ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ DLL4-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ Российский патент 2016 года по МПК C07K16/18 C12N15/13 C12N5/10 C12N15/63 A61K39/395 A61P35/00 A61P37/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/309494, зарегистрированной 2 марта 2010 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Список последовательностей

Настоящая заявка содержит список последовательностей, предоставляемый в формате ASCII посредством EFS-Web и включенный, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 24 февраля 2011 года, названа 10920WOO1.txt, и ее размер составляет 111426 байтов.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к разработке и применению DLL4-связывающих белков в ингибировании, профилактике и/или лечении злокачественных новообразований, опухолей, других ангиогенез-зависимых заболеваний, ангиогенез-независимых заболеваний, дегенерации желтого пятна и заболеваний, связанных с возрастной дегенерацией желтого пятна, отличающихся аномальной экспрессией или активностью DLL4.

Предпосылки изобретения

Межклеточные взаимодействия необходимы для многих биологических процессов, таких как дифференцировка, пролиферация и гомеостаз. Одной системой, используемой широким диапазоном эукариот, является путь передачи сигнала Notch. Этот путь, особенно рецептор Notch, также является критичным для эффективного ангиогенеза в опухоли. Таким образом, ингибирование функций рецептора Notch, блокирование рецептора Notch и/или блокирование пути передачи сигнала Notch представляют собой потенциальные стратегии для противоопухолевых композиций и способов терапии. Доказано, что низкомолекулярные ингибиторы рецептора Notch являются токсичными, т.к. они супрессируют экспрессию рецепторов Notch дикого типа в ткани (нормальную) во всем организме. Таким образом, различных участников пути передачи сигнала Notch следует считать потенциальными мишенями для терапевтических средств.

Лигандом рецептора Notch в сосудистой системе является Дельта 4 или Дельта-подобный лиганд 4 (DLL4). Широко экспрессирующийся в сосудистой системе DLL4 является критичным для развития сосудов (Yan et al., Clin. Cancer Res., 13(24): 7243-7246 (2007); Shutter et al., Genes Dev., 14(11): 1313-1318 (2000); Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 14(11): 1343-1352 (2000)). Мыши, гетерозиготные по DLL4, погибают в эмбриогенезе по причине обширных дефектов в развитии сосудов (Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Duarte et al., Genes Dev., 18(20): 2474-2478 (2004); Krebs etal., Genes Dev., 18(20): 2469-2473 (2004)). Экспрессию DLL4 можно индуцировать посредством VEGF (Liu et al., Mol. Cell Biol., 23(1): 14-25 (2003); Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3219-3224 (2007)). В общем, DLL4 может отрицательно регулировать передачу сигнала VEGF, частично через подавление VEGFR2 и стимуляцию VEGFR1 (Harrington et al., Microvasc. Res., 75(2): 144-154 (2008); Suchting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3225-3230 (2007)). Точная координация между DLL4 и VEGF необходима для эффективного ангиогенеза.

В дополнение к его физиологической роли, DLL4 подвергается положительной регуляции в кровеносных сосудах опухоли (Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Mailhos et al., Differentiation, 69(2-3): 135-144 (2001); Patel et al., Cancer Res., 65(19): 8690-8697 (2005); Patel et al., Clin. Cancer Res., 12(16): 4836-4844 (2006); Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006)). Блокирование DLL4 теоретически ингибирует первичный рост опухоли на множестве моделей (Noguera-Troise et al., Nature, 444 (7122): 1032-1037 (2006); Ridgway et al., Nature, 444 (7122): 1083-1087 (2006); Scehnet et al., Blood, 109 (11): 4753-4760 (2007)). Ингибирование DLL4 являлось эффективным даже против опухолей, устойчивых к терапии против VEGF. Комбинированное ингибирование DLL4 и VEGF обеспечивало повышенную противоопухолевую активность. Что интересно, в отличие от ингибирования VEGF, снижающего образование сосудов опухоли, блокирование DLL4 приводит к повышению плотности сосудов опухоли, где сосуды являются аномальными, не могут поддерживать эффективный транспорт веществ кровью и, по существу, являются нефункциональными. Таким образом, DLL4 представляет потенциальную мишень для лечения злокачественных опухолей.

В данной области существует потребность в терапевтических средствах, способных воздействовать на путь передачи сигнала DLL4-Notch и, таким образом, ингибировать или даже предотвращать ангиогенез и рост опухолей.

Сущность изобретения

Изобретение относится к белкам, связывающим DLL4 человека. DLL4-связывающие белки по изобретению включают, в качестве неограничивающих примеров, моноклональные антитела крысы, химерные антитела, антитела с пересаженными CDR, гуманизированные антитела, приматизированные антитела, аффинно-зрелые антитела и их фрагменты, способные связывать DLL4 человека. Предпочтительно, связывающий белок, приведенный в настоящем описании, связывает DLL4 человека с высокой аффинностью. Более предпочтительно, связывающий белок по изобретению способен нейтрализовать DLL4 человека. Изобретение также относится к способам получения и применения DLL4-связывающих белков.

Один из аспектов изобретения относится к связывающему белку, способному связывать DLL4 человека, где связывающий белок содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы аминокислотных последовательностей, состоящей из SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163 и SEQ ID NO:164.

Аспект настоящего изобретения относится к связывающему белку, содержащему антигенсвязывающий домен, где связывающий белок способен связывать DLL4 человека и указанный антигенсвязывающий домен содержит по меньшей мере одну или более (т.е. две, три, четыре, пять или шесть) CDR, где:

CDR-H1 выбрана из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅ (SEQ ID NO:151), где

X₁ является N, H или Y;

X₂ является F;

X₃ является P;

X₄ является M;

X₅ является A или S;

остатков 31-35 SEQ ID NO:157 (CDR-H1 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:161 (CDR-H1 37D10);

остатков 31-35 SEQ ID NO:163 (CDR-H1 32C7);

остатков 31-35 SEQ ID NO:165 (CDR-H1 14G1);

остатков 31-35 SEQ ID NO:167 (CDR-H1 14A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:169 (CDR-H1 15D6);

остатков 31-35 SEQ ID NO:171 (CDR-H1 VH.1 1A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:172 (CDR-H1 VH.1a 1A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:173 (CDR-H1 VH.1b 1A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:174 (CDR-H1 VH.2a 1A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:179 (CDR-H1 VH.1 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:180 (CDR-H1 VH.1A 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:181 (CDR-H1 VH.1b 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:182 (CDR-H1 VH.2a 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:187 (CDR-H1 h1A11VH.1);

остатков 31-35 SEQ ID NO:188 (CDR-H1 h1A11.A6);

остатков 31-35 SEQ ID NO:189 (CDR-H1 h1A11.A8);

остатков 31-35 SEQ ID NO:190 (CDR-H1 h1A11.C6);

остатков 31-35 SEQ ID NO:191 (CDR-H1 h1A11.A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:192 (CDR-H1 h1A11.B5);

остатков 31-35 SEQ ID NO:193 (CDR-H1 h1A11.E12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:194 (CDR-H1 h1A11.G3);

остатков 31-35 SEQ ID NO:195 (CDR-H1 h1A11.F5); и

остатков 31-35 SEQ ID NO:196 (CDR-H1 h1A11.H2);

CDR-H2 выбрана из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇ (SEQ ID NO:152), где

X₁ является T или S;

X₂ является I;

X₃ является S;

X₄ является S или G;

X₅ является S;

X₆ является D;

X₇ является G, A, D, S или E;

X₈ является T или W;

X₉ является T, P или A;

X₁₀ является Y, S, T или N;

X₁₁ является Y или I;

X₁₂ является R или G;

X₁₃ является D;

X₁₄ является S;

X₁₅ является V;

X₁₆ является K; и

X₁₇ является G;

остатков 50-66 SEQ ID NO:157 (CDR-H2 38H12);

остатков 50-68 SEQ ID NO:161 (CDR-H2 37D10);

остатков 50-66 SEQ ID NO:163 (CDR-H2 32C7);

остатков 50-66 SEQ ID NO:165 (CDR-H2 14G1);

остатков 50-66 SEQ ID NO:167 (CDR-H2 14A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:169 (CDR-H2 15D6);

остатков 50-66 SEQ ID NO:171 (CDR-H2 VH.1 1A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:172 (CDR-H2 VH.1a 1A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:173 (CDR-H2 VH.1b 1A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:174 (CDR-H2 VH.2a 1A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:179 (CDR-H2 VH.1 38H12);

остатков 50-66 SEQ ID NO:180 (CDR-H2 VH.1A 38H12);

остатков 50-66 SEQ ID NO:181 (CDR-H2 VH.1b 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:182 (CDR-H2 VH.2a 38H12);

остатков 50-66 SEQ ID NO:187 (CDR-H2 h1A11VH.1);

остатков 50-66 SEQ ID NO:188 (CDR-H2 h1A11.A6);

остатков 50-66 SEQ ID NO:189 (CDR-H2 h1A11.A8);

остатков 50-66 SEQ ID NO:190 (CDR-H2 h1A11.C6);

остатков 50-66 SEQ ID NO:191 (CDR-H2 h1A11.A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:192 (CDR-H2 h1A11.B5);

остатков 50-66 SEQ ID NO:193 (CDR-H2 h1A11.E12);

остатков 50-66 SEQ ID NO:194 (CDR-H2 h1A11.G3);

остатков 50-66 SEQ ID NO:195 (CDR-H2 h1A11.F5); и

остатков 50-66 SEQ ID NO:196 (CDR-H2 h1A11.H2);

CDR-H3 выбрана из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉ (SEQ ID NO:153), где

X₁ является G;

X₂ является Y;

X₃ является Y;

X₄ является N;

X₅ является S;

X₆ является P;

X₇ является F;

X₈ является A; и

X₉ является Y, F или S;

остатков 99-107 SEQ ID NO:157 (CDR-H3 38H12);

остатков 101-111 SEQ ID NO:161 (CDR-H3 37D10);

остатков 99-105 SEQ ID NO:163 (CDR-H3 32C7);

остатков 99-105 SEQ ID NO:165 (CDR-H3 14G1);

остатков 99-110 SEQ ID NO:167 (CDR-H3 14A11);

остатков 99-110 SEQ ID NO:169 (CDR-H3 15D6);

остатков 99-107 SEQ ID NO:171 (CDR-H3 VH.1 1A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:172 (CDR-H3 VH.1a 1A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:173 (CDR-H3 VH.1b 1A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:174 (CDR-H3 VH.2a 1A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:179 (CDR-H3 VH.1 38H12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:180 (CDR-H3 VH.1A 38H12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:181 (CDR-H3 VH.1b 38H12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:182 (CDR-H3 VH.2a 38H12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:187 (CDR-H3 h1A11VH.1);

остатков 99-107 SEQ ID NO:188 (CDR-H3 h1A11.A6);

остатков 99-107 SEQ ID NO:189 (CDR-H3 h1A11.A8);

остатков 99-107 SEQ ID NO:190 (CDR-H3 h1A11.C6);

остатков 99-107 SEQ ID NO:191 (CDR-H3 h1A11.A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:192 (CDR-H3 h1A11.B5);

остатков 99-107 SEQ ID NO:193 (CDR-H3 h1A11.E12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:194 (CDR-H3 h1A11.G3);

остатков 99-107 SEQ ID NO:195 (CDR-H3 h1A11.F5); и

остатков 99-107 SEQ ID NO:196 (CDR-H3 h1A11.H2);

CDR-L1 выбрана из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁ (SEQ ID NO:154), где

X₁ является R;

X₂ является A;

X₃ является S;

X₄ является E или Q;

X₅ является D или E;

X₆ является I;

X₇ является Y или W;

X₈ является S, I, Y, N или R;

X₉ является N;

X₁₀ является L; и

X₁₁ является A;

остатков 24-34 SEQ ID NO:158 (CDR-L1 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:162 (CDR-L1 37D10);

остатков 24-34 SEQ ID NO:164 (CDR-L1 32C7);

остатков 24-34 SEQ ID NO:166 (CDR-L1 14G1);

остатков 23-37 SEQ ID NO:168 (CDR-L1 14A11);

остатков 23-37 SEQ ID NO:170 (CDR-L1 15D6);

остатков 24-34 SEQ ID NO:175 (CDR-L1 VL.1 1A11);

остатков 24-34 SEQ ID NO:176 (CDR-L1 VL.1a 1A11);

остатков 24-34 SEQ ID NO:177 (CDR-L1 VL.1b 1A11);

остатков 24-34 SEQ ID NO:178 (CDR-L1 VL.2a 1A11);

остатков 24-34 SEQ ID NO:183 (CDR-L1 VL.1 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:184 (CDR-L1 VL.1a 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:185 (CDR-L1 VH.1b 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:186 (CDR-L1 VL.2a 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:197 (CDR-L1 h1A11VL.1);

остатков 24-34 SEQ ID NO:198 (CDR-L1 h1A11.A2);

остатков 24-34 SEQ ID NO:199 (CDR-L1 h1A11.A12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:200 (CDR-L1 h1A11.A7);

остатков 24-34 SEQ ID NO:201 (CDR-L1 h1A11.B4);

остатков 24-34 SEQ ID NO:202 (CDR-L1 h1A11.B5); и

остатков 24-34 SEQ ID NO:203 (CDR-L1 h1A11.E12);

CDR-L2 выбрана из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇ (SEQ ID NO:155), где

X₁ является D;

X₂ является T;

X₃ является N или S;

X₄ является N, D, S, I, Y или V;

X₅ является L;

X₆ является A; и

X₇ является D;

остатков 50-56 SEQ ID NO:158 (CDR-L2 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:162 (CDR-L2 37D10);

остатков 50-56 SEQ ID NO:164 (CDR-L2 32C7);

остатков 50-56 SEQ ID NO:166 (CDR-L2 14G1);

остатков 53-59 SEQ ID NO:168 (CDR-L2 14A11);

остатков 53-59 SEQ ID NO:170 (CDR-L2 15D6);

остатков 50-56 SEQ ID NO:175 (CDR-L2 VL.1 1A11);

остатков 50-56 SEQ ID NO:176 (CDR-L2 VL.1a 1A11);

остатков 50-56 SEQ ID NO:177 (CDR-L2 VL.1b 1A11);

остатков 50-56 SEQ ID NO:178 (CDR-L2 VL.2a 1A11);

остатков 50-56 SEQ ID NO:183 (CDR-L2 VL.1 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:184 (CDR-L2 VL.1a 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:185 (CDR-L2 VH.1b 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:186 (CDR-L2 VL.2a 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:197 (CDR-L2 h1A11VL.1);

остатков 50-56 SEQ ID NO:198 (CDR-L2 h1A11.A2);

остатков 50-56 SEQ ID NO:199 (CDR-L2 h1A11.A12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:200 (CDR-L2 h1A11.A7);

остатков 50-56 SEQ ID NO:201 (CDR-L2 h1A11.B4);

остатков 50-56 SEQ ID NO:202 (CDR-L2 h1A11.B5); и

остатков 50-56 SEQ ID NO:203 (CDR-L2 h1A11.E12);

и CDR-L3 выбрана из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉ (SEQ ID NO:156), где

X₁ является Q;

X₂ является Q;

X₃ является Y;

X₄ является N, D или T;

X₅ является N, Y или W;

X₆ является Y или V;

X₇ является P;

X₈ является P; и

X₉ является T;

остатков 89-97 SEQ ID NO:158 (CDR-L3 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:162 (CDR-L3 37D10);

остатков 89-97 SEQ ID NO:164 (CDR-L3 32C7);

остатков 89-98 SEQ ID NO:166 (CDR-L3 14G1);

остатков 92-100 SEQ ID NO:168 (CDR-L3 14A11);

остатков 92-100 SEQ ID NO:170 (CDR-L3 15D6);

остатков 89-97 SEQ ID NO:175 (CDR-L3 VL.1 1A11);

остатков 89-97 SEQ ID NO:176 (CDR-L3 VL.1a 1A11);

остатков 89-97 SEQ ID NO:177 (CDR-L3 VL.1b 1A11);

остатков 89-97 SEQ ID NO:178 (CDR-L3 VL.2a 1A11);

остатков 89-97 SEQ ID NO:183 (CDR-L3 VL.1 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:184 (CDR-L3 VL.1a 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:185 (CDR-L3 VH.1b 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:186 (CDR-L3 VL.2a 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:197 (CDR-L3 h1A11VL.1);

остатков 89-97 SEQ ID NO:198 (CDR-L3 h1A11.A2);

остатков 89-97 SEQ ID NO:199 (CDR-L3 h1A11.A12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:200 (CDR-L3 h1A11.A7);

остатков 89-97 SEQ ID NO:201 (CDR-L3 h1A11.B4);

остатков 89-97 SEQ ID NO:202 (CDR-L3 h1A11.B5); и

остатков 89-97 SEQ ID NO:203 (CDR-L3 h1A11.E12).

Предпочтительно, DLL4-связывающий белок по изобретению содержит по меньшей мере одну CDR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

остатков 31-35 SEQ ID NO:157 (CDR-H1 38H12); остатков 50-66 SEQ ID NO:157 (CDR-H2 38H12); остатков 99-107 SEQ ID NO:157 (CDR-H3 38H12); остатков 24-34 SEQ ID NO:158 (CDR-L1 38H12); остатков 50-56 SEQ ID NO:158 (CDR-L2 38H12); остатков 89-97 SEQ ID NO:158 (CDR-L3 38H12); остатков 31-35 SEQ ID NO:159 (CDR-H1 1A11); остатков 50-66 SEQ ID NO:159(CDR-H2 1A11); остатков 99-107 SEQ ID NO:159 (CDR-H3 1A11); остатков 24-34 SEQ ID NO:160 (CDR-L1 1A11); остатков 50-56 SEQ ID NO:160 (CDR-L2 1A11); остатков 89-97 SEQ ID NO:160 (CDR-L3 1A11); остатков 31-35 SEQ ID NO:161 (CDR-H1 37D10); остатков 50-68 SEQ ID NO:161 (CDR-H2 37D10); остатков 101-111 SEQ ID NO:161 (CDR-H3 37D10); остатков 24-34 SEQ ID NO:162 (CDR-L1 37D10); остатков 50-56 SEQ ID NO:162 (CDR-L2 37D10); остатков 89-97 SEQ ID NO:162 (CDR-L3 37D10); остатков 31-35 SEQ ID NO:163 (CDR-H1 32C7); остатков 50-66 SEQ ID NO:163 (CDR-H2 32C7); остатков 99-105 SEQ ID NO:163 (CDR-H3 32C7); остатков 24-34 SEQ ID NO:164 (CDR-L1 32C7); остатков 50-56 SEQ ID NO:164 (CDR-L2 32C7); остатков 89-98 SEQ ID NO:164 (CDR-L3 32C7); остатков 31-35 SEQ ID NO:165 (CDR-H1 14G1); остатков 50-66 SEQ ID NO:165 (CDR-H2 14G1); остатков 99-105 SEQ ID NO:165 (CDR-H3 14G1); остатков 24-34 SEQ ID NO:166 (CDR-L1 14G1); остатков 50-56 SEQ ID NO:166 (CDR-L2 14G1); остатков 89-98 SEQ ID NO:166 (CDR-L3 14G1); остатков 31-35 SEQ ID NO:167 (CDR-H1 14A11); остатков 50-66 SEQ ID NO:167 (CDR-H2 14A11); остатков 99-110 SEQ ID NO:167 (CDR-H3 14A11); остатков 23-37 SEQ ID NO:168 (CDR-L1 14A11); остатков 53-59 SEQ ID NO:168 (CDR-L2 14A11); остатков 92-100 SEQ ID NO:168 (CDR-L3 14A11); остатков 31-35 SEQ ID NO:169 (CDR-H1 15D6); остатков 50-66 SEQ ID NO:169 (CDR-H2 15D6); остатков 99-110 SEQ ID NO:169 (CDR-H3 15D6); остатков 23-37 SEQ ID NO:170 (CDR-L1 15D6); остатков 53-59 SEQ ID NO:170 (CDR-L2 15D6); остатков 92-100 SEQ ID NO:170 (CDR-L3 15D6); остатков 31-35 SEQ ID NO:171 (CDR-H1 VH.1 1A11); остатков 50-66 SEQ ID NO:171 (CDR-H2 VH.1 1A11); остатков 99-107 SEQ ID NO:171 (CDR-H3 VH.1 1A11); остатков 31-35 SEQ ID NO:172 (CDR-H1 VH.1a 1A11); остатков 50-66 SEQ ID NO:172 (CDR-H2 VH.1a 1A11); остатков 99-107 SEQ ID NO:172 (CDR-H3 VH.1a 1A11); остатков 31-35 SEQ ID NO:173 (CDR-H1 VH.1b 1A11); остатков 50-66 SEQ ID NO:173 (CDR-H2 VH.1b 1A11); остатков 99-107 SEQ ID NO:173 (CDR-H3 VH.1b 1A11); остатков 31-35 SEQ ID NO:174 (CDR-H1 VH.2a 1A11); остатков 50-66 SEQ ID NO:174 (CDR-H2 VH.2a 1A11); остатков 99-107 SEQ ID NO:174 (CDR-H3 VH.2a 1A11); остатков 24-34 SEQ ID NO:175 (CDR-L1 VL.1 1A11); остатков 50-56 SEQ ID NO:175 (CDR-L2 VL.1 1A11); остатков 89-97 SEQ ID NO:175 (CDR-L3 VL.1 1A11); остатков 24-34 SEQ ID NO:176 (CDR-L1 VL.1a 1A11); остатков 50-56 SEQ ID NO:176 (CDR-L2 VL.1a 1A11); остатков 89-97 SEQ ID NO:176 (CDR-L3 VL.1a 1A11); остатков 24-34 SEQ ID NO:177 (CDR-L1 VL.1b 1A11); остатков 50-56 SEQ ID NO:177 (CDR-L2 VL.1b 1A11); остатков 89-97 SEQ ID NO:177 (CDR-L3 VL.1b 1A11); остатков 24-34 SEQ ID NO:178 (CDR-L1 VL.2a 1A11); остатков 50-56 SEQ ID NO:178 (CDR-L2 VL.2a 1A11); остатков 89-97 SEQ ID NO:178 (CDR-L3 VL.2a 1A11); остатков 31-35 SEQ ID NO:179 (CDR-H1 VH.1 38H12); остатков 50-66 SEQ ID NO:179 (CDR-H2 VH.1 38H12); остатков 99-107 SEQ ID NO:179 (CDR-H3 VH.1 38H12); остатков 31-35 SEQ ID NO:180 (CDR-H1 VH.1A 38H12); остатков 50-66 SEQ ID NO:180 (CDR-H2 VH.1A 38H12); остатков 99-107 SEQ ID NO:180 (CDR-H3 VH.1A 38H12); остатков 31-35 SEQ ID NO:181 (CDR-H1 VH.1b 38H12); остатков 50-66 SEQ ID NO:181 (CDR-H2 VH.1b 38H12); остатков 99-107 SEQ ID NO:181 (CDR-H3 VH.1b 38H12); остатков 31-35 SEQ ID NO:182 (CDR-H1 VH.2a 38H12); остатков 50-66 SEQ ID NO:182 (CDR-H2 VH.2a 38H12); остатков 99-107 SEQ ID NO:182 (CDR-H3 VH.2a 38H12); остатков 24-34 SEQ ID NO:183 (CDR-L1 VL.1 38H12); остатков 50-56 SEQ ID NO:183 (CDR-L2 VL.1 38H12); остатков 89-97 SEQ ID NO:183 (CDR-L3 VL.1 38H12); остатков 24-34 SEQ ID NO:184 (CDR-L1 VL.1a 38H12); остатков 50-56 SEQ ID NO:184 (CDR-L2 VL.1a 38H12); остатков 89-97 SEQ ID NO:184 (CDR-L3 VL.1a 38H12); остатков 24-34 SEQ ID NO:185 (CDR-L1 VL.1b 38H12); остатков 50-56 SEQ ID NO:185 (CDR-L2 VL.1b 38H12); остатков 89-97 SEQ ID NO:185 (CDR-L3 VL.1b 38H12); остатков 24-34 SEQ ID NO:186 (CDR-L1 VL.2a 38H12); остатков 50-56 SEQ ID NO:186 (CDR-L2 VL.2a 38H12); остатков 89-97 SEQ ID NO:186 (CDR-L3 VL.2a 38H12); остатков 31-35 SEQ ID NO:187 (CDR-H1 h1A11VH.1), остатков 50-66 SEQ ID NO:187 (CDR-H2 h1A11VH.1); остатков 99-107 SEQ ID NO:187 (CDR-H3 h1A11VH.1); остатков 31-35 SEQ ID NO:188 (CDR-H1 h1A11.A6), остатков 50-66 SEQ ID NO:188 (CDR-H2 h1A11.A6); остатков 99-107 SEQ ID NO:188 (CDR-H3 h1A11.A6); остатков 31-35 SEQ ID NO:189 (CDR-H1 h1A11.A8), остатков 50-66 SEQ ID NO:189 (CDR-H2 h1A11.A8); остатков 99-107 SEQ ID NO:189 (CDR-H3 h1A11.A8); остатков 31-35 SEQ ID NO:190 (CDR-H1 h1A11.C6), остатков 50-66 SEQ ID NO:190 (CDR-H2 h1A11.C6); остатков 99-107 SEQ ID NO:190 (CDR-H3 h1A11.C6); остатков 31-35 SEQ ID NO:191 (CDR-H1 h1A11.A11), остатков 50-66 SEQ ID NO:191 (CDR-H2 h1A11.A11); остатков 99-107 SEQ ID NO:191 (CDR-H3 h1A11.A11); остатков 31-35 SEQ ID NO:192 (CDR-H1 h1A11.B5), остатков 50-66 SEQ ID NO:192 (CDR-H2 h1A11.B5); остатков 99-107 SEQ ID NO:192 (CDR-H3 h1A11.B5); остатков 31-35 SEQ ID NO:193 (CDR-H1 h1A11.E12), остатков 50-66 SEQ ID NO:193 (CDR-H2 h1A11.E12); остатков 99-107 SEQ ID NO:193 (CDR-H3 h1A11.E12); остатков 31-35 SEQ ID NO:194 (CDR-H1 h1A11.G3), остатков 50-66 SEQ ID NO:194 (CDR-H2 h1A11.G3); остатков 99-107 SEQ ID NO:194 (CDR-H3 h1A11.G3); остатков 31-35 SEQ ID NO:195 (CDR-H1 h1A11.F5), остатков 50-66 SEQ ID NO:195 (CDR-H2 h1A11.F5); остатков 99-107 SEQ ID NO:195 (CDR-H3 h1A11.F5); остатков 31-35 SEQ ID NO:196 (CDR-H1 h1A11.H2), остатков 50-66 SEQ ID NO:196 (CDR-H2 h1A11.H2); остатков 99-107 SEQ ID NO:196 (CDR-H3 h1A11.H2); остатков 24-34 SEQ ID NO:197 (CDR-L1 h1A11VL.1), остатков 50-56 SEQ ID NO:197 (CDR-L2 h1A11VL.1); остатков 89-97 SEQ ID NO:197 (CDR-L3 h1A11VL.1); остатков 24-34 SEQ ID NO:198 (CDR-L1 h1A11.A2), остатков 50-56 SEQ ID NO:198 (CDR-L2 h1A11.A2); остатков 89-97 SEQ ID NO:198 (CDR-L3 h1A11.A2); остатков 24-34 SEQ ID NO:199 (CDR-L1 h1A11.A12), остатков 50-56 SEQ ID NO:199 (CDR-L2 h1A11.A12); остатков 89-97 SEQ ID NO:199 (CDR-L3 h1A11.A12); остатков 24-34 SEQ ID NO:200 (CDR-L1 h1A11.A7), остатков 50-56 SEQ ID NO:200 (CDR-L2 h1A11.A7); остатков 89-97 SEQ ID NO:200 (CDR-L3 h1A11.A7); остатков 24-34 SEQ ID NO:201 (CDR-L1 h1A11.B4), остатков 50-56 SEQ ID NO:201 (CDR-L2 h1A11.B4); остатков 89-97 SEQ ID NO:201 (CDR-L3 h1A11.B4); остатков 24-34 SEQ ID NO:202 (CDR-L1 h1A11.B5), остатков 50-56 SEQ ID NO:202 (CDR-L2 h1A11.B5); остатков 89-97 SEQ ID NO:202 (CDR-L3 h1A11.B5); остатков 24-34 SEQ ID NO:203 (CDR-L1 h1A11.E12), остатков 50-56 SEQ ID NO:203 (CDR-L2 h1A11.E12); и остатков 89-97 SEQ ID NO:203 (CDR-L3h1A11.E12).

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит по меньшей мере три CDR, приведенных в настоящем описании (выше или ниже). В неограничивающем примере DLL4-связывающий белок по изобретению содержит три CDR, приведенных в настоящем описании, где три CDR являются CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, как приведено в настоящем описании. В другом неограничивающем примере DLL4-связывающий белок по изобретению содержит три CDR, приведенных в настоящем описании, где три CDR являются CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, как приведено в настоящем описании.

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит одну или более CDR, приведенных в настоящем описании (выше или ниже), например, одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, приведенных в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит шесть CDR, приведенных в настоящем описании, например, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, как приведено в настоящем описании.

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит три CDR, выбранных из набора CDR вариабельного домена, где набор CDR вариабельного домена выбран из группы наборов CDR вариабельного домена, состоящей из:

Набора CDR VH 38Н12

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:157

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:157

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:157

Набора CDR VL 38Н12

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:158

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:158

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:158

Набора CDR VH 1А11

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:159

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:159

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:159

Набора CDR VL 1А11

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:160

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:160

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:160

Набора CDR VH 37D10

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:161

CDR-H2: остатки 50-68 SEQ ID NO:161

CDR-H3: остатки 101-111 SEQ ID NO:161

Набора CDR VL 37D10

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:162

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:162

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:162

Набора CDR VH 32C7

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:163

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:163

CDR-H3: остатки 99-105 SEQ ID NO:163

Набора CDR VL 32C7

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:164

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:164

CDR-L3: остатки 89-98 SEQ ID NO:164

Набора CDR VH 14G1

CDR-H1: остатки 31 -35 SEQ ID NO:165

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:165

CDR-H3: остатки 99-105 SEQ ID NO:165

Набора CDR VL 14G1

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:166

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:166

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:166

Набора CDR VH 14A11

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:167

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:167

CDR-H3: остатки 99-110 SEQ ID NO:167

Набора CDR VL 14A11

CDR-L1: остатки 23-37 SEQ ID NO:168

CDR-L2: остатки 53-59 SEQ ID NO:168

CDR-L3: остатки 92-100 SEQ ID NO:168

Набора CDR VH 15D6

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:169

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:169

CDR-H3: остатки 99-110 SEQ ID NO:169

Набора CDR VL 15D6

CDR-L1: остатки 23-37 SEQ ID NO:170

CDR-L2: остатки 53-59 SEQ ID NO:170

CDR-L3: остатки 92-100 SEQ ID NO:170

Набора CDR VH VH.1 1A11

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:171

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:171

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:171

Набора CDR VH VH.1a 1A11

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:172

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:172

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:172

Набора CDR VH VH.1b 1A11

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:173

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:173

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:173

Набора CDR VH VH.2a 1A11

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:174

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:174

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:174

Набора CDR VL VL.1 1A11

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:175

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:175

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:175

Набора CDR VL VL.1a 1A11

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:176

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:176

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:176

Набора CDR VL VL.1b 1A11

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:177

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:177

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:177

Набора CDR VL VL.2a 1A11

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:178

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:178

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:178

Набора CDR VH VH.1 38H12

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:179

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:179

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:179

Набора CDR VH VH.1a 38H12

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:180

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:180

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:180

Набора CDR VH VH.1b 38H12

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:181

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:181

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:181

Набора CDR VH VH.2a 38H12

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:182

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:182

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:182

Набора CDR VL VL.1 38H12

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:183

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:183

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:183

Набора CDR VL VL.1a 38H12

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:184

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:184

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:184

Набора CDR VL VL.1b 38H12

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:185

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:185

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:185

Набора CDR VL VL.2a 38H12

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:186

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:186

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:186

Набора CDR VH hA11VH.1

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:187

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:187

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:187

Набора CDR VH hA11.A6

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:188

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:188

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:188

Набора CDR VH hA11.A8

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:189

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:189

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:189

Набора CDR VH hA11.C6

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:190

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:190

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:190

Набора CDR VH hA11.All

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:191

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:191

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:191

Набора CDR VH hA11.B5

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:192

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:192

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:192

Набора CDR VH hA11.E12

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:193

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:193

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:193

Набора CDR VH hA11.G3

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:194

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:194

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:194

Набора CDR VH hA11.F5

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:195

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:195

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:195

Набора CDR VH hA11.H2

CDR-H1: остатки 31-35 SEQ ID NO:196

CDR-H2: остатки 50-66 SEQ ID NO:196

CDR-H3: остатки 99-107 SEQ ID NO:196

Набора CDR VL h1A11VL.1

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:197

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:197

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:197

Набора CDR VL h1A11.A2

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:198

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:198

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:198

Набора CDR VL h1A11.A12

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:199

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:199

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:199

Набора CDR VL h1A11.A7

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:200

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:200

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:200

Набора CDR VL h1A11.B4

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:201

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:201

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:201

Набора CDR VL h1A11.B5

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:202

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:202

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:202

и

Набора CDR VL h1A11.E12

CDR-L1: остатки 24-34 SEQ ID NO:203

CDR-L2: остатки 50-56 SEQ ID NO:203

CDR-L3: остатки 89-97 SEQ ID NO:203

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок содержит CDR по меньшей мере из двух наборов CDR вариабельного домена из указанной выше группы.

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит три CDR, выбранные из любого набора VH трех CDR в указанной выше группе, и три CDR, выбранные из любого набора VL трех CDR в указанной выше группе.

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит набор трех CDR VH, как описано выше, и набор трех CDR VL, как описано выше, из пары наборов CDR VH и VL, выбранных из группы, состоящей из:

Набора CDR VH 38H12 и набора CDR VL 38H12,

Набора CDR VH 1A11 и набора CDR VL 1A11,

Набора CDR VH 37D10 и набора CDR VL 37D10,

Набора CDR VH 32C7 и набора CDR VL 32C7,

Набора CDR VH 14G1 и набора CDR VL 14G1,

Набора CDR VH 14A11 и набора CDR VL 14A11,

Набора CDR VH 15D6 и набора CDR VL 15D6,

Набора CDR VH VH.1 1A11 и набора CDR VL VL.1 1A11,

Набора CDR VH VH.1 1A11 и набора CDR VL VL.1a 1A11,

Набора CDR VH VH.1 1A11 и набора CDR VL VL.1b 1A11,

Набора CDR VH VH.1 1A11 и набора CDR VL VL.2a 1A11,

Набора CDR VH VH.1a 1A11 и набора CDR VL VL.1 1A11,

Набора CDR VH VH.1a 1A11 и набора CDR VL VL.1a 1A11,

Набора CDR VH VH.1a 1A11 и набора CDR VL VL.1b 1A11,

Набора CDR VH VH.1a 1A11 и набора CDR VL VL.2a 1A11,

Набора CDR VH VH.1b 1A11 и набора CDR VL VL.1 1A11,

Набора CDR VH VH.1b 1A11 и набора CDR VL VL.1a 1A11,

Набора CDR VH VH.1b 1A11 и набора CDR VL VL.1b 1A11,

Набора CDR VH VH.1b 1A11 и набора CDR VL VL.2a 1A11,

Набора CDR VH VH.2a 1A11 и набора CDR VL VL.1 1A11,

Набора CDR VH VH.2a 1A11 и набора CDR VL VL.1a 1A11,

Набора CDR VH VH.2a 1A11 и набора CDR VL VL.1b 1A11,

Набора CDR VH VH.2a 1A11 и набора CDR VL VL.2a 1A11,

Набора CDR VH VH.1 38H12 и набора CDR VL VL.1 38H12,

Набора CDR VH VH.1 38H12 и набора CDR VL VL.1a 38H12,

Набора CDR VH VH.1 38H12 и набора CDR VL VL.1b 38H12,

Набора CDR VH VH.1 38H12 и набора CDR VL VL.2a 38H12,

Набора CDR VH VH.1a 38H12 и набора CDR VL VL.1 38H12,

Набора CDR VH VH.1a 38H12 и набора CDR VL VL.1a 38H12,

Набора CDR VH VH.1a 38H12 и набора CDR VL VL.1b 38H12,

Набора CDR VH VH.1a 38H12 и набора CDR VL VL.2a 38H12,

Набора CDR VH VH.1b 38H12 и набора CDR VL VL.1 38H12,

Набора CDR VH VH.1b 38H12 и набора CDR VL VL.1a 38H12,

Набора CDR VH VH.1b 38H12 и набора CDR VL VL.1b 38H12,

Набора CDR VH VH.1b 38H12 и набора CDR VL VL.2a 38H12,

Набора CDR VH VH.2a 38H12 и набора CDR VL VL.1 38H12,

Набора CDR VH VH.2a 38H12 и набора CDR VL VL.1a 38H12,

Набора CDR VH VH.2a 38H12 и набора CDR VL VL.1b 38H12,

Набора CDR VH VH.2a 38H12 и набора CDR VL VL.2a 38H12,

Набора CDR VH h1A11.A6 и набора CDR VL h1A11VL.1,

Набора CDR VH h1A11.C6 и набора CDR VL h1A11VL.1,

Набора CDR VH h1A11.A11 и набора CDR VL h1A11VL.1,

Набора CDR VH h1A11.A8 и набора CDR VL h1A11VL.1,

Набора CDR VH h1A11VH.1 и набора CDR VL h1A11.B4,

Набора CDR VH h1A11VH.1 и набора CDR VL h1A11.A7,

Набора CDR VH h1A11VH.1 и набора CDR VL h1A11.A12,

Набора CDR VH h1A11VH.1 и набора CDR VL h1A11.A2,

Набора CDR VH h1A11.B5 и набора CDR VL h1A11.B5,

Набора CDR VH h1A11.E12 и набора CDR VL h1A11.E12,

Набора CDR VH h1A11.G3 и набора CDR VL h1A11.E12,

Набора CDR VH h1A11.F5 и набора CDR VL h1A11.E12, и

Набора CDR VH h1A11.H2 и набора CDR VL h1A11.E12.

