Антипролиферативное средство Российский патент 2017 года по МПК A61K35/62 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности к новому средству природного происхождения, оказывающему антипролиферативное действие.

Современная медицина располагает достаточно обширным арсеналом лекарственных препаратов для химиотерапии опухолей. В основном химиотерапевтические средства представлены группами алкилирующих антинеопластических препаратов, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, противоопухолевых гормональных препаратов, иммуномодуляторов и некоторых других с иным механизмом действия. Большинство указанных противоопухолевых препаратов очень токсичны, и поэтому схемы и продолжительность химиотерапии выбирают с учетом проявления побочных эффектов, что отражается на эффективности лечения в целом.

Известны природные противоопухолевые препараты растительного происхождения (алкалоиды барвинка розового (винбластин, винкристин); алкалоиды тисового дерева (таксаны) (паклитаксел, доцетаксел); подофиллотоксины, выделяемые из подофилла щитовидного (этопозид, тенипозид) и алкалоиды безвременника великолепного (демекольцин (колхамин), колхицин)) и бактериального происхождения (рубромицин и др.), которые имеют ограниченное применение также из-за высокой токсичности и узкого терапевтического спектра действия (лечение некоторых разновидностей опухолей, преимущественно с экзофитным ростом).

Следовательно, существует необходимость в новых, высокоэффективных противоопухолевых препаратах природного происхождения, которые имели бы широкий спектр действия и были бы менее токсичными.

Гельминты - общее название паразитических червей, обитающих в организме человека, других животных и растений, вызывающих гельминтозы.

К гельминтам относят представителей ленточных червей, или цестод, сосальщиков, или трематод (обе эти группы относятся к плоским червям) и круглых червей, или нематод.

К числу последних относятся токсокары (в частности, Toxocara canis). Т. canis представляет нематоду, паразитирующую в кишечнике плотоядных, например собак; вызывающую инвазию, известную как токсокароз.

Во время паразитирования гельминты продуцируют и высвобождают различные продукты метаболизма. Секреторно-экскреторные продукты жизнедеятельности гельминтов являются для организма хозяина неестественными веществами в его физиологически процессах.

Известно, что возбудители инвазий могут оказывать модулирующее влияние на течение многих заболеваний самой различной этиологии, в том числе, злокачественных (например, Vasilev S. et al. (2015). В частности, имеются сообщения о том, что заражение мышей нематодой Trichinella spiralis (воспроизведение трихинеллеза) приводит к подавлению роста злокачественных клеток и повышению выживаемости животных после прививки клеток меланомы В-16 в условиях in vivo (Molinari J.A., Ebersole J.L., 1977; Pocock D., Meerovitch E., 1982; Kang Y.L. et al., 2013). Также имеются данные по испытанию продуктов метаболизма Т. spiralis с ингибирующим эффектом в отношении роста и выживаемости опухолевых клеток в условиях in vitro (Vasilev S. et al., 2015; Wang X.L. et al., 2009; Wang X.L. et al., 2013).

Исследования по оценке противоопухолевой активности Т. canis или продуктов метаболизма этих гельминтов ранее не проводились.

Целью изобретения является получение белковых экстрактов из тканей Т. canis, оценка их антипролиферативного действия на моделях опухолевых клеток различных линий и обеспечение их возможного применения в дальнейшем в качестве эффективного противоопухолевого средства.

Сущность изобретения заключается в том, что средство, обладающее антипролиферативной активностью, представляет белковый экстракт гельминтов, в частности экстракт Toxocara canis. Необходимо отметить, что условия получения экстракта из гомогената гельминтов, в том числе, Т. canis, зависят от используемого биологического материала, и существенными признаками получения белковых экстрактов является экстракция фосфатно-солевым буфером с рН=7,2.

Экстракт оказывает выраженное антипролиферативное и цитостатическое действие на моделях опухолевых клеток человека in vitro. Как уже указывалось выше, экстракт токсокар ранее не испытывался на моделях опухолевых клеток человека in vitro.

За счет природного происхождения предлагаемое антипролиферативное средство может быть менее токсичным при наличии высокой противоопухолевой эффективности широкого спектра действия.

Примеры конкретного исполнения

Пример 1. Приготовление белкового экстракта Т. canis.

В качестве средства, предположительно обладающего антипролиферативной активностью, использовали белковый экстракт из половозрелых Т. canis, предварительно очищенный от низкомолекулярных соединений.

