Настоящая заявка притязает на приоритет согласно 35 U.S.C. § 119 на основании предварительной заявки на выдачу патента США № 61/721072, поданной 1 ноября 2012 года, и предварительной заявки на выдачу патента США № 61/787927, поданной 15 марта 2013 года, обе заявки включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

В настоящем описании раскрыты поливалентные и полиспецифичные связывающие белки, способы получения связывающих белков и их применения для диагностики, подавления, профилактики и/или лечения рака, опухолей и/или других зависимых от ангиогенеза заболеваний.

Сконструированные белки, такие как полиспецифичные связывающие белки, способные связывать два или больше антигенов, известны в данной области. Такие полиспецифичные связывающие белки могут быть созданы с использованием слияния клеток, химической конъюгации или методики получения рекомбинантной ДНК. Существует множество полиспецифичных связывающих белковых структур, известных в данной области; однако многие такие структуры и способы имеют явные недостатки.

Биспецифичные антитела были получены с использованием методики квадром. Однако присутствие ошибочно спаренных побочных продуктов и значимо сниженные выходы продукции при использовании такой методики означают, что требуются сложные способы очистки. Биспецифичные антитела также могут быть получены в результате химической конъюгации двух разных мАт. Однако такой способ не дает гомогенных препаратов.

Другие способы, применяемые ранее, включают связывание двух исходных антител с помощью гетеро-бифункицонального поперечносшивающего агента, получение тандемных одноцепочечных молекул Fv, диантител, биспецифичных диантител, одноцепочечных диантител и ди-диантител. Однако каждый из таких способов имеет недостатки. Кроме того, была описана конструкция поливалентного антитела, содержащего два повтора Fab в тяжелой цепи IgG и способная связывать четыре молекулы антигена (смотрите публикацию PCT № WO 0177342 и публикацию Miller с соавторами (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61).

Системы лиганд-рецептор эволюционировали совместно для поддержания специфичности. Их взаимодействия активируют специфичную передачу сигналов для конкретной биологической активности. Однако не являющиеся лигандами связывающие рецептор белки, такие как моноспецифичные антитела, би- или полиспецифичные связывающие белки, сочетания неконкурентных антител или другие связывающие рецептор белки, связывающиеся с внеклеточным доменом (ECD) рецептора, могут узнавать эпитопы, отличные от связывающего лиганд участка рецептора. Связывание с таким отличающимся эпитопом(ами) на ECD рецептора может передавать конформационные изменения внутриклеточному домену, что может приводить к новому неожиданному каскаду передачи сигнала.

В патенте США № 7612181 (включенном в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме) предлагается новое семейство связывающих белков, способных связывать два или больше антигенов с высокой аффинностью, которые названы связывающими белками с двойным вариабельным доменом (DVD-связывающий белок) или иммуноглобулинами с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig™). DVD-молекулы являются тетравалентными Ig-подобными белками с двойной специфичностью, способными связывать два разных эпитопа на одной и той же молекуле или две разных молекулы одновременно. DVD являются уникальными связывающими белками, состоящими из двух вариабельных доменов, слитых с N-концом бивалентного антитела. Вариабельные домены могут быть непосредственно слиты друг с другом или могут быть связаны через синтетические пептидные линкеры разной длины и аминокислотного состава. DVD могут быть сконструированы с интактными и функциональными Fc-доменами, позволяя им затем опосредовать соответствующие эффекторные функции. Форма DVD вследствие гибкости в отношении выбора пары антител, ориентации двух антигенсвязывающих доменов и длины линкера, который их связывает, может обеспечивать новые терапевтические возможности.

Хотя в данной области предлагается множество структур с некоторыми преимуществами и недостатками, необходимы специфичные конструкции для получения поливалентных связывающих белков со специфичными свойствами, которые связываются со специфичными мишенями. Кроме того, новые последовательности вариабельных доменов могут дополнительно улучшать свойства связывающих белков. В частности, улучшенные DVD, которые связываются с DLL4 и VEGF, могут оказаться полезными. Соответственно, в настоящем описании раскрыты иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами, получаемые с использованием каркаса связывающего белка, раскрытого в патенте США № 7612181 (включенном в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме), и содержащие конкретные первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая содержит первую и вторую последовательности вариабельных доменов (например, последовательности, перечисленные в таблице 2), которые образуют функциональные связывающие участки для VEGF и DLL4. В некоторых вариантах первая и вторая полипептидные цепи содержат первую и вторую последовательности вариабельного домена, каждая из которых содержит три CDR из одной из последовательностей, перечисленных в таблице 2, и образуют функциональные участки связывания для VEGF и DLL4.

DLL4 является лигандом, вовлеченным в передачу сигналов от клетки к клетке посредством пути рецептора Notch. Такая коммуникация между клетками необходима для многих биологических процессов, таких как дифференцировка, пролиферация и гомеостаз. Путь передачи сигнала Notch является одной из систем, которая используется широким кругом эукариот. Такой путь, особенно рецептор Notch, также важен для функционального опухолевого ангиогенеза. Таким образом, ингибирование функции рецептора Notch, блокирование рецептора Notch и/или блокирование пути передачи сигнала Notch являются возможными стратегиями создания противоопухолевых композиций и способов терапии. Было доказано, что низкомолекулярные ингибиторы рецептора Notch часто бывают токсичными, поскольку они подавляют экспрессию рецепторов Notch дикого типа (нормальную) в организме. Таким образом, разные представители пути передачи сигналов Notch можно рассматривать в качестве потенциальных мишеней для терапии. Лигандом рецептора Notch в сосудистой системе является Delta 4 или Delta-подобный 4 (DLL4). Широко экспрессируемый в сосудистой системе DLL4 важен для развития сосудов (Yan et al., Clin. Cancer Res., 13(24): 7243-7246 (2007); Shutter et al., Genes Dev., 14(11): 1313-1318 (2000); Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 14(11): 1343-1352 (2000)). У мышей, гетерозиготных по DLL4, наблюдают эмбриональную гибель вследствие крупных дефектов развития сосудов (Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Duarte et al., Genes Dev., 18(20): 2474-2478 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 18(20): 2469-2473 (2004)).

Экспрессия DLL4 может быть индуцирована VEGF (Liu et al., Mol. Cell Biol., 23(1): 14-25 (2003); Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3219-3224 (2007)). VEGF является сигнальным белком, продуцируемым клетками, вовлеченными в ангиогенез. Кроме того, DLL4 может негативно регулировать передачу сигнала VEGF, отчасти посредством репрессии VEGFR2 и индукции VEGR1 (Harrington et al., Microvasc. Res., 75(2): 144-154 (2008); Suchting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3225-3230 (2007)). Тонкая координация между DLL4 и VEGF важна для функционального ангиогенеза, что делает и DLL4 и VEGF потенциальными мишенями для терапевтического вмешательства.

Кроме своей физиологической роли DLL4 и VEGF также подвергаются повышающей регуляции в кровеносных сосудах в опухолях Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Mailhos et al., Differentiation, 69(2-3): 135-144 (2001); Patel et al., Cancer Res., 65(19): 8690-8697 (2005); Patel et al., Clin. Cancer Res., 12(16): 4836-4844 (2006); Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006)). Было показано, что блокирование DLL4 ингибирует рост первичных опухолей во множестве моделей (Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006); Ridgway et al., Nature, 444(7122): 1083-1087 (2006); Scehnet et al., Blood, 109(11): 4753-4760 (2007)). Ингибирование DLL4 эффективно даже против опухолей, которые резистентны к анти-VEGF-терапии. Таким образом, комбинированное ингибирование и DLL4 и VEGF может приводить к усиленной противоопухолевой терапии. Интересно, что в отличие от ингибирования VEGF, которое снижает формирование сосудов в опухоли, блокирование DLL4 приводит к увеличению плотности сосудистой системы в опухоли, при этом сосуды являются аномальными, не могут поддерживать эффективный перенос крови и функционально неэффективными. Таким образом, разрушение обоих лигандов VEGF и DLL4 обеспечивает разные способы действия потенциальных противоопухолевых средств лечения.

Хотя в данной области известны антитела и различные связывающие конструкции, сохраняется необходимость в улучшенном целенаправленном действии и повышенной эффективности связывания с VEGF и DLL4, например, для лечения злокачественной опухоли и канцерогенеза. В данной области имеется потребность в улучшенных поливалентных связывающих белках, способных связывать DLL4 и VEGF. Соответственно предлагаются новые связывающие белки, при этом связывающие белки способны связывать DLL4 и VEGF. В некоторых вариантах связывающие белки способны, например, связываться с DLL4 и VEGF с улучшенной аффинностью связывания и/или эффективностью нейтрализации.

Предлагаются связывающие белки, способные целенаправленно действовать на два эпитопа, при этом связывающие белки способны связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте предлагаются связывающие белки, способные связывать эпитопы DLL4 и VEGF с высокой аффинностью. В одном варианте связывающие белки содержат каркас связывающего белка с двойным вариабельным доменом, который содержит последовательности CDR и вариабельных доменов, перечисленные в таблице 2. В одном варианте каркас связывающего белка с двойным вариабельным доменом содержит каркас, описанный в патенте США № 7612181 (включенном в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме).

В одном варианте предлагаются связывающие белки, содержащие полипептидную цепь, которая может связывать два эпитопа двух разных белков (VEGF и DLL4), при этом полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает аминокислоту или полипептид, X2 означает Fc-область, и n равно 0 или 1. В некоторых вариантах VD1 и VD2 в связывающем белке представляют собой вариабельные домены тяжелой цепи. В некоторых вариантах VD1 и VD2 способны связывать эпитоп DLL4 и эпитоп VEGF. В некоторых вариантах C означает константный домен тяжелой цепи, такой как CH1. В некоторых вариантах X1 означает линкер при условии, что X1 не означает CH1.

В различных вариантах связывающий белок, раскрытый в настоящем описании, содержит полипептидную цепь, которая связывает эпитоп DLL4 и эпитоп VEGF, при этом полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 содержит первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 содержит второй вариабельный домен тяжелой цепи, C содержит константный домен тяжелой цепи, X1 содержит линкер, и X2 содержит Fc-область. В одном варианте X1 означает линкер при условии, что он не является CH1. В одном варианте каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и VD2 содержит три CDR, выбранные из CDR в последовательностях SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53 (т.е. CDR 1-3 из одной из таких последовательностей), при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:39. В другом варианте связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте вариабельные домены тяжелой цепи VD1 и VD2 содержат последовательности SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательности SEQ ID NO:39.

В различных вариантах связывающий белок, раскрытый в настоящем описании, содержит полипептидную цепь, которая связывает эпитоп DLL4 и эпитоп VEGF, при этом полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 содержит первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 содержит второй вариабельный домен легкой цепи, C содержит константный домен легкой цепи, X1 содержит линкер, и X2 не содержит Fc-область. В одном варианте X1 означает линкер при условии, что он не является CH1 или CL. В одном варианте каждый из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и VD2 содержит три CDR, выбранные из CDR в последовательностях SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54 (т.е. CDR 1-3 из одной из таких последовательностей), при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:40. В другом варианте связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте каждый из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и VD2 содержит последовательности SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:40.

В другом варианте раскрыт связывающий белок, который связывает эпитоп DLL4 и эпитоп VEGF. В некоторых вариантах связывающий белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из первой и второй полипептидных цепей независимо содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает линкер, X2 означает Fc-область, и n равно 0 или 1, при этом домены VD1 в первой и второй полипептидных цепях образуют первый функциональный связывающий мишень участок, и домены VD2 в первой и второй полипептидных цепях образуют второй функциональный связывающий мишень участок. В одном варианте X2 содержит Fc-область, когда n=1, и X2 не содержит Fc-области, когда n=0. В некоторых вариантах последовательности X1 в первой и второй полипептидных цепях являются одинаковыми. В других вариантах последовательности X1 в первой и второй полипептидных цепях являются разными. В некоторых вариантах X1 в по меньшей мере одной из полипептидных цепей не является доменом CH1 и/или доменом CL. В одном варианте последовательность X1 является коротким линкером (например, 6, 5, 4, 3 или 2 аминокислот). В другом варианте последовательность X1 является длинным линкером (например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30 или больше аминокислот). В другом варианте последовательность X1 в одной из двух полипептидных цепей представляет собой короткий линкер, а последовательность X1 в другой полипептидной цепи представляет собой длинный линкер. В одном варианте каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и VD2 содержит три CDR из последовательностей SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53 (т.е. CDR 1-3 из одной из таких последовательностей), при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:39; и вариабельные домены легкой цепи VD1 и VD2 содержат три CDR из последовательностей SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54 (т.е. CDR 1-3 из одной из таких последовательностей), при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:40. В другом варианте связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте вариабельные домены тяжелой цепи VD1 и VD2 содержат последовательности SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:39, и вариабельные домены легкой цепи VD1 и VD2 содержат последовательности SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, или 54, при этом, по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:40.

В различных вариантах раскрыт связывающий белок, который способен связывать VEGF и DLL4. В некоторых вариантах связывающий белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из первой и второй полипептидных цепей независимо содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает линкер, X2 означает Fc-область, и n равен 0 или 1, при этом домены VD1 в первой и второй полипептидных цепях образуют первый функциональный связывающий мишень участок и домены VD2 в первой и второй полипептидных цепях образуют второй функциональный связывающий мишень участок. В одном варианте вариабельные домены, которые образуют функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержат три CDR из последовательности SEQ ID NO:41 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:42 (например, CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:41 и CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:42, присутствующие в отдельных цепях, при этом CDR в каждой цепи распределены в указанном порядке и разделены подходящими каркасными последовательностями с образованием функционального связывающего участка). В одном варианте вариабельные домены, которые образуют функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержат три CDR из последовательности SEQ ID NO:39 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:40 (например, CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:39 и CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:40, присутствующие в отдельных цепях, при этом CDR в каждой цепи распределены в указанном порядке и разделены подходящими каркасными последовательностями с образованием функционального связывающего участка). В одном варианте связывающий белок содержит функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержащий три CDR из последовательности SEQ ID NO:41 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:42 (например, CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:41 и CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:42), и функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержащий три CDR из последовательности SEQ ID NO:39 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:40 (например, CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:39 и CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:40). В одном варианте связывающий белок содержит функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержащий последовательности SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:42, и функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержащий последовательности SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO:40. В одном варианте связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:56, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:64. В одном варианте связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:73, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:74. В некоторых вариантах вариабельные домены, которые образуют участок связывания для DLL4, включают домены, описанные в публикации заявки на выдачу патента США № 20110217237, и/или вариабельные домены, которые образуют участок связывания для VEGF, включают домены, описанные в публикации заявки на выдачу патента США № 20100076178, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. В одном варианте связывающий белок содержит h1A11.1-SL-Av. В одном варианте связывающий белок h1A11.1-SL-Av содержит Fc-область из мутанта LALA IgG1 человека.

Для разработки и получения связывающего белка, подходящего для применения в качестве терапевтического средства для человека, например, в качестве противоракового/противоопухолевого средства, может требоваться больше, чем просто идентификация связывающего белка, способного связываться с требуемой мишенью или мишенями. Например, кандидат может связывать свою мишень(мишени), но проявлять пониженную способность ингибировать или нейтрализовать требуемую мишень, может создавать трудности при приготовлении стабильного препарата, может проявлять нежелательные фармакокинетические свойства или может быть связан с трудностями при получении в подходящей системе экспрессии (например, экспрессии в клетке-хозяине, такой как CHO). Таким образом, факторы, которые необходимо учитывать при разработке подходящего терапевтического средства включают, но без ограничения, (a) кинетику связывания (скорость образования комплекса, скорость распада комплекса и аффинность) как для внутреннего, так и для внешнего антигенсвязывающих доменов, (b) эффективности в различных биохимических и клеточных биологических анализах, (c) эффективности in vivo в соответствующих моделях опухолей, (d) фармакокинетические и фармакодинамические свойства, (e) возможность производства, включая уровень экспрессии белка в выбранных линиях клеток, масштабируемость, посттрансляционную модификацию, физико-химические свойства, такие как процентное содержание мономеров, растворимость и стабильность (собственная стабильность, стабильность при замораживании/размораживании, стабильность при хранении и т.д.), (f) свойства, связанные с приготовлением препарата, (g) потенциальный риск иммуногенности и (h) токсикологические свойства молекулы. Также можно оценивать способность к связыванию и валентность, так как они могут влиять на свойства связывания и эффективность молекулы в клетке. В случае некоторых связывающих белков даже небольшие изменения в аминокислотных последовательностях вариабельных доменов, константных доменов и/или линкеров потенциально могут влиять (позитивно или негативно) на один или несколько таких факторов, и таким образом, может быть проведена оценка сочетания факторов, чтобы выбрать лучшего кандидата. После идентификации лучшего кандидата проводят дополнительную оценку in vivo терапевтических свойств включая оценку безопасности, эффективности и активность у животных и человека.

В этой связи неожиданно было обнаружено, что связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64, или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74, имел превосходное сочетание свойств, таких как кинетика связывания (т.е. константа диссоциации), превышающая терапевтически применимый порог, улучшенная способность к нейтрализации, повышенная эффективность in vivo, превосходные свойства, обеспечивающие возможность получения препарата, требуемая картина гликозилирования, подходящий профиль фармакокинетики и эффективная экспрессия в клетках-хозяевах по сравнению с другими оцениваемыми связывающими белками, содержащими другие вариабельные домены и/или линкерные последовательности. Связывающие белки для сравнения могут включать белки, имеющие такие же последовательности вариабельных доменов и ориентации, но с другими линкерами, а также белки, имеющие измененные ориентации связывающих доменов и/или других последовательностей вариабельных доменов (например, последовательностей с созревшей аффинностью, полностью человеческие последовательности и т.д.). В некоторых вариантах такие превосходные свойства зависят от выбора конкретных последовательностей вариабельных доменов (например, SEQ ID NO:39-42), конкретной ориентации доменов, связывающих VEGF и DLL4, во внутренних и наружных положениях (например, ориентации, представленные в последовательностях SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64), конкретных линкерных последовательностей (например, вариабельные домены тяжелой цепи и короткая линкерная последовательность, используемые в последовательности SEQ ID NO:56, и вариабельные домены легкой цепи и длинная линкерная последовательность, используемые в последовательности SEQ ID NO:64), и/или конкретных последовательностей константных доменов (например, последовательности константного домена, используемые в последовательностях SEQ ID NO:73 и 74). В некоторых вариантах только изменение линкерной последовательности может иметь значимое влияние на функциональные свойства. Например, выбор линкерной последовательности, используемой в последовательности SEQ ID NO:73 и 74 (наряду с вариабельными и константными доменами, включенными в такие последовательности) может способствовать неожиданному улучшению терапевтических свойств связывающего белка для человека. Например, в таблице 9 показано влияние различных линкерных последовательностей на противоопухолевую эффективность in vivo, которую измеряли в моделях ксенотрансплантатов аденокарциномы прямой и ободочной кишки и глиобластомы. Таким образом, например, применение последовательностей SEQ ID NO:56 и 64 или SEQ ID NO:73 и 74 (включая входящие в них линкерные последовательности), может обеспечивать неожиданное повышение противоопухолевой эффективности in vivo.

В различных вариантах связывающий белок, раскрытый в настоящем описании, имеет требуемую аффинность связывания, способность к блокированию и/или активность в нейтрализации VEGF и/или DLL4, например, на уровнях, примерно сравнимых с уровнями, наблюдаемыми в случае антител против VEGF (например, AVASTIN®) или DLL4 (например, антитело h1A11.1). В некоторых вариантах связывающий белок имеет повышенную аффинность, способность к блокированию и/или активность в нейтрализации VEGF и/или DLL4 по сравнению сл связывающими белками DVD-Ig, содержащими другие последовательности вариабельных доменов или линкеры. В некоторых вариантах связывающий белок содержит функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержащий три CDR из последовательности SEQ ID NO:41 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:42, и функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержащий три CDR из последовательности SEQ ID NO:39 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:40; или содержит функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержащий последовательности SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:42, и функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержащий последовательности SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO:40; или содержит последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64; или содержит последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74. Например, связывающий белок (например, связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74) может обладать способностью связываться с VEGF с константой диссоциации (K_D) не более чем приблизительно 7,0×10^-10 М, которую измеряют, используя резонанс поверхностного плазмона, и/или блокирующей VEGF активностью с IC50 не более чем приблизительно 3,8 нМ, которую измеряют в конкурентном ELISA VEGFR1; и/или способен связываться с DLL4 с константой диссоциации (K_D) не более чем приблизительно 1,0×10^-8 M, которую измеряют с использованием резонанса поверхностного плазмона, и/или может обладать блокирующей DLL4 активностью с IC50 не более чем приблизительно 1,09 нМ, которую измеряют в конкурентном ELISA Notch.

В некоторых вариантах связывающий белок (например, связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74) может иметь повышенную активность в нейтрализации DLL4, в том числе и в случае присутствия VEGF, по сравнению со смесью антител к VEGF и DLL4 (например, исходных антител, используемых для получения вариабельных доменов для связывающего белка). В некоторых вариантах связывающий белок может иметь повышение на порядок активности в нейтрализации DLL4, также и в случае присутствия VEGF, по сравнению со смесью антител к VEGF и DLL4 (например, исходных антител, используемых для получения вариабельных доменов для связывающего белка). Например, в таблице 24 показано, что связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74, повышение на порядок активности в нейтрализации DLL4, в том числе и в присутствии по меньшей мере приблизительно 1,2 нМ VEGF (например, по меньшей мере приблизительно 1,2, 1,5, 2, 2,5, 5, 10, 50, 150 или больше), по сравнению со смесью антител к VEGF и DLL4 (исходных антитела, используемых для получения вариабельных доменов для связывающего белка). Такое свойство нейтрализовать DLL4 может быть полезным, поскольку в ситуации лечения опухоли in vivo уровни VEGF обычно более высокие вблизи опухоли, чем в общей циркуляции, что обеспечивает как улучшенное направление к мишени, так и повышенную активность в нейтрализации функционального DLL4 в месте опухоли.

В различных вариантах связывающий белок (например, связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74) проявляет улучшенные свойства, например, повышенную безопасность, повышенную стабильность, более высокую активность, пониженные воспалительные и иммунные ответы или другие полезные для терапии человека in vivo свойства, по сравнению с другими средствами лечения злокачественных опухолей и/или васкуляризированных опухолей. Средства лечения, подходящие для сравнения, могут включать введение низкомолекулярного противоопухолевого средства или антитела против VEGF (например, авастина®) и/или DLL4 (например, антитела h1A11.1), или связывающего белка DVD-Ig, содержащего другие последовательности вариабельного домена и/или линкеры. В некоторых вариантах связывающий белок проявляет улучшенные свойства по сравнению с современным стандартом лечения злокачественной опухоли и/или васкуляризированной опухоли. Например, связывающий белок может иметь улучшенную кинетику связывания, превосходную терапевтическую эффективность in vivo, улучшенную способность подвергаться обработке при приготовлении препарата (включая уменьшенную агрегацию и повышенную стабильность при хранении), улучшенную фармакокинетику, пониженный воспалительный или иммунный ответ и/или повышенные уровни экспрессии в клетке-хозяине.

В некоторых вариантах связывающий белок (например, связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74), вызывает превосходящие (например, аддитивные и/или сверхаддитивные) эффекты в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами, по сравнению с анти-VEGF-антителом или анти-DLL4-антителом в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами или по сравнению со связывающим белком DVD-Ig, содержащим другие последовательности вариабельных доменов и/или линкеры, в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами. Например, превосходящими связывающими свойствами могут быть свойства, указанные в таблицах 27-30 и 34. Например, связывающий белок может вызывать по меньшей мере приблизительно 50% или большее (например, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150% или большее) ингибирование роста опухоли или задержку роста опухоли после введения отдельно или в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами, по сравнению с необработанной опухолью. Противоопухолевым средством может быть, например, один или несколько из следующих средств; иринотекан, FOLFIRI, темозоломид, гемцитабин, паклитаксел, 5-FU и капецитабин или любое другое низкомолекулярное или биологическое средство, применяемое при лечении конкретной злокачественной опухоли. Связывающий белок отдельно или в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами можно применять в качестве лекарственного средства для лечения, например, рака ободочной кишки, глиобластомы, рака поджелудочной железы или рака молочной железы.

В одном варианте связывающий белок с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig) содержит две первых и две вторых полипептидных цепи, которые описаны в предыдущем абзаце (т.е. содержит четыре полипептидных цепи), при этом каждая из полипептидных цепей независимо содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает линкер, X2 означает Fc-область, и n равен 0 или 1. В некоторых вариантах первая цепь представляет собой тяжелую цепь и спарена со второй цепью, которая представляет собой легкую цепь. Такой связывающий белок DVD-Ig содержит четыре функциональных связывающих мишень участка. В некоторых вариантах линкеры X1 в первой и второй полипептидных цепях являются одинаковыми или разными. В некоторых вариантах связывающие белки DVD-Ig содержат по меньшей мере две последовательности вариабельных доменов (например, VD1 и VD2), способных связывать два или больше эпитопов (например, два, три или четыре) одного и того же или разных белков в любой ориентации. В некоторых вариантах VD1 и VD2 выбирают независимо. В одном варианте каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и VD2 содержит три CDR из последовательности SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:39, и вариабельные домены легкой цепи VD1 и VD2 содержат три CDR в последовательности SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:40. В другом варианте связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и VD2 содержит последовательности SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:39, и каждый из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и VD2 содержит последовательности SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:40.

В другом варианте связывающий белок с двойным вариабельным доменом содержит последовательность тяжелой цепи и легкой цепи, которая показана в таблице 2, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:39 и/или по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:40.

В следующем варианте любой из вариантов из тяжелой цепи, легкой цепи, двух цепей или четырех цепей содержит по меньшей мере один линкер X1, включающий линкеры, выбранные из последовательностей SEQ ID NO:1-38. В одном варианте X2 означает Fc-область. В другом варианте X2 означает вариант Fc-области.

В еще одном варианте Fc-область, если она присутствует в первом полипептиде, представляет собой Fc-область с нативной последовательностью или Fc-область с вариантом последовательности. В еще одном варианте Fc-область представляет собой Fc-область из IgG1, Fc-область из IgG2, Fc-область из IgG3, Fc-область из IgG4, Fc-область из IgA, Fc-область из IgM, Fc-область из IgE или Fc-область из IgD. В некоторых вариантах Fc-область представляет собой Fc-область из мутанта LALA IgG1 человека, который является мутантом антитела b12, которое обеспечивает защиту от вируса ВИЧ.

Предлагается способ получения связывающего белка, который связывает два разных белка-мишени. В одном варианте способ получения связывающего белка включает в себя стадии: a) получения первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которая связывает первый эпитоп; b) получения второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которая связывает второй эпитоп; c) получения конструкции(ий), кодирующей любой из связывающих белков, описанных в настоящей публикации; и d) экспрессии полипептидных цепей так, чтобы был создан связывающий белок, который связывает первый и второй эпитопы.

В любом из описанных в настоящей публикации вариантов вариабельный домен тяжелой цепи VD1, ели он присутствует, и вариабельный домен легкой цепи, если он присутствует, могут быть из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; вариабельный домен тяжелой цепи VD2, если он присутствует, и вариабельный домен легкой цепи, если он присутствует, могут быть из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части. Первое и второе исходные антитела могут быть одинаковыми или разными.

В одном варианте первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген, и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген. В одном варианте первый и второй антигены являются разными антигенами. В другом варианте первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген с другой эффективностью, отличной от эффективности, с которой второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген. В еще одном варианте первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген с аффинностью, отличной от аффинности, с которой второй исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген.

В другом варианте первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть являются антителами человека, CDR-привитыми антителами, гуманизированными антителами и/или антителами с созревшей аффинностью.

В другом варианте связывающий белок обладает по меньшей мере одним требуемым свойством, которым обладает первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть или второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть. Альтернативно первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере одним требуемым свойством, которое проявляется связывающим белком. В одном варианте требуемым свойством является один или несколько параметров антитела. В другом варианте параметрами антитела являются специфичность по отношению к антигену, аффинность по отношению к антигену, активность, биологическая функция, узнавание эпитопа, стабильность, растворимость, эффективность продуцирования, иммуногенность, фармакокинетика, биологическая доступность, перекрестная реактивность с тканями или связывание ортологичных антигенов. В одном варианте связывающий белок является поливалентным. В другом варианте связывающий белок является полиспецифичным. Поливалентные и/или полиспецифичные связывающие белки, описанные в настоящей публикации, обладают требуемыми свойствами, в частности с терапевтической точки зрения. Например, поливалентный и/или полиспецифичный связывающий белок может (1) интенализоваться (и/или катаболизироваться) быстрее, чем бивалентное антитело, клеткой, экспрессирующей антиген, с которым антитела связываются; (2) быть агонистом связывающего белка; и/или (3) индуцировать гибель клеток и/или апоптоз клетки, экспрессирующей антиген, с которым поливалентный связывающий белок способен связываться. «Исходное антитело», которое обеспечивает по меньшей мере одну специфичность связывания антигена для поливалентного и/или полиспецифичного связывающего белка, может представлять собой антитело, которое интернализуется (и/или катаболизируется) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым антитело связывается; и/или может быть агонистическим, индуцирующим клеточную гибель и/или индуцирующим апоптоз антителом, и поливалентный и/или полиспецифичный связывающий белок, который описан в настоящей публикации, может иметь улучшение(ия) одного или нескольких таких свойств. Кроме того, исходное антитело может не иметь любое одно или несколько из указанных свойств, но может приобретать одно или несколько из них в случае конструирования в виде поливалентного связывающего белка, который описан в настоящей публикации.

В другом варианте связывающий белок имеет константу скорости образования комплекса (K_on) с одной или несколькими мишенями по меньшей мере приблизительно 10² М^-1⋅с^-1; по меньшей мере приблизительно 10³ М^-1⋅с^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁴ М^-1⋅с^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁵ М^-1⋅с^-1; или по меньшей мере приблизительно 10⁶ М^-1⋅с^-1, которую измеряли, используя резонанс поверхностного плазмона. В одном варианте связывающий белок имеет константу скорости образования комплекса (K_on) с одной или несколькими мишенями от приблизительно 10² М^-1⋅с^-1до приблизительно 10³ М^-1⋅с^-1; от приблизительно 10³ М^-1⋅с^-1до приблизительно 10⁴ М^-1⋅с^-1; от приблизительно 10⁴ М^-1⋅с^-1 до приблизительно 10⁵ М^-1⋅с^-1; или от приблизительно 10⁵ М^-1⋅с^-1 до приблизительно 10⁶ М^-1⋅с^-1, которую измеряли, используя резонанс поверхностного плазмона.

В другом варианте связывающий белок имеет константу скорость распада комплекса (K_off) с одной или несколькими мишенями не более чем приблизительно 10^-2 с^-1; не более чем приблизительно 10^-3 с^-1; не более чем приблизительно 10^-4 с^-1; не более чем приблизительно 10^-5 с^-1; или не более чем приблизительно 10^-6 с^-1, которую измеряли, используя резонанс поверхностного плазмона. В одном варианте связывающий белок имеет константу скорости распада комплекса (K_off) c одной или несколькими мишенями от приблизительно 10^-2 с^-1 до приблизительно 10^-3 с^-1; от приблизительно 10^-3 с^-1 до приблизительно 10^-4 с^-1; от приблизительно 10^-4 с^-1 до приблизительно 10^-5 с^-1; или от приблизительно 10^-5 с^-1 до приблизительно 10^-6 с^-1, которую измеряли, используя резонанс поверхностного плазмона.

В другом варианте связывающий белок имеет равновесную константу диссоциации (K_D) по отношению к одной нескольким мишеням не более чем приблизительно 10^-7 М; не более чем приблизительно 10^-8 М; не более чем приблизительно 10^-9 М; не более чем приблизительно 10^-10 М; не более чем приблизительно 10^-11 М; или не более чем приблизительно 10^-12 М. В одном варианте связывающий белок имеет равновесную константу диссоциации (K_D) по отношению к мишеням от приблизительно 10^-7 M до приблизительно 10^-8 М; от приблизительно 10^-8 М до приблизительно 10^-9 М; от приблизительно 10^-9 М до приблизительно 10^-10 М; от приблизительно 10^-10 М до приблизительно 10^-11 М; или от приблизительно 10^-11 М до приблизительно 10^-12 М.

В некоторых вариантах анти-DLL4/анти-VEGF-связывающий белок проявляет повышенную активность (например, повышенную способность мешать, ингибировать и/или нейтрализовать активность DLL4 и/или VEGF) по сравнению с анти-DLL4- или анти-VEGF-антителом. В некоторых вариантах активность связывающего белка можно оценить в любом анализе, используемом для оценки активности VEGF и/или DLL4, например, в анализе связывания VEGF и/или DLL4 в ELISA, анализе BIACORE™, анализе DLL4-Notch-репортера, анализе стимулированной VEGF пролиферации/жизнеспособности эндотелиальных клеток или в любом другом анализе, известном специалисту в данной области. В некоторых вариантах связывающий белок проявляет повышенную активность по отношению к DLL4 в присутствии VEGF.

В другом варианте предлагается конъюгат, содержащий любой из связывающих белков, описанных в настоящей публикации, и дополнительно содержащий определенное средство. В одном варианте средством является молекула для иммуноадгезии, визуализующее средство, терапевтическое средство или цитотоксическое средство. В одном варианте визуализирующим средством является радиоактивная метка, фермент, флуоресцирующая метка, люминесцентная метка, биолюминесцентная метка, магнитная метка или биотин. В другом варианте радиоактивной меткой является ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho или ¹⁵³Sm. В еще одном варианте терапевтическим или цитотоксическим средством является антиметаболит, алкилирующее средство, антибиотик, фактор роста, цитокин, противоангиогенное средство, антимитотическое средство, антрациклин, токсин или апоптозное средство. В некоторых вариантах средством является одно или несколько из следующих средств: иринотекан, лейковорин, 5-FU, темозоломид, гемцитабин и паклитаксел. В одном варианте средством является иринотекан. В одном варианте средством является лейковорин. В одном варианте средством является 5-FU. В одном варианте средство является иринотекан, лейковорин и 5-FU. В одном варианте средством является темозоломид. В одном варианте средством является гемцитабин. В одном варианте средством является паклитаксел.

