Способ изготовления микросфер, содержащих лекарственные вещества в качестве биологически активного действующего вещества, заключенные в матрицу полимера, с использованием получения микросфер методом двойной эмульсии Российский патент 2017 года по МПК A61K9/64 A61K9/113 A61K47/34 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения микрокапсулированных лекарственных форм, используемых для получения лекарственных препаратов. Конкретно изобретение относится к способу получения микросфер в виде частиц из биоразлагающегося сополимера молочной и гликолевой кислоты с инкапсулированным в микросферы биологически активным веществом.

Лечение и профилактика ряда заболеваний, например, эндокринных, онкологических, иммунных, инфекционных, наследственных и других зачастую требуют длительного поддержания необходимой концентрации соответствующих лекарственных веществ в организме пациента, что обуславливает необходимость разработки лекарственных форм, обеспечивающих пролонгированное действие действующего начала препарата.

После перорального введения большинство белковых и пептидных лекарственных средств теряют их активные структуры в кислом окружении желудка или подвергаются ферментативному разложению. Также они всасываются через слизистую оболочку желудка или кишечника на очень низких уровнях. По этим причинам белковые или пептидные лекарственные средства, как правило, вводят не перорально, то есть их, как правило, вводят посредством инъекции. Непероральное (парентеральное) введение белковых или пептидных лекарственных средств должно быть повторяющимся, поскольку большинство неперорально (парентерально) вводимых белковых или пептидных лекарственных средств демонстрирует короткое время полужизни и низкую биодоступность в организме. Кроме того, во многих случаях их введение может продолжаться в течение длительного периода времени, например, месяцев. Для избежания этих проблем проведено активное исследование составов для дозировок с замедленным высвобождением, что привело к применению биоразлагающихся полимерных носителей с инкапсулированными в них белковыми или пептидными лекарственными средствами, которые могут высвобождать из них белковые или пептидные лекарственные средства по мере биоразложения полимерных носителей [Heller, J. et al., Controlled release of water-soluble macromolecules from bioerodible hydrogels, Biomaterials, 4, 262-266, 1983; Langer R., New methods of drug delivery, Science, 249, 1527-1533, 1990; Langer R., Chem. Eng. Commun., 6, 1-48, 1980; Langer R.S. and Peppas N.A., Biomaterials, 2, 201-214, 1981; Heller, J., CRC Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst, 1 (1), 39-90, 1984; Holland S.J. Tighe B.J. and Gould P.L, J. Controlled Release, 155-180, 1986]. Алифатические полиэфиры, в настоящее время используемые в качестве полимерных носителей, в частности, для белковых или пептидных лекарственных средств, получили одобрение FDA для их применения, поскольку была установлена их биологическая совместимость. Их широко используют в качестве носителей для доставки лекарственных веществ или нитей для наложения швов при операциях.

Преимуществами депонированных лекарственных форм над недепонированными являются непрерывность терапевтического или профилактического воздействия, стабильная предсказуемая концентрация лекарственных веществ в плазме крови, возможность применения более низких терапевтических доз, снижение риска побочных эффектов, отсутствие необходимости многократного введения. В составе многих разрабатываемых депо-препаратов действующее вещество находится в растворяющихся полимерных микрокапсулах. Продолжительность действия таких препаратов зависит в том числе от размера и материала использованных микрокапсул.

Однако дозированные формы, содержащие полиэфирные микросферы с инкапсулированными в них белковыми лекарственными средствами, имеют недостатки, состоящие в том, что они демонстрируют исходный эффект всплеска, неконтролируемую скорость высвобождения в течение некоторого периода времени вследствие различных факторов или неполное высвобождение инкапсулированного лекарственного вещества. Например, модельные белковые лекарственные вещества, такие как бычий сывороточный альбумин, лизоцим и т.д., высвобождаются в больших количествах на начальной стадии, однако демонстрируют конечное высвобождение приблизительно 50% [Crotts G. and Park Т.G., J. Control. Release, 44, 123-134, 1997; Leonard N.В., Michael L.H., Lee M.M.J. Pharm. Sci., 84, 707-712]. Что касается микросфер с использованием алифатических полиэфирных носителей с инкапсулированным в них рекомбинантным гормоном роста человека, они исходно высвобождают лекарственное вещество в количестве 30-50%, однако 40~60% лекарственного вещества остается в микросферах [Van С, et al., J. Control. Release, 32, 231-241, 1994; Kim Н.K. and Park Т.G., Biotechnol. Bioeng., 65, 659-667, 1999].

