СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/22 C12P19/04 

Изобретение относится к области микробиологического получения полисахаридов, а именно: бактериальной целлюлозы (БЦ), которая может быть использована в медицине, промышленности и технике.

Из уровня техники известен способ получения бактериальной целлюлозы по патенту РФ №2536973 (дата публикации 27.12.2014), включающий культивирование бактерий в питательной среде с последующим отделением бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости, последующую обработку щелочью и кислотой, промывку, сушку.

Основным недостатком описанного способа является использование в качестве питательной среды отхода пищевого производства - послеспиртовой зерновой барды.

Наиболее близким, а потому и принятым за прототип является техническое решение по патенту РФ №2536257 (дата публикации 20.12.2014), включающее культивирование бактерий в питательной среде с последующим отделением бактериальной целлюлозы, последующей обработкой щелочью и кислотой, промывку, сушку.

Основным недостатком описанного способа является использование в качестве питательной среды отхода пищевого производства - молочной сыворотки.

Применение питательных сред на основе отходов пищевых производств проблематично, так как, во-первых, используются пищевые ресурсы, во-вторых, производство бактериальной целлюлозы становится зависимым от функционирования смежного предприятия, в-третьих, отходы - это всегда скоропортящееся сырье и технически сложно соблюдать сроки его доставки. Скоропортящееся сырье требует введения дополнительной стадии стерилизации питательной среды для избежания контаминации посторонней микрофлорой, что усложняет способ получения бактериальной целлюлозы технологически (требуются дополнительное оборудование и электроэнергия) и ведет к повышению себестоимости готового продукта.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего получать бактериальную целлюлозу из дешевого непищевого целлюлозосодержащего сырья, а также сделать процесс технологичным и микробиологически безопасным в отношении посторонней микрофлоры.

Замена пищевого сырья на непищевое позволит снизить себестоимость бактериальной целлюлозы. Применение целлюлозосодержащего сырья, стабильного в хранении, позволяет сделать процесс технологичным и микробиологически безопасным в отношении посторонней микрофлоры.

Поставленная задача решается предлагаемым способом получения бактериальной целлюлозы, включающим культивирование продуцента в питательной среде с последующим отделением бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости и дальнейшую обработку щелочью и кислотой, промывку, сушку; при этом продуцент представляет собой симбиотическую культуру Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 (также Юркевич Д.И., Кутышенко В.П. Медузомицет (Чайный гриб): научная история, состав, особенности физиологии и метаболизма // Биофизика. - 2002. - №6. - С. 1116-1129), которую культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка, обработка производится соляной кислотой, а сушка осуществляется при комнатной температуре.

Особенностью предлагаемого способа является следующее: в качестве продуцента выбрана симбиотическая культура Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12, достоинствами которой являются высокая адаптивная способность, устойчивость к фагам, нетребовательность к составу среды, способность саморегулировать уровень активной кислотности в процессе ее культивирования.

В качестве питательной среды выбран ферментативный гидролизат мискантуса, или плодовых оболочек, или соломы льна-межеумка (Makarova E.I. Results of Miscanthus cellulose fermentation in the acetate buffer and in water medium // Chemistry for Sustainable Development. - 2013. - №2. - P. 209-214; Скиба E.A. Методика определения биологической доброкачественности гидролизатов из целлюлозосодержащего сырья с помощью штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1693 // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2016. - №1 (16). - С. 34-44; Pavlov I. N. A Setup for Studying the Biocatalytic Conversion of Products from the Processing of Nonwood Raw Materials // Catalysis in Industry. - 2014. - Vol. 6. - No. 4. - P. 350-360. DOI: 10.1134/S207005041404014X.).

Мискантус - это род многолетних, легковозобновляемых, травянистых растений семейства злаковых, который может составить достойную конкуренцию древесине по такому параметру, как скорость роста биомассы. Мискантус отличается морозостойкостью, неприхотливостью, может выращиваться на неплодородных землях, одна плантация в условиях Сибири может давать урожай в течение 15-20 лет с высокой урожайностью (10-15 т сухой биомассы с гектара в год).

Плодовые оболочки овса (ПОО) составляют до 28% отходов обработки овса, ранее рассматривались в качестве промышленно значимого источника для производства ксилита. ПОО представляют собой калиброванное природой сырье (размеры частиц в диапазоне 0,007-0,012 м) с содержанием целлюлозы 35-40% и размещаются непосредственно в промышленных районах на элеваторах.

Солома льна-межеумка представляет интерес, так как может произрастать в различных климатических зонах страны, в том числе и регионах, в которых выращивание других сельскохозяйственных культур малоэффективно. Гарантированная урожайность льна, многовариантность его переработки могут существенно поднять доходность и занятость населения аграрно-промышленных регионов России. Урожайность семян льна достигает 14-16 ц/га, при этом масса соломы составляет 1,5 т/га.

После микробиологического синтеза бактериальную целлюлозу отделяют от питательной среды и проводят ее обработку соляной кислотой для удаления клеток и компонентов культуральной среды. Соляная кислота в два раза дешевле уксусной кислоты, используемой для очистки бактериальной целлюлозы в прототипе.