В другом варианте конъюгат содержит связывающий белок и лекарственное средство. В одном варианте связывающий белок в конъюгате содержит первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из первой и второй полипептидных цепей независимо содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает линкер, и X2 означает Fc-область, при этом домены VD1 в первой и второй полипептидных цепях образуют первый функциональный связывающий мишень участок, и домены VD2 в первой и второй полипептидных цепях образуют второй функциональный связывающий мишень участок, и при этом связывающий белок способен связывать VEGF и DLL4. В некоторых вариантах домены VD1 и VD2 содержат последовательности CDR или вариабельных доменов из любой из последовательностей, описанных в таблице 2, спаренных и распределенных с образованием функциональных связывающих участков для VEGF и DLL4. В одном варианте лекарственное средство в конъюгате выбрано из группы, состоящей из ингибитора митоза, противоопухолевого антибиотика, иммуномодулирующего средства, вектора для генной терапии, алкилирующего средства, антиангиогенного средства, антиметаболита, содержащего бор средства, хемопротекторного средства, гормона, противогормонального средства, кортикостероида, фотоактивного терапевтического средства, олигонуклеотида, радионуклидного средства, ингибитора топоизомеразы, ингибитора тирозинкиназы и радиосенсибилизатора. В другом варианте лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из иксемпры, доластатина 10, доластатина 15, ауристатина E, ауристатина PE, монометилауристатина D (MMAD или производного ауристатина D), монометилауристатина E (MMAE или производного ауристатина E), монометилауристатина F (MMAF или производного ауристатина F), фенилендиамина ауристатина F (AFP), ауристатина EB (AEB), ауристатина EFP (AEFP), сложного эфира AE 5-бензоилвалериановой кислоты (AEVB), метотрексата, даунорубицина, винкристина, мейтанзина, мейтанзинола, сложных C-3-эфиров мейтанзинола, ансамитоцина P1, ансамитоцина P2, ансамитоцина P3, ансамитоцина P4, доцетаксела, паклитаксела, наночастиц паклитаксела, сульфата виндезина, винкристина, винбластина, винорелбина, актиномицинов, актиномицина D, антрамицина, чикамицина A, DC-18, мазетрамицина, неотрамицина A, неотрамицина B, протракарцина B, SG2285, сибаномицина, сибиромицина, антрациклинов, даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина, калихеамицинов, γ₁’,α₂’,α₃’,N-ацетил-γ₁’, PSAG, θ’₁, дуокармицинов, адозелезина, бизелезина и карзелезина, блеомицина, митомицина, пликамицина, бациллы Кальмета-Герена (БЦЖ), левамизола, противоопухолевых вакцин, рекомбинантной бивалентной вакцины против вирусов папилломы человека (HPV) типов 16 и 18, рекомбинантной квадривалентной вакцины против вирусов папилломы человека (HPV) типов 6, 11, 16 и 18, сипулейцела-T, цитокинов, паратиреоидного гормона; тироксина; инсулина; проинсулина; релаксина; прорелаксина; гликопротеидных гормонов, таких как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующего гормона (TSH) и лютеинизирующего гормона (LH), фактора роста печени; фактора роста фибробластов, пролактина, плацентарного лактогена, фактора некроза опухолей, мюллеровой ингибирующей субстанции, мышиного ассоциированного с гонадотропином пептида, ингибина, активина, фактора роста эндотелия сосудов, интегрина, тромбопоэтина (TPO), факторов роста нервов, таких как NGF, фактора роста тромбоцитов, трансформирующих факторов роста (TGF), инсулиноподобного фактора роста-I и -II, эритропоэтина (EPO), остеоиндуктивных факторов, интерферонов, таких как интерферон α, β и γ, колониестимулирующих факторов (CSF), CSF гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и CSF гранулоцитов (G-CSF), интерлейкинов (IL), таких как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, фактора некроза опухолей и других полипептидных факторов, включая LIF и kit-лиганд (KL), колониестимулирующих факторов, эритропоэтина (эпоэтина), филграстима, сарграмостина, промегапоэтина, опрелвекина, иммуномодулирующих генных терапевтических средств, нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный, терапевтический ген, который используют для замены мутантного или имеющего иным образом нарушенную функцию (например, укороченного) гена, ассоциированного со злокачественной опухолью, нуклеиновой кислоты, которая кодирует или иным образом обеспечивает продукцию терапевтического белка для лечения злокачественной опухоли, алкилсульфонатов, бусульфана, азотистых ипритов, хлорамбуцила, циклофосфамида, эстрамустина, ифосфамида, мехлорэтамина и мелфалана, нитрозомочевин, кармустина, фотемустина, ломустина, нимустина, стрептохоцина, триазинов и гидразинов, дакарбазина, прокарбазина, темозоломида, этилениминов, тиотепа, диазиквона, митомицина C, производных метиламина, эпоксидов, алтретамина, диангидрогалактитола, дибромдулцитола, ангиостатина, ABX EFG, C1-1033, PKI-166, вакцины EGF, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225, OSI-774, эрлотиниба, ангиостатина, аррестина, эндостатина, BAY 12-9566 и 5-фторурацила или доксорубицина, канстатина, карбоксиамидотриозола и с паклитакселом, EMD121974, S-24, витаксина, диметилксантенонуксусной кислоты, IM862, интерлейкина-12, интерлейкина-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, ангиозима, IMC-1C11, неовастата, маримастата, приномастата, BMS-275291, COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, с паклитакселом, с гемцитабином и цисплатином и с иринотеканом и цисплатином и с излучением, текогалана, темозоломида и ПЭГ-интерферона a2b, тетратиомолибдата, TNP-470, талидомида, CC-5013 и с таксотером, тумстатина, 2-метоксиэстрадиола, ловушки VEGF, ингибиторов mTOR (дефоролимуса, эверолимуса и темсиролимуса), ингибиторов тирозинкиназы (например, иматиниба, гефитиниба, дасатиниба, сунитиниба, нилотиниба, лапатиниба, сорафениба, фосфоинозитид-3-киназ (PI3K), антагонистов фолиевой кислоты, метотрексата, 4-аминофолиевой кислоты, лометрексола, пеметрекседа, триметрексата, антагонистов пиримидина, азацитидина, капецитабина, цитарабина, децитабина, 5-фторурацила, 5-втор-2’-дезоксиуридин-5’-фосфата, 5-фторуридин-трифосфата, гемцитабина, фоксуридина, антагониста пурина азатиоприна, кладрибина, меркаптопурина, флударабина, пентостатина, 6-тиогуанина, ингибиторов аденозиндезаминазы, кладрибина, флударабина, неларбина, пентостатина, борофицина, бортезомиба, цитопротекторных средств, амифостина, дексразоксана, месны, андрогенов, эстрогенов, ацетата медроксипрогестерона, прогестинов, аминоглутетимида, анастрозола, бикалутамида, хлортрианизенов, ацетата ципротерона, дегареликса, эксеместана, флутамида, фулвестранта, госерелина, летрозола, лейпролида, лупрона, ацетата медроксипрогестерона, ацетата мегестрола, тамоксифена, трипторелина, аспарагиназы, дакарбазина, оксимочевины, левамизола, митотана, прокарбазана, третиноина, глюкокортикоидов, преднизона, хромагенов, красителей, антисмысловых олигонуклетидов, либо встречающихся в природе, либо синтезированных с использованием стандартных и/или нестандартных нуклеотидов (включая интерференцию РНК (РНК-и)), двунитевой РНК (дн-РНК), малой интерферирующей РНК (ми-РНК), микро-РНК (микро-РНК), аптамеров, CpG-олигонуклеотидов, рибозимов, ангиозима, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹¹At, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³³P, ⁴⁷Sc, ¹¹¹Ag, ⁶⁷Ga, ¹⁴²Pr, ¹⁵³Sm, ¹⁶Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁹Re, ¹²Pb, ²²³Ra, ²²⁵Ac, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ⁷⁷As, ⁸⁹Sr, ⁹⁹Mo, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁹Pm, ¹⁶⁹Er, ¹⁹⁴Ir, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²¹¹Pb, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m, Ir-192, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Fm-255, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁷⁵Br, ¹⁹⁸Au, ²²⁴Ac, ¹²⁶I, ¹³³I, ⁷⁷Br, ^113mIn, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Ru, ¹⁰⁷Hg, ²⁰³Hg, ^121mTe, ^122mTe, ^125mTe, ¹⁶⁵Tm, ¹⁶⁷Tm, ¹⁶⁸Tm, ¹⁹⁷Pt, ¹⁰⁹Pd, ¹⁰⁵Rh, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Ho, ¹⁹⁹Au, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵¹Cr, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ²⁰¹TI, ²²⁵Ac, ⁷⁶Br, ¹⁶⁹Yb, таксана, цисплатина, метронидазола, мисонидазола, десметилмисонидазола, пимонидазола, этанидазола, ниморазола, митомицина C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, никотинамида, 5-бромдезоксиуридина (BUdR), 5-йоддезоксиуридина (BUdR), бромдезоксицитидина, фтордезоксиуридина (FUdR), оксимочевины, производных гематопорфирина, фотофрина(r), производных бензопорфирина, NPe6, этиопорфирина олова (SnET2), феоборбида a, бактериохлорофилла a, нафталоцианинов, фталоцианинов, фталоцианина цинка, камптотецинов, иринотекана, топотекана, амсакрина, даунорубицина, доксорубицина, эпиподофиллотоксинов, эллиптицинов, эпирубицина, этопозида, разоксана, тенипозида, акситиниба, босутриниба, цедираниба, дасатиниба, эрлотиниба, гефитиниба, иматиниба, лапатиниба, лестауротиниба, нилотиниба, семаксаниба, сунитиниба, вандетаниба, абрина, цепи A абрина, альфа-токсина, белков Aleurites fordii, аматоксина, кротина, курцина, белков диантина, дифтерийного токсина, цепи A дифтерийного токсина, не связывающихся активных фрагментов дифтерийного токсина, дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы), гелонина, митогеллина, цепи A модеццина, ингибитора Memordica charantia, неомицина, онконазы, феномицина, белков Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), противовирусного белка лаконоса, эндотоксина Pseudomonas, экзотоксина Pseudomonas, цепи A экзотоксина Pseudomonas aeruginosa, рестриктоцина, рицина, цепи A рицина, рибонуклеазы (РНК-азы), ингибитора Saponaria officinalis, сапорина, альфа-сарцина, стафиллококкового энтеротоксина-A, столбнячного токсина, цисплатина, карбоплатина и оксалиплатина (элоксатина, Sanofi Aventis), ингибиторов протеосом, PS-341, ингибиторов HDAC, вориностата, белиностата, энтиностата, моцетиностата, панобиностата, ингибиторов ЦОГ-2, замещенных мочевин, ингибиторов белков теплового шока, гелданамицина, адренокортикальных супрессоров, трикотеценов, A12, 19D12, Cp751-871, H7C10, альфа-IR3, ScFV/FC, EM/164, матузумаба, эрбитукса, вектибикса, мАт 806, нимотуксимаба, AVEO, AMG102, 5D5 (OA-5d5), H244G11, Ат №14 (MM 121-14), герцептина, 1B4C3; 2D1D12, NVP-AEW541-A, BMS-536924 (1H-бензоимидазол-2-ил)-1H-пиридин-2-она), BMS-554417, циклолигана, TAE226, PQ401, иресса, CI-1033 (PD 183805), лапатиниба (GW-57206), тикерба, тарцева, PKI-166, PD-158780, EKB-569, тирфостина AG 1478 (4-(3-хлоранилино)-6,7-диметоксихиназолина), PHA665752, ARQ 197, капецитабина, 5-трифторметил-2’-дезоксиуридина, метотрексата натрия, ралтитрекседа, пеметрекседа, тегафура, цитозинарабинозида (цитарабина), 5-азацитидина, 6-меркаптопурина (меркаптопурина, 6-MP), азатиоприна, 6-тиогуанина, пентостатина, фосфата флударабина, кладрибина (2-CdA, 2-хлордезоксиаденозина), ингибитора рибонуклеотидредуктазы, циклофосфамида, неосара, ифосфамида, тиотепа, BCNU → 1,3-би(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевины, CCNU → 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевины (метил-CCNU), гексаметилмеламина, бусульфана, прокарбазина HCl, дакарбазина (DTIC), хлорамбуцила, мелфалана, карбоплатина, оксалиплатина, доксорубицина HCl, цитрата даунорубицина, митоксантрона HCl, актиномицина D, этопозида, топотекана HCl, тенипозида, иринотекана HCl (CPT-II), винкристина, сульфата винбластина, тартрата винорелбина, сульфата виндезина, паклитаксела, доцетаксела, абраксана, иксабепилона, мезилата иматиниба, малата сунитиниба, тозилата сорафениба, моногидрата гидрохлорида нилотиниба, L-аспарагиназы, альфа-интерферона, авастина, IL-2, алдеслейкина, пролейкина, IL-12, цитрата торемифена, фулвестранта, ралоксифена HCl, анастразола, летрозола, фадрозола (CGS 16949A), эксеместана, ацетата лейпролида, лупрона, ацетата госерелина, памоата трипторелина, бучерелина, нафарелина, сетрореликса, бикалутамида, нилутамида, ацетата мегестрола, аналогов соматостатина, пренднизолона, дексаметазона, кетоконазола, сиролимуса, темсиролимуса (CCI-779), дефоролимуса (AP23573), иринотекана; лейковорина; FOLFIRI; 5-FU; эналаприла; нифедипина; клонидина; темозоломида; гемцитабина; капецитабина; падитаксела; регорафениба; пертузумаба и эверолимуса (RAD00I).

В некоторых вариантах раскрыта композиция, содержащая один или несколько связывающих белков, которые описаны в настоящей публикации, и одно или несколько дополнительных средств, например, химиотерапевтическое средство. Например, композиция может содержать один или несколько связывающих белков в растворе с одним или несколькими дополнительными средствами. В некоторых вариантах средство представляет собой одно или несколько из следующих средств: иринотекан, лейковорин, 5-FU, темозоломид, гемцитабин и паклитаксел. В одном варианте средством является иринотекан. В одном варианте средством является лейковорин. В одном варианте средством является 5-FU. В одном варианте средством является иринотекан, лейковорин и 5-FU. В одном варианте средством является темозоломид. В одном варианте средством является гемцитабин. В одном варианте средством является паклитаксел.

В другом варианте связывающий белок является кристаллизованным связывающим белком и существует в виде кристалла. В одном варианте кристалл представляет собой не содержащий носителя кристалл с фармацевтически контролируемым высвобождением. В другом варианте кристаллизованный связывающий белок имеет более длительное время полужизни in vivo, чем растворимый аналог связывающего белка. В еще одном варианте кристаллизованный связывающий белок сохраняет биологическую активность.

В другом варианте связывающий белок, описанный в настоящей публикации, гликозилирован. Например, картина гликозилирования представляет собой картину гликозилирования у человека.

Также предлагается изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая любой из связывающих белков, раскрытых в настоящем описании. В следующем варианте предлагается вектор, содержащий изолированную нуклеиновую кислоту, раскрытую в настоящем описании, при этом вектором является pcDNA; pTT (Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(2); pTT3 (pTT с дополнительным сайтом множественного клонирования; pEFBOS (Mizushima and Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO; pEF6 TOPO; pBOS; pHybE; или pBJ. В одном варианте вектором является вектор, раскрытый в публикации патента США № 20090239259.

В другом аспекте клетка-хозяин трансформирована вектором, раскрытым в настоящем описании. В одном варианте клеткой-хозяином является прокариотическая клетка, например, E. coli. В другом варианте клеткой-хозяином является эукариотическая клетка, например, клетка простейшего, клетка животного, клетка растения или клетка гриба. В одном варианте клеткой-хозяином является клетка млекопитающего, включая без ограничения CHO, COS, NS0, SP2, PER.C6, или клетка гриба, такая как Saccharomyces cerevisiae, или клетка насекомого, такая как Sf9. В одном варианте два или больше связывающих белков, например, с разными специфичностями, получают в одной рекомбинантной клетке-хозяине. Например, экспрессия смеси антител была названа Oligoclonics™ (Merus.B.V., The Netherlands) и описана в патентах США № 7262028 и 7429486.

Предлагается способ получения связывающего белка, раскрытого в настоящем описании, включающий в себя культивирование любой из клеток-хозяев, раскрытых в настоящем описании, в культуральной среде в условиях, достаточных для продуцирования связывающего белка. В одном варианте 50-75% связывающего белка, полученного таким способом, представлено тетравалентным связывающим белком с двойной специфичностью. В другом варианте 75-90% связывающего белка, полученного таким способом, представлено тетравалентным связывающим белком с двойной специфичностью. В другом варианте, 90-95% полученного связывающего белка представлено тетравалентным связывающим белком с двойной специфичностью.

В одном варианте предлагается композиция для высвобождения связывающего белка, при этом композиция содержит кристаллизованный связывающий белок, ингредиент и по меньшей мере один полимерный носитель. В одном варианте полимерным носителем является поли(акриловая кислота), поли(цианоакрилат), поли(аминокислота), поли(ангидрид), поли(депсипептид), сложный поли(эфир), поли(молочная кислота), сополимер (молочной-гликолевой кислоты) или PLGA, поли(b-гидроксибутират), поли(капролактон), поли(диоксанон); поли(этиленгликоль), поли((гидроксипропил)метакриламид), поли[(органо)фосфазен], сложный поли(ортоэфир), поли(виниловый спирт), поли(винилпирролидон), сополимер малеиновый ангидрид-алкилвиниловый эфир, полиол плюроник, альбумин, альгинат, целлюлоза, производное целлюлозы, коллаген, фибрин, желатин, гиалуроновая кислота, олигосахарид, гликаминогликан, сульфатированный полисахарид их смеси и сополимеры. В одном варианте ингредиентом является альбумин, сахароза, трегалоза, лактит, желатин, гидроксипропил-β-циклодекстрин, метоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Другой вариант относится к способу лечения млекопитающего, включающему в себя стадию введения млекопитающему эффективного количества композиции, раскрытой в настоящем описании.

Предлагается фармацевтическая композиция, содержащая связывающий белок, раскрытый в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство для лечения расстройства. Например, дополнительное средство может представлять собой терапевтическое средство, химиотерапевтическое средство; средство для визуализации, цитотоксическое средство, ингибитор ангиогенеза, ингибитор киназы (включая, но без ограничения, ингибитор KDR и TIE-2), модулятор молекулы костимуляции (включая, но без ограничения, анти-B7.1, анти-B7.2, CTLA4-Ig, анти-CD20), блокатор молекулы адгезии (включая, но без ограничения, анти-LFA-1-антитело, антитело против E/L-селектина, низкомолекулярный ингибитор), антитело против цитокина или его функциональный фрагмент (включая, но без ограничения, анти-IL-18, анти-TNF или антитело против IL-6/рецептора цитокина), анти-VEGF-мАт; анти-DLL4-мАт; метотрексат, циклоспорин, рапамицин, FK506, регистрируемую метку или репортер, антагонист TNF, противоревматическое средство, миорелаксант, наркотик, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (НПВС), анальгетик, анестетик, седативное средство, локальный анестетик, блокатор нервно-мышечного проведения, противомикробное средство, противопсориатическое средство, кортикостероид, анаболический стероид, эритропоэтин, иммунизацию, иммуноглобулин, иммуносупрессор, гормон роста, гормонозаместительное лекарственное средство, радиофармацевтическое средство, антидепрессант, антипсихотическое средство, стимулятор, лекарственное средство против астмы, бета-агонист, ингаляционный стероид, эпинефрин или аналог, цитокин или антагонист цитокина. В некоторых вариантах дополнительным терапевтическим средством является химиотерапевтическое средство. В некоторых вариантах дополнительным средством является одно или несколько из следующих свойств: иринотекан, лейковорин, 5-FU, темозоломид, гемцитабин и паклитаксел. В одном варианте средством является иринотекан. В одном варианте средством является лейковорин. В одном варианте средством является 5-FU. В одном варианте средством является иринотекан, лейковорин и 5-FU. В одном варианте средством является темозоломид. В одном варианте средством является гемцитабин. В одном варианте средством является паклитаксел.

В различных вариантах предлагается способ диагностики и/или лечения человека, страдающего от расстройства, которое может быть диагностировано и/или которое можно лечить посредством целенаправленного воздействия на мишени VEGF и/или DLL4 (например, любого расстройства ангиогенеза или любого другого расстройства, ассоциированного с аномальной экспрессией VEGF и/или DLL4), включающий в себя введение человеку связывающего белка, раскрытого в настоящем описании, так, чтобы активность мишени или мишеней у человека была ингибирована, и один или несколько симптомов были ослаблены или было осуществлено лечение. Связывающие белки, предлагаемые в настоящем описании, можно применять для диагностики и/или лечения людей, страдающих от первичных и метастатических злокачественных опухолей, включая карциномы молочной железы, ободочной кишки, прямой кишки, легкого, ротовой части глотки, гортанной части глотки, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, мочевыводящих путей (включая почки, мочевой пузырь и уротелий), женских половых путей (включая шейку матки, матку и яичники, а также хориокарциному и гестационную трофобластическую болезнь), мужских половых путей (включая опухоли простаты, семенных пузырьков, семенников и зародышевых клеток), эндокринных желез (включая щитовидную железу, надпочечники и гипофиз) и кожи, а также гемангиомы, меланомы, саркомы (включая саркомы костей и мягких тканей, а также саркому Капоши), опухоли головного мозга, нервов, глаз и оболочки головного мозга (включая астроцитомы, глиомы, глиобластомы, ретинобластомы, нейромы, нейробластомы, шванномы и менингиомы), опухоли, возникающие в результате гематопоэтических злокачественных новообразований, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), B-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз, ходжкинские и неходжкинские лимфомы, гематопоэтические злокачественные новообразования, саркому Капоши, злокачественную лимфому, злокачественный гистиоцитоз, злокачественную меланому, множественную меланому, паранеопластический синдром/гиперкальцемию при злокачественных новообразованиях или солидные опухоли.

В некоторых вариантах способ лечения злокачественной опухоли у пациента включает в себя введение одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, или их фармацевтической композиции. В одном варианте злокачественная опухоль представляет собой рак ободочной кишки. В одном варианте злокачественная опухоль представляет собой глиобластому. В одном варианте злокачественная опухоль представляет собой рак поджелудочной железы. В одном варианте злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы. В некоторых вариантах способы лечения злокачественной опухоли, включающие в себя введение одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, или их фармацевтической композиции, приводят к уменьшению роста опухоли или замедлению роста опухоли, которые по меньшей мере примерно эквивалентны ожидаемым аддитивным эффектам сочетания анти-VEGF антитела и анти-DLL4-антитела. В некоторых вариантах способы приводят к уменьшению роста опухоли или замедлению роста опухоли, которые являются более чем аддитивными (например, уменьшение больше, чем уменьшение, ожидаемое в случае аддитивности предполагаемых эффектов анти-VEGF-антитела и анти-DLL4-антитела).

В некоторых вариантах способ лечения злокачественной опухоли включает в себя введение одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, или их фармацевтической композиции в сочетании с одним или несколькими дополнительными средствами, например, химиотерапевтическим или биологическим средством. В некоторых вариантах средство представляет собой одно или несколько из следующих средств: регорафениб (STIVAGRA™), пертузумаб (PERJECTA™), иринотекан, лейковорин, 5-FU, темозоломид, гемцитабин и паклитаксел. В одном варианте средством является иринотекан. В одном варианте средством является лейковорин. В одном варианте средством является 5-FU. В одном варианте средством является иринотекан, лейковорин и 5-FU. В одном варианте средством является темозоломид. В одном варианте средством является гемцитабин. В одном варианте средством является паклитаксел. В некоторых вариантах способы лечения злокачественной опухоли, включающие в себя введение одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, или их фармацевтической композиции в сочетании с одним или несколькими дополнительными средствами приводят к уменьшению роста опухоли или замедлению роста опухоли, которые по меньшей мере эквивалентны ожидаемым аддитивным эффектам сочетания связывающего белка и дополнительного средства. В некоторых вариантах способы приводят к уменьшению роста опухоли или замедлению роста опухоли. Которые могут быть больше, чем аддитивные (например, уменьшение больше, чем уменьшение, ожидаемое в случае аддитивности предполагаемых эффектов связывающего белка и дополнительного средства).

В некоторых вариантах способ лечения рака ободочной кишки включает в себя введение одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, или их фармацевтической композиции, необязательно в сочетании с одним или несколькими средствами: иринотеканом, лейковорином и 5-FU. В некоторых вариантах способ лечения глиобластомы включает в себя введение одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, или их фармацевтической композиции, необязательно в сочетании с темозоломидом. В некоторых вариантах способ лечения рака поджелудочной железы включает в себя введение одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, или их фармацевтической композиции, необязательно в сочетании с гемцитабином. В некоторых вариантах способ лечения рака молочной железы включает в себя введение одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, или их фармацевтической композиции, необязательно в сочетании с паклитакселом.

В различных вариантах связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть введены в сочетании с одним или несколькими противогипертоническими средствами. Одно или несколько противогипертонических средств могут быть выбраны из группы, состоящей из диуретика, антагониста адренергического рецептора, блокатора кальциевых каналов, ингибиторов ренина, ингибиторов ACE, антагонистов рецептора ангиотензина II, сосудорасширяющих средств агонистов альфа-2. Например, средство может представлять собой одно или несколько из следующих средств: клонидин, эналаприл; нифедипин; метилдопа, гидралазин, празозин, резерпин, моксонидин, кванфацин, периндоприл/индапамид, лофексидин и метирозин. В некоторых вариантах связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть введены в сочетании с одним или несколькими антикоагулянтами. Например, антикоагулянтом может быть одно или несколько из следующих средств: варфарин, гепарин, низкомолекулярный гепарин, дальтепарин-натрий, аргатробан, бивалирудин, лепирудин и декстроза. В некоторых вариантах связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть введены в сочетании с одним или несколькими противогипертоническими средствами и одним или несколькими антикоагулянтами.

В различных вариантах связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для диагностики и/или лечения людей, страдающих от макулярной дегенерации (включая влажную форму), диабетической ретинопатии и/или любого другого заболевания или расстройства, характеризуемого чрезмерным ростом сосудов или отеком.

В одном варианте связывающие белки или их антигенсвязывающие части применяют для лечения злокачественной опухоли или предотвращения или ингибирования метастазов опухолей, описанных в настоящей публикации, либо используя их отдельно, либо в сочетании с лучевой терапией и/или химиотерапевтическими средствами.

В одном варианте химиотерапевтические или биологические средства, с которыми можно сочетать связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, включают следующие средства: 13-цис-ретиноевую кислоту; 2-CdA; 2-хлордезоксиаденозин; 5-азацитидин; 5-фторурацил; 5-FU; 6-меркаптопурин; 6-MP; 6-TG; 6-тиогуанин; абраксан; аккутан®; актиномицин-D; адриамицин®; адруцил®; афинитор®; агрилин®; ала-корт ®; алдеслейкин; алемтузумаб; ALIMTA; алитретиноин; алкабан-AQ®; алкеран®; полностью трансретиноевую кислоту; альфа-интерферон; алтретамин; аметоптерин; амифостин; аминоглутетимид; анагрелид; анандрон®; анастрозол; арабинозилцитозин; Ara-C аранесп®; аредиа®; аримидекс®; аромазин®; арранон®; триоксид мышьяка; арзерра™; аспарагиназу; ATRA; авастин®; азацитидин; BCG; BCNU; бендамустин; бевацизумаб; бексаротен; BEXXAR®; бикалутамид; BiCNU; бленоксан®; блеомицин; бортезомиб; бусульфан; бусульфекс®; C225; кальций-лейковорин; кампат®; камптосар®; камптотецин-11; капецитабин; карак™; карбоплатин; кармустин; кармустин в облатках; казодекс®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; церубидин®; цетуксимаб; хлорамбуцил; цисплатин; цитроворум фактор; кладрибин; кортизон; космеген®; CPT-11; циклофосфамид; цитадрен ®; цитарабин; липосомный цитарабин; цитозар-U®; цитоксан®; дакарбазин; дакоген; дактиномицин; дарбепоэтин альфа; дасатиниб; дауномицин; даунорубицин; гидрохлорид даунорубицина; липосомный даунорубицин; дауноксом®; декадрон; децитабин; дельта-кортеф®; дельтазон®; денилейкин; дифтитокс; депоцит™; дексаметазон; ацетат дексаметазона; фосфат натрия-дексаметазона; дексазон; декстразоксан; DHAD; DIC; диодекс; доцетаксел; доксил®; доксорубицин; липосомный доксорубицин; дроксиа™; DTIC; DTIC-Dome®; дуралон®; эфудекс®; элигард™; элленц™; элоксатин™; элспар®; эмцит®; эпирубицин; эпоэтин альфа; эрбитукс; эрлотиниб; L-аспарагиназу Erwinia; эстрамустин; этиол этопофос®; этопозид; фосфат этопозида; эулексин®; эверолимус; эвиста®; эксеместан; фарестон®; фаслодекс®; фемару®; филграстим; флуоксуридин; флудару®; флударабин; флуороплекс®; фторурацил; фторурацил (крем); флуоксиместерон; флутамид; фолиновую кислоту; FUDR®; фулвестрант; гефитиниб; гемцитабин; гемтузумаб озогамицин; гемзар; гливек™; глиадел® в облатке; GM-CSF; госерелин; колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF); колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (G-MCSF); галотестин®; герцептин®; гексадрол; гексален®; гексаметилмеламин; HMM; гикамтин®; гидреа®; ацетат гидрокорта®; гидрокортизон; фосфат натрия гидрокортизона; сукцинат натрия гидрокортизона; фосфат гидрокортона; гидроксимочевину; ибритумомаб; ибритумомаб тиуксетан; идамицин®; идарубицин ифекс®; интерферон-альфа; интерферон-альфа-2b (ПЭГ-конъюгат); ифосфамид; интерлекин-11 (IL-11); интерлейкин-2 (IL-2); мезилат иматиниба; карбоксамид имидазола; интрон A®; ирессу®; иринотекан; изотретиноин; иксабепилон; иксемпру™; KADCYCLA®; кидролазу (t); ланакорт®; лапатиниб; L-аспарагиназу; LCR; леналидомид; летрозол; лейковорин; лейкеран; лейкин™; лейпролид; лейрокристин; лейстатин™; липосомный Ara-C; жидкий Pred®; ломустин; L-PAM; L-сарколизин; лупрон®; лупрон депо®; матулан®; максидекс; мехлорэтамин; гидрохлорид мехлорэтамина; медралон®; медрол®; мегейс®; мегестрол; ацетат мегестрола; мелфалан; меркаптопурин; месну; меснекс™; метотрексат; метотрексат-натрий; метилпреднизолон; метикортен®; митомицин; митомицин-C; митоксантрон M-преднизол®; MTC; MTX; мустарген®; мустин; мутамицин®; милеран®; милоцел™; милотарг®; навелбин®; неларабин; неосар®; нейласта™; неймега®; нейпоген®; нексавар®; ниландрон®; нилотиниб; нилутамид; нипент®; азотистый иприт; новалдекс®; новантрон®; нплейт; октреотид; ацетат октреотида; офатумумаб; онкоспар®; онковин®; онтак®; онксал™; опрелвекин; орапред®; оразон®; оксалиплатин; паклитаксел; паклитаксел, связанный с белком; памидронат; панитумумаб; панретин® параплатин®; пазопаниб; педиапред®; ПЭГ-интерферон; пегаспаргазу; пегфилграстим; ПЭГ-интрон™; ПЭГ-L-аспарагиназу; пеметрексед; пентостатин; фенилаланин-иприт; платинол®; платинол-AQ®; преднизолон; преднизон; прелон®; прокарбазин; прокрит®; пролейкин®; пролифероспан 20 с имплантатом кармустина; пуринетол®; ралоксифен; ревиимид®; ревматрекс®; ритуксан®; ритуксимаб; роферон-A®; ромиплостим; рубекс®; гидрохлорид рубидомицина; сандостатин®; сандостатин LAR®; сарграмостин; солу-кортеф®; солу-медрол®; сорафениб; сприцел™; STI-571; стрептозоцин; SU11248; сунитиниб; сутент®; тамоксифен тарцева®; таргретин®; тасигну®; таксол®; таксотере®; темодар®; темозоломид темсиролимус; тенипозид; TESPA; талидомид; таломид®; тера-цис®; тиогуанин; тиогуанин таблоид®; тиофосфоамид; тиоплекс®; тиотепа; TICE®; топосар®; топотекан; торемифен; торисел®; тозитумомаб; трастузумаб; треанда®; третиноин; трексалл™; трисенокс®; TSPA; TYKERB®; VCR; вектибикс™; велбан®; велкад®; вепезид®; весаноид®; виадур™; видаза®; винбластин; сульфат винбластина; винкасар Pfs®; винкристин; винорелбин; тартрат винорелбина; VLB; VM-26; вориностат; вотриент; VP-16; вумон®; кселода®; заносар®; зевалин™; зинекард®; золадекс®; золедроновую кислоту; золинза; или зомета® и/или любое другое средство, специально не указанное в настоящем описании, мишенью которых являются сходные пути.

В другом варианте способы лечения пациента, страдающего от расстройства, включают в себя стадию введения одного или нескольких связывающих белков, раскрытых в настоящем описании, отдельно или введение связывающего белка(ов) до, одновременно или после введения второго средства. В конкретном варианте фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем описании, вводят пациенту посредством перорального, парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутричревного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного введения, введения внутрь ободочной кишки, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутримиокрадиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального введения, введения внутрь простаты, внутрилегочного, внутриректального, внутрипочечного, внутриретинального, интраспинального, интрасиновиального, интраторакального, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, буккального, подъязычного, интраназального или трансдермального введения.

В различных вариантах предлагаются способы определения присутствия, количества или концентрации одного или нескольких антигенов или их фрагментов в тестируемом образце, при этом один или несколько антигенов или их фрагментов представляют собой DLL4 и/или VEGF. Способ включает в себя анализ тестируемого образца в отношении антигена или его фрагмента с использованием иммуноанализа. В иммуноанализе (i) используют по меньшей мере один связывающий белок и по меньшей мере одну регистрируемую метку и иммуноанализ (ii) включает в себя сравнение сигнала, генерируемого регистрируемой меткой, в качестве прямого или опосредованного указания на присутствие, количество или концентрацию антигена или его фрагмента в тестируемом образце с сигналом, генерируемым в качестве прямого или опосредованного указания на присутствие, количество или концентрацию антигена или его фрагмента в контроле или калибровочном эталоне. Калибровочный эталон необязательно является частью калибровочных эталонов, в которой каждый из калибровочных эталонов отличается от других калибровочных эталонов в серии по концентрации антигена или его фрагмента. Способ может включать в себя (i) осуществление контакта тестируемого образца с по меньшей мере одним улавливающим средством, которое связывается с эпитопом на антигене или его фрагменте, для того, чтобы образовался комплекс, содержащий улавливающее средство и антиген или его фрагмент, (ii) осуществление контакта комплекса, содержащего улавливающее средство и антиген или его фрагмент с по меньшей мере одним средством для выявления, которое содержит регистрируемую метку и связывается с эпитопом на антигене или его фрагменте, который не связывается улавливающим средством, с образованием регистрируемого комплекса, и (iii) определение присутствия, количества или концентрации антигена или его фрагмента в тестируемом образце на основании сигнала, генерируемого регистрируемой меткой в регистрируемом комплексе, образованном на стадии (ii), при этом по меньшей мере одно улавливающее средство и/или по меньшей мере одно средство для выявления представляет собой по меньшей мере один связывающий белок.

Альтернативно в некоторых вариантах способ определения присутствия, количества или концентрации одного или нескольких антигенов или их фрагментов в тестируемом образце может включать в себя (i) осуществление контакта тестируемого образца с по меньшей мере одним улавливающим средством, которое связывается с эпитопом на антигене или его фрагменте, для того, чтобы образовался комплекс, содержащий улавливающее средство и антиген или его фрагмент, и одновременно или последовательно в любом порядке осуществление контакта тестируемого образца с антигеном, меченым регистрируемой меткой, или его фрагментом, который может конкурировать с любым антигеном или его фрагментом в тестируемом образце за связывание с по меньшей мере одним улавливающим средством, при этом любой антиген или его фрагмент, присутствующий в тестируемом образце и меченый регистрируемой меткой антиген конкурируют друг с другом за образование выявляемого комплекса, и (ii) определение присутствия, количества или концентрации антигена или его фрагмента в тестируемом образце на основании сигнала, генерируемого регистрируемой меткой в выявляемом комплексе, образованном на стадии (i), при этом по меньшей мере одно улавливающее средство представляет собой по меньшей мере один связывающий белок, и при этом сигнал, генерируемый регистрируемой меткой в улавливающем выявляемом комплексе обратно пропорционален количеству или концентрации антигена или его фрагмента в тестируемом образце.

