СПОСОБ ИНКАПСУЛИРОВАНИЯ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ ВЕЩЕСТВ В МИКРОСФЕРЫ ИЗ СОПОЛИМЕРА ПОЛИЛАКТИД-ПОЛИГЛИКОЛИД Российский патент 2008 года по МПК A61K9/64 A61K38/38 A61K47/30 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения микроинкапсулированных форм лекарственных препаратов.

Лечение и профилактика эндокринных, онкологических, иммунных, инфекционных, наследственных и ряда других заболеваний зачастую требуют длительного поддержания необходимой концентрации соответствующих лекарственных средств в организме пациента, что обуславливает необходимость разработки лекарственных форм, обеспечивающих пролонгированное действие действующего начала препарата.

Преимуществами депонированных лекарственных форм над недепонированными являются непрерывность терапевтического или профилактического воздействия, стабильная предсказуемая концентрация препаратов в плазме крови, возможность применения более низких терапевтических доз, снижение риска побочных эффектов, отсутствие необходимости многократного введения. В составе многих разрабатываемых депо-препаратов действующее вещество находится в растворяющихся полимерных микрокапсулах. Продолжительность действия таких препаратов зависит в том числе от размера и материала использованных микрокапсул.

Одним из примеров успешного применения депонированных лекарственных форм является использование препаратов, инкапсулированных в микросферы из сополимера полилактид-полигликолид (ПЛ-ПГ) (Штильман М.И. Полимеры в биологически активных системах // Соросовский Образовательн. Журн. - 1998. - №5. - С.48-53). ПЛ-ПГ - полиэфир полимолочной и полигликолевой кислот. Он разрушается в организме до естественных метаболитов - молочной и гликолевой кислот, нетоксичен, не вызывает воспалительных реакций в месте введения, стабилен при хранении, технологичен в изготовлении, характеризуется хорошей воспроизводимостью качества конечного продукта. Соотношение ПЛ и ПГ в составе сополимера определяет скорость его биодеструкции in vivo. Рассасывающиеся костные имплантаты и хирургические нити, сделанные из этого материала, имеют длительную историю безопасного использования в медицине (В.В.Михайлов, Р.А.Хамитов, Б.В.Кравцов. Иммобилизованные препараты в вирусологии и вакцинологии // Журн. Вопр. Вирусологии. - 1995. - №5. - С.194-197).

Существуют различные способы микроинкапсулирования действующего вещества с использованием ПЛ-ПГ, однако одним из наиболее распространенных из них является метод выпаривания растворителя.

Известен метод приготовления микросфер выпариванием растворителя из простой (двухфазной) эмульсии, который является частным случаем метода обращения фаз (Beck L.R., Pope V.Z., Flowers C.E. et al.Poly (DL-lactide-co-glycolide) / Norethisterone Microcapsules: An injectable Biodegradable Contraceptive // Biology of reproduction. - 1983. - №28. - P.186-195). В основе этого метода лежит использование двух фаз: гидрофобной органической фазы, состоящей из органического растворителя, растворенных в нем полимера и действующего вещества, и гидрофильной дисперсионной среды, состоящей из воды и стабилизатора эмульсии (сурфактанта), в качестве которого используется, как правило, поливиниловый спирт (ПВС). Органическая фаза добавляется к дисперсионной среде и подвергается эмульгированию, после чего органический растворитель выпаривается из полученной эмульсии при непрерывном ее перемешивании. В процессе испарения растворителя капли органической фазы затвердевают, эмульсия превращается в суспензию. Полученная взвесь микросфер осаждается центрифугированием. Для того чтобы отмыть полученные микросферы от сурфактанта, операция центрифугирования с последующим ресуспендированием в дистиллированной воде повторяется трижды. После отмывки препарат микросфер подвергается лиофильному высушиванию. Полученные таким образом микросферы характеризуются сферической формой, относительной гомогенностью и мелкими размерами (около 10 мкм). Недостатком вышеописанного метода является то, что для его использования необходимо, чтобы инкапсулируемый препарат был, хотя бы частично, растворим в органическом растворителе. Это является главным ограничением применения указанного метода для инкапсулирования гидрофильных соединений, таких как пептиды, белки или нуклеиновые кислоты.

Общими существенными признаками описанного метода с заявляемым способом являются:

1. Включение действующего вещества в микросферы из биодеградируемого носителя;

2. Испарение органического растворителя из органической фазы, в результате которого эмульсия превращается в суспензию.