Исходный всплеск высвобождения лекарственного вещества объясняется тем фактом, что белковые лекарственные вещества, агрегированные или адсорбированные на поверхностях или в пустотах микросфер, высвобождаются посредством быстрой диффузии на начальной стадии. В процессе изготовления микросфер белковые лекарственные вещества могут денатурировать на границе контакта между водой и органическим растворителем, и таким образом они могут образовывать необратимые агрегаты, которые приводят к нестабильному высвобождению. Для предотвращения индуцируемой границей контакта денатурации белковых лекарственных средств описано применение при получении микросфер поверхностно-активных веществ (например, поверхностно-активного вещества неионного типа Tween, Pluronic F68, Brij 35 и т.д.) и стабилизаторов (например, маннита, желатина, трегалозы, карбоксиметилцеллюлозы и т.д.) или органического растворителя, не содержащего воды [Gombotz W.R., Healy М., Brown L, патент США №5019400].

Одним из примеров успешного применения депонированных лекарственных форм является использование препаратов, инкапсулированных в микросферы из сополимера полилактид-полигликолид (ПЛ-ПГ) (Штильман М И. Полимеры в биологически активных системах // Соросовский Образовательн. Журн. - 1998. - №5. - С. 48-53). ПЛ-ПГ - полиэфир полимолочной и полигликолевой кислот. Он разрушается в организме до естественных метаболитов - молочной и гликолевой кислот, нетоксичен, не вызывает воспалительных реакций в месте введения, стабилен при хранении, технологичен в изготовлении, характеризуется хорошей воспроизводимостью качества конечного продукта. Соотношение ПЛ и ПГ в составе сополимера определяет скорость его биодеструкции in vivo. Рассасывающиеся костные имплантаты и хирургические нити, сделанные из этого материала, имеют длительную историю безопасного использования в медицине (В.В. Михайлов, Р.А. Хамитов, Б.В. Кравцов. Иммобилизованные препараты в вирусологии и вакцинологии //Журн. Вопр. Вирусологии. - 1995. - №5. - С. 194-197).

Конкретные примеры алифатических полиэфиров включают поли-L-молочную кислоту, полигликолевую кислоту, сополимер D-молочной кислоты и гликолевой кислоты, сополимер L-молочной кислоты и гликолевой кислоты, сополимер D,L-молочной кислоты и гликолевой кислоты (в дальнейшем в настоящем документе обозначаемый как "PLGA"), поликапролактон, поливалеролактон, полигидроксибутират и полигидроксивалерат [Peppas, L.В., Int. J. Pharm., 116, 1-9, 1995]. С развитием в последние годы высокомолекулярных пептидов или белков в качестве новых лекарственных средств были предприняты различные попытки для высвобождения их из полимерных носителей контролируемым образом.

Существуют различные способы микроинкапсулирования действующего вещества с использованием ПЛ-ПГ, однако одним из наиболее распространенных из них является метод выпаривания растворителя.

Известен метод изготовления микросфер выпариванием растворителя из простой (двухфазной) эмульсии, который является частным случаем метода обращения фаз (Beck L.R., Pope V.Z., Flowers С.Е. et al. Poly (DL-lactide-co-glycolide) / Norethisterone Microcapsules: An injectable Biodegradable Contraceptive // Biology of reproduction. - 1983. - №28. - P. 186-195). В основе этого метода лежит использование двух фаз: гидрофобной органической фазы, состоящей из органического растворителя, растворенных в нем полимера и действующего вещества, и гидрофильной дисперсионной среды, состоящей из воды и стабилизатора эмульсии (сурфактанта), в качестве которого используется, как правило, поливиниловый спирт (ПВС). Органическая фаза добавляется к дисперсионной среде и подвергается эмульгированию, после чего органический растворитель выпаривается из полученной эмульсии при непрерывном ее перемешивании. В процессе испарения растворителя капли органической фазы затвердевают, эмульсия превращается в суспензию. Полученная взвесь микросфер осаждается центрифугированием. Для того чтобы отмыть полученные микросферы от сурфактанта, операция центрифугирования с последующим ресуспендированием в дистиллированной воде повторяется трижды. После отмывки препарат микросфер подвергается лиофильному высушиванию. Полученные таким образом микросферы характеризуются сферической формой, относительной гомогенностью и мелкими размерами (около 10 мкм). Недостатком вышеописанного метода является то, что для его использования необходимо, чтобы инкапсулируемый препарат был, хотя бы частично, растворим в органическом растворителе. Это является главным ограничением применения указанного метода для инкапсулирования гидрофильных соединений, таких как пептиды, белки или нуклеиновые кислоты.