В различных вариантах тестируемый образец может быть получен от пациента, и в таком случае способ может дополнительно включать в себя диагностику, прогнозирование или оценку эффективность терапевтического/профилактического лечения пациента. Если способ дополнительно включает в себя оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента, то способ необязательно дополнительно включает в себя модификацию терапевтического/профилактического лечения пациента таким образом, который необходим для повышения эффективности. Способ может быть адаптирован для применения в автоматизированной системе или полуавтоматизированной системе. Соответственно, способы, описанные в настоящей публикации, также можно применять для определения того, имеет ли субъект или подвергается ли он риску развития данного заболевания, расстройства или состояния. В частности, такой способ может включать в себя стадии:

(a) определения концентрации или количества одного или нескольких аналитов или их фрагментов в тестируемом образце, полученном от субъекта (например, с применением способов, описанных в настоящей публикации, или способов, известных в данной области); и

(b) сравнения концентрации или количества аналита(ов) или его фрагмента(ов), которые определяют на стадии (a), с предварительно определяемым уровнем, при этом если концентрация или количество аналита(ов), определяемые на стадии (a), удовлетворяют значению предварительно определяемого уровня, то определяют, что субъект не имеет или не подвергается риску развития данного заболевания, расстройства или состояния. Однако если концентрация или количество аналита(ов), определяемые на стадии (a), не удовлетворяют значению предварительно определяемого уровня, то определяют, что субъект имеет или подвергается риску развития данного заболевания, расстройства или состояния.

Кроме того, в изобретении предлагаются способы мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта. В некоторых вариантах способы включают в себя стадии:

(a) определения концентрации или количества в тестируемом образце, полученном от субъекта, одного или нескольких аналитов;

(b) определения концентрации или количества аналита(ов) в более позднем тестируемом образце, взятом от того же субъекта; и

(c) сравнения концентрации или количества аналита(ов), которые определяют на стадии (b), с концентрацией или количеством аналита(ов), определяемыми на стадии (a), при этом если концентрация или количество, определяемые на стадии (b), не изменяются или являются неудовлетворительными по сравнению с концентрацией или количеством, определяемыми на стадии (a), то определяют, что заболевание у субъекта продолжается, прогрессирует или ухудшается. При сравнении, если концентрация или количество, которые определяют на стадии (b), являются удовлетворительными по сравнению с концентрацией или количеством, которые определяют на стадии (a), то определяют, что заболевание у субъекта приостановлено, регрессировало или состояние улучшилось.

Необязательно способы мониторинга прогрессирования заболевания дополнительно включают в себя сравнение концентрации или количества аналита(ов), которые определяют на стадии (b), например, с предварительно определяемым уровнем. Кроме того, необязательно способы включают в себя лечение субъекта одной или несколькими фармацевтическими композициями в течение определенного периода времени, если сравнение показывает, что концентрация или количество аналита(ов), которые определяют на стадии (b), например, неудовлетворительно изменены по сравнению с предварительно определяемым уровнем.

Также предлагается набор для анализа тестируемого образца в отношении присутствия или концентрации одного или нескольких антигенов или их фрагментов, при этом один или несколько антигенов представляют собой DLL4 и/или VEGF. Набор содержит по меньшей мере один связывающий белок, который описан в настоящей публикации, для анализа тестируемого образца в отношении антигена или его фрагмента, и инструкции по выполнению анализа тестируемого образца в отношении антигена или его фрагмента. В одном варианте по меньшей мере один связывающий белок необязательно мечен регистрируемой меткой.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 является схематичным представлением конструкции связывающих белков с двойными вариабельными доменами (DVD) и показывает стратегию создания связывающего DVD-белка из двух исходных антител.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Предлагаются поливалентные и/или полиспецифичные связывающие белки, способные связывать эпитопы на двух разных белках. Также предлагаются связывающие белки с двойными вариабельными доменами (также называемые DVD, связывающими DVD-белками или иммуноглобулинами с двойными вариабельными доменами (DVD-Ig™)) и их фармацевтические композиции, а также нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы и клетки-хозяева для получения таких связывающих DVD-белков. Также предлагаются способы применения связывающих DVD-белков для выявления специфичных антигенов либо in vitro, либо in vivo.

Если в настоящем описании не определено иное, научные и технические термины, используемые в настоящем описании, имеют значения, которые обычно подразумевают специалисты в данной области. В случае любой возможной неясности определения, приведенные в настоящем описании, имеет приоритет по сравнению с любым словарным или внешним определением. Если согласно контексту не требуется иное, то термины в единственном числе должны включать термины во множественном числе, а термины во множественном числе должны включать и форму единственного числа. Использование «или» означает «и/или», если не указано иное. Использование термина «включая», а также других форма, таких как «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Будет понятно, что любой диапазон, описанный в настоящей публикации, включает конечные точки и все значения между конечными точками.

Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, приведены только в организационных целях, и их не следует рассматривать как ограничивающие описываемый предмет изобретения. Все документы или части документов, цитированные в настоящей заявке, включая, но без ограничения патенты, заявки на выдачу патентов, статьи, книги и монографии, специально включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме для любой цели. В той степени, в которой документы, включенные в виде ссылки, противоречат раскрытию, которое содержится в описании, описание будет заменять любой противоречащий материал.

Как правило, номенклатура, используемая в связи с культурой клеток или тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией белков и нуклеиновых кислот и гибридизацией, описанная в настоящей публикации, хорошо известна и широко применяется в данной области. Способы и методики, предлагаемые в описании, обычно осуществляют согласно обычным способам, хорошо известным в данной области, и как описано в различных общих и более конкретных публикациях, которые цитированы и обсуждаются на протяжении настоящего описания, если не указано иное. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют согласно инструкциям производителя или как обычно осуществляют в данной области, или как описано в настоящей публикации, если не указано иное. Номенклатуры, используемые в указанной связи, и лабораторные способы и методики аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящей публикации, представляют собой способы и методики, хорошо известные и широко применяемые в данной области, если не указано иное. Используют стандартные методики химического синтеза, химических анализов, приготовления фармацевтических средств, препаратов и их доставки и лечения пациентов.

Чтобы изобретение можно было легче понять, ниже дано определение отдельных терминов.

Термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина (Ig), которая обычно состоит из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, или его функциональному фрагменту, мутанту, варианту или производному, которые сохраняют признаки связывания эпитопа молекулы Ig. Такие формы антитела в виде фрагмента, мутанта, вариант или производного известны в данной области. В одном варианте полноразмерного антитела каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). CH состоит их трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). CL состоит из одного домена CL. VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), между которыми находятся более консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Обычно каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, которые распределены от амино-конца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Термин «биспецифичное антитело» относится к антителу, которое связывает один антиген (или эпитоп) на одном из его двух связывающих плеч (одна пара HC/LC) и связывает другой антиген (или эпитоп) на своем втором связывающем плече (другая пара HC/LC). Биспецифичное антитело имеет два отдельных антигенсвязывающих плеча (оба обладают специфичностью и имеют последовательности CDR) и является моновалентным для каждого антигена, с которым оно связывается. Биспецифичные антитела включают антитела, полученные с использованием методики квадром (Milstein and Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40), посредством химической конъюгации двух разных моноклональных антител (Staerz et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31), или способом «выступ во впадину» или сходными способами, которые позволяют вводить мутации в Fc-область (Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-6448).

Антитело «с созревшей аффинностью» представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких его CDR, которые приводят к улучшению аффинности антитела по отношению к антигену, по сравнению с исходным антителом, которое не имеет такого изменения(ий). Примеры антител с созревшей аффинностью могут иметь наномолярные или даже пикомолярные аффинности по отношению к антигену-мишени. Антитела с созревшей аффинностью получают способами, известными в данной области. В публикации Marks с соавторами ((1992) BioTechnology 10: 779-783) описано созревание аффинности за счет перетасовки доменов VH и VL. Случайный мутагенез остатков CDR и/или каркаса описан в публикациях: Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169: 147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7):3310-9; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896, и мутация в выбранных положениях для мутагенеза, положениях контактов или гипермутаций с использованием усиливающего активность аминокислотного остатка описана в патенте США № 6914128.

Термин «CDR-привитое антитело» относится к антителу, которое содержит последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, в которых последовательности одной или нескольких областей CDR в VH и/или VL заменены последовательностями CDR другого антитела. Например, два антитела могут быть из разных видов, такие как антитела, имеющие мышиные вариабельные области тяжелой и легкой цепей, в которых одна или несколько мышиных CDR были заменены последовательностями CDR человека.

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителу вида, отличного от человека, которое было изменено так, чтобы оно было более «подобным человеческому», т.е. более сходным с последовательностями зародышевой линии человека. Одним из типов гуманизированного антитела является CDR-привитое антитело, в котором последовательности CDR животного, отличного от человека, введены в последовательности VH и VL человека, чтобы заменить соответствующие последовательности CDR человека. Термин «гуманизированным антитело» также означает антитело или его вариант, производное, аналог или фрагмент, который содержит последовательности каркасной области (FR), имеющие значимую идентичность (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность) с аминокислотной последовательностью последовательностей FR антитела человека и по меньшей мере одну CDR, имеющую значимую идентичность (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность) с аминокислотной последовательностью CDR вида, отличного от человека. Гуманизированное антитело может содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов (Fab, Fab’, F(ab’)₂, FabC, Fv), в которых последовательности всех или по существу всех областей CDR соответствуют CDR-областям иммуноглобулина вида, отличного от человека (т.е. донорного антитела), и последовательность всех или по существу всех FR-областей являются FR-областями иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать области CH1, шарнира, CH2, CH3 и CH4 тяжелой цепи из антитела человека. В некоторых вариантах гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В одном варианте гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть Fc-области иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В некоторых вариантах гуманизированное антитело содержит только гуманизированную тяжелую цепь. В некоторых вариантах гуманизированное антитело содержит только гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и/или гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах гуманизированное антитело содержит легкую цепь, а также по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, а также по меньшей мере вариабельный домен легкой цепи.

Термины «связывающий белок с двойными вариабельными доменами» и «иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами» относятся к связывающему белку, который имеет два вариабельных домена, в каждом из своих двух плеч (например, пара HC/LC) (смотрите публикацию PCT № WO 02/02773), каждый из которых способен связываться с антигеном. В одном варианте каждые вариабельные домены связывают разные антигены или эпитопы. В другом варианте вариабельные домены связывают один и тот же антиген или эпитоп. В другом варианте связывающий белок с двойными вариабельными доменами имеет два идентичных антигенсвязывающих плеча с идентичной специфичностью и идентичными последовательностями CDR, и является бивалентным по отношению к каждому антигену, с которым оно связывается. В одном варианте связывающие DVD-белки могут быть моноспецифичными, т.е. способными связывать один антиген, или полиспецифичными, т.е. способными связывать два или больше антигенов. Связывающие DVD-белки, содержащие два полипептида DVD тяжелой цепи и два полипептида DVD легкой цепи, названы DVD-Ig™. В одном варианте каждая половина состоящего из четырех цепей связывающий DVD-белок содержит полипептид DVD тяжелой цепи и полипептид DVD легкой цепи и два антигенсвязывающих участка. В одном варианте каждый связывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, всего с 6 CDR, вовлеченными в связывание антигена на антигенсвязывающий участок.

Термин «антиидиотипическое антитело» относится к антителу, вырабатываемому против аминокислотной последовательности участка связывания с антигеном другого антитела. Антиидиотипические антитела могут быть введены для усиления иммунного ответа против антигена.

Термин «биологическая активность» относится к любому одному или нескольким биологическим свойствам молекулы (либо присутствующей в природе, которую выявляют in vivo, либо получаемой или доступной благодаря использованию способов рекомбинации). Биологические свойства включают, но без ограничения, связывание рецептора, индукцию клеточной пролиферации, ингибирование роста клеток, индукцию других цитокинов, индукцию апопотоза и ферментативную активность.

Термин «нейтрализация» относится к противодействию биологической активности антигена в том случае, когда связывающий белок специфично связывается с антигеном. В одном варианте нейтрализующий связывающий белок связывается с антигеном (например, цитокином) и снижает его биологическую активность на по меньшей мере приблизительно 20%, 40%, 60%, 80%, 85% или больше.

«Специфичность» относится к способности связывающего белка избирательно связывать антиген.

«Аффинность» означает силу взаимодействия между связывающим белком и антигеном, и она определяется последовательностью CDR связывающего белка, а также природой антигена, например его размером, формой и/или зарядом. Связывающие белки могут быть выбраны по аффинности, которая обеспечивает требуемые терапевтические результаты при минимизации негативных побочных эффектов. Аффинность можно измерить, используя способы, известные специалисту в данной области (US 20090311253).

Термин «потенциальная активность» относится к способности связывающего белка достигать требуемого эффекта, и является мерой его терапевтической эффективности. Потенциальную активность можно оценить, используя способы, известные специалисту в данной области (US 20090311253).

Термин «перекрестная реактивность» относится к способности связывающего белка связывать другую мишень, отличную от мишени, против которой он получен. Обычно связывающий белок может связывать свою ткань(ни)/антиген(ны)-мишень с достаточно высокой аффинностью, но будет проявлять соответствующую низкую аффинность по отношению к нормальным тканям/антигенами, не являющимся мишенями. Отдельные связывающие белки обычно выбирают так, чтобы они удовлетворяли двум критериям: (1) связывание антитела с тканью, которое визуализируют, используя способы окрашивания, известные в данной области, соответствует известной экспрессии мишени антитела, и (2) сходные картины окрашивания между тканями человека и видов, используемых для токсикологической оценки (например, мышей и макак-крабоедов), из одного и того же органа. Указанные и другие способы оценки перекрестной реактивности известны специалисту в данной области (US 20090311253).

Термин «биологическая функция» относится к специфичному действию связывающего белка in vitro или in vivo. Связывающие белки могут иметь в качестве мишеней несколько классов антигенов и могут достигать требуемых терапевтических результатов посредством множества механизмов действия. Мишенями связывающих белков могут быть растворимые белки, антигены клеточной поверхности и/или отложения внеклеточных белков. Связывающие белки могут агонизировать, антагонизировать или нейтрализовать активность своих мишеней. Связывающие белки могут способствовать клиренсу мишеней, с которыми они связываются, или могут приводить к цитотоксичности при связывании с клетками. Части двух или более антител могут быть включены в поливалентную форму, чтобы добиться более одной отличительной функции в одной молекуле связывающего белка. Анализы in vitro и модели in vivo, используемые для оценки биологической функции известны специалисту в данной области (US 20090311253).

«Стабильный» связывающий белок представляет собой белок в том случае, когда связывающий белок по существу сохраняет свою физическую стабильность, химическую стабильность и/или биологическую активность при хранении. Желателен поливалентный связывающий белок, который является стабильным in vitro при разных температурах в течение длительного периода времени. Способы стабилизации связывающих белков и оценки их стабильности при разных температурах известны специалисту в данной области (US 20090311253).

Термин «растворимость» относится к способности белка сохраняться диспергированным в водном растворе. Растворимость белка в водном препарате зависит от правильного распределения гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков, и поэтому растворимость может коррелировать с получением белков, подвергнутых правильной укладке. Специалист в данной области сможет выявить повышении или снижение растворимости связывающего белка с использованием рутинных методик ВЭЖХ и способов, известных специалисту в данной области (US 20090311253).

Связывающие белки могут быть получены с использованием различных клеток-хозяев или могут быть получены in vitro, и относительный выход на одно исследование определяет «эффективность продукции». Факторы, влияющие на эффективность продукции, включают, но без ограничения, тип клеток-хозяев (прокариотические или эукариотические), выбор экспрессирующего вектора, выбор нуклеотидной последовательности и применяемые способы. Материалы и способы, используемые при получении связывающих белков, а также измерение эффективности продукции, известны специалисту в данной области (US 20090311253).

Термин «иммуногенность» означает способность вещества индуцировать иммунный ответ. Введение терапевтического связывающего белка может приводить в некоторых случаях к иммунному ответу. Потенциальные элементы, которые могут индуцировать иммуногенность в поливалентной форме, можно анализировать во время отбора исходных антител, и могут быть предприняты шаги для снижения такого риска, чтобы оптимизировать исходные антитела перед включением их последовательностей в поливалентную форму связывающего белка. Способы снижения иммуногенности антител и связывающих белков известны специалисту в данной области (US 20090311253).

Термины «метка» и «регистрируемая метка» означают компонент, связанный с членом специфично связывающейся пары, таким как антитело или его аналит, чтобы сделать реакцию (например, связывание) между членами специфично связывающейся пары регистрируемой. Меченый представитель специфично связывающейся пары называют «меченным регистрируемой меткой». Таким образом, термин «меченый связывающий белок» относится к белку с включенной меткой, которая обеспечивает идентификацию связывающего белка. В одном варианте метка является регистрируемым маркером, который может продуцировать сигнал, который регистрируют визуально или инструментальными способами, например, включение радиоактивно меченой аминокислоты или связывание с полипептидом остатков биотинила, которые могут быть выявлены содержащим маркер авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцирующий маркер, или с использованием ферментативной активности, которая может быть выявлена оптическими или колориметрическими способами). Примеры меток для полипептидов включают, но без ограничения, следующие метки: радиоактивные изотопы или радионуклиды (например, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho или ¹⁵³Sm); хромогены, флуоресцирующие метки (например, ФИТЦ, родамин, лантанидные люминофоры), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные маркеры; группы биотинила; предварительно определяемые полипептидные эпитопы, узнаваемые вторым репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания для вторых антител, домены связывания металлов, эпитопные метки) и магнитные средства, такие как хелаты гадолиния. Типичные примеры меток, обычно используемых для иммуноанализов, включают компоненты, которые испускают свет, например соединения акридиния, и компоненты, которые продуцируют флуоресценцию, например, флуоресцеин. В этоя связи компонент сам по себе может быть не мечен регистрируемой меткой, но может становиться регистрируемым после взаимодействия с другим компонентом.

Термин «конъюгат» относится к связывающему белку, такому как антитело или DVD-Ig, химически связанному со вторым химическим компонентом, таким как терапевтическое или цитотоксическое средство. Термин «средство» включает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов. Примеры терапевтических или цитотоксических средств включают без ограничения таксол, цитохалазин B, грамицидин D, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, метопролол, атенолол, бисопролол и пуромицин и их аналоги или гомологи. При использовании в контексте иммуноанализа конъюгат может быть представлять собой меченое регистрируемой меткой антитело или DVD-Ig, используемые в качестве средства для выявления.

Термины «кристалл» и «кристаллизованное» относятся к связывающему белку (например, антителу) или его антигенсвязывающей части, которые существуют в форме кристалла. Кристаллы представляют собой одну из форм твердого состояния вещества, которое отличается от других форм, таких как аморфное твердое состояние или жидкокристаллическое состояние. Кристаллы состоят из правильных повторяющихся трехмерных решеток атомов, ионов, молекул (например, белков, таких как антитела) или молекулярных ансамблей (например, комплексов антиген/антитело). Такие трехмерные решетки расположены согласно конкретным математическим взаимосвязям, которые хорошо известны в данной области. Фундаментальную единицу или строительный блок, который повторяется в кристалле, называют ассиметричной единицей. Повторение ассиметричной единицы в структуре, которое подчиняется некоторой хорошо определенной кристаллографической симметрии, создает «элементарную ячейку» кристалла. Повторение элементарной ячейки в результате регулярных трансляций во всех трех направлениях создает кристалл. Смотрите Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2^nd ed., pp. 201-16, Oxford University Press, New York, N.Y., (1999).

Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к транспорту другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Одним из типов векторов является «плазмида», которая представляет собой кольцевую двунитевую петлю ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные участки ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в случае которого дополнительные фрагменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Другие векторы включают РНК-векторы. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное начало репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и при этом реплицируются вместе с геномом хозяина. Некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы в настоящем описании называют «рекомбинантными экспрессирующими векторами» (или просто «экспрессирующими векторами»). В общем, экспрессирующие векторы, применимые в способах рекомбинации ДНК, часто имеют форму плазмид. В настоящем описании термины «плазмида» и «вектор» могут быть использованы взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее широко применяемой формой вектора. Однако подразумевается, что изобретение включает и другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, дефицитные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции. Группа векторов pHybE (заявка на выдачу патента США с регистрационным № 61/021282) может быть использована для клонирования исходного антитела и связывающего DVD-белка. V1, полученный из pJP183; pHybE-hCg1,z,non-a V2, можно использовать для клонирования тяжелых цепей антитела и DVD с константной областью дикого типа. V2, полученный из pJP191; pHybE-hCk V3, можно использовать для клонирования легких цепей антитела и DVD с константной областью каппа. V3, полученный из pJP192; pHybE-hCI V2, можно использовать для клонирования легких цепей антитела и DVD с константной областью лямбда. V4, построенный с сигнальным пептидом лямбда и коснтантной областью каппа, можно использовать для клонирования легких цепей DVD с гибридным лямбда-каппа V-доменом. V5, построенный с сигнальным пептидом каппа и константной областью лямбда, можно использовать для клонирования легких цепей DVD с гибридным каппа-лямбда V-доменом. V7, полученный из pJP183; pHybE-hCg1,z,non-a V2, можно использовать для клонирования тяжелых цепей антитела и DVD с мутантной константной областью (234235 а/к).

Термины «рекомбинантная клетка-хозяин» или «клетка-хозяин» относятся к клетке, в которую была введена экзогенная ДНК. Такие термины относятся не только к конкретной клетке субъекта, но и к потомству такой клетки. Так как в последующих поколениях могут иметь место некоторые модификации либо вследствие мутации, либо вследствие влияния окружающей среды, такое потомство в действительности может быть не идентичным исходной клетке, но все еще будет входить в объем термина «клетка-хозяин» в используемом в настоящем описании смысле. В одном варианте клетки-хозяева включают прокариотические и эукариотические клетки. В одном варианте эукариотические клетки включают клетки простейших, грибов, растений и животных. В другом варианте клетки-хозяева включают без ограничения линию прокариотических клеток E. coli; линии клеток млекопитающих CHO, HEK 293, COS, NS0, SP2 и PER.C6; линию клеток насекомых Sf9; и клетки грибов Saccharomyces cerevisiae.

Термин «трансфекция» охватывают широкое множество способов, обычно применяемых для введения экзогенной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с использованием DEAE-декстрана и тому подобные.

Термин «цитокин» относится к белку, высвобождаемому одной популяцией клеток, который действует на другую популяцию клеток в качестве межклеточного медиатора. Термин «цитокин» включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток, и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

Термин «биологический образец» означает определенное количество вещества из живого организма или ранее жившего организма. Такие вещества включают, но без ограничения, кровь (например, цельную кровь), плазму, сыворотку, мочу, амниотическую жидкость, синовиальную жидкость, эндотелиальные клетки, лейкоциты, моноциты, другие клетки, органы, ткани, костный мозг, лимфатические узлы и селезенку.

Термин «компонент» относится к элементу композиции. В связи с диагностическим набором, например, компонентом может быть улавливающее антитело, антитело для детекции или конъюгат антитела, контроль, калибровочный эталон, серия калибровочных эталонов, панель для определения чувствительности, емкость, буфер, разбавитель, соль, фермент, кофактор фермента, реагент для выявления, реагент/раствор для предварительной обработки, субстрат (например, в виде раствора, раствор для остановки реакции и тому подобное, что может быть включено в набор для анализа тестируемого образца. Таким образом, «компонент» может включать в некоторых вариантах полипептид или другой аналит, указанный выше, который иммобилизуют на твердой подложке, например благодаря связыванию с антителом против аналита (например, антителом против полипептида). В некоторых вариантах один или несколько компонентов могут быть в растворе или могут быть лиофилизированы.

«Контроль» относится к композиции, которая не содержит аналита («негативный контроль») или содержит аналит («позитивный контроль»). Позитивный контроль может содержать известную концентрацию аналита. «Контроль», «позитивный контроль» и «калибровочный эталон» могут быть использованы в настоящем описании взаимозаменяемо по отношению к композиции, содержащей известную концентрацию аналита. «Позитивный контроль» может быть использован для установления характеристик эффективности анализа и является полезным показателем целостности реагентов (например, аналитов).

«Предварительно определяемый предел отсечения» и «предварительно определяемый уровень», в общем, относятся к значению предела отсечения в анализе, который используют для оценки результатов оценки диагностической/прогностической/терапевтической эффективности путем сравнения результатов анализа с предварительно определяемым пределом отсечения/уровнем, который уже был связан или ассоциирован с различными клиническими параметрами (например, тяжестью заболевания, прогрессированием/отсутствием прогрессирования/улучшением и т.д.). Хотя в настоящем описании могут быть приведены примеры предварительно определяемых уровней, хорошо известно, что значения предела отсечения могут варьировать, в зависимости от природы иммуноанализа (например, используемых антител и т.д.). Специалист в данной области сможет адаптировать приведенной в настоящей публикации описание для других иммуноанализов, чтобы получить специфичные для иммуноанализа значения предела отсечения для таких других иммуноанализов на основе настоящего описания. Принимая во внимание, что точное значение предварительного определяемого предела отсечения/уровня может варьировать от анализа к анализу, в общем, могут быть применимы корреляции, которые описаны в настоящей публикации (при необходимости).

«Реагент для предварительной обработки», например, реагент для лизиса, преципитации и/или солюбилизации, который используют в диагностическом анализе, который описан в настоящей публикации, представляет собой реагент, который лизирует любые клетки и/или солюбилизирует любой аналит, который присутствует в тестируемом образце. Предварительная обработки необязательна для всех образцов, которые описаны в настоящей публикации. Наряду с прочим солюбилизация аналита (например, представляющего интерес полипептида) может вызывать высвобождение аналита из эндогенных связывающих белков, присутствующих в образце. Реагент для предварительной обработки может быть гомогенным (не требующим стадии разделения) или гетерогенным (требующим стадии разделения). В некоторых вариантах при использовании гетерогенного реагента для предварительной обработки преципитированные связывающие аналит белки извлекают из тестируемого образца перед проведением следующей стадии анализа

«Реагенты для контроля качества» в контексте иммуноанализов и наборов, описанных в настоящей публикации, включают, но без ограничения, калибровочные эталоны, контроли и панели для оценки чувствительности. Обычно используют один или несколько «калибровочных эталонов» или «стандартов», чтобы получить калибровочные (стандартные) кривые для интерполяции концентрации молекулы-мишени, такой как антитело или аналит. В некоторых вариантах можно использовать один калибровочный эталон, который близок предварительно определяемому позитивному/негативному пределу отсечения. Альтернативно, в других вариантах можно использовать несколько калибровочных эталонов (т.е. более одного калибровочного эталона или различное количество калибровочных эталонов, чтобы получить «панель чувствительности» или установить «градиент чувствительности».

Термин «партнер в специфичном связывании» относится к члену специфично связывающейся пары. Специфично связывающаяся пара содержит две разные молекулы, которые специфично связываются друг с другом химическими или физическими способами. В различных вариантах в дополнение к специфичному связыванию антигена и антитела другие специфично связывающиеся пары могут включать биотин и авидин (или стрептавидин), углеводы и лектины, комплементарные нуклеотидные последовательности, эффекторные и рецепторные молекулы, кофакторы и ферменты, ингибиторы ферментов и ферменты, и тому подобное. Кроме того, специфично связывающиеся пары могут включать в некоторых вариантах члены, которые являются аналогами исходных специфично связывающихся членов, например, аналит-аналог. Иммунореактивные специфично связывающиеся члены включают антигены, фрагменты антигенов и антитела, включая моноклональные и поликлональные антитела, а также их комплексы, фрагменты и варианты (включая фрагменты вариантов), либо выделенные, либо полученные рекомбинантно.

Термин «Fc-область» определяет C-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая может быть создана при расщеплении интактного антитела папаином. Fc-область может представлять собой Fc-область с нативной последовательностью или вариант Fc-области. Fc-область иммуноглобулина обычно содержит два константных домена, домен CH2 и домен CH3, и необязательно содержит домен CH4. Замены аминокислотных остатков в Fc-части для изменения эффекторной функции антитела известны в данной области (например, патенты США № 5648260 и 5624821). Fc-область опосредует несколько важных эффекторных функций, например, индукцию цитокинов, зависимую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC), и время полужизни/скорость клиренса антитела и комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях такие эффекторные функции требуются для терапевтического иммуноглобулина, но в других случаях могут быть необязательными или даже вредными, в зависимости от терапевтических целей.

Термин «антигенсвязывающая часть» связывающего белка означает один или несколько фрагментов связывающего белка (например, антитела), которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном. Антигенсвязывающая функция связывающего белка может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела, а также биспецифичной, обладающее двойной специфичностью или полиспецифичной формами. Примеры связывающих фрагментов охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» связывающего белка, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL1 и CH1; (ii) F(ab’)₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два F(ab)’-фрагмента, связанных дисульфидной связью в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент, который содержит один вариабельный домен; и (vi) изолированную область, определяющую комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны с использованием способов рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет получать из них одну цепь белка, в которой области VL и VH составляют пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv). Также подразумевается, что такие одноцепочечные антитела охвачены термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диантитела. Кроме того, одноцепочечные антитела также включают «линейные антитела», содержащие пару тандемных участков Fv (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей.

Термин «поливалентный связывающий белок» означает связывающий белок, содержащий два или больше антигенсвязывающих участка. В одном варианте поливалентный связывающий белок сконструирован так, что он имеет три или больше антигенсвязывающих участков и является не встречающимся в природе антителом. Термин «полиспецифичные связывающий белок» относится к связывающему белку, способному связывать две или больше родственных или неродственных мишеней. В одном варианте связывающие DVD-белки, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат два или больше антигенсвязывающих участков и являются тетравалентными или поливалентными связывающими белками.

Термин «линкер» означает аминокислотный остаток или полипептид, содержащий два или больше аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, которые используют для связывания двух полипептидов (например, двух доменов VH или двух доменов VL). Примеры таких линкерных полипептидов хорошо известны в данной области (смотрите, например, публикации Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

Термины «нумерация по Кабату», «определения по Кабату» и «маркировка по Кабату» используют в настоящем описании взаимозаменяемо. Такие термины, которые известны в данной области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad., Sci. 190: 382-391, и Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). В случае вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельная область находится в диапазоне положений аминокислот 31-35 в случае CDR1, положений аминокислот 50-65 в случае CDR2 и положений аминокислот 95-102 в случае CDR3. В случае вариабельной области легкой цепи гипервариабельная область находится в диапазоне положений аминокислот 24-34 в случае CDR1, положений аминокислот 50-56 в случае CDR2 и положений аминокислот 89-97 в случае CDR3.

Термин «CDR» означает определяющую комплементарность область в последовательности вариабельной области иммуноглобулина. Существует три CDR в каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, которые названы CDR1, CDR2 и CDR3 в случае каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Термин «набор CDR» относится к группе из трех CDR, которые находятся в одной вариабельной области, способной связывать антиген. Точные границы таких CDR определяют по-разному согласно разным системам. Система, описанная Кабатом (Kabat et al. (1987) и (1991)), не только обеспечивает четкую систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но также позволяет выявить точные границы остатков, определяющих три CDR. Такие CDR могут быть названы CDR согласно системе Кабата. Чотия с соавторами (Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 8 77-883) обнаружили, что некоторые субчасти в CDR согласно системе Кабата принимают почти идентичные конформации пептидного остова, несмотря на наличие большого разнообразия на уровне аминокислотной последовательности. Такие субчасти названы L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где «L» и «H» означают области легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно. Такие области могут быть названы CDR согласно системе Чотия, которые имеют границы, которые перекрываются с CDR согласно системе Кабата. Другие границы, определяющие CDR, перекрывающиеся с CDR согласно системе Кабата, описаны Padlan (1995) (FASEB J. 9: 133-139) и MacCallum (1996) (J. Mol. Biol. 262(5): 732-45). Другие определения границ CDR могут не строго следовать одной из указанных выше систем, однако будут перекрываться с CDR согласно Кабату, хотя они могут быть более короткими или более длинными в свете предварительных оценок или экспериментальных данных о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже полные CDR значимо не влияют на связывание антигена. В способах применяемых согласно настоящему изобретению, можно использовать CDR, определяемые согласно любой из указанных систем, хотя в некоторых вариантах использованы CDR, определяемые согласно Кабату или Чотия.

Термин «эпитоп» означает область антигена, которая связывается связывающим белком, например, область, способную специфично связываться с иммуноглобулином или T-клеточным рецептором. В некоторых вариантах эпитопные детерминанты включают в себя химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорил или сульфонил, и в некоторых вариантах могут иметь специфичные признаки трехмерной структуры и/или специфичные характеристики заряда. В одном варианте эпитоп содержит аминокислотные остатки области антигена (или его фрагмента), которые, как известно, связываются с комплементарным участком на специфичном партнере в связывании. Фрагмент антигена может содержать более одного эпитопа. В некоторых вариантах связывающий белок специфично связывает антиген, когда он распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. Связывающие белки «связываются с одним и тем же эпитопом», если антитела перекрестно конкурируют (например, одно предотвращает связывание другого со связывающим белком или ингибирует модулирующее действие на другой связывания со связывающим белком). Способы визуализации и моделирования узнавания эпитопа известны специалисту в данной области (US 20090311253).

«Фармакокинетика» относится к процессу, в котором лекарственное средство всасывается, распределяется, метаболизируется и экскретируется организмом. В некоторых вариантах для создания поливалентной молекулы связывающего белка с требуемым фармакокинетическим профилем выбирают исходные моноклональные антитела с фармакокинетическими профилями, сходными с требуемым профилем. ФК-профили выбранных исходных моноклональных антител могут быть легко определены с использованием, например, грызунов в способах, известных специалисту в данной области (US 20090311253).

«Биодоступность» относится к количеству активного лекарственного средства, которое достигает своей мишени после введения. Биодоступность является функцией нескольких ранее описанных свойств, включая стабильность, растворимость, иммуногенность и фармакокинетику, и может быть оценена с использованием способов, известных специалисту в данной области (US 20090311253).

Термин «резонанс поверхностного плазмона» относится к оптическому явлению, которое обеспечивает возможность анализа биспецифичных взаимодействий в режиме реального времени посредством выявления изменений концентраций белков на биосенсорной матрице, например, с использованием системы BIAcore (BIAcore International AB, a GE Healthcare Co., Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Дополнительное описание смотрите в публикации Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26. Термин «k_on» означает константу скорости ассоциации связывающего белка (например, антитела или DVD) с антигеном с образованием комплекса (например, комплекса DVD/антиген). Термин «K_on» также означает «константу скорости ассоциации» или «ka», которые используют в настоящем описании взаимозаменяемо. Такое значение показывает скорость связывания связывающего белка с его антигеном-мишенью или скорость образования комплекса между связывающим белком (например, антителом) и антигеном. Это также показано в уравнении ниже:

Антитело («Ат») + антиген («Аг») → Ат-Аг

Термин «k_off» означает константу скорости распада комплекса или «константу скорости диссоциации» связывающего белка (например, антитела или DVD) из связанного комплекса (например, комплекса DVD/антиген), как известно в данной области. Такое значение показывает скорость диссоциации связывающего белка (например, антитела) от его антигена-мишени или разделения комплекса Ат-Аг с течением времени на свободное антитело и антиген, как показано в уравнении ниже:

Ат + Аг ← Ат-Аг

Термины «K_D» и «равновесная константа диссоциации» означают значение, полученное при измерении в случае титрования в равновесии или путем деления константы скорости диссоциации (K_off) на константу скорости ассоциации (K_on). Константу скорости ассоциации, константу скорости диссоциации и равновесную константу диссоциации используют для представления аффинности связывания связывающего белка (например, антитела или DVD) по отношению к антигену. Способы определения констант скорости ассоциации и диссоциации хорошо известны в данной области. Применение основанных на флуоресценции способов обеспечивает высокую чувствительность и возможность исследования образцов в физиологических буферах в равновесии. Можно использовать другие экспериментальные подходы и приборы, такие как анализ BIAcore® (анализ взаимодействия биологических молекул) (например, прибор, доступный из BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden). Кроме того, также можно использовать анализ KinExA® (анализ кинетического исключения), доступный из Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).

