламино) бензил]карбамат, (1S,2S,3R,4R)-3-({5-хлор-2-[(1-этил-2,3,4,5-тетрагидро-6-метокси-2-оксо-1Н-1-бензазепин-7-ил)амино]-4-пиримидинил}амино)бицикло[2,2,1]гепт-5-ен-2-карбоксамид и NVP-TAE684, см. например, PNAS 104:270-275, 2007; Choi, Y.L. et al. (2008) Cancer Res. 68:4971-2976; и Biochemistry 48:3600-3609, 2009, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки).

Включение посредством ссылки

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упоминаемые в настоящей заявке, включены посредством ссылки на их полную версию, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент или заявка на патент были бы специфически и индивидуально указаны и включены посредством ссылки. В случае конфликта настоящая заявка, включая все данные в ней определения, сожжет урегулировать конфликт.

Также посредством ссылок на их полную версию в настоящую заявку включены любые последовательности полинуклеотидов и полипептидов, где указывается их номер доступа, коррелирующий с входом в общедоступную базу данных, такую как база Института геномных исследований (TIGR) на международном интернет-сайте tigr.org и/или Национального центра биотехнологической информации на международном интернет-сайте ncbi.nlm.nih.gov.

ПРИМЕРЫ

Также настоящее исследование проиллюстрировано следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие. Содержание всех ссылок, фигур, перечислений последовательностей, патентов и опубликованных заявок на патенты, цитируемых в настоящей заявке, включены в нее посредством ссылки.

Пример 1 - Материалы и методы для Примеров 2-4

а. секвенирование ДНК

Олиго(dT)-примированную кДНК генерировали из образца РНК, экстрагированного с применением системы EZ1 («Qiagen», Валенсия, Калифорния) и подвергали полимеразной цепной реакции (ПНР из 30 циклов (состоящих из циклов при 98°С в течение 10 с и при 68°С в течение 1 мин) с применением полимеразы PrimeSTAR HS DNA («Takara Bio Inc.», Шига, Япония) и праймеров ALK-TK-F (5'-TACAACCCCAACTACTGCTTTGCT-3') и ALK-TK-R1 (5'-AGGCACTTTCTCTTCCTCTTCCAC-3'). Продукты ПЦР, соответствующие киназному домену ALK затем фрагментировали и секвенировали на Геномном анализаторе Illumina II (GAII) на протяжении 76 оснований с обоих концов при помощи системы секвенирования парных концов («Illumina», Сан-Диего, Калифорния). Исходные данные считывания качественно фильтровали на основании присутствия последовательностей ПЦР-праймеров и q-значения ≥20 для всех оснований. Прошедшие через фильтр показатели затем выравнивали с последовательностью кДНК ALK с применением алгоритма Bowtie (достпен на международном сайте bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml). Для капиллярного секвенирования на Генетическом анализаторе 3130×1 («Applied Biosystems», Фостер Сити, Калифорния), продукты секвенирования готовили из кДНК с применением того же набора праймеров или с применением сочетания праймеров EA-F-g-S (5'-CCACACCTGGGAAAGGACCTAAAG-3') и ALK-TK-R2 (5'-CCTCCAAATACTGACAGCCACAGG-3').

b. Мутантные EML4-ALK

кДНК, кодирующую вариант EML4-ALK, меченный эпитопом FLAG, (Soda, M. et al. (2007) Nature 448:561-566) вводили в вектор на основе ретровируса pMX-iresCDS (Yamashita Y. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39012-39020) для одновременной экспрессии EML4-ALK, меченного эпитопом FLAG, и CD8 мыши. Замены нуклеотидов, соответствующие мутациям C1156Y и L1196MB ALK, вводили в указанную плазмиду по отдельности или вместе, чтобы экспрессировать EML4-ALK(C1156Y), EML4-ALK(L1196M) или EML4-ALK(C1156Y/L1196M). Рекомбинантные вирусы на основе указанных плазмид генерировали с применением пакующей клеточной линии, BOSC23 (Pear, W.S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396), и применяли их для инфицирования линии интерлейкин-3-зависимых клеток мышей BA/F3 (Palacious, R. et al. (1985) Cell 41:727-734). Полученные в результате С08-положительные клетки очищали с применением колонки miniMACS для отделения клеток и магнитных микроносителей с антителами к CD8 (и те, и другие компании «Miltenyi Biotec», Гладбах, Германия). PF-02341066 приобретали у компании «Selleck».