В предпочтительном варианте осуществления DLL4-связывающий белок обладает DLL4-антигенсвязывающим доменом (или участком связывания), содержащим шесть CDR, где CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 находятся в вариабельной области тяжелой цепи (VH), и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 находятся в вариабельной области легкой цепи (VL), и где соединение областей VH и VL образует функциональный DLL4-антигенсвязывающий домен DLL4-связывающего белка. В дополнительном неограничивающем примере этого варианта осуществления DLL4-связывающий белок, обладающий двумя DLL4-антигенсвязывающими доменами, содержит два набора областей VH и VL и, таким образом, содержит двенадцать CDR.

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок обладает DLL4-антигенсвязывающим доменом, содержащим шесть CDR, где CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 находятся в вариабельной области тяжелой цепи (VH), и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 находятся в вариабельной области легкой цепи (VL), и где остальные последовательности в каждой вариабельной области составляют каркасную область (FR) таким образом, что каждая CDR находится между двумя последовательностями FR-областей всего для четырех последовательностей FR, т.е. FR1, FR2, FR3 и FR4. В этом варианте осуществления расположение последовательностей FR и CDR в вариабельной области представляет собой FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. В этом варианте осуществления связывающий домен, образованный соединением области VH и области VL, содержит восемь последовательностей FR и шесть CDR.

DLL4-связывающие белки по изобретению включают антитела с пересаженными CDR, где пересаживают одну или более областей CDR VH и/или VL антитела одних видов (донорных видов) и замещают соответствующими CDR VH и/или VL антитела других (акцепторных) видов с использованием рекомбинантных способов, доступных в этой области. Примером молекул донорных видов является моноклональное антитело крысы против DLL4 человека, приведенное в настоящем описании, и примером молекул акцепторных видов является молекула иммуноглобулина гамма (IgG) человека, где последовательности FR человека областей VH и VL молекулы IgG человека являются акцепторными каркасными последовательностями человека, получающими пересаженные CDR от донорного моноклонального антитела крысы. Акцепторные каркасные последовательности человека полученного антитела с пересаженными CDR можно дополнительно подвергать мутагенезу для улучшения одного или более свойств антитела с пересаженными CDR. В качестве неограничивающих примеров, один или более остатков одной или более последовательностей FR антитела с пересаженными CDR можно подвергать мутагенезу для улучшения аффинности связывания с DLL4 или снижения иммуногенности антитела с пересаженными CDR у человека.

В варианте осуществления изобретения DLL4-связывающий белок, содержащий одну или более описываемых выше CDR, дополнительно содержит акцепторную каркасную последовательность человека. Предпочтительно, DLL4-связывающий белок содержит одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, или восемь) акцепторных каркасных последовательностей человека.

Акцепторная каркасная последовательность человека, присутствующая в DLL4-связывающем белке по изобретению, может содержать один или более аминокислотных остатков, подвергнутых обратному мутагенезу в один или более соответствующих аминокислотных остатков, присутствующих в моноклональном антителе крысы, связывающем DLL4, и/или подвергнутых мутагенезу в одном или более аминокислотных остатках, уменьшающих или устраняющих участок(и) для нежелательных реакций, например, для уменьшения или устранения участка нежелательного гликозилирования, и/или участка нежелательного образования N-концевого пироглутамата, и/или участка потенциально сниженного риска иммуногенности.

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок, содержащий одну или более описываемых выше CDR, дополнительно содержит одну или более (например, любую одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) акцепторных каркасных последовательностей человека, выбранных из группы акцепторных каркасных последовательностей человека в таблицах 3 и 4 ниже. Одна или более акцепторных каркасных последовательностей человека из таблиц 3 и 4, присутствующих в DLL4-связывающем белке по изобретению, может дополнительно содержать один или более аминокислотных остатков, подвергнутых обратному мутагенезу в один или более соответствующих аминокислотных остатков, присутствующих в моноклональном антителе крысы, связывающем DLL4, и/или подвергнутых мутагенезу в одну или более аминокислот, уменьшающих или устраняющих участок(и) для нежелательной реакции, например, для уменьшения или устранения участка нежелательного гликозилирования, и/или участка нежелательного образования N-концевого пироглутамата, и/или участка потенциально сниженного риска иммуногенности.

В другом варианте осуществления изобретение относится к DLL4-связывающему белку, содержащему одну или более описываемых выше CDR, где связывающий белок также содержит одну или более (например, любую одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь на связывающий домен) акцепторных каркасных последовательностей человека, выбранных из любой каркасной последовательности, присутствующей в последовательности вариабельной области, выбранной из группы, состоящей из:

В еще одном варианте осуществления изобретения DLL4-связывающий белок дополнительно содержит одну или более (например, любую одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) акцепторных каркасных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из:

каркаса тяжелой цепи-1 (H-FR1):

E-V-Q-L-V-E-S-G-G-G-L-V-Q-P-G-G-S-L-R-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-X₃₀ (SEQ ID NO:143), где X₃₀ является S, R или G;

каркаса тяжелой цепи-2 (H-FR2): W-V-R-Q-A-P-G-K-G-L-E-W-V-A (SEQ ID NO:144);

каркаса тяжелой цепи-3 (H-FR3):

R-F-T-I-S-R-D-N-A-K-X₁₁-S-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C-X₃₁-R (SEQ ID NO:145), где

X₁₁ является Ν или S; и

X₃₁ является A или S;

каркаса тяжелой цепи-4 (H-FR4): W-G-Q-G-T-L-V-T-V-S-S (SEQ ID NO:146);

каркаса легкой цепи-1 (L-FR1):

D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-T-C (SEQ ID NO:147);

каркаса легкой цепи-2 (L-FR2): W-Y-Q-Q-K-P-G-K-X₉-P-K-L-L-I-X₁₅ (SEQ ID NO:148), где

X₉ является A или S; и

X₁₅ является F или Y;

каркаса легкой цепи-3 (L-FR3):

G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-X₁₅-T-L-T-I-S-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C (SEQ ID NO:149), где

X₁₅ является F или S; и

каркаса легкой цепи-4 (L-FR4): F-G-Q-G-T-K-L-E-I-K (SEQ ID NO:150).

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок, содержащий одну или более описываемых выше CDR, также содержит описываемую выше акцепторную каркасную последовательность человека, где акцепторная каркасная последовательность человека содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в каркасной области в ключевом остатке, где ключевой остаток выбран из группы, состоящей из остатка, смежного с CDR, остатка в участке гликозилирования, редкого остатка, остатка, способного взаимодействовать с DLL4 человека, остатка, способного взаимодействовать с CDR, канонического остатка, контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи, остатка в зоне Вернье и остатка в области, перекрывающейся для CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, определенного по Chothia, и первой каркасной областью тяжелой цепи, определяемой по Kabat.

В другом варианте осуществления акцепторная каркасная последовательность человека DLL4-связывающего белка, приведенная в настоящем описании, содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в каркасной области, где аминокислотная каркасная последовательность является по меньшей мере на 65% идентичной акцепторной каркасной последовательности зародышевой линии человека и содержит по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, идентичных акцепторной каркасной последовательности зародышевой линии человека. В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит консенсусную последовательность вариабельного домена человека.

В варианте осуществления изобретение относится к DLL4-связывающему белку, содержащему акцепторную каркасную последовательность человека, где связывающий белок содержит по меньшей мере один вариабельный домен с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из:

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит два или более описываемых выше вариабельных домена. В предпочтительном варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит два вариабельных домена, где два вариабельных домена имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит по меньшей мере один вариабельный домен с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из:

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит два вариабельных домена, где два вариабельных домена имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит два вариабельных домена с аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из:

SEQ ID NO:188 (h1A11.A6 VH) и SEQ ID NO:197 (h1A11VL.1),

SEQ ID NO:190 (h1A11.C6 VH) и SEQ ID NO:197 (h1A11VL.1) и

SEQ ID NO:191 (h1A11.A11 VH) и SEQ ID NO:197 (h1A11.VL.1).

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению содержит два вариабельных домена с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:181 (VH.1b 38H12) и SEQ ID NO:185 (VL.1b 38H12).

По изобретению вариабельные домены тяжелой цепи (VH) и вариабельные домены легкой цепи (VL) любого из DLL4-связывающих белков, приведенных в настоящем описании, также можно перетасовывать с использованием доступных в этой области рекомбинантных способов для получения и селекции дополнительных DLL4-связывающих белков, содержащих различные комбинации доменов VH и VL, приведенные в настоящем описании.

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению связывает DLL4 человека (hu DLL4) и по меньшей мере DLL4 одного другого вида. Более предпочтительно, DLL4-связывающий белок, приведенный в настоящем описании, связывает DLL4 человека и DLL4, выбранный из группы, состоящей из DLL4 яванского макака (DLL4 яванского макака, cyno DLL4), DLL4 мыши (mu DLL4), DLL4 крысы и их комбинаций.

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок, приведенный в настоящем описании, способен блокировать взаимодействие DLL4 с белком Notch. Предпочтительно, белок Notch выбран из группы, состоящей из Notch-1, Notch-2, Notch-3, Notch-4 и их комбинаций.

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок, приведенный в настоящем описании, способен модулировать, ингибировать или нейтрализовать одну или более биологических функций DLL4 человека. Более предпочтительно, DLL4-связывающий белок по изобретению способен модулировать, ингибировать или нейтрализовывать активность DLL4, выбранного из группы, состоящей из DLL4 человека, DLL4 яванского макака, DLL4 обезьяны, DLL4 крысы и их комбинаций.

В дополнительном варианте осуществления DLL4-связывающий белок, приведенный в настоящем описании, способен ингибировать активность VEGFR2, активность VEGFR1 или активность и VEGFR2, и VEGFR1.

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок, приведенный в настоящем описании, способен ингибировать нормальный ангиогенез.

В варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению имеет константу скорости прямой реакции (K_on) с DLL4 по меньшей мере приблизительно 10² М^-1с^-1;, по меньшей мере приблизительно 10³ М^-1с^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁴ М^-1с^-1;, по меньшей мере приблизительно 10⁵ М^-1с^-1; или по меньшей мере приблизительно 10⁶ М^-1с^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса. Предпочтительно, связывающий белок по изобретению имеет константу скорости прямой реакции (K_on) с DLL4 от 10² М^-1с^-1 до 10³ М^-1с^-1; от 10³ М^-1с^-1 до 10⁴ М^-1с^-1; от 10⁴ М^-1с^-1 до 10⁵ М^-1с^-1; или от 10⁵ М^-1с^-1 до 10⁶ М^-1с^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса.

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению имеет константу скорости обратной реакции (K_off) с DLL4 не более приблизительно 10^-3 с^-1; не более приблизительно 10^-4 с^-1; не более приблизительно 10^-5 с^-1; или не более приблизительно 10^-6 с^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса. Предпочтительно, связывающий белок по изобретению имеет константу скорости обратной реакции (K_off) с DLL4 от 10^-3 с^-1 до 10^-4 с^-1; от 10^-4 с^-1 до 10^-5 с^-1; или от 10^-5 с^-1 до 10^-6 с^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса.

В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению имеет константу диссоциации (K_D) для DLL4 не более приблизительно 10^-7 M; не более приблизительно 10^-8 M; не более приблизительно 10^-9 M; не более приблизительно 10^-10 M; не более приблизительно 10^-11 M; не более приблизительно 10^-12 M; или не более 10^-13 M. Предпочтительно, связывающий белок по изобретению имеет константу диссоциации (K_D) для DLL4 от 10^-7 Μ до 10^-8 M; от 10^-8 M до 10^-9 Μ; от 10^-9 Μ до 10^-10 Μ; от 10^-10 до 10^-11 Μ; от 10^-11 Μ до 10^-12 Μ; или от 10^-12 Μ до 10^-13 Μ.

В варианте осуществления изобретение относится к конструкции антитела, содержащей описываемый выше DLL4-связывающий белок и линкерный полипептид или константный домен иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления конструкция антитела по изобретению выбрана из группы, состоящей из: молекулы иммуноглобулина, моноклонального антитела, химерного антитела, антитела с пересаженными CDR, гуманизированного антитела, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, связанных дисульфидной связью Fv, scFv, однодоменного антитела, диатела, полиспецифического антитела, антитела с двойной специфичностью и биспецифического антитела.

В предпочтительном варианте осуществления конструкция антитела по изобретению содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из константного домена IgM человека, константного домена IgG1 человека, константного домена IgG2 человека, константного домена IgG3 человека, константного домена IgG4 человека, константного домена IgE человека и константного домена IgA человека.

В другом варианте осуществления конструкция антитела по изобретению содержит константную область иммуноглобулина, выбранную из группы, состоящей из константной области тяжелой цепи иммуноглобулина гамма-1 (IgG1) (такой как SEQ ID NO:3), мутантной константной области тяжелой цепи IgG1 (такой как SEQ ID NO:4), константной области легкой каппа-цепи иммуноглобулина (такой как SEQ ID NO:5), константной области легкой лямбда-цепи иммуноглобулина (такой как SEQ ID NO:6) и их комбинаций.

В другом варианте осуществления конструкция антитела гликозилирована. Предпочтительно, гликозилирование происходит по профилю гликозилирования человека.

В варианте осуществления изобретение относится к конъюгату антитела, содержащему конструкцию антитела, приведенную в настоящем описании, конъюгированную со средством. Предпочтительно, средство выбрано из группы, состоящей из: средства для визуализации, терапевтического средства, цитотоксического средства и молекулы иммуноадгезии. В предпочтительном варианте осуществления средства визуализации выбраны из группы, состоящей из: радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминисцентной метки, биолюминисцентной метки, магнитной метки и биотина. Более предпочтительно, средство для визуализации является радиоактивной меткой, выбранной из группы, состоящей из: ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho и ¹⁵³Sm. В предпочтительном варианте осуществления терапевтическое или цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из: антиметаболита, алкилирующего средства, антибиотика, фактора роста, цитокина, антиангиогенного средства, антимитотического средства, антрациклина, токсина и проапоптотического средства.

В другом варианте осуществления описываемые выше DLL4-связывающий белок, конструкция антитела или конъюгат антитела существуют в виде кристалла. Предпочтительно, кристалл является фармацевтическим кристаллом с контролируемым высвобождением без носителя. В другом варианте осуществления такой кристаллизованный связывающий белок, кристаллизованная конструкция антитела или кристаллизованный конъюгат антитела имеет большее время полужизни in vivo, чем его растворимый эквивалент. В предпочтительном варианте осуществления кристаллизованный связывающий белок, кристаллизованная конструкция антитела или кристаллизованный конъюгат антитела после кристаллизации сохраняет биологическую активность растворимой или некристаллической формы связывающего белка, конструкции антитела или конъюгата антитела.

В варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей одну или более аминокислотных последовательностей DLL4-связывающего белка (включая любую конструкцию антитела или конъюгат антитела), приведенного в настоящем описании.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, выбранный из группы, состоящей из: полипептида, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит одну или более из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, как описано выше; полипептида, содержащего вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен легкой цепи содержит одну или более из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, как описано выше; и комбинации обоих полипептидов.

Один из аспектов изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей DLL4-связывающий белок, конструкцию антитела, DLL4-связывающий конъюгат антитела или его DLL4-связывающую часть. Особенно предпочтительной является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, выбранный из группы, состоящей из: полипептида, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит описываемые выше CDR-H1, CDR-H2 или CDR-H3; полипептида, содержащего вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен легкой цепи содержит CDR-L1, CDR-L2 или CDR-L3, как описано выше; или комбинации обоих полипептидов.

Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к вектору, содержащему выделенную нуклеиновую кислоту, приведенную в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления вектор выбран из группы, состоящей из: pcDNA, pTT (Durocher et al., Nucl. Acids Res., 30(2e9): 1-9 (2002)), pTT3 (pTT с дополнительными множественными участками клонирования), pEFBOS (Mizushima et al., Nucl. Acids. Res., 18 (17): 5322 (1990)), pBV, pJV и pBJ.

Другой аспект изобретения относится к клетке-хозяину, трансформированной описываемым выше вектором. Клетка-хозяин может являться прокариотической или эукариотической клеткой. Предпочтительная прокариотическая клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli. Предпочтительно, эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из: клетки простейшего, клетки животного, растительной клетки и клетки гриба. Более предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, включая, в качестве неограничивающих примеров, клетки CHO и COS. Предпочтительная клетка гриба представляет собой Saccharomyces cerevisiae. Предпочтительная клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.

Другой аспект изобретения относится к способу получения связывающего белка, связывающего DLL4 человека, включающему этап культивирования любой из описываемых выше клеток-хозяев в среде для культивирования в условиях, достаточных для получения связывающего белка, связывающего DLL4 человека.

Один из вариантов осуществления относится к композиции для высвобождения DLL4-связывающего белка по изобретению, где композиция содержит состав, содержащий кристаллизованный DLL4-связывающий белок, кристаллизованную конструкцию антитела или кристаллизованный конъюгат антитела, как описано выше, и ингредиент, и дополнительно по меньшей мере один полимерный носитель. Предпочтительно, полимерный носитель является полимером, выбранным из одного или более из группы, состоящей из: поли(акриловой кислоты), поли(цианоакрилатов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(депсипептида), поли(сложных эфиров), поли(молочной кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислоты или PLGA, поли(b-гидроксибутирата), поли(капролактона), поли(диоксанона); поли(этиленгликоля), поли(гидроксипропил)метакриламида, поли[(органо)фосфазена], поли(ортоэфиров), поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), сополимеров малеинового ангидрида и алкилвинилового простого эфира, полиолов-плюроников, альбумина, альгината, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликозаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и сополимеров. Предпочтительно, ингредиент выбран из группы, состоящей из альбумина, сахарозы, трегалозы, лактитола, желатина, гидроксипропил-β-циклодекстрина, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленгликоля.

Другой вариант осуществления относится к способу лечения млекопитающего, включающему этап введения млекопитающему эффективного количества композиции, содержащей кристаллизованный DLL4-связывающий белок, кристаллизованную конструкцию антитела или кристаллизованные конъюгаты антитела, описываемые выше.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей DLL4-связывающий белок, как описано выше (включая конструкцию антитела или конъюгат антитела, как описано выше) и фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное средство. Дополнительное средство может являться терапевтическим средством для лечения нарушения, при котором DLL4 наносит вред. Предпочтительно, фармацевтическая композиция по изобретению содержит дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из: терапевтического средства; средства для визуализации; противоопухолевого средства; химиотерапевтического средства; ингибитора ангиогенеза; антитела против VEGF; антитела против EGFR; антитела против cMet; антитела против ErbB3; антитела против HER2; антитела против CD20; молекулы-ловушки для VEGF; ингибитора киназ; блокатора костимуляторных молекул; антитела против B7.2; CTLA4-Ig; блокатора молекул адгезии; антитела против селектина E; антитела против селектина L; антитела против цитокина или его функционального фрагмента; антитела против IL-18; антитела против TNF; антитела против IL-6; метотрексата; кортикостероида; циклоспорина; рапамицина; FK506; ДНК-алкилирующего средства; цисплатина; карбоплатина; антитубулинового средства; паклитаксела; доцетаксела; доксорубицина; гемцитабина; гемзара; антрациклина; адриамицина; ингибитора топоизомеразы I; ингибитора топоизомеразы II; 5-фторурацила (5-FU); лейковорина; иринотекана; ингибитора тирозинкиназного рецептора; ингибитора апоптоза; ингибитора Bcl2/Bclx; эрлотиниба; гефитиниба; ингибитора COX-2; целекоксиба; циклоспорина; рапамицина; детектируемой метки или репортерной молекулы; антагониста TNF; противоревматического средства; миорелаксанта; наркотического средства; анальгезирующего средства; анестетика; седативного средства; местного анестетика; блокатора нервно-мышечного проведения; противомикробного средства; противопсориазного средства; кортикостероида; анаболического стероида; эритропоэтина; средства для иммунизации; иммуноглобулина; иммуносупрессирующего средства; гормона роста; лекарственного средства для гормонозаместительной терапии; радиофармацевтического лекарственного средства; антидепрессанта; антипсихотического лекарственного средства; стимулятора; лекарственного средства против астмы; бета-агониста; ингаляционного стероида; эпинефрина; аналога эпинефрина; цитокина; и антагониста цитокина.

В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования активности DLL4 человека, включающему приведение DLL4 человека в контакт с описываемым выше связывающим белком таким образом, что ингибируют или нейтрализуют DLL4 человека. В родственном аспекте изобретение относится к способу ингибирования активности DLL4 у человека, страдающего нарушением, при котором DLL4 наносит вред, включающему введение человеку описываемого выше связывающего белка таким образом, что у человека ингибируют DLL4 человека и достигают лечения. Предпочтительно, нарушение выбрано из группы, включающей первичные и метастатические злокачественные новообразования, включая карциномы молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, легких, ротоглотки, гортаноглотки, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, мочевыводящих путей (включая почки, мочевой пузырь и уротелий), женской половой системы (включая шейку матки, матку и яичники, а также хориокарциному и гестационную трофобластическую болезнь), мужской половой системы (включая предстательную железу, семенные пузырьки, тестикулы и герминогенные опухоли), эндокринных желез (включая щитовидную железу, надпочечники и гипофиз) и кожи, а также гемангиомы, меланомы, саркомы (включая возникающие из костной ткани и мягких тканей, а также саркому Капоши), опухоли головного мозга, нервов, глаз и оболочек головного и спинного мозга (включая астроцитомы, глиомы, глиобластомы, ретинобластомы, невромы, нейробластомы, шванномы и менингиомы), солидные опухоли, возникающие из злокачественных новообразований гемопоэтической системы, такие как лейкозы и лимфомы (ходжкинские и неходжкинские лимфомы), метастазы опухолей, неоваскуляризацию глаз (включая диабетический амавроз, ретинопатии, возрастную дегенерацию желтого пятна и рубеоз), отек, ревматоидный артрит, атеросклеротические бляшки, рефрактерный асцит, псориаз, панкреатит, поликистоз яичников (POD), эндометриоз, миому матки, доброкачественную гипертрофию предстательной железы, T-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), церебральную аутосомно-доминантную артериопатию с подкорковыми инфарктами и лейкоэнцефалопатией (CADASIL), рассеянный склероз (MS), тетраду Фалло (TOF), синдром Алажиля (AS), дегенерацию желтого пятна и заболевания, связанные с возрастной дегенерацией желтого пятна, и другие ангиогенез-независимые и зависимые заболевания, связанные с аномальной экспрессией или активностью DLL4.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего нарушением, при котором DLL4 человека наносит вред, включающему этап введения любого из описываемых выше связывающих белков до, одновременно или после введения терапевтически эффективного количества второго средства. В предпочтительном варианте осуществления второе средство выбрано из группы, состоящей из: радиотерапевтического средства; противоопухолевого средства; химиотерапевтического средства; ДНК-алкилирующего средства; цисплатина; карбоплатина; антитубулинового средства; паклитаксела; доцетаксела; таксола; доксорубицина; гемцитабина; гемзара; антрациклина; адриамицина; ингибитора топоизомеразы I; ингибитора топоизомеразы II; 5-фторурацила (5-FU); лейковорина; иринотекана; ингибитора тирозинкиназного рецептора; ингибитора апоптоза; ингибитора Bcl2/Bclx; эрлотиниба; гефитиниба; ингибитора COX-2; целекоксиба; ингибитора киназ; ингибитора ангиогенеза; антитела против VEGF; антитела против EGFR; антитела против cMet; антитела против ErbB3; антитела против HER2; антитела против CD20; молекулы-ловушки для VEGF (афлиберцепта); блокатора костимуляторных молекул; антитела против B7.1; антитела против B7.2; CTLA4-Ig; блокатора молекул адгезии; антитела против LFA-1; антитела против селектина E; антитела против селектина L; низкомолекулярного ингибитора; антитела против цитокина или его функционального фрагмента; антитела против IL-18; антитела против TNF; антитела против IL-6; антитела против цитокинового рецептора; метотрексата; циклоспорина; рапамицина; FK506; детектируемой метки или репортера; антагониста TNF; противоревматического средства; миорелаксанта; наркотического средства; нестероидного противовоспалительного средства (NSAID); анальгезирующего средства; анестетика; седативного средства; местного анестетика; блокатора нервно-мышечного проведения; противомикробного средства; противопсориазного средства; кортикостероида; анаболического стероида; эритропоэтина; средства для иммунизации; иммуноглобулина; иммуносупрессирующего средства; гормона роста; лекарственного средства для гормонозаместительной терапии; радиофармацевтического лекарственного средства; антидепрессанта; антипсихотического лекарственного средства; стимулятора; лекарственного средства против астмы; бета-агониста; ингаляционного стероида; эпинефрина; аналога эпинефрина; цитокина; и антагониста цитокина.

В предпочтительном варианте осуществления описываемые выше фармацевтические композиции вводят индивидууму по меньшей мере одним способом, выбранным из группы, состоящей из: парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, интраартериального, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшинного, внутрикапсульного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутричревного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутритолстокишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, интраперитонеального, внутриплеврального, внутрипростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, внутрипозвоночного, внутрисуставного, интраторакального, внутриматочного, интравезикального, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального введения.

Другой аспект изобретения относится по меньшей мере к одному DLL4-антиидиотипическому антителу к по меньшей мере одному DLL4-связывающему белку по настоящему изобретению. Антиидиотипическое антитело включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, содержащую по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, в качестве неограничивающих примеров, такую как по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR) тяжелой или легкой цепи или ее часть, связывающую лиганд, вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, константную область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасную область и любую его часть, которую можно встраивать в связывающий белок по настоящему изобретению.

Любой из множества форматов иммунологических анализов можно адаптировать для использования DLL4-связывающего белка по изобретению для определения или измерения DLL4 в смеси, растворе или биологическом образце. Такие форматы иммунологических анализов включают, в качестве неограничивающих примеров, радиоиммунологический анализ (RIA), иммунопреципитацию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноблоттинг (например, вестерн-блоттинг), иммунострипы (например, тест-полоски), содержащие DLL4-связывающий белок по изобретению, адсорбированный или иммобилизованный на субстрате, FACS и т.п. Определение DLL4 с использованием DLL4-связывающего белка по изобретению можно осуществлять in vitro в смеси, растворе или биологическом образце. Биологический образец, который можно приводить в контакт со связывающим белком по изобретению для определения или измерения DLL4 в образце, включает, в качестве неограничивающих примеров, мочу, слюну, мазок со слизистой оболочки ротовой полости (буккальный, лингвальный или мазок из зева), мазок с кожи, соскоб с кожи, ректальный мазок, вагинальный мазок, образец цельной крови, образец плазмы, образец сыворотки, биопсийный материал ткани и любой другой образец, получаемый от индивидуума известным в этой области способом. В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок можно использовать для определения DLL4 in vivo, такого как различные способы томографии и сканирования, включая, в качестве неограничивающих примеров, компьютерную томографию (КТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ) и позитрон-эмиссионную томографию (ПЭТ).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к DLL4-связывающим белкам, в частности, антителам против DLL4 или их антигенсвязывающим частям, связывающим DLL4. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1) DLL4 человека представлена в таблице 1 вместе с соответствующей кодирующей нуклеотидной последовательностью DLL4 (SEQ ID NO:2). Различные аспекты изобретения относятся к антителам и фрагментам антител, и их фармацевтическим композициям, а также нуклеиновым кислотам, рекомбинантным экспрессирующим векторам и клеткам-хозяевам для получения таких антител и фрагментов. Способы использования антител по изобретению для определения DLL4 человека или DLL4 мыши, способы ингибирования активности DLL4 человека или мыши и/или VEGFR2 или VEGFR1 человека или мыши in vitro или in vivo и способы регуляции экспрессии генов также включены в изобретение.

Таблица 1
Аминокислотная и кодирующая нуклеотидная последовательности DLL4 человека.      

 

 

Если иное не указано в настоящем описании, научные и технические термины, используемые в отношении настоящего изобретения, должны обладать значениями, которые обычно понимают специалисты в этой области. Значение и объем терминов должны быть четкими, однако в случае любой скрытой двусмысленности представляемые в настоящем описании определения превалируют над любым словарным или посторонним определением. Кроме того, если иное не предусмотрено контекстом, термины в единственном числе должны включать множественное число, и термины во множественном числе должны включать единственное число. В настоящей заявке использование "или" означает "и/или", если не указано иначе. Кроме того, не ограничивают использование термина "включая", а также других форм, таких как "включает" и "включенный". Также, термины, такие как "элемент" или "компонент" включают и элементы, и компоненты, содержащие одну единицу, и элементы и компоненты, содержащие несколько субъединиц, если особо не указано иначе.

Как правило, используемые номенклатуры и способы культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, приведенные в настоящем описании, являются теми, которые хорошо известны и общеупотребительны в этой области. Способы по настоящему изобретению, как правило, осуществляют в соответствии с общепринятыми хорошо известными в этой области способами и как описано в различных общих и более специализированных источниках, цитируемых и обсуждаемых на всем протяжении настоящего описания, если не указано иначе. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют по руководствам производителей, как общепринято осуществляют в этой области или как приведено в настоящем описании. Используемые номенклатуры и лабораторные способы аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, приведенные в настоящем описании, являются хорошо известными и общеупотребительными в этой области. Для химического синтеза, химического анализа, получения, составления и доставки лекарственного средства и лечения пациентов используют стандартные способы.

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводят выбранные термины.

Как применяют в настоящем описании, термин "полипептид" относится к любой полимерной цепи аминокислот. Термины "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо с термином полипептид, и они также относятся к полимерной цепи аминокислот. Термин "полипептид" включает природные или искусственные белки, фрагменты белка и полипептидные аналоги последовательности белка. Полипептид может являться мономерным или полимерным. Использование термина "полипептид" в настоящем описании предназначено для включения полипептида и его фрагментов и вариантов (включая фрагменты вариантов), если не указано иначе. В случае антигенного полипептида фрагмент полипептида, необязательно, содержит по меньшей мере один смежный или нелинейный эпитоп полипептида. Специалист в этой области может подтверждать точные границы по меньшей мере одного фрагмента эпитопа. Фрагмент содержит по меньшей мере приблизительно 5 смежных аминокислот, например, по меньшей мере приблизительно 10 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 15 смежных аминокислот или по меньшей мере приблизительно 20 смежных аминокислот. Вариант полипептида приведен в настоящем описании.

Термин "выделенный белок" или "выделенный полипептид" означает белок или полипептид, в силу своего происхождения или источника получения не связанный с природными компонентами, сопутствующими ему в его нативном состоянии; по существу, несодержащий белки тех же видов; экспрессируемый клетками других видов; или не существующий в природе. Таким образом, полипептид, химически синтезированный или синтезированный в клеточной системе, отличающейся от клетки, из которой он происходит в природе, будет являться "выделенным" из связанных с ним в природе компонентов. Также белок можно получать, по существу, несодержащим связанные с ним в природе компоненты посредством выделения с использованием хорошо известных в этой области способов очистки белка.

Как применяют в настоящем описании, термин "выделение", относится к способу получения химических соединений, таких как полипептид, по существу, не содержащих связанные с ними в природе компоненты посредством выделения, например, с использованием хорошо известных в этой области способов очистки белка.

Как применяют в настоящем описании, термин "DLL4 человека" (сокращенный в настоящем описании как "hDLL4" или "huDLL4"), включает несколько EGF-подобных доменов и DSL-домен, необходимый для связывания рецептора. Термин включает белок, составляющий приблизительно 74-75 кДа. Структуру и предсказанные последовательности ДНК и белка DLL4 человека дополнительно описывают, например, в Shutter et al., Genes & Dev., 4: 1313-1318 (2000). Термин "DLL4 человека" предназначен для включения рекомбинантного DLL4 человека (rh DLL4), который можно получать стандартными способами рекомбинантной экспрессии.

Как применяют в настоящем описании в отношении DLL4, "биологическая активность" относится ко всем присущим DLL4 биологическим свойствам. Биологические свойства DLL4 включают, в качестве неограничивающих примеров, связывание рецептора Notch, активацию рецептора Notch, отрицательную регуляцию передачи сигнала VEGF, репрессию VEGFR2 и стимуляцию VEGFR1.

Как применяют в настоящем описании по отношению к взаимодействию антитела, белка или пептида со вторым химическим соединением, термины "специфическое связывание" или "специфически связывающий" означают, что взаимодействие зависит от наличия в химическом соединении конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа); например, антитело распознает и связывается с конкретной белковой структурой чаще, чем с белками вообще. Если антитело является специфичным к эпитопу "A", наличие молекулы, содержащей эпитоп A (или свободный, немеченый A), в реакции, включающей меченый "A" и антитело, будет снижать количество меченого A, связывающегося с антителом.

"Связывающий белок" является мономерным или мультимерным белком, связывающимся и образующим комплекс с партнером по связыванию, который может являться полипептидом, антигеном, химическим соединением или другой молекулой, или субстратом любого типа. Связывающий белок специфически связывается с партнером по связыванию. Связывающие белки включают антитела и другие молекулы, содержащие один или более антигенсвязывающих доменов, связывающихся с молекулой антигена или конкретным участком (эпитопом) на молекуле антигена. Связывающий белок включает антитело или любой из его антигенсвязывающих фрагментов, и различные формы и производные антител, известные в этой области и описываемые ниже. Таким образом, связывающий белок включает, в качестве неограничивающих примеров, антитело, тетрамерный иммуноглобулин, молекулу IgG, молекулу IgG1, моноклональное антитело, химерное антитело, антитело с пересаженными CDR, гуманизированное антитело, аффинно-зрелое антитело и фрагменты любых таких антител, сохраняющие способность связываться с антигеном.

Как применяют в настоящем описании, термин "антитело" приблизительно относится к любой молекуле иммуноглобулина (Ig), состоящей из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, или любому его функциональному фрагменту, мутанту, варианту или производному, сохраняющему необходимые для связывания эпитопа свойства молекулы Ig. В этой области известны форматы таких мутантов, вариантов или производных антител. Их неограничивающие варианты осуществления представлены ниже.