В прототипе сушка бактериальной целлюлозы проводится при 80°С. В данном изобретении сушка продукта осуществляется при комнатной температуре, что исключает использование дополнительного нагревательного оборудования, обеспечивает равномерное высушивание бактериальной целлюлозы, сохраняет толщину волокна. Известно, что сушка целлюлозы при температуре выше 50°С может приводить к снижению реакционной способности целлюлозы. Сушка при комнатной температуре экономична и позволяет сохранить физико-химические свойства бактериальной целлюлозы.

По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет снизить себестоимость получения БЦ за счет использования дешевого непищевого целлюлозосодержащего сырья, а также сделать процесс технологичным и микробиологически безопасным в отношении посторонней микрофлоры. Способ позволяет получать бактериальную целлюлозу в статических условиях в виде гель-пленки.

Внешний вид полученной бактериальной целлюлозы представлен на Фиг. 1 и Фиг. 2.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Симбиотическую культуру Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанного химическим способом мискантуса. Ферментативный гидролизат представляет собой жидкость светло-коричневого цвета с небольшим количеством взвесей, с характерным кисловатым запахом мискантуса и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 5,8%; концентрация редуцирующих веществ - 35 г/л; рН 5,0. В 1 л ферментативного гидролизата мискантуса добавляют 15 г черного байхового чая, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 28°С.

Культивирование симбиотической культуры осуществляется в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 10 суток при температуре 28°С с последующим отделением пленок полученной бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости.

Образцы пленок бактериальной целлюлозы очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Сушат при комнатной температуре в расправленном состоянии. Масса воздушно-сухой бактериальной целлюлозы составляет 7,26 г/л.

Пример 2.

Симбиотическую культуру Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанных химическим способом плодовых оболочек овса. Ферментативный гидролизат представляет собой прозрачную жидкость янтарно-желтого цвета с характерным запахом плодовых оболочек овса и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 8,5%; концентрация редуцирующих веществ - 45 г/л; рН 4,8. В 1 л ферментативного гидролизата мискантуса добавляют 10 г черного байхового чая, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 30°С.

Культивирование симбиотической культуры осуществлялось в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 13 суток при температуре 30°С с последующим отделением пленок полученной бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости.

Образцы пленок бактериальной целлюлозы очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Сушат при комнатной температуре в расправленном состоянии. Масса воздушно-сухой бактериальной целлюлозы составляет 7,90 г/л.

Пример 3.

Симбиотическую культуру Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанной химическим способом соломы льна-межеумка. Ферментативный гидролизат представляет собой мутноватую жидкость серо-коричневого цвета с характерным запахом соломы льна-межеумка и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 7,5%; концентрация редуцирующих веществ - 60 г/л; рН 4,5. В 1 л ферментативного гидролизата мискантуса добавляют 5 г зеленого байхового чая, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 26°С.

Культивирование симбиотической культуры осуществлялось в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 14 суток при температуре 26°С с последующим отделением пленок полученной бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости.

Образцы пленок бактериальной целлюлозы очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Сушат при комнатной температуре в расправленном состоянии. Масса воздушно-сухой бактериальной целлюлозы составляет 6,45 г/л.

Пример 4.

Симбиотическую культуру Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанного химическим способом мискантуса. Ферментативный гидролизат представляет собой жидкость светло-коричневого цвета с небольшим количеством взвесей, с характерным кисловатым запахом мискантуса и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 3,7%; концентрация редуцирующих веществ - 15 г/л; рН 4,6. В 1 л ферментативного гидролизата мискантуса добавляют 1 г гранулированного черного чая, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 20°С.

Культивирование симбиотической культуры осуществлялось в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 7 суток при температуре 20°С с последующим отделением пленок полученной бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости.

Образцы пленок бактериальной целлюлозы очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Сушат при комнатной температуре в расправленном состоянии. Масса воздушно-сухой бактериальной целлюлозы составляет 3,0 г/л.

Пример 5.

Симбиотическую культуру Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанных химическим способом плодовых оболочек овса. Ферментативный гидролизат представляет собой прозрачную жидкость янтарно-желтого цвета с характерным запахом плодовых оболочек овса и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 13%; концентрация редуцирующих веществ - 70 г/л; рН 4,9.

Культивирование симбиотической культуры осуществляется в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 5 суток при температуре 40°С с последующим отделением пленок полученной бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости.

Образцы пленок бактериальной целлюлозы очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Сушат при комнатной температуре в расправленном состоянии. Масса воздушно-сухой бактериальной целлюлозы составляет 1,0 г/л.

Бактериальная целлюлоза получена в лабораторных условиях на базе ИПХЭТ СО РАН. Способ реализуется на стандартном оборудовании с помощью стандартных широко доступных реактивов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы. Предложен способ получения бактериальной целлюлозы, включающий культивирование симбиотической культуры Medusomyces gisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка. Бактериальную целлюлозу отделяют от культуральной жидкости, обрабатывают соляной кислотой и высушивают при комнатной температуре. Изобретение обеспечивает получение бактериальной целлюлозы из дешевого непищевого целлюлозосодержащего сырья. 2 ил., 5 пр.

Способ получения бактериальной целлюлозы, включающий культивирование продуцента на питательной среде с последующим отделением бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости, обработку бактериальной целлюлозы щелочью, кислотой, промывку, сушку, отличающийся тем, что продуцент представляет собой симбиотическую культуру Medusomyces gisevii, которую культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка, обработка производится соляной кислотой, а сушка осуществляется при комнатной температуре.