СПОСОБ ОТБОРА И ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНЫХ И МУЛЬТИСПЕЦИФИЧНЫХ НАЦЕЛИВАЮЩИХ ГРУПП С ЗАДАННЫМИ СВОЙСТВАМИ, ВКЛЮЧАЮЩИХ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ДВЕ РАЗЛИЧНЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ ГРУППИРОВКИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2017 года по МПК C07K16/00 C07K16/46 C12N9/16 C12P21/00 

В данном документе описан способ отбора и получения мультиспецифичных групп с использованием транспептидазы, такой как сортаза А, в которых специфичности могут быть выбраны независимо друг от друга, и применение данного способа для получения новых мультиспецифичных антител с заданными свойствами.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Моноклональные антитела имеют большой терапевтический потенциал и играют важную роль в современной линейке медицинских продуктов. На протяжении последнего десятилетия значимой тенденцией в фармацевтической промышленности была разработка моноклональных антител (mAb) и слитых полипептидов с Fc антитела (слитые полипептиды с кристаллизуемым фрагментом) в качестве терапевтических агентов при различных клинических ситуациях, включающих онкологию, хронические воспалительные заболевания, трансплантацию, инфекционные заболевания, сердечно-сосудистую медицину или офтальмологические заболевания (Carter, J.P., Nature Reviews Immunology 6 (2006) 343-357; Chan, A.C. and Carter, J.P., Nature Reviews Immunology 10 (2010) 301-316).

Клиническая эффективность терапевтического антитела основывается, главным образом, на двух функциональных свойствах: i) специфичном в отношении мишени связывании, опосредованном доменом Fv, и ii) иммуноопосредованной эффекторной функции, такой как ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность), CDC (комплементзависимая цитотоксичность) и ADCP (антителозависимый клеточный фагоцитоз), которые опосредованы областью Fc антитела. Область Fc иммуноглобулина класса IgG содержит шарнирную область и два константных домена (СН2 и СН3). Область Fc также взаимодействует с неонатальным рецептором FcRn и, посредством этого, определяет период полувыведения антитела in vivo. Шарнирная область представляет собой область, в которой плечи молекулы антитела образуют Y-подобную структуру, обеспечивающую гибкость молекулы в данной точке.

Подкласс/подклассы IgG отличаются числом дисульфидных связей и длиной шарнирной области.

Эффекторные функции, ассоциированные с областью Fc антитела, отличаются в зависимости от класса и подкласса антитела и включают, например, связывание антитела через его область Fc со специфичным рецептором Fc (FcR) на клетке, что запускает разные биологические ответы (см., например, Jiang, X.-R., et al., Nature Reviews Drug Discovery 10 (2011) 101-110; Presta, L.G., Current Opinion in Immunology 20 (2008) 460-470).

Шарнирная область антитела или слитого полипептида или конъюгата, содержащего область Fc, участвует в по меньшей мере части функций антитела, таких как связывание антигена и эффекторные функции антитела, опосредованные областью Fc. В то время как связывание антигена (особенно двухвалентное авидное связывание антителом) зависит от гибкости, длины и пространственной ориентации конкретной/нативной шарнирной области, эффекторные функции, опосредованные областью Fc, зависят от класса и подкласса антитела. Функциональная одновалентность, наблюдаемая для некоторых человеческих антител lgG4, по сравнению с двухвалентностью других антител IgG представляет собой другой пример, демонстрирующий участие области Fc в антигенсвязывающих свойствах (Salfeld, J.G., Nature Biotechnology 12 (2007) 1369-1372; Presta, L.G., Current Opinion in Immunology 20 (2008) 460-470).

Levary, D.A., et al. сообщают о слиянии белок-белок, катализируемом сортазой A (PLOS ONE 6 (2011)). Конструирование антитела в одноцепочечном формате против рецептора эпидермального фактора роста и мечение лигированием белка, опосредованным сортазой А, описано Madej, М.Р., et al. (Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1461-1470). Та, H.T., et al. описывают ферментативное мечение одноцепочечным антителом в качестве универсального подхода для направленной молекулярной визуализации и клеточной направленности при сердечно-сосудистых заболеваниях (Cir. Res. 109 (2011) 365-373). Рорр, М., et al. описывают белковую инженерию с получением и разрушением пептидных связей с использованием сортазы (Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50 (2011) 5024-5032). В WO 2010/087994 описаны способы лигирования и их применения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении описан способ предоставления высокоспецифичных терапевтических молекул с заданными свойствами для лечения заболевания, такого как рак, у пациента, нуждающегося в лечении, при этом терапевтическая молекула адаптирована к характеристикам заболевания пациента и/или к генотипу/фенотипу пациента.

Такая адаптация достигается получением молекулы с заданными свойствами, принимая во внимание генотип/фенотип клеток пациента, имеющих/пораженных заболеванием.

На первом этапе определяют генотип/фенотип клеток (например, присутствие и число/количество антигенов поверхности клетки, специфичных для заболевания), на которые предполагают оказать направленное воздействие терапевтической молекулы. Это может достигаться, например, методиками визуализации клеток, такими как иммуногистохимическое окрашивание (IHC, иммуногистохимия) клеток пациента, происходящих, например, из крови и/или материала биопсии, с использованием флуоресцентно меченых моноспецифичных (терапевтических или диагностических) антител. В качестве альтернативы, генотип/фенотип клеток можно анализировать после окрашивания мечеными терапевтическими или диагностическими антителами с использованием способов на основе FACS (флуоресцентная сортировка клеток). Для определения генотипа/фенотипа имеющих отношение к заболеванию клеток пациента также можно использовать методики визуализации in vivo, включающие оптическую визуализацию, молекулярную визуализацию, флуоресцентную визуализацию, биолюминисцентную визуализацию, MRI (магнитно-резонансная томография), PET (позитронно-эмиссионная томография), SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография), СТ (компьютерная томография) и прижизненную микроскопию. В зависимости от определенного генотипа/фенотипа клеток пациента, имеющих отношение к заболеванию, можно выбирать комбинацию направленно действующих/связывающих группировок с заданными свойствами и объединять их в терапевтической молекуле. Такая терапевтическая молекула может представлять собой, например, биспецифичное антитело.

Такие терапевтические молекулы с заданными свойствами i) будут высокоспецифичными, ii) будут иметь хорошую эффективность и iii) будут индуцировать меньше побочных эффектов по сравнению с традиционно выбираемыми терапевтическими средствами. Это может достигаться путем наделения терапевтической молекулы заданными свойствами улучшенного направленного действия и/или улучшенной доставки, например, для терапевтической загрузки в ее намеченное место действия.

Улучшенная доставка терапевтической молекулы к ее сайту действия, такому как, например, раковая клетка, может достигаться посредством повышенной/увеличенной селективности и/или специфичности терапевтической молекулы направленного действия по сравнению с традиционно выбираемыми терапевтическими молекулами. Терапевтическая молекула содержит по меньшей мере две группировки, которые специфично связываются с разными антигенами (например, с двумя разными поверхностными маркерами) или с разными эпитопами на том же самом антигене (например, два разных эпитопа на том же самом поверхностном маркере).

Повышенная селективность и/или специфичность терапевтической молекулы с заданными свойствами может достигаться одновременным связыванием обеих направленно действующих группировок с их соответствующими мишенями/эпитопами, т.е. она достигается посредством эффектов авидности. Особенно подходит комбинация двух связывающих группировок с аффинностью в отношении их соответствующих мишеней/эпитопов, варьирующей от низкой до средней. Кроме того, связывание вне мишени значительно снижается или даже может полностью устраняться.

Обнаружили, что могут быть предложены биспецифичные молекулы с заданными свойствами, обеспечивающие направленную доставку и связывание, с использованием реакции ферментативной конъюгации между первой связывающей группировкой, такой как связывающая группировка на основе домена дарпина, связывающая группировка на основе домена антикалина, связывающая группировка на основе домена scTCR, подобного фрагменту рецептора Т-клетки, связывающая группировка на основе домена VH верблюда, связывающая группировка на основе десятого домена фибронектина 3, связывающая группировка на основе домена тенасцина, связывающая группировка на основе домена кадгерина, связывающая группировка на основе домена ICAM, связывающая группировка на основе домена титина, связывающая группировка на основе домена GCSF-R (рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора), связывающая группировка на основе домена рецептора цитокина, связывающая группировка на основе домена ингибитора гликозидазы, связывающая группировка на основе домена супероксиддисмутазы или фрагмент антитела (фрагмент Fab или scFv), содержащий аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в его С-концевой области аминокислотной последовательности, и фрагментом в виде неполного одноплечего антитела (OA-Fc), который содержит тяжелую цепь полноразмерного антитела, образующую пару с когнатной полноразмерной легкой цепью, и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела с олигоглицином G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) на его N-конце, с использованием фермента сортазы А.