В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенной в настоящем описании как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенной в настоящем описании как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделять на гипервариабельные области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), рассеянными среди более консервативных областей, называемых каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Термин "Fc-область" используют для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которую можно получать расщеплением интактного антитела папаином. Fc-область может представлять собой нативную последовательность Fc-области или вариант Fc-области. Fc-область иммуноглобулина, как правило, содержит два константных домена, домен CH2 и домен CH3, и, необязательно, содержит домен CH4. В этой области известны замены аминокислотных остатков в Fc-части для изменения эффекторной функции антитела (патенты США №№ 5648260 и 5624821). Fc-часть антитела опосредует несколько важных эффекторных функций, например, стимуляцию цитокинов, ADCC, фагоцитоз, обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC) и время полужизни/скорость выведения антитела и комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях эти эффекторные функции желательны для терапевтического антитела, но в других случаях могут являться нежелательными или даже вредными в зависимости от терапевтических целей. Конкретные изотипы IgG человека, в частности, IgG1 и IgG3, опосредуют ADCC и CDC посредством связывания FcγR и компонента комплемента C1q, соответственно. Неонатальные Fc-рецепторы (FcRn) являются критическими компонентами, определяющими время полужизни циркулирующих антител. В другом варианте осуществления по меньшей мере один аминокислотный остаток заменяют в константной области антитела, например, Fc-области антитела, таким образом, что изменяют эффекторные функции антитела. Димеризацию двух идентичных тяжелых цепей иммуноглобулина опосредует димеризация доменов CH3, и стабилизируют дисульфидные связи в шарнирной области (Huber et al., Nature, 264: 415-420 (1976); Thies et al., J. Mol. Biol, 293: 67-79 (1999)). Мутация остатков цистеина в шарнирных областях для предотвращения образования дисульфидных связей между тяжелыми цепями будет дестабилизировать димеризацию доменов CH3. Идентифицируют остатки, ответственные за димеризацию CH3 (Dall'Acqua, Biochem., 37: 9266-9273 (1998)). Таким образом, можно получать моновалентные полу-Ig. Что интересно, эти моновалентные молекулы полу-Ig обнаруживают в природе в случае подклассов IgG и IgA (Seligman, Ann. Immunol., 129: 855-70 (1978); Biewenga et al., Clin. Exp. Immunol., 51: 395-400 (1983)). Стехиометрический состав FcRn:Ig Fc-область определяют как 2:1 (West et al., Biochem., 39: 9698-9708 (2000)), и половины Fc достаточно для опосредования связывания FcRn (Kim et al., Eur. J. Immunol., 24: 542-548 (1994)). Мутации с нарушением димеризации домена CH3 могут не оказывать большого неблагоприятного воздействия на его связывание с FcRn, т.к. остатки, важные для димеризации CH3, находятся на внутренней поверхности структуры β-листа CH3, в то время как область, ответственная за связывание FcRn, находится на внешней поверхности доменов CH2-CH3. Однако молекула полу-Ig может обладать конкретными преимуществами при проникновении в ткань по причине своего меньшего размера по сравнению с размером обычного антитела. В одном из вариантов осуществления в константной области связывающего белка по изобретению, например, Fc-области, заменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток таким образом, что нарушают димеризацию тяжелых цепей, приводя к образованию молекул полу-Ig. Противовоспалительная активность IgG полностью зависит от сиалирования N-связанного гликана Fc-фрагмента IgG. Определяют точную необходимость наличия гликана для противовоспалительной активности таким образом, что можно получать соответствующий Fc-фрагмент IgG1, таким образом, получая полностью рекомбинантный, сиалированный Fc IgG1 со значительно большей активностью (Anthony et al., Science, 320: 373-376 (2008)).

Как применяют в настоящем описании, термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "часть антитела") относится к одному или более фрагментам антитела, сохраняющим способность специфически связываться с антигеном (т.е. с конкретным эпитопом антигена, таким как эпитоп DLL4). Показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Такие варианты осуществления антитела также могут представлять собой биспецифичные форматы, форматы с двойной специфичностью или мультиспецифичные форматы, специфически связывающиеся с двумя или более различными антигенами (или двумя или более различными эпитопами одного антигена). Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989); публикация PCT № WO 90/05144 A1), содержащий один вариабельный домен; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируют разные гены, их можно соединять с использованием рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, позволяющего получать их в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH составляют пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин "антигенсвязывающая часть" антитела. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются в одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, слишком короткого, чтобы допускать образование пары между двумя доменами на одной цепи, таким образом, заставляя домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих участка (см., например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993); Poljak, R.J., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Такие антигенсвязывающие части известны в этой области (см., Kontermann и Dubel eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag. New York, 2001), p. 790 (ISBN 3-540-41354-5)). Кроме того, одноцепочечные антитела также включают "линейные антитела", содержащие пару тандемных Fv-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al. Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995); и патент США № 5641870).

Как применяют в настоящем описании, термин "конструкция антитела" (или "конструкция антитела против DLL4") относится к полипептиду, содержащему одну или более антигенсвязывающих частей по изобретению, связанных с линкерным полипептидом или константным доменом иммуноглобулина. Линкерные полипептиды содержат два или более аминокислотных остатка, соединенных пептидными связями, и их используют для соединения одной или более антигенсвязывающих частей. Такие линкерные полипептиды хорошо известны в этой области (см., например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993); Poljak, R.J., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Константный домен иммуноглобулина относится к константному домену тяжелой или легкой цепи. Аминокислотные последовательности константных доменов тяжелой цепи и легкой цепи IgG человека известны в этой области и представлены в таблице 2.

Таблица 2
Последовательность константного домена тяжелой цепи и константного домена легкой цепи IgG человека    

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающая часть может являться частью большей молекулы иммуноадгезии, образованной ковалентным или нековалентным соединением антитела или части антитела с одним или более белками или пептидами. Примеры использования таких молекул иммуноадгезии включают использование коровой области стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6: 93-101 (1995)) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и C-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov et al., Mol. Immunol., 31: 1047-1058 (1994)). Части антитела, такие как Fab- и F(ab')₂-фрагменты, можно получать из целых антител с использованием общепринятых способов, таких как расщепление папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Кроме того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии можно получать с использованием стандартных способов рекомбинантной ДНК, как приведено в настоящем описании, и известных в этой области.

Как применяют в настоящем описании, "выделенное антитело" предназначено для обозначения антитела, по существу, не содержащего другие антитела с различными антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, специфически связывающееся с hDLL4, по существу, не содержит антитела, специфически связывающиеся с антигенами, иными, чем hDLL4). Выделенное антитело, специфически связывающееся с hDLL4, однако, может обладать перекрестной реактивностью с другими антигенами, такими как молекулы DLL4 других видов (например, muDLL4). Кроме того, выделенное антитело может, по существу, не содержать другой клеточный материал и/или химические вещества.

Как применяют в настоящем описании, термин "моноклональное антитело" и аббревиатуры "MAb" и "mAb" относятся к антителу, получаемому из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, как правило, включающих различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое mAb направлено против одной детерминанты на антигене. Определение "моноклональное" не должно быть истолковано как требование к получению антитела любым конкретным способом.

Как применяют в настоящем описании, термин "антитело человека" предназначен для включения антитела с вариабельными и константными областями, полученными из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, встраиваемые случайным или сайт-специфичным мутагенезом in vitro или при соматической мутации in vivo), например, в CDR, и в частности, CDR3. Однако, как применяют в настоящем описании, термин "антитело человека" не предназначен для включения антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, пересаживают на каркасные последовательности человека.

Как применяют в настоящем описании, термин "рекомбинантное антитело человека" предназначен для включения всех антител человека, получаемых, экспрессируемых, созданных или выделенных рекомбинантными способами, таких как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицируемого в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека (Hoogenboom, Trends Biotechnol., 15:62-70 (1997); Azzazy и Highsmith, Clin. Biochem., 35: 425-445 (2002); Gavilondo и Larrick, BioTechniques, 29: 128-145 (2000); Hoogenboom и Chames, Immunol. Today, 21: 371-378 (2000)), антитела, выделенные из животного (например, мыши), являющегося трансгенным по генам иммуноглобулинов человека (см., Taylor et al., Nucl. Acids Res., 20: 6287-6295 (1992); Kellermann и Green, Curr. Opin. Biotechnol., 13: 593-597 (2002); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)), или антител, получаемых, экспрессируемых, созданных или выделенных любыми другими способами, включающими сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, получаемые из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют трансгенное для последовательностей Ig человека животное, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые хоть и происходят из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и относятся к ним, могут не существовать в природе в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

Термин "химерное антитело" относится к антителам, содержащим последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи из одного вида и последовательности константных областей из других видов, таким как антитела с вариабельными областями тяжелой и легкой цепи мыши, соединенными с константными областями человека.

Как применяют в настоящем описании, термин "CDR" относится к определяющей комплементарность области в последовательностях вариабельных областей антитела. В каждой вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи присутствует три CDR, обозначаемых как "CDR1", "CDR2" и "CDR3", для каждой из вариабельных областей. Как применяют в настоящем описании, термин "набор CDR" относится к группе трех CDR, присутствующих в одной вариабельной области, связывающей антиген. Точные границы этих CDR по-разному определяют по различным системам. Система, описанная Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) и (1991)), не только предоставляет четкую систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но также предоставляет предсказанные границы остатков, определяющие три CDR. Эти CDR можно обозначать как "CDR по Kabat ". Chothia с соавторами (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342: 877-883 (1989)) обнаруживали, что отдельные подчасти CDR по Kabat принимают почти идентичные конформации пептидного остова, несмотря на большие различия на уровне аминокислотной последовательности. Эти подчасти обозначали как "L1", "L2" и "L3" или "H1", "H2" и "H3", где "L" и "H" обозначают области легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно. Эти области можно обозначать как "CDR по Chothia", имеющие границы, перекрывающиеся с CDR по Kabat. Другие границы, определяющие перекрывание CDR с CDR по Kabat, описаны Padlan, FASEB J., 9: 133-139 (1995) и MacCallum, J. Mol. Biol, 262(5): 732-745 (1996). Тем не менее, другие определения границ CDR могут не следовать строго одной из систем, приведенных в настоящем описании, но при этом будут перекрываться с CDR по Kabat, хотя их можно укорачивать или удлинять в связи с прогнозированием или экспериментальными данными о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже целые CDR не влияют значительно на связывание антигена. В способах, используемых в настоящем описании, могут использовать CDR, определяемые по любой из этих систем, хотя в конкретных вариантах осуществления используют CDR, определяемые по Kabat или Chothia.

Термины "нумерация по Kabat," "определения по Kabat" и "маркировка по Kabat" в настоящем описании используют взаимозаменяемо. Эти термины, общепринятые в этой области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, более вариабельных (т.е. гипервариабельных), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190: 382-391 (1971) и Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Fifth Edition. U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). Для вариабельной области тяжелой цепи (VH) гипервариабельная область находится в диапазоне положений аминокислот с 31 по 35 для CDR1, положений аминокислот с 50 по 65 для CDR2 и положений аминокислот с 95 по 102 для CDR3. Для вариабельной области легкой цепи (VL) гипервариабельная область находится в диапазоне положений аминокислот с 24 по 34 для CDR1, положений аминокислот с 50 по 56 для CDR2 и положений аминокислот с 89 по 97 для CDR3.

За последние двадцать лет рост и анализ обширных общедоступных баз данных об аминокислотных последовательностях вариабельных областей тяжелой и легкой цепи привели к пониманию типичных границ между каркасными областями (FR) и последовательностями CDR в последовательностях вариабельных областей и позволил специалистам в этой области точно определять CDR в соответствии с нумерацией по Kabat, нумерацией по Chothia или другими системами. См., например, Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), глава 31, стр. 432-433. Применимый способ определения аминокислотных последовательностей CDR по Kabat и, таким образом, последовательностей FR по Kabat в аминокислотных последовательностях вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой (VL) цепи представлен ниже:

Для определения аминокислотной последовательности CDR-L1:

Начинается приблизительно через 24 аминокислотных остатка с амино-конца области VL;

Остаток перед последовательностью CDR-L1 всегда является цистеином (C);

Остаток после последовательности CDR-L1 всегда является триптофаном (W), как правило, Trp-Tyr-Gln (W-Y-Q), а также Trp-Leu-Gln (W-L-Q), Trp-Phe-Gln (W-F-Q) и Trp-Tyr-Leu (W-Y-L);

Длина, как правило, составляет от 10 до 17 аминокислотных остатков.

Для определения аминокислотной последовательности CDR-L2:

Всегда начинается через 16 остатков после конца CDR-L1;

Остатки перед последовательностью CDR-L2, как правило, являются Ile-Tyr (I-Y), а также Val-Tyr (V-Y), Ile-Lys (I-K) и Ile-Phe (I-F);

Длина всегда составляет 7 аминокислотных остатков.

Для определения аминокислотной последовательности CDR-L3:

Всегда начинается через 33 аминокислоты после конца CDR-L2;

Остаток перед аминокислотной последовательностью CDR-L3 всегда является цистеином (C);

Последующие остатки всегда являются Phe-Gly-X-Gly (F-G-X-G) (SEQ ID NO:7), где X является любой аминокислотой;

Длина, как правило, составляет от 7 до 11 аминокислотных остатков.

Для определения аминокислотной последовательности CDR-H1:

Начинается приблизительно через 31 аминокислотных остатков от амино-конца области VH и всегда через 9 остатков после цистеина (C);

Предшествующие остатки всегда являются Cys-X-X-X-X-X-X-X-X (SEQ ID NO:8), где X является любой аминокислотой;

Последующий остаток всегда является Trp (W), как правило, Trp-Val (W-V), а также Trp-Ile (W-I) и Trp-Ala (W-A);

Длина, как правило, составляет от 5 до 7 аминокислотных остатков.

Для определения аминокислотной последовательности CDR-H2:

Всегда начинается через 15 аминокислотных остатков после конца CDR-H1;

Предшествующие остатки, как правило, являются Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (L-E-W-I-G) (SEQ ID NO:9), а также другими вариантами;

Последующие остатки являются Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala (K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A);

Длина, как правило, составляет от 16 до 19 аминокислотных остатков.

Для определения аминокислотной последовательности CDR-H3:

Всегда начинается через 33 аминокислотных остатка после конца CDR-H2 и всегда через 3 после цистеина (C)

Предшествующие остатки всегда являются Cys-X-X (C-X-X), где X является любой аминокислотой, как правило, Cys-Ala-Arg (C-A-R);

Последующие остатки всегда являются Trp-Gly-X-Gly (W-G-X-G) (SEQ ID NO:10), где X является любой аминокислотой;

Длина, как правило, составляет от 3 до 25 аминокислотных остатков.

Термин "антитело с пересаженными CDR" относится к антителам, содержащим последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи одного вида, но в которых последовательности одной или более областей CDR VH и/или VL заменяют последовательностями CDR другого вида, например, антитела с вариабельными областями тяжелой и легкой цепи мыши, в которых одну или более CDR мыши (например, CDR3) заменяют последовательностями CDR человека.

Термин "гуманизированное антитело" относится к антителам, содержащим последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи из не являющихся человеком видов (например, мыши), но в которых по меньшей мере часть последовательности VH и/или VL изменяют так, чтобы она была более "человекоподобной", т.е. более схожей с последовательностями вариабельных областей зародышевой линии человека. "Гуманизированное антитело" является антителом или вариантом, производным, аналогом или его фрагментом, специфически связывающимся с интересующим антигеном и содержащим каркасную (FR) область с аминокислотной последовательностью, по существу, антитела человека и определяющей комплементарность областью (CDR) с аминокислотной последовательностью, по существу, не принадлежащего человеку антитела. Как применяют в настоящем описании, термин "по существу" в отношении CDR относится к CDR с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной аминокислотной последовательности CDR не принадлежащего человеку антитела. Гуманизированное антитело содержит, по существу, все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов (Fab, Fab', F(ab')₂, FabC, Fv), в которых все или, по существу, все области CDR соответствуют таковым в не принадлежащем человеку иммуноглобулине (т.е. донорном антителе), и все или, по существу, все каркасные области являются таковыми из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. В варианте осуществления гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит обе легких цепи, а также по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может включать область CH1, шарнирную область, области CH2, CH3 и CH4 тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную тяжелую цепь. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и/или гуманизированную тяжелую цепь.

Гуманизированное антитело можно выбирать из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая, в качестве неограничивающих примеров, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Гуманизированное антитело может содержать последовательности из нескольких классов или изотипов, и можно выбирать конкретные константные домены для оптимизации желаемых эффекторных функций с использованием хорошо известных в этой области способов.

Каркасные области и CDR гуманизированного антитела не должны точно соответствовать родительским последовательностям, например, CDR донорного антитела или консенсусную каркасную последовательность можно подвергать мутагенезу посредством замены, инсерции и/или делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка таким образом, что CDR или каркасный остаток в этом участке не соответствует донорному антителу или консенсусной каркасной последовательности. Однако в предпочтительном варианте осуществления такие мутации не будут протяженными. Как правило, по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 90% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% остатков гуманизированного антитела будут соответствовать таковым в родительских последовательностях FR и CDR. Как применяют в настоящем описании, термин "консенсусная каркасная последовательность" относится к каркасной области в консенсусной последовательности иммуноглобулина. Как применяют в настоящем описании, термин "консенсусная последовательность иммуноглобулина" относится к последовательности, образуемой наиболее часто встречающимися аминокислотами (или нуклеотидами) в семействе родственных последовательностей иммуноглобулинов (см., например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). Таким образом "консенсусная последовательность иммуноглобулина" может содержать "консенсусные каркасные области" и/или "консенсусные CDR". В семействе иммуноглобулинов каждое положение в консенсусной последовательности занято аминокислотой, наиболее часто встречающейся в этом положении в семействе. Если две аминокислоты встречаются одинаково часто, то в консенсусную последовательность можно включать любую.

"Аффинно-зрелое" антитело является антителом с одним или более изменениями в одной или более его CDR, что приводит к улучшению аффинности антитела к целевому антигену по сравнению с родительским антителом, не имеющим изменений. Примеры аффинно-зрелых антител будут иметь наномолярные или даже пикомолярные аффинности для целевого антигена. В этой области известно множество способов получения аффинно-зрелых антител. Например, в Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992) описывают созревание аффинности посредством перетасовывания доменов VH и VL. Случайный мутагенез CDR и/или каркасных остатков описывают в Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992). Избирательные мутации в избирательных положениях для мутагенеза и в контактных положениях или положениях гипермутаций с усиливающим активность аминокислотным остатком описывают в патенте США № 6914128 B1.

Термин "мультивалентный связывающий белок" означает связывающий белок, содержащий два или более антигенсвязывающих участка (также обозначают в настоящем описании как "антигенсвязывающие домены"). Мультивалентный связывающий белок предпочтительно конструируют таким образом, что он имеет три или более антигенсвязывающих участка и, как правило, не является природным антителом. Термин "мультиспецифичный связывающий белок" относится к связывающему белку, способному связываться с двумя или более родственными или неродственными мишенями, включая связывающий белок, способный связываться с двумя или более различными эпитопами одной и той же целевой молекулы.

Как применяют в настоящем описании, термин "биспецифическое антитело" относится к полноразмерным антителам, получаемым квадромной технологией (см. Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)), химической конъюгацией двух различных моноклональных антител (см. Staerz et al., Nature, 314(6012): 628-631 (1985)), или посредством способа "выступ-во-впадину" или схожих подходов, при которых в Fc-область встраивают мутации (см. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993)), приводя к получению множества различных молекул иммуноглобулинов, из которых только одна является функциональным биспецифическим антителом. В соответствие со своей молекулярной функцией биспецифическое антитело связывает один антиген (или эпитоп) на одном из двух своих связывающих плеч (одна пара HC/LC) и связывает другой антиген (или эпитоп) на втором своем плече (другая пара HC/LC). По этому определению биспецифическое антитело имеет два отдельных антигенсвязывающих плеча (у обоих специфичность и последовательности CDR) и является моновалентным для каждого антигена, с которым оно связывается.

Как применяют в настоящем описании, термин "антитело с двойной специфичностью" относится к полноразмерным антителам, которые могут связывать два различных антигена (или эпитопа) в каждом из двух своих связывающих плеч (пара HC/LC) (см. публикацию PCT № WO02/02773). Таким образом, связывающий белок с двойной специфичностью имеет два идентичных антигенсвязывающих плеча с идентичной специфичностью и идентичными последовательностями CDR, и является бивалентным для каждого антигена, с которым оно связывается.

Связывающие белки с "двойным вариабельным доменом" ("DVD") по изобретению содержат два или более антигенсвязывающих участка и могут являться бивалентными (два антигенсвязывающих участка), тетравалентными (четыре антигенсвязывающих участка) или мультивалентными связывающими белками. DVD могут являться моноспецифичными, т.е. способными связывать один антиген (или один специфический эпитоп), или мультиспецифичными, т.е. способными связывать два или более антигена (т.е. два или более эпитопа одной целевой молекулы антигена или два или более эпитопа различных целевых антигенов). Предпочтительный связывающий белок с DVD, содержащий два полипептида тяжелой цепи с DVD и два полипептида легкой цепи с DVD, обозначают как "иммуноглобулин с DVD" или "DVD-Ig". Таким образом, такой связывающий белок DVD-Ig является тетрамерным и напоминает молекулу IgG, но обеспечивает больше антигенсвязывающих участков, чем молекула IgG. Таким образом, каждая половина тетрамерной молекулы DVD-Ig напоминает одну половину молекулы IgG и содержит полипептид тяжелой цепи с DVD и полипептид легкой цепи с DVD, но в отличие от пары тяжелой и легкой цепей молекулы IgG, обеспечивающей один антигенсвязывающий домен, пара тяжелой и легкой цепей DVD-Ig обеспечивает два или более антигенсвязывающих участка.

Каждый антигенсвязывающий участок связывающего белка DVD-Ig получают от донорного ("родительского") моноклонального антитела и, таким образом, оно содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) всего с шестью CDR, участвующими в связывании антигена, на антигенсвязывающий участок. Таким образом, связывающий белок DVD-Ig, связывающий два различных эпитопа (т.е. два различных эпитопа двух различных молекул антигена или двух различных эпитопов одной и той же молекулы антигена), содержит антигенсвязывающий участок, получаемый из первого родительского моноклонального антитела, и антигенсвязывающий участок второго родительского моноклонального антитела.

Описание конструирования, экспрессии и характеристики связывающих молекул с DVD-Ig представлены в публикации PCT № WO 2007/024715, патенте США № 7612181 и Wu et al., Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007). Предпочтительный пример такой молекулы DVD-Ig содержит тяжелую цепь, содержащую структурную формулу VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 является первым вариабельным доменом тяжелой цепи, VD2 является вторым вариабельным доменом тяжелой цепи, C является константным доменом тяжелой цепи, X1 является линкером с условием, что он не является CH1, X2 представляет собой Fc-область, и n является 0 или 1, но предпочтительно 1; и легкую цепь, содержащую структурную формулу VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 является первым вариабельным доменом легкой цепи, VD2 является вторым вариабельным доменом легкой цепи, C является константным доменом легкой цепи, X1 является линкером с условием, что он не является CH1, и X2 не содержат Fc-область; и n является 0 или 1, но предпочтительно 1. Такой DVD-Ig может содержать две таких тяжелых цепи и две таких легких цепи, где каждая цепь содержит вариабельные домены, соединенные в тандем без промежуточной константной области между вариабельными областями, где тяжелая цепь и легкая цепь связаны для образования тандемных функциональных антигенсвязывающих участков, и пару тяжелых и легких цепей можно соединять с другой парой тяжелых и легких цепей для образования тетрамерного связывающего белка с четырьмя функциональными антигенсвязывающими участками. В другом примере, молекула DVD-Ig может содержать тяжелые и легкие цепи, каждая из которых содержит три вариабельных домена (VD1, VD2, VD3), соединенных в тандем без промежуточной константной области между вариабельными доменами, где пару тяжелых и легких цепей можно соединять для образования трех антигенсвязывающих участков, и где пару тяжелых и легких цепей можно соединять с другой парой тяжелых и легких цепей для образования тетрамерного связывающего белка с шестью антигенсвязывающими участками.

В предпочтительном варианте осуществления связывающий белок DVD-Ig по изобретению не только связывает те же молекулы-мишени, связываемые их родительскими моноклональными антителами, но также обладает одним или более желаемыми свойствами одного или более из их родительских моноклональных антител. Предпочтительно, такое дополнительное свойство является параметром антитела одного или более родительских моноклональных антител. Параметры антитела, которые могут передаваться связывающему белку DVD-Ig от одного или более из их родительских моноклональных антител, включают, в качестве неограничивающих примеров, антигенспецифичность, аффинность к антигену, активность, биологическую функцию, распознавание эпитопа, стабильность белка, растворимость белка, эффективность продукции, иммуногенность, фармакокинетику, биодоступность, тканевую перекрестную реактивность и связывание ортологичных антигенов.

Связывающий белок DVD-Ig по изобретению связывается по меньшей мере с одним эпитопом белка DLL4 человека. Неограничивающие примеры связывающего белка DVD-Ig по изобретению включают связывающий белок DVD-Ig, связывающий один или более эпитопов DLL4 человека, связывающий белок DVD-Ig, связывающий эпитоп DLL4 человека и эпитоп DLL4 других видов (например, мыши), и связывающий белок DVD-Ig, связывающий эпитоп DLL4 человека и эпитоп другой молекулы-мишени (например, VEGFR2 или VEGFR1).

"Функциональный антигенсвязывающий участок" связывающего белка представляет собой участок, способный связывать антиген-мишень. Аффинность связывания антигена антигенсвязывающим участком необязательно является столь же сильной, как у родительского антитела, из которого получают антигенсвязывающий участок, но способность связывать антиген должна являться измеряемой с использованием любого из множества известных способов оценки связывания антитела с антигеном. Кроме того, аффинность связывания антигена каждым из антигенсвязывающих участков поливалентного антитела в настоящем описании не должна являться количественно той же.

Как применяют в настоящем описании, термины "акцептор" и "акцепторное антитело" относится к антителу или последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей или кодирующей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% аминокислотных последовательностей одной или более каркасных областей (FR). В некоторых вариантах осуществления термин "акцептор" относится к аминокислотной последовательности антитела или последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей или кодирующей константные области. В еще одном варианте осуществления термин "акцептор" относится к аминокислотной последовательности антитела или последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей или кодирующей одну или более каркасных областей и константных областей. В конкретном варианте осуществления термин "акцептор" относится к аминокислотной последовательности антитела человека или последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей или кодирующей по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% аминокислотных последовательностей одной или более каркасных областей. По этому варианту осуществления акцептор может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, не находящихся в одном или более специфических положениях антитела человека. Например, акцепторную каркасную область и/или акцепторные константные области можно получать из гена антитела зародышевой линии, гена зрелого антитела, функционального антитела (например, антител, хорошо известных в этой области, антител, находящихся в стадии разработки, или коммерчески доступных антител).

Как применяют в настоящем описании, термин "канонический" остаток относится к остатку CDR или каркасу, определяющему конкретную каноническую структуру CDR, как определено по Chothia et al. (J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol, 227: 799-817 (1992), включенных в настоящий документ в качестве ссылки). По Chothia et al., критические части CDR многих антител обладают приблизительно идентичными конформациями пептидного остова, несмотря на большое разнообразие на уровне аминокислотной последовательности. Каждая каноническая структура, главным образом, определяет набор торсионных углов пептидного остова для смежного сегмента аминокислотных остатков, образующих петлю.

Как применяют в настоящем описании, термины "донор" и "донорное антитело" относится к антителу, предоставляющему одну или более CDR. В предпочтительном варианте осуществления донорное антитело является антителом от видов, отличающихся от антитела, из которого получают каркасные области. В отношении гуманизированного антитела термин "донорное антитело" относится к не принадлежащему человеку антителу, предоставляющему одну или более CDR.

Как применяют в настоящем описании, термин "каркас" или "каркасная последовательность" относится к остальным последовательностям вариабельной области за исключением CDR. По причине того, что точное определение последовательности CDR можно осуществлять различными системами (например, см. выше), определение каркасной последовательности является предметом соответственно отличающихся интерпретаций. Шесть CDR (CDR-L1, -L2 и -L3 легкой цепи и CDR-H1, -H2 и -H3 тяжелой цепи) также разделяют каркасные области легкой цепи и тяжелой цепи на четыре подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) на каждой цепи, в которых CDR1 расположена между FR1 и FR2, CDR2 - между FR2 и FR3, и CDR3 - между FR3 и FR4. Без точного определения конкретных подобластей как FR1, FR2, FR3 или FR4, каркасная область, как сообщают другие, представляет собой комбинированные FR в вариабельной области одной природной цепи иммуноглобулина. Как применяют в настоящем описании, FR представляет собой одну из четырех подобластей, и области FR представляют две или более из четырех подобластей, составляющих каркасную область.

В этой области известны каркасные последовательности (FR) тяжелой цепи и легкой цепи человека, которые можно использовать в качестве "акцепторных" каркасных последовательностей (или просто, "акцепторных" последовательностей) тяжелой цепи и легкой цепи для гуманизации не принадлежащего человеку антитела с применением известных в этой области способов. В варианте осуществления изобретения акцепторные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи человека выбраны из каркасных последовательностей, указанных в общедоступных базах данных, таких как V-base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) или международной информационной системе ImMunoGeneTics® (IMGT®) (http://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/). В таблице 3 ниже представлен неограничивающий список примеров акцепторных последовательностей тяжелой цепи человека, известных в этой области. В таблице 4 ниже представлен неограничивающий список примеров акцепторных последовательностей легкой цепи человека, известных в этой области. В варианте осуществления изобретения, акцепторные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи человека выбраны из аминокислотных последовательностей, описываемых в таблице 3 и таблице 4 ниже, однако, для гуманизации антитела по изобретению также можно использовать другие акцепторные последовательности тяжелой и легкой цепи человека, не приведенные в таблицах 3 и 4.

Таблица 3
Акцепторные последовательности тяжелой цепи.    

 

Таблица 4
Акцепторные последовательности легкой цепи    

   

В варианте осуществления акцепторные каркасные последовательности тяжелой цепи человека из таблицы 3 для применения в получении гуманизированных антител по изобретению, связывающих DLL4, включают набор, состоящий из акцепторных последовательностей VH3-7 FR1, VH3-7 FR2, VH3-7 FR3 и JH4 FR4; набор, состоящий из акцепторных консенсусных последовательностей FR1 VH3, FR2 VH3, FR3 VH3 и акцепторной последовательности FR4 JH4; набор, состоящий из акцепторных последовательностей VH1-46 FR1, VH1-46 FR2, VH1-46 FR3 и JH4 FR4; набор, состоящий из акцепторных последовательностей VH3-30 FR1, VH3-30 FR2, VH3-30 FR3 и JH3 FR4; и набор, состоящий из акцепторных консенсусных последовательностей FR1 VH3, FR2 VH3, FR3 VH3 и акцепторной последовательности JH3 FR4.

В варианте осуществления акцепторные каркасные последовательности легкой цепи человека из таблицы 4 для применения в получении гуманизированных антител по изобретению, связывающих DLL4, включают набор, состоящий из акцепторных последовательностей O2 FR1, O2 FR2, O2 FR3 и JK2 FR4, и набор, состоящий из акцепторных последовательностей L2 FR1, L2 FR2, L2 FR3 и JK2 FR4.

В варианте осуществления набор акцепторных каркасных последовательностей человека для применения в получении гуманизированного антитела по изобретению, связывающего DLL4, содержит одну или более (например, любые одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь на связывающий домен) акцепторных каркасных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из:

Каркаса тяжелой цепи-1 (H-FR1):

E-V-Q-L-V-E-S-G-G-G-L-V-Q-P-G-G-S-L-R-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-X₃₀ (SEQ ID NO:143), где X₃₀ является S, R или G;

Каркаса тяжелой цепи-2 (H-FR2): W-V-R-Q-A-P-G-K-G-L-E-W-V-A (SEQ ID NO:144);

Каркаса тяжелой цепи-3 (H-FR3):

R-F-T-I-S-R-D-N-A-K-X₁₁-S-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C-X₃₁-R (SEQ ID NO:145), где

X₁₁ является Ν или S; и

X₃₁ является A или S;

Каркаса тяжелой цепи-4 (H-FR4): W-G-Q-G-T-L-V-T-V-S-S (SEQ ID NO:146);

Каркаса легкой цепи-1 (L-FR1):

D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-T-C (SEQ ID NO:147);

Каркаса легкой цепи-2 (L-FR2): W-Y-Q-Q-K-P-G-K-X₉-P-K-L-L-I-X₁₅ (SEQ ID NO:148), где

X₉ является A или S; и

X₁₅ является F или Y;

Каркаса легкой цепи-3 (L-FR3):

G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-X₁₅-T-L-T-I-S-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C (SEQ ID NO:149), где

X₁₅ является F или S; и

Каркаса легкой цепи-4 (L-FR4): F-G-Q-G-T-K-L-E-I-K (SEQ ID NO:150).

В предпочтительном варианте осуществления антитело по изобретению, связывающее DLL4, гуманизируют с использованием набора акцепторных последовательностей человека, состоящего из описываемых выше акцепторных последовательностей H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR-4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4.

Как применяют в настоящем описании, термин "ген антитела зародышевой линии" или "фрагмент гена" относится к последовательности иммуноглобулина, кодируемой в нелимфоидных клетках, не подвергавшихся процессу созревания, приводящему в генетической реаранжировке и мутации для экспрессии конкретного иммуноглобулина. (См., например, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol., 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv. Exp. Med. Biol, 484:13-30 (2001)). Одно из преимуществ, представляемых различными вариантами осуществления настоящего изобретения, связано с тем, что гены антител зародышевой линии в большей степени, чем гены зрелых антител, сохраняют неотъемлемые характеристики структур аминокислотной последовательности у индивидуумов различных видов, таким образом, менее вероятно, что их будут распознавать как чужеродные при терапевтическом использовании для этих видов.

Как применяют в настоящем описании, термин "ключевой остаток" относится к конкретным остаткам в вариабельной области, оказывающим больше влияния на специфичность связывания и/или аффинность антитела, в частности, гуманизированного антитела. Ключевой остаток включает, в качестве неограничивающих примеров, один или более из следующих: остаток, смежный с CDR, потенциальный участок гликозилирования (может являться N- или O-участком гликозилирования), редкий остаток, остаток, способный взаимодействовать с антигеном, остаток, способный взаимодействовать с CDR, канонический остаток, контактный остаток между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи, остаток в зоне Вернье и остаток в области, перекрывающейся между определением CDR1 вариабельной области тяжелой цепи по Chothia и определением первой каркасной области тяжелой цепи по Kabat.

Как применяют в настоящем описании, "зона Вернье" относится к поднабору каркасных остатков, которые могут регулировать структуру CDR и тонко настраивать соответствие антигену, как описывают Foote и Winter (J. Mol. Biol, 224: 487-499 (1992)). Остатки зоны Вернье образуют слой, лежащий под CDR, и могут влиять на структуру CDR и аффинность антитела.

Как применяют в настоящем описании, термин "нейтрализация" относится к противодействию биологической активности антигена, когда связывающий белок специфически связывает антиген. В варианте осуществления нейтрализующий связывающий белок связывает антиген и снижает его биологическую активность по меньшей мере приблизительно на 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95% или более.

Термин "активность" включает активности, такие как специфичность связывания/аффинность антитела к антигену, например, антитела против hDLL4, связывающегося с антигеном DLL4, и/или нейтрализующего активность антитела, или антитела против hDLL4, связывание которого с hDLL4 ингибирует биологическую активность hDLL4, например, ингибирование пролиферации бластных клеток под воздействием ФГА или ингибирование связывания рецептора в анализе связывания рецептора Notch человека или анализе индукции интерферона-гамма в ФГА-активированных бластных клетках.

Термин "эпитоп" включает любую полипептидную детерминанту, специфически связывающуюся с иммуноглобулином или T-клеточным рецептором. В определенных вариантах осуществления эпитоп включает химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления они могут иметь конкретные трехмерные структурные характеристики и/или конкретные характеристики заряда. Эпитоп является областью антигена, связываемой антителом. Таким образом, эпитоп состоит из аминокислотных остатков области антигена (или его фрагмента), о котором известно, что он связывается с комплементарным участком на специфическом партнере по связыванию. Антиген или антигенный фрагмент могут содержать несколько эпитопов. Таким образом, специалисту в этой области следует понимать, что каждый "антигенсвязывающий участок" молекулы антитела связывает эпитоп молекулы антигена, и каждая молекула антигена может иметь один, два, несколько или много эпитопов. Кроме того, специалисту в этой области следует понимать, что два независимо выделенных антитела к молекуле антигена могут связываться с одним и тем же эпитопом или с двумя различными эпитопами на молекуле антигена.

В определенных вариантах осуществления указано, что антитело специфически связывает антиген, когда оно специфически распознает свой антиген-мишень в комплексной смеси белков и/или макромолекул. Указано, что антитела "связываются с одним и тем же эпитопом", если антитела перекрестно конкурируют (одно из них предотвращает связывание или модулирование эффекта другого). Кроме того, структурные определения эпитопов (перекрывающихся, схожих, идентичных) являются информативными, но функциональные определения часто являются более значимыми, поскольку они охватывают структурные (связывание) и функциональные (модуляцию, конкуренцию) параметры.

Как применяют в настоящем описании, термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, позволяющему осуществлять анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени посредством определения изменения концентраций белка в матрице биосенсора, например, с использованием системы BIAcore® (BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden и Piscataway, New Jersey, US). Для дополнительного описания см. Jönsson et al., Ann. Biol. Clin., 51: 19-26 (1993); Jönsson et al. BioTechniques, 11: 620-627 (1991); Johnsson et al., J. Mol. Recognit., 8: 125-131 (1995); и Johnsson et al., Anal. Biochem., 198: 268-277 (1991).