Термин «вариант» означает полипептид, который отличается от данного полипептида по аминокислотной последовательности за счет добавления (например, инсерции), делеции или консервативной замены аминокислот, но который сохраняет биологическую активность данного полипептида (например, вариант VEGF-антитела может конкурировать с анти-VEGF-антителом за связывание с VEGF). Консервативная замена аминокислоты, т.е. замена аминокислоты другой аминокислотой со сходными свойствами (например, гидрофильностью и/или степенью или распределением заряженных областей), как известно в данной области, обычно заключается в минорном изменении. Такие минорные изменения могут быть идентифицированы, отчасти, в результате анализа гидропатического индекса аминокислот, как известно в данной области (смотрите, например, Kyte et al. (1982) J. Mol. Biol. 57: 105-132). В одном аспекте осуществляют замены аминокислот, имеющих гидропатические индексы ±2. Также можно использовать гидрофильность аминокислот для выявления замен, которые могут приводить к получению белков, которые сохраняют биологическую функцию. Учитывание гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет вычислять наибольшую среднюю локальную гидрофильность такого пептида, полезную меру, которая, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью (смотрите, например, патент США № 4554101). Замена аминокислот, имеющих сходные значения гидрофильности, может приводить к получению пептидов, сохраняющих биологическую активность, например, иммуногенность, как известно в данной области. В одном аспекте замены осуществляют, используя аминокислоты, имеющие значения гидрофильности, отличающиеся друг от друга в пределах ±2. И на индекс гидрофобности и на значение гидрофильности аминокислот влияет конкретная боковая цепь такой аминокислоты. Понятно, что в соответствии с таким наблюдением замены аминокислот, которые совместимы с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот, и в частности, боковых цепей таких аминокислот, как выявлено по гидрофобности, гидрофильности, заряду, размеру и другим свойствам. Термин «вариант» также включает полипептиды или их фрагменты, которые были по-разному процессированы, например, в результате протеолиза, фосфорилирования или другой посттрансляционной модификации, но еще сохраняют биологическую активность и/или реактивность по отношению к антигену, например, способность связываться с VEGF и/или DLL4. Термин «варианте» охватывает фрагменты варианта, если не определено иное. Вариант может быть на 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76% или 75% идентичным последовательности дикого типа.

I. Создание связывающих белков

Предлагаются связывающие белки, способные связывать два разных антигена, и способы их получения. Связывающий белок может быть создан с использованием различных методик. Также предлагаются экспрессирующие векторы, клетка-хозяин и способы создания связывающего белка.

A. Создание исходных моноклональных антител

Вариабельные домены связывающего DVD-белка могут быть получены из исходных антител (Ат), включая поликлональные Ат и моноклональные Ат (мАт), способные связывать представляющие интерес антигены. Такие антитела могут быть встречающимися в природе или могут быть созданы с использованием методики рекомбинации. Специалисту в данной области хорошо известны многие способы получения антител, включая, но без ограничения, методики на основе гибридом, способ получения антител из отобранных лимфоцитов (SLAM), использование фагового, дрожжевого дисплея или дисплея на основе слияния РНК-белок или другой библиотеки, иммунизацию животного, отличного от человека, имеющего по меньшей мере некоторые локусы иммуноглобулина человека, и получение химерных, CDR-привитых и гуманизированных антител. Смотрите, например, публикацию патента США № 20090311253 A1. Вариабельные домены также могут быть получены с использованием методик созревания аффинности.

B. Критерии отбора исходных моноклональных антител

Предлагается вариант, включающий в себя отбор исходных антител с по меньшей мере одним или несколькими свойствами, необходимыми в молекуле связывающего DVD-белка. В одном варианте требуемым свойством является один или несколько параметров антитело, таких как, например, антигенная специфичность, аффинность по отношению к антигену, потенциальная активность, биологическая функция, узнавание эпитопа, стабильность, растворимость, эффективность продуцирования, иммуногенность, фармакокинетика, биодоступность, перекрестная тканевая реактивность или связывание ортологичных антигенов. Смотрите, например, публикацию патента США № 20090311253.

C. Молекулы связывающих белков

В различных вариантах связывающий белок может быть сконструирован так, чтобы два разных вариабельных домена легкой цепи (VL) из двух разных исходных моноклональных антител были связаны в тандеме непосредственно или через линкер способами получения рекомбинантной ДНК, с последующим константным доменом легкой цепи CL. Подобным образом, тяжелая цепь содержит два разных вариабельных домена тяжелой цепи (VH), связанных в тандеме непосредственно или через линкер, с последующим константным доменом CH1 и Fc-областью (фиг.1).

В различных вариантах вариабельные домены могут быть получены с использованием методики рекомбинации ДНК из исходных антител, созданных любым из способов, описанных в настоящей публикации. В одном варианте вариабельный домен является вариабельным доменом тяжелой или легкой цепи мыши. В другом варианте вариабельный домен является CDR-привитым или гуманизированным вариабельным доменом тяжелой или легкйо цепи. В одном варианте вариабельный домен является вариабельным доменом тяжелой или легкой цепи человека.

В различных вариантах линкерная последовательность может представлять собой одну аминокислоту или полипептидную последовательность. В одном варианте выбор линкерных последовательностей основан на анализе кристаллической структуры нескольких молекул Fab. Существует природная гибкая связка между вариабельным доменом и константным доменом CH1/CL в структуре молекулы Fab или антитела. Такая природная связка обычно содержит приблизительно 10-12 аминокислотных остатков, среди которых 4-6 остатков из C-конца V-домена и 4-6 остатков из N-конца домена CL/CH1. В некоторых вариантах связывающие DVD-белки создают, используя N-концевые 5-6 аминокислотных остатков или 11-12 аминокислотных остатков CL или CH1 в качестве линкера в легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно. N-концевые остатки доменов CL или CH1, в частности первые 5-6 аминокислотных остатков, могут принимать конформацию петли без строгих вторичных структур и поэтому могут дествовать в качестве гибких линкеров между двумя вариабельными доменами. N-концевые остатки доменов CL или CH1 являются природным удлинением вариабельных доменов, так как они являются частью последовательностей Ig, и поэтому их использование в большой степени минимизирует любую иммуногенность, потенциально возникающую из-за линкеров и соединений.

В различных вариантах связывающие белки, раскрытые в настоящем описании, содержат по меньшей мере один линкер, содержащий одну или несколько последовательностей SEQ ID NO:1-38 (таблица 1). В одном варианте X2 означает Fc-область. В другом варианте X2 означает вариант Fc-области.

Таблица 1
Список линкерных последовательностей SEQ ID NO: Последовательность SEQ ID NO: Последовательность 1 astkgpsvfplap 20 RADAAAAGGPGS 2 astkgp 21 RADAAAA 3 ggggsg 22 SAKTTPKLEEGEFSEARV 4 GGGGSGGGGS 23 ADAAP 5 GGGGSGGGGSGGGG 24 ADAAPTVSIFPP 6 tvaapsvfifpp 25 TVAAP 7 tvaap 26 TVAAPSVFIFPP 8 ggggsg 27 QPKAAP 9 GGSGGGGSG 28 QPKAAPSVTLFPP 10 GGSGGGGSGgggS 29 AKTTPP 11 ggSgg 30 AKTTPPSVTPLAP 12 GGSGGGGSGggS 31 akttap 13 AKTTPKLEEGEFSEAR 32 akttapsvyplap 14 AKTTPKLEEGEFSEARV 33 GGGGSGGGGSGGGGS 15 AKTTPKLGG 34 GENKVEYAPALMALS 16 SAKTTPKLGG 35 GPAKELTPLKEAKVS 17 SAKTTP 36 GHEAAAVMQVQYPAS 18 RADAAP 37 TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP 19 RADAAPTVS 38 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP

Другие линкерные последовательности могут включать любую последовательность любой длины, полученную из домена CL/CH1, но не все остатки домена CL/CH1; например первые 5-12 аминокислотных остатков домена CL/CH1. В другом примере линкеры легкой цепи могут быть выбраны из Cκ или Cλ; и линкеры тяжелой цепи могут быть получены из CH1 любого изотипа, включая Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε и Cμ. Линкерные последовательности также могут быть получены из других белков, таких как Ig-подобные белки (например, TCR, FcR, KIR); основанные на G/S последовательности (например, повторы G4S); полученные из шарнирной области последовательности; и другие природные последовательности из других белков. Другие линкерные последовательности могут включать любую последовательность любой длины, содержащую повторы G/S (например, последовательность, содержащую повторы мотива GGGS) или любые другие пептидные линкеры.

В одном варианте константный домен связывают с двумя связанными вариабельными доменами с использованием методики рекомбинации ДНК. В одном варианте последовательность, содержащую связанные вариабельные домены тяжелой цепи, связывают с константным доменом тяжелой цепи, и последовательность, содержащую связанные вариабельные домены легкой цепи, связывают с константным доменом легкой цепи. В одном варианте константные домены представляют собой константные домены тяжелой цепи человека и константные домены легкой цепи человека, соответственно. В одном варианте тяжелую цепь DVD дополнительно связывают с Fc-областью. Fc-область может представлять собой Fc-область с нативной последовательностью или вариант Fc-области. В другом варианте Fc-область представляет собой Fc-область человека. В другом варианте Fc-область включает Fc-область из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD.

В одном варианте раскрыто антитело, или его функциональный антигенсвязывающий фрагмент, включающее антитело, имеющее функциональный участок связывания для одного из антигенов-мишеней, перечисленных в таблице 2, и содержащее спаренную область VH и VL, выбранную из пар, перечисленных в таблице 2, или содержащее области CDR таких областей VH и VL. Например, антитело может содержать области VH и VL из таблицы 2, которые образуют функциональный участок связывания для DLL4. В одном варианте в функциональном антигенсвязывающем фрагменте сохраняются области вариабельного домена (например, области CDR, взятые из спаренных последовательностей VH и VL, указанных в таблице 2), достаточные для связывания антигена-мишени. Функциональный антигенсвязывающий фрагмент может включать гуманизированное, полностью человеческое, верблюдизированное, одноцепочечное, химерное, синтетическое, рекомбинантное, гибридное, мутантное, содержащее обратные мутации или CDR-привитое антитело или Fab, F(ab’)₂, Fv, scFv, Fd, dAb, VHH (также называемое наноантителом) или другой фрагмент антитела, который сохраняет функцию связывания антигена, включая биспецифичные или полиспецифичные антитела.

В одном варианте предлагается связывающий белок, содержащий вариабельные домены, выбранные из доменов, указанных в таблице 2. В одном варианте связывающий белок содержит первую цепь и вторую цепь и два функциональных связывающих участка, которые описаны выше, и при этом первая и вторая цепи связывающего белка образуют два функциональных связывающих участка для одного или нескольких антигенов-мишеней, перечисленных в таблице 2. В одном варианте каждый функциональный связывающий участок содержит спаренные последовательности VH и VL, выбранные из пар, перечисленных в таблице 2 (например, спаренные последовательности VH и VL, образующие участок связывания для DLL4), или содержащие области CDR из таких областей VH и VL. В некоторых вариантах первая цепь содержит первую последовательность VH и вторую последовательность VH, выбранные из таблицы 2, или содержит последовательности CDR из таких последовательностей VH, и вторая цепь содержит первую последовательность VL и вторую последовательность VL, выбранные из таблицы 2, или содержит последовательности CDR из таких последовательностей VL. В других вариантах распределение VH-VL в первом или втором участке связывания является перекрестным между двумя цепями, так что каждая цепь содержит домен VH из одного участка связывания и домен VL из другого участка связывания, при этом сохраняются два функциональных связывающих участка.

В одном варианте два полипептида DVD тяжелой цепи и два полипептида DVD легкой цепи объединены с образованием связывающего DVD-белка. В таблице 2 перечислены аминокислотные последовательности областей VH и VL иллюстративных антител, применимых для лечения заболевания. В одном варианте предлагается DVD, содержащий по меньшей мере две из областей VH и/или VL, перечисленных в таблице 2, в любой ориентации, при этом по меньшей мере одна из последовательностей VH и/или VL представляет собой последовательность SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:40. В некоторых вариантах VD1 и VD2 выбраны независимо. Последовательности доменов VH и VL, приведенные ниже, содержат определяющие комплементарность области (CDR) и каркасные последовательности. В некоторых вариантах одна или несколько таких CDR и/или каркасных последовательностей заменены без утраты функции другими CDR и/или каркасными последовательностями из связывающих белков, которые, как известно в данной области, связываются с таким же антигеном.

Таблица 2
Список аминокислотных последовательностей областей VH и VL анти-DLL4- и анти-VEGF-антител для создания связывающих белков, включая поливалентные связывающие белки (последовательности CDR указаны жирным шрифтом) SEQ ID NO: Уникальный идентификационный номер АВТ Область белка Последовательность 1234567890123456789012345678901234567890 39 h1A11.1 DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSS 40 h1A11.1 DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKR 41 Av VEGF VH (последовательность 1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS 42 Av VEGF VL (последовательность 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

43 AB285VH VEGF VH (последовательность 2) EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTASGYTFTNYGMNWVRQPPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSQAVLTMTNMDPVDTATYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTTVTVSS 44 AB285VL VEGF VL (последовательность 2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCSASQDISNYLNWYQQKPGQAPKVLIYFTSSLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTVPWTFGGGTKVEIKR 45 AB288VH VEGF VH (последовательность 3) EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKASGYTFTNYGMNWVRQMPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRQFTFSLDTSFSTAFLQWSSLKASDTAMYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTMVTVSS 46 AB288VL VEGF VL (последовательность 3) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSASQDISNYLNWYQQKPGQAPRVLIYFTSSLHSDVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSTVPWTFGQGTRLEIKR 47 AB305VH VEGF VH (последовательность 4) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

48 AB305VL VEGF VL (последовательность 4) EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCSASQDISNYLNWYQQKPGQAPRVLIYFTSSLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR 49 AB308VH VEGF VH (последовательность 5) EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTAKSSAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS 50 AB308VL VEGF VL (последовательность 5) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR 51 AB318VH VEGF VH (последовательность 6) EVQLVESGGGLVQPANSLKLSCAASGYTFTNYGMNWVRQSPKKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTAKSTAYLQMDSLRSEDTATYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGVLVTVSS 52 AB318VL VEGF VL (последовательность 6) DIRMTQSPASLSASLGETVNIECSASQDISNYLNWYQQKPGKAPQVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQSEDVATYYCQQYSTVPWTFGGGTKLELKR

53 AB333VH VEGF VH (последовательность 7) QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTNYGMNWVKQRPGHGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRKFTFTLDTSSSTAYIQLISLTTEDSAIYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLLTVSA 54 AB333VL VEGF VL (последовательность 7) DILMTQSPAILSVSPGERVSFSCSASQDISNYLNWYQQRTNGAPRVLIYFTSSLHSGVPSRFSGGGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQYSTVPWTFGAGTKLELKR

В некоторых вариантах предлагаются связывающие DVD-белки, содержащие область VH, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:55-63. В некоторых вариантах связывающий DVD-белок содержит область VL, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:64-73. В некоторых вариантах связывающий DVD-белок содержит область VH, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:55-63 и 74, и область VL, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:64-73. Аминокислотные последовательности таких доменов VH и VL показаны ниже в таблице 3.

Таблица 3
Связывающие DVD-белки, направленные против эпитопов DLL4 и VEGF (линкерная последовательность подчеркнута; последовательности CDR указаны жирным шрифтом) SEQ ID NO: Уникальный идентификационный номер АВТ Область белка Последовательность 1234567890123456789012345678901234567890 55 h1A11.1-L-Av VH DLL4 VH и VEGF VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS 56 h1A11.1-S-Av VH DLL4 VH и VEGF VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS

57 h1A11.1-GS10-Av VH DLL4 VH и VEGF VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS 58 h1A11.1-GS14-Av VH DLL4 VH и VEGF VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS 59 Av-L-h1A11.1 VH VEGF VH и DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSS

60 Av-S-h1A11.1 VH VEGF VH и DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSS 61 Av-GS6-h1A11.1 VH VEGF VH и DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSS 62 Av-GS10-h1A11.1 VH VEGF VH и DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSS

63 Av-GS14-h1A11.1 VH VEGF VH и DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSS 64 h1A11.1-L-Av VL DLL4 VL и VEGF VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR 65 h1A11.1-S-Av VL DLL4 VL и VEGF VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR

66 h1A11.1-GS10-Av VL DLL4 VL и VEGF VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKRGGSGGGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR 67 h1A11.1-GS14-Av VL DLL4 VL и VEGF VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKRGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR 68 Av-L-h1A11.1 VL VEGF VL и DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKR

69 Av-S-h1A11.1 VL VEGF VL и DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKR 70 Av-GS6-h1A11.1 VL VEGF VL и DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKR 71 Av-GS10-h1A11.1 VL VEGF VL и DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRGGSGGGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKR

72 Av-GS14-h1A11.1 VL VEGF VL и DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRGGSGGGGSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKR

Таблица 3a
Полноразмерные связывающие белки, направленные против эпитопов DLL4 и VEGF 73 h1A11.1-SL-Av легкая цепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDTNNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 74 h1A11.1-SL-Av тяжелая цепь EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMAWVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

В таблице 3a представлены полноразмерные последовательности тяжелой и легкой цепей для связывающих белков, направленных против VEGF и DLL4. Линкерные последовательности подчеркнуты, а последовательности CDR и константных областей указаны жирным шрифтом.

Подробное описание специфичных связывающих DVD-белков, способных связывать специфичные мишени, и способов их получения приведено в разделе «Примеры» ниже.

D. Получение связывающих белков

Связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть получены любым из ряда способов, известных в данной области. Например, связывающие белки могут быть экспрессированы в клетках-хозяевах, при этом экспрессирующий вектор (векторы), кодирующий DVD-тяжелую и DVD-легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина стандартными способами. В некоторых вариантах связывающие DVD-белки, предлагаемые в настоящем изобретении, экспрессируют в прокаритических клетках-хозяевах. В других вариантах связывающие DVD-белки экспрессируют в эукариотических клетках, например, клетках-хозяевах млекопитающих.

В иллюстративной системе рекомбинантной экспрессии DVD-белков рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий обе цепи, тяжелую цепь DVD и легкую цепь DVD, вводят в клетки DHFR-CHO, используя опосредованную фосфатом кальция трансфекцию. В рекомбинантном экспрессирующем векторе каждый из генов тяжелой и легкой цепей DVD оперативно связан с регуляторными элементами энхансером CMV/промотором AdMLP для управления высокими уровнями транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор также несет ген DHFR, который обеспечивает возможность селекции клеток CHO, которые были трансфицированы вектором, с использованием селекции/амплификации в присутствии метотрексата. Отобранные клетки-хозяева культивируют, обеспечивая возможность экспрессии тяжелой и легко цепей DVD, и интактный DVD-белок извлекают из культуральной среды. Используют стандартные способы молекулярной биологии для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и извлечения DVD-белка из культуральной среды. В различных вариантах в настоящем изобретении также предлагается способ синтеза DVD-белка посредством культивирования клетки-хозяина в подходящей культуральной среде до тех пор, пока синтезируется DVD-белок. В некоторых вариантах способ может дополнительно включать в себя выделение DVD-белка из культуральной среды.

Характерной особенностью связывающего DVD-белка является то, что он может быть получен и очищен способами, сходными со способами получения и очистки обычного антитела. В некоторых вариантах продуцирование связывающего DVD-белка приводит к получению гомогенного одного основного продукта с требуемой двойной специфичной активностью без необходимости в модификации последовательности константной области или химических модификаций. Другие ранее описанные способы создания «биспецифичных», «полиспецифичных» и «полиспецифичных поливалентных» полноразмерных связывающих белков могут приводить к получению внутриклеточной или секретируемой смеси собранных неактивных, моноспецифичных, полиспецифичных, поливалентных полноразмерных связывающих белков и поливалентных полноразмерных связывающих белков с сочетанием разных участков связывания.

В некоторых вариантах конструирование DVD-белков, предлагаемых в настоящем изобретении, приводит к получению легкой цепи с двойным вариабельным доменом и тяжелой цепи с двойным вариабельным доменом, которые, главным образом, собираются в требуемые «поливалентные полноразмерные связывающие белки с двойной специфичностью» после экспрессии в клетках-хозяевах.

В некоторых вариантах по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 90% (или любой процент между указанными значениями) экспрессированных и собранных молекул иммуноглобулинов с двойными вариабельными доменами представляют собой требуемый тетравалентный белок с двойной специфичностью, и поэтому имеют более широкую коммерческую применимость. Таким образом, в некоторых вариантах предлагается способ экспрессии легкой цепи с двойным вариабельным доменом и тяжелой цепи с двойным вариабельным доменом в одной клетке, приводящий к получению одного главного продукта «тетравалентного полноразмерного связывающего белка с двойной специфичностью».

В различных вариантах предлагаются способы экспрессии легкой цепи с двойным вариабельным доменом и тяжелой цепи с двойным вариабельным доменом в одной клетке, приводящие к получению «главного продукта» «тетравалентного полноразмерного связывающего белка с двойной специфичностью», при этом «главный продукт» составляет более 50%, например, более 75% или более 90% (или любой процент между указанными значениями), от всех собранных белков, содержащих легкую цепь с двойным вариабельным доменом и тяжелую цепь с двойным вариабельным доменом.

II. Применения связывающих белков

Учитывая способность связывающих белков, предлагаемых в настоящем изобретении, связываться с одним, двумя или большим количеством антигенов, их можно применять в некоторых вариантах для выявления антигена(ов) в образце (например, биологическом образце, таком как сыворотка или плазма) с использованием обычного иммуноанализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (РИА) или иммуногистохимия тканей. В некоторых вариантах связывающий белок прямо или опосредованно метят регистрируемым веществом для облегчения выявления связанного или несвязанного антитела. Подходящие регистрируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцирующие вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцирующих веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин. Примером люминесцентного вещества является люминол, и примеры подходящих радиоактивных веществ включают ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁶Ho и ¹⁵³Sm.

В различных вариантах связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, способны нейтрализовать активность своих антигенов-мишеней in vitro и/или in vivo. Соответственно, в некоторых вариантах связывающие белки могут быть использованы для ингибирования активности антигенов, например, в культуре клеток, содержащей антигены, в организме человека или других млекопитающих, имеющих антигены, с которыми перекрестно взаимодействует связывающий белок. В другом варианте предлагается способ снижения активности антигена у человека или животного, отличного от человека, страдающего от заболевания или расстройства, при котором антиген является вредным. В различных вариантах связывающий белок, предлагаемый в настоящем изобретении, может быть введен человеку или животному, отличному от человека с диагностическими или терапевтическими целями (например, для выявления или лечения заболевания, такого как заболевание, характеризующееся аномальной экспрессией VEGF и/или DLL4).

В используемом в настоящем описании смысле подразумевается, что термин «расстройство, при котором активность антигена является вредной» включает заболевания и/или другие расстройства, при которых присутствие антигена в организме субъекта, страдающего от расстройства, как было показано или как предполагается, ответственно за патофизиологию расстройства и/или является фактором, который вносит вклад в ухудшение расстройства. Соответственно, расстройство, при котором активность антигена является вредной, представляет собой расстройство, при котором предполагается, что снижение активности антигена ослабит симптомы и/или прогрессирование расстройства. Такие расстройства могут быть выявлены, например, по увеличению концентрации антигена в биологической жидкости субъекта, страдающего от расстройства (например, по увеличению концентрации антигена в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д. у субъекта). Неограничивающие примеры расстройств, которые можно лечить связывающими белками, предлагаемыми в настоящем изобретении, включают расстройства, обсуждаемые ниже и в разделе, имеющем отношение к фармацевтическим композициям, содержащим связывающие белки.

В различных вариантах связывающие DVD-белки применимы в качестве терапевтических средств для увеличения связывания с вредными антигенами и/или для одновременного блокирования двух разных антигенов-мишеней (DLL4 и/или VEGF), чтобы повысить эффективность/безопасность и/или увеличить охват пациентов.

Кроме того, в некоторых вариантах связывающие DVD-белки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть применены для тканеспецифичной доставки (например, для целенаправленного воздействия на тканевой маркер и/или медиатор заболевания для усиления локальной ФК и обеспечения таким образом более высокой эффективности и/или более низко токсичности), включая внутриклеточную доставку (например, направление DVD к внутриклеточной молекуле-мишени). В некоторых вариантах связывающие DVD-белки также могут служить в качестве белков-носителей для доставки антигенов в специфичное положение посредством связывания с не нейтрализующим эпитопом такого антигена, а также для увеличения времени полужизни антигена. Кроме того, в некоторых вариантах связывающий DVD-белок может быть сконструирован так, чтобы он либо был физически связан с медицинскими устройствами, имплантируемыми в организм пациентов, либо целенаправленно действовал на такие медицинские устройства (смотрите Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324; Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11): 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397).

A. Применение связывающих белков при различных заболеваниях

В различных вариантах связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, применимы в качестве терапевтических молекул для лечения различных заболеваний или расстройств, например, заболеваний или расстройств, ассоциированных с вредной экспрессией или уровнями экспрессии DLL4 и/или VEGF. В некоторых вариантах один или несколько связывающих белков могут быть введены для диагностики, лечения или усиления противоопухолевой терапии и/или могут быть полезными при лечении первичных и/или метастатических злокачественных опухолей. В различных вариантах один или несколько связывающих белков могут быть введены для диагностики, лечения или усиления лечения онкологического состояния. В других вариантах один или несколько связывающих белков могут быть введены для диагностики, лечения или усиления лечения любого другого заболевания или расстройства, характеризуемого аномальным ангиогенезом (например, общих аутоиммунных и воспалительных расстройств, заживления ран). В различных вариантах введение одного или нескольких связывающих белков приводит к связыванию с VEGF и/или DLL4, что может нейтрализовать или иным образом снизить уровни VEGF и/или DLL4 у пациента, страдающего от состояния, характеризуемого избыточными уровнями VEGF и/или DLL4.

Предлагается дополнительная информация о некоторых патологических состояниях без ограничения изобретения.

1. Онкологические расстройства

Терапия моноклональными антителами возникла как важная тактика лечения злокачественной опухоли (von Mehren et al. (2003) Annu. Rev. Med. 54: 343-69). Применение антитела с двойной специфичностью, которое раскрыто в настоящем описании и мишенью которого являются два отдельных онкологических медиатора, вероятно принесет дополнительную пользу по сравнению с моноспецифичной терапией.

В различных вариантах онкологические заболевания, которые можно диагностировать и/или лечить с применением композиций и способов, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но без ограничения, первичную или метастатическую злокачественную опухоль, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному, рак ротовой части глотки, рак гортанной части глотки, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак печени, рак желчного пузыря, рак желчных протоков, рак тонкого кишечника, рак мочевых путей (включая почки, мочевой пузырь и уротелий), рак женских половых путей (включая шейку матки, матку и яичники, а также хориокарциному и гестационную трофобластическую болезнь), рак мужских половых путей (включая опухоли простаты, семенных пузырьков, семенников и зародышевых клеток), рак эндокринных желез (включая щитовидную железу, надпочечники и гипофиз), рак кожи, гемангиомы, меланомы, саркомы (включая саркомы костей и мягких тканей, а также саркому Капоши), опухоли головного мозга, нервов, глаз и оболочки головного мозга (включая астроцитомы, глиомы, глиобластомы, ретинобластомы, нейромы, нейробластомы, шванномы и менингиомы), солидные опухоли, возникающие в результате гематопоэтических злокачественных новообразований, таких как лейкозы и лимфомы (ходжкинские и неходжкинские лимфомы), рак желудка, рак мочевого пузыря, рак простаты, рак прямой кишки, гематологические злокачественные новообразования, лейкоз, лимфому, абеталипопротеинемию, акроцианоз, острые и хронические паразитарные или инфекционные процессы, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), B-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), карциному прямой и ободочной кишки, волосатоклеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, саркому Капоши, злокачественную лимфому, злокачественный гистиоцитоз, злокачественную меланому, множественную миелому, неходжкинскую лимфому, карциному поджелудочной железы, паранеопластический синдром/гиперкальцемию при злокачественных новообразованиях, саркомы, солидные опухоли или любые другие независимые или зависимые от ангиогенеза заболевания, характеризуемые аномальной активностью DLL4 или VEGF.

В различных вариантах связывающие DVD-белки, которые связывают DLL4 и/или VEG, или их антигенсвязывающие части применяют для диагностики и/или лечения злокачественной опухоли и/или для предотвращения метастазов либо при использовании отдельно, либо в сочетании с лучевой терапией и/или другими химиотерапевтическими средствами.

2. Макулярная дегенерация

В различных вариантах композиции и способы, предлагаемые в настоящем описании, можно применять для лечения макулярной дегенерации, включая неоваскулярную (влажную) макулярную дегенерацию. Макулярная дегенерация представляет собой медицинское состояние, которое приводит к потере зрения в центре поля зрения вследствие повреждения сетчатки. Неоваскулярная (влажная) макулярная дегенерация возникает в результате аномального роста кровеносных сосудов, в конце концов приводящего к просачиванию крови и белка под макулу, что может вызывать необратимое поражение фоторецепторов.

В различных вариантах DVD, которые связывают DLL4 и/или VEGF, или их антигенсвязывающие части применяют для диагностики и/или лечения макулярной дегенерации либо при использовании отдельно, либо в сочетании с другими терапевтическими средствами.

3. Диабет и диабетическая ретинопатия

Сахарный диабет типа 1 представляет собой форму сахарного диабета, который возникает в результате аутоиммунного разрушения продуцирующих инсулин бета-клеток в поджелудочной железе. Последующее отсутствие инсулина приводит к повышенным уровням глюкозы в крови и моче. В диабетическую ретинопатию вовлечено поражение сетчатки, возникающее как следствие диабета.

Диабетическая ретинопатия является результатом небольших изменений в сосудистой системе сетчатки, которые возникают из-за индуцированой гипергликемией гибели перицитов и ослабления стенок сосудов. По мере прогрессирования заболевания тяжелая непролиферативная диабетическая ретинопатия вступает в позднюю стадию, когда пролиферируют клетки кровеносных сосудов. Без лечения новые кровеносные сосуды могут кровоточить, приводить к помутнению зрения и дальнейшему поражению сетчатки. Фиброваскулярная пролиферация также может вызывать отслоение сетчатки. Пролиферирующие кровеносные сосуды также могут прорастать в переднюю камеру глаза и вызывать неоваскулярную глаукому.

Полагают, что передача сигнала VEGF и DLL4 играет важные роли в опосредовании диабетической дисфункции эндотелия и васкулопатии, включая вовлеченность в патогенез диабетической нейропатии и ретинопатии. J. Exp. Med. 209(5): 1011-28 (2012); Nephrol. Dial. Transplant. 18 (8): 1427-1430 (2003); PNAS 109(27): E1868-77 (2012); заявка на выдачу патента США № 20110189176 (Skokos с соавторами). Таким образом, VEGF и DLL4 могут являться возможными мишенями для диагностики и/или терапии диабета и/или диабетической ретинопатии с использованием DVD согласно настоящему изобретению (например, чтобы идентифицировать уровни в сыворотке и/или изменить уровни VEGF и/или DLL4 в организме пациента). В различных вариантах DVD, которые связывают DLL4 и/или VEGF, или их антигенсвязывающие части применяют для диагностики и/или лечения сахарного диабета типа 1 и/или диабетической ретинопатии либо при использовании отдельно, либо в сочетании с другими терапевтическими средствами.

4. Атеросклероз

Полагают, что VEGF и DLL4 вовлечены в прогрессирование атеросклероза. Circulation 98(20): 2108-16 (1998); PNAS 109(27): E1868-77 (2012). В частности, была показана экспрессия VEGF в атеросклеротических поражениях коронарных артерий у человека, что свидетельствует о роли VEGF в прогрессировании атеросклероза коронарных артерий у человека, а также в процессах реканализации при обструктивных заболеваниях коронарных сосудов. Подобным образом показано, что ингибирование передачи сигналов DLL4 с использованием нейтрализующего анти-DLL4-антитела, ослабляет развитие атеросклероза и снижает кальцификацию бляшек. Таким образом, уровни VEGF и DLL4 могут являться потенциальными мишенями для диагностики и/или терапии атеросклероза с использованием DVD согласно настоящему изобретению (например, чтобы идентифицировать уровни в сыворотке и/или изменить уровни VEGF и/или DLL4 в организме пациента). В различных вариантах DVD, которые связывают DLL4 и/или VEGF, или их антигенсвязывающие части применяют для диагностики и/или лечения атеросклероза либо при использовании отдельно, либо в сочетании с другими терапевтическими средствами.

III. Фармацевтические композиции

В различных вариантах в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические композиции, содержащие один или несколько связывающих белков либо отдельно, либо в сочетании с профилактическими средствами, терапевтическими средствами и/или фармацевтически приемлемыми носителями. В различных вариантах неограничивающие примеры применений фармацевтических композиций, раскрытых в настоящем описании, включают диагностику, выявление и/или мониторинг расстройства, профилактику, лечение, контролирование и/или ослабление расстройства или одного или нескольких его симптомов, и/или применение в исследовании. Приготовление препаратов фармацевтических композиций либо отдельно, либо в сочетании с профилактическими средствами, терапевтическими средствами и/или фармацевтически приемлемыми носителями известны специалисту в данной области (публикация патента США № 20090311253 A1).

В различных вариантах фармацевтический препарат содержит одну или несколько аминокислот, один или несколько полисахаридов и/или полисорбат, и связывающий белок присутствует в концентрации от приблизительно 0,1 до 100 мг/мл, включая конечные точки (например, 0,1-10, 1-10, 0,01-50, 1-50, 1-100, 10-100, 25-100, 25-50 или 50-100 мг/мл), при этом препарат имеет pH от приблизительно 5,0 до 7,0, включая конченые точки (например, pH приблизительно 5,0-6,0, 5,5-6,0, 5,0-6,5, 5,5-6,5 или 6,0-7,0). В некоторых вариантах связывающий белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из первой и второй полипептидных цепей независимо содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, при этом VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает линкер, X2 означает Fc-область, и n равен 0 или 1, при этом домены VD1 в первой и второй полипептидных цепях образуют первый функциональный связывающий мишень участок, и домены VD2 в первой и второй полипептидных цепях образуют второй функциональный связывающий мишень участок. В одном варианте связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:56, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:64. В одном варианте связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:73, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:74. В одном варианте по меньшей мере одной аминокислотой в препарате является гистидин, и он присутствует в концентрации приблизительно 10-20 мМ, 10-15 мМ, 15-20 мМ или приблизительно 15 мМ. В одном варианте по меньшей мере одним полисахаридом в препарате является сахароза, и она присутствует в концентрации приблизительно 0-8,0% масса/объем (масс./об.). В одном варианте полисорбат в препарате представляет собой полисорбат 80 и присутствует в концентрации приблизительно 0-0,06% масс./об. В одном варианте по меньшей мере одной аминокислотой в препарате является аргинин, и он присутствует в концентрации приблизительно 0-1,5% масс./об. (например, 0,5-1,5, 1,0-1,5 или 0,5-1,0 масс./об.). В одном варианте связывающий белок присутствует в препарате в концентрации приблизительно 0,1-100 мг/мл, (например, приблизительно 1-100 мг/мл или приблизительно 1-15 мг/мл, или приблизительно 1-7,5 мг/мл, или приблизительно 2,5-7,5 мг/мл, или приблизительно 5-7,5 мг/мл, или приблизительно 25-100 мг/мл, или приблизительно 20-60 мг/мл, или приблизительно 25-50 мг/мл, или приблизительно 25 мг/мл, или приблизительно 50 мг/мл, или приблизительно 0,1-60 мг/мл, или приблизительно 0,1-25 мг/мл, или приблизительно 1,0-60 мг/мл, или приблизительно 0,5-60 мг/мл, или приблизительно 0,1-2,0 мг/мл, или приблизительно 0,5-2,0 мг/мл, или приблизительно 1-5 мг/мл, или приблизительно 1-7,5 мг/мл, или приблизительно 1-15 мг/мл, или приблизительно 0,5 мг/мл, или приблизительно 1,0 мг/мл).