Обнаружили, что с использованием описанного здесь способа можно задавать свойства, например, биспецифичных антител, специфично направленных на два поверхностных маркера, находящихся на поверхности клетки, такой как раковая клетка. Поскольку специфичности связывания индивидуально предоставлены исходными компонентами, можно задавать свойства мультиспецифичной направленной доставки и связывания молекулы просто путем определения поверхностных маркеров, присутствующих на клетке, например, на раковой клетке, и конъюгирования соответствующих фрагментов антител, которые специфично связываются с данными поверхностными маркерами или их соответствующими лигандами, посредством ферментативной методики. Поскольку ферментативная конъюгация осуществляется ферментом сортазой А, образующееся биспецифичное антитело характеризуется присутствием аминокислотной последовательности LPX1TG ((SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком).

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения мультиспецифичной связывающей молекулы, включающий стадию инкубирования

(i) первой связывающей группировки, содержащей аминокислотную последовательность LPX1TG ((SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков,

(ii) фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела и

при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце,

и

(iii) фермента сортазы А,

и получения, посредством этого, мультиспецифичной связывающей молекулы.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения мультиспецифичной связывающей молекулы, включающий следующие стадии:

(i) определение маркеров поверхности клетки, присутствующих в образце, содержащем клетки, и i) выбор из них по меньшей мере первого маркера поверхности клетки и второго маркера поверхности клетки или ii) выбор из них совокупности маркеров поверхности клетки, соответствующих числу специфичностей связывания мультиспецифичной связывающей молекулы,

(ii) инкубирование (а) первой связывающей группировки, которая специфично связывается с первым маркером поверхности клетки или ее лигандом, и которая содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, (б) фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым маркером поверхности клетки или его лигандом, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А

и получение, посредством этого, мультиспецифичной связывающей молекулы.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ отбора по меньшей мере двух связывающих группировок из набора/библиотеки связывающих группировок, которые собираются в одну мультиспецифичную связывающую молекулу путем инкубирования (а) первой связывающей группировки, которая специфично связывается с эпитопом или антигеном, и которая содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, (б) фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым эпитопом или антигеном, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (гл равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А, для применения в качестве терапевтического агента. Такой агент имеет улучшенные свойства направленного действия/доставки.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения биспецифичного антитела, включающий стадию инкубирования

(i) фрагмента Fab антитела или scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков,

(ii) фрагмента в виде неполного одноплечего антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и

при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце,

и

(iii) фермента сортазы А,

и получение, посредством этого, биспецифичного антитела.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения биспецифичного антитела, включающий следующие стадии:

(i) определение маркеров поверхности клетки, присутствующих в образце, содержащем клетки, и выбор из них по меньшей мере первого маркера поверхности клетки и второго маркера поверхности клетки,

(ii) инкубирование (а) фрагмента Fab антитела или scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab антитела или scFv антитела специфично связывается с первым маркером поверхности клетки или его лигандом (б) фрагмента в виде неполного одноплечего антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым маркером поверхности клетки или его лигандом, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А

и получение, посредством этого, биспецифичного антитела.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения комбинации связывающих группировок для мультиспецифичной связывающей молекулы, включающий следующие стадии:

(i) определение специфичности связывания и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полувыведения in vivo множества мультиспецифичных связывающих молекул, при этом в множестве мультиспецифичных связывающих молекул содержится каждая (возможная) комбинация связывающих группировок,

и

(ii) выбор мультиспецифичной связывающей молекулы с подходящей специфичностью связывания и/или селективностью, и/или аффинностью, и/или эффекторной функцией, и/или периодом полувыведения in vivo и, посредством этого, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов, включающий следующие стадии:

(i) определение специфичности связывания и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полувыведения in vivo множества биспецифичных антител, полученных объединением (а) каждого члена первого множества фрагментов Fab антитела или фрагментов scFv антитела, при этом каждый член содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab или scFv антитела специфично связывается с первым эпитопом или антигеном, с (б) каждым членом из множества фрагментов в виде неполного одноплечего антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым эпитопом или антигеном, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) ферментом сортазой А

и

(ii) выбор биспецифичного антитела с подходящей специфичностью связывания и/или селективностью, и/или аффинностью, и/или эффекторной функцией, и/или периодом полувыведения in vivo и, посредством этого, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.

В одном воплощении связывающие группировки независимо друг от друга выбраны из следующих: связывающая группировка на основе домена дарпина, связывающая группировка на основе домена антикалина, связывающая группировка на основе домена scTCR, подобного фрагменту рецептора Т-клетки, связывающая группировка на основе домена VH верблюда, связывающая группировка на основе десятого домена фибронектина 3, связывающая группировка на основе домена тенасцина, связывающая группировка на основе домена кадгерина, связывающая группировка на основе домена ICAM, связывающая группировка на основе домена титина, связывающая группировка на основе домена GCSF-R, связывающая группировка на основе домена рецептора цитокина, связывающая группировка на основе домена ингибитора гликозидазы, связывающая группировка на основе домена супероксиддисмутазы или фрагменты антитела, подобные фрагментам Fab или scFv.

В одном воплощении всех аспектов мультиспецифичная связывающая молекула представляет собой биспецифичное антитело, и/или первая связывающая группировка представляет собой фрагмент Fab антитела или scFv антитела.

В одном воплощении объединение характеризуется инкубированием фрагмента Fab антитела или фрагмента scFv антитела и фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, с ферментом сортазой А.

В одном воплощении фрагмент Fab или фрагмент scFv антитела содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела фрагмента в виде одноплечего антитела представляют собой когнатные цепи антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым поверхностным маркером, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность GGGSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 04, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, где X1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х3 представляет собой метку в виде аминокислотной последовательности.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G, и при этом Х3 представляет собой метку в виде аминокислотной последовательности.

В одном воплощении всех аспектов полипептид области Fc тяжелой цепи антитела содержит два остатка глицина на его N-конце.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент в виде одноплечего антитела содержит аминокислотную последовательность GGCPX4C (SEQ ID NO: 08) на N-конце его тяжелой цепи, при этом Х4 представляет собой S или Р.

В одном воплощении всех аспектов Х1 представляет собой Е.

Одним аспектом, как здесь описано, является описанная здесь мультиспецифичная связывающая молекула.

Одним аспектом является мультиспецифичная связывающая молекула, содержащая аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в одной из ее тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в одной из ее тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р, с n, равным 1, 2 или 3) в одной из ее тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р) в одной из ее тяжелых цепей, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G.

Одним аспектом, как здесь описано, является биспецифичное антитело, полученное описанным здесь способом.

Одним аспектом является биспецифичное антитело, содержащее аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении биспецифичное антитело содержит аминокислотную последовательность G_nSLPXUG (SEQ ID NO: 02, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении биспецифичное антитело содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р, с n, равным 1, 2 или 3) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении биспецифичное антитело содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р) в одной из его тяжелых цепей, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G.

Одним аспектом, как здесь описано, является фармацевтическая композиция, содержащая мультиспецифичную связывающую молекулу, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано, в изготовлении лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рака.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ лечения индивида, имеющего рак, включающий введение индивиду эффективного количества мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ разрушения раковых клеток у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является фармацевтическая композиция, содержащая биспецифичное антитело, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение биспецифичного антитела, как здесь описано, в изготовлении лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рака.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ лечения индивида, имеющего рак, включающий введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ разрушения раковых клеток у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела, как здесь описано. В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, область Fc представляет собой человеческую область Fc или ее вариант.

В одном воплощении область Fc человеческого антитела принадлежит к человеческому подклассу lgG1 или человеческому подклассу lgG2, или человеческому подклассу lgG3, или человеческому подклассу lgG4.

В одном воплощении область Fc антитела представляет собой область Fc человеческого антитела человеческого подкласса lgG1 или человеческого подкласса lgG4.