Как применяют в настоящем описании термин "K_on" предназначен для обозначения константы скорости прямой реакции ассоциации связывающего белка (например, антитела) с родственным партнером (например, антигеном) для образования комплекса партнер по связыванию/родственный партнер (например, антитело/антиген), как известно в этой области. "K_on" также известна по терминам "константа скорости ассоциации" или "k_a", как взаимозаменяемо используют в настоящем описании. Это определение, свидетельствующее о скорости связывания антитела с его антигеном-мишенью или скорости образования комплекса между антителом и антигеном, также показано уравнением:

Антитело ("Ab") + Антиген ("Ag") → Ab-Ag.

Как применяют в настоящем описании, термин "K_off" предназначен для обозначения константы скорости обратной реакции диссоциации связывающего белка (например, антитела) из, например, комплекса антитело/антиген, как известно в этой области. "K_off" также известна по терминам "константа скорости диссоциации" или "k_d", как взаимозаменяемо используют в настоящем описании. Это определение свидетельствует о скорости диссоциации антитела от его антигена-мишени или разделения комплекса Ab-Ag с течением времени на свободное антитело и антиген, как показано уравнением ниже:

Ab + Ag ← Ab-Ag.

Термины "равновесная константа диссоциации" или "Κ_D", как взаимозаменяемо используют в настоящем описании, относится к значению, получаемому при измерении титрованием при равновесии или посредством разделения константы скорости диссоциации (K_off) на константу скорости ассоциации (K_on). Константу скорости ассоциации, константу скорости диссоциации и равновесную константу диссоциации используют для представления аффинности связывания антитела с антигеном. Способы определения констант скорости ассоциации и диссоциации хорошо известны в этой области. Использование способов на основе флуоресценции обеспечивает высокую чувствительность и способность исследовать образцы в физиологических буферах при равновесии. Можно использовать другие экспериментальные походы и устройства, такие как анализ BIAcore® на основе поверхностного плазмонного резонанса (анализ бимолекулярного взаимодействия) (например, устройство, доступное в BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden). Дополнительно, также можно использовать анализ KinExA® (анализ кинетического исключения), доступный в Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).

"Метка" и "детектируемая метка" означает остаток, прикрепляемый к специфическому партнеру по связыванию, такому как антитело или аналит, связываемый антителом, например, для визуализации реакции между участниками определяемой специфической связывающейся пары, такой как антитело и аналит. Меченного таким образом специфического партнера по связыванию, например, антитело или аналит, обозначают как "детектируемо меченый". Таким образом, как применяют в настоящем описании, термин "меченый связывающий белок" относится к белку со встроенной меткой, обеспечивающей определение связывающего белка. В варианте осуществления метка является детектируемым маркером, который может давать сигнал, детектируемый визуальными или инструментальными средствами, например, встраивание радиоактивно меченой аминокислоты или присоединение к полипептиду остатков биотина, которые можно определять посредством меченого авидина (например, авидина или стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или маркер с ферментативной активностью, которую можно определять оптическими или колориметрическими способами). Примеры меток для полипептидов включают, в качестве неограничивающих примеров, следующие: радиоактивные изотопы или радионуклиды (например, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho и ¹⁵³Sm); хромогены, флуоресцентные метки (например, FITC, родамин и люминофоры на основе лантаноидов), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, люциферазу, щелочную фосфатазу); хемилюминесцентные маркеры; биотиновые группы; заранее определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, пара последовательностей лейциновой молнии, участки связывания для вторичных антител, металлсвязывающие домены и эпитопные метки); и магнитные средства, такие как хелатные комплексы гадолиния. Типичные примеры меток, общепринято используемых для иммунологических анализов, включают вещества, испускающие свет, например, соединения акридиния, и вещества, испускающие флуоресценцию, например, флуоресцеин. Другие метки известны в этой области или приведены в настоящем описании. В связи с этим вещество само по себе может не являться детектируемо меченым, но может становиться детектируемым после реакции с другим веществом. Использование фразы "детектируемо меченый" предназначено для включения последнего типа детектируемой метки.

Термин "конъюгат антитела" относится к связывающему белку, такому как антитело, химически связанному со вторым химическим веществом, таким как терапевтическое или цитотоксическое средство. Термин "средство" используют в настоящем описании для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, получаемого из биологических материалов. Предпочтительно, терапевтические или цитотоксические средства включают, в качестве неограничивающих примеров, коклюшный токсин, таксол, цитохалазин B, грамицидин D, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацендион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи.

Как применяют в настоящем описании, термины "кристалл" и "кристаллизованный" относятся к связывающему белку (например, антителу) или его антигенсвязывающей части, существующим в форме кристалла. Кристаллы являются одной из форм твердого состояния материи, отличающейся от других форм, таких как аморфное твердое состояние или жидкокристаллическое состояние. Кристаллы состоят из регулярных, повторяющихся, трехмерных решеток атомов, ионов, молекул (например, белков, таких как антитела) или молекулярных агрегатов (например, комплексов антиген/антитело, включая комплексы Fab/антиген). Эти трехмерные решетки расположены в соответствии с конкретными математическими отношениями, хорошо известными в этой области. Основную единицу или структурный элемент, повторяющийся в кристалле, называют ассиметричной единицей. Повторение ассиметричной единицы в схеме расположения, соответствующей конкретной, четкой кристаллографической симметрии, обеспечивает "элементарную ячейку" кристалла. Повторение элементарной ячейки посредством регулярных трансляций во всех трех измерениях дает кристалл. См., Giegé et al., In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ed., (Ducruix and Giegé, eds.) (Oxford University Press, New York, 1999), глава 1, стр. 1-16.

Термин "полинуклеотид" означает полимерную форму двух или более нуклеотидов, рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов, или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает одно- и двуцепочечные формы ДНК.

Термин "выделенный полинуклеотид" должен означать полинуклеотид (например, геномного, кДНК- или синтетического происхождения, или некоторого их сочетания) таким образом, что в связи со своим происхождением "выделенный полинуклеотид" не связан со всем полинуклеотидом или его частью, с которым "выделенный полинуклеотид" обнаруживают в природе; функционально связан с полинуклеотидом, с которым не связан в природе; или не существует в природе как часть большей последовательности.

Термин "вектор" предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является "плазмида", что означает замкнутую кольцевую двухцепочечную ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Конкретные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их встраивают (например, бактериальные векторы с бактериальным участком начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, не-эписомные векторы млекопитающих) можно встраивать в геном клетки-хозяина после встраивания в клетку-хозяина, и, таким образом, они реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, конкретные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначают в настоящем описании как "рекомбинантные экспрессирующие векторы" (или просто "экспрессирующие векторы"). В основном, экспрессирующие векторы, пригодные в способах рекомбинантной ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, т.к. плазмида является наиболее общеупотребительной формой вектора. Однако изобретение предназначено для включения таких других форм экспрессирующих векторов, таких как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), выполняющих аналогичные функции. Также в изобретении можно использовать РНК-версии векторов (включая РНК-вирусные векторы).

Термин "функционально связанный" относится к непосредственному соседству, где описываемые компоненты находятся в отношениях, позволяющих им функционировать определенным образом. Контролирующую последовательность, "функционально связанную" с кодирующей последовательностью, лигируют так, что достигают экспрессии кодирующей последовательности в условиях, совместимых с контрольными последовательностями. "Функционально связанные" последовательности включают контролирующие экспрессию последовательности, смежные с интересующим геном, контролирующие экспрессию последовательности, действующие in trans, т.е. находящиеся в иной молекуле нуклеиновой кислоты, чем интересующий ген, а также контролирующие экспрессию последовательности, находящиеся на той же молекуле нуклеиновой кислоты, что и интересующий ген, но на расстоянии от него. Как применяют в настоящем описании, термин "контролирующая экспрессию последовательность" относится к полинуклеотидным последовательностям, необходимым для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми их лигируют. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие инициирующие транскрипцию последовательности, терминатор, промотор и энхансерные последовательности; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, усиливающие эффективность трансляции (т.е. консенсусную последовательность Козак); последовательности, усиливающие стабильность белка; и, при желании, последовательности, усиливающие секрецию белка. Природа таких контролирующих последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина; у прокариот такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, участок связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие контролирующие последовательности включают промотор и последовательность терминации транскрипции. Термин "контролирующие последовательности" предназначен для включения компонентов, наличие которых необходимо для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, наличие которых является предпочтительным, например, лидерные последовательности и последовательности партнера по слиянию.

Термин "трансформация" относится к любому способу, которым экзогенная нуклеиновая кислота (например, молекула ДНК) попадает в клетку-хозяина. Трансформация может происходить в природных или искусственных условиях с использованием различных способов, хорошо известных в этой области. Трансформация может основываться на любом известном способе встраивания чужеродных последовательностей нуклеиновой кислоты в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина. Способ выбирают с учетом подвергаемой трансформации клетки-хозяина, и он может включать, в качестве неограничивающих примеров, поглощение плазмиды через мембрану клетки, вирусную инфекцию, электропорацию, липофекцию и бомбардировку частицами. Такие "трансформированные" клетки включают стабильно трансформированные клетки, в которых встроенная ДНК способна реплицироваться как автономно реплицирующаяся плазмида или как часть хромосомы хозяина. Они также включают клетки, транзиентно экспрессирующие встроенную ДНК или РНК в течение ограниченных периодов времени.

Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") предназначен для обозначения клетки, в которую встраивают экзогенную ДНК. В варианте осуществления клетка-хозяин содержит две или более (например, множественные) нуклеиновых кислоты, кодирующие антитела, например, в качестве неограничивающего примера, клетки-хозяева, описываемые в патенте США № 7262028. Такие термины должны относиться не только к конкретной подвергаемой воздействию клетке, но также и к потомству такой клетки. Т.к. в последующих поколениях могут происходить конкретные модификации по причине мутации или воздействия окружающей среды, такое потомство может фактически не являться идентичным родительской клетке, но все равно включенным в объем используемого в настоящем описании термина "клетка-хозяин". В варианте осуществления, клетки-хозяева включают прокариотические и эукариотические клетки, выбранные из любого царства. В другом варианте осуществления эукариотические клетки включают клетки простейших, грибов, растений и животных. В другом варианте осуществления клетки-хозяева включают, в качестве неограничивающих примеров, прокариотические виды, такие как Escherichia coli; линии клеток млекопитающих, такие как CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2 и PER.C6; линию клеток насекомых Sf9; и клетки грибов, такие как Saccharomyces cerevisiae.

Можно использовать стандартные способы рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов и культивирования тканей и трансформации (например, электропорации, липофекции). Ферментативные реакции и способы очистки можно осуществлять по руководству производителя, или как общепринято используют в этой области, или как приведено в настоящем описании. Следующие способы, как правило, можно осуществлять в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в этой области, и как описано в различных общих и более специальных источниках, цитируемых и обсуждаемых на всем протяжении настоящего описания. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).

Как известно в этой области, термин "трансгенный организм" относится к организму, имеющему клетки, содержащие трансген, где трансген, встроенный в организм (или предка организма), экспрессирует полипептид, в природе не экспрессирующийся в организме. "Трансген" является конструкцией ДНК, являющейся стабильной и функционально встроенной в геном клетки, из которой получают трансгенный организм, управляя экспрессией кодируемого продукта гена в одном или более типах клеток или тканей трансгенного организма.

Как применяют в настоящем описании, термины "регулировать" и "модулировать" используют взаимозаменяемо, и они относятся к изменению активности интересующей молекулы (например, биологической активности hDLL4). Модуляция может являться повышением или снижением величины конкретной активности или функции интересующей молекулы. Примеры активностей и функций молекулы включают, в качестве неограничивающих примеров, характеристики связывания, ферментативную активность, активацию клеточных рецепторов и передачу сигнала.

Соответственно, как применяют в настоящем описании, термин "модулятор" означает соединение, способное изменять активность или функцию интересующей молекулы (например, биологическую активность hDLL4). Например, модулятор может вызывать повышение или снижение величины конкретной активности или функции молекулы по сравнению с величиной активности или функции, наблюдаемой в отсутствие модулятора. В определенных вариантах осуществления модулятор является ингибитором, снижающим величину по меньшей мере одной активности или функции молекулы. Примеры ингибиторов включают, в качестве неограничивающих примеров, белки, пептиды, антитела, пептидные антитела, углеводы или небольшие органические молекулы. Описывают пептидные антитела. См., например, публикацию PCT № WO01/83525.

Как применяют в настоящем описании, термин "агонист" относится к модулятору, который при контакте с интересующей молекулой вызывает повышение величины конкретной активности или функции молекулы по сравнению с величиной активности или функции, наблюдаемой в отсутствие агониста. Конкретные интересующие агонисты могут включать, в качестве неограничивающих примеров, участников пути передачи сигнала Notch, полипептиды и нуклеиновые кислоты DLL4, углеводы или любые другие молекулы, связывающиеся с DLL4.

Как применяют в настоящем описании, термин "антагонист" или "ингибитор" относится к модулятору, который при контакте с интересующей молекулой вызывает снижение величины конкретной активности или функции молекулы по сравнению с величиной активности или функции, наблюдаемой в отсутствие антагониста. Конкретные интересующие антагонисты включают те, которые блокируют или модулируют биологическую или иммунологическую активность DLL4, особенно DLL4 человека (hDLL4). Антагонисты и ингибиторы hDLL4 могут включать, в качестве неограничивающих примеров, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы или любую другую молекулу, связывающуюся с hDLL4 и/или DLL4 грызуна.

Как применяют в настоящем описании, термин "эффективное количество" относится к количеству терапевтического средства, достаточному для снижения или улучшения тяжести и/или длительности нарушения или одного или более его симптомов; ингибирования или профилактики прогрессирования нарушения; вызывания регрессии нарушения; ингибирования или профилактики рецидивов, развития, начала или прогрессирования одного или более симптомов, связанных с нарушением; определения нарушения; или повышения или улучшения профилактических или терапевтических эффектов другой терапии (например, профилактического или терапевтического средства).

Термины "пациент" и "индивидуум" в настоящем описании можно использовать взаимозаменяемо, и они относятся к животному, такому как млекопитающее, включая примата (например, человека, мартышку и шимпанзе), не-примата (например, корову, свинью, верблюда, ламу, лошадь, козу, кролика, овцу, хомяка, морскую свинку, кошку, собаку, крысу, мышь и кита), птицу (например, утку или гуся) и акулу. Предпочтительно, пациентом или индивидуумом является человек, такой как человек, подвергаемый лечению или оценке заболевания, нарушения или состояния; человек с риском развития заболевания, нарушения или состояния; человек с заболеванием, нарушением или состоянием; и/или человек, подвергаемый лечению заболевания, нарушения или состояния. Более предпочтительно, пациента или индивидуума подвергают лечению или оценке злокачественного новообразования или другого заболевания, при которой наличие аномальной экспрессии DLL4 поддерживает злокачественное новообразование или другое заболевание, и ингибирование или нарушение активности DLL4 является желательным для лечения злокачественного новообразования или другого заболевания.

Как применяют в настоящем описании, термин "образец" используют в его широчайшем смысле. Как применяют в настоящем описании, "биологический образец" включает, в качестве неограничивающих примеров, любое количество материала от живого существа или некогда живого существа. Такие живые существа включают, в качестве неограничивающих примеров, людей, мышей, крыс, мартышек, собак, кроликов и других животных. Такие материалы включают, в качестве неограничивающих примеров, кровь (например, цельную кровь), плазму, сыворотку, мочу, амниотическую жидкость, синовиальную жидкость, эндотелиальные клетки, лейкоциты, моноциты, другие клетки, органы, ткани, костный мозг, лимфоузлы и селезенку.

Термины "компонент", "компоненты" и "по меньшей мере один компонент", как правило, относятся к иммобилизованному антителу, детекторному или конъюгированному антителу, контролю, калибратору, серии калибраторов, панели чувствительности, контейнеру, буферу, дилюенту, соли, ферменту, кофактору фермента, детекторному реагенту, реагенту/раствору для предварительной обработки, субстрату (например, в качестве раствора), стоп-раствору и т.п., которые можно включать в набор для анализа тестового образца, такого как образец мочи, сыворотки или плазмы пациента, в соответствии со способами, приведенными в настоящем описании, и другими известными в этой области способами. Таким образом, в отношении настоящего описания "по меньшей мере один компонент", "компонент" и "компоненты" могут включать полипептид или другой аналит, как указано выше, такой как композиция, содержащая аналит, такой как полипептид, необязательно иммобилизованный на твердой подложке, например, посредством связывания с антителом против аналита (например, против полипептида). Некоторые компоненты могут находиться в растворе, или их можно лиофилизировать для восстановления для использования в анализе.

Термин "риск" относится к возможности или вероятности конкретного события, происходящего в настоящее время или в некоторый момент времени в будущем. Термин "стратификация риска" относится к набору известных клинических факторов риска, позволяющему врачам классифицировать пациентов на группы низкого, умеренного, высокого или наивысшего риска развития конкретного заболевания, нарушения или состояния.

Термин "специфический" и "специфичность" в отношении взаимодействия между участниками специфической связывающейся пары (например, антигена или его фрагмента и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента) относится к избирательной реактивности взаимодействия. Фраза "специфически связывается с" и аналогичные фразы относятся к способности связывающих белков, таких как антитела (или их антигенсвязывающие фрагменты) специфически связываться с интересующей молекулой (или его фрагментом) и не связываться специфически с другими молекулами.

"Специфический партнер по связыванию" является участником специфической связывающейся пары. Специфическая связывающаяся пара содержит две различных молекулы, специфически связывающиеся друг с другом химическими или физическими средствами. Таким образом, в дополнение к специфическим связывающимся парам антигена и антитела, другие специфические связывающиеся пары могут включать биотин и авидин (или стрептавидин), углеводы и лектины, комплементарные нуклеотидные последовательности, молекулы эффектора и рецептора, кофакторы и ферменты, ингибиторы ферментов и ферменты и т.п. Кроме того, специфические связывающиеся пары могут включать участников, являющихся аналогами исходных специфических связывающихся участников, например, аналит-аналог. Иммунореактивные специфические связывающиеся участники включают антигены, фрагменты антигенов и антитела, включая моноклональные и поликлональные антитела, а также их комплексы, фрагменты и варианты (включая фрагменты вариантов), как выделенные, так и полученные рекомбинантно.

Как применяют в настоящем описании, термин "вариант" означает полипептид, отличающийся от указанного полипептида (например, полипептид DLL4 или антитело против DLL4) по аминокислотной последовательности добавлением (например, инсерцией), делецией или консервативной заменой аминокислот, но сохраняющий биологическую активность указанного полипептида (например, вариант DLL4 может конкурировать с DLL4 дикого типа за связывание с антителом против DLL4, если вариант DLL4 сохраняет участок связывания антитела (эпитоп) DLL4 дикого типа). Консервативная замена аминокислоты, т.е. замена аминокислоты, отличающейся аминокислотой со схожими свойствами (например, гидрофильностью и степенью и распределением заряженных областей), общепринята в этой области в качестве, как правило, включающей незначительное изменение. Эти незначительные изменения можно частично определять, учитывая индекс гидрофобности аминокислот, как общепринято в этой области (см., например, Kyte et al., J. Mol. Biol, 157: 105-132 (1982)). Индекс гидрофобности аминокислот основан на представлении об их гидрофобности и заряде. В этой области известно, что можно заменять аминокислоты со схожими индексами гидрофобности и все равно сохранять функцию белка. В одном из аспектов заменяют аминокислоты с индексами гидрофобности ±2. Гидрофильность аминокислот также можно использовать для выявления замен, которые будут приводить к получению белков, сохраняющих биологическую функцию. Представление о гидрофильности аминокислот в отношении пептида позволяет вычислять наибольшую среднюю локальную гидрофильность этого пептида, применимое измерение, которое, как сообщают, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью (см., например, патент США № 4554101). Как известно в этой области, замена аминокислот со схожими величинами гидрофильности может приводить к получению пептидов, сохраняющих биологическую активность, например иммуногенность. В одном из аспектов замены осуществляют с аминокислотами с величинами гидрофильности в диапазоне ±2 друг от друга. И на индекс гидрофобности, и на величину гидрофильности аминокислот влияет конкретная боковая цепь этой аминокислоты. В соответствии с наблюдениями замены аминокислот, совместимые с биологической функцией, понимают как зависящие от относительного сходства аминокислот и, в частности, боковых цепей этих аминокислот, о чем свидетельствуют гидрофобность, гидрофильность, заряд, размер и другие свойства. Термин "вариант" также можно использовать для описания полипептида или его фрагмента, процессируемых по-разному, например, посредством протеолиза, фосфорилирования или другой посттрансляционной модификации, сохраняющих свою биологическую активность или реактивность по отношению к антигену, например, способность связываться с DLL4. Использование термина "вариант" в настоящем описании предназначено для включения фрагментов вариантов, если контекст не указывает на иное.

Как применяют в настоящем описании, термин "образец" используют в его широчайшем смысле. Как применяют в настоящем описании, "биологический образец" включает, в качестве неограничивающих примеров, любое количество материала от живого существа или некогда живого существа. Такие живые существа включают, в качестве неограничивающих примеров, людей, мышей, крыс, мартышек, собак, кроликов и других животных. Такие материалы включают, в качестве неограничивающих примеров, кровь, сыворотку, мочу, синовиальную жидкость, клетки, органы, ткани, костный мозг, лимфоузлы и селезенку.

I. Антитела, связывающие DLL4 человека.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к выделенным моноклональным антителам крысы или их антигенсвязывающим частям, связывающимся с DLL4 с высокой аффинностью, низкой скоростью обратной реакции и/или высокой нейтрализующей способностью. Другой аспект изобретения относится к химерным антителам, связывающим DLL4. В другом аспекте изобретение относится к антителам с пересаженными CDR или их антигенсвязывающим частям, связывающим DLL4. Другой аспект изобретения относится к гуманизированным антителам или их антигенсвязывающим частям, связывающим DLL4. В варианте осуществления антитела или их части являются выделенными антителами или их выделенными частями. В другом варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению являются нейтрализующими антителами против DLL. Преимущественно, такие антитела или их антигенсвязывающие части, связывающие DLL4, находят применение в качестве терапевтических средств, которые можно вводить индивидууму (человеку или другому млекопитающему). Предпочтительно, антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению являются нейтрализующими антителами против DLL4 и/или против VEGFR2.

A. Способ получения антител против DLL4.

Антитела по настоящему изобретению можно получать любым из ряда способов, известных в этой области. Аспекты различных способов, которые можно использовать для получения моноклональных антител против DLL4 по изобретению, описаны ниже.

1. Получение моноклональных антител против DLL4 с использованием гибридомной технологии.

Моноклональные антитела можно получать с использованием широкого спектра известных в этой области способов, включая использование гибридомной, рекомбинантной технологии и технологии фагового дисплея, или их сочетания. Например, моноклональные антитела можно получать с использованием гибридомных способов, включая известные в этой области и описываемые, например, в Harlow et al., Antibidies: A Laboratory Manual, second edition. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. (Elsevier, New York, 1981). Также необходимо отметить, что термин "моноклональное антитело", как применяют в настоящем описании, не ограничен антителами, получаемыми гибридомной технологией. Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, получаемому из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, и не ограничен способом, которым его получают.

В варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам получения моноклональных антител, а также антител, получаемых способом, включающим культивирование гибридомной клетки, секретирующей антитело по изобретению, где, предпочтительно, гибридому получают слиянием спленоцитов, выделенных из животного, например, крысы или мыши, иммунизированного DLL4, с миеломными клетками и затем скринингом гибридом, получаемых от слияния, на предмет гибридомных клонов, секретирующих антитело, способное связывать полипептид по изобретению. В кратком изложении, крыс можно иммунизировать антигеном DLL4 (см. примеры ниже). В предпочтительном варианте осуществления антиген DLL4 вводят с адъювантом для стимуляции иммунного ответа. Такие адъюванты включают полный или неполный адъювант Фрейнда, RIBI (мурамил-дипептиды) или ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептид от быстрого рассеивания посредством его изоляции в местном депо, или они могут содержать вещества, стимулирующие секрецию хозяином факторов, являющихся хемотаксическими для макрофагов и других компонентов иммунной системы. Предпочтительно, если вводят полипептид, режим иммунизации будет включать два или более введений полипептида, высвобождающихся в течение нескольких недель; однако, также можно использовать однократное введение полипептида.

После иммунизации животного антигеном DLL4 из животного можно получать антитела и/или продуцирующие антитело клетки. Сыворотку, содержащую антитело против DLL4, получают из животного обескровливанием или умерщвлением животного. Можно использовать сыворотку, т.к. ее получают из животного, фракцию иммуноглобулинов можно получать из сыворотки, или антитела против DLL4 можно выделять из сыворотки. Получаемые таким образом сыворотка или иммуноглобулины являются поликлональными и, таким образом, имеющими гетерогенный набор свойств.

Как только определяют иммунный ответ, например, антитела, специфичные для антигена DLL4, определяют в сыворотке крысы, собирают селезенку крысы и выделяют спленоциты. Затем спленоциты подвергают слиянию хорошо известными способами с любыми подходящими миеломными клетками, например, клетками клеточной линии SP20, доступной в American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, US). Выбирают гибридомы и клонируют лимитированным разведением. Затем гибридомные клоны анализируют известными в этой области способами на предмет клеток, секретирующих антитела, способные связывать DLL4. Асцитную жидкость, как правило, содержащую высокие уровни антител, можно получать иммунизацией крыс положительными гибридомными клонами.

В другом варианте осуществления продуцирующие антитело иммортализованные гибридомы можно получать из иммунизированного животного. После иммунизации животное умерщвляют и Β-клетки селезенки подвергают слиянию с иммортализованными миеломными клетками, как хорошо известно в этой области. См., например, Harlow и Lane, выше. В предпочтительном варианте осуществления миеломные клетки не секретируют полипептиды иммуноглобулина (несекреторная клеточная линия). После слияния и селекции с использованием антибиотика гибридомы подвергают скринингу с использованием DLL4, или его части, или клетки, экспрессирующей DLL4. В предпочтительном варианте осуществления начальный скрининг осуществляют с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммунологического анализа (RIA), предпочтительно ELISA. Пример скрининга с использованием ELISA представлен в публикации PCT № WO 00/37504.

Продуцирующие антитело против DLL4 гибридомы выбирают, клонируют и подвергают дальнейшему скринингу на предмет желаемых характеристик, включая сильный рост гибридомы, высокую продукцию антитела и желаемые характеристики антитела, как дополнительно описано ниже. Гибридомы можно культивировать и наращивать in vivo в сингенных животных, в животных с недостаточностью иммунной системы, например, безтимусных мышах, или в культуре клеток in vitro. Способы селекции, клонирования и наращивания гибридом хорошо известны специалистам в этой области.

В предпочтительном варианте осуществления гибридомы являются гибридомами крысы, как приведено в настоящем описании. В другом варианте осуществления гибридомы получают в не являющихся человеком, не являющихся видах, таких как мышь, овца, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. В другом предпочтительном варианте осуществления гибридомы являются гибридомами человека, в которых несекреторную миелому человека подвергают слиянию с клеткой человека, экспрессирующей антитело против DLL4.

Фрагменты антител, распознающие специфические эпитопы, можно получать известными способами. Например, Fab- и F(ab')₂-фрагменты по изобретению можно получать протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулинов с использованием ферментов, таких как папаин (для получения двух идентичных Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')₂-фрагмента). F(ab')₂-фрагмент молекулы IgG сохраняет два антигенсвязывающих участка большей ("родительской") молекулы IgG, включая обе легкие цепи (содержащие вариабельные области легкой цепи и константные области легкой цепи), домены CH1 тяжелых цепей и образованную дисульфидной связью шарнирную область родительской молекулы IgG. Таким образом, F(ab')₂-фрагмент все еще способен к образованию перекрестных связей с молекулами антигена, подобно родительской молекуле IgG.

2. Получение моноклональных антител против DLL4 с использованием SLAM.

В другом аспекте изобретения рекомбинантные антитела получают из одиночных, выделенных лимфоцитов с использованием способа, называемого в этой области как способ получения антител из отобранных лимфоцитов (SLAM), как описано в патенте США № 5627052; публикации PCT № WO 92/02551; и Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996). В этом способе одиночные клетки, секретирующие интересующие антитела, например, лимфоциты, получаемые из любого из иммунизированных животных, описываемых в разделе I.A.1 (выше), подвергают скринингу с использованием антиген-специфического метода гемолитических бляшек, где антиген DLL4, субъединицу DLL4 или его фрагмент соединяют с эритроцитами овцы с использованием линкера, такого как биотин, и используют для определения одиночных клеток, секретирующих антитела со специфичностью к DLL4. После идентификации секретирующих интересующее антитело клеток, кДНК вариабельных областей тяжелой и легкой цепей получают из клеток ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), и затем эти вариабельные области можно экспрессировать, в отношении соответствующих константных областей иммуноглобулинов (например, константных областей человека), в клетках-хозяевах млекопитающих, таких как клетки COS или CHO. Клетки-хозяева, трансфицированные амплифицированными последовательностями иммуноглобулина, получаемыми из отобранных in vivo лимфоцитов, затем можно подвергать дальнейшему анализу и селекции in vitro, например, пэннингом трансфицированных клеток с выделенными клетками, экспрессирующими антитела против DLL4. НА амплифицированные последовательности иммуноглобулина можно дополнительно воздействовать in vitro, например, способом созревание аффинности in vitro. См., например, публикацию PCT № WO 97/29131 и публикацию PCT № WO 00/56772.

3. Получение моноклональных антител против DLL4 с использованием трансгенных животных.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитела получают иммунизацией не принадлежащего человеку животного, содержащего часть или весь локус иммуноглобулина человека с антигеном DLL4. В варианте осуществления не принадлежащее человеку животное является трансгенной мышью XENOMOUSE®, сконструированной линией мышей, содержащей большие фрагменты локусов иммуноглобулина человека и дефектной по продукции антител мыши. См., например, Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994) и патенты США №№ 5916771; 5939598; 5985615; 5998209; 6075181; 6091001; 6114598; и 6130364. Также см. публикации PCT №№ WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; и WO 00/37504. Трансгенная мышь XENOMOUSE® продуцирует репертуар антител полностью человека, подобный взрослому, и продуцирует антиген-специфичные моноклональные антитела человека. Трансгенная мышь XENOMOUSE® содержит приблизительно 80% репертуара антител человека посредством встраивания YAC-фрагментов локусов тяжелой цепи и κ-легкой цепи человека размером в мегабазу с конфигурацией зародышевой линии. См. Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green и Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998), содержание которых, таким образом, включено в качестве ссылки.

4. Получение моноклональных антител против DLL4 с использованием библиотек рекомбинантных антител.

Для получения антител по изобретению также можно использовать способы in vitro, где библиотеку антител подвергают скринингу для определения антитела с желаемой DLL4-специфичностью связывания. Способы такого скрининга библиотек рекомбинантных антител хорошо известны в этой области и включают способы, описываемые, например, в патенте США № 5223409 (Ladner et al.); публикации PCT № WO 92/18619 (Kang et al.); публикации PCT № WO 91/17271 (Dower et al.); публикации PCT № WO 92/20791 (Winter et al.); публикации PCT № WO 92/15679 (Markland et al.); публикации PCT № WO 93/01288 (Breitling et al.); публикации PCT № WO 92/01047 (McCafferty et al.); публикации PCT № WO 92/09690 (Garrard et al.); Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et ed., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991); патентной заявке США № 2003/0186374; и публикации PCT № WO 97/29131, содержание каждого из которых включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Библиотеку рекомбинантных антител можно получать от индивидуума, иммунизированного DLL4, или частью DLL4. Альтернативно, библиотеку рекомбинантных антител можно получать из "наивного" индивидуума, т.е. неиммунизированного DLL4, например, библиотека антител человека от человека, неиммунизированного DLL4 человека. Антитела по изобретению выбирают посредством скрининга библиотеки рекомбинантных антител с использованием пептида, содержащего DLL4 человека, чтобы, таким образом, выбирать антитела, распознающие DLL4. Способы проведения такого скрининга и селекции хорошо известны в этой области, такие как описано в ссылках в предыдущем параграфе. Для селекции антител по изобретению с конкретными аффинностями связывания DLL4, например, тех, которые диссоциируют от DLL4 человека с конкретной константой скорости K_off, можно использовать известный в этой области способ поверхностного плазмонного резонанса для селекции антител с желаемой константой скорости K_off. Для селекции антител по изобретению с конкретной нейтрализующей активностью hDLL4, например, с конкретной IC₅₀, можно использовать стандартные известные в этой области способы оценки ингибирования активности DLL4.

В одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающей части, связывающей DLL4 человека. Предпочтительно, антитело является нейтрализующим антителом. В различных вариантах осуществления антитело является рекомбинантным антителом или моноклональным антителом.

Например, антитела по настоящему изобретению также можно получать с использованием различных способов фагового дисплея, известных в этой области. В способах фагового дисплея домены функционального антитела представлены на поверхности фаговых частиц, несущих кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Такие фаги можно использовать для представления антигенсвязывающих доменов, экспрессируемых из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Фага, экспрессирующего антигенсвязывающий домен, связывающий интересующий антиген, можно выбирать или идентифицировать с использованием антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного или иммобилизованного на твердой поверхности или бусине. Используемый в этих способах фаг, как правило, являются нитевидными фагами, включая fd и M13, связывающими домены, экспрессируемые из фага с Fab-, Fv- или стабилизированными дисульфидными связями Fv-доменами антитела, рекомбинантно слитыми с белком гена III или гена VIII фага. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения антител по настоящему изобретению, включают описываемые в Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994); публикации PCT № WO 92/01047; публикациях PCT №№ WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; и патентах США №№ 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743; и 5969108.

Как описано в указанных выше источниках, после селекции фага кодирующие антитело области из фага можно выделять и использовать для получения целых антител, включая антитела человека, или любого другого желаемого антигенсвязывающего фрагмента, и экспрессировать в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные клетки, дрожжи и бактерии, например, как подробно описано ниже. Например, также можно использовать способы рекомбинантного получения Fab-, Fab'- и F(ab')₂-фрагментов с использованием известных в этой области способов, таких как описываемые в публикации PCT № WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995); и Better et al., Science, 240: 1041-1043 (1988). Примеры способов, которые можно использовать для получения одноцепочечных Fv и антител, включают описываемые в патенте США № 4946778 и 5258498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); и Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988).

Альтернативно скринингу библиотек рекомбинантных антител посредством фагового дисплея, можно использовать другие способы, известные в этой области для скрининга больших комбинаторных библиотек для идентификации антител по изобретению. Одним из типов альтернативной системы экспрессии является тот, в котором библиотеку рекомбинантных антител экспрессируют как соединения РНК-белок, как описано в публикации PCT № WO 98/31700 (Szostak и Roberts) и в Roberts и Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997). В этой системе осуществляют ковалентное соединение мРНК и пептида или белка, которого она кодирует, посредством трансляции in vitro синтетической мРНК, несущей пуромицин, пептидил-акцепторный антибиотик, на своем 3'-конец. Таким образом, специфичную мРНК можно пополнять из комплексной смеси мРНК (например, комбинаторной библиотеки) на основе свойств кодируемого пептида или белка, например, антитела или его части, такой как связывание антитела или его части с антигеном с двойной специфичностью. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или их части, получаемые при скрининге таких библиотек, можно экспрессировать рекомбинантными способами, как описано выше (например, в клетках-хозяевах млекопитающих), и, кроме того, можно подвергать дальнейшему созреванию аффинности посредством дополнительных циклов скрининга соединений мРНК-пептид, в которых мутации встраивали в исходно выбранные последовательности, или другим способам созревания аффинности рекомбинантных антител in vitro, как описано выше. Предпочтительным примером этой методологии является технология фагового дисплея PROfusion, используемая в примерах (ниже).

При другом подходе антитела по настоящему изобретению также можно получать с использованием способов дрожжевого дисплея, известных в этой области. В способах дрожжевого дисплея используют генетические способы для соединения доменов антитела со стенкой дрожжевой клетки и их представления на поверхности дрожжей. В частности, такие дрожжи можно использовать для представления антигенсвязывающих доменов, экспрессируемых из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Примеры способов дрожжевого дисплея, которые можно использовать для получения антител по настоящему изобретению, включают описываемые в патенте США № 6699658 (Wittrup et al.), включенном в настоящий документ в качестве ссылки.