Для увеличения степени инкапсулирования гидрофильных молекул (активно действующего вещества) были разработаны альтернативные методы, наиболее распространенным из которых является способ приготовления микросфер выпариванием органического растворителя из двойной (трехфазной) эмульсии (X.M. Deng, X.H. Li, M.L. Yuan, C.D. Xiong et al. Optimization of preparative conditiones for poly-DL-lactide-polyethylene glycol microspheres with entrapped Vibrio cholera anti-genes // Jomal of Controlled Release. - 1999. - N58. - P. 123-131). В этом случае водный раствор гидрофильного соединения первично эмульгируется в органическом растворе полимера. Затем первичную эмульсию вливают в большой объем воды, содержащей сурфактант. Из образовавшейся трехфазной эмульсии при непрерывном перемешивании выпаривается органический растворитель. Полученные таким образом микросферы отмывают от сурфактанта и лиофильно высушивают. При использовании техники двойной эмульсии, как правило, достигается хорошая эффективность инкапсулирования гидрофильных соединений, однако размер частиц обычно больше, чем при использовании метода на основе простой эмульсии.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата, относится то, что при использовании способа приготовления микросфер выпариванием органического растворителя из двойной (трехфазной) эмульсии, принятого за прототип, происходит неполная загрузка действующего вещества в микросферы в результате частичного его перехода в дисперсионную среду в процессе затвердевания микросфер. Потеря может достигать 80% и более использованного для загрузки действующего вещества. Кроме того, при использовании данного способа сохраняется необходимость отмывать готовые микросферы от дисперсионной среды, что делает технологию приготовления микросфер сложной, громоздкой и дорогой.

В частности, из патента RU 2326655, С1, 20.06.2008, известен способ инкапсулирования белоксодержащих веществ в микросферы из сополимера полилактид-полигликолид методом выпаривания растворителя, включающий приготовление первичной эмульсии путем эмульгирования водного раствора действующего вещества в органической фазе, получение вторичной эмульсии посредством соединения первичной эмульсии и гидрофильной фазы, состоящей из стабилизатора эмульсии и воды, испарение растворителя, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора вторичной эмульсии используется полиглюкин. Известный способ содержит следующую последовательность операций:

(1) приготовление первичной (двухфазной) эмульсии: водный раствор белоксодержащего вещества (бычий сывороточный альбумин) (далее - БСА) эмульгируют в органической фазе, состоящей из органического растворителя и растворенного в нем полимера;

(2) приготовление вторичной (трехфазной) эмульсии: первичную эмульсию эмульгируют в гидрофильной фазе, состоящей из воды и растворенного в ней полиглюкина;

(3) выпаривание органического растворителя из органической фазы, в результате чего эмульсия превращается в суспензию;

(4) лиофильное высушивание готового препарата.

Известный способ предназначен в основном для инкапсулирования такого белоксодержащего вещества как альбумин. Оптимальная концентрация полиглюкина в дисперсионной среде, при которой обеспечивается получение микросфер удовлетворительных характеристик, и, в тоже время, после лиофильного высушивания удается получить хорошо ресуспендируемый препарат с низкой агрегацией микросфер, составляет только 40%. При этом при другом количестве полиглюкина в дисперсионной среде получают микросферы с широким разбросом получаемых диаметров микросфер от 12,1 мкм до 327,4 мкм и являющимся токсичным препаратом (смотри таблицу 1 в патенте RU №2326655), а также увеличивается наличие агрегатов в суспензии.

Технической задачей заявленного способа получения микросфер в целом является:

- разработка доступного и простого для промышленного внедрения усовершенствованного способа получения микрокапсулированных микросфер для использования их при получении различных фармацевтических средств, используемых для получения различных лекарственных средств, обеспечивающего более полное высвобождение инкапсулированного биологически активного действующего вещества (фармацевтического вещества, лекарственного средства) с целью увеличения их арсенала средств;

- уменьшение агрегативности частиц,

- обеспечение высокой стабильности инкапсулированного средства, - снижение токсичности инкапсулированного биологически активного вещества за счет использования биоразлагаемого сополимера, разлагающегося с образованием нетоксичных веществ.