В одном воплощении область Fc человеческого антитела содержит мутацию встречающегося в природе аминокислотного остатка по меньшей мере в одном из следующих положений аминокислот: 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329 и/или 331 до другого остатка, где остатки в области Fc антитела пронумерованы согласно индексу EU (Европейсткий Союз) по Kabat.

В одном воплощении область Fc человеческого антитела содержит мутацию встречающегося в природе аминокислотного остатка в положении 329 и по меньшей мере одну другую мутацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из группы, содержащей аминокислотные остатки в положении 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 и 331, до другого остатка, где остатки в области Fc пронумерованы согласно индексу EU по Kabat. Замена данных конкретных аминокислотных остатков приводит к изменению эффекторной функции области Fc по сравнению с немодифицированной областью Fc (дикого типа).

В одном воплощении область Fc человеческого антитела имеет пониженную аффинность с человеческим FcγRIIIA и/или FcγRIIA, и/или FcγRI по сравнению с конъюгатом, содержащим соответствующую область Fc IgG дикого типа.

В одном воплощении аминокислотный остаток в положении 329 области Fc человеческого антитела заменен глицином или аргинином, или достаточно большим аминокислотным остатком для разрушения пролиновой слоистой структуры в области Fc.

В одном воплощении мутацией встречающегося в природе аминокислотного остатка в области Fc человеческого антитела является по меньшей мере одна из S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G и/или P331S.

В одном воплощении мутацией является L234A и L235A, если область Fc антитела принадлежит к человеческому подклассу lgG1, или S228P и L235E, если область Fc антитела принадлежит к человеческому подклассу lgG4.

В одном воплощении область Fc антитела содержит мутацию P329G.

В одном воплощении область Fc антитела содержит мутацию T366W в полипептиде области Fc первой тяжелой цепи и мутации T366S, L368A и Y407V в полипептиде области Fc второй тяжелой цепи, где нумерация осуществляется согласно индексу EU по Kabat.

В одном воплощении область Fc антитела содержит мутацию S354C в полипептиде области Fc первой тяжелой цепи и мутацию Y349C в полипептиде области Fc второй тяжелой цепи.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем описании и формуле изобретения нумерацией остатков в области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина является нумерация согласно индексу EU по Kabat (Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, прямо включенная сюда посредством ссылки).

Термин «изменение» обозначает мутацию, присоединение или делецию одного или более чем одного аминокислотного остатка в родительской аминокислотной последовательности, например, антитела или слитого полипептида, содержащего по меньшей мере часть области Fc, связывающуюся FcRn, с получением варианта антитела или слитого полипептида.

Термин «мутация аминокислот» обозначает модификацию аминокислотной последовательности родительской аминокислотной последовательности. Типичные модификации включают аминокислотные замены, вставки и/или делеции. В одном воплощении мутация аминокислоты представляет собой замену. Термин «мутации аминокислот в положении» обозначает замену или делецию определенного остатка или вставку по меньшей мере одного аминокислотного остатка рядом с определенным остатком. Термин «вставка рядом с определенным остатком» обозначает вставку в пределах одного-двух остатков рядом с ним. Вставка может быть N-концевой или С-концевой по отношению к определенному остатку.

Термин «аминокислотная замена» обозначает замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка в заданной родительской аминокислотной последовательности другим «заменяющим» аминокислотным остатком. Заменяющий остаток или остатки может быть «аминокислотным остатком, встречающимся в природе» (т.е. кодируемым генетическим кодом), и выбранным из группы, состоящей из следующих: аланин (Ala); аргинин (Arg); аспарагин (Asn); аспарагиновая кислота (Asp); цистеин (Cys); глутамин (Gln); глутаминовая кислота (Glu); глицин (Gly); гистидин (His); изолейцин (Ilе): лейцин (Leu); лизин (Lys); метионин (Met); фенилаланин (Phe); пролин (Pro); серии (Ser); треонин (Thr); триптофан (Тrр); тирозин (Туr) и валин (Val). В одном воплощении заменяющий остаток не является цистеином. Замена на один или более чем один аминокислотный остаток, не встречающийся в природе, также здесь охватывается определением аминокислотной замены. Термин «аминокислотный остаток, не встречающийся в природе» обозначает остаток, отличный от перечисленных выше аминокислотных остатков, встречающийся в природе, который способен ковалентно связываться со смежным(ми) аминокислотным(ми) остатком(ами) в полипептидной цепи. Примеры аминокислотных остатков, не встречающихся в природе, включают норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин, Aib (α-аминомасляная кислота) и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как аналоги, описанные в Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336. Для получения таких аминокислотных остатков, не встречающихся в природе, можно использовать методики Noren, et al. (Science 244 (1989) 182) и/или Ellman, et al. (выше). Вкратце, данные методики включают химическую активацию супрессорной тРНК аминокислотным остатком, не встречающимся в природе, с последующей транскрипцией in vitro и трансляцией РНК. Не встречающиеся в природе аминокислоты также могут быть включены в пептиды посредством химического пептидного синтеза и последующего слияния данных пептидов с полипептидами, полученными рекомбинантно, такими как антитела или фрагменты антител.

Термин «вставка аминокислоты» обозначает включение по меньшей мере одного дополнительного аминокислотного остатка в заданную родительскую аминокислотную последовательность. В то время как вставка обычно будет состоять во вставке одного или двух аминокислотных остатков, в настоящей заявке рассматриваются большие «пептидные вставки», например, вставка от примерно трех до примерно пяти или даже вплоть до примерно десяти аминокислотных остатков. Вставленный(ные) остаток(тки) может(гут) быть встречающим(ми)ся в природе или не встречающим(ми)ся в природе, как определено выше.

Термин «делеция аминокислоты» обозначает удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка в заданном положении в аминокислотной последовательности.

В пределах данной заявки всякий раз, когда упоминается изменение аминокислоты, оно представляет собой преднамеренное изменение аминокислоты, а не случайную модификацию аминокислоты.

Термин «метка в виде аминокислотной последовательности» обозначает последовательность аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями, которая имеет свойства специфичного связывания. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности представляет собой аффинную метку или метку для очистки. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности выбрана из метки, содержащей Аrg, метки, содержащей His, метки Flag, метки 3xFlag, метки Strep, метки Nano, метки SBP, метки с-myc, метки S, кальмодулинсвязывающего пептида, целлюлозосвязывающего домена, хитинсвязывающего домена, метки GST (глутатион-S-трансфераза) или метки МВР (основной белок миелина). В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности выбрана из SEQ ID NO: 11 (RRRRR) или SEQ ID NO: 12 (RRRRRR), или SEQ ID NO: 13 (HHHHHH), или SEQ ID NO: 14 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK), или SEQ ID NO: 15 (DYKDDDDK), или SEQ ID NO: 16 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK), или SEQ ID NO: 17 (AWRHPQFGG), или SEQ ID NO: 18 (WSHPQFEK), или SEQ ID NO: 19 (MDVEAWLGAR), или SEQ ID NO: 20 (MDVEAWLGARVPLVET), или SEQ ID NO: 21 (MDEKTTGWRGGHWEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), или SEQ ID N0:22 (EQKLISEEDL), или SEQ ID NO: 23 (KETAAAKFERQHMDS), или SEQ ID NO: 24 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), или SEQ ID NO: 25 (целлюлозосвязывающий домен), или SEQ ID NO: 26 (целлюлозосвязывающий домен), или SEQ ID NO: 27 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ), или SEQ ID NO: 28 (метка GST), или SEQ ID NO: 29 (метка MBP).

Термин «фрагмент антитела» обозначает молекулу, отличную от полноразмерного антитела, которая содержит часть полноразмерного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

Фрагменты антител включают фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv и scFv, и другие фрагменты, описанные ниже, но не ограничиваются ими. Относительно обзора определенных фрагментов антител, см. Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Относительно обзора фрагментов scFv см., например, Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp.269-315; см. также WO 93/16185; US 5571894 и US 5587458. Относительно обсуждения фрагментов Fab и F(ab')₂, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором реутилизации, и имеющие повышенный период полувыведения in vivo, см. US 5869046.

Диатела представляют собой фрагменты антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифичными. См., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 и Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Триатела и тетратела также описаны в Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9(2003) 129-134).

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи, или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных воплощениях однодоменное антитело представляет собой однодоменное человеческое антитело (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, патент США №6248516 В1).

Фрагменты антител можно получать разными методиками, включающими протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продукцию рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фагом), как здесь описано, но не ограничивающимися ими.