Β. Получение рекомбинантных антител против DLL4

Антитела по настоящему изобретению можно получать любым из ряда способов, известных в этой области. Например, экспрессией в клетках-хозяевах, где экспрессирующие вектора, кодирующие тяжелые и легкие цепи, трансфицируют в клетку-хозяина стандартными способами. Различные формы термина "трансфекция" предназначены для включения широкого спектра способов, общеупотребительных для встраивания экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацией, осаждением фосфатом кальция, трансфекцией с использованием DEAE-декстрана и т.п. Хотя можно экспрессировать антитела по изобретению в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительной является экспрессия антител в эукариотических клетках и, наиболее предпочтительно - в клетках-хозяевах млекопитающих, т.к. такие эукариотические клетки (и, в частности, клетки млекопитающих) более вероятно, чем прокариотические клетки, способны к сборке и секреции правильным образом свернутого и иммунологически активного антитела.

Примеры клеток-хозяев млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки китайского хомяка (клетки CHO) (включая клетки dhfr-CHO, описываемые в Urlaub и Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980), используемые с селективным маркером DHFR, например, как описано в Kaufman и Sharp, J. Mol. Biol, 159: 601-621 (1982), миеломные клетки NS0, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антитела, встраивают в клетки-хозяева млекопитающих, антитела получают культивированием клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного, чтобы сделать возможной экспрессию антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секрецию антитела в среду для культивирования, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела можно выделять из среды для культивирования с использованием стандартных способов очистки белка.

Клетки-хозяева также можно использовать для получения функциональных фрагментов антител, таких как Fab-фрагменты или scFv-молекулы. Следует понимать, что варианты указанного выше способа входят в объем настоящего изобретения. Например, желательной может являться трансфекция клетки-хозяина ДНК, кодирующей функциональные фрагменты легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению. Технологию рекомбинантных ДНК также можно использовать для удаления некоторой или всей ДНК, кодирующей любую или обе из легкой и тяжелой цепей, не являющейся необходимой для связывания интересующих антигенов. Молекулы, экспрессируемые из таких укороченных молекул ДНК, также включены в антитела по изобретению. Кроме того, перекрестным соединением антитела по изобретению со вторым антителом стандартными химическими способами получения поперечных связей можно получать бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь являются антителом по изобретению (т.е. связывают DLL4 человека), и другие тяжелая и легкая цепи являются специфичными для антигена, иного, чем DLL4 человека.

В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий и тяжелую цепь антитела, и легкую цепь антитела, встраивают в клетки dhfr-CHO трансфекцией, опосредованной фосфатом кальция. В рекомбинантном экспрессирующем векторе каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела функционально связан с регуляторными элементами энхансером CMV/промотором AdMLP для запуска высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор также несет ген DHFR, делающий возможной селекцию клеток CHO, трансфицированных вектором с использованием селекции/амплификации метотрексатом. Выбранные трансформанты-клетки-хозяева культивируют, позволяя экспрессировать тяжелую и легкую цепи антитела, и выделяют интактное антитело из среды для культивирования. Для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфекции клеток-хозяев, селекции трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из среды для культивирования используют стандартные способы молекулярной биологии. Дополнительно изобретение относится к способу синтеза рекомбинантного антитела по изобретению культивированием клетки-хозяина по изобретению в подходящей среде для культивирования до синтеза рекомбинантного антитела по изобретению. Способ дополнительно может включать выделение рекомбинантного антитела из среды для культивирования.

1. Антитела против DLL4.

Аминокислотные последовательности областей VH и VL выделенных моноклональных антител крысы, связывающих DLL4 человека, представлены для клонов 38H12, 1A11, 37D10, 32C7, 14G1, 14A11 и 15D6 в таблице 9 (см. пример 4 ниже). Последовательности CDR выделенного антитела против DLL4, приведенного в настоящем описании, составляют семейство DLL4-связывающих белков, выделенных в соответствии с настоящим изобретением и содержащих полипептиды, включающие получаемые из них последовательности CDR и их аффинно-зрелые клоны. Последовательности вариабельных областей и CDR моноклональных антител и их аффинно-зрелых производных представлены в таблицах 9, 11, 16, 20 и 21. Для получения и селекции CDR для связывания белков по изобретению с предпочтительной DLL4-связывающей и/или нейтрализующей активностью в отношении DLL4 человека, можно использовать стандартные известные в этой области способы получения связывающих белков по настоящему изобретению и оценки DLL4-связывающих и/или нейтрализующих характеристик этого связывающего белка, включая, в качестве неограничивающих примеров, конкретно приведенные в настоящем описании.

На основе выравнивания аминокислотных последовательностей CDR вариабельных областей тяжелой цепи (VH) и вариабельных областей легкой цепи (VL) клонов антитела против DLL4, приведенных в настоящем описании, изобретение относится к DLL4-связывающему белку, содержащему антигенсвязывающий домен, способный связывать DLL4 человека, указанный антигенсвязывающий домен, содержащий по меньшей мере один или более из шести CDR, т.е. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, определенные ниже:

CDR-H1 выбран из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅ (SEQ ID NO:151), где

X₁ является N, H или Y;

X₂ является F;

X₃ является P;

X₄ является M;

X₅ является A или S;

остатков 31-35 SEQ ID NO:157 (CDR-H1 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:161 (CDR-H1 37D10);

остатков 31-35 SEQ ID NO:163 (CDR-H1 32C7);

остатков 31-35 SEQ ID NO:165 (CDR-H1 14G1);

остатков 31-35 SEQ ID NO:167 (CDR-H1 14A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:169 (CDR-H1 15D6);

остатков 31-35 SEQ ID NO:171 (CDR-H1 VH.1 1A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:172 (CDR-H1 VH.1a 1A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:173 (CDR-H1 VH.1b 1A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:174 (CDR-H1 VH.2a 1A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:179 (CDR-H1 VH.1 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:180 (CDR-H1 VH.1A 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:181 (CDR-H1 VH.1b 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:182 (CDR-H1 VH.2a 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:187 (CDR-H1 h1A11VH.1);

остатков 31-35 SEQ ID NO:188 (CDR-H1 h1A11.A6);

остатков 31-35 SEQ ID NO:189 (CDR-H1 h1A11.A8);

остатков 31-35 SEQ ID NO:190 (CDR-H1 h1A11.C6);

остатков 31-35 SEQ ID NO:191 (CDR-H1 h1A11.A11);

остатков 31-35 SEQ ID NO:192 (CDR-H1 h1A11.B5);

остатков 31-35 SEQ ID NO:193 (CDR-H1 h1A11.E12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:194 (CDR-H1 h1A11.G3);

остатков 31-35 SEQ ID NO:195 (CDR-H1 h1A11.F5); и

остатков 31-35 SEQ ID NO:196 (CDR-H1 h1A11.H2);

CDR-H2 выбран из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇ (SEQ ID NO:152), где

X₁ является T или S;

X₂ является I;

X₃ является S;

X₄ является S или G;

X₅ является S;

X₆ является D;

X₇ является G, A, D, S или E;

X₈ является T или W;

X₉ является T, P или A;

X₁₀ является Y, S, T или N;

X₁₁ является Y или I;

X₁₂ является R или G;

X₁₃ является D;

X₁₄ является S;

X₁₅ является V;

X₁₆ является K; и

X₁₇ является G;

остатков 50-66 SEQ ID NO:157 (CDR-H2 38H12);

остатков 50-68 SEQ ID NO:161 (CDR-H2 37D10);

остатков 50-66 SEQ ID NO:163 (CDR-H2 32C7);

остатков 50-66 SEQ ID NO:165 (CDR-H2 14G1);

остатков 50-66 SEQ ID NO:167 (CDR-H2 14A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:169 (CDR-H2 15D6);

остатков 50-66 SEQ ID NO:171 (CDR-H2 VH.1 1A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:172 (CDR-H2 VH.1a 1A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:173 (CDR-H2 VH.1b 1A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:174 (CDR-H2 VH.2a 1A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:179 (CDR-H2 VH.1 38H12);

остатков 50-66 SEQ ID NO:180 (CDR-H2 VH.1A 38H12);

остатков 50-66 SEQ ID NO:181 (CDR-H2 VH.1b 38H12);

остатков 31-35 SEQ ID NO:182 (CDR-H2 VH.2a 38H12);

остатков 50-66 SEQ ID NO:187 (CDR-H2 h1A11VH.1);

остатков 50-66 SEQ ID NO:188 (CDR-H2 h1A11.A6);

остатков 50-66 SEQ ID NO:189 (CDR-H2 h1A11.A8);

остатков 50-66 SEQ ID NO:190 (CDR-H2 h1A11.C6);

остатков 50-66 SEQ ID NO:191 (CDR-H2 h1A11.A11);

остатков 50-66 SEQ ID NO:192 (CDR-H2 h1A11.B5);

остатков 50-66 SEQ ID NO:193 (CDR-H2 h1A11.E12);

остатков 50-66 SEQ ID NO:194 (CDR-H2 h1A11.G3);

остатков 50-66 SEQ ID NO:195 (CDR-H2 h1A11.F5); и

остатков 50-66 SEQ ID NO:196 (CDR-H2 h1A11.H2);

CDR-H3 выбран из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉ (SEQ ID NO:153), где

X₁ является G;

X₂ является Y;

X₃ является Y;

X₄ является N;

X₅ является S;

X₆ является P;

X₇ является F;

X₈ является A; и

X₉ является Y, F или S;

остатков 99-107 SEQ ID NO:157 (CDR-H3 38H12);

остатков 101-111 SEQ ID NO:161 (CDR-H3 37D10);

остатков 99-105 SEQ ID NO:163 (CDR-H3 32C7);

остатков 99-105 SEQ ID NO:165 (CDR-H3 14G1);

остатков 99-110 SEQ ID NO:167 (CDR-H3 14A11);

остатков 99-110 SEQ ID NO:169 (CDR-H3 15D6);

остатков 99-107 SEQ ID NO:171 (CDR-H3 VH.1 1A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:172 (CDR-H3 VH.1a 1A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:173 (CDR-H3 VH.1b 1A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:174 (CDR-H3 VH.2a 1A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:179 (CDR-H3 VH.1 38H12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:180 (CDR-H3 VH.1A 38H12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:181 (CDR-H3 VH.1b 38H12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:182 (CDR-H3 VH.2a 38H12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:187 (CDR-H3 h1A11VH.1);

остатков 99-107 SEQ ID NO:188 (CDR-H3 h1A11.A6);

остатков 99-107 SEQ ID NO:189 (CDR-H3 h1A11.A8);

остатков 99-107 SEQ ID NO:190 (CDR-H3 h1A11.C6);

остатков 99-107 SEQ ID NO:191 (CDR-H3 h1A11.A11);

остатков 99-107 SEQ ID NO:192 (CDR-H3 h1A11.B5);

остатков 99-107 SEQ ID NO:193 (CDR-H3 h1A11.E12);

остатков 99-107 SEQ ID NO:194 (CDR-H3 h1A11.G3);

остатков 99-107 SEQ ID NO:195 (CDR-H3 h1A11.F5); и

остатков 99-107 SEQ ID NO:196 (CDR-H3 h1A11.H2);

CDR-L1 выбран из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁ (SEQ ID NO:154), где

X₁ является R;

X₂ является A;

X₃ является S;

X₄ является E или Q;

X₅ является D или E;

X₆ является I;

X₇ является Y или W;

X₈ является S, I, Y, N или R;

X₉ является N;

X₁₀ является L; и

X₁₁ является A;

остатков 24-34 SEQ ID NO:158 (CDR-L1 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:162 (CDR-L1 37D10);

остатков 24-34 SEQ ID NO:164 (CDR-L1 32C7);

остатков 24-34 SEQ ID NO:166 (CDR-L1 14G1);

остатков 24-37 SEQ ID NO:168 (CDR-L1 14A11);

остатков 24-37 SEQ ID NO:170 (CDR-L1 15D6);

остатков 24-34 SEQ ID NO:175 (CDR-L1 VL.1 1A11);

остатков 24-34 SEQ ID NO:176 (CDR-L1 VL.1a 1A11);

остатков 24-34 SEQ ID NO:177 (CDR-L1 VL.1b 1A11);

остатков 24-34 SEQ ID NO:178 (CDR-L1 VL.2a 1A11);

остатков 24-34 SEQ ID NO:183 (CDR-L1 VL.1 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:184 (CDR-L1 VL.1a 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:185 (CDR-L1 VH.1b 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:186 (CDR-L1 VL.2a 38H12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:197 (CDR-L1 h1A11VL.1);

остатков 24-34 SEQ ID NO:198 (CDR-L1 h1A11.A2);

остатков 24-34 SEQ ID NO:199 (CDR-L1 h1A11.A12);

остатков 24-34 SEQ ID NO:200 (CDR-L1 h1A11.A7);

остатков 24-34 SEQ ID NO:201 (CDR-L1 h1A11.B4);

остатков 24-34 SEQ ID NO:202 (CDR-L1 h1A11.B5); и

остатков 24-34 SEQ ID NO:203 (CDR-L1 h1A11.E12);

CDR-L2 выбран из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇ (SEQ ID NO:155), где

X₁ является D;

X₂ является T;

X₃ является N или S;

X₄ является N, D, S, I, Y или V;

X₅ является L;

X₆ является A; и

X₇ является D;

остатков 50-56 SEQ ID NO:158 (CDR-L2 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:162 (CDR-L2 37D10);

остатков 50-56 SEQ ID NO:164 (CDR-L2 32C7);

остатков 50-56 SEQ ID NO:166 (CDR-L2 14G1);

остатков 50-59 SEQ ID NO:168 (CDR-L2 14A11);

остатков 50-59 SEQ ID NO:170 (CDR-L2 15D6);

остатков 50-56 SEQ ID NO:175 (CDR-L2 VL.1 1A11);

остатков 50-56 SEQ ID NO:176 (CDR-L2 VL.1a 1A11);

остатков 50-56 SEQ ID NO:177 (CDR-L2 VL.1b 1A11);

остатков 50-56 SEQ ID NO:178 (CDR-L2 VL.2a 1A11);

остатков 50-56 SEQ ID NO:183 (CDR-L2 VL.1 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:184 (CDR-L2 VL.1a 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:185 (CDR-L2 VH.1b 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:186 (CDR-L2 VL.2a 38H12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:197 (CDR-L2 h1A11VL.1);

остатков 50-56 SEQ ID NO:198 (CDR-L2 h1A11.A2);

остатков 50-56 SEQ ID NO:199 (CDR-L2 h1A11.A12);

остатков 50-56 SEQ ID NO:200 (CDR-L2 h1A11.A7);

остатков 50-56 SEQ ID NO:201 (CDR-L2 h1A11.B4);

остатков 50-56 SEQ ID NO:202 (CDR-L2 h1A11.B5); и

остатков 50-56 SEQ ID NO:203 (CDR-L2 h1A11.E12);

и CDR-L3 выбран из группы, состоящей из:

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉ (SEQ ID NO:156), где

X₁ является Q;

X₂ является Q;

X₃ является Y;

X₄ является N, D или T;

X₅ является N, Y или W;

X₆ является Y или V;

X₇ является P;

X₈ является P; и

X₉ является T;

остатков 89-97 SEQ ID NO:158 (CDR-L3 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:162 (CDR-L3 37D10);

остатков 89-97 SEQ ID NO:164 (CDR-L3 32C7);

остатков 89-98 SEQ ID NO:166 (CDR-L3 14G1);

остатков 92-100 SEQ ID NO:168 (CDR-L3 14A11);

остатков 92-100 SEQ ID NO:170 (CDR-L3 15D6);

остатков 89-97 SEQ ID NO:175 (CDR-L3 VL.1 1A11);

остатков 89-97 SEQ ID NO:176 (CDR-L3 VL.1a 1A11);

остатков 89-97 SEQ ID NO:177 (CDR-L3 VL.1b 1A11);

остатков 89-97 SEQ ID NO:178 (CDR-L3 VL.2a 1A11);

остатков 89-97 SEQ ID NO:183 (CDR-L3 VL.1 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:184 (CDR-L3 VL.1a 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:185 (CDR-L3 VH.1b 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:186 (CDR-L3 VL.2a 38H12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:197 (CDR-L3 h1A11VL.1);

остатков 89-97 SEQ ID NO:198 (CDR-L3 h1A11.A2);

остатков 89-97 SEQ ID NO:199 (CDR-L3 h1A11.A12);

остатков 89-97 SEQ ID NO:200 (CDR-L3 h1A11.A7);

остатков 89-97 SEQ ID NO:201 (CDR-L3 h1A11.B4);

остатков 89-97 SEQ ID NO:202 (CDR-L3 h1A11.B5); и

остатков 89-97 SEQ ID NO:203 (CDR-L3 h1A11.E12).

Предпочтительно, DLL4-связывающий белок содержит по меньшей мере одну описываемую выше CDR, более предпочтительно, любые две описываемые выше CDR, более предпочтительно, любые три описываемые выше CDR, даже более предпочтительно, любые четыре описываемые выше CDR, еще более предпочтительно, любые пять описываемые выше CDR, и наиболее предпочтительно, любые шесть описываемые выше CDR (т.е. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, как описано выше). Особенно предпочтительный DLL4-связывающий белок, содержащий три CDR, содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, как описано выше.

Предпочтительно, DLL4-связывающий белок, содержащий одну или более описываемых выше CDR, связывает DLL4 человека ("hu", "h"), а также один или более белков DLL4, выбранных из группы, состоящей из: DLL4 мыши ("мыши", "mu"), DLL4 яванского макака ("яванского макака", "cyno") и DLL4 крысы.

Предпочтительно, DLL4-связывающий белок, содержащий одну или более описываемых выше CDR, связывает DLL4 человека ("hu"), а также DLL4 яванского макака ("яванского макака", "cyno").

2. Химерные антитела против DLL4.

Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части антитела получают из различных видов животных, например, антитела с вариабельной областью, получаемой из моноклонального антитела мыши, и константной областью иммуноглобулина человека. См. например, Morrison, Science, 229: 1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques, 4: 214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202 (1989); патенты США №№ 5807715; 4816567; и 4816397. Кроме того, можно использовать способы, разработанные для получения "химерных антител" посредством сплайсинга генов молекулы антитела мыши с соответствующей специфичностью к антигену с генами молекулы антитела человека с соответствующей биологической активностью. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985), включенные в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

3. Антитела против DLL4 с пересаженными CDR.

Последовательности CDR выделенного антитела против DLL4 по изобретению можно использовать для получения антитела с пересаженными CDR для модуляции свойств исходного антитела. Такие свойства включают, в качестве неограничивающих примеров, кинетику связывания, аффинность, виды биологической активности, перекрестную реактивность видов, перекрестную реактивность молекул, эпитоп, физико-химические свойства, фармакокинетические свойства, фармакодинамические свойства или фармакологические свойства. Антитела с пересаженными CDR содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела человека или антитела не являющегося человеком примата, где одну или более областей CDR VH и/или VL заменяют последовательностями CDR исходного антитела против DLL4. Каркасная последовательность из любого антитела человека или не являющегося человеком примата может служить в качестве основы для пересадки CDR. Однако, прямая замена цепи на таком каркасе часто приводит к некоторой потере аффинности связывания с антигеном. Чем более гомологичным является антитело человека или другого вида по отношению к исходному антителу человека, тем меньше вероятность того, что комбинация CDR с новым каркасом человека или каркасом не являющегося человеком примата внесет искажения в CDR, которые могут снижать аффинность или другие свойства. Таким образом, предпочтительно, каркас вариабельной области, выбранный для замены каркаса вариабельной области человека, помимо CDR имеет по меньшей мере 30% идентичности последовательности с каркасом вариабельной области антитела человека. Более предпочтительно, каркас вариабельной области, выбранный для замены каркаса вариабельной области человека, помимо CDR имеет по меньшей мере 40% идентичности последовательности с каркасом вариабельной области антитела человека. Более предпочтительно, каркас вариабельной области, выбранный для замены каркаса вариабельной области человека, помимо CDR имеет по меньшей мере 50% идентичности последовательности с каркасом вариабельной области антитела человека. Более предпочтительно, каркас вариабельной области, выбранный для замены каркаса вариабельной области человека, помимо CDR имеет по меньшей мере 60% идентичности последовательности с каркасом вариабельной области антитела человека. Более предпочтительно, новый каркас вариабельной области человека или не являющегося человеком примата и исходный каркас вариабельной области человека помимо CDR имеет по меньшей мере 70% идентичности последовательности. Даже более предпочтительно, новый каркас вариабельной области человека или не являющегося человеком примата и исходный каркас вариабельной области человека помимо CDR имеет по меньшей мере 75% идентичности последовательности. Наиболее предпочтительно, новый каркас вариабельной области человека или не являющегося человеком примата и исходный каркас вариабельной области человека помимо CDR имеет по меньшей мере 80% идентичности последовательности. Даже с использованием высоко гомологичных каркасов человека или не являющегося человеком примата для пересадки CDR исходного антитела человека против DLL4, получаемое антитело с пересаженными CDR все равно может до некоторой степени терять аффинность связывания с антигеном. В этом случае для восстановления аффинности необходимо включать по меньшей мере один или более замен ключевых каркасных остатков исходного антитела в соответствующих положениях антитела с пересаженными CDR. Такой ключевой остаток можно выбрать из группы, состоящей из:

остатка, смежного с CDR;

остатка участка гликозилирования;

редкого остатка;

остатка, способного взаимодействовать с DLL4 человека;

канонического остатка;

контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи;

остатка в зоне Вернье; и

остатка в области, перекрывающейся между CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, определяемого по Chothia, первой каркасной областью тяжелой цепи, определяемой по Kabat.

4. Гуманизированные антитела против DLL4.

Несмотря на то, что композиции по настоящему изобретению устраняют требование для получения гуманизированных антител, гуманизированные антитела против DLL4 можно получать с использованием композиций по изобретению. Гуманизированные антитела являются молекулами антител из не являющихся человеком видов, связывающими желаемый антиген, с одной или более определяющими комплементарность областями (CDR) не являющихся человеком видов и каркасными областями молекулы иммуноглобулина человека. Известные последовательности Ig человека описывают на веб-сайтах, доступных в сети интернет (www.), например, ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; atcc.org/phage/hdb.html; sciquest.com/; abcam.com/; antibodyresource.com/onlinecomp.html; public.iastate.edu/.about.pedro-/research_tools.html; mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; whfreeman.com/immunology-/CH05/kuby05.htm; library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody .html; hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; path.-cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks-/Immunology.html; immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; bio-tech.ufl.edu/.about.hcl/; pebio.com/pa/340913-/340913.html; nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; biodesign.com/table.asp; icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html; biotech.ufl.edu-/.about.fccl/protocol.html; isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; ibt.unam.mx/-vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; anti-body.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; unizh.ch/.about.honegger/AHO-seminar/Slide01.html; cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.-html; biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages-/Pept/spottech.html; jerini.de/frroducts.htm; patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), полностью включенное в настоящий документ в качестве ссылки. Такие заимствованные последовательности можно использовать для снижения иммуногенности или снижения, повышения или модификации связывания, аффинности, скорости прямой реакции, скорости обратной реакции, авидности, специфичности, времени полужизни или любой другой подходящей характеристики, как известно в этой области.

Каркасные остатки в каркасных областях человека можно заменять соответствующим остатком из CDR-донорного антитела для изменения, предпочтительно, улучшения, связывания антигена. Эти замены в каркасе идентифицируют способами, хорошо известными в этой области, например, моделированием взаимодействий CDR и каркасных остатков для определения каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнением последовательностей для определения необычных каркасных остатков в конкретных положениях. (См., например, патент США № 5585089 (Queen et al.); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988), включенные в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме). Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и хорошо известны специалистам в этой области. Доступны компьютерные программы, иллюстрирующие и демонстрирующие возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатов-последовательностей иммуноглобулинов. Осмотр этих изображений делает возможным анализ возможной роли остатков в функционировании вероятной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, влияющих на способность вероятного иммуноглобулина связывать свой антиген. Таким образом, можно выбирать и комбинировать остатки FR из консенсусных и заимствованных последовательностей таким образом, что достигают желаемой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность для антигенов-мишеней. В основном, остатки CDR напрямую и в большей степени вовлечены в воздействие на связывание антигена. Антитела можно гуманизировать с использованием множества способов, известных в этой области, таких как, в качестве неограничивающих примеров, описываемые в Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988), Sims et al., J. Immunol., 151 : 2296-2308 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151 : 2623-2632 (1993), Padlan, E.A., Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 :969-973 (1994); публикациях PCT №№ WO 91/09967, WO 99/06834 (PCT/US98/16280), WO 97/20032 (PCT/US96/18978), WO 92/11272 (PCT/US91/09630), WO 92/03461 (PCT/US91/05939), WO 94/18219 (PCT/US94/01234), WO 92/01047 (PCT/GB91/01134), WO 93/06213 (PCT/GB92/01755), WO90/14443, WO90/14424 и WO90/14430; европейских публикациях №№ EP 0592106, EP 0519596 и EP 0239400; патентах США №№ 5565332; 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539; и 4816567, включенных в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме, включая цитируемые в них ссылки.

C. Получение антител и продуцирующих антитела клеточных линий.

Предпочтительно, антитела против DLL4 по настоящему изобретению проявляют высокую способность снижать или нейтрализовывать ангиогенную активность опухоли, например, как оценивают любым из нескольких анализов in vitro и in vivo, известных в этой области. Например, эти антитела нейтрализуют взаимодействие DLL4 в пути передачи сигнала Notch с величинами IC₅₀ в DLL4 в диапазоне по меньшей мере приблизительно 10^-7 M или приблизительно 10^-8 M. Предпочтительно, антитела против DLL4 по настоящему изобретению также проявляют высокую способность снижать или нейтрализовывать активность DLL4.

В предпочтительных вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает DLL4 человека, где антитело или его антигенсвязывающая часть диссоциирует от DLL4 человека с константой скорости K_off приблизительно 0,1 с^-1 или менее, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса, или ингибирует активность DLL4 и/или DLL4 человека с IC₅₀ приблизительно 1 × 10^-6 Μ или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от DLL4 человека с константой скорости K_off приблизительно 1 × 10^-2 с^-1 или менее, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса, или может ингибировать DLL4 человека и/или активность DLL4 человека с IC₅₀ приблизительно 1 × 10^-7 Μ или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от DLL4 человека с константой скорости K_off приблизительно 1 × 10^-3 с^-1 или менее, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать DLL4 человека с IC₅₀ приблизительно 1 × 10^-8 Μ или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от DLL4 человека с константой скорости K_off приблизительно 1 × 10^-4 с^-1 или менее, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать активность DLL4 с IC₅₀ приблизительно 1 × 10^-9 Μ или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от DLL4 человека с константой скорости K_off приблизительно 1 × 10^-5 с^-1 или менее, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать DLL4 и/или активность DLL4 человека с IC₅₀ приблизительно 1 × 10^-10 Μ или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от DLL4 человека с константой скорости K_off приблизительно 1 × 10^-5 с^-1 или менее, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать DLL4 и/или активность DLL4 человека с IC₅₀ приблизительно 1 × 10^-11 Μ или менее.

В определенных вариантах осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. Предпочтительно, константная область тяжелой цепи является константной областью тяжелой цепи IgG1 или константной областью тяжелой цепи IgG4. Кроме того, антитело может содержать константную область легкой цепи, константную область легкой каппа-цепи или константную область легкой лямбда-цепи. Предпочтительно, антитело содержит константную область легкой каппа-цепи. Альтернативно, часть антитела может являться, например, Fab-фрагментом или одноцепочечным Fv-фрагментом.

Замены аминокислотных остатков в Fc-части для изменения эффекторной функции антитела известны в этой области (см. патенты США №№ 5648260 и 5624821 (Winter et al.)). Fc-часть антитела опосредует несколько важных эффекторных функций, например, стимуляцию цитокинов, ADCC, фагоцитоз, обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC) и время полужизни/скорость выведения антитела и комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях эти эффекторные функции являются желательными для терапевтического антитела, но в других случаях могут не являться необходимыми или даже являться вредными в зависимости от терапевтических целей. Конкретные изотипы IgG человека, в частности, IgG1 и IgG3, опосредуют ADCC и CDC через связывание с FcγRs и компонентом комплемента C1q, соответственно. Неонатальные Fc-рецепторы (FcRn) являются критическими компонентами, определяющими время полужизни циркулирующих антител. В другом варианте осуществления по меньшей мере один аминокислотный остаток заменяют в константной области антитела, например, Fc-области антитела, таким образом, что изменяют эффекторные функции антитела.

Один из вариантов осуществления относится к меченому связывающему белку, где антитело или часть антитела по изобретению дериватизируют или соединяют с другой функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком). Например, меченый связывающий белок по изобретению можно получать, функционально связывая антитело или часть антитела по изобретению (посредством химического соединения, генетического слияния, нековалентного соединения или иначе), с одной или более другими молекулярными структурами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектируемое средство, цитотоксическое средство, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, который может опосредовать соединение антитела или части антитела с другой молекулой (такой как коровая область стрептавидина или полигистидиновая метка).

Применимые детектируемые средства, с использованием которых можно дериватизировать антитело или часть антитела по изобретению, включают флуоресцентные соединения. Примеры флуоресцентных детектируемых средств включают флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталенсульфонилхлорид, фикоэритрин и т.п. Антитело также можно дериватизировать с использованием детектируемых ферментов, таких как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозоксидаза и т.п. Если антитело дериватизируют с использованием детектируемого фермента, то его определяют добавлением дополнительных реагентов, используемых ферментом для получения детектируемого продукта реакции. Например, если присутствует детектируемое средство пероксидаза хрена, добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к окрашенному продукту реакции, являющемуся детектируемым. Антитело также можно дериватизировать с использованием биотина и определять посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина.

Другой вариант осуществления изобретения относится к кристаллизованному DLL4-связывающему белку. Предпочтительно, изобретение относится к кристаллам DLL4-связывающих белков, приведенных в настоящем описании, включая целые антитела против DLL4, их фрагменты, а также конструкции антител и конъюгаты связывающих белков (включая конъюгаты антител), как приведено в настоящем описании, и составам и композициям, содержащим такие кристаллы. В одном из вариантов осуществления кристаллизованный связывающий белок имеет большее время полужизни in vivo, чем растворимый аналог связывающего белка. В другом варианте осуществления связывающий белок сохраняет биологическую активность после кристаллизации. Кристаллизованные связывающие белки по изобретению можно получать в соответствии с известными в этой области способами и как описывают в публикации PCT № WO 02/72636, включенной в настоящий документ в качестве ссылки.

Другой вариант осуществления изобретения относится к гликозилированному связывающему белку, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит один или более углеводных остатков. Образующийся in vivo белковый продукт может подвергаться дальнейшему процессингу, известному как посттрансляционная модификация. В частности, остатки сахара (гликозил) можно добавлять ферментативно, способом, известным как гликозилирование. Получаемые белки, несущие ковалентно связанные олигосахаридные боковые цепи, известны как гликозилированные белки или гликопротеины. Гликозилирование белка зависит от аминокислотной последовательности интересующего белка, а также клетки-хозяина, в которой экспрессируют белок. Различные организмы могут продуцировать различные ферменты гликозилирования (например, гликозилтрансферазы и гликозидазы) и иметь различные доступные субстраты (сахара нуклеотидов). По причине таких факторов профиль гликозилирования белка и композиция гликозильных остатков могут отличаться в зависимости от системы хозяина, в которой конкретный белок экспрессируется. Гликозильные остатки, применимые в изобретении, могут включать, в качестве неограничивающих примеров, глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, н-ацетилглюкозамин и сиаловую кислоту. Предпочтительно, гликозилированный связывающий белок содержит гликозильные остатки таким образом, что профиль гликозилирования принадлежит человеку.

Специалистам в этой области известно, что различное гликозилирование белка может приводить к различным характеристикам белка. Например, эффективность терапевтического белка, продуцируемого в микроорганизме-хозяине, таком как дрожжи, и гликозилированного с использованием эндогенного пути дрожжей может являться сниженной по сравнению с таковой того же белка, экспрессируемого в клетке млекопитающего, такой как клеточная линия CHO. Такие гликопротеины также могут являться иммуногенными для людей и демонстрировать сниженное время полужизни in vivo после введения. Специфичные рецепторы у людей и других животных могут распознавать специфичные гликозильные остатки и стимулировать быстрое выведение белка из кровотока. Другие неблагоприятные эффекты могут включать изменения фолдинга белка, растворимости, восприимчивости к протеазам, транспорта, компартментализации, секреции, распознавания другими белками или факторами, антигенности или аллергенности. Таким образом, практикующий специалист может предпочитать терапевтический белок со специфической композицией и профилем гликозилирования, например, идентичными композицией и профилем гликозилирования, или по меньшей мере схожими с таковыми, продуцируемыми в клетках человека или в видо-специфичных клетках определенного животного.

Экспрессию гликозилированных белков, отличающихся от таковой в клетке-хозяине, можно достигать генетической модификацией клетки-хозяина для экспрессии гетерологичных ферментов гликозилирования. С применением известных в этой области способов практикующий специалист может получать антитела или их антигенсвязывающие части, демонстрирующие гликозилирование белка человека. Например, штаммы дрожжей генетически модифицировали для экспрессии неприродных ферментов гликозилирования таким образом, что гликозилированные белки (гликопротеины), продуцируемые этими штаммами дрожжей, демонстрировали гликозилирование белка, идентичное таковому в клетках животных, особенно клетках человека (патентные заявки США №№ 2004/0018590 и 2002/0137134).

Кроме того, специалисту в этой области следует понимать, что интересующий белок можно экспрессировать с использованием библиотеки клеток-хозяев, генетически сконструированных для экспрессии различных ферментов гликозилирования, таким образом, что клетки-хозяева из библиотеки продуцируют интересующий белок с различными профилями гликозилирования. Затем практикующий специалист может выбирать и выделять интересующий белок с конкретными новыми профилями гликозилирования. Предпочтительно, белок, обладающий конкретным выбранным новым профилем гликозилирования, проявляет улучшенные или измененные биологические свойства.

D. Применение DLL4-связывающих белков.

Учитывая их способность связываться с DLL4 человека и DLL4 мыши, DLL4-связывающие белки, приведенные в настоящем описании, включая антитела и их части, можно использовать для определения или измерения DLL4 в образце (например, в смеси, растворе или биологическом образце, таком как кровь, сыворотка или плазма) с использованием любых общепринятых иммунологических анализов, известных в этой области, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) или иммуногистохимия ткани. Изобретение относится к способу определения DLL4 человека и/или DLL4 мыши в образце, включающему приведение образца в контакт с DLL4-связывающим белком и определение DLL4-связывающего белка, связавшегося с DLL4 человека и/или DLL4 мыши, или несвязавшегося связывающего белка, чтобы, таким образом, определять DLL4 человека и/или DLL4 мыши в образце. DLL4-связывающий белок, приведенный в настоящем описании, может являться прямо или косвенно меченым детектируемым веществом для облегчения определения связавшегося или несвязавшегося DLL4-связывающего белка. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетической группы включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламин флуоресцеин, данзилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; и примеры подходящего радиоактивного материала включают ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho или ¹⁵³Sm.

Биологические образцы, которые можно анализировать на предмет DLL4, включают мочу, кал, кровь, сыворотку, плазму, пот, слюну, мазок со слизистой оболочки рта (щеки, языка, глотки), вагинальный мазок, ректальный мазок, кожный мазок, кожный соскоб, биопсию ткани, а также любой другой образец ткани, который можно получать способами, доступными в этой области.

Альтернативно мечению связывающего белка, DLL4 человека можно анализировать в биологических жидкостях конкурентным иммунологическим анализом с использованием стандартов рекомбинантного DLL4 человека (rh), меченых детектируемым веществом, и немеченого DLL4-связывающего белка, приведенного в настоящем описании. В этом анализе комбинируют биологический образец, меченые стандарты rhDLL4 и DLL4-связывающий белок и определяют количество меченого стандарта rhDLL4, связавшегося с немеченым связывающим белком. Количество DLL4 человека в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта rhDLL4, связавшегося с DLL4-связывающим белком. Аналогично, DLL4 человека также можно анализировать в биологических жидкостях конкурентным иммунологическим анализом с использованием стандартов rhDLL4, меченых детектируемым веществом, и немеченого DLL4-связывающего белка, приведенного в настоящем описании.