Поставленная техническая задача и технический результат достигаются способом изготовления микросфер, содержащих лекарственные вещества в качестве биологически активного действующего вещества, заключенные в матрицу полимера, с использованием получения микросфер методом двойной эмульсии, и включающих при этом в качестве активного действующего вещества пептид, заключенный в полимерную матрицу, представляющую собой сополимер молочной и гликолевой кислот с вязкостью 0,2-0,8 дл/г и с соотношением указанных сомономеров, соответственно, от 47,0:53,0 до 85,0:15,0, сформированных из двойной эмульсии типа вода/масло/вода,

при этом способ включает следующие стадии:

а) сначала получают первую простую эмульсию типа вода/масло в первом реакторе путем смешения, гомогенизации и эмульгирования в присутствии эмульгатора стабилизатора эмульсии раствора сополимера молочной и гликолевой кислот в хлористом метилене при соотношении их от 1,0:2,5 до 1,0:5,0 с раствором пептида в качестве биологически активного вещества в воде для инъекций или в водном растворе уксусной кислоты при соотношении их от 1,0:2,0 до 1,0:8,0,

б) затем получают двойную эмульсию во втором реакторе путем смешения первой эмульсии со смесью, содержащей воду для инъекций, эмульгатор - стабилизатор эмульсии натрий карбоксиметилцеллюлозу, маннитол, осуществляемое в режиме проточной циркуляции, с поддержанием температуры от -10°С до +10°С и

в) далее получаемый продукт в виде двойной эмульсии типа вода/масло/вода загружают в третий реактор, содержащий воду для инъекций, и эмульгатор, как стабилизатор эмульсии, поверхностно-активное вещество;

г) осуществляют формирование микросфер с размером частиц от 10 нм до 150 мкм, удаляя пары растворителя хлористого метилена в течение времени в диапазоне от 1 часа до 24 часов при постепенном повышении температуры до 25-45°С и постоянном перемешивании с получением суспензии отвержденных микросфер в виде частиц;

д) из суспензии последующим разделением микросфер на фракции удаляют сепарацией, фильтрацией крупную фракцию с размером частиц более 150 мкм и мелкую фракцию с размером частиц менее

10 нм и получают целевой продукт с размером частиц от 10 нм до 150 мкм.

В заявленном способе изготовления микросфер могут использовать сополимер молочной и гликолевой кислот, в частности, с вязкостью 0,3-0,5 дг/л и с соотношением сомономеров, соответственно, от 47,0:53,0 до 53,0:47,0.

В заявленном в качестве изобретения способе целесообразно изготовление микросфер (микрочастиц), в частности, с размером частиц 5-90 мкм, удаляя сепарацией крупную фракцию с размером частиц более 90 мкм и мелкую фракцию с размером частиц менее 5 мкм.

Согласно заявленному способу на стадии (б) стадию получения двойной эмульсии желательно осуществлять, в частности, в режиме проточной циркуляции с поддержанием температуры около 0°.

Ниже представлено общее описание процесса, в качестве примера, иллюстрирующего способ, но не ограничивающее его. В первую емкость загружают 1,5 л раствора сополимера молочной и гликолевой кислот в дихлорметане (метиленхлорид, хлористый метилен, CH₂Cl₂) (далее - ДХМ) в соотношении от 1,0:2,5 до 1,0:5,0

Во вторую емкость загружают 0,1 л раствора пептида, в частности, октреотида, в качестве биологически действующего активного вещества в воде или в водном растворе уксусной кислоты (соотношение от 1:2 до 1:8).

Растворы из первой и второй емкостей подают через стерилизующие фильтры в первый реактор (Реактор №1). Общий объем раствора 1,6 л. Первый реактор (реактор №1) снабжен мешалкой, рубашкой с использованием возможностей охлаждения/нагрева от минус 10°С до 150°С, с возможностью подключения SIP, CIP, дыхательного фильтра с размером ячеек не более 0,22 мкм, подключения азота, и снабженного термодатчиком.

После загрузки первого реактора перекрывают линии подачи раствора и начинают перемешивание не более 5 минут, затем включают гомогенизатор первый проточный и начинают смешение раствора в режиме циркуляции в присутствии эмульгатора - стабилизатора эмульсии. Полученный продукт представляет собой эмульсию типа В/М (типа вода/масло) (первичная эмульсия).