Для увеличения степени инкапсулирования гидрофильных молекул были разработаны альтернативные методы, наиболее распространенным из которых является способ приготовления микросфер выпариванием органического растворителя из двойной (трехфазной) эмульсии (Х.М.Deng, X.H.Li, M.L.Yuan, C.D.Xiong et al. Optimization of preparative conditiones for poly-DL-lactide-polyethylene glycol microspheres with entrapped Vibrio cholera anti-genes // Jomal of Controlled Release. - 1999. - N58. - P.123-131). В этом случае водный раствор гидрофильного соединения первично эмульгируется в органическом растворе полимера. Затем первичную эмульсию вливают в большой объем воды, содержащей сурфактант. Из образовавшейся трехфазной эмульсии при непрерывном перемешивании выпаривается органический растворитель. Полученные таким образом микросферы отмывают от сурфактанта и лиофильно высушивают. При использовании техники двойной эмульсии, как правило, достигается хорошая эффективность инкапсулирования гидрофильных соединений, однако размер частиц обычно больше, чем при использовании метода на основе простой эмульсии.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата, относится то, что при использовании способа приготовления микросфер выпариванием органического растворителя из двойной (трехфазной) эмульсии, принятого за прототип, происходит неполная загрузка действующего вещества в микросферы в результате частичного его перехода в дисперсионную среду в процессе затвердевания микросфер. Потеря может достигать 80% и более использованного для загрузки действующего вещества. Кроме того, при использовании данного способа сохраняется необходимость отмывать готовые микросферы от дисперсионной среды, что делает технологию приготовления микросфер сложной, громоздкой и дорогой.

Общими существенными признаками указанного метода с заявляемым способом являются:

1. Включение действующего вещества в микросферы из биодеградируемого носителя;

2. Использование эмульсии, состоящей из трех фаз: водная, органическая, водная;

3. Испарение органического растворителя из органической фазы, в результате которого эмульсия превращается в суспензию.

Задачей изобретения является усовершенствование способа микроинкапсулирования белоксодержащих веществ.

Технический результат изобретения - увеличение количества действующего вещества в составе конечного препарата и упрощение процедуры подготовки жидкого полуфабриката вакцинного препарата к стадии лиофильного высушивания.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в предлагаемом способе в качестве стабилизатора эмульсии вместо ПВС предложено использовать полиглюкин. Полиглюкин - это декстрановый препарат, 6%-ный водный раствор которого применяется в медицинской практике в качестве плазмозаменителя для улучшения реологических свойств крови. Он представляет собой частично гидролизованный полимер глюкозы с молекулярной массой около 60000 Д. Поскольку полиглюкин - препарат, официально допущенный к парентеральному применению, нет необходимости исключать его из состава лекарственной формы, как это имеет место при использовании ПВС. Помимо этого полиглюкин, как известно, с успехом используется в качестве криопротектора при лиофильном высушивании препаратов.

Таким образом, заявляемый способ представляет собой следующую последовательность манипуляций:

1. Приготовление первичной (двухфазной) эмульсии: водный раствор белоксодержащего вещества эмульгируют в органической фазе, состоящей из органического растворителя и растворенного в нем полимера.

2. Приготовление вторичной (трехфазной) эмульсии: первичную эмульсию эмульгируют в гидрофильной фазе, состоящей из воды и растворенного в ней полиглюкина.

3. Выпаривание органического растворителя из органической фазы, в результате чего эмульсия превращается в суспензию.

4. Лиофильное высушивание готового препарата.

Между совокупностью существенных признаков заявляемого способа и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно: использование полиглюкина в качестве стабилизатора эмульсии позволило оптимизировать схему микроинкапсулирования белоксодержащих веществ путем исключения стадии отмывки микросфер и упрощения стадии подготовки к лиофильному высушиванию. При этом действующее вещество, вышедшее в дисперсионную среду из микросфер в процессе испарения растворителя, остается в составе конечного препарата в свободном виде и не теряется, как это имеет место в методе-прототипе.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами. Все нижеприведенные исследования проведены с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве модели инкапсулируемого действующего вещества.

Пример 1. Схема приготовления микросфер выпариванием растворителя из двойной эмульсии с использованием в качестве стабилизатора полиглюкина

Для приготовления препарата 0,2 мл 1%-ного водного раствора БСА добавляли в органическую фазу, состоящую из 0,4 г ПЛ-ПГ, растворенного в 1,8 мл дихлорметана, и энергично эмульгировали на магнитной мешалке в течение 1 минуты. После этого полученную первичную эмульсию добавляли в 12 мл водного раствора полиглюкина. Вторичную (трехфазную) эмульсию перемешивали на магнитной мешалке 1 минуту на максимальной скорости, после чего скорость перемешивания понижали до минимальной (˜100 об/мин) и выдерживали такие условия в течение примерно 2 часов - до полного испарения дихлорметана. Готовую суспензию микросфер помещали в пенициллиновые флаконы в объеме 2,5 мл и подвергали лиофильному высушиванию.