В различных вариантах фармацевтический препарат является водным препаратом, лиофилизированным препаратом или лиофилизированным и регидратированным препаратом. В одном варианте гидратирующим раствором является раствор декстрозы и/или раствор соли (например, декстрозы в концентрации приблизительно 5% масс./об. и/или раствор соли в концентрации приблизительно 0,9% масс./об.). В одном варианте фармацевтический препарат содержит приблизительно 15 мМ гистидина, приблизительно 0,03% (масс./об.) полисорбата 80, приблизительно 4% (масс./об.) сахарозы и приблизительно 0,1-25 мг/мл связывающего белка или приблизительно 1-15 мг/мл связывающего белка, и имеет pH приблизительно 6, при этом связывающий белок содержит последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74. В одном варианте связывающий белок содержит h1A11.1-SL-Av. В одном варианте связывающий белок h1A11.1-SL-Av содержит Fc-область из мутанта LALA IgG1 человека. В одном варианте препарат, кроме того, содержит по меньшей мере одно дополнительное средство.

В различных вариантах применяют препарат, содержащий приблизительно 25 мг/мл связывающего белка (например, связывающего белка, содержащего последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74), приблизительно 15 мМ гистидина, 0,03% полисорбата 80 (масса/объем, масс./об.), 4,0% сахарозы (масс./об.), и имеющий pH приблизительно 6,0. В некоторых вариантах препарат не содержит аргинина. В некоторых вариантах препарат проявляет неожиданно улучшенную стабильность при замораживании-размораживании, стабильность жидкого препарата и/или стабильность лиофилизированного препарата, по сравнению с другими препаратами, содержащими другие компоненты или концентрации.

В некоторых вариантах препараты, обсуждаемые выше и содержащие связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74, проявляет неожиданное улучшение в свойствах, связанных с приготовлением препарата. Например, препараты не подвергаются нежелательному гелеобразованию, или не происходит образования высоких уровней агрегатов в случае хранения при 5°C. В некоторых вариантах препараты являются стабильными как в условиях хранения (5°C), так и в ускоренных условиях (40°C).

Способы введения профилактического или терапевтического средства, предлагаемого в настоящем изобретении, включают, но без ограничения, пероральное введение, парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, внутривенное и подкожное), эпидуральное введение, введение внутрь опухолей, мукозальное (например, интраназальный путь и введение в ротовую полость) и легочное введение (например, аэрозольные соединения, вводимые с использованием ингалятора или распылителя). Приготовление препаратов фармацевтических композиций для конкретных путей введения и материалы и способы, необходимые для осуществления различных способов введения, доступны и известны специалисту в данной области (публикация патента США № 20090311253 A1).

В различных вариантах схемы дозирования могут быть скорректированы для оптимального требуемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно вводить один болюс, можно вводить несколько дробных доз в течение определенного периода времени, или доза может быть пропорционально снижена или увеличена в зависимости от того, что требует терапевтическая ситуация. В некоторых вариантах парентеральные композиции готовят в стандартной лекарственной форме для простоты введения и единообразия дозирования. Термин «стандартная лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для млекопитающих, подвергаемых лечению; при этом каждая единица содержит предварительно определяемое количество активного соединения, вычисляемое для получения требуемого терапевтического эффекта, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем.

Примерный неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества связывающего белка, предлагаемого в настоящем изобретении, составляет приблизительно 0,1-100 мг/кг (например приблизительно 0,1-0,5, 0,1-1, 0,1-10, 0,1-20, 0,1-50, 0,1-75, 1-10, 1-15, 1-7,5, 1,25-15, 1,25-7,5, 2,5-7,5, 2,5-15, 5-15, 5-7,5, 1-20, 1-50, 7-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75 или 10-100 мг/кг или любую концентрацию в указанных диапазонах). В некоторых вариантах связывающий белок присутствует в фармацевтической композиции в терапевтически эффективной концентрации, например, в концентрации приблизительно 0,1-100 мг/мл (например приблизительно 0,1-0,5, 0,1-1, 0,1-10, 0,1-20, 0,1-50, 0,1-75, 1-10, 1-20, 1-50, 1-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75 или 10-100 мг/мл или любой концентрации в указанных диапазонах). Следует отметить, что значения доз могут варьировать в зависимости от типа и/или тяжести состояния, которое необходимо облегчить. Кроме того, должно быть понятно, что для любого конкретного субъекта конкретные схемы дозирования могут быть скорректированы с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями и/или профессиональным мнением лица, которое вводит или контролирует введение композиций, и что диапазоны доз, указанные в описании, являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или практического применения заявленной композиции.

IV. Комбинированная терапия

В различных вариантах связывающий белок, предлагаемый в настоящем изобретении, также можно вводить отдельно или в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, используемыми для лечения заболевания или расстройства, например, заболевания или расстройства, ассоциированного с вредной экспрессией или уровнями экспрессии DLL4 и/или VEGF. В некоторых вариантах один или несколько связывающих белков можно вводить в сочетании с одним или несколькими терапевтическими средствами для диагностики, лечения или усиления противоопухолевой терапии и/или для лечения первичных и/или метастатических злокачественных опухолей. В различных вариантах один или несколько связывающих белков можно вводить в сочетании с одним или несколькими терапевтическими средствами для диагностики, лечения или усиления лечения онкологического состояния. В других вариантах один или несколько связывающих белков можно вводить в сочетании с одним или несколькими терапевтическими средствами для диагностики, лечения или усиления лечения любого другого заболевания или расстройства, характеризуемого аномальным ангиогенезом (например общих аутоиммунных и воспалительных расстройств, заживления ран). В различных вариантах введение одного или нескольких связывающих белков в сочетании с одним или несколькими терапевтическими средствами приводит к нейтрализации или иному снижению уровней VEGF и/или DLL4 у пациента, страдающего от состояния, характеризуемого избыточными уровнями VEGF и/или DLL4, а также другим терапевтическим изменениям, возникающим в результате введения связывающих белков и/или одного или нескольких терапевтических средств.

В различных вариантах одно или несколько дополнительных средств выбирает специалист в данной области для предполагаемой цели. Например, дополнительным средством может быть терапевтическое средство, которое, как известно в данной области, применимо для лечения злокачественной опухоли. Комбинированная терапия также может включать более одного дополнительного средства, например, два, три, четыре, пять или больше дополнительных средств.

В различных вариантах комбинированная терапия включает, но без ограничения, использованием антиангиогенных средств, антинеопластических средств, лучевой терапии, химиотерапии, такой как ДНК-алкилирующие средства, цисплатин, карбоплатин, средства против тубулина, паклитаксел, доцетаксел, таксол, доксорубицин, гемцитабин, гемзар, антрациклины, адриамицин, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, 5-фторурацил (5-FU), лейковорин, иринотекан, ингибиторы рецепторной тирозинкиназы (например, эрлотиниб, гефитиниб) и ми-РНК.

Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств, с которыми можно сочетать связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, включают следующие средства: 13-цис-ретиноевую кислоту; 2-CdA; 2-хлордезоксиаденозин; 5-азацитидин; 5-фторурацил; 5-FU; 6-меркаптопурин; 6-MP; 6-TG; 6-тиогуанин; абраксан; аккутан®; актиномицин-D; адриамицин®; адруцил®; афинитор®; агрилин®; ала-корт ®; алдеслейкин; алемтузумаб; ALIMTA; алитретиноин; алкабан-AQ®; алкеран®; полностью трансретиноевую кислоту; альфа-интерферон; алтретамин; аметоптерин; амифостин; аминоглутетимид; анагрелид; анандрон®; анастрозол; арабинозилцитозин; Ara-C аранесп®; аредиа®; аримидекс®; аромазин®; арранон®; триоксид мышьяка; арзерра™; аспарагиназу; ATRA; авастин®; азацитидин; BCG; BCNU; бендамустин; бевацизумаб; бексаротен; BEXXAR®; бикалутамид; BiCNU; бленоксан®; блеомицин; бортезомиб; бусульфан; бусульфекс®; C225; кальций-лейковорин; кампат®; камптосар®; камптотецин-11; капецитабин карак™; карбоплатин; кармустин; кармустин в облатках; казодекс®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; церубидин®; цетуксимаб; хлорамбуцил; цисплатин; цитроворум фактор; кладрибин; кортизон; космеген®; CPT-11; циклофосфамид; цитадрен ®; цитарабин; липосомный цитарабин; цитозар-U®; цитоксан®; дакарбазин; дакоген; дактиномицин; дарбепоэтин альфа; дасатиниб; дауномицин; даунорубицин; гидрохлорид даунорубицина; липосомный даунорубицин; дауноксом®; декадрон; децитабин; дельта-кортеф®; дельтазон®; денилейкин; дифтитокс; депоцит™; дексаметазон; ацетат дексаметазона; фосфат натрия-дексаметазона; дексазон; декстразоксан; DHAD; DIC; диодекс; доцетаксел; доксил®; доксорубицин; липосомный доксорубицин; дроксиа™; DTIC; DTIC-Dome®; дуралон®; эфудекс®; элигард™; элленц™; элоксатин™; элспар®; эмцит®; эпирубицин; эпоэтин альфа; эрбитукс; эрлотиниб; L-аспарагиназу Erwinia; эстрамустин; этиол этопофос®; этопозид; фосфат этопозида; эулексин®; эверолимус; эвиста®; эксеместан; фарестон®; фаслодекс®; фемару®; филграстим; флуоксуридин; флудару®; флударабин; флуороплекс®; фторурацил; фторурацил (крем); флуоксиместерон; флутамид; фолиновую кислоту; FUDR®; фулвестрант; гефитиниб; гемцитабин; гемтузумаб озогамицин; гемзар; гливек™; глиадел® в облатке; GM-CSF; госерелин; колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF); колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (G-MCSF); галотестин®; герцептин®; гексадрол; гексален®; гексаметилмеламин; HMM; гикамтин®; гидреа®; ацетат гидрокорта®; гидрокортизона; фосфат натрия гидрокортизона; сукцинат натрия гидрокортизона; фосфат гидрокортона; гидроксимочевину; ибритумомаб; ибритумомаб тиуксетан; идамицин®; идарубицин ифекс®; интерферон-альфа; интерферон-альфа-2b (ПЭГ-конъюгат); ифосфамид; интерлекин-11 (IL-11); интерлейкин-2 (IL-2); мезилат иматиниба; карбоксамид имидазола; интрон A®; ирессу®; иринотекан; изотретиноин; иксабепилон; иксемпру™; KADCYCLA®; кидролазу (t); ланакорт®; лапатиниб; L-аспарагиназу; LCR; леналидомид; летрозол; лейковорин; лейкеран; лейкин™; лейпролид; лейрокристин; лейстатин™; липосомный Ara-C; жидкий Pred®; ломустин; L-PAM; L-сарколизин; лупрон®; лупрон депо®; матулан®; максидекс; мехлорэтамин; гидрохлорид мехлорэтамина; медралон®; медрол®; мегейс®; мегестрол; ацетат мегестрола; мелфалан; меркаптопурин; месну; меснекс™; метотрексат; метотрексат-натрий; метилпреднизолон; метикортен®; митомицин; митомицин-C; митоксантрон M-преднизол®; MTC; MTX; мустарген®; мустин; мутамицин®; милеран®; милоцел™; милотарг®; навелбин®; неларабин; неосар®; нейласта™; неймега®; нейпоген®; нексавар®; ниландрон®; нилотиниб; нилутамид; нипент®; азотистый иприт; новалдекс®; новантрон®; нплейт; октреотид; ацетат октреотида; офатумумаб; онкоспар®; онковин®; онтак®; онксал™; опрелвекин; орапред®; оразон®; оксалиплатин; паклитаксел; паклитаксел, связанный с белком; памидронат; панитумумаб; панретин® параплатин®; пазопаниб; педиапред®; ПЭГ-интерферон; пегаспаргазу; пегфилграстим; ПЭГ-интрон™; ПЭГ-L-аспарагиназу; пеметрексед; пентостатин; фенилаланин-иприт; платинол®; платинол-AQ®; преднизолон; преднизон; прелон®; прокарбазин; прокрит®; пролейкин®; пролифероспан 20 с имплантатом кармустина; пуринетол®; ралоксифен; ревиимид®; ревматрекс®; ритуксан®; ритуксимаб; роферон-A®; ромиплостим; рубекс®; гидрохлорид рубидомицина; сандостатин®; сандостатин LAR®; сарграмостин; солу-кортеф®; солу-медрол®; сорафениб; сприцел™; STI-571; стрептозоцин; SU11248; сунитиниб; сутент®; тамоксифен тарцева®; таргретин®; тасигну®; таксол®; таксотере®; темодар®; темозоломид темсиролимус; тенипозид; TESPA; талидомид; таломид®; тера-цис®; тиогуанин; тиогуанин таблоид®; тиофосфоамид; тиоплекс®; тиотепа; TICE®; топосар®; топотекан; торемифен; торисел®; тозитумомаб; трастузумаб; треанда®; третиноин; трексалл™; трисенокс®; TSPA; TYKERB®; VCR; вектибикс™; велбан®; велкад®; вепезид®; весаноид®; виадур™; видаза®; винбластин; сульфат винбластина; винкасар Pfs®; винкристин; винорелбин; тартрат винорелбина; VLB; VM-26; вориностат; вотриент; VP-16; вумон®; кселода®; заносар®; зевалин™; зинекард®; золадекс®; золедроновую кислоту; золинзу или зомету®.

В одном варианте связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют в сочетании с одним или несколькими из следующих средств: темозоломидом®, иринотеканом, лейковорином, 5-FU, гемцитабином и паклитакселом. В одном варианте связывающий белок h1A11.1-SL-Av применяют в сочетании с одним или несколькими средствами: темозоломидом®, иринотеканом, лейковорином, 5-FU, гемцитабином и паклитакселом.

В различных вариантах связывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, также можно сочетать с таким средством, как метотрексат, 6-MP, азатиоприн, сульфасалазин, месалазин, олсалазин, хлорохинин/гидроксихлорохин, пеницилламин, ауротиомалат (внутримышечный и пероральный), азатиоприн, колхицин, кортикостероид (пероральный, ингаляционный и для местной инъекции), агонисть бета-2-адренорецептора (салбутамол, тербуталин, салметерал), ксантин (теофиллин, аминофиллин), кромогликат, недокромил, кетотифен, ипратропий, окситропий, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, НПВС, например, ибупрофен, кортикостероид, такой как преднизолон, ингибитор фосфодиэстеразы, агонист аденозина, противотромботическое средство, ингибитор комплемента, адренергическое средство, средство, которое мешает передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNF-α или IL-1 (например, ингибитор IRAK, NIK, IKK, p38 или ингибитор MAP-киназы), ингибитор фермента, превращающего IL-1β, ингибитор фермента превращения TNFα (TACE), ингибитор передачи T-клеточных сигналов, такой как ингибитор киназы, ингибитор металлопротеиназы, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурин, ингибитор ангиотензин-превращающего фермента, растворимый рецептор цитокинов или его производное (например, растворимый рецептор TNF p55 или p75 или производное p75TNFRIgG (энбрел™) или p55TNFRIgG (ленерцепт), sIL-RI, sIL-1RII, sIL-6R), противовоспалительный цитокин (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ), целекоксиб, фолиевая кислота, сульфат гидроксихлорохина, рофекоксиб, этанерцепт, инфликсимаб, напроксен, вальдекоксиб, сульфасалазин, метилпреднизолон, мелоксикам, ацетат метилпреднизолона, ауротиомалат натрия, аспирин, ацетонид триамцинолона, напсилат/апап пропоксифена, фолат, набуметон, диклофенак, пироксикам, этодолак, диклофенак-натрий, оксапрозин, оксикодон HCl, битартрат/апап гидрокодона, диклофенак-натрий/мизопростол, фентанил, анакинра, человеческий рекомбинантный, трамадол HCl, салсалат, сулиндак, цианокобаламин/fa/пиридоксин, ацетаминофен, алендронат натрия, преднизолон, сульфат морфина, гидрохлорид лидокаина, индометацин, сульфат глюкозамина/хондроитин, амитриптилин HCl, сульфадиазин, оксикодон HCl/ацетаминофен, олопатадин HCl, мизопростол, напроксен натрия, омепразол, циклофосфамид, ритуксимаб, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, анти-IL-18, анти-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, рофлумиласт, IC-485, CDC-801 или мезопрам. В некоторых вариантах сочетания могут включать метотрексат или лефлуномид и циклоспорин.

В некоторых вариантах фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, могут содержать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» связывающего белка, предлагаемого в изобретении. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтическое эффективное количество связывающего белка может быть определено специалистом в данной области и может варьировать в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и масса индивидуума и способность связывающего белка вызывать требуемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой такое количество, при использовании которого любые токсические или вредные эффекты антитела или связывающее части антитела перевешиваются терапевтически полезными эффектами. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого профилактического результата. Обычно в связи с тем, что профилактическую дозу используют для субъектов до возникновения или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

V. Диагностика

Изобретение, раскрытое в настоящей публикации, также относится к диагностическим применениям, включая без ограничения способы диагностических анализов с использованием одного или нескольких связывающих белков, диагностических наборов, содержащих один или несколько связывающих белков, и к способам и наборам для применения в автоматизированных и/или полуавтоматизированных системах. В некоторых вариантах способы и наборы можно применять для выявления, мониторинга и/или лечения заболевания или расстройства у индивидуума.

A. Способ анализа

В различных вариантах предлагаются способы определения присутствия, количества и/или концентрации по меньшей мере одного аналита или его фрагмента в тестируемом образце с использованием по меньшей мере одного связывающего белка. Примеры анализов включают, но без ограничения, иммуноанализы и/или способы, в которых используют масс-спектрометрию.

Например, иммуноанализы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать наряду с прочими иммуноанализы типа «сэндвич», радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (EIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммуноанализы конкурентного ингибирования, поляризационные флуоресцентные иммуноанализы (FPIA), способы иммуноанализов с ферментативным усилением (EMIT), резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET) и анализы гомогенной хемилюминесценции.

В некоторых вариантах предлагается способ определения присутствия, количества или концентрации одного или нескольких антигенов или их фрагментов в тестируемом образце, при этом один или несколько антигенов или их фрагментов представляют собой DLL4 и/или VEGF. Способ включает в себя анализ тестируемого образца в отношении антигена или его фрагмента с использованием иммуноанализа. В иммуноанализе: (i) используют по меньшей мере один связывающий белок и по меньшей мере одну регистрируемую метку и (ii) иммуноанализ включает в себя сравнение сигнала, генерируемого регистрируемой меткой, в качестве прямого или опосредованного показателя присутствия, количества или концентрации антигена или его фрагмента в тестируемом образце, с сигналом, генерируемым в качестве прямого или опосредованного показателя присутствия, количества или концентрации антигена или его фрагментов в контроле или калибровочном эталоне. Калибровочный эталон необязательно является частью калибровочных эталонов, в которой каждый из калибровочных эталонов отличается от других калибровочных эталонов в серии по концентрации антигена или его фрагмента. Способ может включать в себя: (i) осуществление контакта тестируемого образца с по меньшей мере одним улавливающим средством, которое связывается с эпитопом на антигене или его фрагменте, для того, чтобы образовался комплекс, содержащий улавливающее средство и антиген или его фрагмент; (ii) осуществление контакта комплекса, содержащего улавливающее средство и антиген или его фрагмент с по меньшей мере одним средством для выявления, которое содержит регистрируемую метку и связывается с эпитопом на антигене или его фрагменте, который не связывается улавливающим средством, с образованием регистрируемого комплекса, и (iii) определение присутствия, количества или концентрации антигена или его фрагмента в тестируемом образце на основании сигнала, генерируемого регистрируемой меткой в регистрируемом комплексе, образованном на стадии (ii), при этом по меньшей мере одно улавливающее средство и/или по меньшей мере одно средство для выявления представляет собой по меньшей мере один связывающий белок.

Альтернативно в некоторых вариантах способ определения присутствия, количества или концентрации одного или нескольких антигенов или их фрагментов в тестируемом образце может включать в себя: (i) осуществление контакта тестируемого образца с по меньшей мере одним улавливающим средством, которое связывается с эпитопом на антигене или его фрагменте, для того, чтобы образовался комплекс, содержащий улавливающее средство и антиген или его фрагмент, и одновременно или последовательно в любом порядке осуществление контакта тестируемого образца с антигеном, меченым регистрируемой меткой, или его фрагментом, который может конкурировать с любым антигеном или его фрагментом в тестируемом образце за связывание с по меньшей мере одним улавливающим средством, при этом любой антиген или его фрагмент, присутствующий в тестируемом образце и меченый регистрируемой меткой антиген конкурируют друг с другом за образование выявляемого комплекса, и (ii) определение присутствия, количества или концентрации антигена или его фрагмента в тестируемом образце на основании сигнала, генерируемого регистрируемой меткой в выявляемом комплексе, образованном на стадии (i), при этом по меньшей мере одно улавливающее средство представляет собой по меньшей мере один связывающий белок, и при этом сигнал, генерируемый регистрируемой меткой в улавливающем выявляемом комплексе обратно пропорционален количеству или концентрации антигена или его фрагмента в тестируемом образце.

В различных вариантах тестируемый образец может быть получен от пациента, и в таком случае способ может дополнительно включать в себя диагностику, прогнозирование или оценку эффективность терапевтического/профилактического лечения пациента. Если способ дополнительно включает в себя оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента, то способ необязательно дополнительно включает в себя модификацию терапевтического/профилактического лечения пациента таким образом, который необходим для повышения эффективности. Способ может быть адаптирован для применения в автоматизированной системе или полуавтоматизированной системе. Соответственно, способы, описанные в настоящей публикации, также можно применять для определения того, имеет ли субъект или подвергается ли он риску развития данного заболевания, расстройства или состояния. В частности, такой способ может включать в себя стадии:

(a) определения концентрации или количества одного или нескольких аналитов или их фрагментов в тестируемом образце, полученном от субъекта (например, с применением способов, описанных в настоящей публикации, или способов, известных в данной области); и (b) сравнения концентрации или количества аналита(ов) или его фрагмента(ов), которые определяют на стадии (a), с предварительно определяемым уровнем, при этом если концентрация или количество аналита(ов), определяемые на стадии (a), удовлетворяют значению предварительно определяемого уровня, то определяют, что субъект не имеет или не подвергается риску развития данного заболевания, расстройства или состояния. Однако если концентрация или количество аналита(ов), определяемые на стадии (a) не удовлетворяют значению предварительно определяемого уровня, то определяют, что субъект имеет или подвергается риску развития данного заболевания, расстройства или состояния.

Кроме того, в изобретении предлагаются способы мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта. В некоторых вариантах способы включают в себя стадии:

(a) определения концентрации или количества в тестируемом образце, полученном от субъекта, одного или нескольких аналитов;

(b) определения концентрации или количества аналита(ов) в более позднем тестируемом образце, взятом от того же субъекта; и

(c) сравнения концентрации или количества аналита(ов), которые определяют на стадии (b), с концентрацией или количеством аналита(ов), определяемым на стадии (a), при этом, если концентрация или количество, определяемые на стадии (b), не изменяются или являются неудовлетворительными по сравнению с концентрацией или количеством, определяемым на стадии (a), то определяют, что заболевание у субъекта продолжается, прогрессирует или ухудшается. При сравнении, если концентрация или количество, которые определяют на стадии (b), являются удовлетворительными по сравнению с концентрацией или количеством, которые определяют на стадии (a), то определяют, что заболевание у субъекта приостановлено, регрессировало или состояние улучшилось.

Необязательно способы мониторинга прогрессирования заболевания дополнительно включают в себя сравнение концентрации или количества аналита(ов), которые определяют на стадии (b), например, с предварительно определяемым уровнем. Кроме того, необязательно способы включают в себя лечение субъекта одной или несколькими фармацевтическими композициями в течение определенного периода времени, если сравнение показывает, что концентрация или количество аналита(ов), которые определяют на стадии (b), например, неудовлетворительно изменены по сравнению с предварительно определяемым уровнем.

В некоторых вариантах присутствие, количество или концентрацию аналита или его фрагмента выявляют в образце, используя регистрируемую метку, такую как хемилюминесцентная метка (соединение акридиния). В некоторых вариантах хемилюминесцентный сигнал, который генерируется, может быть выявлен с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области. На основании интенсивности генерируемого сигнала может быть определено количество или концентрация аналита в образце. В частности, в некоторых вариантах количество аналита в образце может быть пропорционально интенсивности генерируемого сигнала. В некоторых вариантах количество присутствующего аналита может быть определено путем сравнения количества генерируемого света со стандартной кривой для аналита или путем сравнения с эталонным стандартом или калибровочным эталоном. Стандартная кривая может быть создана с использованием серийных разведений или растворов с известными концентрациями аналита посредством масс-спектроскопии, гравиметрических способов и других способов, известных в данной области.

Иммуноанализы аналитов обычно могут быть проведены с использованием любой формы, известной в данной области, такой как без ограничения форма «сэндвича». Например, в иммуноанализах один или несколько связывающих белков можно использовать для улавливания аналита (или его фрагмента) в тестируемом образце (такие связывающие белки часто называют «улавливающими» связывающими белками), и один или несколько связывающих белков можно использовать для связывания регистрируемой (а именно количественно определяемой) метки с сэндвичем (такие связывающие белки часто называют связывающими белками «для выявления», «конъюгатом» или «конъюгатами»). Таким образом, в контексте иллюстративной формы иммуноанализа типа «сэндвич» DVD (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), которая описана в настоящей публикации можно применять в качестве улавливающего связывающего белка, связывающего белка для выявления или в качестве и того и другого. Например, DVD, имеющий первый домен, который может связывать эпитоп на первом аналите (или его фрагменте), и второй домен, который может связывать эпитоп на втором аналите (или его фрагменте), можно применять в качестве улавливающего связывающего белка и/или связывающего белка для выявления, чтобы выявить и необязательно количественно определить один или несколько аналитов (например, DLL4 и/или VEGF). В следующем примере применение DVD, имеющего разные аффинности в анализе типа «сэндвича», может обеспечить преимущественно, связанное с авидностью. В контексте иммуноанализов, которые описаны в настоящей публикации, обычно может быть полезным или может требоваться включение одного или нескольких линкеров в структуру DVD. Оптимально, чтобы линкер, при его наличии, имел достаточную длину и структурную гибкость, чтобы обеспечить связывание эпитопа внутренними доменами, а также связывание другого эпитопа наружными доменами. В этой связи в том случае, если DVD может связывать два разных аналита, и один аналит больше, чем другой, то желательно, чтобы более крупный аналит связывался наружными доменами.

В различных вариантах образец, подвергаемый тестированию (например, образец, который предположительно содержит аналит или его фрагмент), может быть подвергнут контакту с по меньшей мере одним улавливающим связывающим белком и по меньшей мере одним связывающим белком для выявления, либо одновременно, либо последовательно и в любом порядке. Например, тестируемый образец может быть сначала подвергнут контакту с по меньшей мере одним улавливающим связывающим белком и затем (последовательно) с по меньшей мере одним связывающим белком для выявления. Альтернативно тестируемый образец сначала может быть подвергнут контакту с по меньшей мере одним связывающим белком для выявления, а затем (последовательно) с по меньшей мере одним улавливающим связывающим белком. В еще одном альтернативном варианте, тестируемый образец может быть подвергнут контакту одновременно с улавливающим связывающим белком и связывающим белком для выявления. В различных вариантах могут быть использованы иммуноанализы конкурентного ингибирования, включающие в себя использование одного или нескольких DVD, раскрытых в настоящем описании, для выявления присутствия, количества или концентрации одного или нескольких аналитов или их фрагментов (например, DLL4 и/или VEGF).

В различных вариантах регистрируемая метка может быть связана со связывающими белками либо непосредственно, либо через связывающий агент. Примером связывающего агента, который можно использовать, является EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, гидрохлорид), который коммерчески доступен из Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Другие связывающие агенты, которые могут быть использованы, известны в данной области. Способы связывания регистрируемой метки со связывающим белком известны в данной области.

В различных вариантах присутствие или количество метки, связанной с комплексом, содержащим аналит и DVD, в анализе можно оценить, используя способы, известные в данной области. Например, если используют ферментативную метку, то меченый комплекс может подвергнут взаимодействию с субстратом для метки, в результате которого происходит реакция, которую можно оценить количественно, такая как развитие окраски. Если метка является радиоактивно меткой, то метку можно количественно оценить, используя соответствующие способы, такие как сцинтилляционный счетчик. Если метка представляет собой флуоресцирующую метку, то метку можно количественно оценить посредством стимуляции метки и регистрации флуоресцентного сигнала. Если метка является хемилюминесцентной меткой, то метку можно количественно оценить, выявляя испускаемое свечение либо визуально, либо с использованием люменометров, рентгеновской пленки, пленка для высокоскоростной фотосъемки, ПЗС-камеры и т.д. В некоторых вариантах после того, как определено количество метки в комплексе, можно определить концентрацию аналита или его фрагмента в тестируемом образце соответствующими способами, такими как использование стандартной кривой, которая была создана с использованием серийных разведений аналита или его фрагмента с известной концентрацией или с помощью любого другого калибровочного эталона.

В одном варианте используют иммуноанализ на основе хемилюминесцентных микрочастиц, в частности, анализ, в котором используют автоматический анализатор ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).

В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагаются способы, в которых используют масс-спектрометрию, и такие способы включают, но без ограничения, MALDI (активируемая матрицей лазерная десорбция/ионизация) и SELDI (усиливаемая поверхностью лазерная десорбция/ионизация).

Способы сбора, обработки и анализа биологических тестируемых образцов с использованием иммуноанализов и масс-спектрометрии хорошо известны специалисту в данной области и предлагаются для практического осуществления настоящего изобретения (US 2009-0311253 A1).

B. Набор

В различных вариантах также предлагается набор для анализа тестируемого образца в отношении присутствия, количества и/или концентрации по меньшей мере одного аналита или его фрагмента в тестируемом образце. В некоторых вариантах набор содержит по меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца в отношении аналита или его фрагмента и инструкции по анализу тестируемого образца в отношении аналита или его фрагмента. По меньшей мере, один компонент для анализа тестируемого образца в отношении аналита или его фрагмента может включать композицию, содержащую связывающий белок, который раскрыт в настоящем описании, и/или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта. В некоторых вариантах компонент необязательно иммобилизован на твердой фазе.

Необязательно, в некоторых вариантах набор может включать в себя калибровочный эталон или контроль, который может содержать изолированный или очищенный аналит. В некоторых вариантах набор может содержать по меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца в отношении аналита с использованием иммуноанализа и/или масс-спектрометрии. Компоненты набора, включая аналит, связывающий белок и/или связывающий белок против аналита или их фрагменты, необязательно можно метить с использованием любой известной в данной области регистрируемой метки (US 2009-0311253 A1).

C. Автоматизация

В различных вариантах наборы (или их компоненты) и способы определения присутствия, количества и/или концентрации по меньшей мере одного аналита в тестируемом образце могут быть адаптированы для применения в различных автоматизированных и полуавтоматизированных системах, которые описаны, например, в патентах США № 5089424 и 5006309, и в виде продаваемых на рынке, например, Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) в виде ARCHITECT®.

Другие автоматизированные или полуавтоматизированные платформы, которые можно использовать по отношению к связывающим белкам, включают, но без ограничения, AxSYM®, IMx® (смотрите, например, патент США № 5294404, PRISM®, EIA (шарики) и Quantum™ II (все из Abbott Laboratories), а также другие платформы, известные в данной области. Кроме того, анализы, наборы и компоненты наборов можно применять в других формах, например, в системах электрохимического и/или другого портативного или используемого в месте наблюдения за пациентом анализа. Настоящее изобретение, например, применимо к коммерческой электрохимической системе иммуноанализа, используемой в месте наблюдения за пациентом Abbott (i-STAT®, Abbott Laboratories), которая позволяет осуществлять иммуноанализы типа «сэндвич». Иммуносенсоры и способы их производства и работы в устройствах для одноразовых тестов описаны, например, в патентах США № 5063081, 7419821 и 7682833 и в публикациях патентов США № 20040018577, 20060160164 и US 20090311253.

Специалисты в данной области легко поймут, что другие подходящие модификации и адаптации способов, описанных в настоящей публикации, очевидны и могут быть осуществлены с использованием подходящих эквивалентов, не выходя за рамки объема вариантов осуществления изобретения, раскрытых в настоящем описании. Далее, после подробного описания некоторых вариантов, такие варианты будут более понятны при обращении к следующим примерам, которые включены в только целях иллюстрации и не предназначены для ограничения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: конструирование анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-молекул

Последовательности вариабельных доменом из гуманизированного анти-DLL4-мАт (h1A11.1) и анти-VEGF мАт-(Av) использовали для конструирования доменов VH и VL анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-молекул. Вариабельные области синтезировали, используя двухстадийную ПЦР. Праймеры конструировали с фланкирующими областями, гомологичными клонирующему вектору и линкерной области между каждой парой вариабельных доменов DVD. Осуществляли трансформацию бактерий, чтобы идентифицировать позитивные клоны, и конструкции собирали и очищали для применения в трансформации млекопитающих, используя стандартные протоколы, известные в данной области.

Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей клонировали в рамке с константными областями тяжелой цепи и легкой цепи каппа IgG1 человека (L234, 235A), соответственно, создавая анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-молекулы (таблица 4).

Таблица 4
Анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-конструкции Название DVD Тяжелая цепь (HC) Легкая цепь (LC) h1A11.1-LL-Av h1A11.1-L-Av HC h1A11.1-L-Av LC h1A11.1-LS-Av h1A11.1-L-Av HC h1A11.1-S-Av LC h1A11.1-SL-Av h1A11.1-S-Av HC h1A11.1-L-Av LC h1A11.1-SS-Av h1A11.1-S-Av HC h1A11.1-S-Av LC h1A11.1-GS10-Av h1A11.1-GS10-Av HC h1A11.1-GS10-Av LC h1A11.1-GS14-Av h1A11.1-GS14-Av HC h1A11.1-GS14-Av LC Av-LL-h1A11.1 Av-L-h1A11.1 HC Av-L-h1A11.1 LC Av-LS-h1A11.1 Av-L-h1A11.1 HC Av-S-h1A11.1 LC Av-SL-h1A11.1 Av-S-h1A11.1 HC Av-L-h1A11.1 LC Av-SS-h1A11.1 Av-S-h1A11.1 HC Av-S-h1A11.1 LC Av-GS6-h1A11.1 Av-GS6-h1A11.1 HC Av-GS6-h1A11.1 LC Av-GS10-h1A11.1 Av-GS10-h1A11.1 HC Av-GS10-h1A11.1 LC Av-GS14-h1A11.1 Av-GS14-h1A11.1 HC Av-GS14-h1A11.1 LC

Пример 2: определение аффинности анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-конструкций

Использовали анализ BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) для оценки связывания DVD с очищенным рекомбинантным внеклеточным доменом (ECD) DLL4 или с VEGF₁₆₅, которое определяли путем измерений, основанных на резонансе поверхностного плазмона, осуществляемых на Biacore 2000, Biacore 3000 или Biacore T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) при 25°C. В случае измерений кинетики связывания DLL4 в качестве буфера для анализа использовали HBS-EPB: 10 мМ Hepes, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% твин-20, 0,1 мг/мл БСА (Sigma A7906). В случае измерений кинетики связывания VEGF в качестве буфера для анализа использовали HBS-EP+(3N01B): 10 мМ Hepes, pH 7,5, 300 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% твин-20, 0,1 мг/мл БСА (Sigma A7906). Например, приблизительно 9000 условных единиц специфичных поликлональных антител козы против Fc человека (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL), разбавленных в 10 мМ ацетате натрия (pH 4,5) непосредственно иммобилизуют на биосенсорном чипе CM5 высокой чистоты, используя стандартный набор для связывания аминов согласно инструкциям производителя и способам в концентрации 25 мкг/мл. Не прореагировавшие остатки на поверхности биосенсора блокируют этаноламином. В случае кинетических анализов уравнения скорости, полученные на основании модели связывания Ленгмюра 1:1, одновременно подгоняют к множественным инъекциям антигенов (используя анализ на основе глобальной подгонки) с помощью Scrubber 2 (BioLogic Software), компьютерной программы Biacore Biaevaluation 4.0.1 или компьютерной программы Biacore T100 Evaluation. Очищенные антитела разбавляют в рабочем буфере для улавливания на реакционных поверхностях с антителом козы против Fc человека. Антитела, которые необходимо уловить в качестве лиганда (1 мкг/мл), инъецируют на реакционные матрицы со скоростью потока 10 мкл/мин. В ходе анализа все измерения сравнивают с поверхностью для улавливания в качестве эталона сравнения (т.е. без улавливаемого антитела). Константы скорости ассоциации и диссоциации, K_on (М^-1⋅с^-1) и K_off (с^-1) определяют при скорости непрерывного потока 80 мкл/мин. Константы скорости получают, производя измерения кинетики связывания при разных концентрациях антигена в диапазоне 1,23-900 нМ, в виде 3-кратных серийных разведений, и с включением инъекций только одного буфера (которые используют для двойного сравнительного контроля). Затем вычисляют равновесную константу диссоциации K_D (М) для взаимодействия между антителами и антигеном-мишенью, исходя из кинетических констант скорости по следующей формуле: K_D=K_off/K_on. Связывание регистрируют в виде функции времени и вычисляют кинетические константы скорости. В данном анализе могут быть измерены такие высокие скорости образования комплексов, как 10⁶ М^-1⋅с^-1, и такие низкие скорости распада комплекса, как 10^-6 с^-1. Аффинности связывания антигена для анти-DLL4/анти-VEGF-DVD суммированы в таблицах 5 и 6.