DLL4-связывающие белки по изобретению, предпочтительно, способны нейтрализовывать активность DLL4, в частности, активность hDLL4 как in vitro, так и in vivo. Таким образом, такие связывающие белки по изобретению можно использовать для ингибирования активности DLL4, например, в культуре клеток, содержащей DLL4, у человека или другого млекопитающего, экспрессирующего DLL4, с которым перекрестно реагирует связывающий белок по изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу ингибирования активности DLL4, включающему приведение DLL4 в контакт с антителом против DLL4 или частью антитела по изобретению таким образом, что ингибируют активность DLL4. Например, в культуре клеток, содержащей или потенциально содержащей DLL4, антитело или часть антитела по изобретению можно добавлять в среду для культивирования для ингибирования активности DLL4 в культуре.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу снижения активности DLL4 у индивидуума, преимущественно, индивидуума, страдающего заболеванием или нарушением, при котором DLL4 или активность DLL4 наносит вред. Изобретение относится к способам снижения DLL4 или активности DLL4 у индивидуума, страдающего такими заболеваниями или нарушениями, включающим введение индивидууму DLL4-связывающего белка по изобретению таким образом, что снижают DLL4 или активность DLL4 у индивидуума. Предпочтительно, DLL4 является DLL4 человека, и индивидуум является человеком. Альтернативно, индивидуум может являться млекопитающим, экспрессирующим DLL4, с которым способен связываться DLL4-связывающий белок по изобретению. Кроме того, индивидуум может являться млекопитающим, в которое вводят DLL4 (например, введением DLL4 или экспрессией трансгена DLL4). Антитело или другой DLL4-связывающий белок по изобретению можно вводить человеку в терапевтических целях. Кроме того, DLL4-связывающий белок по изобретению можно вводить не принадлежащему человеку млекопитающему, экспрессирующему DLL4, с которым способен связываться связывающий белок, в ветеринарных целях или в качестве модели заболевания человека на животных. Учитывая последнее, такие модели на животных могут являться применимыми для оценки терапевтической эффективности антител и других DLL4-связывающих белков по изобретению (например, тестирования доз и периода действия после введения).

Как применяют в настоящем описании, термин "нарушение, при котором активность DLL4 и/или пути передачи сигнала Notch наносит вред" предназначен для включения заболеваний, таких как злокачественное новообразование, и других нарушений, при которых показано или предполагают, что наличие активности DLL4 и/или пути передачи сигнала Notch у страдающего нарушением индивидуума отвечает за патофизиологию нарушения или является фактором, участвующим в ухудшении нарушения. Таким образом, нарушение, при котором активность DLL4 и/или пути передачи сигнала Notch наносит вред, является нарушением, при котором ожидают, что снижение активности DLL4 и/или пути передачи сигнала Notch облегчает симптомы и/или прогрессирование нарушения (например, рост опухоли). Такие нарушения можно подтверждать, например, по повышению ангиогенеза у страдающего нарушением индивидуума (например, повышение концентрации различных белков, повышающихся, как известно в этой области, в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д. индивидуума в течение роста и образования опухоли), которое можно определять, например, с использованием антитела против DLL4, как описано выше. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить с использованием антител по изобретению, включают нарушения, описываемые ниже в разделе, относящемся к фармацевтическим композициям антител по изобретению.

II. Фармацевтические композиции и терапевтическое применение.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим DLL4-связывающий белок по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, содержащие DLL4-связывающие белки по изобретению, предназначены для применения, в качестве неограничивающих примеров, в диагностике, определении или мониторинге нарушения; в профилактике, лечении, контроле или облегчении нарушения или одного или более его симптомов; и/или в исследованиях. В конкретном варианте осуществления композиция содержит один или более DLL4-связывающих белков по изобретению. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит один или более связывающих белков по изобретению и одно или более профилактических или терапевтических средств, иных, чем связывающие белки по изобретению, для лечения нарушения, при котором DLL4 и/или активность DLL4 наносит вред. Предпочтительно, профилактические или терапевтические средства, о которых известно, что они применимы, или их применяют, или применяют в настоящее время в профилактике, лечении, контроле или облегчении нарушения, такого как злокачественное новообразование или опухоль, или одного или более его симптомов. По этим вариантам осуществления, композиция может дополнительно содержать носитель, дилюент или эксципиент.

Связывающие белки по изобретению можно включать в фармацевтические композиции, подходящие для введения индивидууму. Как правило, фармацевтическая композиция содержит DLL4-связывающий белок (или его DLL4-связывающую часть) по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Как применяют в настоящем описании, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, диспергенты, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и т.п., являющиеся физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более из воды, физиологического раствора, фосфатно-солевого буфера, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические средства, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать незначительные количества вспомогательных средств, таких как увлажнители или эмульгаторы, консерванты или буферы, повышающие срок годности или эффективность антитела или части антитела.

Известны различные системы доставки, и их можно использовать для введения одного или более DLL4-связывающих белков по изобретению или комбинации одного или более связывающих белков по изобретению и профилактического средства или терапевтического средства, применимого для профилактики, контроля, лечения или облегчения нарушения или одного или более его симптомов, например, снижения ангиогенеза в опухоли, инкапсуляции в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантных клетках, способных экспрессировать DLL4-связывающий белок, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu и Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987)), конструкции нуклеиновой кислоты, как часть ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения профилактического или терапевтического средства по изобретению включают, в качестве неограничивающих примеров, парентеральное введение (например, внутридермальное, внутримышечное, интраперитонеальное, внутривенное и подкожное), эпидуральное введение, внутриопухолевое введение и черезслизистое введение (например, интраназальное и пероральное введение). Кроме того, можно использовать ингаляционное введение, например, с использованием ингалятора или небулайзера, и состав с аэрозольными средствами. См., например, патенты США №№ 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540 и 4880078; и публикации PCT №№ WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, включенные в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. В одном из вариантов осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению, комбинированное терапевтическое средство или композицию по изобретению вводят с использованием ингаляционной технологии доставки лекарственных средств Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Massachusetts, US). В конкретном варианте осуществления профилактические или терапевтические средства по изобретению вводят внутримышечно, внутривенно, внутриопухолево, перорально, интраназально, ингаляционно или подкожно. Профилактические или терапевтические средства можно вводить любыми общепринятыми способами, например вливанием или болюсной инъекцией, посредством абсорбции через эпителий или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую оболочку рта, прямой кишки и кишечника и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может являться системным или местным.

В конкретном варианте осуществления желательным может являться введение профилактических или терапевтических средств по изобретению местно в область, нуждающуюся в лечении; этого можно достигать, например, в качестве неограничивающих примеров, местным вливанием, инъекцией или посредством имплантата из пористого или непористого материала, включая мембраны и матрицы, такие как силиконовые мембраны, полимеры, волокнистые матрицы (например, Tissuel®) или коллагеновые матрицы. В одном из вариантов осуществления эффективное количество одного или более DLL4-связывающих белков по изобретению вводят индивидууму местно в пораженную область для профилактики, лечения, контроля и/или облегчения нарушения или его симптома. В другом варианте осуществления эффективное количество одного или более DLL4-связывающих белков по изобретению вводят индивидууму местно в пораженную область в сочетании с эффективным количеством одного или более терапевтических средств (например, одним или более профилактическими или терапевтическими средствами), иными, чем связывающий белок по изобретению, для профилактики, лечения, контроля и/или облегчения нарушения или одного или более его симптомов.

В другом варианте осуществления профилактическое или терапевтическое средство можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением или замедленным высвобождением. В одном из вариантов осуществления для достижения контролируемого или замедленного высвобождения можно использовать инфузионный насос (см., Langer (Science, 249: 1527-1533 (1990)); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 201-240 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88: 507-516 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 574-579 (1989)). В другом варианте осуществления для достижения контролируемого или замедленного высвобождения терапевтических средств по изобретению можно использовать полимерные материалы. См., например, Goodson, J.M, In Medical Applications of Controlled Release. Vol. II. Applications and Evaluations. (Langer and Wise, eds.), (CRC Press Inc., Boca Raton, 1984), chapter 6, pages 115-138; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.) (Wiley, New York, 1984); Langer and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys., C23: 61-126 (1983); см. также, Levy et al., Science, 228: 190-192 (1985); During et al., Ann. Neurol, 25: 351-356 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71: 105-112 (1989); патенты США №№ 5679377; 5916597; 5912015; 5989463 и 5128326; и публикации PCT №№ WO 99/15154 и WO 99/20253. Примеры полимеров, используемых в составах с замедленным высвобождением включают, в качестве неограничивающих примеров, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловую кислоту), поли(сополимер этилена и винилацетата), поли(метакриловую кислоту), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), поли(сополимеры лактидов и гликолидов) (PLGA) и полиортоэфиры. В предпочтительном варианте осуществления полимер, используемый в составе с замедленным высвобождением, является инертным, несодержащим вымываемые примеси, стабильным при хранении, стерильным и биодеградируемым. В еще одном варианте осуществления систему с контролируемым или замедленным высвобождением можно помещать вблизи цели профилактики или терапии, таким образом, требуется часть системной дозы (см., например, Goodson, In Medical Applications of Controlled Release. (1984). pages 115-138).

Системы с контролируемым высвобождением описывают в обзоре Langer (Science, 249: 1527-1533 (1990)). Для получения составов с замедленным высвобождением, содержащим одно или более терапевтических средств по изобретению, можно использовать любой способ, известный специалисту в этой области. См., например, патент США № 4526938; публикации PCT №№ WO 91/05548 и WO 96/20698; Ning et al., "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiother. Oncol, 39: 179-189 (1996); Song et al., "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA J. Pharm. Sci.Tech., 50: 372-377 (1996); Cleek et al., "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Proceed. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24: 853-854 (1997), и Lam et al., "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proceed. Intl. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.: 24: 759-760 (1997), включенных в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

В конкретном варианте осуществления, где композиция по изобретению является нуклеиновой кислотой, кодирующей профилактическое или терапевтическое средство, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для стимуляции экспрессии кодируемого ею профилактического или терапевтического средства, конструируя ее как часть соответствующего экспрессирующего нуклеиновую кислоту вектора и вводя ее таким образом, что она становится внутриклеточной, например, с использованием ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или прямой инъекции, или с использованием бомбардировки микрочастицами (например, генной пушки; Biolistic, DuPont), или покрывая липидами, или поверхностными рецепторами клетки или средствами для трансфекции, или вводя ее в соединении с гомеобокс-подобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1864-1868 (1991)). Альтернативно, нуклеиновую кислоту можно вводить внутриклеточно и встраивать в ДНК клетки-хозяина для экспрессии посредством гомологичной рекомбинации.

Фармацевтическую композицию по изобретению составляют так, что она является совместимой с предполагаемым путем ее введения. Примеры путей введения включают, в качестве неограничивающих примеров, парентеральное (например, внутривенное), внутридермальное, подкожное, пероральное, интраназальное (например, ингаляцию), трансдермальное (например, местное), трансмукозальное и ректальное введение. В конкретном варианте осуществления композицию составляют в соответствии с общепринятыми способами как фармацевтическую композицию, адаптированную для внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или местного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения являются растворами в стерильном изотоничном водном буфере. При необходимости композиция также может включать солюбилизатор и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции.

Если композиции по изобретению предназначены для местного введения, композиции можно составлять в форме мази, крема, трансдермального пластыря, лосьона, геля, шампуня, спрея, аэрозоля, раствора, эмульсии или другой формы, хорошо известной специалисту в этой области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms. 19th ed. (Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1995). В случае нераспыляемых местных лекарственных форм, как правило, используют формы от вязких до полутвердых или твердых, содержащие носитель или один или более эксципиентов, совместимых с местным использованием и имеющих динамическую вязкость, предпочтительно, больше воды. Подходящие составы включают, в качестве неограничивающих примеров, растворы, суспензии, эмульсии, кремы, мази, порошки, линименты, бальзамы и т.п., при желании, стерилизуемых или смешиваемых со вспомогательными средствами (например, консерванты, стабилизаторы, увлажнители, буферы или соли) для воздействия на различные свойства, такие как, например, осмотическое давление. Другие подходящие местные лекарственные формы включают распыляемые аэрозольные препараты, где активный ингредиент, предпочтительно в сочетании с твердым или жидким инертным носителем, упаковывают в смеси с находящимся под давлением летучим веществом (например, газообразным пропеллентом, таким как FREON®) или в мягкой бутыли. При желании в фармацевтические композиции и лекарственные формы также можно добавлять увлажнители. Примеры таких дополнительных ингредиентов хорошо известны в этой области.

Если способ по изобретению включает интраназальное введение композиции, то композицию можно составлять в аэрозольной форме, спрее или в форме капель. В частности, профилактические или терапевтические средства для применения по настоящему изобретению общепринято можно выпускать в форме аэрозольного спрея из упаковок под давлением или небулайзера с использованием подходящего пропеллента (например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа). В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определять, используя клапан для выпуска измеренного количества. Капсулы и картриджи (состоящие, например, из желатина) для применения в ингаляторе или инсуффляторе можно составлять содержащими смесь порошков соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Если способ по изобретению включает пероральное введение, можно составлять пероральные композиции в форме таблеток, капсул, крахмальных капсул, желатиновых капсул, растворов, суспензий и т.п. Таблетки или капсулы можно получать общепринятыми способами с использованием фармацевтически приемлемых эксципиентов, таких как связывающие средства (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или фосфат дикальция); смазочные средства (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); разрыхлители (например, картофельный крахмал или крахмалгликолят натрия); или увлажнители (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки можно покрывать способами, хорошо известными в этой области. Жидкие препараты для перорального введения можно составлять в форме, в качестве неограничивающих примеров, растворов, сиропов или суспензий, или они могут представлять собой сухой продукт для разведения водой или другим подходящим средством перед использованием. Такие жидкие препараты можно получать общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитовый сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или гуммиарабик); неводные средства (например, миндальное масло, маслянистые сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты также при необходимости могут содержать буферные соли, ароматизаторы, красители и подсластители. Препараты для перорального введения можно соответствующим образом составлять для медленного высвобождения, контролируемого высвобождения или замедленного высвобождения профилактических или терапевтических средств.

Способ по изобретению может включать ингаляционное введение, например, с использованием ингалятора или небулайзера, композиции, составляемой с использованием аэрозольного средства. См., например, патенты США №№ 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540; и 4880078; и публикации PCT №№ WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, и WO 99/66903, включенные в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. В конкретном варианте осуществления антитело по изобретению, комбинированное терапевтическое средство и/или композицию по изобретению вводят с использованием технологии ингаляционной доставки лекарственных средств Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Massachusetts, US).

Способ по изобретению может включать введение композиции, составляемой для парентерального введения, посредством инъекции (например, болюсной инъекции или непрерывного вливания). Составы для инъекции могут находиться в стандартной лекарственной форме (например, в ампулах или в упаковке лекарственных средств для многократного приема) с добавленным консервантом. Композиции можно составлять в таких формах, как суспензии, растворы или эмульсии в маслянистых или водных средствах, и они могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для разведения перед использованием подходящим средством (например, стерильной несодержащей пирогены водой).

Способ по изобретению может дополнительно включать введение композиций, составляемых как депонируемые препараты. Такие составы длительного действия можно вводить посредством имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекции. Таким образом, например, можно составлять композиции с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, как эмульсии в применимом масле) или ионообменными смолами, или как труднорастворимые производные (например, как труднорастворимая соль).

Способы по изобретению включают введение композиций, составляемых как нейтральные или солевые формы. Фармацевтически приемлемые соли включают образуемые анионами, такими как полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и образуемые катионами, такими как полученные из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.

Как правило, ингредиенты в композициях предоставляют раздельно или смешивают вместе в стандартной лекарственной форме, например, как сухой лиофилизированный порошок или безводный концентрат в герметично запаянном контейнере, таком как ампула или саше, указывая количество активного средства. Если способ введения является вливанием, композицию можно распределять с использованием бутыли для вливаний, содержащую стерильную воду фармацевтической категории или физиологический раствор. Если способ введения является инъекцией, можно предоставлять ампулу стерильной воды для инъекций или физиологического раствора таким образом, что можно смешивать ингредиенты перед введением.

В частности, изобретение также относится к одному или более профилактическим или терапевтическим средствам или фармацевтическим композициям по изобретению, упакованным в герметично запаянный контейнер, такой как ампула или саше, указывая количество средства. В одном из вариантов осуществления одно или более профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению предоставляют как сухой стирилизованный лиофилизированный порошок или безводный концентрат в герметично запаянном контейнере и его можно разводить (например, водой или физиологическим раствором) до соответствующей концентрации для введения индивидууму. Предпочтительно, один или более профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению предоставляют как сухой стерильный лиофилизированный порошок в герметично запаянном контейнере при единице дозирования по меньшей мере 5 мг, более предпочтительно - по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг, по меньшей мере 75 мг или по меньшей мере 100 мг. Лиофилизированные профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по изобретению необходимо хранить при температуре от 2°C до 8°C в его исходном контейнере и профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по изобретению необходимо вводить в течение 1 недели, предпочтительно, в течение 5 дней, в течение 72 часов, в течение 48 часов, в течение 24 часов, в течение 12 часов, в течение 6 часов, в течение 5 часов, в течение 3 часов или в течение 1 часа после разведения. В альтернативном варианте осуществления одно или более профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению предоставляют в жидкой форме в герметично запаянном контейнере, указывая количество и концентрацию средства. Предпочтительно, жидкую форму вводимой композиции предоставляют в герметично запаянном контейнере в концентрации по меньшей мере 0,25 мг/мл, более предпочтительно, по меньшей мере 0,5 мг/мл, по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/кг, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл, или, по меньшей мере 100 мг/мл. Жидкую форму необходимо хранить при температуре от 2°C до 8°C в ее исходном контейнере.

Связывающие белки по изобретению можно включать в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Предпочтительно, связывающий белок будут получать как инъекционный раствор, содержащий 0,1-250 мг/мл антитела. Инъекционный раствор может состоять из жидкой или лиофилизированной лекарственной формы в сосуде бесцветного или желтого стекла, ампуле или предварительно заполненном шприце. Буфер может быть L-гистидиновым буфером (1-50 мМ), оптимально, 5-10 мМ, при pH от 5,0 до 7,0 (оптимально, pH 6,0). Другие подходящие буферы включают, в качестве неограничивающих примеров, сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. Хлорид натрия можно использовать для модификации токсичности раствора в концентрации 0-300 мМ (оптимально, 150 мМ для жидкой лекарственной формы). В случае лиофилизированной лекарственной формы можно включать криопротекторы, в основном, 0-10% сахарозы (оптимально, 0,5-1,0%). Другие подходящие криопротекторы включают трегалозу и лактозу. В случае лиофилизированной лекарственной формы можно включать объемообразующие средства, в основном, 1-10% маннита (оптимально, 2-4%). В жидких и лиофилизированных лекарственных формах можно использовать стабилизаторы, в основном, 1-50 мМ L-метионина (оптимально, 5-10 мМ). Другие подходящие объемообразующие средства включают глицин, аргинин, можно включать как 0-0,05% полисорбата-80 (оптимально, 0,005-0,01%). Дополнительные поверхностно-активные вещества включают, в качестве неограничивающих примеров, полисорбат-20 и поверхностно-активные вещества BRIJ.

Композиции по настоящему изобретению могут находиться во множестве форм. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и вливаний), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции находятся в форме растворов для инъекций и вливаний, таких как композиции, схожие с используемыми для пассивной иммунизации людей другими антителами. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, интраперитонеальный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления DLL4-связывающий белок, приведенный в настоящем описании, вводят внутривенным вливанием или инъекцией. В другом предпочтительном варианте осуществления DLL4-связывающий белок вводят внутримышечной или подкожной инъекцией.

Терапевтические композиции, как правило, должны являться стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно составлять как раствор, микроэмульсию, дисперсию, липосому или другую упорядоченную структуру, подходящую для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъецируемые растворы можно получать введением активного соединения (т.е. антитела или части антитела) в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией перечисленных выше ингредиентов, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии получают введением активного соединения в стерильное средство, содержащее основной диспергент и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных, лиофилизированных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сушка распылением, с использованием которых получают порошок активного ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из его предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Соответствующую текучесть раствора можно поддерживать, например, использованием покрытия, такого как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированную абсорбцию инъекционных композиций можно достигать включением в композицию средства, замедляющего абсорбцию, например, моностеаратных солей и желатина.

DLL4-связывающие белки по настоящему изобретению можно вводить множеством известных в этой области способов, хотя для многих терапевтических способов применения предпочтительным путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или вливание. Как будет понятно специалистам в этой области, путь и/или способ введения будет варьироваться в зависимости от желаемых результатов. В определенных вариантах осуществления активное соединение можно получать с использованием носителя, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, такого как состав с контролируемым высвобождением, включая импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких составов запатентованы или, как правило, известны специалистам в этой области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., (Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).

В определенных вариантах осуществления связывающий белок по изобретению можно вводить перорально, например, с использованием инертного дилюента или усваиваемого съедобного носителя. Соединение (и, при желании, другие ингредиенты) также можно заключать в твердые или мягкие желатиновые капсулы, прессовать в таблетки или вводить непосредственно в питание индивидуума. В случае перорального терапевтического введения соединения можно вводить с использованием эксципиентов и использовать в форме таблеток для приема внутрь, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, пластинок и т.п. Для введения соединения по изобретению иным, чем парентеральное введение, способом может являться необходимым покрывать соединение или вводить соединение совместно с материалом для предотвращения его инактивации.

В композиции также можно включать дополнительные активные соединения. В определенных вариантах осуществления связывающий белок по изобретению составляют и/или вводят совместно с одним или более дополнительными терапевтическими средствами, применимыми для лечения нарушений, при которых активность DLL4 наносит вред. Например, антитело против huDLL4 или часть антитела по изобретению можно составлять и/или вводить совместно с одним или более дополнительными антителами, связывающими другие мишени (например, антителами, связывающими другие цитокины или связывающими молекулы поверхности клетки). Кроме того, один или более связывающих белков по изобретению можно использовать в сочетании с двумя или более из упомянутых выше терапевтических средств. В таких способах комбинированного лечения преимущественно можно использовать более низкие дозы вводимых терапевтических средств, таким образом, избегая возможной токсичности или осложнений, связанных с различными способами монотерапии.

В определенных вариантах осуществления DLL4-связывающий белок по изобретению связан с увеличивающим время полужизни средством, известным в этой области. Такие средства включают, в качестве неограничивающих примеров, Fc-домен, полиэтиленгликоль и декстран. Такие средства описывают, например, в патенте США № 6660843 B1 и опубликованной публикации PCT № WO 99/25044, таким образом, включенных в качестве ссылок.

В конкретном варианте осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие связывающий белок по изобретению или другое профилактическое или терапевтическое средство по изобретению, вводят для лечения, профилактики, контроля или облегчения нарушения или одного или более его симптомов посредством генотерапии. Генотерапия относится к терапии, осуществляемой введением индивидууму экспрессирующейся или экспрессируемой нуклеиновой кислоты. В этом варианте осуществления изобретения с использованием нуклеиновых кислот получают кодируемый ими связывающий белок или профилактическое или терапевтическое средство по изобретению, опосредующие профилактический или терапевтический эффект.

Любые способы генотерапии, доступные в этой области, можно использовать по настоящему изобретению. Для общего обзора способов генотерапии см. Goldspiel et al., Clin. Pharmacy, 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy, 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science, 260: 926- 932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem., 62: 191-217 (1993); Robinson, C., Trends Biotechnol., 11(5): 155 (1993). Общеизвестные в этой области способы технологии рекомбинантных ДНК, которые можно использовать, описывают в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, (Stockton Press, New York, 1990). Подробное описание различных способов генотерапии описывают в патентной заявке США №. 20050042664 A1, включенной в настоящий документ в качестве ссылки.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения (например, излечения, супрессии, облегчения, замедления или профилактики начала или профилактики рецидива) или профилактики связанной с DLL4 опухоли у индивидуума. Способ включает введение индивидууму DLL4-связывающего белка, например, антитела против DLL4 или его фрагмента, как приведено в настоящем описании, в количестве, достаточном для лечения или профилактики связанной с DLL опухоли или злокачественного новообразования. Антагонист DLL4, т.е. антитело против DLL4 или его фрагмент, можно вводить индивидууму отдельно или в сочетании с другими терапевтическими средствами, как приведено в настоящем описании. DLL4 играет критическую роль в патологии, связанной со многими заболеваниями, вовлекающими иммунные и воспалительные элементы, в частности, злокачественных новообразованиях и ангиогенезе в опухоли. Примеры связанных с DLL4 нарушений включают, в качестве неограничивающих примеров, нарушения, неблагоприятно влияющие на следующие биологические процессы: функционирование и развитие нейронов; стабилизацию развития эндотелия артерий и ангиогенеза; регуляцию ключевых событий в образовании межклеточных контактов между эндокардом и миокардом в течение образования зародышевого клапана и развития и дифференцировки желудочков; гомеостаз сердечных клапанов, а также осложнения других нарушений у человека, вовлекающих сердечнососудистую систему; своевременную специализацию клеточных линий эндокринной и экзокринной частей поджелудочной железы; влияние на бинарный выбор при развитии клеток, которые должны выбирать между секреторной и всасывающей линией клеток в кишечнике; увеличение компартмента гемопоэтических стволовых клеток при развитии костной ткани и участие в коммитировании остеобластической линии, таком как остеопороз; регуляцию выбора развития клеток в молочных железах на нескольких отдельных стадиях развития; и конкретные неклеточные механизмы, такие как контроль актинового цитоскелета посредством тирозинкиназы Abl. Более конкретно, связанные с DLL4 нарушения включают, в качестве неограничивающих примеров, злокачественные новообразования, T-ALL (T-клеточный острый лимфобластный лейкоз), CADASIL (церебральная аутосомно-доминантная артериопатия с подкорковыми инфарктами и лейкоэнцефалопатией), MS (рассеянный склероз), тетраду Фалло (TOF) и синдром Алажиля (AS), дегенерацию желтого пятна и заболевания, связанные с возрастной дегенерацией желтого пятна, и другие ангиогенез-независимые и -зависимые заболевания, отличающиеся аномальной экспрессией или активностью DLL4.

Предпочтительно, DLL4-связывающие белки, такие как антитела и их антигенсвязывающие части, как приведено в настоящем описании, используют для лечения злокачественных новообразований и опухолей.

Связывающие белки по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации, т.е. нескольких DLL4-связывающих белков, приведенных в настоящем описании, для лечения злокачественного новообразования, опухоли или другого нарушения, при котором связывание, ингибирование и/или нейтрализацию DLL4 считают желательной или иным образом благоприятной для здоровья индивидуума.

Следует понимать, что DLL4-связывающие белки по изобретению также можно использовать отдельно или в сочетании с дополнительным средством, например, терапевтическим средством, выбранным практикующим специалистом по назначению. Например, дополнительное средство может являться терапевтическим средством, считающимся в этой области применимым для лечения злокачественного новообразования, опухоли или другого заболевания или состояния, при котором связывание или ингибирование DLL4 считают желательным или благоприятным для лечения злокачественного новообразования, опухоли или другого заболевания или состояния. Дополнительное средство также может являться средством, придающим терапевтической композиции благоприятное свойство, например, средством, действующим на вязкость композиции.

Также следует понимать, что комбинации, предназначенные для включения в настоящее изобретение, являются комбинациями, применимыми по назначению. Указанные ниже средства приведены в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения изобретения. Комбинации, являющиеся частью настоящего изобретения, могут представлять собой антитела по настоящему изобретению и по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из приведенного ниже списка. Комбинация также может включать несколько дополнительных средств, например, два или три дополнительных средства, если комбинация является таковой, что образуемая композиция может выполнять свою предполагаемую функцию.

Предпочтительные комбинации терапевтических средств могут противодействовать друг другу в различных точках туморогенных или проангиогенных путей передачи сигнала. Предпочтительные примеры терапевтических средств, применимых в способах и композициях по изобретению, включают противоопухолевые средства, лучевую терапию и химиотерапию, например, ДНК-алкилирующие средства, цисплатин, карбоплатин, антитубулиновые средства, паклитаксел, доцетаксел, таксол, доксорубицин, гемцитабин, гемзар, антрациклины, адриамицин, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, 5-фторурацил (5-FU), лейковорин, иринотекан, ингибиторы тирозинкиназного рецептора (например, эрлотиниб, гефитиниб), ингибиторы COX-2 (например, целекоксиб) и ингибиторы киназ.

DLL4-связывающие белки по изобретению также можно вводить в сочетании со средствами, такими как метотрексат, 6-MP, азатиоприн, сульфасалазин, месалазин, олсалазин хлорохин/гидроксихлорохин, пеницилламин, ауротиомалат (внутримышечный и пероральный), азатиоприн, колхицин, кортикостероиды (пероральные, ингаляционные и для местной инъекции), агонисты бета-2 адренорецепторов (сальбутамол, тербуталин, салметерол), ксантины (теофиллин, аминофиллин), кромогликат, недокромил, кетотифен, ипратропий и окситропий, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолата мофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозиновых рецепторов, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, препятствующие передаче сигнала посредством провоспалительных цитокинов, таких как TNFα или IL-1 (например, ингибиторы киназ IRAK, NIK, IKK, p38 или MAP), ингибиторы IL-1β-превращающего фермента, ингибиторы TNFα-превращающего фермента (TACE), ингибиторы T-клеточной передачи сигнала, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75 и производные p75TNFRIgG (Enbrel™) и p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ), целекоксиб, фолиевая кислота, гидроксихлорхин сульфат, рофекоксиб, этанерцепт, инфликсимаб, напроксен, валдекоксиб, сульфасалазин, метилпреднизолон, мелоксикам, метилпреднизолон ацетат, ауротиомалат натрия, аспирин, триамцинолона ацетонид, пропоксифена напсилат/ацетаминофен, фолат, набуметон, диклофенак, пироксикам, этодолак, диклофенак натрия, оксапрозин, оксикодона гидрохлорид, гидрокодона битартрат/ацетаминофен, диклофенак натрия/мизопростол, фентанил, рекомбинантный рецепторный антагонист IL-1 человека анакинра, трамадола гидрохлорид, сальсалат, сулиндак, цианокобаламин/фолиевая кислота/пиридоксин, ацетаминофен, аледронат натрия, преднизолон, морфина сульфат, лидокаин гидрохлорид, индометацин, глюкозамин сульфат/хондроитин, амитриптилина гидрохлорид, сульфадиазин, оксикодона гидрохлорид/ацетаминофен, олопатадина гидрохлорид, мизопростол, напроксен натрия, омепразол, циклофосфамид, ритуксимаб, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, антитело против IL-18, антитело против IL-15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, рофлумиласт, IC-485, CDC-801 и мезопрам.

Неограничивающие примеры терапевтических средств для злокачественных новообразований, с которыми можно вводить или использовать в комбинации DLL4-связывающий белок по изобретению, включают следующие: буденозид; эпидермальный фактор роста; сульфасалазин; аминосалицилаты; 6-меркаптопурин; азатиоприн; метронидазол; ингибиторы липоксигеназы; месаламин; олсалазин; балсалазид; антиоксиданты; ингибиторы тромбоксана; антагонисты рецептора IL-1; моноклональные антитела против IL-1β; моноклональные антитела против IL-6; факторы роста; ингибиторы эластазы; пиридинил-имидазольные соединения; и антитела или антагонисты других цитокинов или факторов роста человека, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать с антителами к молекулам поверхности клетки, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 или их лигандам.

Другие примеры терапевтических средств, с которыми можно комбинировать DLL4-связывающий белок по изобретению, включают следующие: антагонисты TNF, например, антитела против TNF, D2E7 (публикация PCT № WO 97/29131; HUMIRA®), CA2 (РЕМИКЕЙД®), CDP 571, конструкции TNFR-Ig (p75TNFRIgG (ENBREL®) и p55TNFRIgG (LENERCEPT)) и ингибиторы PDE4. Связывающие белки по изобретению можно комбинировать месаламином, преднизоном, азатиоприном, меркаптопурином, инфликсимабом, метилпреднизолона натрия сукцинатом, дифеноксилатом/сульфатом атропина, лоперамида гидрохлоридом, метотрексатом, омепразолом, фолатом, ципрофлоксацин/декстроза-вода, гидрокодона битартратом/ацетаминофеном, тетрациклина гидрохлоридом, флуоцинонидом, метронидазолом, тимеросалом/борной кислотой, холестирамином/сахарозой, ципрофлоксацина гидрохлоридом, гиосциамина сульфатом, меперидина гидрохлоридом, мидазолама гидрохлоридом, оксикодона гидрохлоридом/ацетаминофеном, прометазина гидрохлоридом, фосфатом натрия, сульфаметоксазолом/триметопримом, целекоксибом, поликарбофилом, пропоксифена напсилатом, гидрокортизоном, мультивитаминами, балсалазидом динатрия, кодеина фосфатом/ацетаминофеном, колесевелама гидрохлоридом, цианокобаламином, фолиевой кислотой, левофлоксацином, метилпреднизолоном, натализумабом и интерфероном-гамма.

Неограничивающие примеры терапевтических средств, с которыми можно комбинировать связывающий белок по изобретению, включают следующие: аспирин, нитроглицерин, изосорбида мононитрат, метопролола сукцинат, атенолол, метопролол тартрат, амлодипина бесилат, дилтиазема гидрохлорид, изосорбида динитрат, клопидогрела бисульфаты, нифедипин, аторвастатин кальция, хлорид калия, фуросемид, симвастатин, верапамил гидрохлорид, дигоксин, пропранолола гидрохлорид, карведилол, лизиноприл, спиронолактон, гидрохлортиазид, эналаприла малеат, надолол, рамиприл, эноксапарин натрия, гепарин натрия, валсартан, соталола гидрохлорид, фенофибрат, эзетимиб, буметанид, лозартан калия, лизиноприл/гидрохлортиазид, фелодипин, каптоприл и бисопролола фумарат.

Фармацевтические композиции по изобретению могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" связывающего белка по изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество связывающего белка может определять специалист в этой области, и оно может варьироваться в зависимости от факторов, таких как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, и способности связывающего белка вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также является количеством, при котором любые токсические или вредные эффекты связывающего белка перевешиваются терапевтически положительным воздействием. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, т.к. профилактическую дозу используют у индивидуума до развития заболевания или на его ранней стадии, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.

Для достижения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа) можно регулировать режимы дозирования. Например, можно вводить однократный болюс, можно вводить несколько разделенных доз в течение периода времени или дозу можно пропорционально снижать или повышать, на что указывают условия терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно составлять парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для облегчения введения и единообразия доз. Как применяют в настоящем описании, стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных доз для подвергаемых лечению млекопитающих; каждая единица содержит заранее определенное количество активного вещества, вычисляемого для получения желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация стандартных лекарственных форм по изобретению продиктована и напрямую зависит от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного достигаемого терапевтического или профилактического эффекта и (b) ограничений, присущих этой области составления такого активного соединения для лечения восприимчивости у индивидуумов.

Неограничивающим примером диапазона терапевтически или профилактически эффективного количества DLL4-связывающего белка по изобретению является 0,1-20 мг/кг, более предпочтительно, 1-10 мг/кг. Следует отметить, что величины доз могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести подлежащего облегчению состояния. Также следует понимать, что для любого конкретного индивидуума, необходимо корректировать конкретные режимы дозирования в течение времени в соответствии с потребностями индивидуума и профессионального мнения лица, вводящего или руководящего введением композиций, и что приведенные в настоящем описании диапазоны доз являются исключительно примерами и не предназначены для ограничения объема или практического осуществления заявляемой композиции.

III. Применение в иммунологических способах.

Любой из множества форматов иммунологических анализов можно адаптировать для применения DLL4-связывающего белка по изобретению для применения в определении DLL4, присутствующего в смеси, растворе или биологическом образце. Такие форматы иммунологических анализов включают, в качестве неограничивающих примеров, радиоиммунологический анализ (RIA), иммунопреципитацию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноблоттинг (например, вестерн-блоттинг), иммунострипы (например, тест-полоски), содержащие DLL4-связывающий белок по изобретению, адсорбированный или иммобилизованный на субстрате, активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS) и т.п. DLL4-связывающий белок, приведенный в настоящем описании, можно адсорбировать или иммобилизировать на субстрате, например, частице смолы или другом материале, для применения в колонке для аффинной хроматографии или любом другом формате аффинной хроматографии, доступном в этой области, для выделения DLL4 из образца. Определение DLL4 с использованием DLL4-связывающего белка по изобретению можно осуществлять in vitro в смеси, растворе или биологическом образце. Биологический образец, который можно приводить в контакт с DLL4-связывающим белком по изобретению для определения или измерения DLL4 в образце, включает, в качестве неограничивающих примеров, мочу, слюну, мазок со слизистой оболочки ротовой полости (буккальный, лингвальный мазок или мазок из зева), кожный мазок, кожный соскоб, ректальный мазок, вагинальный мазок, образец цельной крови, образец плазмы, образец сыворотки, биопсию ткани и любой другой образец, получаемый от индивидуума известным в этой области способом. В другом варианте осуществления DLL4-связывающий белок можно использовать для определения DLL4 in vivo, например, в различных способах томографии и сканирования, включая, в качестве неограничивающих примеров, компьютерную томографию (КТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ) и позитрон-эмисионную томографию (ПЭТ).