Далее во второй реактор (реактор №2) загружают воду для инъекции (далее - ВДИ) в количестве около 30 л ВДИ, добавляют около 430 г эмульгатора - стабилизатора эмульсии, например, натрия карбоксиметилцеллюлозы, около 920 г маннитола. Перемешивают около 60 минут, после перемешивания проводят нагрев полученного раствора до температуры не менее 121°С и выдерживают по достижению стерилизации продукта в режиме проточной циркуляции с поддержанием температуры от -10°С до +10°С, в частности, около 0°С.

Второй реактор (реактор №2) снабжен мешалкой, рубашкой с использованием возможностей охлаждения/нагрева от 0°С до 150°С, с возможностью подключения SIP, CIP, дыхательного фильтра с размером ячеек не более 0,22 мкм, подключения азота, и снабженного термодатчиком.

К полученному раствору во втором реакторе (Реактор №2) добавляют первичную эмульсию из первого реактора (Реактор №1), проводят смешивание их и передают на гомогенизацию через второй гомогенизатор проточный в режиме циркуляции с поддержанием температуры продукта от -10°С до +10°С. Полученный продукт представляет собой двойную эмульсию типа вода/масло/вода (двойная эмульсия).

В третий реактор (Реактор №3) загружают около 200 л ВДИ, добавляют эмульгатор-стабилизатор эмульсии, например, поверхностно-активное вещество (далее - ПАВ), например, полисорбат 80 около 1% и возможно использование натрия хлорида с приблизительной концентрацией около 1,5%. Раствор охлаждают приблизительно до 0°.

Третий реактор (Реактор №3) снабжен мешалкой, рубашкой, обеспечивающей возможность охлаждения/нагрева от 0°С до 150°С, с возможностью подключения SIP, CIP, дыхательного фильтра с размером ячеек не более 0,22 мкм, подключения азота, снабженного термодатчиком.

К полученному раствору в третьем реакторе (Реактор №3) добавляют двойную эмульсию из второго реактора при постоянном перемешивании. Далее проводят процесс формирования микросфер, в течение около 24 часов с постепенным повышением температуры до 24-25°С и постоянным перемешиванием. В процессе формирования частиц (микросфер) предпочтительно проводить подачу и вытяжку стерильного воздуха или инертного газа для более интенсивного удаления паров ДХМ. При удалении ДХМ из дисперсной фазы продукта частицы (микросферы) постепенно отвердевают. Готовый продукт представляет собой суспензию, в которой дисперсной фазой являются частицы (микросферы) целевого продукта с размером частиц от 10 нм до 150 мкм.

В связи с тем, что полученные микросферы (микрочастицы) могут иметь достаточно широкий разброс по размерам, проводят процесс выделения микросфер с требуемыми (необходимыми) размерами. При этом, в зависимости от задачи, первым этапом может стать удаление крупной фракции, например, микросфер с диаметром более 150 мкм, например, более 90 мкм, с помощью процесса фильтрации, или удаление мелкой фракции, например, микросфер с диаметром менее 10 нм, в частности, менее 5 мкм с помощью процесса фильтрации и/или тангенциальной фильтрации, или оба этих процесса в любой последовательности. Возможно проведение промывки и/или концентрирования полученного продукта с помощью фильтрации и/или тангенциальной фильтрации.

Полученную суспензию (в качестве дисперсной фазы целевой продукт - микросферы с размером частиц менее 150 мкм, в частности, 90 мкм, и более 10 нм, в частности, более 5 мкм, направляют на друк-фильтр №1. Характеристики друк-фильтра №1: снабжен мешалкой, оснащен рубашкой, обеспечивающей возможность охлаждения/нагрева от 0°С до 150°С, обладает возможностью подключения SIP, CIP, дыхательного фильтра с размером ячеек не более 0,22 мкм, подключения азота, снабженного термодатчиком, обеспечивает асептическую выгрузку продукта, имеет размер ячеек сетки не более 5 мкм, обладает возможностью осуществлять вакуумную сушку, фильтрацию давлением, возможность проведения очищающей и суспензионной промывки.

Ниже представлена расшифровка некоторых используемых аббревиатур и пояснения:

Аббревиатура SIP - «sterilization in place», стерилизация объекта и/или оборудования на месте. Стерилизация осуществляется через подключение к объекту стерилизующего агента. Стерилизация может быть проведена любым известным и разрешенным способом (газовая стерилизация, стерилизация парами перекиси водорода, температурная обработка). В нашем случае предпочтительно использовать «чистый» пар.