Термин «биспецифичное антитело» обозначает антигенсвязывающую молекулу, которая может специфично связываться с первым антигеном или эпитопом и со вторым антигеном или эпитопом, при этом первый антиген или эпитоп отличаются от второго антигена или эпитопа.

Форматы биспецифичных антител описаны, например, в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.

Термин «антителозависимая клеточная цитотоксичность», кратко - «ADCC», обозначает опосредованную клетками реакцию, в которой неспецифичные в отношении антигена цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcR (рецепторы Fc) (например, естественные клетки-киллеры (NK-клетки), нейтрофилы и макрофаги), распознают клетку-мишень посредством связывания с областью Fc иммуноглобулина и затем вызывают лизис данной клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена в Таблице 3 на стр. 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492.

Термин «антителозависимый клеточный фагоцитоз», кратко - «ADCP», обозначает процесс, посредством которого клетки, покрытые антителами, интернализуются, либо целиком, либо частично, фагоцитарными иммунными клетками (например, макрофагами, нейтрофилами или дендритными клетками), которые связываются с областью Fc иммуноглобулина.

Термин «связывание с рецептором Fc» обозначает связывание области Fc с рецептором Fc, например, в анализе BIAcore^® (Pharmacia Biosensor АВ, Уппсала, Швеция).

В анализе BIAcore^® рецептор Fc связывают с поверхностью, и связывание аналита, например, слитого полипептида, содержащего область Fc, или антитела, измеряют поверхностным плазмонным резонансом (SPR). Аффинность связывания определяется значениями kа (константа ассоциации: константа скорости ассоциации слитого полипептида или конъюгата с областью Fc с образованием комплекса область Fc/рецептор Fc), kd (константа диссоциации: константа скорости диссоциации слитого полипептида или конъюгата с областью Fc от комплекса область Fc/рецептор Fc) и KD (kd/ka). В качестве альтернативы, сигнал связывания сенсограммы SPR можно непосредственно сравнивать с сигналом ответа контроля по отношению к высоте сигнала резонанса и характеристикам диссоциации.

Термин «C1q» обозначает полипептид, который включает сайт связывания с областью Fc иммуноглобулина. C1q совместно с двумя сериновыми протеазами, С1r и C1s, образуют комплекс С1, первый компонент пути цитотоксичности, зависимой от комплемента (CDC). Человеческий C1q можно приобрести коммерчески, например, у Quidel, Сан-Диего, Калифорния.

Термин «домен СН2» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 231 по EU до положения 340 по EU (система нумерации EU согласно Kabat). В одном воплощении домен СН2 имеет аминокислотную последовательность APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 30). Домен СН2 уникален в том, что он не вступает в тесное парное взаимодействие с другим доменом. Скорее две N-связанные разветвленные углеводные цепи вклиниваются между двумя доменами СН2 интактной нативной области Fc. Высказывали предположение о том, что данный углевод может обеспечивать замену парного взаимодействия домен-домен и помогать стабилизировать домен СН2. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206.

Термин «домен СН3» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 341 по EU до положения 446 по EU. В одном воплощении домен СН3 имеет аминокислотную последовательность

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 31).

Термин «класс» антитела обозначает тип константного домена или константной области, которыми обладает его тяжелая цепь. У человека существуют пять главных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, lgG₁, lgG₂, lgG₃, lgG₄, lgA₁ и lgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Термин «комплементзависимая цитотоксичность», кратко - «CDC», обозначает механизм индуцирования гибели клеток, при котором область Fc связанного с мишенью слитого полипептида или конъюгата с областью Fc, активирует серию ферментативных реакций, завершающихся образованием отверстий в мембране клетки-мишени. Типично комплексы антиген-антитело, такие как комплексы на клетках-мишенях, покрытых антителами, связываются и активируют компонент C1q комплемента, что, в свою очередь, активирует каскад комплемента, приводящий к гибели клетки-мишени. Активация комплемента также может приводить к отложению компонентов комплемента на поверхности клетки-мишени, что облегчает ADCC или ADCP посредством связывания с рецепторами комплемента (например, CR3) на лейкоцитах.

Термин «эффекторная функция» обозначает те биологические активности, приписываемые области Fc антитела, которые варьируют, в зависимости от подкласса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание с рецептором Fc; антител озависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз (ADCP); понижающую регуляцию рецепторов поверхности клетки (например, рецептора В-клетки) и активацию В-клеток. Такая функция может осуществляться, например, связыванием области Fc с рецептором Fc на иммунной клетке с фагоцитарной или литической активностью или посредством связывания области Fc с компонентами системы комплемента.

Термин «эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, относится к эффективному количеству при дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желательного терапевтического или профилактического результата.

Термин «пониженная эффекторная функция» обозначает уменьшение специфической эффекторной функции, ассоциированной с молекулой, подобной, например, ADCC или CDC, по меньшей мере на 20% по сравнению с контрольной молекулой (например, с полипептидом с областью Fc дикого типа). Термин «значительно пониженная эффекторная функция» обозначает уменьшение специфической эффекторной функции, ассоциированной с молекулой, подобной, например, ADCC или CDC, по меньшей мере на 50% по сравнению с контрольной молекулой.

Термин «область Fc» обозначает С-концевую область иммуноглобулина. Область Fc представляет собой димерную молекулу, содержащую два фрагмента тяжелой цепи антитела, связанные дисульфидной связью (полипептидные цепи области Fc тяжелой цепи). Область Fc может быть получена расщеплением интактного (полноразмерного антитела) папаином или расщеплением IdeS, или расщеплением трипсином, или может быть получена рекомбинантно.

Область Fc, которую можно получать из полноразмерного антитела или иммуноглобулина, содержит по меньшей мере остатки от положения 226 (Cys) до С-конца полноразмерной тяжелой цепи и, таким образом, содержит часть шарнирной области и два или три константных домена, т.е. домен СН2, домен СН3 и дополнительный домен СН4 на антителах класса IgE и IgM. Из US 5648260 и US 5624821 известно, что модификация определенных аминокислотных остатков в области Fc приводит к фенотипическим эффектам.

Образование димерной области Fc, содержащей два идентичных или неидентичных фрагмента тяжелой цепи антитела, опосредовано нековалентной димеризацией содержащихся в них доменов СН3 (относительно участвующих аминокислотных остатков, см., например, Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273). Область Fc ковалентно стабилизирована образованием дисульфидных связей в шарнирной области (см., например, Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79). Введение замен аминокислотных остатков в домен СН3 для того, чтобы нарушать димеризацию посредством взаимодействий доменов СН3-СН3, не оказывает вредного влияния на связывание с неонатальным рецептором Fc (FcRn) из-за локализации остатков, участвующих в димеризации доменов СН3-СН3, на внутренней поверхности домена СН3, тогда как остатки, участвующие во взаимодействии область Fc-FcRn, расположены снаружи домена СН2-СН3.

Остатки, ассоциированные с эффекторными функциями области Fc, расположены в шарнирной области, домене СН2 и/или домене СН3 при определении для молекулы полноразмерного антитела. Функциями, ассоциированными/опосредованными областью Fc, являются:

(i) антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC),

(ii) связывание комплемента (C1q), активация и комплементзависимая цитотоксичность (CDC),

(iii) фагоцитоз/клиренс комплексов антиген-антитело,

(iv) в некоторых случаях высвобождение цитокинов и

(v) период полувыведения/скорость клиренса антитела и комплексов антиген-антитело.

Эффекторные функции, ассоциированные с областью Fc, инициируются взаимодействием области Fc с молекулами или рецепторами, специфичными в отношении эффекторной функции. Активацию рецептора, главным образом, могут осуществлять антитела подкласса lgG1, тогда как антитела подклассов lgG2 и lgG4 не имеют эффекторной функции или имеют ограниченную эффекторную функцию.

Рецепторами, индуцирующими эффекторную функцию, являются рецепторы Fc типов (и подтипов) FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Эффекторные функции, ассоциированные с подклассом lgG1, могут быть снижены введением специфических аминокислотных замен в нижнюю шарнирную область, таких как L234A и/или L235A, которая участвует в связывании с FcγR и C1q. Определенные аминокислотные остатки, особенно локализованные в домене СН2 и/или СН3, также ассоциированы с периодом полувыведения молекулы антитела или слитого полипептида с областью Fc в системе кровообращения. Период полувыведения в системе кровообращения определяется связыванием области Fc с неонатальным рецептором Fc (FcRn).