Специалистам в этой области будет очевидно, что другие подходящие модификации и адаптации способов по изобретению, приведенных в настоящем описании, являются очевидными, и их можно осуществлять с использованием подходящих эквивалентов без отклонения от объема изобретения или вариантов осуществления, приведенных в настоящем описании. Подробно описав настоящее изобретение, его будет легче понять на основе следующих примеров, включенных исключительно в иллюстративных целях и не предназначенных для ограничения изобретения.

Примеры

Пример 1: Анализы in vitro, используемые для определения функциональной активности антитела против DLL4.

Пример 1.1: Определение аффинности с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса BIACORE®.

В анализе поверхностного плазмонного резонанса BIACORE® (Biacore, Inc., Piscataway, New Jersey, US) определяют аффинность антител с использованием кинетических измерений скорости прямой реакции и скорости обратной реакции. Связывание антител против DLL4 с очищенным рекомбинантным внеклеточным доменом (ECD) DLL4 определяли посредством измерений на основе поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore® (Biacore 2000, Biacore 3000 или Biacore T100; GE Healthcare, Piscataway, New Jersey, US) с использованием подвижного буфера HBS-EPB (10 мМ HEPES [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,1 мг/мл BSA и 0,005% поверхностно-активного вещества P20) при 25°C. Например, приблизительно 9000 RU поликлонального антитела козла против Fc человека (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, Illinois, US), разбавленного в 10 мМ ацетата натрия (pH 4,5), непосредственно иммобилизовали по всему исследовательскому биосенсорному чипу CM5 с использованием стандартного набора для иммобилизации по аминогруппе по инструкциям и способам производителя в концентрации 25 мкг/мл. Непрореагировавшие вещества на поверхности биосенсора блокировали этаноламином. Для кинетического анализа уравнения скорости реакции, полученные из модели связывания Ленгмюра 1:1, подбирали одновременно для многократных инъекций антигена (с использованием global fit analysis) с использованием Scrubber 2 (BioLogic Software), программного обеспечения Biacore Biaevaluation 4.0.1 или программного обеспечения Biacore Τ100 Evaluation. Очищенные антитела разбавляли подвижным буфером для иммобилизации по всей реакционной поверхности с антителом козла против Fc человека. Антитела, подвергаемые иммобилизации в качестве лиганда (1 мкг/мл), инъецировали на реакционные матрицы при скорости потока 10 мкл/мин. В течение анализа все измерения сравнивали с поверхностью для иммобилизации в отдельности (т.е. без иммобилизованного антитела против DLL4). Константы скорости ассоциации и диссоциации K_on (М^-1с^-1) и K_off (с^-1) определяли при постоянной скорости потока 80 мкл/мин. Получали константы скорости, осуществляя кинетические измерения связывания при различных концентрациях антигена в диапазоне 1,23-900 нМ, в качестве 3-кратной серии разведений, и включенных инъекциях исключительно буфера (для использования в целях двойного сравнения). Затем равновесную константу диссоциации K_D (M) в реакции между антителами и антигеном-мишенью вычисляли из констант скорости реакции по следующей формуле: K_D=K_off/K_on. Связывание записывали как функцию времени и вычисляли кинетические константы скорости. В этом анализе можно измерять такие высокие скорости прямых реакций, как 10⁶ M^-1с^-1, и такие низкие скорости обратных реакций, как 10^-6 с^-1.

Пример 1.2: Связывание антител против DLL4 с растворимым внеклеточным доменом DLL4, определяемое посредством ELISA.

Способ 1 (ELISA с захватом).

96-луночные планшеты Nunc-Immuno (№439454) покрывали 5 мкг/мл антитела против IgG человека (специфичного к Fcg-фрагменту, Jackson ImmunoResearch, №109-005-098, 100 мкл/лунку) в D-PBS (Gibco №14190) и инкубировали в течение ночи при 4°C. Планшеты для ELISA промывали 3 раза промывочным буфером (PBS, 0,05% Tween-20), а затем блокировали 200 мл/лунку блокирующего буфера (D-PBS, 1% BSA, 1 мМ CaCl₂, 0,05% Tween-20) в течение 1 часа при 25°C. Планшеты промывали 3 раза и инкубировали с 100 мкл/лунку антител против DLL4 (0,0001-100 нМ, 10-кратное серийное разведение в блокирующем буфере) в течение 1 часа при 25°C, а затем снова промывали 3 раза. Планшеты, содержащие иммобилизованное антитело против DLL4, инкубировали с меченным биотином внеклеточным доменом DLL4 человека (10 нМ в блокирующем буфере, 100 мкл/лунку) в течение 1 часа при 25°C, промывали 3 раза и инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с HRP (KPL №474-3000, разведение в блокирующем буфере 1:10000, 100 мкл/лунку) в течение 1 часа при 25°C. После конечного промывания планшеты инкубировали с 100 мкл/лунку субстрата для ELISA (1-Step Ultra TMB-ELISA, Pierce №340280). Реакцию останавливали после 2 минут при 25°C с использованием 100 мкл/лунку 2 Н H₂SO₄ и считывали поглощение при 450 нм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и описывали значения EC₅₀.

Способ 2 (Планшет с медным покрытием).

96-луночные планшеты с медным покрытием (Thermo Scientific №15143) 3 раза промывали промывочным буфером (PBS, 0,05% Tween-20) перед использованием и затем инкубировали с 100 мкл/лунку внеклеточного домена рекомбинантного DLL4 (ECD) с полигистидиновой меткой 6xHis ("6xHis" описывают как SEQ ID NO:206) в концентрации 1 мкг/мл в PBS, 1 час при 25°C при встряхивании. Затем планшеты промывали 3 раза. Затем на планшет добавляли 100 мкл/лунку рекомбинантных химерных антител крысы/человека или рекомбинантных антител человека против DLL4 (0,00164-27 нМ, 4-кратное серийное разведение в буфере для ELISA=PBST, 10% Superblock (Pierce №37515)) в течение 1 часа при 25°C при встряхивании и затем снова промывали 3 раза. Планшеты инкубировали с антителом козла против человека с HRP (Pierce №31412) (разведение в буфере для ELISA 1:40000, 100 мкл/лунку) в течение 1 часа при 25°C при встряхивании, затем промывали 3 раза. После конечного промывания планшеты инкубировали с 100 мкл/лунку субстрата для ELISA (Sigma №T8665). Реакцию останавливали после 8 минут при 25°C с использованием 100 мкл/лунку 1 Н HCl и считывали поглощение при 450 нм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и описывали значения EC₅₀.

Пример 1.3: Связывание моноклональных антител против DLL4 с поверхностями линий опухолевых клеток человека, анализируемое посредством проточной цитометрии (FACS).

Стабильные линии клеток, гиперэкспрессирующие DLL4 на поверхности клетки, собирали из флаконов для тканевых культур, промывали четыре раза и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 1% бычий сывороточный альбумин и 1 мМ CaCl₂ (буфер для FACS). 1,5 × 10⁵ клеток инкубировали с антителами при различных концентрациях в буфере для FACS в течение 60 минут на льду. Клетки промывали дважды и добавляли 50 мкл R-фикоэритрин-конъюгированного антитела против IgG крысы, F(ab')₂-фрагмент (разведение в буфере для FACS 1:200) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, кат. № 112-116-072). После инкубации на льду (4°C, 60 минут) клетки промывали три раза и ресуспендировали в буфере для FACS. Флуоресценцию измеряли с использованием Becton Dickinson FACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, California, US). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и описывали величины EC₅₀ как концентрацию антитела, при которой достигают 50% от максимального связывания антител против DLL4 с экспрессирующими DLL4 клетками.

Пример 1.4: Ингибирование взаимодействия Notch-1 с растворимым внеклеточным доменом DLL4 антителами против DLL4 (конкурентный ELISA).

96-луночные планшеты Nunc-Immuno (№439454 для ELISA с huDLL4) и 96-луночные планшеты Costar (№9018 для ELISA с muDLL4) покрывали 16 нМ Notch-1 человека (R&D Systems №3647-TK, 100 мкл/лунку в D-PBS) и инкубировали в течение ночи при 4°C. Затем планшеты промывали 3 раза промывочным буфером (PBS, 0,05% Tween-20) и блокировали 200 мкл/лунку блокирующего буфера (D-PBS, 1% BSA, 1 мМ CaCl₂, 0,05% Tween-20) в течение 1 часа при 25°C. В течение блокирования меченый биотином внеклеточный домен DLL4 (14 нМ) смешивали с антителом (30 pM-66 нМ, 3-кратное серийное разведение в блокирующем буфере) в течение 1 часа при 25°C при встряхивании. Планшеты для анализа после блокирования промывали и инкубировали со смесями DLL4/антитело (100 мкл/лунку, 1 час при 25°C при встряхивании). Планшеты снова промывали и добавляли 100 мкл/лунку стрептавидина, конъюгированного с HRP (Fitzgerald №65R-S104PHRPx, разведенного 1:5000 в блокирующем буфере) в течение 1 часа при 25°C при встряхивании. После конечного промывания планшеты обрабатывали с использованием 100 мкл/лунку субстрата (TMB Sigma №T8665), реакцию останавливали с использованием 100 мкл/лунку 1 Н HCl и считывали поглощение при 450 нм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и описывали величины IC₅₀ как концентрацию антитела, при которой достигают 50% снижения связывания DLL4 с Notch 1.

Пример 1.5: Блокирование связывания растворимого Notch с DLL4-гиперэкспрессирующими клетками 293G моноклональными антителами против DLL4, анализируемое посредством проточной цитометрии (конкурентная FACS).

Анализ блокирования Notch: В кратком изложении, стабильные линии клеток, гиперэкспрессирующие DLL4 на поверхности клеток, собирали из флаконов для тканевых культур и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 1% бычий сывороточный альбумин и 1 мМ CaCl₂ (буфер для FACS). Клетки HEK293G-DLL4 наносили на 96-луночный планшет (v-донный) в концентрации 1,5 × l0⁵ клеток/лунку в буфере для FACS. После центрифугирования клеток и сливания супернатанта в каждую лунку добавляли 50 мкл очищенного IgG в соответствующем разведении и инкубировали на льду при 4°C в течение 60 минут с последующим добавлением 50 мкл/лунку Notch 1-биотина в концентрации 0,2 мкг/мл для DLL4 человека-293G или 2,0 мкг/мл для DLL4 мыши-293G (1,0 или конечная концентрация 0,1 мкг/мл) для дополнительной инкубации в течение 1 часа на льду при 4°C. После промывания клеток два раза буфером для FACS добавляли 50 мкл R-фикоэритрин-конъюгированного стрептавидина (разведение в буфере для FACS 1:150) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, кат. № 016-110-084). После инкубации на льду (4°C, 60 минут), клетки промывали три раза и ресуспендировали в буфере для FACS. Флуоресценцию измеряли с использованием Becton Dickinson FACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, CA). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и описывали величины IC₅₀ как концентрацию антитела, при которой достигают 50% снижения связывания Notch1 с экспрессирующими DLL4 клетками.

Пример 1.6: Ингибирование DLL4-зависимой активации Notch в клетках EA.hy926 антителами против DLL4 с использованием репортерного анализа Notch.

96-луночные черные планшеты с прозрачным дном для культивирования тканей засевали в течение ночи сконструированными клетками EA.hy926 (7000 клеток/лунку), экспрессирующими люциферазу, запускаемую Notch-чувствительным промотором. Антитела, серийно разведенные от 200 нМ, смешивали в течение 15 минут с равным объемом 5000 клеток HEK293G/лунку, экспрессирующих полноразмерный DLL4. Клетки 293G/DLL4 совместно культивировали с Notch-репортерными клетками EA.hy926 в течение 24 часов в присутствии тестируемых антител. Активность люциферазы анализировали с использованием субстрата Promega (Promega № E2940). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и описывали величины IC₅₀ как концентрацию антитела, при которой достигают 50% снижения индуцируемой DLL4 активации Notch.

Пример 1.7: Аналитические способы описания физико-химических свойств.

Способ осаждения PEG.

Использование PEG для разделения фаз твердого белка в соответствии с принципами исключения объема представляет собой применимый подход для оценки растворимости белка. PEG обладает несколькими преимуществами относительно других осадителей, включая минимальную денатурацию белков при температуре окружающей среды (не влияет на третичную структуру белков), и в диапазоне от 4°C до 30°C не требуется температурный контроль, т.е. исследования осаждения можно осуществлять при температуре окружающей среды на лабораторном столе.

Как правило, осаждение белков посредством PEG объясняют на основе эффектов исключения объема. Согласно этой теории белки стерически исключаются из областей растворителя, занятых линейными цепями PEG. В результате, белки концентрируются и в конечном итоге осаждаются при превышении их растворимости. В терминах термодинамики стерическое исключение приводит к повышению химического потенциала белка, пока он не превысит потенциал в чистом твердом состоянии, что приводит к осаждению белка. В основном, это происходит из-за обширной отрицательной свободной энергии взаимодействия между PEG и белками, снижающей предпочтительную гидратацию белка по причине эффектов стерического исключения. В водных растворах предпочтительная гидратация помогает поддерживать нативную структуру белков. Как правило, показано, что исключение по объему становится более эффективным с повышением молекулярной массы PEG, т.е. необходимо меньше PEG для осаждения белков с повышением молекулярной массы PEG.

Для оценки растворимости антител, включенных в настоящий патент, выбирали PEG с молекулярной массой 3000. 50% раствор PEG получали растворением PEG в деионизированной воде в соотношении один грамм PEG на 1 мл воды. Затем раствор PEG добавляли в раствор антитела, исходно находящегося в концентрации, равной 0,5 мг/мл, и объеме 0,5 мл. Раствор PEG непрерывно добавляли и перемешивали до первого появления устойчивого помутнения. Процентную долю PEG 3000, необходимую, чтобы вызывать это осаждение, вычисляли как (50) × (объем добавляемого раствора PEG 3000)/(исходный объем раствора антитела до добавления PEG).

Необходимую для осаждения процентную долю PEG 3000 сравнивали с процентной долей, необходимой для осаждения белка с известной растворимостью в воде. Например, растворимость в воде адалимумаба превышает 200 мг/мл. Таким образом, если процентная доля PEG 3000, необходимая для осаждения интересующего белка, является схожей с процентной долей, необходимой для осаждения адалимумаба, то прогнозируемая растворимость этого белка будет схожей с растворимостью адалимумаба.

Способ определения действительной растворимости.

Действительную растворимость определяют с использованием центрифужных фильтров Amicon для концентрирования белка в растворе до наблюдения осаждения белка из раствора или до достижения минимального объема, до которого можно концентрировать белок в фильтре. В последнем случае центрифужный фильтр Amicon 15 мл имеет минимальный объем ~50 мкл, в то время как центрифужный фильтр Amicon 4 мл имеет минимальный объем ~15 мкл.

Сначала белок диализировали в специальные составы. Для этих исследований количество антитела составляло 10 мг или намного меньше. Затем раствор белка помещали в камеру для ретентата центрифужного фильтра Amicon. Камеру выстилали нитроцеллюлозной мембраной, позволяющей молекулам менее чем от 10 до 30 кДа проходить под воздействием центробежной силы. Антитела, как правило, составляющие больше 140 кДа, оставались, в то время как вода, молекулы буфера, небольшие эксципиенты и соли проходили через мембрану. Затем центрифужный фильтр центрифугировали по инструкциям производителя до наблюдения осаждения белка из раствора или до достижения минимального объема, до которого можно концентрировать белок в фильтре.

После центрифугирования раствор белка удаляли из камеры для ретентата и измеряли концентрацию по поглощению УФ. Затем раствор хранили при 25°C и 5°C в течение от 1 до 2 дней и проверяли на признаки осаждения.

Способ измерения кругового дихроизма в ближней УФ-области.

Спектроскопия с измерением кругового дихроизма в ближней УФ-области предоставляет важную информацию о третичной структуре белков и является одним из наиболее используемых способов в этой области. Круговой дихроизм (КД (CD)) относится к дифференциальному поглощению компонентов с левой и правой круговой поляризацией плоскополяризованного излучения. В случае белков хромофорами в ближней УФ-КД-области (250-320 нм) являются ароматические аминокислоты (т.е. триптофан, тирозин и фенилаланин) и дисульфидные связи, и CD-эффект имеет место, когда хромофоры находятся в асимметричном (внутреннем) окружении. Сигналы в области 250-270 нм свойственны остаткам фенилаланина, сигналы в 270-290 нм свойственны тирозину, а в 280-300 нм свойственны триптофану. Дисульфидные связи дают широкие слабые сигналы на всем протяжении близкой УФ-области. Ближняя УФ-КД область может являться чувствительной к небольшим изменениям третичной структуры, например, по причине белок-белковых взаимодействий и/или изменениям условий состава.

Существует ряд других факторов, которые могут влиять на КД-спектры ароматических аминокислот. Среди них - (1) жесткость белка, (2) природа водородных связей и (3) взаимодействия между различными ароматическими аминокислотами. Дополнительно, белки с большим количеством таких аминокислот могут иметь меньше КД-полос по причине взаимной компенсации положительных и отрицательных полос.

В кратком изложении, белок диализировали в желаемые составы в концентрации 1 мг/мл и сканировали при 250-320 нм или 240-320 нм с использованием КД-спектрометра Jasco 800. Также сканировали соответствующий состав без белка и вычитали результаты этих считываний из считываний с раствором белка. Ближний УФ-КД (UV-CD) спектр представлял собой график молярных эллиптичностей относительно длины волны от 250 или 240 до 320 нм.

Для антител в общем, ближний УФ-КД спектр с полусигмоидальным профилем свидетельствует о хорошем фолдинге третичной структуры, в то время как более плоский и менее характерный профиль свидетельствует о более выраженной тенденции к разворачиванию. Компактный фолдинг связан с хорошей стабильностью, в то время как при плохом фолдинге обнажается гидрофобная внутренняя часть, что может приводить к гидрофобным взаимодействиям между молекулами белка, что приводит к образованию нежелательных агрегатов.

Способ DSC.

Термическую стабильность антител оценивали с использованием устройства для дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Используемым устройством для DSC являлось автоматическое устройство VP-DSC с капиллярной ячейкой (Microcal, GE Healthcare Ltd./Microcal, Buckinghamshire, UK). Разворачивание молекул изучали, используя скорость сканирования 1°C/минуту в диапазоне температур 25°C - 95°C для образцов в концентрации 1 мг/мл. Дополнительными используемыми параметрами измерения являлись время настройки 16 секунд, время ожидания перед сканированием 10 минут, и измерения осуществляли способом без обратной связи. Для отдельного измерения 420 мкл образца/пустой пробы помещали в штатив для образов DSC-устройства со схемой наполнения планшета, представленной ниже. Получаемые термограммы выравнивали по модели «non two state» для получения средних температур и энтальпий различных переходов.

Дополнительным требованием для подходящего кандидата для разработки биологического препарата является то, что белок сохраняет свое нативное состояние и конформацию. Белок в водном растворе находится в равновесии между нативной (свернутой) конформацией и своей денатурированной (развернутой) конформацией. Стабильность нативного состояния основана на величине свободной энергии Гиббса (DG) в системе и термодинамическое отношение между изменениями энтальпии (DH) и энтропии (DS). Положительная DG свидетельствует о том, что нативное состояние является более стабильным, чем денатурированное состояние - чем более положительна DG, тем больше стабильность. Для разворачивания белка необходимо нарушить стабилизирующие силы. Конформационная энтропия преодолевает стабилизирующие силы, позволяя белку разворачиваться при температурах, когда энтропия начинает доминировать. С использованием DSC измеряют DH белка, развернутого по причине тепловой денатурации. Как правило, можно сказать, что чем выше температура средней точки перехода (Tm), тем более стабилен белок при более низких температурах. В течение того же эксперимента с использованием DSC также измеряют изменение теплоемкости (DCp) для денатурации белка. Изменения теплоемкости, связанные с разворачиванием белка, главным образом, происходят по причине изменений гидратации боковых цепей, в нативном состоянии погруженных, но становящихся доступными для растворителя в денатурированном состоянии. Показано, что DSC является полезным прогностическим средством для оценки стабильности жидких составов белков и других биологических макромолекул (Remmele, R.L. Jr., Gombotz, W.R., BioPharm 13, 36-46, 2000, и; Remmele, R.L. Jr., Nightlinger, N.S., Srinivasen, S., Gombotz, W.R., Pharm. Res. 15, 200-208, 1998).

Способ SEC.

Эксклюзионную хроматографию (SEC) использовали для разделения белков на основе их размера. Белки перемещаются в водной подвижной фазе и через пористую смолу стационарной фазы, упакованную в колонку. Время удержания в колонке является функцией гидродинамического размера белка и размера пор в упакованном слое смолы. Меньшие молекулы могут проникать в меньшие поры смолы и сохраняются дольше, чем большие молекулы. После элюирования из колонки белки определяют посредством поглощения УФ. В способе SEC использовали предколонку TSK gel guard (TOSOH Biosciences, Montgomeryville, PA, кат № 08543) и колонку TSK gel G3000SWxL (TOSOH Biosciences, Montgomeryville, PA, кат. № 08541). Подвижной фазой являлся 100 мМ Na₂HPO₄, 200 мМ Na₂SO₄, pH 6,8. Скорость потока составляла 0,25 мл/минуту. Инъекционный объем составлял 20 мкл образца 1 мг/мл. Температура колонки являлась комнатной температурой. Температура автоматического дозатора составляла 2-8°C. Общее время работы составляло 55 минут. Определение основывалось на поглощении УФ при длине волны 214 нм с шириной полосы, установленной на 8 нм, с использованием референсной длины волны 360 нм с шириной полосы 100 нм.

Способ замораживания-оттаивания.

Растворы антител в концентрации 1 мг/мл в желаемых составах замораживали при -80°C в течение по меньшей мере 4 часов и затем размораживали при 30°C на водяной бане. Затем растворы снова замораживали при -80°C. Это повторяли в течение 5 циклов. После конкретных циклов замораживания-оттаивания, например, второго и четвертого, часть раствора отбирали для анализа посредством SEC до повторного замораживания. Тестирование стабильности при замораживании-оттаивании осуществляли при низкой концентрации белка для получения "худшего варианта развития событий" по причине большего воздействия на молекулы белка вызывающих денатурацию поверхностей раздела фаз лед-вода. При более высоких концентрациях пропорционально меньше белка соприкасается с поверхностью раздела фаз лед-вода, вместо этого взаимодействуя с другими молекулами белка.

Ускоренное исследование стабильности.

Растворы антитела при концентрации 1 мг/мл в желаемых составах пропускали через фильтры PVDF 0,22 мкм в стерильных условиях и инкубировали при 40°C и/или 50°C в течение по меньшей мере 21 дня. На 7 день и 21 день в стерильных условиях отбирали аликвоты и подвергали анализу посредством SEC. Затем растворы возвращали на инкубацию.

Пример 2: Получение моноклональных антител крысы против DLL4 посредством технологии гибридомы крысы.

Крыс иммунизировали известными в этой области способами (например, Ε Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998). Линию клеток человека, экспрессирующую полноразмерный белок DLL4 человека, а также рекомбинантный DLL4-ECD мыши (внеклеточный домен DLL4) использовали в качестве иммуногена. Линии клеток мыши, экспрессирующие DLL4 человека или DLL4 мыши, использовали для определения титра антисыворотки и для скрининга гибридом, секретирующих антиген-специфичные антитела. Дозы для иммунизации включали 1 × 10⁶ клеток/крысу/инъекцию для первичной и повторных иммунизаций. Для повышения иммунного ответа на DLL4 мыши крыс повторно иммунизировали рекомбинантным DLL4-ECD мыши в форме эмульсии с неполным адъювантом Фрейнда (Sigma, St. Louis, MO, US). В кратком изложении, получали смесь адъювант-антиген, сначала осторожно смешивая адъювант в сосуде с использованием центрифуги типа вортекс. Желаемое количество адъюванта удаляли из сосуда и помещали в автоклавируемую микроцентрифужную пробирку 1,5 мл. Антиген получали в PBS или физиологическом растворе с концентрацией в диапазоне 0,5-1,0 мг/мл. Затем вычисленное количество антигена добавляли в микроцентрифужную пробирку с адъювантом и осторожно перемешивали раствор на центрифуге типа вортекс в течение 2 минут для получения эмульсии "вода-в-масле". Затем раствор адъювант-антиген помещали в соответствующий шприц для инъекции животному. Всего инъецировали 50 мкг антигена в объеме 50-100 мкл. Каждое животное иммунизировали и затем повторно иммунизировали от 2 до 3 раз в зависимости от титра. Животным с хорошими титрами вводили конечную подкожную повторную дозу с клеточной линией, экспрессирующей DLL4 человека до слияния.

Слияние гибридомы и скрининг.

Клетки линии миеломных клеток мыши (SP2/0-Ag14, ATCC CRL-1581) культивировали для достижения фазы логарифмического роста непосредственно перед слиянием. Стерильно получали клетки селезенки иммунизированных крыс и подвергали слиянию с миеломными клетками известными в этой области способами (например, E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998); Kohler G, and Milstein C., “Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefined specificity,” Nature, 256: 495-497 (1975)). Затем подвергнутые слиянию "гибридные клетки" наносили на 96-луночные планшеты в среде DMEM/20%FCS/HAT. Выжившие гибридомные колонии исследовали под микроскопом через период от семи до десяти дней после слияния. Через две недели супернатант из каждой лунки подвергали клеточному скринингу связывания с использованием линии клеток мышей, экспрессирующих рекомбинантный DLL4 человека или DLL4 мыши. В кратком изложении, смесь (в отношении 1:1) линии клеток мыши, экспрессирующих DLL4 человека или мыши, наносили на 96-луночный (круглодонный) планшет в концентрации 1 × 10⁶ клеток/лунку и инкубировали с супернатантом гибридомы (50 мкл) при 4°C в течение 1 часа. Затем клетки промывали 3 раза буфером для FACS (PBS+ 2% BSA), конъюгированное с HRP и PE (фикоэритрином) антитело козла против Ig крысы использовали для определения в устройстве FACS. Гибридомы подвергали скринингу с использованием формата ELISA следующим способом. Планшеты для ELISA покрывали 50 мкл DLL4 человека или DLL4 мыши (2,0 мкг/мл в PBS) в течение ночи при 4°C. Планшеты промывали 3 раза 250 мкл PBS/0,5% Tween₂₀ и блокировали 200 мкл блокирующего буфера (2% BSA в PBS с 0,5% Tween₂₀). Разбавленную сыворотку или супернатант гибридомы (100 мкл) добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем планшеты промывали 3 раза PBS/0,5% Tween₂₀, для определения использовали конъюгированное с HRP антитело козла против IgG крысы, и OD связывания наблюдали при 450 нм. Затем выбирали положительную гибридому, секретирующую антитело, связывающееся с DLL4 человека или DLL4 мыши или обоими, переносили на 24-луночные планшеты и субклонировали способом лимитирующих разведений для обеспечения клональности клеточной линии. Изотип каждого моноклонального антитела определяли с использованием набора Zymed's Mouse MonoAb-ID. Гибридомные клоны, продуцирующие антитела, демонстрирующие высокую специфическую активность связывания, субклонировали и очищали (таблица 5), и анализировали аффинность (Biacore) и активность (FACS блокирования Notch и репортерный анализ) антител следующим образом.

Таблица 5
Список антител против DLL4, полученных с использованием технологии гибридомы крысы      

Пример 3. Определение характеристик in vitro моноклональных антител крысы против DLL4.

Аффинности связывания этих моноклональных антител (mAb) крысы с антигеном определяли посредством технологии BIACORE, как описано в примере 1.1, и они представлены в таблицах 6 и 7 ниже. Их активности in vitro дополнительно исследовали с использованием других способов, описываемых в примере 1, и они представлены в таблице 8. Дополнительно описываемые 37D10 и 40B10 являлись идентичными mAb крысы.

Таблица 6
Кинетический анализ Biacore антител крысы против DLL4, полученных посредством и связывающихся с DLL4 человека и яванского макака.     hu=человек; cyno=яванский макак; *=выпадает из диапазона измерений  

Таблица 7
Кинетический анализ Biacore антител крысы против DLL4, полученных посредством гибридомы и связывающихся с DLL4 мыши и крысы.      

Таблица 8
Определение характеристик in vitro антител крысы против DLL4, полученных посредством гибридомы.    

Пример 4. Прогнозирование белковых последовательностей вариабельной области моноклональных антител крысы против DLL4 посредством клонирования и секвенирования ДНК.

Из массы гибридомных клеток выделяли тотальную РНК с использованием набора RNeasy mini kit (Qiagen, кат. № 74104) с использованием следующего протокола. 600 мкл буфера RLT добавляли для разрушения клеток пипетированием несколько раз. Клеточный лизат гомогенизировали, пропуская его 10 раз через иглу 20-gauge, снабженную не содержащим РНКазу шприцом. Один объем 70% этанола добавляли к гомогенизированному лизату и хорошо перемешивали пипетированием. В центрифужную колонку RNeasy добавляли до 700 мкл образца за один раз и центрифугировали в течение 15 секунд при 10000 об./мин., отбрасывая фильтрат. В колонку добавляли 700 мкл буфера RW1 и центрифугировали в течение 15 секунд при 10000 об./мин., отбрасывая фильтрат. Для промывания мембраны колонки добавляли 500 мкл буфера RPE и центрифугировали в течение 15 секунд при 10000 об./мин., отбрасывая фильтрат. Этот этап повторяли еще раз, но колонку центрифугировали в течение 2 минут. Затем образец центрифугировали в течение 1 минуты при 10000 об./мин. для удаления любого остатка буфера RPE. РНК элюировали с использованием 30 мкл не содержащей РНКазу воды посредством центрифугирования в течение 1 минуты при 10000 об./мин. Затем 2 мкг тотальной РНК использовали для синтеза первой цепи кДНК с использованием системы Superscript First-Strand Synthesis System для ОТ-ПЦР (Invitrogen, кат. № 11904-018) по следующему протоколу: 2 мкг РНК + 2 мкл dNTP + 2 мкл Oligo (dT) + DEPC-H₂O (до 20 мкл) инкубировали при 65°C в течение 5 минут, затем переносили на лед по меньшей мере на 1 минуту. Затем образец добавляли к следующей смеси: 4 мкл 10X буфера RT + 8 мкл 25 мМ MgCl₂ + 4 мкл 0,1 Μ DTT + 2 мкл РНКазы OUT и инкубировали при 42°C в течение 2 минут. Затем к образцу добавляли 2 мкл Superscript II RT и инкубировали при 42°C в течение 50 минут. Затем образец инкубировали при 70°C в течение 15 минут и охлаждали на льду. Затем добавляли 2 мкл РНКазы Η и образец инкубировали при 37°C в течение 20 минут. Затем использовали кДНК в качестве матрицы для ПЦР-амплификации вариабельных областей антител. ПЦР осуществляли с использованием первой цепи кДНК, праймеров из набора Mouse Ig-Primer Set (Novagen, кат. № 69831-3) и Platinum Super Mix High Fidelity (Invitrogen, кат. № 12532-016). Для амплификации вариабельных областей тяжелой цепи ПЦР-образцы объединяли следующим образом: 22,5 мкл PCR Super Mix + 0,25 мкл обратный праймер MuIgG V_H3'-2 + 1 мкл кДНК + 1,25 мкл одного из прямых праймеров (VH-A, VH-B) или 0,5 мкл одного из прямых праймеров (VH-C, VH-D, VH-E, VH-F). Для амплификации вариабельных областей легкой цепи ПЦР-образцы объединяли следующим образом: 22,5 мкл PCR Super Mix + 0,25 мкл обратного праймера MuIgKV_L-3'-1 + 1 мкл кДНК + 1,25 мкл одного из прямых праймеров (VL-A, VL-B) или 0,5 мкл одного из прямых праймеров (VL-C, VL-D, VL-E, VL-F, VL-G).

Для образцов с праймерами VH-A, VH-B, VL-A и VL-B, использовали следующие циклы ПЦР (40-45 циклов, этапы со 2 по 4):

1 - Денатурация 94°C 2 мин.

2 - Денатурация 94°C 30 сек.

3 - Отжиг 50°C 30 сек.

4 - Элонгация 68°C 1 мин.

5 - Конечная элонгация 68°C 5 мин.

6. Охлаждение 4°C

Для образцов с праймерами с VH-C по VH-F и с VL-C по VL-G, использовали следующие циклы ПЦР (40-45 циклов, этапы с 2 по 4):

1 -Денатурация 94°C 2 мин.

2 - Денатурация 94°C 30 сек.

3 - Отжиг 60°C 30 сек.

4 - Элонгация 68°C 1 мин.

5 - Конечная элонгация 68°C 5 мин.

6 - Охлаждение 4°C

Продукты ПЦР анализировали в 1,2% агарозном геле и полосы, доходящие до ожидаемого размера (400-500 п.н.), вырезали для выделения ДНК. ДНК очищали с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, кат. № 28704) по следующему протоколу: взвешивали кусочки геля. К каждому кусочку геля добавляли 3 объема буфера QG к 1 объему геля. Образцы инкубировали при 50°C в течение 10 минут до полного растворения кусочков геля, перемешивая каждые 2-3 минуты. Затем 1 объем изопропанола, соответствующий 1 объему геля, добавляли к каждому образцу и перемешивали. Затем образцы наносили на колонку QIAquick и центрифугировали в течение 1 минуты при 13000 об./мин. Для промывания к образцам добавляли 750 мкл буфера PE и центрифугировали в течение 1 минуты при 13000 об./мин. Затем колонки центрифугировали в течение дополнительной минуты при 13000 об./мин. для полного удаления остаточного этанола. ДНК элюировали добавлением 30 мкл H₂O в каждую колонку и центрифугированием в течение 1 минуты при 13000 об./мин. Затем очищенные продукты ПЦР секвенировали для определения последовательностей вариабельной области (таблица 9 ниже).

Таблица 9
Аминокислотные последовательности VH и VL моноклональных антител крысы против DLL4.      

   

   

   

Пример 5. Получение химерных антител.

Вариабельные домены тяжелой и легкой цепи mAb крысы против DLL4 (таблица 9 выше) клонировали в рамке считывания с мутантными константными областями тяжелой цепи и легкой каппа-цепи IgG1 человека (L234, 235A), соответственно. Активности получаемых химерных антител подтверждали в анализах связывания и конкурентных анализах на основе FACS (таблица 10 ниже), и они являлись сравнимыми с их родительскими mAb крысы.

Таблица 10
Анализ связывания и нейтрализующей активности на основе FACS рекомбинантных химерных антител, содержащих вариабельные домены mAb крысы против DLL4.      

Пример 6. Гуманизация моноклонального антитела крысы против DLL4 1A11.

Антитело крысы против DLL4 1A11 (таблица 9 выше) гуманизировали. Гуманизированный вариант аминокислотных последовательностей VH.1, VH.1a, VH.1b, VH.2a, VL.1, VL.1a, VL.1b и VL.2a (таблица 11 ниже) преобразовывали в последовательность ДНК на основе наиболее гомологичных зародышевых линий человека и синтезировали их. В случае вариантов тяжелой цепи использовали акцепторные последовательности тяжелой цепи зародышевой линии человека VH3-7 FR1, VH3-7 FR2, VH3-7 FR 3 и JH4 FR4 (см. таблицу 3 выше). В случае вариантов легкой цепи VL.1, VL.1a, и VL.1b использовали акцепторные последовательности легкой цепи зародышевой линии человека О2 FR1, О2 FR2, О2 FR3 и JK2 FR4 (см. таблицу 3 выше). В случае варианта легкой цепи VL.2a использовали акцепторные последовательности легкой цепи зародышевой линии человека L2 FR1, L2 FR2, L2 FR3 и JK2 FR4 (см. таблицу 4 выше). Последовательности отдельных конструкций проверяли на точность. Затем положительные варианты инокулировали в 250 мл среды Луриа с ампициллином и культивировали в течение ночи при 37°C. ДНК выделяли из культур вариантов с использованием набора Qiagen Hi speed maxi prep kit (12662).

Таблица 11
Аминокислотные последовательности гуманизированных вариантов VH и VL моноклонального антитела крысы против DLL4 1A11.    

 

 

 

Гуманизированные антитела получали комбинацией каждого варианта тяжелой цепи с каждым вариантом легкой цепи всего для 16 вариантов (таблица 12 ниже). Каждый из вариантов 1-4 содержал VH.1 в паре с каждым вариантом VL: VL.1: 0 обратных мутаций, VL.1a: 4 обратные мутации, VL.1b: 1 обратная мутация и VL.2a: 5 обратных мутаций. Каждый из вариантов 5-8 содержал VH.1a в паре с каждым вариантом VL: VL.1: 2 обратные мутации, VL.1a: 6 обратных мутаций, VL.1b: 3 обратные мутации и VL.2a: 7 обратных мутаций. Каждый из вариантов 9-12 содержал VH.1b в паре с каждым вариантом VL: VL.1: 1 обратная мутация, VL.1a: 5 обратных мутаций, VL.1b: 2 обратные мутации и VL.2a: 6 обратных мутаций. Каждый из вариантов 13-16 содержал VH.2a в паре с каждым вариантом VL: VL.1: 3 обратные мутации, VL.1a: 7 обратных мутаций, VL.1b: 4 обратные мутации, VL.2a: 8 обратных мутаций.