Для исследования фосфорилирования тирозина EML4-ALK клетки BA/F3, экспрессирующие указанный гибридный белок, подвергали действию ингибиторов ALK в течение 15 ч, после которого EML4-ALK подвергали иммунопреципитации из лизатов клеток с применением антител к FLAG («Sigma-Aldrich», Сент-Луис, Миссури) и далее подвергали иммуноблоттингу с применением антител к Tyr¹⁶⁰⁴-фосфорилированной ALK («Cell Signaling Technology», Данверс, Массачусетс). Анализ киназной активности in vitro проводили при комнатной температуре в течение 30 мин, как было описано ранее (Donella-Deana, A. et al. (2005) Biochemistry 44:8533-8542) с применением синтетического пептида YFF («Operon Biotechnologies», Хантсвилл, Алабама).

Пример 2 - Новые мутации ALK, ассоциированные с устойчивостью с к ингибиторам тирозинкиназной активности ALK

Пациентом был мужчина в возрасте 28 лет, курильщик в анамнезе, и в апреле 2008 г. ему был поставлен диагноз аденокарцинома легких на клинической стадии T4N3M1. С учетом того, что опухоль не содержала мутаций EGFR, пациенту проводили стандартную химиотерапию, которая привела к прогрессированию заболевания с образованием метастазов в головном мозге и костях. В ноябре 2008 г. присутствие мРНК варианта 1 EML4-ALK в опухоли было подтверждено при помощи ПЦР с обратной транскрипцией в пробе мокроты, а также при помощи флуоресцентой гибридизации in situ в пробе ткани, отобранной при биопсии. Таким образом, цказанного пациента включили в исследование PF-02341066, и он испытал значительное улучшение общего состояния (снижение с 4 до 2 уровня). Хотя указанный пациент демонстрировал «частичный ответ» на лечение, плевральный выпот полностью устранить не удалось. Однако после 5 месяцев лечения опухоль снова начла быстро расти, что привело к увеличению плеврального выпота и образованию множественных раковых узелков в обоих легких. Пациент вышел из исследования в мае 2009 г., и затем плевральный выпот был отобран для молекулярного анализа.

На основании того, что опухоль возобновила рост, несмотря на непрерывное введение ингибитора ALK, было решено определить, не приобрела ли указанная опухоль вторичные генетические изменения, придающие устойчивость к данному лекарственному препарату. Кроме того, учитывая тот факт, что устойчивость к ИТК часто возникает вследствие приобретенных мутаций в целевой киназе, оценивалась возможность того, что в самой EML4-ALK. возникли аминокислотные замены.

Для молекулярного анализа опухоли пациента до и после лечения, соответственно, были доступны образцы мокроты (ID J-#1) и плеврального выпота (ID J-#13). С учетом того, что доля клеток опухоли в обоих образцах может различаться, для проведения глубокого секвенирования кДНК EML4-ALK, полученной из указанных образцов, применяли секвенатор нового поколения. Затем кДНК, соответствующая тирозинкиназному домену ALK, из обоих образцов амплифицировали (Фигура 1А), фрагментировали и подвергалинуклеотидному секвенированию при помощи системы GAII. Для сравнения аналогичный анализ проводили в линии клеток НМКРЛ, позитивной по EML4-ALK, - Н2228, и в трех других клинических образцах, также позитивных по указанному гибридному белку. В кДНК из указанных четырех образцов выявили известный однонуклеотидный полиморфизм, rs3 795850 (Фигура 1В). Кроме того, замену Т→С в положении, соответствующем нуклеотиду 4230 в кДНК ALK дикого типа человека (номер доступа в GenBank NM_004304) в кДНК J-#1 выявляли с низкой частотой (839%). Кроме того, два новых изменения - замены G→A и С→А в положениях, соответствующих нуклеотидам 4374 и 4493 в кДНК ALK дикого типа человека выявляли с частотой 41,8 и 14,0%, соответственно в кДНК J-#113. Никаких других сопутствующих изменений в киназном домене кДНК, полученном из любого из указанных образцов, не было (присутствующих ≥5% считываний).