Пример 2. Физико-химические свойства микроинкапсулированного препарата БСА

Для оценки влияния концентрации полиглюкина в дисперсионной среде на размер микросфер, на степень их загрузки и на характеристики лиофильно высушенного препарата предлагаемым способом (см. пример 1) был приготовлен ряд препаратов микросфер, загруженных БСА. При этом в качестве дисперсионной среды использовался водный раствор, содержащий различное количество полиглюкина. В лиофилизированных препаратах оценивалась потеря в массе при высушивании. При регидратации высушенных препаратов визуальным методом оценивались скорость ресуспендирования и наличие агрегатов. В регидратированных препаратах определяли средний диаметр микросфер микроскопическим методом посредством измерения 200 микросфер. Степень загрузки микросфер определялась спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм, оптическая плотность экстракта из микросфер сравнивалась с оптической плотностью референс-препарата, содержащего такое же количество БСА, которое использовалось для приготовления опытного образца. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, с увеличением концентрации полиглюкина в дисперсионной среде средний размер микросфер уменьшается, при этом уменьшается и степень их загрузки БСА. Оптимальная концентрация полиглюкина в дисперсионной среде, при которой обеспечивается получение микросфер удовлетворительных характеристик, и, в то же время, после лиофильного высушивания удается получить хорошо ресуспендируемый препарат с низкой агрегацией микросфер, составляет 40%.

Пример 3. Иммунохимические свойства микроинкапсулированного препарата БСА

Лабораторные животные (морские свинки) иммунизировались препаратами БСА, приготовленными с использованием различных адъювантов. Препарат №1 представлял собой БСА, инкапсулированный в микросферы из ПЛ-ПГ (50:50) методом выпаривания растворителя из двойной эмульсии при использовании 40%-ного водного раствора полиглюкина в качестве сурфактанта. Препараты сравнения (№№2, 3) содержали идентичные количества БСА в комплексе с соответственно масляным (полный адъювант Фрейнда, ПАФ) и минеральным (гель гидроокиси алюминия, ГГА) адъювантами.

Иммунизация морских свинок (по 20 животных в группе) проводилась подкожно во внутреннюю поверхность бедра в объеме 0,2 мл в дозе 20 мкг БСА.

Через 3 месяца после иммунизации в сыворотке крови животных оценивался титр антител к БСА в РНГА с эритроцитарным антигенным диагностикумом лабораторного приготовления.

В таблице 2 представлены результаты определения иммунохимических свойств сравниваемых препаратов.

Данные таблицы 2 показывают, что через 3 месяца после иммунизации наибольший титр антител к БСА выявлялся в сыворотке крови животных, иммунизированных препаратом БСА, микроинкапсулированного в ПЛ-ПГ, либо эмульгированного в ПАФ. Среднегеометрический титр антител к БСА у животных, иммунизированных БСА, сорбированном на ГТА, был приблизительно в 4 раза ниже (различие достоверно для р=0,95).

Таблица 1Влияние концентрации полиглюкина в дисперсионной среде на характеристики микросферКонцентрация полиглюкина в дисперсионной среде, %Диаметр микросфер, , мкмСтепень загрузки микросфер, %Потеря в массе при высушивании препарата после лиофильного обезвоживания, %Скорость ресуспендирования сухого препарата, , минНаличие агрегатов в суспензии10327,463,50,14+15280,550,30,17+20120,541,80,213+2545,728,30,517±3014,324,30,923-4012,125,41,426-

Таблица 2Иммунохимическая активность микроинкапсулированного препарата БСАСостав препаратаКоличество животных с сероконверсией, процентТитр антител к БСА в крови животных, БСА+ПЛ-ПГ95БСА+ПАФ (контроль 1)90БСА+ГГА (контроль 2)70Примечания: 1. Доза БСА - 20 мкг на одно животное;2. Препараты вводились подкожно в объеме 0,2 мл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения микроинкапсулированных форм лекарственных препаратов. Микросферы представляют собой сополимер полилактид-полигликолид - полиэфир полимолочной и полигликолевой кислот. Он разрушается в организме до естественных метаболитов - молочной и гликолевой кислот, нетоксичен, не вызывает воспалительных реакций в месте введения, стабилен при хранении. Способ инкапсулирования белоксодержащих веществ в микросферы из сополимера полилактид-полигликолид включает: приготовление первичной эмульсии путем эмульгирования водного раствора действующего вещества в органической фазе; получение вторичной эмульсии посредством соединения первичной эмульсии и гидрофильной фазы, состоящей из водного раствора стабилизатора эмульсии; испарение органического растворителя. В качестве стабилизатора вторичной эмульсии использовался полиглюкин, разрешенный к применению в составе парентерально вводимых лекарственных средств. 2 табл.

Способ инкапсулирования белоксодержащих веществ в микросферы из сополимера полилактид-полигликолид методом выпаривания растворителя, включающий приготовление первичной эмульсии путем эмульгирования водного раствора действующего вещества в органической фазе, получение вторичной эмульсии посредством соединения первичной эмульсии и гидрофильной фазы, состоящей из стабилизатора эмульсии и воды, испарение растворителя, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора вторичной эмульсии используется полиглюкин.