Сиалильные остатки, присутствующие на гликоструктуре области Fc, участвуют в противовоспалительной активности, опосредованной областью Fc (см., например, Anthony, R.M., et al., Science 320 (2008) 373-376).

Нумерация аминокислотных остатков в константной области антитела осуществляется согласно индексу EU по Kabat (Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242).

Термин «человеческая область Fc» обозначает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина человеческого происхождения, которая содержит по меньшей мере часть шарнирной области, домен СН2 и домен СН3. В одном воплощении область Fc тяжелой цепи человеческого антитела IgG простирается от примерно Glu216 или от примерно Cys226 или от примерно Рrо230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) области Fc антитела может присутствовать или может не присутствовать.

Термин «вариант области Fc» обозначает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности «нативной» области Fc или области Fc «дикого типа» за счет по меньшей мере одного «изменения/мутации аминокислоты». В одном воплощении вариант области Fc имеет по меньшей мере одну мутацию аминокислоты по сравнению с нативной областью Fc или областью Fc родительского полипептида, например, от примерно одной до примерно десяти мутаций аминокислот, и в одном воплощении от примерно одной до примерно пяти мутаций аминокислот в нативной области Fc или в области Fc родительского полипептида. В одном воплощении (вариант) области Fc имеет по меньшей мере примерно 80%-ную гомологию с областью Fc дикого типа и/или с областью Fc родительского полипептида, и в одном воплощении вариант области Fc имеет по меньшей мере примерно 90%-ную гомологию, в одном воплощении вариант области Fc имеет по меньшей мере примерно 95%-ную гомологию.

Варианты области Fc, как здесь описано, определяются изменениями аминокислот, которые они содержат. Таким образом, например, термин P329G обозначает вариант области Fc с мутацией пролина до глицина в положении аминокислоты 329 относительно родительской (дикого типа) области Fc. Идентичность аминокислоты дикого типа может быть неопределенной, в данном случае вышеупомянутый вариант именуется 329G. Для всех положений, обсуждаемых в настоящем изобретении, нумерация осуществляется согласно индексу EU. Индекс EU или индекс EU согласно Kabat, или схема нумерации EU относится к нумерации антитела EU (Edelman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85, тем самым включенная целиком посредством ссылки). Изменением может быть присоединение, делеция или мутация. Термин «мутация» обозначает замену на встречающиеся в природе аминокислоты, а также замену на не встречающиеся в природе аминокислоты, см., например, US 6586207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024 и Wang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10 (все включены сюда целиком посредством ссылки).

Полипептидная цепь человеческой области Fc дикого типа подкласса lgG1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутациями L234A, L235A имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией T366S, 368А и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта, человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией L234A, L235A и T366S, 368А и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией L234A, L235A и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией L234A, L235A и P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса IgG 1 с мутацией P239G и T366S, 368А и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией P329G и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией L234A, L235A и P329G и T366S, 368А и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG1 с мутацией L234A, L235A, P329G и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь человеческой области Fc дикого типа подкласса lgG4 имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG4 с мутацией S228P и L235E имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc подкласса lgG4 с мутацией S228P, L235E и P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Термин «рецептор Fc», сокращенно «FcR», обозначает рецептор, который связывается с областью Fc. В одном воплощении FcR представляет собой человеческий FcR с нативной последовательностью. Кроме того, в одном воплощении FcR представляет собой FcR, который связывается с антителом IgG (рецептор Fc гамма), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая их аллельные варианты и формы, образовавшиеся в результате альтернативного сплайсинга. Рецепторы FcγRII включают FcγRI IA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, которые отличаются, главным образом, в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в его цитоплазматическом домене активирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в его цитоплазматическом домене ингибирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITIM) (см., например, Dаëron, М., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234). Обзор FcR делается в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492, Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34, de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341. Термином «FcR» здесь охватываются и другие FcR, включающие FcR, подлежащие идентификации в будущем. Данный термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод (см., например, Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587; Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).

Термин «рецептор Fc гамма», сокращенно «FcγR», обозначает любого члена семейства белков, которые связываются с областью Fc антитела IgG, и они кодируются геном FcγR. У человека данное семейство включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIA, FcγRIB и FcγRIC, FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRII А (включая аллотипы Н131 и R131), FcγRIIB (включая FcγRIIB-1 и FcγRIIB-2), и FcγRIIC, и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIA (включая аллотипы V158 и F158); и FcγRIIIB (включая аллотипы FcγRIIB-NA1 и FcγRIIB-NA2) (см., например, Jefferis et al., Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65, полностью включенную посредством ссылки), а также любые неоткрытые человеческие FcγR или изоформы или аллотипы FcγR, но не ограничивается ими. FcγR может происходить из любого организма, включая людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян, но не ограничиваясь ими. Мышиные FcγR включают FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (CD16-2), а также любые неоткрытые мышиные FcγR или изоформы или аллотипы FcγR, но не ограничиваются ими. Во взаимодействии область Fc-FcγR участвуют аминокислотные остатки 234-239 (нижняя шарнирная область), 265-269 (петля В/С), 297-299 (петля D/E) и 327-332 (петля F/G) (Sondermann, et al., Nature 406 (2000) 267-273). Мутации аминокислот, которые приводят к ослабленному связыванию/аффинности в отношении FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB и/или FcγRIIIA, включают N297A (сопутствует пониженной иммуногенности и пролонгированному полупериоду связывания/аффинности) (Routledge, et al., Transplantation 60 (1995) 847; Friend et al., Transplantation 68 (1999) 1632; Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (1995) 6591), остатки 233-236 (Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2 (1995) 77; Armour et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613). Некоторые типичные аминокислотные замены описаны в US 7355008 и US 7381408.

Термин «неонатальный рецептор Fc», сокращенно «FcRn», обозначает белок, который связывается с областью Fc антитела IgG и кодируется, по меньшей мере частично, геном FcRn. FcRn может происходить из любого организма, включая людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян, но не ограничиваясь ими. Как известно в данной области, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, часто называемых тяжелой цепью и легкой цепью. Легкая цепь представляет собой бета-2-микроглобулин, и тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если здесь не отмечено иное, термин «FcRn» или «белок FcRn» относится к комплексу тяжелой цепи FcRn с бета-2-микроглобулином. Взаимодействующие аминокислотные остатки области Fc с FcRn располагаются около соединения доменов СН2 и СНЗ. Все остатки, образующие контакт область Fc-FcRn, находятся в пределах одной тяжелой цепи IgG. Участвующими аминокислотными остатками являются 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 (все в домене СН2) и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 (все в домене СН3). Мутации аминокислот, которые приводят к усиленному связыванию/аффинности в отношении FcRn, включают Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

Термин «полноразмерное антитело» обозначает антитело, которое имеет структуру и аминокислотную последовательность, по существу идентичные структуре нативного антитела, а также полипептиды, которые содержат область Fc, как здесь описано.

Термин «полноразмерная тяжелая цепь антитела» обозначает полипептид, содержащий в направлении от N- к С-концу вариабельный домен антитела, первый константный домен, шарнирную область тяжелой цепи антитела, второй константный домен и третий константный домен.

Термин «область Fc тяжелой цепи антитела» обозначает полипептид, содержащий шарнирную область тяжелой цепи антитела, первый константный домен и второй константный домен.

Термин « легкая цепь полноразмерного антитела» обозначает полипептид, содержащий в направлении от N- к С-концу вариабельный домен антитела и константный домен.

Термин «шарнирная область» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая соединяет домен СН1 и домен СН2 тяжелой цепи антитела дикого типа, например, от примерно положения 216 до примерно положения 230 согласно системе нумерации EU по Kabat, или от примерно положения 226 до примерно положения 230 согласно системе нумерации EU по Kabat. Шарнирные области других подклассов IgG можно определять выравниванием с остатками цистеина шарнирной области последовательности подкласса lgG1.

Шарнирная область обычно представляет собой димерную молекулу, состоящую из двух полипептидов с идентичной аминокислотной последовательностью. Шарнирная область обычно содержит примерно 25 аминокислотных остатков и является гибкой, обеспечивая независимое перемещение антигенсвязывающих областей. Шарнирная область может подразделяться на три домена: верхний, средний и нижний шарнирный домен (см., например, Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).