Указанные нуклеотидные замены были впоследствии подтверждены на секвенаторе Сангера. Чтобы исключить возможность того, что указанные мутации возникли в эндогенных ALK дикого типа, а не в EML4-ALK, также провели ПЦР с прямым праймером, направленным на кДНК EML4 так, чтобы могла амплифицироваться только гибридная кДНК (Фигура 1А). Замену Т4230С не удалось определить среди сотен гибридных кДНК из образца J-#1, что указывает на то, что это был артефакт, который возник при начальной ПЦР или на этапе секвенирования GAII.

Однако замены и G4374A, и С4493А без труда были подтверждены при секвенировании по Сангеру. Из 73 клонов кДНК, секвенированных для образца J-#113, 34 клона (46,6%) были позитивны по G4374A, 11 (15,1%) были позитивны по С4493А, а остальные клоны (38,4%) были клонами дикого типа (Фигура 1C). Хотя анализ на основе ПЦР охватывал оба положения нуклеотидов в одних и тех же продуктах, ни один из продуктов не содержал двух мутаций одновременно, что указывает на то, что каждая из мутаций происходила независимо. Фрагменты генома, зключающие в себе положения G4374 или С4493,также амплифицировали посредством ПЦР и подвергали нуклеотидному секвенированию, что привело к подтверждению присутствия каждой из замен в геноме опухоли (Фигура 2).

Замены G4374 или С4493 приводят к заменам Cys→Tyr и Leu→Met в положениях, соответствующих аминокислотам 1156 и 1196, соответственно, ALK человека дикого типа.

Пример 3 - Новые мутации в ALK придают устойчивость к ингибиторам протеинкиназной активности ALK

Далее определяли, влияют ли такие замены аминокислот на чувствительность EML4-ALK к ингибиторам ALK. EML4-ALK дикого типа, одиночные мутанты EML4-ALK(C1156Y) и EML4-ALK(L1196M), и двойные мутанты EML4-ALK(C1156Y/L1196M) экспрессировали по отдельности в клетках BA/F3, и затем указанные клетки подвергали действию ингибиторов ALK. PF-02341066 ингибировал рост клеток BA/F3, экспрессирующих EML4-ALK дикого типа с зависимостью от концентрации (Фигура 4А). В отличие от этого клетки, экспрессирующие мутанты либо C1156Y, либо L1196M, проявляли значительно сниженную чувствительность к указанному препарату, и повторные эксперименты показали, что клетки BA/F3, экспрессирующие EML4-ALK(L1196M), были более устойчивы к PF-02341066, чем клетки, экспрессирующие EML4-ALK(C1156Y) (Фигура 3). Присутствие обеих мутаций не приводило к аддитивному эффекту на устойчивость клеток к PF-02341066. Указанные данные, таким образом, показали, что каждая из мутаций C1156Y и L1196M придает устойчивость к указанному препарату.

Фосфорилирование тирозина EML4-ALK оценивали способом иммуноблоттинга с применением антител, специфичных в отношении ALK, фосфорилированной по Тyr1604. Хотя воздействие на клетки BA/F3 препарата PF-02341066 приводило к выраженному ингибированию фосфорилирования тирозина в EML4-ALK дикого типа, оно не оказывало значимого действия на фосфорилирование EML4-ALK(C1156Y) или EML4-ALK(L1196M) (Фигура 4В). В согласии с указанными результатами анализ киназной активности in vitro показал, что мутанты EML4-ALK C1156Y и L1196M были менее чувствительны к ингибированию ферментативной активности препаратом PF-02341066, чем белок дикого типа (Фигура 4С). Как и в случае подавления роста клеток (Фигура 4А), мутант L1196M был более устойчивым к ингибированию киназной активности препаратом PF-02341066, чем мутант C1156Y (Фигура 4С).