Тщательно промытые дистиллированной водой, затем физиологическим раствором свежезамороженные половозрелые гельминты - Toxocara canis подвергали измельчению ножницами, гомогенизации в фарфоровой ступке, помещенной в посуду со льдом. В процессе гомогенизации полученный биоматериал подвергали многократному (3-5 раз) замораживанию и оттаиванию с одновременным растиранием для полного разрушения структуры сырья с целью получения однородной гомогенной массы. В качестве экстрагента белков из полученного гомогената Т. canis использовали фосфатно-солевой буферный раствор pH 7,2, который готовили по прописи (натрий хлористый - 8,5 г; двузамещенный фосфорнокислый натрий - 1,15 г; однозамещенный фосфорно-кислый калий - 0,2 г в 1 л дистиллированной воды) в соотношении 1:10. Экстрагирование проводили в условиях холодильной камеры при +4°C в течение 48 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. По истечении времени экстрагирования полученный биоматериал центрифугировали при 15000 об/мин в течение 20 мин в центрифуге с охлаждением Optima TLX (настольная центрифуга, контролируемая микропроцессором Becman Coulter Herneshal, S.A.). Полученный после центрифугирования белковый экстракт из Т. canis освобождали от низкомолекулярных белков путем диализа против фосфатно-солевого буферного раствора, разбавленного дистиллированной водой в соотношении 1:10.

Полученный белковый экстракт хранили при -20°С. Методом электрофореза в полиакриламидном геле определили, что белковый экстракт из Т. canis содержит более 20 белковый фракций различной электрофоретической подвижности и молекулярной массы.

Пример 2. Оценка влияния белкового экстракта Т. canis на культуры опухолевых клеток молочной железы человека (MCF-7) и ободочной кишки человека (Сасо-2) в зависимости от концентрации экстракта.

Целью настоящего опыта была оценка влияния белкового экстракта Т. canis на пролиферацию опухолевых клеток человека двух линий.

Материалы и методы

Клетки-мишени. В работе были использованы две эпителиальные клеточные линии: MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека) и Сасо-2 (аденокарцинома ободочной кишки человека). Клетки, вне периода постановки эксперимента, хранили в жидком азоте. Перед проведением исследований ампулы с клетками размораживали и культивировали по стандартной методике в культуральных флаконах (CORNING, Flask, 25 cm², США) в ростовой среде DMEM GlutaMAX (Gibco) с добавлением 10% FBS и антибиотика/антимикотика (Gibco, ×100) в условиях повышенной влажности СО₂-инкубатора (New Brunswick, Galaxy 170R) при Т=37°C в атмосфере 5% CO₂.

Исследуемый белковый экстракт. Исследуемый белковый экстракт Т. canis (приготовление смотри в примере 1) представляет экстракт в фосфатно-солевом буфере, не стерильный. Концентрация белка в стоковом растворе составляла 10,9 мг/мл. До проведения исследований раствор хранился при температуре -70°C.

Описание исследования

Перед работой пробирку с белковым экстрактом размораживали при комнатной температуре. В эксперименте in vitro белковый экстракт испытывали в следующих концентрациях по белку: 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, 1 и 2 мг/мл. Для приготовления разведений использовали ростовую среду DMEM GlutaMAX (DGIBCO) с 2% FBS и антибиотиком.

Перед проведением опыта готовили рабочий раствор с концентрацией 2 мг/мл, после его стерилизации через миллипоровый фильт-насадку (0,22 μ) были приготовлены разведения экстракта Т. canis: 1, 500, 250, 100, 50, 25 и 12,5 мкг/мл с использованием ростовой среды DMEM GlutaMAX (DGIBCO) с 2% FBS и антибиотиком.

Для проведения эксперимента клетки MCF-7 и Сасо-2 инкубировали по стандартной методике до получения субконфлуэнтного монослоя. В стадии активного роста клеточный монослой диспергировали раствором трипсин/версена, полученные клетки ресуспендировали в ростовой среде DMEM GlutaMAX (Gibco) с 10% FBS и антибиотиком стандартной концентрации. Свежеприготовленную суспензию клеток высевали в 24-луночные планшеты (SARSTEDT, Германия) по 35×10³ клеток в лунку для клеток MCF-7 и по 30×10³ клеток в лунку для клеток Сасо-2. После чего планшеты ставили в СО₂-инкубатор на 3 ч до полного распластывания клеток. Затем из лунок удаляли среду с не прикрепившимися клетками и в опытные лунки вносили ростовую среду с исследуемыми концентрациями вещества (в 4 повторах на каждую исследуемую концентрацию). В качестве контроля оставили четыре лунки с клетками, которые культивировали в полной ростовой среде с 2% FBS без исследуемого вещества. Конечный объем ростовой среды в контрольных и опытных группах по 500 мкл на лунку.