Термин «нижняя шарнирная область» области Fc обозначает отрезок аминокислотных остатков, расположенный непосредственно С-терминально по отношению к шарнирной области, т.е. остатки 233-239 области Fc согласно нумерации EU по Kabat.

Термин «область Fc дикого типа» обозначает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности области Fc, встречающейся в природе. Человеческие области Fc дикого типа включают нативную область Fc человеческого lgG1 (не-А и А аллотипов), нативную область Fc человеческого lgG2, нативную область Fc человеческого lgG3 и нативную область Fc человеческого lgG4, а также их варианты, встречающиеся в природе.

Термин «индивид» или «субъект» обозначает млекопитающее. Млекопитающие включают домашних животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, человек и приматы, не являющиеся человеком, такие как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы), но не ограничиваются ими. В определенных воплощениях индивид или субъект является человеком.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к последовательности эталонного полипептида определяется как процентная доля аминокислотных остатков в интересующей последовательности, которые являются идентичными аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотной последовательности может достигаться разными способами, которые находятся в пределах специальных знаний в данной области, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для приведенных здесь целей, однако, значения % идентичности аминокислотной последовательности генерируют с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Авторство компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2 принадлежит Genentech, Inc., и исходный код с пользовательской документацией был подан в Бюро регистрации авторских прав США, Washington D.C., 20559, где он зарегестрирован под №регистрации авторских прав США TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной от Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или может быть составлена из исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения на операционной системе UNIX, включая цифровую UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей заданы программой ALIGN-2 и не изменяются.

В ситуациях, когда для сравнений аминокислотных последовательностей используется ALIGN-2, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А к, с или относительно данной аминокислотной последовательности В (который, в качестве альтернативы, можно перефразировать как то, что данная аминокислотная последовательность А имеет или обладает определенным % идентичности аминокислотной последовательности к, с или относительно данной аминокислотной последовательности В) рассчитывается следующим образом:

100 умножить на долю X/Y

где X представляет собой число аминокислотных остатков, оцениваемых программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 как идентичные соответствия, при выравнивании А и В данной программой, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в В. Будет понятно, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А к В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В к А. Если конкретно не утверждается иное, все использованные здесь значения % идентичности аминокислотной последовательности получены, как описано в непосредственно предшествующем абзаце, с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечивать эффективную биологическую активность содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводилась бы данная композиция.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Термин «фенотип пациента» обозначает состав рецепторов поверхности клетки в типе клеток от пациента. Данный состав может представлять собой качественный, а также количественный состав. Клетки, для которых определен/приведен генотип, могут представлять собой одиночную клетку или образец, содержащий много клеток.

Термин «положение» обозначает место аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности полипептида. Положения могут быть пронумерованы последовательно или согласно установленному формату, например индексу EU по Kabat для нумерации антител.

Термин «с измененной» аффинностью связывания с FcR или активностью ADCC обозначает полипептид, который имеет либо увеличенную, либо сниженную активность связывания с FcR и/или активность ADCC по сравнению с родительским полипептидом (например, полипептидом, содержащим область Fc дикого типа). Вариант полипетида, который «имеет усиленное связывание» с FcR, связывается с по меньшей мере одним FcR с меньшей константой диссоциации (т.е. лучшей/более высокой аффинностью), чем родительский полипептид или полипептид дикого типа. Вариант полипетида, который «имеет ослабленное связывание» с FcR, связывается с по меньшей мере одним FcR с большей константой диссоциации (т.е. худшей/меньшей аффинностью), чем родительский полипептид или полипептид дикого типа. Такие варианты, которые демонстрируют ослабленное связывание с FcR, могут обладать слабым или не обладать поддающимся оценке связыванием с FcR, например, характеризоваться 0-20% связывания с FcR по сравнению с областью Fc IgG дикого типа или родительского IgG.

Полипептид, который связывается с FcR с «пониженной аффинностью» по сравнению с родительским полипептидом или полипептидом дикого типа, представляет собой полипептид, который связывается с любым одним или более чем одним из идентифицированных выше FcR с (существенно) пониженной аффинностью связывания по сравнению с родительским полипептидом, когда количества варианта полипептида и родительского полипептида в анализе связывания являются (по существу) примерно одинаковыми. Например, вариант полипептида с пониженной аффинностью связывания с FcR может демонстрировать от примерно 1,15-кратного до примерно 100-кратного, например, от примерно 1,2-кратного до примерно 50-кратного снижения аффинности связывания с FcR по сравнению с родительским полипептидом, при определении аффинности связывания с FcR.

Полипептид, содержащий вариант области Fc, который «менее эффективно опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии человеческих эффекторных клеток», чем родительский полипептид, представляет собой полипептид, который (существенно) менее эффективен в опосредовании ADCC in vitro или in vivo, когда количества варианта полипептида и родительского полипептида, используемых в анализе, являются (по существу) примерно одинаковыми. Обычно такие варианты будут идентифицированы с использованием анализа ADCC in vitro, как здесь раскрыто, но рассматриваются и другие анализы или способы определения ADCC, например, в животной модели и т.д. В одном воплощении вариант от примерно 1,5-кратно до примерно 100-кратно, например, от примерно двухкратно до примерно пятикратно менее эффективен в опосредовании ADCC, чем родительский полипептид, например, в раскрытом здесь анализе in vitro.

Термин «рецептор» обозначает полипептид, способный к связыванию с по меньшей мере одним лигандом. В одном воплощении рецептор представляет собой рецептор клеточной поверхности, имеющий внеклеточный лигандсвязывающий домен и, возможно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и/или мембранный якорь). Рецептор, подлежащий оценке в описанном здесь анализе, может быть интактным рецептором или его фрагментом, или производным (например, слитым белком, содержащим связывающий домен рецептора, слитый с одним или более чем одним гетерологичным полипептидом). Кроме того, рецептор, подлежащий оценке на его свойства связывания, может присутствовать в клетке или быть выделен и возможно нанесен на планшет для анализа или на некоторую другую твердую фазу.

Термин «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «проведение лечения») в том виде, как он здесь используется, относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественный ход заболевания индивида, которого лечат, и его можно проводить либо для профилактики, либо во время развития клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают предупреждение появления или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, предупреждение метастазов, уменьшение скорости развития заболевания, уменьшение интенсивности или временное ослабление болезненного состояния и ремиссию или улучшенный прогноз, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела по изобретению используют для задержки развития заболевания или для замедления хода заболевания.

II. Мультиспецифичные связывающие молекулы с заданными свойствами

В большинстве заболеваний на основе клеток направленное действие на клетки, имеющие отношение к заболеванию, посредством основанного на антителах связывания молекул рецептора является одним многообещающим подходом. Однако уровень экспрессии клинически релевантных рецепторов поверхности (мишень) варьирует от пациента к пациенту, и эффективность стандартизированных лекарственных средств на основе антител, таким образом, является очень разной. Это конкретно относится к би- и мультиспецифичным связывающим молекулам, способом действия которых является одновременное нацеливание на два разных эпитопа/рецептора.

Одним многообещающим подходом является разработка лекарственного средства (здесь би- или мультиспецифичной связывающей молекулы) конкретно для особой/индивидуальной ситуации соответствующего пациента.

Каждая клетка от индивида отличается, принимая во внимание экспрессируемые молекулы поверхности клетки, такие как рецепторы, по их числу и типу. Это особенно верно для раковых клеток и нераковых клеток. Таким образом, клетка может быть охарактеризована молекулами, присутствующими на поверхности клетки.

На основе данных по профилю экспрессии клинически релевантных поверхностных рецепторов на клетках, ассоциированных с заболеванием, у пациента, из библиотеки конкретно выбирают ряд связывающих группировок (например, фрагментов Fab) и объединяют с мультиспецифичной связывающей молекулой в качестве специфичного для пациента лекарственного средства. Эти выбранные связывающие молекулы выбирают конкретно в отношении соответствующей клетки, ассоциированной с заболеванием, такой как, например, опухолевая клетка, на основе, например, уровня экспрессии поверхностных рецепторов и, таким образом, потребности и фенотипа индивидуального пациента.