Пример 4 - Структурно-функциональная взаимосвязь между новыми мутациями ALK и устойчивостью к ингибиторам тирозинкиназной активности ALK

На Фигуре 5 показаны положения Cys1156 и Leu 1196 в модели трехмерной структуры киназного домена ALK построенной на основании кристаллической структуры родственной киназы - рецептора инсулина. Первый остаток расположен вблизи N-конца предсказанной петли αС, а также близко от верхней створки АТФ-связывающего кармана. В указанном положении в других тирозинкиназах ни о каких активирующих мутациях не сообщалось. Leu 1196 в ALK соответствует Thr315 в ABL1 и Thr790 в EGFR, каждый из которых является сайтом, где наиболее часто возникают мутации, придающие устойчивость к ИТК, в данных киназах (Deininger, M. et al. (2005) Blood 105:2640-2653; Linardou, H. et al. (2009) Nat. Rev. Clin. Oncol. 6:352-366). Указанный «привратниковый» сайт расположен на нижней поверхности АТФ-связывающего кармана (Фигура 5), и известно, что присутствие аминокислоты с массивной боковой цепью в данном положении препятствует связыванию со многими ИТК (Shah, N.P. et al. (2002) Cancer Cell 2:117-125; Tsao, M.S. etal. (2005) N. Engl. J. Med. 353:133-144).

Таким образом, были идентифицированы две мутации de novo в киназном домене EML4-ALK, которые придают устойчивость ко многим ингибиторам ALK. На основании того, что ни в одной из кДНК EML4-ALK не отмечалось присутствия обеих мутаций, предполагается, что каждая мутация развивалась независимо в отдельных субклонах указанной опухоли.

Не вдаваясь в теорию, при условии, что кДНК, приготовленная из мокроты пациента до лечения, не содержала нуклеотидных замен, соответствующих мутациям C1156Y или L1196M, вероятно, что указанные субклоны опухоли приобрели указанные мутации de novo во время лечения препаратом PF-02341066. Однако поскольку плевральный выпот нельзя было исследовать до лечения, возможность того, что клетки опухоли с мутантами C1156Y или L1196M, уже были в плевральном выпоте при первом поступлении пациента, полностью исключить нельзя. Если бы это было так, указанная опухоль могла бы приобрести другие, еще неизвестные мутации за 5-месячный период лечения препаратом PF-02341066, которые бы обусловили ее дальнейший быстрый рост. Однако субклоны клеток опухоли с мутациями C1156Y или L1196M должны были обладать устойчивостью к начальному лечению и должны были увеличиться во время курса лечения. На самом деле никаких признаков разрастания опухоли у пациента по меньшей мере в течение 5 месяцев не было, что указывает на то, что мутации C1156Y и L1196M развились во время лечения PF-02341066. Данное положение также получает дополнительное подтверждение в связи с тем фактом, что мутация Т790М в EGFR придает устойчивость к гефитинибу или эрлотинибу, выявляемую у пациентов, ранее получавших ИТК, но редко обнаруживаемую у пациентов, не подвергавшихся лечению (Рао, W. et al. (2005) PLoS Med. 2:e73).

Замены аминокислот в привратниковом положении нескольких тирозинкиназ обнаруживались в опухолях, подвергавшихся лечению ИТК (Kobayashi, S. et al. (2005) N. Engl. J. Med. 352:786-792; Рао, W. et al. (2005) PLoS Med. 2:e73; Shah, N.P. et al. (2002) Cancer Cell 2:117-125; Cools, J. et al. (2003) N. Engl. J. Med. 348:1201-1214; Tamborini, E. et al. (2004) Gastroenterology 127:294-299). Хотя для EML4-ALK или ALK ни о каких мутациях в указанном сайте не сообщалось, эффекты разных искусственным замен аминокислот в привратниковом положении NPM-ALK - другой гибридной раковой киназы для ALK недавно были исследованы (Lu, L. et al. (2009) Biochemistry 48:3600-3609). В согласии с данными настоящего анализа клеток опухоли in vivo, было показано, что введение Met в данное положение делает NPM-ALK более устойчивой к многим ингибиторам ALK.

В отличие от замен в привратниковом положении, никаких сообщений для тирозинкиназ об активирующих мутациях в положении, расположенные непосредственно от N-конца до αС-спирали(Сys1156 в ALK), не было. Хотя замена Thr→Ile в соответствующем положении EGFR была описано в одном случае НМКРЛ, ее значимость для чувствительности к препаратам не исследовалась (Tsao, M.S. et al. (2005) N. Engl. J. Med. 353:133-144). Значимость спирали аС для аллостерической регуляции ферментативной активности была продемонстрирована для серин-треониновых киназ (Hindie, V. et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5:758-764). Замена в положении Cysll56 в ALK, следовательно, может аллостерически интерферировать со связыванием ИТК, или Cys1156 может непосредственно участвовать в физическом взаимодействии между киназным доменом и ИТК.