Аббревиатура CIP - «clean in place», очистка объекта и/или оборудования на месте. Очистка может осуществляться через подключение или подачу к объекту очищающего агента. Это могут быть:

вода разной степени чистоты (вода очищенная, вода для инъекций, вода умягченная);

вода, содержащая различные моющие средства (например, поверхностно-активные вещества (далее - ПАВ);

моющие средства, растворы кислот или солей.

В качестве вспомогательных веществ изготовления микросфер заявленным способом с использованием метода двойной эмульсии используют различные стабилизаторы эмульсий - эмульгаторы. В качестве эмульгирующих агентов, способствующих образованию стабильной эмульсии, используют, например, анионные поверхностно-активные вещества (ПАВ) (олеат натрия, стеарат натрия, натрий лаурил сульфат (лаурилсульфат натрия), и т.п.); неионные поверхностно-активные вещества (ПАВ) (полиоксиэтилен сорбентный эфир жирной кислоты (полисорбат 80, Twen 80, Tween 80), поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза, лецитин, желатин. Такие эмульгаторы можно использовать как по отдельности, так и в комбинации; а также можно использовать эмульгаторы с диспергирующим эффектом; загустители (повышают вязкость и контролируют высвобождение биологически активного вещества).

В качестве эмульгаторов, как стабилизаторов эмульсий, используют также другие производные целлюлозы (оксипропилцеллюлоза, оксипропилметилцеллюлоза, соли карбоксиметилцеллюлозы), различные полиэтиленгликоли (ПЭГ), например, ПЭГ 200, ПЭГ 500, ПЭГ 1000, ПЭГ 6000 и др., буферные агенты, изотонирующие агенты (хлорид натрия, маннит, сорбит, глюкоза). Все эти эмульгаторы обеспечивают устойчивость эмульсий (стабильность ее) и в свою очередь позволяют контролировать поверхностную структуру микрокапсул, что является решающим фактором в скорости высвобождения биологически активного действующего вещества (из матрицы).

В качестве биологически активного действующего вещества при осуществлении заявленного способа используют такие пептиды как, например, бусерелин ацетат, октреотид, лейпрорелин, гозерелин, трипторелин.

В данном случае был использован биоразлагаемый полимер молочной и гликолевой кислот, содержащий D,L-лактид и гликолид, в частности, в соотношении их 50:50. Используют сополимер с соотношением сомономеров в общем случае от 47:53 до 85:15 D,L-лактида и гликолида, соответственно. Вязкость полимера от 0,2 до 0,8 дл/г, в частности, предпочтительно от 0,3 до 0,5 дл/г.

Проведенные экспериментальные данные с применением целевого продукта свидетельствуют:

а) о замедленном (пролонгированном) выделении в организме активно действующих веществ (в данном случае различных пептидов, например, октреотида, лейпрорелина, гозерелина, трипторелина, бусерелина ацетата и других;

б) об уменьшении их деградации на пути следования к биомишени и достаточно высоком быстродействии в отношении различных микроорганизмов, инфекций, заболеваний разных типов.

Полученные заявленным способом микросферы из биоразлагающегося сополимера молочной и гликолевой кислот с инкапсулированным в микросферы биологически активным действующим веществом (фармацевтическим веществом, лекарственным веществом) обеспечивают пролонгированное высвобождение этих веществ. Получаемые микросферы (в виде наночастиц) обладают стабильностью основных показателей качества средств при хранении, препараты, содержащие их (как и они сами) практически нетоксичны, обладают противомикробной активностью, расширяют ассортимент различных фармацевтических и лекарственных средств, обеспечивающие контролируемое высвобождение инкапсулированных биологически активных веществ.

Пример 1

Иммунохимические свойства заявленного микроинкапсулированного препарата

Лабораторные животные (морские свинки) иммунизировались препаратами, полученными заявленным способом, приготовленными с использованием различных адъювантов. Препарат №1 представлял собой пептид (октреотид), инкапсулированный в микросферы из ПЛ-ПГ в соотношении 50:50 (где ПЛ-ПГ означает сополимер полилактид-полигликалид) методом выпаривания растворителя из двойной эмульсии при использовании водного раствора маннита в качестве сурфактанта. Препараты сравнения (№№2, 3) содержали идентичные количества пептида в комплексе с соответственно масляным (полный адъювант Фрейнда, ПАФ) и минеральным (гель гидроокиси алюминия, ГГА) адъювантами.