Такую характеризацию можно осуществлять in vitro и in vivo на основе методик визуализации клеток. Методики визуализации in vivo включают, например, оптическую визуализацию, молекулярную визуализацию, флуоресцентную визуализацию, биолюминисцентную визуализацию, MRI, PET, SPECT, СТ и прижизненную микроскопию. Методики визуализации in vitro включают, например, иммуногистохимическое окрашивание родительских клеток, например, флуоресцентно мечеными антителами, распознающими специфические маркеры поверхности клетки, и анализ флуоресцентных сигналов посредством микроскопии. В качестве альтернативы, генотип/фенотип клеток можно анализировать после окрашивания мечеными терапевтическими или диагностическими антителами с использованием способов, основанных на FACS.

В одном воплощении генотип/фенотип клеток, полученных от пациента, определяют способом, основанным на FACS. В одном воплощении маркеры поверхности клетки определяют с использованием флуоресцентно меченых диагностических или терапевтических антител. В одном воплощении используют флуоресцентно меченые терапевтические антитела.

Определенные заболевания можно связывать с изменением числа специфических молекул поверхности клетки или с появлением новой молекулы поверхности клетки.

Индивиды, пораженные таким заболеванием, будут демонстрировать в определенных пределах специфическую для заболевания и/или индивида картину маркеров поверхности клетки.

Это следует принимать во внимание для того, чтобы предложить такому индивиду направленно действующее терапевтическое средство с заданными свойствами.

Известен целый ряд терапевтических антител, направленных против молекул поверхности клетки и их лигандов, которые можно использовать для отбора и конструирования мультиспецифичных направленно действующих группировок с заданными свойствами, как, например, ритуксан/МаbТhеrа/ритуксимаб, 2Н7/окрелизумаб, зевалин/ибризумомаб, арзерра/офатумумаб (CD20), НLL2/эпратузумаб, инотузомаб (CD22), зенапакс/даклизумаб, симулект/базиликсимаб (CD25), герцептин/трастузумаб, пертузумаб (Her2/ERBB2), милотарг/гемтузумаб (CD33), раптива/эфализумаб (Cd11a), эрбитукс/цетуксимаб (EGFR, рецептор эпидермального фактора роста), IMC-1121B (рецептор VEGF 2 (фактор роста эндотелия сосудов 2)), тисабри/натализумаб (α4-субъединица α4β1 и α4β7 интегринов), РеоПро/абциксимаб (gpllb-gplla и αvβ3-интегрин), ортоклон ОКТ3/муромонаб-СD3 (CD3), бенлиста/белимумаб (BAFF), толеркс/отеликсимаб (CD3), солирис/экулизумаб (белок комплемента С5), актемра/тоцилизумаб (IL-6R), панорекс/эдреколомаб (ЕрСАМ, молекула адгезии эпителиальной клетки), СЕА-САМ5/лабетузумаб (CD66/CEA, карциноэмбриональный антиген), СТ-11 (PD-1, ингибирующий рецептор программируемой смерти Т-клеток 1, CD-d279), H224G11 (рецептор c-Met), SAR3419 (CD19), 1МС-А12/циксутумумаб (IGF-1R, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1), MEDI-575 (рецептор фактора роста тромбоцитов PDGF-R), СР-675, 206/тремелимумаб (антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов), R05323441 (плацентарный фактор роста или PGF), HGS-1012/мапатумумаб (TRAIL-R1), SGN-70 (CD70), ветодин(SGN-35)/брентуксимаб (CD30) и ARH460-16-2 (CD44).

Для определения маркеров поверхности клетки, присутствующих в образце, например, пациента, известны разные способы. Один типичный способ основан на флуоресцентной сортировке клеток (FACS), в частности, анализе специфично окрашенных и сортированных популяций клеток. В данном способе фенотипирование образца (популяции клеток) достигается проведением анализа индивидуальных клеток в отношении презентируемых маркеров поверхности клетки с использованием флуоресцентно меченых антител, направленных против данных маркеров, возможно включая определение статистического распределения поверхностных маркеров в популяции клеток. Он особенно подходит для применения терапевтических антител, которые были для этой цели мечены флуоресцентной меткой, так как посредством этого обеспечивается то, что полученная позднее мультиспецифичная связывающая молекула с заданными свойствами будет связываться с тем же самым эпитопом, что и диагностическое антитело. Мультиспецифичные связывающие

молекулы/биспецифичные антитела, как здесь описано, можно использовать в получении лекарственных средств для лечения, например, онкологического заболевания, сердечно-сосудистого заболевания, инфекционного заболевания, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, метаболического (например, эндокринного) заболевания или неврологического (например, нейродегенеративного) заболевания. Типичными неограничивающими примерами данных заболеваний являются болезнь Альцгеймера, неходжкинские лимфомы, В-клеточные острые и хронические лимфоидные лейкозы, лимфома Беркитта, лимфома Ходжкина, волосатоклеточный лейкоз, острые и хронические миелоидные лейкозы, Т-клеточные лимфомы и лейкозы, множественная миелома, глиома, макроглобулинемия Вальденстрема, карциномы (такие как карциномы полости рта, желудочно-кишечного тракта, толстой кишки, желудка, дыхательного тракта, легкого, молочной железы, яичника, простаты, матки, эндометрия, шейки матки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, кости, печени, желчного пузыря, почки, кожи и яичек), меланомы, саркомы, глиомы и раковые заболевания кожи, острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, дерматомиозит, болезни Сиденгама, тяжелая миастения, системная красная волчанка, волчаночный нефрит, ревматическая лихорадка, полигландулярные синдромы, пузырчатка, сахарный диабет, пурпура Хеноха-Шонляйна, постстрептококковый нефрит, узелковая эритема, болезнь отсутствия пульса, болезнь Эдисона, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, саркоидоз, язвенный колит, полиморфная эритема, первичная нефропатия lgА-типа, узелковый полиартериит, анкилозирующий спондилоартрит, синдром Гудпасчера, облитерирующий тромбангиит, синдром Шегрена, билиарный первичный цирроз печени, аутоиммунный тиреоидит, тиротоксикоз, склеродермия, хронический активный гепатит, полимиозит/дерматомиозит, полихондрит, обыкновенная пузырчатка, гранулематоз Вегенера, мембранная нефропатия, боковой амиотрофический склероз, сухотка спинного мозга, узелковый периартериит/полимиалгия, пернициозная анемия, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, псориаз или фиброзирующий альвеолит.

Известен целый ряд маркеров поверхности клетки и их лигандов. Например, сообщали о том, что раковые клетки экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров поверхности клетки и/или лигандов, включая следующие: карбоангидраза IX, альфа-фетопротеин, альфа-актинин-4, A3 (специфичный в отношении антитела А33 антиген), ART-4, В7, Ва-733, BAGE, ВrЕ3-антиген, СА125, CAMEL, САР-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD1-1A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-l-альфа, специфический для толстой кишки антиген р (CSAp), СЕА (СЕАСАМ5), СЕАСАМ6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, рецептор фолиевой кислоты, антиген G250, GAGE, GROB, HLA-DR, HM1.24, человеческий хорионгонадотропин (HCG) и его субъединицы, HER2/neu, HMGB-1, фактор, индуцируемый гипоксией (HIF-1), HSP70-2M, HST-2 или Ia, IGF-1R, IFN-гамма (интерферон-гамма), IFN-альфа, IFN-бета, IL-2 (интерлейкин-2), IL-4R (рецептор интерлейкина-4), IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL- 25, инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), КС4-антиген, KS-1-антиген, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, МСР-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, муцин рака поджелудочной железы, плацентарный фактор роста, р53, PLAGL2, кислая фосфатаза простаты, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, Т101, SAGE, S100, сурвивин, сурвивин-2В, ТАС, TAG-72, тенасцин, рецепторы TRAIL, TNF-альфа (фактор некроза опухоли-альфа), Тп-антиген, антигены Томсона-Фриденрайха, антигены некроза опухоли, VEGFR (рецептор фактора роста эндотелия сосудов), ED-B фибронектин, WT-1, 17-1А-антиген, факторы комплемента С3, С3а, С3b, С5а, С5, маркер ангиогенеза, bcl-2, bcl-6, Kras, сМЕТ, онкогенный маркер и онкогенный продукт (см., например, Sensi, et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 5023-5032; Parmiani, et al, J. Immunol. 178 (2007) 1975-1979; Novellino, et al., Cancer Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207), но не ограничиваясь ими.

Таким образом, антитела, распознающие специфические рецепторы поверхности клетки, включая их лиганды, можно использовать для специфичной и селективной направленной доставки и связывания с рядом/множеством маркеров поверхности клетки, которые ассоциированы с заболеванием. Маркер поверхности клетки представляет собой полипептид, локализованный на поверхности клетки (например, клетки, имеющей отношение к заболеванию), который, например, ассоциирован с событием сигнализации или со связыванием лиганда.