Таблица 5
Кинетические данные, полученные с использованием Biacore, для связывающих анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-белков Название DVD BIAcore DLL4₅₂₉ человека BIAcore VEGF₁₆₅ человека K_on K_off K_D K_on K_off K_D (M^-1⋅с^-1) (с^-1) (M) (M^-1⋅с^-1) (с^-1) (M) Av Н/П Н/П Н/П 1,19E+05 3,47E-05 2,9E-10 h1A11.1 1,60E+05 1,93E-03 1,2E-08 Н/П Н/П Н/П h1A11.1-LL-Av 2,05E+05 2,63E-03 1,2E-08 5,19E+04 2,44E-05 4,7E-10 h1A11.1-LS-Av 2,15E+05 2,36E-03 1,1E-08 2,26E+04 2,83E-05 1,3E-09 h1A11.1-SL-Av 2,17E+05 2,24E-03 1,0E-08 4,57E+04 3,20E-05 7,0E-10 h1A11.1-SS-Av 1,92E+05 2,25E-03 1,2E-08 7,32E+03 5,42E-05 7,4E-09 h1A11.GS10-Av 2,52E+05 2,33E-03 9,3E-09 1,92E+04 4,26E-05 2,2E-09 h1A11.1-GS14-Av 2,40E+05 2,33E-03 9,7E-09 2,87E+04 3,72E-05 1,3E-09 Av-GS6-h1A11.1 1,41E+04 7,03E-04 5,0E-08 1,94E+05 3,72E-05 1,9E-10 Av-GS10-h1A11.1 3,45E+04 1,01E-03 2,9E-08 1,84E+05 3,59E-05 1,9E-10 Av-GS14-h1A11.1 3,97E+04 1,34E-03 3,4E-08 1,82E+05 3,08E-05 1,7E-10 Н/П: не применимо.

Таблица 6
Дополнительные кинетические данные, полученные с использованием Biacore, для h1A11.1-SL-Av-DVD Название DVD BIAcore DLL4₅₂₉ макака-крабоеда BIAcore DLL4₅₃₀ мыши K_on K_off K_D K_on K_off K_D (M^-1⋅с^-1) (с^-1) (M) (M^-1⋅с^-1) (с^-1) (M) h1A11.1-SL-Av 4,43E+05 2,49E-03 5,6E-09 3,22E+05 7,74E-03 2,4E-08

Пример 3: характеристика in vitro анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-молекул

Пример 3.1: активность связывания DLL4, которую определяли, используя проточную цитометрию (FACS)

Стабильные линии клеток HEK293G, сверхэкспрессирующих полноразмерный DLL4, собирали из флаконов для культуры тканей, промывали четыре раза и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 1 мМ CaCl₂ (FACS-буфер). 1,5×10⁵ клеток инкубировали со связывающими DVD-белками в различных концентрациях в FACS-буфере в течение 60 минут на льду. Клетки два раза промывали и добавляли 50 мкл конъюгированного с R-фикоэритрином антитела против F(ab’)₂-фрагмента IgG крысы (разведение 1:200 в FACS-буфере) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, в каталоге № 12-116-072). После инкубации на льду (4°C, 60 минут), клетки три раза промывали и ресуспендировали в FACS-буфере. Флуоресценцию измеряли, используя Becton Dickinson FACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, CA). Данные анализировали, используя компьютерную программу Graphpad Prism, и значения EC₅₀ представляли в виде концентрации антитела, необходимого для достижения 50% от максимального связывания антител с клетками, экспрессирующими DLL4.

Пример 3.2: DLL4-блокирующая активность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-белков, которую определяли по ингибированию взаимодействия Notch-1 с растворимым внеклеточным доменом DLL4

96-луночные планшеты Nunc-Immuno (№ 439454 для ELISA huDLL4) и 96-луночные планшеты Costar (№ 9018 для ELISA muDLL4) покрывали 16 нМ Notch-1 человека (R&D Systems № 3647-TK, 100 мкл/лунку в D-PBS) и инкубировали в течение ночи при 4°C. Затем планшеты промывали 3 раза буфером для промывки (PBS, 0,05% твин-20) и блокировали, используя 200 мкл/лунку блокирующего буфера (D-PBS, 1% БСА, 1 мМ CaCl₂, 0,05% твин-20), в течение 1 часа при 25°C. Пока происходило блокирование, меченный биотином внеклеточный домен DLL4 (14 нМ) смешивали с антителом (30 пМ - 66 нМ, 3-кратные серийные разведения в блокирующем буфере) в течение 1 часа при 25°C со встряхиванием. Планшеты для анализа промывали после блокирования и инкубировали со смесями DLL4/антитело (100 мкл/лунку, 1 час при 25°C со встряхиванием). Планшеты снова промывали и добавляли 100 мкл/лунку стрептавидина, конъюгированного с HRP (Fitzgerald № 65R-S104PHRPx, в разведении 1:5000 в блокирующем буфере) на 1 час при 25°C со встряхиванием. После последней промывки планшеты проявляли, используя 100 мкл/лунку субстрата (TMB Sigma № T8665), и реакцию останавливали, используя 100 мкл/лунку 1 н. HCl, и регистрировали оптическую плотность при 450 нм. Данные анализировали, используя компьютерную программу Graphpad Prism, и значения IC₅₀ представляли в виде концентрации антитела, необходимой для достижения 50% снижения связывания DLL4 с Notch1.

Пример 3.3: DLL4-блокирующая активность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-белков, которую определяли по ингибированию зависимой от DLL4 активации Notch, используя анализ на основе репортера Notch

В 96-луночные планшеты для культуры ткани с черным прозрачным дном высевали сконструированные клетки EA.hy926, экспрессирующие люциферазу, управляемую отвечающим на Notch промотором (7000 клеток/лунку) и оставляли на ночь. Антитела, серийно разведенные из раствора с концентрацией 200 нМ, смешивали в течение 15 минут с равным объемом раствора, содержащего клетки HEK293G, экспрессирующие полноразмерный DLL4 (5000 клеток/лунку). Клетки 293G/DLL4 культивировали совместно с клетками с репортером Notch EA.hy926 в течение 24 часов в присутствии антител для тестирования. Активность люциферазы анализировали, используя субстрат из Promega (Promega, № E2940). Данные анализировали, используя компьютерную программу Graphpad Prism, и значения IC₅₀ представляли в виде концентрации антитела, необходимой для достижения 50% снижения DLL4-индуцированной активации Notch.

Пример 3.4: активность в связывании VEGF анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-белков, которую определяли в ELISA с улавливанием

Планшеты ELISA (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) инкубировали в течение ночи при 4°C с антителом против Fc человека (5 нг/мл в PBS, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Планшеты промывали три раза в буфере для промывки (PBS, содержащий 0,05% твин-20) и блокировали в течение 1 часа при 25°C в блокирующем буфере (PBS, содержащий 1% БСА). Лунки промывали три раза и каждое антитело или DVD серийно разводили в PBS, содержащем 0,1% БСА, перед инкубацией при 25°C в течение 1 часа. Лунки промывали три раза и в планшеты добавляли биотинилированный VEGF (2 нМ) и инкубировали в течение 1 часа при 25°C. Лунки промывали три раза и затем инкубировали в течение 1 часа при 25°C со стрептавидином-HRP (KPL № 474-3000, Gaithersburg, MD). Лунки промывали три раза и добавляли 100 мкл ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) на лунку. После развития окраски реакцию останавливали, используя 1 M HCl, и измеряли оптическую плотность при 450 нМ.

Пример 3.5: VEGF-блокирующая активность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-белков, которую определяли по ингибированию взаимодействия VEGF с VEGFR1

Планшеты для ELISA (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) инкубировали в течение ночи при 4°C с 100 мкл PBS, содержащего рекомбинантный слитый белок внеклеточный домен VEGFR1-Fc (5 мкг/мл, R&D systems, Minneapolis, MN). Планшеты промывали три раза в буере для промывки (PBS, содержащий 0,05% твин-20) и блокировали в течение 1 часа при 25°C в блокирующем буфере (PBS, содержащий 1% БСА). Каждое антитело и DVD серийно разводили в PBS, содержащем 0,1% БСА и инкубировали с 50 мкл 2 нМ биотинилированного VEGF в течение 1 часа при 25°C. Затем смеси антитела и биотинилированного VEGF или DVD и биотинилированного VEGF (100 мкл) добавляли в лунки, покрытые VEGFR1-Fc, и инкубировали при 25°C в течение 10 минут. Лунки промывали три раза и затем инкубировали в течение 1 часа при 25°C с 100 мкл стрептавидина-HRP (KPL № 474-3000, Gaithersburg, MD). Лунки промывали три раза и добавляли 100 мкл ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) на лунку. После развития окраски реакцию останавливали, используя 1 М HCl, и измеряли оптическую плотность при 450 нМ.

Пример 3.6: VEGF-блокирующая активность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-белка, которую определяли по ингибированию VEGF-стимулированной пролиферации/жизнеспособности эндотелиальных клеток

Перед посевом для анализа эндотелиальные клетки TIME (ATCC) или HUVEC (пассажи 2-6) поддерживали в EBM-2 (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD) с добавлением EGM-2 SingleQuots (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD, № CC-4176). Клетки высевали по 10000 клеток/лунку на покрытые коллагеном черные 96-луночные планшеты в 100 мкл EMB-2 с 0,1% FBS в отсутствие факторов роста. На следующий день среду заменяли 0,1% FBS без факторов роста. На следующий день среду заменял 100 мкл EMB-2 (без факторов роста или сыворотки) и инкубировали в течение четырех часов перед добавлением VEGF и антител или DVD. Моноклональные анти-VEGF-антитела или DVD серийно разводили в EMB-2 с 0,1% БСА и предварительно инкубировали с рекомбинантным VEGF₁₆₅ человека (50 нг/мл) в течение 1 часа при 25°C в 50 мкл. Затем смеси антитела и VEGF или DVD и VEGF добавляли к клеткам (50 мкл) и планшеты инкубировали при 37°C во влажной, содержащей 5% CO₂ атмосфере в течение 72 часов. Жизнеспособность/пролиферацию клеток измеряли непосредственно, оценивая уровни АТФ с использованием набора ATPIite (Perkin Elmer, Waltham, MA) согласно инструкциям производителя.

Активности in vitro анти-DLL4/анти-VEGF-DVD, которые характеризовали в описанных выше анализах, суммированы в таблице 7.

Таблица 7
Характеристика анти-DLL4/анти-VEGF-DVD in vitro Название DVD DLL4 человека VEGF человека Связывание Функциональная блокада Связывание Функциональная блокада FACS EC₅₀ (нM) Конкурентный Notch ELISA IC₅₀ (нM) Активная Notch IC₅₀ (нM) ELISA EC₅₀ (нM) Конкурентный VEGFR1 ELISA IC₅₀ (нM) Пролиферация эндотелиальных клеток IC₅₀ (нM) Av-LL-h1A11,1 2,43 Av-LS-h1A11,1 2,77 Av-SL-h1A11,1 7,38 Av-SS-h1A11,1 3503 h1A11,1-LL-Av 5,04 0,79 4,56 0,12 3,8 0,42 h1A11,1-LS-Av 5 0,76 4,59 0,16 7,7 0,57 h1A11,1-SL-Av 4,35 1,09 5,34 0,55 3,8 0,61

h1A11,1-SS-Av 3,75 0,91 7,47 2,5 26 4,2 h1A11,1-GS10-Av 0,65 0,99 37,2 1,21 h1A11,1-GS14-Av 0,68 0,41 20,2 0,84 Av-GS6-h1A11,1 3,41 0,25 7,44 4,14 Av-GS10-h1A11,1 1,5 0,12 2,01 0,57 Av-GS14-h1A11,1 1,54 0,17 4,69 0,48

Пример 4: фармакокинетические результаты для анти-DLL4/анти-VEGF-DVD in vivo

Фармакокинетические свойства h1A11.1-SL-Av-DVD оценивали у макак-крабоедов (n=2 для каждой группы дозирования) и мышей CD1 (n=6 для каждой группы дозирования) после болюсного внутривенного введения. Фармакокинетический профиль h1A11.1-SL-Av-DVD у мышей CD1 и макак-крабоедов был характерным для традиционного моноклонального антитела (таблица 8).

Таблица 8
Средние ФК-параметры h1A11.1-SL-Av-DVD после болюсного внутривенного введения Вид Доза AUC Cmax Vss CL T1/2 MRT Мышь 1 30,4 16,6 56,6 33,6 1,4 1,8 3 203,1 68,9 46,2 14,9 2,3 3,1 10 570,3 187,2 102,8 18,3 4,7 5,9 30 4488,1 496,2 94,4 6,8 9,8 13,7 Обезьяна 1 109,7 30,3 35,9 10,5 3,1 3,9 3 403,9 92,8 33,9 7,5 4,3 4,6 10 1957,1 395,1 35,9 5,1 5,0 7,1 30 8626,9 1344,4 27,0 3,7 5,5 7,8

Доза: мг/кг; AUC: площадь под кривой зависимости концентрации от времени 0 до бесконечности (d*мкг/мл); Cmax: первая наблюдаемая концентрация после введения дозы (мкг/мл); Vss: объем распределения (мл/кг); CL: клиренс (мл/сутки/кг); T1/2: конечное время полужизни (дни); MRT: среднее время удержания от 0 до бесконечности (дни).

Пример 5: противоопухолевая эффективность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD in vivo

Влияние анти-DLL4/анти-VEGF-DVD на рост опухолей сначала оценивали на ксенотрансплантатах опухолей аденокарциномы прямой и ободочной кишки человека HT-29 у самок бестимусных мышей nude. Кратко, 2×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 25 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 214 мм³ перед началом терапии. Животным еженедельно внутрибрюшинно вводили дозы в течение четырех недель, при этом объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 9.

Затем влияние анти-DLL4/анти-VEGF-DVD на рост опухолей оценивали на ксенотрансплантатах опухолей глиобластомы человека U87-MG у самок мышей SCID. Кратко, 3×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 17 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем, по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 221 мм³ перед началом терапии. Животным еженедельно внутрибрюшинно вводили дозы в течение четырех недель, при этом объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 9.

Таблица 9
Эффективность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD в моделях, основанных на ксенотрансплантатах аденокарциномы прямой и ободочной кишки HT-29 и глиобластомы U87-MG HT-29 U87-MG Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a % TGD^b % TGI^c % TGD^b h1A11.1-LL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 59** 42*** 74*** 100*** h1A11.1-LS-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 59** 42*** 77*** 124*** h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 68*** 61*** 81*** 100***

h1A11.1-SS-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 47* 49* 64*** 48***

Ключ к таблице 9: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 29 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения. b. % TGD = замедление роста опухолей в процентах = (T-C)/C×100, где T = медианное время по отношению к конечной точке в группе лечения и C = медианное время по отношению к конечной точке в контрольной группе лечения. На основании результата в конечной точке 1000 мм³. P-значения (которые указаны звездочками), полученные на основании сравнения с использованием логарифмического рангового критерия Каплана-Майера группы лечения и контрольной группы лечения. c. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 24 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения (*p<0,01, **p<0,001, ***p<0,0001).

Пример 6: эффективность сочетаний анти-DLL4/анти-VEGF-DVD in vivo

Влияние анти-DLL4/анти-VEGF-DVD в сочетании с химиотерапией на рост опухолей оценивали на ксенотрансплантатах опухолей глиобластомы человека U87-MG у самок мышей SCID. Кратко, 3×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 22 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем, по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 207 мм³ перед началом терапии. Животным внутрибрюшинно вводили одну дозу темозоломида и/или четыре еженедельных дозы анти-DLL4/анти-VEGF-DVD, при этом объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 10.

Таблица 10
Эффективность сочетания анти-DLL4/анти-VEGF-DVD и темозоломида в модели ксенотрансплантатов глиобластомы U87-MG Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a % TGD^b Темозоломид 5 мг/кг в/б, каждый день ×1 65*** 45*** h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 69*** 100*** Темозоломид + h1A11.1-SL-Av 5 мг/кг в/б, каждый день ×1 + 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 78*** 147***

Ключ к таблице 10: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 19 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения. b. % TGD = Замедление роста опухолей в процентах = (T-C)/C×100, где T = медианное время по отношению к конечной точке в группе лечения и C = медианное время по отношению к конечной точке в контрольной группе лечения. На основании результата в конечной точке 1000 мм³. P-значения (которые указаны звездочками), полученные на основании сравнения с использованием логарифмического рангового критерия Каплана-Майера группы лечения и контрольной группы лечения. (*p<0,01, **p<0,001, ***p<0,0001).

Пример 7: характеристика компонентов лекарственной формы анти-DLL4/анти-VEGF-DVD

Оценивали стабильность при хранении (5°C) и стабильность в ускоренных условиях (40°C) анти-DLL4/анти-VEGF DVD (h1A11.1-SL-Av) в препаратах и при концентрациях белка, указанных ниже. Стабильность оценивали, используя эксклюзионную хроматографию по размеру (SE-ВЭЖХ), и количественно оценивали % агрегатов, % мономеров, % фрагментов и все извлекаемые виды. В общем, препараты охватывают диапазон pH от 5 до 7 и диапазон концентраций белка от 1,0 до 118 мг/мл.

При температурах 5°C и 40°C и концентрациях белка 50, 30 и 10 мг/мл препараты содержали: 15 мМ ацетат, pH 5; 15 мМ фосфат, pH 7; 30 мМ ацетат, 80 мг/мл сахарозы, 0,02% твин-80, с pH 5; 30 мМ гистидин, 80 мг/мл сахарозы, 0,02% твин-80 с pH 6; PBS (фосфатно-солевой буфер). Все препараты содержали 0,02% азид натрия для предотвращении роста микроорганизмов при хранении. При температурах 5°C и 40°C и концентрациях белка 60, 50, 30 и 10 мг/мл, препарат содержал 15 мМ гистидин, pH 6 (и также содержал 0,02% азид натрия для предотвращения роста микроорганизмов во время хранения). При 5°C и концентрации белка 118 мг/мл препарат содержал 15 мМ гистидин, pH 6 (и также содержал 0,02% азид натрия для предотвращения роста микроорганизмов при хранении). При 40°C и концентрации белка 1,0 мг/мл препараты содержали 10 мМ цитрат + 10 мМ фосфат с pH 5, 6, 7. Препараты с белком фильтровали, чтобы удалить возможные микроорганизмы.

Оценку стабильности при замораживании-размораживании осуществляли, подвергая белок в препарате четырем циклам замораживания при -80°C в течение по меньшей мере 20 часов и размораживания на водяной бане при 30°C. Препараты, которые тестировали в отношении стабильности при замораживании-размораживании, перечислены ниже. Стабильность оценивали, используя SE-ВЭЖХ, и количественно оценивали % агрегатов, % мономеров, % фрагментов и все извлекаемые виды. Препараты представляли собой 15 мМ гистидин, pH 6, с концентрацией белка 60 мг/мл белок (также содержал 0,02% азид натрия, чтобы предотвратить рост микроорганизмов) и 10 мМ цитрат + 10 мМ фосфат с pH 5, 6, 7 и концентрацией белка 1,0 мг/мл (профильтрованный для удаления возможных микроорганизмов).

Наконец, осуществляли дифференциальную сканирующую калориметрию, чтобы измерить термическую стабильность белка в 10 мМ цитратном + 10 мМ фосфатном буфере при pH 5, 6, 7 и концентрации белка 1,0 мг/мл. Количественно оценивали начальную температуру разворачивания и температуры разворачивания в средней точке (Tm) для каждого белкового домена.

На основании данных, представленных в таблицах 11 и 12, h1A11.1-SL-Av удовлетворял критериям, предъявляемым к компонентам лекарственных препаратов, в отношении стабильности DVD-Ig.

Таблица 11
Стабильность h1A11.1-SL-Av в условиях ускоренного распада при 40°C при разных концентрациях и в разных буферах, эксципиентах и разных pH Концентрация белка (мг/мл) Время Температура (ºC) Буфер pH % агрегатов % мономеров % фрагментов Общая площадь --- перед диализом --- --- --- 2,71 96,31 0,98 53058 50, 30, 10 T0 --- ace 5 2,89 96,08 1,03 48033 50, 30, 10 T0 --- his 6 2,81 96,23 0,96 46995 50, 30, 10 T0 --- phos 7 2,91 96,09 1,00 52571 50, 30, 10 T0 --- ace-suc-tw 5 2,54 96,50 0,96 50185 50, 30, 10 T0 --- his-suc-tw 6 2,37 96,62 1,01 50771 50, 30, 10 T0 --- PBS 7 2,90 96,08 1,01 49170 50 T7 дней 40 ace 5 5,19 93,32 1,49 49028

30 T7 дней 40 ace 5 3,86 94,68 1,47 48171 10 T7 дней 40 ace 5 2,60 95,97 1,43 48379 50 T7 дней 40 his 6 5,25 93,46 1,29 47731 30 T7 дней 40 his 6 4,13 94,58 1,29 46684 10 T7 дней 40 his 6 2,73 95,84 1,42 46877 50 T7 дней 40 phos 7 9,02 89,52 1,46 53429 30 T7 дней 40 phos 7 6,11 92,40 1,49 51923 10 T7 дней 40 phos 7 3,94 94,57 1,49 53098 50 T7 дней 40 ace-suc-tw 5 5,42 92,85 1,73 50373 30 T7 дней 40 ace-suc-tw 5 4,07 94,06 1,87 48768 10 T7 дней 40 ace-suc-tw 5 2,66 95,20 2,14 49396 50 T7 дней 40 his-suc-tw 6 3,44 95,02 1,54 50040 30 T7 дней 40 his-suc-tw 6 4,16 94,14 1,70 48715 10 T7 дней 40 his-suc-tw 6 2,86 95,24 1,90 49871

50 T7 дней 40 PBS 7 8,13 90,28 1,60 49207 30 T7 дней 40 PBS 7 5,82 92,55 1,63 48853 10 T7 дней 40 PBS 7 3,62 94,82 1,56 48166 50 T21 день 40 ace 5 6,65 90,83 2,51 48536 30 T21 день 40 ace 5 4,55 92,91 2,54 48520 10 T21 день 40 ace 5 2,71 94,70 2,59 48395 50 T21 день 40 his 6 7,01 90,71 2,27 46729 30 T21 день 40 his 6 4,69 93,10 2,21 46687 10 T21 день 40 his 6 2,77 94,93 2,30 46866 50 T21 день 40 phos 7 13,39 83,83 2,78 52244 30 T21 день 40 phos 7 9,38 87,76 2,86 53556 10 T21 день 40 phos 7 4,77 92,32 2,91 52536 50 T21 день 40 ace-suc-tw 5 6,37 90,34 3,30 48268 30 T21 день 40 ace-suc-tw 5 4,27 91,91 3,82 47211 10 T21 день 40 ace-suc-tw 5 2,26 93,02 4,72 46322 50 T21 день 40 his-suc-tw 6 6,84 89,82 3,34 47140 30 T21 день 40 his-suc-tw 6 4,60 91,90 3,50 47416

10 T21 день 40 his-suc-tw 6 2,67 93,66 3,67 48166 50 T21 день 40 PBS 7 12,13 84,81 3,06 49845 30 T21 день 40 PBS 7 8,09 88,78 3,13 48108 10 T21 день 40 PBS 7 4,20 92,63 3,17 48803

Ключ к буферам (все буферы содержат 0,02% азид натрия для предотвращения роста микроорганизмов):

ace = 15 мМ ацетат, pH 5; his = 15 мМ гистидин, pH 6; phos = 15 мМ фосфат, pH 7;

ace-suc-tw = 30 мМ ацетат, 80 мг/мл сахароза, 0,02% твин-80;

his-suc-tw = 30 мМ гистидин, 80 мг/мл сахароза, 0,02% твин-80;

PBS = фосфатно-солевой буфер.

Таблица 12
Стабильность при хранении при 5°C h1A11.1-SL-Av при разных концентрациях и в разных буферах, эксципиентах и разных значениях pH (ключ к буферам такой же, как в таблице 11) Концентрация белка (мг/мл) Время Температура (ºC) Буфер pH % агрегатов % мономеров % фрагментов Общая площадь --- перед диализом --- --- --- 2,71 96,31 0,98 53058 50, 30, 10 T0 --- ace 5 2,89 96,08 1,03 48033 50, 30, 10 T0 --- his 6 2,81 96,23 0,96 46995 50, 30, 10 T0 --- phos 7 2,91 96,09 1,00 52571 50, 30, 10 T0 --- ace-suc-tw 5 2,54 96,50 0,96 50185 50, 30, 10 T0 --- his-suc-tw 6 2,37 96,62 1,01 50771 50, 30, 10 T0 --- PBS 7 2,90 96,08 1,01 49170 50 T7 дней 5 ace 5 2,96 95,99 1,05 49118 30 T7 дней 5 ace 5 2,74 96,21 1,06 48434 10 T7 дней 5 ace 5 2,62 96,23 1,15 48915 50 T7 дней 5 his 6 2,93 95,87 1,20 47967 30 T7 дней 5 his 6 2,75 96,06 1,19 47182

10 T7 дней 5 his 6 2,55 96,31 1,13 47395 50 T7 дней 5 phos 7 3,15 95,64 1,21 53843 30 T7 дней 5 phos 7 3,10 95,76 1,14 53372 10 T7 дней 5 phos 7 2,91 95,96 1,13 53269 50 T7 дней 5 ace-suc-tw 5 2,75 96,13 1,12 50236 30 T7 дней 5 ace-suc-tw 5 2,62 96,11 1,27 50026 10 T7 дней 5 ace-suc-tw 5 2,56 96,18 1,26 49290 50 T7 дней 5 his-suc-tw 6 2,84 96,10 1,07 50129 30 T7 дней 5 his-suc-tw 6 2,58 96,19 1,23 49272 10 T7 дней 5 his-suc-tw 6 2,64 96,08 1,28 50926 50 T7 дней 5 PBS 7 3,26 95,59 1,15 49502 30 T7 дней 5 PBS 7 3,07 95,64 1,29 49724 10 T7 дней 5 PBS 7 2,83 95,87 1,29 49563 50 T21 день 5 ace 5 2,57 95,76 1,67 49722

30 T21 день 5 ace 5 2,37 96,03 1,60 48882 10 T21 день 5 ace 5 2,22 96,09 1,69 49255 50 T21 день 5 his 6 2,63 95,63 1,74 44884 30 T21 день 5 his 6 2,42 95,95 1,62 47510 10 T21 день 5 his 6 2,19 96,08 1,73 47015 50 T21 день 5 phos 7 3,06 94,96 1,98 53449 30 T21 день 5 phos 7 2,69 95,46 1,85 52938 10 T21 день 5 phos 7 2,35 95,84 1,81 52703 50 T21 день 5 ace-suc-tw 5 2,25 95,76 1,99 50960 30 T21 день 5 ace-suc-tw 5 2,08 95,90 2,02 49042 10 T21 день 5 ace-suc-tw 5 1,97 95,84 2,19 49851 50 T21 день 5 his-suc-tw 6 2,24 95,62 2,14 49983 30 T21 день 5 his-suc-tw 6 2,09 95,86 2,05 48813 10 T21 день 5 his-suc-tw 6 1,97 95,83 2,19 49984

50 T21 день 5 PBS 7 2,84 95,07 2,09 50641 30 T21 день 5 PBS 7 2,27 95,62 2,12 48441 10 T21 день 5 PBS 7 1,99 95,94 2,07 48978 50 T10 месяцев 5 his 6 8,05 91,04 0,91 45552 30 T10 месяцев 5 his 6 5,81 93,29 0,90 46607 10 T10 месяцев 5 his 6 3,62 95,46 0,92 46207 50 T10 месяцев 5 his-suc-tw 6 8,08 90,26 1,67 45430 30 T10 месяцев 5 his-suc-tw 6 5,98 92,43 1,58 42967 10 T10 месяцев 5 his-suc-tw 6 3,95 94,25 1,80 42567

Таблица 13
Стабильность при хранении при 5°C, стабильность в условиях ускоренного распада при 40°C и стабильность при замораживании-размораживании h1A11.1-SL-Av при разных концентрациях и в разных буферах и при разных pH Концентрация белка (мг/мл) Время/FT Температура (ºC) Буфер pH % агрегатов % мономеров % фрагментов Общая площадь 1 T0 --- cit-phos 5 7,07 92,14 0,80 46824 1 T8 дней 40 cit-phos 5 2,23 96,39 1,38 47090 1 T22 дня 40 cit-phos 5 7,10 89,62 3,28 47956 1 FT2 --- cit-phos 5 7,91 90,75 1,34 46502 1 FT4 --- cit-phos 5 7,41 92,18 0,41 52181 1 T0 --- cit-phos 6 7,17 92,33 0,50 45809 1 T8 дней 40 cit-phos 6 2,56 96,03 1,42 46783

1 T22 дня 40 cit-phos 6 5,79 91,73 2,48 47401 1 FT2 --- cit-phos 6 7,14 91,48 1,38 45256 1 FT4 --- cit-phos 6 7,09 92,56 0,34 45004 1 T0 --- cit-phos 7 6,82 92,67 0,51 47025 1 T8 дней 40 cit-phos 7 2,52 95,95 1,53 48080 1 T22 дня 40 cit-phos 7 5,52 91,58 2,90 48706 1 FT2 --- cit-phos 7 7,23 91,52 1,25 46732 1 FT4 --- cit-phos 7 7,15 92,49 0,36 46561 60 и 118 T0 --- his 6 8,03 91,15 0,82 43528 60 T7 дней 40 his 6 7,17 91,76 1,07 45333

60 T21 день 40 his 6 15,77 82,13 2,10 44729 60 T7 дней 5 his 6 3,83 95,32 0,86 46774 60 T26 дней 5 his 6 7,14 92,56 0,30 63982 118 T5 месяцев 5 his 6 12,82 86,65 0,53 55869 60 T5 месяцев 5 his 6 9,46 90,03 0,51 64573 60 FT2 --- his 6 6,71 92,59 0,70 42259 60 FT4 --- his 6 6,33 93,62 0,05 41054

Ключ:

FT = замораживание-размораживание;

FT2 = анализ после двух циклов замораживания-размораживания; замораживание при -80°C и размораживание на водяной бане при 30°C;

FT4 = анализ после четырех циклов замораживания-размораживания; замораживание при -80°C и размораживание на водяной бане при 30°C;

cit-phos = 10 мМ цитрат + 10 мМ фосфат;

his = 15 мМ гистидин + 0,02% азид натрия (азид для предотвращения роста микроорганизмов).

Таблица 14
Данные дифференциальной сканирующей калориметрии для h1A11.1-SL-Av в концентрации 1 мг/мл в 10 мМ цитрате + 10 мМ фосфате при разных pH pH Начало (ºC) Tm1 (ºC) Tm2 (ºC) Tm3 (ºC) Tm4 (ºC) 5 55 68,2 68,86 75,56 81,18 6 58 69,04 70,47 75,24 82,04 7 59 69,52 70,94 74,44 82,06

Пример 8: выбор препарата для анти-DLL4/анти-VEGF-DVD

Материалы и способы. Стабильность белка анти-DLL4/анти-VEGF DVD-Ig h1A11.1-SL-Av оценивали в шести препаратах, перечисленных в таблице 15. Все препараты готовили в 15 мМ гистидиновом буфере. Препараты F1-F4 готовили с концентрацией белка 50 мг/мл. В указанных препаратах значение pH было в диапазоне от 5,5 до 6,0, концентрация полисорбата была в диапазоне от 0 до 0,05% масс./об., концентрация сахарозы была в диапазоне от 0 до 7,5% масс./об., и концентрация аргинина была в диапазоне от 0 до 1% масс./об. Препарат F4 готовили в 15 мМ гистидиновом буфере с pH 6,0 без каких-либо стабилизаторов, и он служил в качестве контроля в исследовании в случае оценки стабильности жидкого препарата в концентрации 50 мг/мл. Кроме того, два препарата готовили с концентрацией белка 25 мг/мл при pH 6,0 (препараты F5 и F6). Содержание в составе полисорбата-80 и сахарозы слабо отличалось в указанных двух препаратах; концентрация полисорбата-80 была в диапазоне от 0,025% масс./об. до 0,03% масс./об., и концентрация сахарозы была в диапазоне от 3,8% масс./об. до 4% масс./об. В препаратах F1-F5 использовали материал, полученный в более раннем процессе получения, тогда как препарат F6 готовили с использованием материала, полученного более оптимизированным способом. Составы препаратов F5 и F6 очень сходны, но наблюдали различия в стабильности между двумя препаратами. Так как композиции были получены в разных процессах, это может быть причиной наблюдаемого различия в стабильности.

Таблица 15
Описание состава препаратов Идентификатор препарата Концентрация DVD анти-DLL4/анти-VEGF Буфер pH Полисорбат 80 (Твин-80) Сахароза Аргинин (мг/мл) (% масс./об.) (% масс./об.) (% масс./об.) F1 50 15 мM гистидин 6,0 0,05 7,5 0 F2 50 15 мM гистидин 5,5 0,05 7,5 0 F3 50 15 мM гистидин 6,0 0,05 7,5 1 F4 50 15 мM гистидин 6,0 0 0 0 F5 25 15 мM гистидин 6,0 0,025 3,8 0 F6 25 15 мM гистидин 6,0 0,03 4,0 0

В описанных выше препаратах 15 мМ гистидиновый буфер был выбран в связи с тем, что он обеспечивает адекватную буферную емкость для поддержания целевого значения pH препарата. Сахарозу оценивали в качестве стабилизатора против стресса, вызванного замораживанием-размораживанием (криопротектора) и стресса, индуцированного процессом лиофилизации (лиопротектора). Полисорбат-80 (поверхностно-активное вещество) и аргинин добавляли, что потенциально стабилизировать препарат в отношении противодействия образованию агрегатов и частиц.