Иммунизация морских свинок (по 20 животных в группе) проводилась подкожно во внутреннюю поверхность бедра в объеме 0,2 мл в дозе 20 мкг октреотида (пептида).

Через три месяца после иммунизации в сыворотке крови животных оценивался титр антител к октреотиду (пептиду) в РИГА с эритроцитарным антигенным диагностикумом лабораторного приготовления.

В таблице 1 представлены результаты определения иммунохимических свойств сравниваемых препаратов.

Данные таблицы 1 показывают, что через 3 месяца после иммунизации животных наибольший титр антител к указанному пептиду выявлялся в сыворотке крови животных, иммунизированных препаратом октреотид, микроинкапсулированного в ПЛ-ПГ, либо эмульгированного в ПАФ.

Среднегеометрический титр антител к октриду у животных, иммунизированных октреотидом, сорбированным на ГГА, был приблизительно в 4 раза ниже (различие достоверно для р=0,95)

Пример 2

Оценка токсичности новых препаратов

Оценка токсичности полученных препаратов (микросфер), указанных в изобретении (пример 1), осуществлялась согласно принятых в РФ правил и методик проведения экспериментов на лабораторных животных.

Острую токсичность определяли на мышах линии Balb-C и крысах Wistar обоего пола. Исследование токсического действия каждой дозы проводили на 10 животных (5 самцов и 5 самок). Для изучения острой токсичности препараты вводили внутримышечно с помощью шприца, а перорально - через атравматический металлический зонд, постепенно погружая его до желудка. Большие дозы достигались путем многократной аппликации препаратов с интервалом 30-60 минут в течение 3-4 часов. Оценивалось действие доз эквивалентных эффективным разовым терапевтическим дозам известных лекарственных субстанций (рифабутин, изониазид, пиразинамид, D-циклосерин, D-маннит), а также в 5 и 10 раз их превосходящих.

Установлено, что для полученных препаратов (пример 1) с октреотидом для мышей и крыс при внутримышечном введении составляет 2-3 г/кг, а при пероральной аппликации - более 12-15 г/кг. Иннами словами, новые препараты практически нетоксичны. При вскрытии подопытных и контрольных животных патологических изменений органов и тканей зафиксировано не было.

Пример 3

Оценка противомикробной активности новых препаратов.

Оценку чувствительности грамположительных, грамотрицательных и атипичных бактерий в отношении новых препаратов (пример 1) проводили в соответствии с рекомендациями Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS) и действующих в РФ методических указаний.

Минимальные подавляющие концентрации препаратов в отношении тест-культур определяли методом серийных микроразведений в жидкой среде согласно рекомендаций NCCLS. Кроме того, скорость роста микроорганизмов в присутствии суб- и суперингибирующих концентраций исследуемых препаратов оценивали по динамике оптической плотности бактериальных суспензий. Динамическое измерение оптической плотности проводили с помощью многоканального спектрофотометра Bioscren (Labsystems) при длине волны 610 нм с интервалом 20 мин. Планшеты с бактериальными суспензиями инкубировали при 37°С в термостатируемом модуле прибора. Исходная концентрация микроорганизмов составляла 5×10⁴ КОЕ/мл. Установлено, что для полученных препаратов (пример 1) с октреотидом зафиксирована высокая противомикробная активность.

В связи с изложенным заявленное изобретение позволяет получать доступным способом высокоэффективные препараты с противомикробным действием в виде наночастиц, которые предлагается применять для лечения различных заболеваний.

Проведенные экспериментальные данные свидетельствуют:

а) о замедленном (пролонгированном) выделении в организме активно действующих веществ (в данном случае различных пептидов, например, октреотида, лейпрорелина, гозерелина, трипторелина, бусерелина ацетата и других;

б) об уменьшении их деградации на пути следования к биомишени и достаточно высоком быстродействии в отношении различных микроорганизмов, инфекций, заболеваний разных типов.

Таким образом, полученные заявленным способом микросферы из биоразлагающегося сополимера молочной и гликолевой кислот с инкапсулированным в микросферы биологически активным действующим веществом (фармацевтическим веществом, лекарственным веществом) обеспечивают пролонгированное высвобождение этих веществ. Получаемые микросферы (в виде наночастиц) обладают стабильностью основных показателей качества средств при хранении, препараты, содержащие их (как и они сами) практически нетоксичны, обладают противомикробной активностью, расширяют ассортимент различных фармацевтических и лекарственных средств, обеспечивающие контролируемое высвобождение инкапсулированных биологически активных веществ.