Эквиваленты

Специалисты в данной области техники должны знать, или могут установить с применением не более чем стандартных экспериментов, множество эквивалентов вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящей заявке. Предполагается, что такие эквиваленты включены в следующую формулу изобретения.

Группа изобретений относится к способам для определения того, будет ли субъект, страдающий раковым заболеванием, положительный по мутациям ALK, отвечать на лечение ингибитором ALK, и/или вероятно ли, что у пациента, страдающего таким раковым заболеванием, заболевание будет прогрессировать медленнее, а также к набору. Группа изобретений позволяет оценить эффективность лечения ракового заболевания на основе идентификации новых мутаций в киназе анапластической лимфомы. 3 н. и 27 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ идентификации субъекта, страдающего раковым заболеванием или имеющего риск развития ракового заболевания, как имеющего повышенный риск нечувствительности к лечению ингибитором ALK, включающий:
анализ пробы, взятой у субъекта, на присутствие одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK, кодирующих полипептид мутантной ALK, содержащий мутацию C1156Y и/или L1196M, или одного или более полипептидов мутантных ALK, содержащих мутацию C1156Y и/или L1196M, или обоих типов молекул,
причем присутствие одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK или одного или более полипептидов мутантных ALK или обоих типов молекул указывает на то, что указанный субъект имеет повышенный риск нечувствительности к лечению ингибитором ALK.

2. Способ по п. 1, в котором указанный субъект ранее не подвергался лечению ингибитором ALK, или ранее подвергался лечению ингибитором ALK, и у него развилась по меньшей мере частичная устойчивость к ингибитору ALK.

3. Способ по п. 1, в котором указанное раковое заболевание выбирают из группы, состоящей из анапластической крупноклеточной лимфомы, нейробластомы, рака молочной железы, рака прямой и ободочной кишки, воспалительных миофибробластных опухолей и немелкоклеточного рака легких.

4. Способ по п. 1 или 2, в котором указанный ингибитор ALK выбирают из группы, состоящей из PF-02341066, PDD, 2-метил-11-(2-метилпропил)-4-оксо-4,5,6,11,12,13-гексагидро-2H-индазол[5,4-a]пиррол[3,4-c]карбазол-8-ил [4-(диметиламино)бензил]карбамата, (1S,2S,3R,4R)-3-({5-хлор-2-[(1-этил-2,3,4,5-тетрагидро-6-метокси-2-оксо-1Н-1-бензазепин-7-ил)амино]-4-пиримидинил}амино)бицикло[2,2,1]гепт-5-ен-2-карбоксамида и NVP-TAE684.

5. Способ по п. 1, в котором указанную пробу выбирают из группы, состоящей из мокроты, бронхоальвеолярного смыва, плеврального выпота, ткани, цельной крови, сыворотки, плазмы, соскоба слизистой щеки, слюны, спинномозговой жидкости, мочи, кала, циркулирующих клеток опухоли, циркулирующих нуклеиновых кислот и костного мозга.

6. Способ по п. 5, в котором указанная проба представляет собой ткань; причем указанная ткань представляет собой ткань опухоли или раковую ткань.

7. Способ по п. 1, в котором указанная проба содержит клетки.

8. Способ по п. 1, в котором одну или более мутаций в ALK оценивают в тесте с гибридизацией нуклеиновых кислот.

9. Способ по п. 1, в котором одну или более мутаций в ALK оценивают путем полимеразной цепной реакции.

10. Способ по п. 1, в котором уровень экспрессии одного или более полипептидов ALK определяют с использованием реагента, который специфически связывается с одним или более полипептидами ALK.

11. Способ по п. 1, в котором указанный реагент выбирают из группы, состоящей из антитела, производного антитела и фрагмента антитела.

12. Способ по п. 1, в котором количество одного или более полипептидов мутантной ALK сравнивают с контрольной пробой.

13. Способ по п. 1, в котором одну или более мутаций в ALK оценивают в первый момент времени и по меньшей мере в один последующий момент времени.