Стабильность жидких препаратов оценивали при замораживании/размораживании и при -80, 5, 25 и 40°C, используя широкую панель аналитических способов, включая визуальную оценку внешнего вида, % агрегатов с использованием эксклюзионной хроматографии по размеру (SE-ВЭЖХ), гетерогенности заряда с использованием катионообменной хроматографии (CEX-ВЭЖХ), фрагментации с использованием капиллярного SDS-электрофореза в восстанавливающих условиях (CE-SDS) и частиц довидимого диапазона с использованием визуализации в микропотоке (MFI) или способом затемнения (HIAC). Полученные результаты представлены в таблицах 16-19.

Таблица 16
Результаты оценки стабильности при замораживании-размораживании в жидком препарате при -80°C Идентификатор препарата Время (месяцы) Визуальный внешний вид % агрегатов по данным SE-ВЭЖХ CEX-ВЭЖХ Чистота в % (CE-SDS восстановленный) Подсчет частиц довидимого диапазона в MFI/HIAC Активность в связывании в ELISA % кислой области % основного пика % щелочной области ≥2 мкм/мл ≥10 мкм/мл ≥25 мкм/мл % DLL4 % VEGF F1 0 EFVP 1,0 21,6 61,7 16,7 97,7 3333 5 0 93 113 3FT EFVP 1,1 21,5 61,8 16,6 97,7 2388 50 5 НО НО 1 EFVP 1,1 21,0 62,1 16,8 97,8 1364 15 5 НО НО 3 EFVP 1,1 21,0 62,3 16,6 97,6 714 20 0 НО НО F2 0 EFVP 1,3 21,4 61,8 16,8 97,5 1589 15 0 93 113 3FT EFVP 1,3 21,4 61,8 16,9 97,6 435 5 5 НО НО 1 EFVP 1,4 21,0 62,0 17,0 97,8 315 0 0 НО НО 3 EFVP 1,5 20,9 61,9 17,2 97,7 699 5 0 НО НО

F3 0 EFVP 1,1 21,5 61,7 16,7 97,6 784 0 0 93 113 3FT EFVP 1,1 21,3 61,8 16,9 97,5 490 10 0 НО НО 1 EFVP 1,1 21,0 61,9 17,1 97,9 250 0 0 НО НО 3 EFVP 1,2 21,0 61,8 17,2 97,7 1219 35 0 НО НО F4 0 EFVP 1,2 21,6 61,8 16,6 97,4 23707 370 5 93 113 3FT TMTC 1,5 21,4 61,8 16,8 97,4 105467 5906 30 НО НО 1 TMTC 1,2 21,1 62,0 16,9 97,8 42024 1329 60 НО НО 3 TMTC 1,5 21,1 61,9 17,0 97,8 40065 3203 625 НО НО F5 0 EFVP 0,9 21,6 61,6 16,7 97,7 2808 5 5 93 113 3FT EFVP 1,2 21,5 61,8 16,8 97,6 1949 0 0 НО НО 1 EFVP 1,1 21,0 62,2 16,8 97,8 270 5 0 НО НО 3 EFVP 1,1 21,0 62,2 16,8 97,6 759 0 0 НО НО F6 0 EFVP 1,0 21,6 56,4 22,0 98,1 426 58 1 109 97 3FT EFVP 1,1 21,7 55,9 22,4 98,2 193 24 0 115 100 1 EFVP 1,0 21,6 55,8 22,7 98,2 50 3 0 НО НО 3 EFVP 1,1 22,0 55,9 22,1 98,3 254 31 0 89 96

Ключ: EFVP: по существу не содержит видимых частиц; TMTC: слишком много для подсчета; НО: не осуществляли.

Таблица 17
Результаты оценки стабильности жидких препаратов при 5°C Идентификатор препарата Время (месяцы) Визуальный внешний вид % агрегатов по данным SE-ВЭЖХ CEX-ВЭЖХ Чистота в % (CE-SDS восстановленный) Подсчет частиц довидимого диапазона в MFI/HIAC Активность в связывании в ELISA % кислой области % основного пика % щелочной области ≥2 мкм/мл ≥10 мкм/мл ≥25 мкм/мл % DLL4 % VEGF F1 0 EFVP 1,0 21,6 61,7 16,7 97,7 3333 5 0 93 113 1 EFVP 2,0 21,2 62,4 16,3 97,8 1064 0 0 НО НО 3 EFVP 3,0 21,6 62,5 15,9 97,6 3452 15 0 НО НО F2 0 EFVP 1,3 21,4 61,8 16,8 97,5 1589 15 0 93 113 1 EFVP 2,1 20,9 62,3 16,8 97,8 230 5 5 НО НО 3 EFVP 3,0 21,1 62,5 16,3 97,8 1454 0 0 НО НО F3 0 EFVP 1,1 21,5 61,7 16,7 97,6 784 0 0 93 113 1 EFVP 2,0 20,8 62,0 17,2 97,8 225 5 0 НО НО 3 EFVP 3,2 20,8 61,1 18,1 97,6 1369 5 0 НО НО

F4 0 EFVP 1,2 21,6 61,8 16,6 97,4 23707 370 5 93 113 1 EFVP 2,0 21,3 62,3 16,5 97,8 1189 0 0 НО НО 3 EFVP 3,3 21,6 62,6 15,8 97,8 6046 145 0 НО НО F5 0 EFVP 0,9 21,6 61,6 16,7 97,7 2808 5 5 93 113 1 EFVP 1,5 21,2 61,9 16,8 97,8 709 10 0 НО НО 3 EFVP 2,2 21,4 62,4 16,1 97,6 3203 50 0 НО НО F6* 0 EFVP 1,0 21,6 57,0 21,5 98,1 426 58 1 109 97 1 EFVP 1,1 21,6 55,9 22,5 98,1 2458 164 1 116 99 3 EFVP 1,2 22,4 55,9 21,7 98,0 34 1 0 101 100

Ключ: EFVP: по существу не содержит видимых частиц; НО: не осуществляли.

Таблица 18
Результаты оценки стабильности жидких препаратов при 25°C Идентификатор препарата Время (месяцы) Визуальный внешний вид % агрегатов по данным SE-ВЭЖХ CEX-ВЭЖХ Чистота в % (CE-SDS восстановленный) Подсчет частиц довидимого диапазона в MFI/HIAC Активность в связывании в ELISA % кислой области % основного пика % щелочной области ≥2 мкм/мл ≥10 мкм/мл ≥25 мкм/мл % DLL4 % VEGF F1 0 EFVP 1,0 21,6 61,7 16,7 97,7 3333 5 0 93 113 1 EFVP 4,3 23,5 62,2 14,2 97,4 1559 5 5 НО НО 3 EFVP 6,7 29,2 57,0 13,9 96,3 9358 964 150 НО НО F2 0 EFVP 1,3 21,4 61,8 16,8 97,5 1589 15 0 93 113 1 EFVP 4,4 22,8 61,6 15,6 97,4 1149 5 0 НО НО 3 EFVP 7,1 27,2 56,6 16,2 95,4 6170 95 0 НО НО F3 0 EFVP 1,1 21,5 61,7 16,7 97,6 784 0 0 93 113 1 EFVP 4,9 21,5 58,3 20,2 97,3 834 10 0 НО НО 3 EFVP 9,3 24,7 52,2 23,0 96,4 3677 150 10 НО НО

F4 0 EFVP 1,2 21,6 61,8 16,6 97,4 23707 370 5 93 113 1 EFVP 4,5 23,5 61,8 14,7 97,2 89299 3053 165 НО НО 3 EFVP 7,5 28,6 57,4 14,1 96,6 10527 1279 275 НО НО F5 0 EFVP 0,9 21,6 61,6 16,7 97,7 2808 5 5 93 113 1 EFVP 2,6 23,5 62,0 14,6 97,2 944 15 0 НО НО 3 EFVP 3,9 29,4 57,7 12,9 96,2 13575 1259 225 НО НО F6 0 EFVP 1,0 21,6 57,0 21,5 98,1 426 58 1 109 97 1 EFVP 1,2 23,5 54,8 21,7 97,7 386 50 0 100 96 3 EFVP 1,6 28,8 52,5 18,7 96,2 40 1 0 94 100

Ключ: EFVP: по существу не содержит видимых частиц; НО: не осуществляли.

Таблица 19
Результаты оценки стабильности жидких препаратов при 40°C Идентификатор препарата Время (месяцы) Визуальный внешний вид % агрегатов по данным SE-ВЭЖХ CEX-ВЭЖХ Чистота в % (CE-SDS восстановленный) Подсчет частиц довидимого диапазона в MFI/HIAC Активность в связывании в ELISA % кислой области % основного пика % щелочной области ≥2 мкм/мл ≥10 мкм/мл ≥25 мкм/мл % DLL4 % VEGF F1 0 EFVP 1,0 21,6 61,7 16,7 97,7 3333 5 0 93 113 1 EFVP 7,2 35,8 43,0 21,2 95,0 1219 15 0 94 104 3 EFVP 12,8 57,0 23,0 20,0 85,9 21464 635 30 73 72 F2 0 EFVP 1,3 21,4 61,8 16,8 97,5 1589 15 0 93 113 1 EFVP 7,9 33,8 40,9 25,3 95,1 655 5 0 95 97 3 EFVP 13,3 52,8 22,7 24,5 86,7 6041 90 0 68 73 F3 0 EFVP 1,1 21,5 61,7 16,7 97,6 784 0 0 93 113 1 EFVP 11,3 32,1 42,3 25,6 95,0 1464 5 0 97 101 3 EFVP 18,1 48,6 25,2 26,2 86,3 9103 165 15 81 72

F4 0 EFVP 1,2 21,6 61,8 16,6 97,4 23707 370 5 93 113 1 EFVP 7,7 34,9 44,2 20,9 94,8 61754 5051 670 101 97 3 EFVP 13,5 52,8 25,9 21,4 86,3 14000 1729 480 73 76 F5 0 EFVP 0,9 21,6 61,6 16,7 97,7 2808 5 5 93 113 1 EFVP 3,9 37,0 44,4 18,6 95,0 974 20 0 92 95 3 EFVP 7,4 59,6 24,5 15,9 87,0 11836 610 55 68 69 F6 0 EFVP 1,0 21,6 56,4 22,0 98,1 426 58 1 109 97 1 EFVP 1,9 35,0 42,8 22,2 94,5 60 0 0 96 95

Ключ: EFVP: по существу не содержит видимых частиц.

Тестирование стабильности лиофилизированных препаратов. Стабильность выбранных препаратов, содержащих связывающий белок h1A11.1-SL-Av, также оценивали после лиофилизации препаратов. Стабильность лиофилизированного лекарственного продукта оценивали в случае всех содержащих сахарозу препаратов (F1, F2, F3, F5 и F6). Стабильность оценивали после 2-недельного хранения при 55°C. Стабильность тестировали, используя широкую панель аналитических способов, включая визуальную оценку внешнего вида (до и после перерастворения), времени перерастворения, % агрегатов с использованием эксклюзионной хроматографии по размеру (SE-ВЭЖХ), гетерогенности заряда с использованием катионообменной хроматографии (CEX-ВЭЖХ), фрагментации с использованием капиллярного SDS-электрофореза в восстанавливающих условиях (CE-SDS), частиц довидимого диапазона с использованием визуализации в микропотоке (MFI) или способом затемнения (HIAC) и содержания воды с использованием титрования по Карлу-Фишеру.

Результаты тестирования стабильности лиофилизированного препарата представлены в таблице 20. Время перерастворения в случае всех оцениваемых препаратов составляло от приблизительно 1 до 2 минут. Наблюдали слабое увеличение агрегации по данным SEC и % в основной области по данным CEX в случае всех препаратов в стрессовых условиях хранения при 55°C. Минимальные изменения наблюдали в случае всех других измеряемых показателя стабильности продукта.

Таблица 20
Результаты оценки стабильности лиофилизированного препарата при 55°C Идентификатор препарата Время (месяцы) Визуальный внешний вид % агрегатов под данным SE-ВЭЖХ CEX-ВЭЖХ Чистота в % (CE-SDS восстановленный) Подсчет частиц довидимого диапазона в MFI/HIAC До перерастворения После перерастворения % кислой области % основного пика % щелочной области ≥2 мкм/мл ≥10 мкм/мл ≥25 мкм/мл F1 0 WTOWC EFVP 1,1 21,3 61,9 16,8 97,6 749 20 10 2 недели при 55ºC WTOWC EFVP 1,6 20,6 58,1 21,3 97,5 1639 15 0 F2 0 WTOWC EFVP 1,3 21,2 61,8 17,0 97,6 1254 15 0 2 недели при 55ºC WTOWC EFVP 2,0 20,4 57,8 21,8 97,6 1609 10 0 F3 0 WTOWC EFVP 1,1 21,2 61,9 16,9 97,6 719 5 0 2 недели при 55ºC WTOWC EFVP 1,4 20,8 59,5 19,8 97,5 475 10 5

F5 0 WTOWC EFVP 1,0 21,3 61,8 16,9 97,5 844 35 5 2 недели при 55ºC WTOWC EFVP 1,5 20,5 58,0 21,5 97,7 270 5 0 F6 0 WTOWC EFVP 1,0 21,5 56,5 22,0 98,2 205 7 0 2 недели при 55ºC WTOWC EFVP 1,5 21,1 53,4 25,5 98,2 126 5 1

Ключ: WTOWC: от белого до не совсем белого осадка, EFVP: по существу не содержит видимых частиц.

Стабильность препарата F6 (лиофилизированный, 200 связывающего белка A11.1-SL-Av на флакон) также оценивали на протяжении 12-месячного периода. Препарат был стабильным на протяжении периода тестирования.

Тестирование стабильности раствора дозы. Связывающий анти-DLL4/анти-VEGF-белок тестировали в отношении внутривенного введения (в/в). Перед введением лиофилизированный лекарственный продукт перерастворяли в воде для инъекций (SWFI). Затем перерастворенный продукт разбавляли в растворе, который подходит для в/в-инфузии. Конечную концентрацию, до которой разбавляют раствор дозы, определяли на основании вводимой клинической дозы.

Исследование проводили для оценки стабильности разбавленного связывающего анти-DLL4/анти-VEGF-белка h1A11.1-SL-Av в растворах доз, содержащих один из двух широко используемых в случае в/в-введения разбавителей, 0,9% раствор соли и 5% раствор декстрозы (D5W). Оцениваемые концентрации белка составляли 0,5 и 1 мг/мл. Чтобы оценить стабильность раствора дозы и совместимость с компонентами для инфузии, готовили растворы доз для каждого условия тестирования и хранили а мешках для внутривенного введения (n=2) в течение 6 часов при КТ/RL, и затем осуществляли исследование с имитацией инфузии, используя широко применяемые компоненты для инфузионного введения, включая проходной фильтр. Тестируемые образцы извлекали из мешка непосредственно после приготовления растворов доз в мешках для в/в-введения (T0). Кроме того, тестировали образцы, собранные в конце 30-минутного процесса инфузии. Образцы тестировали с использованием панели аналитических способов, включая визуальную оценку внешнего вида, % агрегатов с использованием эксклюзионной хроматографии по размеру (SE-ВЭЖХ) и оценку частиц довидимого диапазона с использованием способа затемнения (HIAC).

Результаты исследований стабильности растворов доз приведены в таблице 21. Уровень агрегатов в исходном материале составлял 0,7%. После приготовления растворов доз в растворе соли наблюдали четкий тренд, свидетельствующий о повышении уровня агрегатов при разведении в растворе соли (T0) и в конце инфузии. Кроме того, количество частиц довидимого диапазона в таких образцах было высоким. В сравнении, в растворах доз, приготовленных в 5% декстрозе (D5W) соответственно более низкие уровни агрегатов в % с приемлемыми трендами в отношении частиц.

Таблица 21
Результаты оценки стабильности при использовании в клинике Разбавитель Коненцтрация раствора для дозирования (мг/мл) Анализы→ ↓Визуальный внешний вид % агрегатов под данным SE-ВЭЖХ Подсчет частиц довидимого диапазона в HIAC Временная точка↓ ≥2 мкм/мл ≥10 мкм/мл ≥25 мкм/мл 0,9% раствор соли 0,5 мг/мл (Пакет № 1) T0 EFVP 2,7 2139 86 8 После инфузии с использованием насоса EFVP 4,7 4398 63 1 0,5 мг/мл (Пакет № 2) T0 EFVP 2,7 2729 189 12 После инфузии с использованием насоса EFVP 3,5 1879 31 2 1,0 мг/мл (Пакет № 1) T0 EFVP 2,4 1774 85 3 После инфузии с использованием насоса EFVP 3,0 2300 24 0

1,0 мг/мл (Пакет № 2) T0 EFVP 1,8 914 23 0 После инфузии с использованием насоса EFVP 2,5 3056 42 2 5% декстроза 0,5 мг/мл (Пакет № 1) T0 EFVP 0,6 1679 31 0 После инфузии с использованием насоса EFVP 0,6 7 0 0 0,5 мг/мл (Пакет № 2) T0 EFVP 0,6 2944 135 0 После инфузии с использованием насоса EFVP 0,6 3 0 0 1 мг/мл (Пакет № 1) T0 EFVP 0,6 1652 23 0 После инфузии с использованием насоса EFVP 0,6 2 0 0 1 мг/мл (Пакет № 2) T0 EFVP 0,6 2105 38 0 После инфузии с использованием насоса EFVP 0,6 6 0 0

EFVP: по существу не содержит видимых частиц

Пример 9: расширенная характеристика компонентов препаратов

Осуществляли расширенную характеристику компонентов препаратов анти-DLL4/-анти-VEGF-DVD, чтобы исследовать, как влияют разные условия приготовления препаратов на стабильность DVD. Данные для h1A11.1-LS-Av представлены в таблицах 22 и 23. Стабильность DVD при хранении (5°C) и стабильность в условиях ускоренного распада (40°C) оценивали в препаратах и при концентрациях белка, указанных ниже. Стабильность оценивали, используя эксклюзионную хроматографию по размеру (SE-ВЭЖХ), и количественно определяли % агрегатов, % мономеров, % фрагментов и все извлекаемые виды. В общем, препараты охватывают диапазон pH от 5 до 7 и диапазон концентраций белка от 10 до 50 мг/мл.

При температурах 5°C и 40°C и при концентрациях 50, 30 и 10 мг/мл оценивали следующие препараты: 15 мМ ацетат, pH 5, 15 мМ гистидин, pH 6, 15 мМ фосфат, pH 7, 30 мМ ацетат, 80 мг/мл сахарозы, 0,02% твин-80 с pH 5, 30 мМ гистидин, 80 мг/мл сахарозы, 0,02% твин-80 с pH 6, и PBS (фосфатно-солевой буфер). Все препараты содержали 0,02% азида натрия, чтобы предотвратить рост микроорганизмов во время хранения.

На основании данных, представленных в таблицах 22 и 23, h1A11.1-LS-Av удовлетворял критериям, предъявляемым к компонентам препаратов, в отношении стабильности DVD-Ig.

Таблица 22
Стабильность h1A11.1-LS-Av в условиях ускоренного распада при 40°C Концентрация белка (мг/мл) Время Температура (ºC) Буфер pH % агрегатов % мономеров % фрагментов Общая площадь --- перед диализом --- --- --- 0,21 98,42 1,36 56054 50, 30, 10 T0 --- ace 5 0,28 98,41 1,31 56381 50, 30, 10 T0 --- his 6 0,46 98,23 1,31 54316 50, 30, 10 T0 --- phos 7 0,74 97,86 1,40 53212 50, 30, 10 T0 --- ace-suc-tw 5 0,24 98,16 1,60 56244 50, 30, 10 T0 --- his-suc-tw 6 0,30 98,11 1,59 54076 50, 30, 10 T0 --- PBS 7 0,52 98,05 1,43 50085 50 T7 дней 40 ace 5 1,63 96,74 1,63 55563 30 T7 дней 40 ace 5 1,13 97,24 1,62 55194 10 T7 дней 40 ace 5 0,84 97,49 1,67 55029 50 T7 дней 40 his 6 2,00 96,62 1,38 53566 30 T7 дней 40 his 6 1,17 97,46 1,38 52443

10 T7 дней 40 his 6 0,60 98,00 1,40 53812 50 T7 дней 40 phos 7 4,31 94,02 1,67 52934 30 T7 дней 40 phos 7 2,85 95,46 1,69 52663 10 T7 дней 40 phos 7 1,20 97,11 1,69 52411 50 T7 дней 40 ace-suc-tw 5 1,10 96,23 2,66 54837 30 T7 дней 40 ace-suc-tw 5 0,77 96,40 2,83 52474 10 T7 дней 40 ace-suc-tw 5 0,43 96,39 3,17 50855 50 T7 дней 40 his-suc-tw 6 1,69 96,27 2,05 53017 30 T7 дней 40 his-suc-tw 6 1,14 96,84 2,02 52153 10 T7 дней 40 his-suc-tw 6 0,59 97,30 2,11 52208 50 T7 дней 40 PBS 7 2,77 95,30 1,93 51623 30 T7 дней 40 PBS 7 1,73 96,28 1,99 49973 10 T7 дней 40 PBS 7 0,78 97,25 1,97 50851 50 T21 день 40 ace 5 3,66 94,30 2,04 55920

30 T21 день 40 ace 5 2,56 95,33 2,10 54188 10 T21 день 40 ace 5 1,85 96,00 2,15 55213 50 T21 день 40 his 6 4,14 94,28 1,58 54807 30 T21 день 40 his 6 2,67 95,79 1,54 53071 10 T21 день 40 his 6 1,59 96,82 1,58 54053 50 T21 день 40 phos 7 8,52 89,32 2,16 53273 30 T21 день 40 phos 7 5,58 92,54 1,89 53162 10 T21 день 40 phos 7 3,01 94,89 2,10 52747 50 T21 день 40 ace-suc-tw 5 4,12 93,78 2,10 56278 30 T21 день 40 ace-suc-tw 5 2,93 94,94 2,13 55481 10 T21 день 40 ace-suc-tw 5 1,99 95,75 2,26 54696 50 T21 день 40 his-suc-tw 6 4,94 93,21 1,85 54034 30 T21 день 40 his-suc-tw 6 НО НО НО НО 10 T21 день 40 his-suc-tw 6 2,00 96,30 1,70 52686

50 T21 день 40 PBS 7 8,44 89,65 1,90 51697 30 T21 день 40 PBS 7 5,54 92,43 2,03 50282 10 T21 день 40 PBS 7 2,89 95,05 2,06 51580

Ключ к буферам (все буферы содержат 0,02% азид натрия для предотвращения роста микроорганизмов): ace = 15 мМ ацетат, pH 5; his = 15 мМ гистидин, pH 6; phos = 15 мМ фосфат, pH 7; ace-suc-tw = 30 мМ ацетат, 80 мг/мл сахарозы, 0,02% твин-80; his-suc-tw = 30 мМ гистидин, 80 мг/мл сахарозы, 0,02% твин-80; PBS = фосфатно-солевой буфер.

Таблица 23
Стабильность h1A11,1-LS-Av при хранении при 5°C Концентрация белка (мг/мл) Время Температура (ºC) Буфер pH % агрегатов % мономеров % фрагментов Общая площадь --- перед диализом --- --- --- 0,21 98,42 1,36 56054 50, 30, 10 T0 --- ace 5 0,28 98,41 1,31 56381 50, 30, 10 T0 --- his 6 0,46 98,23 1,31 54316 50, 30, 10 T0 --- phos 7 0,74 97,86 1,40 53212 50, 30, 10 T0 --- ace-suc-tw 5 0,24 98,16 1,60 56244 50, 30, 10 T0 --- his-suc-tw 6 0,30 98,11 1,59 54076 50, 30, 10 T0 --- PBS 7 0,52 98,05 1,43 50085 50 T7 дней 5 ace 5 0,18 98,17 1,64 57599 30 T7 дней 5 ace 5 0,16 98,21 1,64 55889 10 T7 дней 5 ace 5 0,13 98,17 1,70 53289 50 T7 дней 5 his 6 0,18 98,14 1,68 55742 30 T7 дней 5 his 6 0,12 98,06 1,82 53603 10 T7 дней 5 his 6 0,13 98,07 1,80 53505 50 T7 дней 5 phos 7 0,23 97,72 2,05 54355 30 T7 дней 5 phos 7 0,18 97,77 2,04 53561

10 T7 дней 5 phos 7 0,13 97,72 2,15 53151 50 T7 дней 5 ace-suc-tw 5 0,09 97,40 2,51 57158 30 T7 дней 5 ace-suc-tw 5 0,08 97,43 2,49 55025 10 T7 дней 5 ace-suc-tw 5 0,08 97,34 2,58 53882 50 T7 дней 5 his-suc-tw 6 0,10 97,48 2,43 55272 30 T7 дней 5 his-suc-tw 6 0,08 97,63 2,29 52763 10 T7 дней 5 his-suc-tw 6 0,05 97,41 2,53 52903 50 T7 дней 5 PBS 7 0,12 97,31 2,58 51698 30 T7 дней 5 PBS 7 0,09 97,24 2,67 50144 10 T7 дней 5 PBS 7 0,08 97,28 2,64 50428 50 T21 день 5 ace 5 0,87 98,45 0,68 57706 30 T21 день 5 ace 5 0,80 98,55 0,65 56566 10 T21 день 5 ace 5 0,83 98,47 0,70 54226 50 T21 день 5 his 6 1,05 98,29 0,66 55911 30 T21 день 5 his 6 0,92 98,40 0,68 54225 10 T21 день 5 his 6 0,90 98,41 0,70 54128 50 T21 день 5 phos 7 1,25 98,09 0,66 54980

30 T21 день 5 phos 7 1,20 98,11 0,69 53903 10 T21 день 5 phos 7 1,01 98,29 0,69 53271 50 T21 день 5 ace-suc-tw 5 0,92 98,36 0,72 61574 30 T21 день 5 ace-suc-tw 5 0,89 98,39 0,72 55532 10 T21 день 5 ace-suc-tw 5 0,83 98,46 0,71 55841 50 T21 день 5 his-suc-tw 6 1,00 98,27 0,73 55484 30 T21 день 5 his-suc-tw 6 0,92 98,37 0,70 53335 10 T21 день 5 his-suc-tw 6 0,82 98,49 0,69 53736

50 T21 день 5 PBS 7 1,49 97,79 0,71 52405 30 T21 день 5 PBS 7 1,29 98,02 0,70 51284 10 T21 день 5 PBS 7 1,12 98,18 0,70 51377

Ключ к буферам в таблице 23 такой же, как в таблице 22.

Пример 10: влияние VEGF на нейтрализующую активность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD в клеточном анализе DLL4

Чтобы оценить, будет ли связывание VEGF влиять на эффективность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD в нейтрализации DLL4, VEGF включали в анализ DLL4-репортера Notch, который описан в примере 3.3. Кратко, клетки HEK293G, экспрессирующие DLL4 человека, культивировали совместно с клетками, имеющими репортер Notch, EA.hy926 в течение 24 часов в присутствии DVD h1A11.1-SL-Av или смеси анти-DLL4-мАт (MA11.1) и анти-VEGF-мАт (Av), серийно разведенных из раствора с концентрацией 300 нМ. Также включали рекомбинантный VEGF₁₆₅ человека (физиологически соответствующую изоформу сплайсинга VEGF человека) или негативный контрольный белок (BSG2). Активность в нейтрализации DLL4 определяли, оценивая значения IC₅₀, концентрации антитела, необходимой для достижения 50% снижения DLL4-индуцированной активации Notch. Как показано в таблице 24, присутствие 6 или 150 нМ VEGF сильно повышало эффективность DVD h1A11.1-SL-Av в нейтрализации DLL4. Такая повышенная эффективность является уникальной для анти-DLL4/анти-VEGF-DVD, так как смесь исходных мАт проявляла сходную эффективность при включении и без включения VEGF.

Таблица 24
VEGF усиливает эффективность по отношению к DLL4 анти-DLL4/анти-VEGF-DVD, но не смеси анти-DLL4/анти-VEGF IC₅₀ (нM) 0 нМ VEGF 6 нM VEGF 6 nM BSG2 h1A11.1-SL-Av 12,50 0,61 16,76 Смесь h1A11.1 + Av 8,64 9,97 9,55 IC₅₀ (нM) 0 нM VEGF 150 нM VEGF 150 нM BSG2 h1A11.1-SL-Av 12,69 0,40 14,11 Смесь h1A11.1 + Av 9,17 10,32 10,93

В другом варианте моновалентный Fab-фрагмент DVD h1A11.1-SL-Av также оценивали в клеточном анализе нейтрализации DLL4. В отличие от DVD-Ig, моновалентный DVD-Fab обладал более слабой эффективностью в нейтрализации DLL4. Присутствие VEGF улучшало эффективность DVD-Fab, но не в такой степени, как наблюдали в случае DVD-Ig (таблица 25).

Таблица 25
Влияние VEGF на эффективность анти-DLL4/анти-VEGF DVD-Ig и DVD-Fab в нейтрализации DLL4 IC₅₀ (нM) 0 нM VEGF 150 нM VEGF 150 нM BSG2 h1A11.1-SL-Av 13,46 0,41 16,55 h1A11.1-SL-Av Fab >40* 4,56 >40* * Точное значение IC₅₀ не могли определить вследствие неспособности полностью нейтрализовать DLL4.

В другом варианте концентрации VEGF серийно уменьшали и использовали в анализе DLL4-репортера Notch, описанном выше. Как показано в таблице 26, VEGF может усиливать активность DVD h1A11.1-SL-Av в нейтрализации DLL4 в такой низкой концентрации, как 1,2 нМ.

Таблица 26
VEGF повышает эффективность анти-DLL4/анти-VEGF-DVD в нейтрализации DLL4 h1A11.1-SL-Av нM IC₅₀ (нM) BSG2 150 11,0 VEGF 150 0,6 30 0,7 6 0,6 1,2 1,1 0,24 12,7 0,048 12,3 0,0096 11,5 0 11,8

Пример 11: эффективность сочетаний DLL4-VEGF-DVD-Ig in vivo

Оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухолей ободочной кишки человека SW-48 у самок мышей SCID. Кратко, 5×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 13 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 211 мм³ перед началом терапии. Животным вводили иринотекан, анти-VEGF-мАт и/или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 27. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 27.

Таблица 27
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и иринотекана в модели ксенотрансплантатов ободочной кишки SW-48 Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a % TGD^b Иринотекан 60 мг/кг в/б, каждые 3 дня ×4 77*** 106*** анти-VEGF мАт 10 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 39* 50* h1A11.1-SL-Av 13,3 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 72*** 150*** анти-VEGF-мАт + иринотекан 10 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + 60 мг/кг в/б, каждые 3 дня ×4 78*** 150*** h1A11.1-SL-Av + иринотекан 13,3 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + 60 мг/кг в/б, каждые 3 дня ×4 90*** 228***

Ключ к таблице 27: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 18 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения, b. % TGD = Замедление роста опухолей в процентах = (T-C)/C×100, где T = медианное время по отношению к конечной точке в группе лечения и C = медианное время по отношению к конечной точке в контрольной группе лечения. На основании результата в конечной точке 1000 мм³. P-значения (которые указаны звездочками), полученные на основании сравнения с использованием логарифмического рангового критерия Каплана-Майера группы лечения и контрольной группы лечения: *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001. «Каждые 3 дня ×4» указывает введение каждые три дня четыре цикла (т.е. 4 дозы), тогда как «каждые 7 дней ×4» указывает введение каждые семь дней четыре цикла.

Также оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухолей ободочной кишки человека HCT-116 у самок мышей SCID. Кратко, 5×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 14 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=9 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 192 мм³ перед началом терапии. Животным вводили 5-FU, лейковорин, иринотекан, анти-VEGF-мАт и/или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 28. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 28.

Таблица 28
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и FOLFIRI в модели ксенотрансплантатов ободочной кишки HCT-116 Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a 5-FU лейковорин иринотекан (FOLFIRI) 50 мг/кг в/в, каждые 7 дней ×3, 25 мг/кг п/о, каждые 7 дней ×3, 30 мг/кг в/в, каждые 7 дней ×3 63*** анти-VEGF мАт 5 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 49*** h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 67*** анти-VEGF мАт + FOLFIRI 5 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + (выше) каждые 7 дней ×3 81***

h1A11.1-SL-Av + FOLFIRI 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + (выше) каждые 7 дней ×3 90***

Ключ к таблице 28: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 26 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения: *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001. «Каждые 7 дней ×3» указывает на введение каждые семь дней три цикла (т.е. 3 дозы), тогда как «каждые 7 дней ×4» указывает на введение каждые семь дней четыре цикла.

Оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухолей оболочной кишки человека HT-29 у самок мышей SCID. Кратко, 2×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 25 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 209 мм³ перед началом терапии. Животным вводили иринотекан и анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 29. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 29.

Таблица 29
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и иринотекана в модели ксенотрансплантатов ободочной кишки HT-29 Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a % TGD^b Иринотекан 60 мг/кг в/б, каждые 3 дня ×4 47* 60* h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 42* 45* h1A11.1-SL-Av + иринотекан 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + 60 мг/кг в/б каждые 3 дня ×4 74** 76*

Ключ к таблице 29: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(TIC×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 20 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения, b. % TGD = Замедление роста опухолей в процентах = (T-C)/C×100, где T = медианное время по отношению к конечной точке в группе лечения и C = медианное время по отношению к конечной точке в контрольной группе лечения. На основании результата в конечной точке 1000 мм³. P-значения (которые указаны звездочками), полученные на основании сравнения с использованием логарифмического рангового критерия Каплана-Майера группы лечения и контрольной группы лечения: *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001. «Каждые 3 дня ×4» указывает введение каждые три дня четыре цикла (т.е. 4 дозы), тогда как «каждые 7 дней ×4» указывает введение каждые семь дней четыре цикла.

Оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухолей глиобластомы человека U87-MG у самок мышей SCID. Кратко, 3×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 13 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 207 мм³ перед началом терапии. Животным вводили темозоломид, анти-VEGF-мАт и/или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 30. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 30.

Таблица 30
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и темозоломида в модели ксенотрансплантатов глиобластомы U87-MG Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a % TGD^b Темозоломид 5 мг/кг в/б, каждый день ×1 65*** 45*** анти-VEGF-мАт 5 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 47** 45** h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 69*** 100*** анти-VEGF мAт + темозоломид 5 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + 5 мг/кг в/б, каждый день ×1 68*** 89*** h1A11.1-SL-Av + темозоломид 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + 5 мг/кг в/б, каждый день ×1 78*** 155***

Ключ к таблице 30: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 19 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения, b. % TGD = Замедление роста опухолей в процентах = (T-C)/C×100, где T = медианное время по отношению к конечной точке в группе лечения и C = медианное время по отношению к конечной точке в контрольной группе лечения. На основании результата в конечной точке 1000 мм³. P-значения (которые указаны звездочками), полученные на основании сравнения с использованием логарифмического рангового критерия Каплана-Майера группы лечения и контрольной группы лечения: *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухоли поджелудочной железы человека, полученной от пациента PA0123, у самок мышей NSG. Кратко, фрагменты замороженной опухоли имплантировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 28 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=7 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 193 мм³ перед началом терапии. Животным вводили гемцитабин и/или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 31. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 31.