Таблица 12
Характеристика полученных гуманизированных антител 1A11 и обратных мутаций.      

Все 16 вариантов транзиентно трансфицировали в 50 мл суспензии культур клеток HEK 293 6e в соотношении конструкций легкой и тяжелой цепей от 60% до 40%. Для трансфекции клеток использовали 1 мг/мл PEI. Супернатанты клеток собирали после шести дней культивирования в колбе для шейкера, центрифугировали для осаждения клеток и фильтровали через фильтры 0,22 мкм для отделения IgG от примесей из культуры. Вариант, связывающийся с DLL4 человека, сначала оценивали посредством анализа связывания ELISA с захватом (пример 1.2), в котором используют иммобилизованное антитело козла против Fc человека (Jackson ImmunoResearch, 109-005-008) для захвата IgG в отфильтрованных супернатантах клеток 293 6e (таблица 13 ниже). Все 16 вариантов имели сопоставимые аффинности и их очищали для дальнейшего определения характеристик.

Все 16 вариантов (h1A11.1-h1A11.16) очищали на установке периодического действия добавлением объема IgG-связывающего буфера с белком A (Thermo Scientific 21001), соответствующего 1 объему супернатанта, и 1 мл сефарозных быстропроточных бус rProteinA (GE Healthcare, 17-1279-04). Супернатанты с добавленными бусами и буфером встряхивали в течение ночи при 4°C и через день бусы собирали в хроматографических колонках Poly Prep (Bio Rad, 731-1550) под действием гравитации. Как только супернатанты пропускали через колонки, бусы промывали объемом связывающего буфера, соответствующим 10 объемам колонки, и IgG элюировали буфером Immunopure IgG elution buffer (Pierce, 185 1520) и собирали в аликвоты 1 мл. Объединяли фракции, содержащие IgG, и диализировали в PBS в течение ночи при 4°C.

Очищенные варианты дополнительно охарактеризовывали по их аффинностям для DLL4 человека, мыши и яванского макака анализом связывания ELISA (пример 1.2, способ 2), посредством Biacore (пример 1.1) и посредством проточной цитометрии (FACS). Все 16 вариантов демонстрировали сравнимые аффинности с родительским рекомбинантным антителом 1A11 во всех трех анализах (таблица 13). Затем гуманизированные варианты тестировали на их функциональность с DLL4 человека и мыши посредством конкурентной ELISA (пример 1.3) и Notch-репортерного анализа (пример 1.6). Все 16 вариантов демонстрировали активности, сравнимые с родительским рекомбинантным антителом 1A11, в обоих анализах (таблица 14 ниже).

Таблица 13
Характеристика активностей связывания гуманизированных mAb 1A11    

 

Таблица 14
Характеристика функциональной активности in vitro гуманизированных mAb 1A11.    

·

 

Дополнительные схемы для гуманизации антител против DLL4 1A11.

Дополнительные схемы VH и VL для гуманизации моноклонального антитела крысы против DLL4 1A11 представлены в таблице ниже.

Таблица 15
Дополнительные схемы VH и VL
для гуманизации антител 1A11.      

 

Пример 7. Гуманизация mAb крысы против DLL4 38H12.

Гуманизировали антитело крысы против DLL4 38H12 (таблица 9, выше). Гуманизированные варианты аминокислотных последовательностей VH.1, VH.1a, VH.1b, VH.2a, VL.1, VL.1a, VL.1b и VL.2a (таблица 16 ниже) преобразовывали в последовательность ДНК на основе наиболее гомологичных зародышевых линий человека и синтезировали. Акцепторные последовательности тяжелой цепи зародышевой линии человека VH3-30 FR1, VH3-30 FR2, VH3-30 FR3 и JH3 FR4 (см. таблица 3) использовали для получения гуманизированных вариантов тяжелой цепи, представленных в таблице 16. Акцепторные последовательности легкой цепи зародышевой линии человека О2 FR1, О2 FR2, О2 FR3 и JK2 FR4 (см. таблица 4) использовали для получения гуманизированных вариантов легкой цепи, представленных в таблице 16. Последовательности отдельных конструкций проверяли на точность. Затем положительные варианты инокулировали в 150 мл среды Луриа с ампициллином и культивировали в течение ночи при 37°C. ДНК выделяли из культур вариантов с использованием набора Qiagen Hi speed maxi prep kit (12662).

Таблица 16
Аминокислотные последовательности VH и VL гуманизированного моноклонального антитела крысы против DLL4 38H12.      

   

Гуманизированные антитела получали комбинацией каждого варианта тяжелой цепи с каждым вариантом легкой цепи всего для 16 вариантов (таблица 17 ниже). Каждый из вариантов 1-4 содержал VH.1 в паре с каждым вариантом VL: VL.1: 0 обратных мутаций, VL. 1a: 4 обратные мутации, VL.1b: 1 обратная мутация, и VL.2a: 5 обратных мутаций. Каждый из вариантов 5-8 содержал VH.1a в паре с каждым вариантом VL: VL.1: 4 обратные мутации, VL.1a: 8 обратных мутаций, VL.1b: 5 обратных мутаций, и VL.2a: 9 обратных мутаций. Каждый из вариантов 9-12 содержал VH.1b в паре с каждым вариантом VL: VL.1: 1 обратная мутация, VL.1a: 5 обратных мутаций, VL.1b: 2 обратные мутации и VL.2a: 5 обратных мутаций. Каждый из вариантов 13-16 содержал VH.2a в паре с каждым вариантом VL: VL.1: 5 обратных мутаций, VL.1a: 9 обратных мутаций, VL.1b: 6 обратных мутаций, VL.2a: 10 обратных мутаций.

Таблица 17
Характеристика полученного гуманизированного антитела 38H12 и обратных мутаций.    

 

Все 16 вариантов транзиентно трансфицировали в 50 мл суспензии культур клеток HEK 293 6e в соотношении конструкций легкой и тяжелой цепей от 60% до 40%. Для трансфекции клеток использовали 1 мг/мл PEI. Супернатанты клеток собирали после шести дней культивирования в колбе для шейкера, центрифугировали для осаждения клеток и фильтровали через фильтры 0,22 мкм для отделения IgG от примесей из культуры. Вариант, связывающийся с DLL4 человека, сначала оценивали посредством анализа связывания ELISA с захватом (пример 1.2), в котором используют иммобилизованное антитело козла против Fc человека (Jackson Immunoresearch, 109-005-008) для захвата IgG в отфильтрованных супернатантах клеток 293 6e (см., EC₅₀ при анализе связывания ELISA, таблица 18 ниже). Варианты, содержащие VH.1, проявляли наиболее низкие аффинности связывания по сравнению с другими вариантами, и исключали из скрининга. В VH.1 пересаживали CDR без обратных мутаций в каркасных последовательностях.

Затем хорошо связывающиеся варианты (h38H12.5-h38H12.16) очищали на установке периодического действия добавлением объема IgG-связывающего буфера с белком A (Thermo Scientific 21001), соответствующего 1 объему супернатанта, и 800 мкл сефарозных быстропроточных бус rProteinA (GE Healthcare, 17-1279-04). Супернатанты с добавленными бусами и буфером перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и бусы собирали в хроматографических колонках Poly Prep (Bio Rad, 731-1550) под действием гравитации. Как только супернатанты пропускали через колонки, бусы промывали 10 мл связывающего буфера, и IgG элюировали буфером Immunopure IgG elution buffer (Pierce, 185 1520) и собирали в аликвоты 1 мл, нейтрализованные 100 мкл 1 M Трис, pH 8.

Очищенные варианты дополнительно охарактеризовывали в конкурентных ELISA с Notch-1 человека (пример 1.4) с использованием формата нанесения Notch-1 Fc на планшеты для ELISA и преинкубации биотинилированного DLL4 человека с титруемым антителом. Сигнал оценивали по связыванию свободного биотинилированного DLL4 с Notch-1 Fc. Сильные связывающие средства ингибировали сигнал при низкой концентрации антитела. Варианты с h38H12.5 по h38H12.7 проявляли более низкие конкурентные активности по сравнению с другими вариантами (см. EC₅₀ в конкурентном ELISA с Notch, таблица 18 ниже).

Варианты с хорошим связыванием, определенным в анализе связывания ELISA, оценивали посредством Biacore (пример 1.1) одновременно со скринингом клеток. K_D для DLL4 человека являлась схожей для всех вариантов (см. Biacore, K_D в таблице 18 ниже). Варианты подвергали скринингу в анализе клеток, в котором исследовали прямое связывание с DLL4 человека (пример 1.3; EC₅₀ при анализе связывания FACS в таблице 18 ниже) и ингибирование пути передачи сигнала Notch-1 (Пример 1.6; EC₅₀ при Notch-репортерном анализе в таблице 18 ниже).

Таблица 18
Характеристика активностей гуманизированных mAb 38H12 in vitro в отношении DLL4 человека.    

 

Дополнительные схемы для гуманизации антител против DLL4 38H12.

Дополнительные схемы VH и VL для гуманизации моноклонального антитела крысы против DLL4 38Н12 представлены в таблице ниже.

Таблица 19
Дополнительные схемы VH и VL для гуманизации антител 38H12.    

 

Пример 8. Созревание аффинности h1A11.1.

Гуманизированное антитело h1A11.1 использовали в качестве матрицы для созревания аффинности. Описание конструирования библиотек приведено ниже. Нумерация последовательностей вариабельных областей моноклональных антител соответствует нумерации по Kabat (как описано выше; или см. веб-сайт bioinf.org.uk/abs/#kabatnum), и ее использовали в получении описываемых ниже библиотек.

Три библиотеки получали, как описано ниже.

Библиотека H1+H2 (примесь: 76080808):

11 примесных остатков в 30, 31, 32, 35, 50, 52, 52a, 55, 56, 57 и 58.

Переключение между зародышевой линией и последовательностью h1A11 в положении 76(V/I).

10⁹ отобранных мутантов из библиотеки с 4 мутировавшими остатками или менее, по меньшей мере 3,7 раз.

Большую часть библиотеки с мутантами, несущими от 4 до 6 остатков, подвергали мутагенезу добавлением примесей.

Библиотека H3 (примесь: 70101010)

8 примесных остатков 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a и 102.

Переключение между зародышевой линией и последовательностью h1A11 в положениях 93 (A/S) и 101 (D/A).

10⁹ отобранных мутантов из библиотеки с 4 мутировавшими остатками или менее, по меньшей мере 4,7 раз.

Большую часть библиотеки с мутантами, несущими от 4 до 5 остатков, подвергали мутагенезу добавлением примесей.

Библиотека LC (примесь: 70101010):

9 примесных остатков в 28, 30, 31, 50, 53, 92, 93, 94 и 96.

Переключение между зародышевой линией и последовательностью h1A11 в 7 положениях 27(Q/E), 43(A/S), 49(Y/F), 52(S/N), 71(F/S), 87(Y/F) и 91(S/Y).

10⁹ отобранных мутантов из библиотеки с 4 мутировавшими остатками или менее, по меньшей мере 1 раз.

Большую часть библиотеки с мутантами, несущими от 4 до 6 остатков, подвергали мутагенезу добавлением примесей.

Библиотека rHC: рекомбинируют выходные данные библиотек H1+H2 и H3.

Библиотека rHCLC: рекомбинируют выходные данные библиотек H1+H2, H3 и LC.

Обе каркасные последовательности VH и VL зародышевой линии снижали предсказанную иммуногенность. Наиболее желаемыми мутациями зародышевой линии в h1A11 VL.1a являлись S43A и S71F.

Здесь описывали используемые кодоны для остатков, которые являлись примесными:

Если пролин являлся примесным, примесный олигонуклеотид будет иметь кодон C(_5-85-5-5)C(_5-85-5-5)S независимо от исходного кодона в последовательности антитела. Эти кодоны выбирали на основе следующих критериев:

1. повышение несинонимичных мутаций

2. повышение охвата большего количества аминокислот при мутагенезе

3. использование часто встречающихся кодонов

4. избежание кодонов SSS и WWW.

Порядок примесей представлял собой A-C-G-T

A(_85-5-5-5), A(_70-10-10-10)

C(_5-85-5-5), C(_10-70-10-10)

G(_5-5-85-5), G(_10-10-70-10)

T(_5-5-5-85), T(_10-10-10-70)

Аланин (A): GCN G(_10-10-70-10)C(_10-70-10-10)S G(_5-5-85-5)C(_5-85-5-5)S Треонин (T): CAN A(_70-10-10-10)C(_10-70-10-10)S A(_85-5-5-5)C(_5-85-5-5)S Пролин (P): CCN C(_10-70-10-10)C(_10-70-10-10)S C(_5-85-5-5)C(_5-85-5-5)S Серин (S): Если TCN T(_10-10-10-70)C(_10-70-10-10)S T(_5-5-5-85)C(_5-85-5-5)S Если AGY A(_70-10-10-10)G(_10-10-70-10)C(_10-70-10-10) A(_85-5-5-5)G(_5-5-85-5)C(_5-85-5-5) Валин (V): GTN G(_10-10-70-10)T(_10-10-10-70)S G(_5-5-85-5)T(_5-5-5-85)S Глицин (G): GGN G(_10-10-70-10)G(_10-10-70-10)S G(_5-5-85-5)G(_5-5-85-5)S

Лейцин (L): Если CTN C(_10-70-10-10)T(_10-10-10-70)S C(_5-85-5-5)T(_5-5-5-85)S Если TTR T(_10-10-10-70)T(_10-10-10-70)G(_10-10-70-10) T(_5-5-5-85)T(_5-5-5-85)G(_5-5-85-5) Аргинин (R): Если CGN C(_10-70-10-10)G(_10-10-70-10)S C(_5-85-5-5)G(_5-5-85-5)S Если AGR A(_70-10-10-10)G(_10-10-70-10)G(_10-10-70-10) A(_85-5-5-5)G(_5-5-85-5)G(_5-5-85-5) Метионин (M): ATG A(_70-10-10-10)T(_10-10-10-70)G(_10-10-70-10) A(_85-5-5-5)T(_5-5-5-85)G(_5-5-85-5) Триптофан (W): TGG T(_10-10-10-70)G(_10-10-70-10)G(_10-10-70-10) T(_5-5-5-85)G(_5-5-85-5)G(_5-5-85-5) Фенилаланин (F): TTY T(_10-10-10-70)T(_10-10-10-70)C(_10-70-10-10) T(_5-5-5-85)T(_5-5-5-85)C(_5-85-5-5) Изолейцин (I): необходимо два олигонуклеотида 50% ATY A(_70-10-10-10)T(_10-10-10-70)C(_10-70-10-10) A(_85-5-5-5)T(_5-5-5-85)C(_5-85-5-5) 50% ATA A(_70-10-10-10)T(_10-10-10-70)A(_70-10-10-10) A(_85-5-5-5)T(_5-5-5-85)A(_85-5-5-5) Тирозин (Y): TAY T(_10-10-10-70)A(_70-10-10-10)C(_10-70-10-10) T(_5-5-5-85)A(_85-5-5-5)C(_5-85-5-5) Гистидин (H): CAY C(_10-70-10-10)A(_70-10-10-10)C(_10-70-10-10) C(_5-85-5-5)A(_85-5-5-5)C(_5-85-5-5) Глутамин (Q):

CAR C(_10-70-10-10)A(_70-10-10-10)G(_10-10-70-10) C(_5-85-5-5)A(_85-5-5-5)G(_5-5-85-5) Аспарагин (N): AAY A(_70-10-10-10)A(_70-10-10-10)C(_10-70-10-10) A(_85-5-5-5)A(_85-5-5-5)C(_5-85-5-5) Лизин (K): AAR A(_70-10-10-10)A(_70-10-10-10)G(_10-10-70-10) A(_85-5-5-5)A(_85-5-5-5)G(_5-5-85-5) Аспарагиновая кислота (D): GAY G(_10-10-70-10)A(_70-10-10-10)C(_10-70-10-10) G(_5-5-85-5)A(_85-5-5-5)C(_5-85-5-5) Глутаминовая кислота (E): GAR G(_10-10-70-10)A(_70-10-10-10)G(_10-10-70-10) G(_5-5-85-5)A(_85-5-5-5)G(_5-5-85-5) Цистеин (C): TGY всегда NNS  

Библиотеки h1A11.1 трансформировали в дрожжевые клетки, и они презентировались на поверхности клетки для отбора относительно низкой концентрации биотинилированного внеклеточного домена DLL4 посредством магнитной, а затем активируемой флуоресценцией сортировки клеток. Осуществляли селекцию на предмет улучшенной скорости прямой реакции, или обратной реакции, или обоих, и из дрожжевых клеток выделяли белковые последовательности антитела с модулированной активностью клонов hu1A11 (таблицы 20 и 21 ниже) для обратного преобразования в формат IgG для дальнейшего определения характеристик (см. характеристику клонов в таблице 22). В таблице 23 приведены аминокислоты, обнаруживаемые при отборе с созреванием аффинности в каркасных областях (FR) и CDR.

Таблица 20
Последовательности VH аффинно-зрелых гуманизированных клонов 1A11.1    

 

 

 

Таблица 21
Последовательности VL аффинно-зрелых гуманизированных клонов 1A11.1.    

 

 

Таблица 22
Характеристика аффинно-зрелых
преобразованных клонов h1A11.1.    

 

Таблица 23
Аминокислоты, обнаруживаемые при отборе с созреванием аффинности h1A11.1 в каркасных областях (FR) и каждой из CDR для областей VH (SEQ ID NO:204) и VL (SEQ ID NO:205).    

 

Аффинно-зрелые клоны hu1A11.1 (таблица 22) экспрессировали, очищали и дополнительно охарактеризовывали in vitro. Их аффинности связывания антигена определяли технологией Biacore, как описано в примере 1.1 и показано в таблицах 24 и 25 (ниже). Активности их связывания со связанным с клетками DLL4 и ингибирования активности Notch, индуцируемой связанным с клетками DLL4, дополнительно исследовали с использованием способов, описываемых в примерах 1.3 и 1.6, и они представлены в таблице 26 (ниже).

Таблица 24
Кинетический анализ Biacore аффинно-зрелых гуманизированных антител 1A11.1, связывающихся с DLL4 человека и яванского макака.      

Таблица 25
Кинетический анализ Biacore аффинно-зрелых гуманизированных антител 1A11.1, связывающихся с DLL4 мыши и крысы.      

Таблица 26
Активности аффинно-зрелых гуманизированных антител 1A11.1 In Vitro в отношении связанного с клетками DLL4.    

Пример 9. Молекулярная идентичность и физико-химические свойства гибридомных антител крысы

Идентичность моноклональных антител, специфичных к DLL4, определяли масс-спектрометрией, как описано ниже.

Масс-спектрометрический анализ h1A11.1

Молекулярная масса легкой цепи 23501 Да хорошо укладывалась в теоретическую величину. Молекулярные массы тяжелой цепи хорошо укладывались в теоретическую величину. Наблюдаемые молекулярные массы составляли 50190 Да; 50352 Да и 50514 Да с разницей, соответствующей 162 Да в результате разного гликозилирования.

Масс-спектрометрический анализ h38H12.11

Молекулярная масса легкой цепи 23408 Да хорошо укладывалась в теоретическую величину. Молекулярные массы тяжелой цепи хорошо укладывались в теоретическую величину. Наблюдаемые молекулярные массы составляли 50368 Да; 50530 Да и 50692 Да с разницей, соответствующей 162 Да в результате разного гликозилирования.

Растворимости антител оценивали осаждением полиэтиленгликолем (PEG) 3000. Их также оценивали напрямую, т.е. оценивали действительную растворимость, концентрированием антител в специальном растворе и/или буфере с использованием центрифужных фильтров Amicon и затем обследовали на предмет любых осадков при 25°C и 5°C. Делали вывод о стабильности по измерению кругового дихроизма в ближней УФ-области (УФ-КД) и дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Стабильность при замораживании-оттаивании и при повышенных температурах (ускоренное исследованием стабильности) оценивали эксклюзионной хроматографией (SEC). Подробности способов описывали в примере 1.7 и результаты описывают ниже.

Результаты скрининга действительной растворимости 1A11

Для серии клонов 1A11, включая hu1A11.1, hu1A11.3, hu1A11.9, hu1A11.11 и рекомбинантного 1A11, 2 мг каждого из них концентрировали с использованием центрифужных фильтров Amicon до концентрации выше 60 мг/мл. Не наблюдали осаждения или помутнения при 25°C или после хранения в течение 1 дня при 5°C. Концентрации каждого составляли 63 мг/мл для 1A11.1, 76 мг/мл для 1A11.3, 63 мг/мл для 1A11.9, 69 мг/мл для 1A11.11 и 76 мг/мл для химерного 1A11.

Пример 10. Группирование эпитопов антител против DLL4 с использованием технологии Biacore.

Группирование эпитопов осуществляли с использованием устройств Biacore 2000, 3000 и Τ100. Интересующие антитела иммобилизовали напрямую на поверхности чипа CM5 посредством соединения через аминогруппу. Проточная кювета с аналогично иммобилизованным неродственным IgG служила в качестве референсной поверхности. Сначала иммобилизованным моноклональным антителам (mAb) позволяли связывать рекомбинантный антиген (в концентрациях по меньшей мере 200 нМ) в течение 120 секунд при 50 мкл/мин. Затем, инъецировали другое антитело при 50 мкл/мл в течение 120-240 секунд для проверки его способности связываться с антигеном, уже связавшимся с иммобилизованными mAb. Отсутствие дополнительного ответа связывания на сенсограмме, представляющего собой перекрывание эпитопов двух mAb (одного, иммобилизованного на чипе, и одного, введенного в жидкую фазу). Затем меняли ориентацию анализа таким образом, что иммобилизовали антитело, находившееся в жидкой фазе, и наоборот. Пары mAb, не позволяющие дополнительное связывание антитела в обоих ориентациях анализа, группировали как точно перекрывающиеся в этих экспериментах. Полученные группировки mAb с перекрывающимися эпитопами представлены в таблице 27 ниже.

Таблица 27
Группирование антител против DLL4 с использованием технологии BIAcore.      

Пример 11. Активности антител против DLL4 в анализе разрастания эндотелиальных клеток in vitro.

Анализ разрастания на основе фибриновых гелевых бус осуществляли для анализа активности ангиогенеза in vitro HUVEC (пассажи 2-3, Lonza), как описано (Nakatsu, Μ. N. et al. 2003 Microvasc. Res. 66, 102-112). В кратком изложении, восстанавливали раствор фибриногена с апротинином (4 единиц/мл) и тромбином (50 единиц/мл). Бусы 3 (Amersham Pharmacia Biotech) покрывали 350-400 HUVEC на бусину в течение ночи. Приблизительно 20 покрытых HUVEC бусин вводили в сгусток фибрина на лунку в 96-луночном планшете для культивирования тканей. Кондиционированную среду, полученную из нормальных фибробластов человека (NHLF, Lonza) при 80% конфлуэнтности, помещали поверх геля. В лунку добавляли антитело против DLL4 и контрольное антитело KLH в концентрации 15 мкг/мл. На 10 и 12 день с использованием инвертированного микроскопа и камеры Nikon CCD получали изображения. В таблице 28 приведены активности некоторых антител против DLL4 относительно повышения разрастания эндотелиальных клеток in vitro. (Nakatsu et al., “Angiogenic sprouting and capillary lumen formation modeled by human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in fibrin gels: the role of fibroblasts and Angiopoietin-1,” Microvasc. Res. 66, 102-112 (2003)).

Таблица 28
Активности антител DLL4 относительно стимуляции разрастания эндотелиальных клеток Тестируемое антитело Стимуляция разрастания HUVEC mAb крысы 38H12 Да mAb крысы 1A11 Да h1A11.1 Да mAb крысы 40B10 Не наблюдали mAb крысы 32C7 Не наблюдали

Пример 12. Оценка PK полученных с использованием гибридомы антител у грызуна.

Для оценки фармакокинетических свойств антител против DLL4, мышам SCID-Beige (n=3 на антитело) вводили однократную интраперитонеальную (IP) дозу антитела в концентрации 1, 5, 10 или 30 мг/кг в зависимости от перекрестной реактивности антитела на DLL4 мыши. Образцы сывороток для исследования динамики (5 мкл цельной крови, разбавленной 1:50 в буфере HBS-EP+, на временную точку) собирали от каждого животного в течение 21 дней. Концентрации сывороток определяли с использованием DLL4-специфичной платформы Biacore. В кратком изложении, DLL4 человека иммобилизовали на биосенсорном чипе и инъецировали образцы в проточную кювету при скорости 5 мкл в минуту в течение 5 минут с измерением получаемых уровней связывания и их сравнением со стандартами. Временные профили концентрации сывороток использовали для оценки фармакокинетических параметров C_max (максимальная концентрация сыворотки), CL (выведение), и t_1/2 (время полужизни антитела), представленных в таблице 29 ниже.

Таблица 29
Фармакокинетические параметры антител против DLL4 у мышей SCID-Beige после однократной IP-дозы.    

Пример 13. Лечение антителом против DLL4 ингибировало рост опухоли in vivo.

Эффект антител против DLL4 на рост опухоли оценивали по подкожным ксенотрансплантированным опухолям Calu-6, имплантированным мышам SCID-Beige. В кратком изложении, 2 × 10⁶ клеток инокулировали подкожно в правый задний пах самок мышей SCID-Beige. Позволяли опухолям развиваться в течение 14-18 дней, когда определяли объем опухоли с использованием измерений электронным циркулем. Размер опухоли вычисляли по формуле: L × W²/2. Мышей распределяли по группам лечения (n=10 на группу) таким образом, что каждая когорта животных имела равноценный средний объем опухоли до начала терапии (как правило, от 180 до 250 мм³). Затем животным интраперитонеально вводили дозы антител против DLL4 дважды в неделю в течение двух недель (всего 4 дозы) или еженедельно в течение четырех недель (всего 4 дозы). Объем опухоли измеряли в среднем дважды в неделю в течение эксперимента до достижения конечной точки среднего объема опухоли в каждой группе ≥2,000 мм³. Результаты представлены в таблице 30 ниже.

Таблица 30
Эффективность антител против DLL4 в отношении модели подкожного ксенотрансплантата немелкоклеточного рака легких человека Calu-6    

 

Включение путем ссылки

Содержание всех цитируемых источников (включая литературные источники, патенты, патентные заявки и веб-сайты), которые могли быть процитированы на всем протяжении настоящей заявки, таким образом, однозначно включено путем ссылки в полном объеме в любых целях, как и цитируемые в них ссылки.

Эквиваленты

Изобретение можно осуществлять в других конкретных формах без отступления от его сущности или основных характеристик. Таким образом, приведенные выше варианты осуществления во всех отношениях должны считаться иллюстративными, а не ограничивающими изобретение, приведенное в настоящем описании. Таким образом, объем изобретения указан заявленной формулой изобретения, а не приведенным выше описанием, и, таким образом, все изменения, подпадающие под значение и диапазон эквивалентности формулы изобретения, предназначены для включения в настоящее описании.

Данное изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связывают дельта-подобный лиганд 4 (DLL4) человека, охарактеризованные последовательностями определяющих комплементарность участков (CDR). Кроме того, рассмотрены: выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент; вектор экспрессии и клетка-хозяин; а также фармацевтическая композиция и применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению в приготовлении лекарственного средства для снижения активности DLL4 человека у субъекта-человека. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии заболеваний, связанных с сигнальным путем Notch. 6 н. и 23 з.п. ф-лы, 30 табл., 13 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связывают DLL4 человека, содержащие антигенсвязывающий домен, содержащий шесть CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где
CDR-H1 представляет собой NFPMA; CDR-H2 представляет собой TISSSDGTTYYRDSVKG; CDR-H3 представляет собой GYYNSPFAY; CDR-L1 представляет собой RASEDIYSNLA; CDR-L2 представляет собой DTNNLAD; и CDR-L3 представляет собой QQYNNYPPT.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, дополнительно содержащие акцепторную каркасную последовательность человека.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где указанная акцепторная каркасная последовательность человека выбрана из группы акцепторных последовательностей, состоящей из: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, и SEQ ID NO: 142.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат два вариабельных домена, где указанные два вариабельных домена имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат два вариабельных домена, где указанные два вариабельных домена имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171 и 175.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат два вариабельных домена, где указанные два вариабельных домена имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 187 и 197.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где указанная акцепторная каркасная последовательность человека содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в каркасной области в ключевом остатке, причем указанный ключевой остаток выбран из группы, состоящей из:
остатка, смежного с CDR;
остатка в участке гликозилирования;
остатка, способного взаимодействовать с DLL4 человека;
остатка, способного взаимодействовать с CDR;
канонического остатка;
контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи;
остатка в зоне Вернье; и
остатка в области, перекрывающейся для CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, определенного по Chothia, и первой каркасной областью тяжелой цепи, определяемой по Kabat.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где указанные каркасные последовательности выбраны из каркасных последовательностей в:

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны блокировать взаимодействие DLL4 с белком Notch, выбранным из группы, состоящей из Notch-1, Notch-2, Notch-3, Notch-4 и их комбинаций.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны модулировать биологическую функцию DLL4.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны нейтрализовать биологическую функцию DLL4.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны ингибировать активность VEGFR2, активность VEGFR1 или обе.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны ингибировать нормальный ангиогенез.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, дополнительно содержащие:
константный домен IgM человека,
константный домен IgG1 человека,
константный домен IgG2 человека,
константный домен IgG3 человека,
константный домен IgG4 человека,
константный домен IgE человека или
константный домен IgA человека.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент существуют в виде кристалла.

16. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8.

17. Вектор экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п.16.

18. Клетка-хозяин для экспрессии антитела к DLL4 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащая вектор экспрессии по п.17.

19. Клетка-хозяин по п.18, где указанная клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, выбранную из группы, состоящей из: клетки простейшего, клетки животного, растительной клетки и клетки гриба.

20. Клетка-хозяин по п.19, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку животного, выбранную из группы, состоящей из: клетки млекопитающего, клетки птицы и клетки насекомого.

21. Клетка-хозяин по п.20, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку СНО, клетку COS или клетку Sf9.

22. Клетка-хозяин по п.19, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку дрожжей.

23. Фармацевтическая композиция для снижения активности DLL4 человека у субъекта-человека, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 в количестве, эффективном для снижения активности DLL4 человека у субъекта-человека, и фармацевтически приемлемый носитель.

24. Фармацевтическая композиция по п.23, дополнительно содержащая по меньшей мере одно дополнительное средство для лечения нарушения, при котором активность DLL4 наносит вред.

25. Фармацевтическая композиция по п.24, где указанное дополнительное средство выбрано из группы, состоящей из:
средства для визуализации; противоопухолевого средства; химиотерапевтического средства; ингибитора ангиогенеза; антитела против VEGF; антитела против EGFR; антитела против cMet; антитела против ErbB3; антитела против HER2; антитела против CD20; афлиберцепта; ингибитора киназ; блокатора костимуляторных молекул; антитела против В7.2; CTLA4-Ig; блокатора молекул адгезии; антитела против селектина Е; антитела против селектина L; антитела против цитокина или его функционального фрагмента; антитела против IL-18; антитела против TNF; антитела против IL-6; метотрексата; кортикостероида; циклоспорина; рапамицина; FK506; ДНК-алкилирующего средства; цисплатина; карбоплатина; антитубулинового средства; паклитаксела; доцетаксела; доксорубицина; гемцитабина; гемзара; антрациклина; адриамицина; ингибитора топоизомеразы I; ингибитора топоизомеразы II; 5-фторурацила (5-FU); лейковорина; иринотекана; ингибитора тирозинкиназного рецептора; ингибитора апоптоза; ингибитора Bcl2/Bclx; эрлотиниба; гефитиниба; ингибитора СОХ-2; целекоксиба; циклоспорина; рапамицина; детектируемой метки или репортерной молекулы; антагониста TNF; противоревматического средства; миорелаксанта; наркотического средства; анальгезирующего средства; анестетика; седативного средства; местного анестетика; блокатора нервно-мышечного проведения; противомикробного средства; противопсориазного средства; кортикостероида; анаболического стероида; эритропоэтина; средства для иммунизации; иммуноглобулина; иммуносупрессирующего средства; гормона роста; лекарственного средства для гормонозаместительной терапии; радиофармацевтического лекарственного средства; антидепрессанта; антипсихотического лекарственного средства; стимулятора; лекарственного средства против астмы; бета-агониста; ингаляционного стероида; эпинефрина; аналога эпинефрина; цитокина; и антагониста цитокина.

26. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 в приготовлении лекарственного средства для снижения активности DLL4 человека у субъекта-человека.

27. Применение по п.26, где указанный субъект-человек страдает нарушением, при котором активность DLL4 наносит вред.

28. Применение по п.27, где указанное нарушение выбрано из группы, состоящей из: рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака легких, рака ротоглотки, рака гортаноглотки, рака пищевода, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака печени, рака желчного пузыря, рака желчных протоков, рака тонкого кишечника, злокачественного новообразования мочевыводящих путей, злокачественного новообразования женской половой системы, злокачественного новообразования мужской половой системы, злокачественного новообразования эндокринных желез, рака кожи, гемангиомы, меланомы, саркомы, опухоли головного мозга, злокачественного новообразования нервов, опухоли глаза, злокачественного новообразования оболочек головного и спинного мозга, солидных опухолей, возникающих из злокачественных новообразований гемопоэтической системы, метастазов опухолей, неоваскуляризации глаз, отека, ревматоидного артрита, атеросклеротических бляшек, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, рефрактерного асцита, псориаза, саркоидоза, атеросклероза сосудов, сепсиса, язвенной болезни, ожогов, панкреатита, поликистоза яичников (POD), эндометриоза, миомы матки, доброкачественной гипертрофии предстательной железы, Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL), церебральной аутосомно-доминантной артериопатии с подкорковыми инфарктами и лейкоэнцефалопатией (CADASIL), рассеянного склероза (MS), тетрады Фалло (TOF), синдрома Алажиля (AS), дегенерации желтого пятна и заболеваний, связанных с возрастной дегенерацией желтого пятна, и других ангиогенез-независимых и зависимых заболеваний, отличающихся аномальной активностью DLL4.

29. Применение по п.26, где лекарственное средство дополнительно содержит второе средство, выбранное из группы, состоящей из антитела или его фрагмента, способного связывать VEGFR2 человека; метотрексата; антитела или его фрагмента, способного связывать TNF человека; кортикостероида; циклоспорина; рапамицина; FK506; нестероидного противовоспалительного средства (NSAID); радиотерапевтического средства; противоопухолевого средства; химиотерапевтического средства; ДНК-алкилирующего средства; цисплатина; карбоплатина; антитубулинового средства; паклитаксела; доцетаксела; таксола; доксорубицина; гемцитабина; гемзара; антрациклина; адриамицина; ингибитора топоизомеразы I; ингибитора топоизомеразы II; 5-фторурацила (5-FU); лейковорина; иринотекана; ингибитора тирозинкиназного рецептора; эрлотиниба; гефитиниба; ингибитора СОХ-2; целекоксиба; ингибитора киназ; ингибитора ангиогенеза; антитела против VEGF; афлиберцепта; блокатора костимуляторных молекул; антитела против В7.1; антитела против В7.2; CTLA4-Ig; антитела против CD20; блокатора молекул адгезии; антитела против LFA-1; антитела против селектина Е; и антитела против селектина L; низкомолекулярного ингибитора; антитела против цитокина или его функционального фрагмента; антитела против IL-18; антитела против TNF; антитела против IL-6; антитела против цитокинового рецептора; детектируемой метки или репортера; антагониста TNF; противоревматического средства; миорелаксанта; наркотического средства; анальгезирующего средства; анестетика; седативного средства; местного анестетика; блокатора нервно-мышечного проведения; противомикробного средства; противопсориазного средства; кортикостероида; анаболического стероида; эритропоэтина; средства для иммунизации; иммуноглобулина; иммуносупрессирующего средства; гормона роста; лекарственного средства для гормонозаместительной терапии; радиофармацевтического лекарственного средства; антидепрессанта; антипсихотического лекарственного средства; стимулятора; лекарственного средства против астмы; бета-агониста; ингаляционного стероида; эпинефрина; аналога эпинефрина; цитокина; и антагониста цитокина.