В ходе эксперимента проводили ежедневное светооптическое наблюдение за клетками с использованием инвертированного микроскопа Olympus CK 40 (Japan), оценивая наличие или отсутствие изменений морфологии клеток в опытных лунках по сравнению с контролем. Пролиферативный ответ опухолевых клеток на действие исследуемого экстракта Т. canis оценивали по плотности и жизнеспособности сформированного монослоя после 96-часовой инкубации клеток в присутствии исследуемого экстракта.

Жизнеспособность клеток определяли, используя стандартную процедуру подсчета клеток в камере Горяева с предварительным окрашиванием клеточной суспензии раствором трипанового синего. Для этого монослой диспергировали раствором трипсин/версена, клетки ресуспендировали в ростовой среде и готовую клеточную суспензию красили 0,4% раствором Trypan Blue (SIGMA). После этого клетки считали в камере Горяева. Для этого в каждой лунке подсчитывали общее (тотальное) количество клеток и количество окрашенных (нежизнеспособных) клеток.

% жизнеспособных клеток (N_ж) рассчитывали по формуле

N_ж=[1,00-(N_о/N_т)]×100%,

где N_т - тотальное (общее) количество клеток в лунке;

N_о - количество окрашенных (нежизнеспособных) клеток в лунке.

Влияние исследуемого экстракта Т. canis на пролиферативную активность опухолевых клеток MCF-7 и Сасо-2 оценивали через 96 ч, сравнивая общее количество клеток в опытных лунках относительно контроля.

Результаты

В ходе эксперимента по оценке влияния исследуемого экстракта Т. canis в указанных концентрациях на эпителиальные культуры опухолевых клеток молочной железы человека (MCF-7) и ободочной кишки человека (Сасо-2) проводили ежедневный визуальный контроль за характером роста и морфологией растущих колоний клеток. Через 24 и 48 ч во всех опытных лунках с клетками MCF-7 и Сасо-2 плотность колоний сопоставима с контролем. Морфологических изменений не обнаружено. Детрит полностью отсутствовал.

Через 72 ч в клетках MCF-7 и Сасо-2 при концентрации 2 мг/мл наблюдали заметное отставание в росте. Отмечено, что в опытных лунках при 2 мг/мл размер колоний был меньше, чем в контрольной группе; также в поле зрения заметно снизилось количество митотически делящихся клеток, при этом морфологических изменений не отмечено. В лунках с клетками MCF-7 и Сасо-2 при 1 и 500 мкг/мл наблюдали незначительное отставание в росте по сравнению с контролем. В опытных лунках с концентрацией 12,5, 25, 50 и 250 мкг/мл отличий в сравнении с контрольной группой К не обнаружено.

Через 96 ч культивирования в клетках MCF-7 и Сасо-2 при концентрациях 2, 1 и 500 мкг/мл в поле зрения наблюдали значительно меньше пролиферирующих колоний, с меньшим количеством клеток, в сравнении с колониями клеток контрольной группы. Морфологические изменения отмечены в клетках MCF-7 только при максимальной концентрации 2 мг/мл. В этой опытной группе видны отдельные колонии, в которых наблюдали клетки без четких и ярко выраженных контуров с потерей характерного рисунка. Количество митотически делящихся клеток в поле зрения снижено. При этом детрит в среде отсутствовал.

После завершения эксперимента, через 96 ч, клетки трипсинизировали, полученную клеточную суспензию красили 0,4% раствором трипановым синим и количество клеток подсчитали в камере Горяева. Результаты подсчета клеток представлены в таблице 1.

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что исследуемый экстракт Т. canis не оказывал существенного влияния на количество жизнеспособных клеток Сасо-2 через 96 ч инкубации. Так, при концентрациях 2, 1 и 500 мкг/мл количество жизнеспособных клеток ободочной кишки человека составляело 90,0, 88,5 и 88%, что сопоставимо с контрольной группой клеток, где жизнеспособность равна 96%. В тоже время, при этих же значениях концентрации наблюдалось значительное снижение тотального количества клеток в сравнении с контрольной группой. Так, общее количество клеток Сасо-2 в контрольной группе через 96 ч культивирования составляло 116,7×10³ кл/лунку, а при 500, 1 и 2 мг/мл были значения 72,0×10³, 63,3×10³ и 65,9×10³ кл/лунке соответственно. При концентрациях экстракта от 12,5 до 250 мкг/мл общее количество клеток сопоставимо с контрольной группой и колебалось от 94,0×10³ до 106,0×10³ кл/лунку. Исходя из этого можно заключить, что высокие концентрации экстракта Т. canis от 500 до 2 мг/мл ингибируют пролиферативную активность опухолевых клеток Сасо-2.