Таблица 31
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и гемцитабина в модели ксенотрансплантатов опухоли поджелудочной железы, полученной от пациента PA0123 Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a % TGD^b Гемцитабин 100 мг/кг в/б, [каждые 3 дня ×4]×2 48** 43** h1A11.1-SL-Av 13,3 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×5 54** 75** h1A11.1-SL-Av + гемцитабин 13,3 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×5 + 100 мг/кг в/б, [каждые 3 дня ×4]×2 75*** 114***

Ключ к таблице 31: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 38 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения, b. % TGD = Замедление роста опухолей в процентах = (T-C)/C×100, где T = медианное время по отношению к конечной точке в группе лечения и C = медианное время по отношению к конечной точке в контрольной группе лечения. На основании результата в конечной точке 1000 мм³. P-значения (которые указаны звездочками), полученные на основании сравнения с использованием логарифмического рангового критерия Каплана-Майера группы лечения и контрольной группы лечения: *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухолей молочной железы человека MDA-MB-231-luc у самок мышей SCID. Кратко, 2×10⁶ клеток имплантировали в жировую подушку молочной железы. Опухолям давали возможность развиться в течение 13 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 150 мм³ перед началом терапии. Животным вводили паклитаксел и/или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 32. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Кроме того, получали биолюминесцентные изображения, чтобы осуществлять мониторинг и слежение за спонтанными метастазами злокачественных клеток в легкие и/или лимфатические узлы. Результаты показаны в таблице 32.

Таблица 32
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и паклитаксела в модели ксенотрансплантатов молочной железы MDA-MB-231-luc Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a % TGD^b Частота метастазов, % Паклитаксел 25 мг/кг в/б, каждые 4 дня ×3 78*** 106*** 40* h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 56*** 85*** 50* h1A11.1-SL-Av + паклитаксел 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + 25 мг/кг в/б, каждые 4 дня ×3 92*** 179*** 0***

Ключ к таблице 32: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения, и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 15 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения. b. % TGD = Замедление роста опухолей в процентах = (T-C)/C×100, где T = медианное время по отношению к конечной точке в группе лечения, и C = медианное время по отношению к конечной точке в контрольной группе лечения. На основании результата в конечной точке 1000 мм³. P-значения (которые указаны звездочками), полученные на основании сравнения с использованием логарифмического рангового критерия Каплана-Майера группы лечения и контрольной группы лечения. c. Частота метастазов в % = процент животных с регистрируемым сигналом в легких и/или лимфатических узлах на основании изображений биолюминесценции. Контрольная группа лечения имела 100%. На основании измерений после совпадения размера на 22 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения: *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухолей молочной железы человека SUM149PT у самок мышей SCID. Кратко, 1×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 28 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=9 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 183 мм³ перед началом терапии. Животным вводили паклитаксел и/или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 33. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 33.

Таблица 33
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и паклитаксела в модели ксенотрансплантатов молочной железы SUM149PT Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a % TGD^b Паклитаксел 25 мг/кг в/б, [каждые 4 дня ×3]×4 60*** 173*** h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×8 88*** 282*** h1A11.1-SL-Av + паклитаксел 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×8 + 25 мг/кг в/б, [каждые 4 дня ×3]×4 93*** 459***

Ключ к таблице 33: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения, и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 22 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения, b. % TGD = Замедление роста опухолей в процентах = (T-C)/C×100, где T = медианное время по отношению к конечной точке в группе лечения, и C = медианное время по отношению к конечной точке в контрольной группе лечения. На основании результата в конечной точке 1000 мм³. P-значения (которые указаны звездочками), полученные на основании сравнения с использованием логарифмического рангового критерия Каплана-Майера группы лечения и контрольной группы лечения: *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухолей молочной железы человека SUM149PT у самок мышей SCID. Кратко, 1×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 25 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 228 мм³ перед началом терапии. Животным вводили паклитаксел, анти-VEGF-мАт и/или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 34. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 34.

Таблица 34
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и паклитаксела в модели ксенотрансплантатов молочной железы SUM149PT Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a Паклитаксел 25 мг/кг в/б, [каждые 4 дня ×3]×4 50* анти-VEGF-мАт 5 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×8 54* h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×8 78** анти-VEGF-мАт + паклитаксел 5 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×8 + 25 мг/кг в/б, [каждые 4 дня ×3]×4 81** h1A11.1-SL-Av + паклитаксел 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×8 + 25 мг/кг в/б, [каждые 4 дня ×3]×4 87**

Ключ к таблице 34: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения, и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 18 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения: *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Дополнительно оценивали влияние анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в сочетании с химиотерапией на рост опухолей в случае ксенотрансплантатов опухолей ободочной кишки человека HCT-116 у самок мышей SCID. Кратко, 5×10⁶ клеток инокулировали подкожно в заднюю часть правого бока. Опухолям давали возможность развиться в течение 16 дней, и в этой точке определяли объем опухолей, используя измерения электронным штангенциркулем по формуле: L×W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=9 на группу) так, чтобы каждая когорта имела эквивалентный средний объем опухоли 198 мм³ перед началом терапии. Животным вводили 5-FU, капецитабин и/или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig в дозах и по схемам, указанным в таблице 35. Объем опухолей измеряли два раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Результаты показаны в таблице 35.

Таблица 35
Эффективность сочетания анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и 5-FU или анти-DLL4-VEGF-DVD-Ig и капецитабина в модели ксенотрансплантатов ободочной кишки HСT-116 Лечение Путь введения дозы, схема % TGI^a 5-FU 75 мг/кг в/в, каждые 7 дней ×4 50** Капецитабин 350 мг/кг п/о, каждый день ×14 69*** h1A11.1-SL-Av 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 66*** h1A11.1-SL-Av + 5-FU 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + 75 мг/кг в/в, каждые 7 дней ×4 84*** h1A11.1-SL-Av + капецитабин 6,7 мг/кг в/б, каждые 7 дней ×4 + 350 мг/кг п/о, каждый день ×14 92***

Ключ к таблице 35: a. % TGI = процент ингибирования роста опухолей = 100-(T/C×100), где T = средний объем опухолей в группе лечения, и C = средний объем опухолей в контрольной группе лечения. На основании измерений после совпадения размера на 21 день. P-значения (которые указаны звездочками) получали на основании сравнения с использованием t-критерия Стьюдента группы лечения и контрольной группы лечения. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

Пример 12: перекрестная между видами эффективность h1A11.1-SL-Av-DVD на клетках

Перекрестную между видами эффективность h1A11.1-SL-Av-DVD в нейтрализации DLL4 сравнивали в основанном на клетках анализе, используя иммобилизованный рекомбинантный внеклеточный домен (ECD) DLL4 из разных видов. Такой анализ использовали для сравнения активности h1A11.1-SL-Av-DVD против одной и той же концентрации DLL4, полученного от человека, крысы, мыши и макака-крабоеда.

Черные 96-луночные планшеты для культуры ткани с лунками, имеющими прозрачное дно (Costar, № 3904), предварительно покрывали либо 100 мкл/лунку DLL4-ECD (11 нМ), разбавленного в PBS (Invitrogen, № 14190), либо 100 мкл/лунку 11 нМ БСА в качестве контроля (Sigma, № A9576). Планшеты для анализа герметично закрывали и инкубировали при 4°C в течение 18 часов. На следующий день h1A11.1-SL-Av-DVD серийно разбавляли в среде для анализа DMEM (Invitrogen, № 11995), содержащей 10% FBS. Предварительно покрытые планшеты для анализа промывали один раз средой для анализа, затем добавляли 50 мкл/лунку серийно разведенного раствора h1A11.1-SL-Av-DVD. Затем планшеты для анализа инкубировали при 25°C в течение 30 минут. Во время периода инкубации клетки EA.hy926, экспрессирующие контрольную люциферазу Renilla и люциферазу светляка под управлением промотора, отвечающего на Notch, открепляли от культурального флакона, используя 0,25% трипсина-ЭДТА (Invitrogen, № 25200), ресуспендировали в концентрации 3×10⁵клеток/мл в среде для анализа и затем добавляли непосредственно в планшеты для анализа по 25 мкл клеток/лунку. Затем планшеты для анализа инкубировали при 37°C в атмосфере с 5% CO₂в течение 24 часов. Анализы люциферазы светляка и Renilla осуществляли согласно протоколу продавца (система для анализа люциферазы Dual-Glo, Promega, № E2940). Люминесценцию регистрировали на устройстве для считывания планшетов (Victor, Perkin Elmer, № 1420-051), и полученные данные нормализовали по отношению к сигналу люминесценции люциферазы Renilla.

Как показано в таблице 36, h1A11.1-SL-Av-DVD ингибирует активность DLL4 человека и макака-крабоеда со сравнимой эффективностью. h1A11.1-SL-Av DVD также ингибирует DLL4 мыши, хотя и с приблизительно в 3 раза меньшей активностью, по сравнению с DLL4 человека. h1A11.1-SL-Av-DVD не ингибирует активность DLL4 крысы в клеточных анализах.

Перекрестную между видами эффективность h1A11.1-SL-AV-DVD в нейтрализации VEGF оценивали в анализе VEGF-стимулированной пролиферации и жизнеспособности клеток NIH3T3/VEGFR-2.

Клетки NIH3T3, стабильно трансфицированные кДНК для полноразмерного VEGFR-2 человека, использовали для анализов VEGF-стимулированной пролиферации и жизнеспособности. Слитую в виде слоя культуру стабильной линии клеток NIH3T3/VEGFR-2 открепляли от культурального флакона, используя 0,25% трипсин-ЭДТА (Invitrogen, № 25200), и ресуспендировали в концентрации 1,33×10⁵ клеток/мл в среде для анализа: DMEM (Invitrogen, № 11995), содержащая 0,1% БСА (Sigma, № A9576). Клетки высевали по 10000 клетки/лунку в общем объеме 75 мкл в черные 96-луночные планшеты для анализа культур тканей с прозрачным дном (Costar, № 3904) и инкубировали в течение 24 часов при 37°C с 5% CO₂. На следующий день рекомбинантный белок VEGF и h1A11.1-SL-AV-DVD разбавляли средой для анализа, перемешивали в 96-луночном планшете из полипропилена и инкубировали при 25°C в течение 30 минут. Затем смеси VEGF и h1A11.1-SL-AV-DVD (4×) добавляли к клеткам в планшете для анализа по 25 мкл/лунку. Затем планшеты для анализа, содержащие обработанные клетки, инкубировали при 37°C с 5% CO₂. Через семьдесят два часа осуществляли анализ жизнеспособности согласно протоколу продавца (ATPIite 1 step, Perkin Elmer, № 6016739). Люминесценцию регистрировали на устройстве для считывания планшетов (Victor, Perkin Elmer, № 1420-051).

Как показано в таблице 36, h1A11.1-SL-Av-DVD нейтрализовал активность VEGF макака-крабоеда с эффективностью, сходной с эффективностью в случае VEGF человека. h1A11.1-SL-AV-DVD не ингибирует VEGF мыши или крысы в клеточном анализе.

Ключ к таблице 36: a. Значения, полученные в клеточном анализе DLL4, представляют собой средние ± стандартные отклонения из четырех независимых экспериментов. Значения, полученные в клеточном анализе VEGF, представляют собой средние ± стандартные отклонения из стрех независимых экспериментов.

Пример 13: последовательное исключение при скрининге и отбор наилучших кандидатов

Отбор наилучших кандидатов DVD-Ig может требовать несколько циклов конструирования молекул, создания сотен потенциальных молекул-кандидатов с последующим тестированием с помощью скрининга с последовательным исключением, которые может включать батарею анализов для идентификации молекулы DVD-Ig, обладающей свойствами, необходимыми для терапевтического средства, во всех случаях не руководствуясь инструкциями, имеющими отношение к последовательностям вариабельных доменов или другим структурам, которые будут обеспечивать оптимальные функциональные свойства. Обычно такие свойства включают, но без ограничения, оценку: (a) кинетики связывания (скорость образования комплекса, скорость распада комплекса и аффинность) в случае как внутренних, так и внешних антигенсвязывающих доменов, (b) активность в различных биохимических и клеточных биоанализах, (c) эффективности in vivo в соответствующих моделях опухолей, (d) фармакокинетические и фармакодинамические свойства, (e) свойства, имеющие значения для производства, включая уровень экспрессии белка в выбранных клеточных линиях, масштабируемость, посттрансляционную модификацию, физико-химические свойства, такие как процент мономеров, растворимость и стабильность (собственная стабильность, стабильность при замораживании/размораживании, хранении и т.д.), (f) свойства препарата, (g) потенциальный риск иммуногенности, и (h) токсикологические свойства молекулы. Также можно оценить способ связывания и валентность, так как они могут влиять на свойства связывания и эффективности молекулы в клетках. Для каждого оцениваемого параметра устанавливают пороговые уровни, и отмечают связывающие белки, имеющие превышающие уровни по каждому параметру. На основании начального скрининга сотен молекул часто появляется только одна или ни одной со свойствами, которые удовлетворяют всем перечисленным параметрам, наряду с другими факторами, которые учитываются при идентификации наилучшего кандидата для дальнейшей оценки. После идентификации наилучшего кандидата осуществляют дальнейшую оценку in vivo терапевтических свойств, включая безопасность, эффективность и активность у животных и человека.

Пример 14: селекция наилучших кандидатов анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-Ig

Авторы изобретения сконструировали и оценили приблизительно 100 молекул анти-DLL4/анти-VEGF-DVD-Ig, включая конструкции с использованием последовательностей VEGF и DLL4, перечисленных в таблице 2, а также CDR-привитых и аффинно-созревших вариантов таких вариабельных доменов и дополнительных гуманизированных и полностью человеческих последовательностей вариабельных доменов. Полностью человеческие исходные анти-DLL4-мАт получали, используя методику дисплея мРНК PROfusion, с последующим созреванием аффинности с использованием методики дрожжевого дисплея. Также получали повторно CDR-привитые исходные антител были основаны на анти-DLL4-мАт E9.71, несколько гуманизированных анти-DLL4-мАт были получены на основе h1A11.1 и h38H12.11, и несколько антител h1A11 с созревшей аффинностью. Авторы изобретения также оценивали множество разных линкерных последовательностей в связывающих белках DVD-Ig. Использование разных линкеров приводило к широкому разнообразию свойств даже между связывающими белками, имеющими одни и те же последовательности вариабельных доменов.

Из приблизительно 100 созданных молекул DVD-Ig 10 были исключены, так как не достигали требуемого уровня экспрессии в клетках HEK293 при временной трансфекции, 22 не давали требуемого порогового уровня связывания с DLL4, 19 не давали требуемого порогового уровня связывания с VEGF, в некоторых наблюдали субоптимальную посттрансляционную модификацию, включая O-связанное гликозилирование. Несколько DVD-Ig исключали из-за того, что ни имели аффинность связывания ниже определенного порогового значения. Антигенсвязывающие домены во внутреннем положении в DVD-Ig могут проявлять пониженный уровень аффинности и эффективности в связывании антигена. Например, все молекулы DVD-Ig серии h1A11/Av, в которых домен связывания VEGF помещен в наружном положении, а домен связывания DLL4 во внутреннем положении, имели пониженную аффинность связывания DLL4. Поэтому такие DVD-Ig не были отобраны для дальнейшего исследования. В противоположной ориентации (т.е. когда домен связывания VEGF находится во внутреннем положении и домен связывания DLL4 в наружном положении), аффинность связывания с VEGF молекулы h1A11.1-SL-Av, как было обнаружено, неожиданно превосходит даже аффинность связывающих белков, в которых использованы такие же вариабельные домены и ориентации, но с другими линкерными последовательностями, таких как h1A11.1-SS-Av (короткие линкеры между доменами VD1 и VD2 и в тяжелой и в легкой цепях).

Кроме того, осуществляли созревание аффинности h1A11, чтобы создать исходные анти-DLL4-антитела с очень высокой аффинностью и стабильностью, когда в форме моноклонального антитела, но не форме DVD-Ig такие конструкции не проявляли стабильности на уровне, наблюдаемом для h1A11.1-SL-Av, независимо от используемых линкеров или ориентаций связывающих доменов. Подобным образом, созревание аффинности вариабельных доменов Av (анти-VEGF) также делала стабильными исходные моноклональные антитела, которые имели пониженные уровни стабильности независимо от манипуляций с линкерами и ориентацией. Кроме того, созревание аффинности, даже в том случае, когда она приводила к превосходной кинетике связывания моноклональных антител, не позволяла прогнозировать активность последующего DVD-Ig. Например, когда h1A11.1 заменяли его вариантами с созревшей аффинностью, такие новые молекулы DVD-Ig имели пониженную стабильность, более короткое время полужизни in vivo и пониженную противоопухолевую активность в моделях опухолей. Кроме того, молекулы DVD-Ig, содержащие вариабельные домены h1A11 и/или Av с созревшее аффинностью, также проявляли повышенную тенденцию к образованию геля или высоким уровням агрегатов во время хранения при 5°C. Такого нежелательного гелеобразования и агрегации не наблюдали в случае молекул DVD-Ig, содержащих вариабельные домены оригинальных исходных антител (т.е. вариабельные домены из антител, которые не были подвергнуты процессу созревания аффинности) при хранении в сходных условиях, в частности в случае DVD-Ig h1A11.1-SL-Av.

Полученные результаты показывают, что только одна аффинность связывания антигена не является единственным фактором, который необходимо учитывать при отборе кандидата для клиники, и действительно аффинность связывания не позволяет прогнозировать другие свойства связывающих белков, такие как стабильность, связанные с приготовлением препаратов свойства, физико-химические свойства, противоопухолевую эффективность in vivo и/или фармакокинетические свойства, которые чувствительны даже к небольшим структурным модификациям. Например, эффективности молекул DVD-Ig h1A11.1-LS-Av, h1A11.1-LL-Av и h1A11.1-SL-Av в нейтрализации VEGF и DLL4 в большой степени сравнимы (таблица 7), но молекула h1A11.1-SL-Av давала более высокий уровень эффективности в ингибировании роста опухолей (таблица 9). Кроме того, в случае молекул DVD-Ig, которые сохраняли аффинности связывания и эффективность в клетках, некоторых из таких молекул имели менее предпочтительные физико-химические свойства. Например, хотя молекула h1A11.1-LL-Av была очень сходной с терапевтическим лидером h1A11.1-SL-Av, различие между линкерами, которые связывают два вариабельных домена в двух конструкциях, привело к менее предпочтительным физико-химическим свойствам h1A11.1-LL-Av. Полученные результаты показывают, что даже небольшие изменения, например, в линкере между двумя вариабельными доменами в DVD-Ig, могут оказывать значимое влияние на оцениваемые терапевтические свойства.

На основании наличия некоторых требуемых признаков, которые измеряли в описанных выше анализах, 17 из приблизительно 100 или больше молекул DVD-Ig дополнительно тестировали в мышиных моделях в отношении противоопухолевой активности и фармакокинетических свойств. DVD-Ig h1A11.1-SL-Av имел неожиданно превосходящую эффективность в ингибировании опухолей и фармакокинетические свойства, по сравнению с другими тестированными связывающими белками. Таким образом, при оценке критериев исключения, используемых при последовательном исключении в скрининге, DVD-Ig h1A11.1-SL-Av в конечном итоге оказался связывающим белком, обладающим предпочтительными (т.е. выше пороговых) свойствами по каждому из измеряемых параметров. Поэтому связывающий белок был выбран для дальнейшей оценки и исследования.

Пример 15: сравнение с более ранними VEGF/DLL4-DVD-Ig

Хотя h1A11.1-SL-Av непосредственно сравнивали с 96 предыдущими молекулами VEGF/DLL4-DVD-Ig, описанными в публикации заявки на выдачу патента США № 20100076178 (смотрите таблицу 5 в указанной заявке), может быть сделано косвенное сравнение. Например, h1A11.1-SL-Av проявлял VEGF-связывающую активность, сравнимую с активностью эталонного анти-VEGF-мАт Av (смотрите таблицу 5). Напротив, по меньшей мере две трети из 96 молекул VEGF/DLL4-DVD-Ig, тестированных, как описано в публикации заявки на выдачу патента США № 20100076178, имели более слабую активность связывания VEGF, чем эталонное анти-VEGF-мАт AB014 (AB014 содержит такие же последовательности вариабельных доменов, как и антитело Av). Соответственно, h1A11.1-SL-Av, по-видимому, имеет улучшенную кинетику связывания по сравнению с большинством конструкций DVD-Ig, тестированных которых описано в более ранней заявке.

Предшествующие примеры предназначены для иллюстрации и никоим образом не ограничивают настоящее изобретение. Другие варианты раскрытых устройств и способов буду очевидны для специалистов в данной области на основании рассмотрения описания и практического применения устройств и способов, раскрытых в настоящем описании.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

Содержание всех цитированных публикаций (включая печатные публикации, патенты, заявки на выдачу патентов и веб-сайты), которые могут быть цитированы на протяжении настоящей заявки, тем самым специально включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме для всех целей, как и публикации, цитированные в настоящей публикации. В изобретении будут использованы, если не указано иное, обычные способы иммунологии, молекулярной биологии и клеточной биологии, которые хорошо известны в данной области.

В настоящее описание также включены в виде ссылки в полном объеме способы, хорошо известные в области молекулярной биологии и доставки лекарственных средств. Такие способы включают, но без ограничения, способы, описанные в следующих публикациях:

Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993);

Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Biology (4th Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X);

Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);

Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999);

Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984);

Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981;

Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988);

Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991);

Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;

Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).

Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);

Lu and Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X).

Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974);

Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4).

Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).

Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978

Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (translated by Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Изобретение может быть воплощено в других конкретных формах, не отходя от сути или его существенных признаков. Поэтому приведенные выше варианты осуществления изобретения следует считать во всех отношениях иллюстративными, а не ограничивающими изобретение. Таким образом, объем изобретения показан в прилагаемой формуле изобретения, а не в приведенном выше описании, и предполагается, что изобретение охватывает все изменения, которые можно придумать, и весь диапазон эквивалентности формулы изобретения.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности, к белку, связывающему DLL4 и VEGF. Указанный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, каждая из которых имеет два вариабельных домена, связанных линкером. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим указанный связывающий белок. Композиции по настоящему изобретению предназначены для лечения заболевания, характеризуемого чрезмерным ростом сосудов, отеком или аномальной экспрессией или активностью DLL4 и/или VEGF. Изобретение также относится к применению связывающего белка в производстве лекарственного средства для лечения указанного заболевания. Настоящее изобретение позволяет получать композиции для лечения заболевания, характеризуемого чрезмерным ростом сосудов, отеком или аномальной экспрессией или активностью DLL4 и/или VEGF. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 1 ил., 36 табл., 15 пр.

1. Связывающий белок, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из них содержит VD1-X1-VD2-С-(Х2)n, где

VD1 означает первый вариабельный домен;

VD2 означает второй вариабельный домен;

С означает константный домен;

X1 означает линкер;

Х2 означает Fc-область;

n равен 0 или 1;

при этом домены VD1 в первой и второй полипептидных цепях образуют первый функциональный связывающий мишень участок, и домены VD2 в первой и второй полипептидных цепях образуют второй функциональный связывающий мишень участок, и при этом связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF,

где VD1-X1-VD2 в указанной первой полипептидной цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 56 и VD1-X1-VD2 в указанной второй полипептидной цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 64.

2. Связывающий белок по п. 1, в котором первая полипептидная цепь содержит VD1-X1-VD2-С-(Х2)n, где

VD1 означает первый вариабельный домен тяжелой цепи;

VD2 означает второй вариабельный домен тяжелой цепи;

С означает константный домен тяжелой цепи;

X1 означает линкер;

Х2 означает Fc-область;

n равен 0 или 1; и

в котором указанная вторая полипептидная цепь содержит VD1-X1-VD2-C, где

VD1 означает первый вариабельный домен легкой цепи;

VD2 означает второй вариабельный домен легкой цепи;

С означает константный домен легкой цепи;

X1 означает линкер;

при этом домены VD1 в первой и второй полипептидных цепях образуют первый функциональный связывающий мишень участок, и домены VD2 в первой и второй полипептидных цепях образуют второй функциональный связывающий мишень участок.

3. Связывающий белок по п. 1, в котором связывающий белок содержит две первых и две вторых полипептидных цепи и четыре функциональных связывающих мишень участка.

4. Связывающий белок по п. 1, в котором Fc-область связывающего белка представляет собой Fc-область из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD или ее вариант.

5. Связывающий белок по п. 4, в котором Fc-область связывающего белка представляет собой Fc-область с вариантом последовательности.

6. Связывающий белок по п. 1, в котором первая и вторая полипептидные цепи связывающего белка содержат последовательности SEQ ID NO: 74 и 73.

7. Композиция для лечения заболевания, характеризуемого чрезмерным ростом сосудов, отеком или аномальной экспрессией или активностью DLL4 и/или VEGF у субъекта, содержащая связывающий белок по любому из пп. 1-6 и по меньшей мере одно дополнительное средство.

8. Композиция по п. 7, в которой дополнительное средство включает по меньшей мере одно из средств: молекулу иммуноадгезии, визуализирующее средство, терапевтическое средство, цитотоксическое средство, радиоактивную метку, фермент, флуоресцирующую метку, люминесцентную метку, биолюминесцентную метку, магнитную метку, биотин, антиметаболит, алкилирующее средство, антибиотик, фактор роста, цитокин, антиангиогенное средство, антимитотическое средство, антрациклин, токсин или апоптозное средство, химиотерапевтическое средство; визуализирующее средство, ингибитор ангиогенеза, ингибитор киназы, ингибитор KDR, ингибитор TIE-2, модулятор костимулирующей молекулы, антитело к В7.1, антитело к В7.2, CTLA4-Ig, антитело к CD20, блокатор молекулы адгезии, анти-LFA-1-антитело, антитело против E/L-селектина, анти-VEGF-мАТ, анти-DLL4-мАт, низкомолекулярный ингибитор, антитело против цитокина или его функциональный фрагмент, антитело к IL-18, антитело к TNF, антитело против IL-6/рецептора цитокина, метотрексат, циклоспорин, рапамицин, FK506, регистрируемую метку или репортер, антагонист TNF, противоревматическое средство, миорелаксант, наркотик, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (НПВС), анальгетик, анестетик, седативное средство, локальный анестетик, блокатор нервно-мышечного проведения, противомикробное средство, противопсориатическое средство, кортикостероид, анаболический стероид, эритропоэтин, иммунизацию, иммуноглобулин, иммуносупрессор, гормон роста, гормонозаместительное лекарственное средство, радиофармацевтическое средство, антидепрессант, антипсихотическое средство, стимулятор, лекарственное средство против астмы, бета-агонист, ингаляционный стероид, эпинефрин или аналог, цитокин, антагонист цитокина, противогипертоническое средство, диуретик, антагонист адренергического рецептора, блокатор кальциевых каналов, ингибитор ренина, ингибитор АСЕ, антагонист рецептора ангиотензина II, сосудорасширяющее средство, агонист альфа-2, клонидин, метилдопа, гидралазин, празозин, резерпин, моксонидин, кванфацин, периндоприл/индапамид, лофексидин, метирозин, антикоагулянт, варфарин, гепарин, низкомолекулярный гепарин, далтепарин, аргатробан, бевалирудин, лепирудин и декстрозу.

9. Композиция по п. 7, в которой дополнительное средство включает одно или несколько из следующих средств: цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство, антиангиогенное средство, анти-CTLA4-антитело, блокатор кальциевых каналов, ингибитор АСЕ, FOLFIRI, паклитаксел, карбоплатин, доксил, топотекан и цисплатин.

10. Композиция для лечения заболевания, характеризуемого чрезмерным ростом сосудов, отеком или аномальной экспрессией или активностью DLL4 и/или VEGF у субъекта, содержащая связывающий белок по любому из пп. 1-6 и дополнительно включающая:

по меньшей мере одну аминокислоту,

по меньшей мере один полисахарид и/или полисорбат, где указанный связывающий белок присутствует в концентрации 0,1-100 мг/мл, и

где композиция имеет рН 5,0-7,0.

11. Композиция по п. 10, в которой по меньшей мере одна аминокислота включает гистидин, и он присутствует в концентрации 10-20 мМ.

12. Композиция по п. 10, в которой по меньшей мере один полисахарид включает сахарозу, и она присутствует в концентрации 0-8,0% масса/объем (масс./об.).

13. Композиция по п. 10, в которой полисорбат представляет собой полисорбат 80, и он присутствует в концентрации 0-0,06% масс./об.

14. Композиция по п. 10, в которой по меньшей мере одна аминокислота включает аргинин, и он присутствует в концентрации 0-1,5% масс./об.

15. Композиция по любому из пп. 10-14, в которой связывающий белок присутствует в концентрации 0,1-25 мг/мл.

16. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что композиция содержит 15 мМ гистидина, 0,03% (масс./об.) полисорбата 80, 4% (масс./об.) сахарозы и 1-25 мг/мл связывающего белка, при этом рН композиции составляет 6.

17. Применение связывающего белка по любому из пп. 1-6 в производстве лекарственного средства для лечения заболевания, характеризуемого чрезмерным ростом сосудов, отеком или аномальной экспрессией или активностью DLL4 и/или VEGF у субъекта.

18. Применение по п. 17, в котором лекарственное средство дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное средство для лечения заболевания, характеризуемого чрезмерным ростом сосудов, отеком или аномальной экспрессией или активностью DLL4 и/или VEGF у субъекта.

19. Применение по п. 18, в котором по меньшей мере одно дополнительное средство включает одно или несколько из следующих средств: иринотекан, лейковорин, 5-FU, темозоломид, капецитабин, гемцитабин и паклитаксел.

20. Применение по п. 18, в котором по меньшей мере одно дополнительное средство включает одно или несколько из следующих средств: цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство, антиангиогенное средство, анти-CTLA4-антитело, блокатор кальциевых каналов, ингибитор АСЕ, FOLFIRI, паклитаксел, карбоплатин, доксил, топотекан и цисплатин.

21. Применение по п. 17, в котором заболеванием является рак прямой и ободочной кишки, рак яичника, рак шейки матки, рак молочной железы, рак легкого или рак поджелудочной железы.

22. Применение по п. 17, в котором заболеванием является первичная или метастатическая злокачественная опухоль, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарцинома, рак ротовой части глотки, рак гортанной части глотки, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак печени, рак желчного пузыря, рак желчных протоков, рак тонкого кишечника, рак мочевых путей, рак почек, рак мочевого пузыря, рак уротелия, рак женских половых путей, рак шейки матки, рак матки, рак яичников, хориокарцинома, гестационная трофобластическая болезнь, рак мужских половых путей, рак простаты, рак семенных пузырьков, рак семенников, опухоли зародышевых клеток, рак эндокринных желез, рак щитовидной железы, рак надпочечников, рак гипофиза, рак кожи, гемангиомы, меланомы, саркомы, саркома костей, саркома мягких тканей, саркома Капоши, опухоли головного мозга, опухоли нервов, опухоли глаз, опухоли оболочек головного мозга, астроцитомы, глиому, глиобластомы, ретинобластомы, нейромы, нейробластомы, шванномы и менингиомы, солидные опухоли, возникающие в результате гематопоэтических злокачественных новообразований, лейкоз, лимфома, ходжкинская лимфома, неходжкинская лимфома, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак простаты, рак прямой кишки, гематологические злокачественные новообразования, абеталипопротеинемия, акроцианоз, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), В-клеточная лимфома, лимфома Беркитта, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), карцинома прямой и ободочной кишки, волосатоклеточный лейкоз, злокачественная лимфома, злокачественный гистиоцитоз, злокачественная меланома, множественная миелома, карцинома поджелудочной железы, паранеопластический синдром, гиперкальцемия при злокачественных новообразованиях, саркомы, солидные опухоли, макулярная дегенерация, сахарный диабет типа 1, диабетическая ретинопатия или атеросклероз.

23. Применение по п. 17, в котором заболеванием является рак ободочной кишки и

(a) лекарственное средство дополнительно содержит одно или несколько из следующих средств: иринотекан, лейковорин, темозоломид, гемцитабин, паклитаксел, капецитабин, FOLFIRI и 5-FU или

(b) связывающий белок вводят в комбинации с по меньшей мере одним из иринотекана, лейковорина, темозоломида, гемцитабина, паклитаксела, капецитабина, FOLFIRI и 5-FU.

24. Применение по п. 17, в котором заболеванием является глиобластома и

(a) лекарственное средство дополнительно содержит темозоломид, или

(b) связывающий белок вводят в комбинации с темозоломидом.

25. Применение по п. 17, в котором заболеванием является рак поджелудочной железы и

(a) лекарственное средство дополнительно содержит гемцитабин, или

(b) связывающий белок вводят в комбинации с гемцитабином.

26. Применение по п. 17, в котором заболеванием является рак молочной железы и

(a) лекарственное средство дополнительно содержит паклитаксел, или

(b) связывающий белок вводят в комбинации с паклитакселом.

название	год	авторы	номер документа
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ DLL4-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ	2010	Бенатуил Лоренцо Богхарт Эрвин Р. Гу Цзицзе Харрис Мария Хиксон Джонатан А. Хсиех Чунг-Минг Куцкова Юлия Ли Инчунь Лю Чжихун Морган-Лэпп Сьюзан	RU2570639C2
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ DLL4-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ	2011	Ли Инчунь Гу Цзицзе Джеймс Морган-Лэпп Сьюзан Чэнь Минцзю Сиех Чун-Мин	RU2605928C2
АНТИТЕЛА ПРОТИВ DLL4 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2007	Янь Минхонг Ву Янь	RU2415869C2
ИММУНОГЛОБУЛИН С ДВОЙНЫМИ ВАРИАБЕЛЬНЫМИ ДОМЕНАМИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ	2006	Ву Ченбин Гхаюр Тарик Диксон Ричард В Зальфельд Йохен Г	RU2515108C2
IL-1 АЛЬФА И БЕТА БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ С ДВОЙНЫМИ ВАРИАБЕЛЬНЫМИ ДОМЕНАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2011	Ву Ченбин	RU2627171C2
СВЯЗЫВАЮЩИЕ IL-1 БЕЛКИ	2011	Ву Ченбин Амбрози Доминик Дж. Сиех Чун-Мин Гхаюр Тарик	RU2615173C2
НОВЫЕ БЕЛКИ, СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ДВУМЯ МИШЕНЯМИ -DLL4 И VEGF-, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2014	Ли Тон Хон Мун Кюн Тюк Цой Ю Пин Кан Кюн Чэ Ким Тон Ин Ан Чин Хён Ю Вён Кю Чон Чинвон	RU2648154C2
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА АНТАГОНИСТОМ DLL4 И ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ СРЕДСТВОМ	2010	Ногера-Троисе Ирене Терстон Гэвин Тибо Ален	RU2571220C2
БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИ-VEGF/АНТИ-ANG-2 АНТИТЕЛА	2014	Бэнер Моника Бринкманн Ульрих Жорж Ги Гриеп Ремко-Альберт Имхоф-Юнг Забине Кавлье Анита Кеттенбергер Хуберт Клайн Кристиан Регула Йёрг Томас Шэфер Вольфганг Шанцер Юрген Михаэль Шойер Вернер Зеебер Штефан Томас Маркус	RU2640253C2
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ПРИМЕНЕНИЕМ АНТАГОНИСТОВ АКСИАЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ PD-1 И VEGF АНТАГОНИСТОВ	2013	Маекер Хизер Ирвинг Брайан	RU2689760C2

US 20100076178 A1, 25.03.2010
WO 2011109298 A2, 09.09.2011
АНТИТЕЛА ПРОТИВ DLL4 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2007	Янь Минхонг Ву Янь	RU2415869C2
US 2004133357 A1, 08.07.2004
WU C
et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig) Molecule, Antibody Engineering, 2010.

АНТИ-VEGF/DLL4-ИММУНОГЛОБУЛИНЫ С ДВОЙНЫМИ ВАРИАБЕЛЬНЫМИ ДОМЕНАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2017 года по МПК C07K16/46 A61K39/395 C07K16/22 A61K31/715 A61K31/198

Описание патента на изобретение RU2636043C2

Похожие патенты RU2636043C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 636 043 C2

Реферат патента 2017 года АНТИ-VEGF/DLL4-ИММУНОГЛОБУЛИНЫ С ДВОЙНЫМИ ВАРИАБЕЛЬНЫМИ ДОМЕНАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Формула изобретения RU 2 636 043 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2636043C2

RU 2 636 043 C2