14. Способ по п. 1, в котором указанная проба содержит эмбриональную или соматическую геномную ДНК.

15. Набор для определения химиочувствительности субъекта, страдающего раковым заболеванием, к лечению ингибитором ALK, включающий: реагент, который специфически связывается с одной или более молекулами полинуклеотидов мутантной ALK, кодирующих полипептид мутантной ALK, содержащий мутацию C1156Y и/или L1196M, или полипептидов мутантных ALK, содержащих мутацию C1156Y и/или L1196M; и инструкцию по применению, причем указанные реагенты включают:
(а) один или более полинуклеотидных зондов, каждый из которых содержит полинуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности нуклеотидов, кодирующей полипептид мутантной ALK, содержащий мутацию в C1156Y и/или L1196M, или
(б) антитело, производное антитела или фрагмент антитела к полипептиду, содержащему мутацию C1156Y и/или L1196M.

16. Набор по п. 15, дополнительно включающий ингибитор ALK.

17. Набор по п. 15, причем указанный реагент содержит один или более полинуклеотидных зондов, каждый из которых содержит полинуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности нуклеотидов, кодирующей полипептид мутантной ALK, содержащий мутацию C1156Y и/или L1196M.

18. Набор по п. 17, в котором указанные зонды содержат полинуклеотиды длиной от приблизительно 50 до 10⁷ нуклеотидов.

19. Набор по п. 17, в котором указанные зонды выбраны из группы, состоящей из олигонуклеотидов, молекул кДНК, молекул РНК и синтетических генных зондов, содержащих нуклеотидные основания.

20. Набор по п. 17, в котором указанный реагент содержит антитело, производное антитела или фрагмент антитела к полипептиду, содержащему мутацию C1156Y и/или L1196M.

21. Способ определения, изменяет ли тестируемое соединение активность одного или более полипептидов мутантных ALK, включающий:
(a) осуществление контакта клеток млекопитающих, трансфецированных конструкцией, кодирующей один или более полипептидов мутантных ALK, содержащих мутацию в C1156Y и/или L1196M, с тестируемым соединением; и
(b) оценку активности одного или более полипептидов мутантных ALK в указанных клетках млекопитающих, причем изменение активности одного или более полипептидов мутантных ALK в присутствии тестируемого соединения по сравнению с контрольным экспериментом указывает на то, что тестируемое соединение является модулятором одного или более полипептидов мутантных ALK.

22. Способ по п. 21, в котором указанный контроль включает клетки млекопитающего, экспрессирующие полипептид ALK дикого типа.

23. Способ по п. 22, в котором активность одного или более полипептидов мутантных ALK выбирают из группы, состоящей из: связывания АТФ, тирозинкиназной активности, пролиферации раковых клеток, роста опухоли, количества опухолей, апоптоза и метастазирования опухоли.

24. Способ по п. 21, в котором указанный контрольный эксперимент включает клетки млекопитающего, экспрессирующие один или более полипептидов мутантных ALK в отсутствие тестируемого соединения.

25. Способ по п. 23, в котором активность одного или более полипептидов мутантных ALK выбирают из группы, состоящей из: связывания АТФ, тирозинкиназной активности, пролиферации раковых клеток, роста опухоли, количества опухолей, апоптоза и метастазирования опухоли.

26. Способ по п. 1, в котором определяют присутствие одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK, и одна или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK выбраны из группы, состоящей из:
a. кДНК мутантной ALK, содержащей мутацию G4374A; и
b. кДНК мутантной ALK, содержащей мутацию С4493А.

27. Способ по п. 1, в котором определяют присутствие одного или более мутантных полипептидов, и одна или более молекул полипептидов мутантных ALK выбраны из группы, состоящей из:
a. мутантного белка ALK, содержащего мутацию C1156T; и
b. мутантного белка ALK, содержащего мутацию L1196M.

28. Способ по п. 5, в котором ингибитор ALK представляет собой PF-02341066.

29. Набор по п. 17, в котором одна или более молекул полипептидов или полинуклеотидов мутантной ALK выбраны из группы, состоящей из:
a. кДНК мутантной ALK, содержащей мутацию G4374A; и
b. кДНК мутантной ALK, содержащей мутацию С4493А.

30. Набор по п. 18, в котором ингибитор ALK представляет собой PF-02341066.