При сравнении полученных результатов (таблица 1) по влиянию экстракта Т. canis на культуру опухолевых клеток молочной железы человека и ободочной кишки человека можно предположить, что клетки MCF-7 более чувствительны к негативному действию исследуемого вещества. Так, из данных таблицы 1 следует, что количество жизнеспособных клеток MCF-7 постепенно снижалось с 95,2% при минимальной дозе от 12,5 до 79,5% при максимальном значении 2 мг/мл, по сравнению с контрольным значением 96,8%. Незначительное ингибирующее действие исследуемого экстракта на пролиферативную активность клеток MCF-7 проявлялась при уже в концентрации 50 мкг/мл, где общее количество клеток составляло 151,9×10³ кл/лунке, в сравнении с контрольным значением 181,3×10³ кл/лунке. С увеличением концентрации от 100 мкг/мл и выше ингибирующее действие экстракта усиливалось пропорционально концентрации и достигало максимальных значений при 2 мг/мл, где тотальное количество клеток снизилось в три раза по сравнению с контролем и составляло 60,0×10³ кл/лунку.

На основании результатов, полученных в данной работе, можно заключить следующее.

1. Исследуемый экстракт Т. canis обладает выраженным антипролиферативным действием на клетки MCF-7 в концентрациях 100, 250, 500, 1 и 2 мг/мл, которое проявляется к 96 ч инкубации.

2. Влияние экстракта на клетки MCF-7 носит дозозависимый характер.

3. Ингибирующее действие экстракта Т. canis на пролиферативную активность культуры клеток Сасо-2 проявляется в меньшей степени и в более высоких концентрациях 500, 1 и 2 мг/мл.

4. Культура клеток MCF-7 обладает более высокой чувствительностью к антипролиферативному действию экстракта Т. canis по сравнению с клетками Сасо-2 в модели in vitro через 96 ч культивирования.

Литература

1. Kang Y.J., Jo Jo, Cho M.K. et al. Thrichinella spiralis infection reduces tumor growth and metastasis of B16-F10 melanoma cells // Vet. Parasitol. - 2013. - V. 196(1-2). - P. 106-113.

2. Molinari J.A., Ebersole J.L. Antineoplastic effects of long-term Trichinella spiralis infection on B-16 melanoma // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. - 1977. - V. 55(1-4). - P. 444-448.

3. Pocock D., Meerovitch E. The anti-neoplastic effect of trichinelosis in syngeneic murine model // Parasitology. - 1982. - V. 84 (Pt. 3). - P. 463-473.

4. Vasilev S., Ilic N., Gruden-Movsesijan A. et al. Necrosis and apoptosis in Trichinella spiralis-mediated tumour reduction // Cent. Eur. J. Immunology. - 2015. - V. 40(1). - P. 42-53.

5. Wang X.L., Fu B.Q., Yang S.J. et al. Trichinella spiralis - a potential antitumor agent // Vet. Parasitol. - 2009. - V. 159(3-4). - P. 249-252.

6. Wang X.L., Liu M.Y., Sun S.M. et al. An anti-tumor protein produced by Trichinella spiralis induces apoptosis in human hepatoma H7402 cells // Vet. Parasitol. - 2013. - V. 194(2-4). - P. 186-188.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству природного происхождения, обладающему антипролиферативной активностью. Средство, обладающее антипролиферативной активностью, представляющее собой белковый экстракт Toxocara canis, полученный путем экстрагирования гомогентата гельминтов Т. Canis фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2 в соотношении 1:10 в течение 36-48 ч при температуре 4°С, центрифугирования. Вышеописанное средство обладает выраженной антипролиферативной активностью. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.,2 пр.

1. Средство, обладающее антипролиферативной активностью, представляющее собой белковый экстракт Toxocara canis, полученный путем экстрагирования гомогентата гельминтов Т. Canis фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2 в соотношении 1:10 в течение 36-48 ч при температуре 4°С, и центрифугирования.

2.Средство по п.1, отличающееся тем, что оно обладает антипролиферативной активностью на моделях опухолевых клеток человека in vitro.