Источники информации

1. Патент RU 2326655, С1, 20.06.2008 (прототип).

Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения микросфер, содержащих биологически активные действующие вещества, заключенные в биоразлагаемую матрицу полимера. Матрица представляет собой сополимер молочной и гликолевой кислоты с вязкостью 0,2-0,8 дл/г и с соотношением сомономеров, соответственно, от 47,0:53,0 до 85,0:15,0. Способ получения микросфер включает стадии получения эмульсии типа вода/масло, затем получают двойную эмульсию в присутствии эмульгатора как стабилизатора эмульсии натрий карбоксиметилцеллюлозы, маннитол, далее получаемый продукт в виде двойной эмульсии типа вода/масло/вода загружают в третий реактор, содержащий воду для инъекций, эмульгатор как стабилизатор эмульсии и осуществляют формирование микросфер в виде частиц, удаляя пары растворителя хлористого метилена в течение времени в диапазоне от 1 часа до 24 часов при постепенном повышении температуры до 25-45°С и постоянном перемешивании с получением суспензии отвержденных микросфер в виде частиц, из суспензии последующим разделением микросфер на фракции удаляют сепарацией, фильтрацией крупную фракцию с размером частиц более 150 мкм и мелкую фракцию с размером частиц менее 10 нм и получают целевой продукт с размером частиц от 10 нм до 150 мкм. Осуществление изобретения позволяет получить микрокапсулированные микросферы нетоксичные, стабильные при хранении, что обеспечивает пролонгированное действие активных действующих веществ. 3 з.п. ф-лы, 3 пр., 1 табл.

1. Способ изготовления микросфер, содержащих лекарственные вещества в качестве биологически активного действующего вещества, заключенные в матрицу полимера, с использованием получения микросфер методом двойной эмульсии, и включающих при этом в качестве активного действующего вещества пептид, заключенный в полимерную матрицу, представляющую собой сополимер молочной и гликолевой кислот с вязкостью 0,2-0,8 дл/г и с соотношением указанных сомономеров, соответственно, от 47,0:53,0 до 85,0:15,0, сформированных из двойной эмульсии типа вода/масло/вода,

при этом способ включает следующие стадии:

а) сначала получают первую простую эмульсию типа вода/масло в первом реакторе путем смешения, гомогенизации, стабилизации и эмульгирования в присутствии эмульгатора как стабилизатора эмульсий раствора сополимера молочной и гликолевой кислот в хлористом метилене при соотношении их от 1,0:2,5 до 1,0:5,0 с раствором пептида в качестве биологически действующего вещества в воде для инъекций или в водном растворе уксусной кислоты при соотношении их от 1,0:2,0 до 1,0:8,0,

б) затем получают двойную эмульсию во втором реакторе путем смешения первой эмульсии со смесью, содержащей воду для инъекций, эмульгаторы как стабилизаторы эмульсии натрий карбоксиметилцеллюлоза, маннитол, осуществляемое в режиме проточной циркуляции, с поддержанием температуры от -10°С до +10°С и

в) далее получаемый продукт в виде двойной эмульсии типа вода/масло/вода загружают в третий реактор, содержащий воду для инъекций, эмульгатор как стабилизатор эмульсии и

г) осуществляют формирование микросфер с размером частиц от 10 нм до 150 мкм, удаляя пары растворителя хлористого метилена в течение времени в диапазоне от 1 часа до 24 часов при постепенном повышении температуры до 25-45°С и постоянном перемешивании с получением суспензии отвержденных микросфер в виде частиц;

д) из суспензии последующим разделением микросфер на фракции удаляют сепарацией, фильтрацией крупную фракцию с размером частиц более 150 мкм и менее 10 нм и получают целевой продукт с размером частиц от 10 нм до 150 мкм.

2. Способ изготовления микросфер по п. 1, отличающийся тем, что используют сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты с вязкостью 0,3-0,5 дл/г и с соотношением сомономеров, соответственно, от 47,0:53,0 до 53,0:47,0.

3. Способ изготовления микросфер по п. 1, отличающийся тем, что на стадии (д) удаляют сепарацией крупную фракцию более 90 мкм и мелкую фракцию с размером частиц менее 5 мкм и получают целевой продукт с размером частиц 5-90 мкм.

4. Способ изготовления микросфер по п. 1, отличающийся тем, что на стадии (б) получение двойной эмульсии осуществляют в режиме проточной циркуляции с поддержанием температуры около 0°С.