В одном воплощении для лечения рака/опухолей используют мультиспецифичные связывающие молекулы/биспецифичные антитела, которые имеют в качестве мишени антигены, ассоциированные с опухолью, такие как антигены, описанные в Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", в Fleisher (ed.), "The Clinical Biochemistry of Cancer", страница 347 (American Association of Clinical Chemists (1979)) и в US 4150149; US 4361544 и US 4444744.

Сообщения об антигенах, ассоциированных с опухолью (ТАА), включают Mizukami, et al., (Nature Med. 11 (2005) 992-997); Hatfield, et al., (Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005) 229-248); Vallbohmer, et al., (J Clin. Oncol. 23 (2005) 3536-3544) и Ren, et al., (Ann. Surg. 242 (2005) 55-63), причем каждая из них включена сюда посредством ссылки в том, что касается идентифицированных ТАА.

Когда заболевание включает лимфому, лейкоз или аутоиммунное расстройство, антигены, являющиеся мишенями, можно выбрать из группы, состоящей из следующих: CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, CXCR4, В7, MUC1 или Ia, НМ1.24, HLA-DR, тенасцин, VEGF, P1GF, ED-B фибронектин, онкоген, онкогенный продукт (например, c-met или PLAGL2), CD66a-d, антигены некроза, IL-2, Т101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1 (DR4) и TRAIL-R2 (DR5).

Известен целый ряд биспецифичных антител, направленных против двух разных мишеней, таких как BCMA/CD3, разные антигены семейства HER в комбинации (EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), HER2, HER3), CD19/CD3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL-1-бета/IL-8, IL-6 или IL-6R/ IL-21, или IL-21R, причем первая специфичность направлена на гликоэпитоп антигена, выбранный из группы, состоящей из следующих: х-структура Льюиса, b-структура Льюиса и у-структура Льюиса, Н-структуры Глобо, КН1, Тn-антиген, TF-антиген и углеводные структуры муцинов, CD44, гликолипиды и гликосфинголипиды, такие как Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, сиалилтетраозилцерамид, и вторая специфичность, направленная на рецепторную тирозинкиназу ErbB, выбранную из группы, состоящей из EGFR, HER2, HER3 и HER4, GD2 в комбинации со вторым антигенсвязывающим сайтом, ассоциирована с иммунологической клеткой, выбранной из группы, состоящей из следующих: Т-лимфоциты, NK клетки, В-лимфоциты, дендритные клетки, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, мезенхимные стволовые клетки, нервные стволовые клетки, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-бета, акцептор 2/CD3 фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), PSMA/CD3, EPCAM/CD3, комбинации антигена выбраны из группы, состоящей из VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT3, C-FMS/CSF1R, RET, c-Met, EGFR, Her2/neu, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, интегрина, и MMP с водорастворимым лигандом выбраны из группы, состоящей из следующих: VEGF, EGF (эпидермальный фактор роста), PIGF (плацентарный фактор роста), PDGF (фактор роста тромбоцитов), HGF (фактор роста гепатоцитов) и ангиопоэтин, ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, рецептор EGF 1/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, С-MET/GD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-1R, IL 17A/F, рецептор EGF r1/CD3 и CD19/CD16.

Таким образом, обнаружили, что с использованием модульного подхода, как здесь описано, можно предоставить биспецифичные терапевтические антитела с заданными свойствами. Свойства данных антител заданы по отношению к молекулам поверхности клетки, реально присутствующим на клетках индивида, нуждающегося в лечении, или по отношению к лигандам, взаимодействующим с такой молекулой поверхности клетки. Посредством определения статуса молекул поверхности клеток индивида можно выбрать комбинацию терапевтических мишеней с заданными свойствами.

С использованием данного получения биспецифичных терапевтических средств с заданными свойствами путем объединения 2 одиночных терапевтических молекул для одновременной направленной доставки и связывания с двумя разными эпитопами можно ожидать аддитивного/синергического эффекта по сравнению с одиночными терапевтическими молекулами.

С использованием уже доступных моноспецифичных терапевтических связывающих группировок, таких как происходящие из терапевтических антител, можно добиться быстрого и легкого получения требующейся мультиспецифичной связывающей молекулы.

Эти связывающие молекулы/антитела со сконструированной авидностью могут связываться с двумя или более чем двумя маркерами поверхности клетки, присутствующими на одной клетке. Данное связывание является авидным, только если с клеткой одновременно связываются все/обе связывающие группировки. Для данной цели особенно подходят антитела с аффинностью от средней до низкой. Это, с другой стороны, также позволяет исключать во время процесса скрининга менее специфичные комбинации специфичностей связывания.

Выбранные специфичные в отношении пациента мультиспецифичные связывающие молекулы можно тестировать в разных клеточных анализах in vitro/образцах клеток на релевантные критерии (например, оптимальное связывание/партнеры связывания, оптимальная длина линкера и т.д.):

- определение статуса фосфорилирования фосфотирозинкиназ

- определение ингибирования c-Jun N-терминальной киназы (JNK)

- определение апоптоза, индуцированного молекулой

- анализ связывания, проведенный с моноспецифичной связывающей молекулой по сравнению с мультиспецифичной

- определение ингибирования пролиферации

С использованием такого подхода возможно получение терапевтических молекул с заданными свойствами, являющихся, таким образом, высокоэффективными. Данные молекулы будут иметь ослабленные побочные эффекты посредством улучшенного направленного действия/доставки (например, нарузки в отношении опухолевых клеток), и улучшенное направленное действие на клетку-мишень основано на более высокой селективности и специфичности компонента, обеспечивающего направленное действие (содержащего по меньшей мере две связывающие молекулы).

Более высокая селективность и специфичность мультиспецифичной связывающей молекулы обусловлена одновременным связыванием (авидностью) комбинацией двух «низкоаффинных» связывающих агентов, что уменьшает возможное связывание вне мишени.

Способы по изобретению

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения биспецифичного антитела, включающий стадию инкубирования

(i) фрагмента Fab антитела или scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков,

(ii) фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и

при этом область Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую аминокислотную последовательность на ее N-конце,

и

(iii) фермента сортазы А,

и получения, посредством этого, биспецифичного антитела. Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения биспецифичного антитела, включающий следующие стадии:

(i) определение поверхностных маркеров, присутствующих на поверхности клетки в образце и выбор из них первого поверхностного маркера и второго поверхностного маркера,

(ii) инкубирование (а) фрагмента Fab антитела или фрагмента scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab или scFv специфично связывается с первым поверхностным маркером, (б) фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым поверхностным маркером, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом область Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А

и получение, посредством этого, биспецифичного антитела.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов, включающий следующие стадии:

(i) определение специфичности связывания и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полувыведения in vivo множества биспецифичных антител, полученных объединением каждого члена первого множества фрагментов Fab антитела или фрагментов scFv антитела с каждым членом второго множества фрагментов антитела, содержащим тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела,

при этом первое множество специфично связывается с первой молекулой поверхности клетки, и второе множество специфично связывается со второй молекулой поверхности клетки,

и

(ii) выбор биспецифичного антитела с подходящей специфичностью связывания и/или аффинностью, и/или эффекторной функцией, и/или периодом полувыведения in vivo и, посредством этого, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.

В одном воплощении данное объединение характеризуется инкубированием фрагмента Fab антитела или фрагмента scFv антитела и фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, с ферментом сортазой А.

В одном воплощении фрагмент Fab или фрагмент scFv антитела содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела фрагмента в виде одноплечего антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым поверхностным маркером, тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую аминокислотную последовательность на его N-конце.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, где X1 может быть любым аминокислотным остатком с n, равным 1, 2 или 3) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G).

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом ХЗ представляет собой метку в виде аминокислотной последовательности.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G, и Х3 представляет собой метку в виде аминокислотной последовательности.

В одном воплощении всех аспектов полипептид области Fc тяжелой цепи антитела содержит два остатка глицина на его N-конце.

В одном воплощении всех аспектов область Fc одноплечего антитела содержит аминокислотную последовательность GGCPX4C (SEQ ID NO: 08) на N-конце его полипептида области Fc тяжелой цепи, при этом Х4 представляет собой либо S, либо Р.

В одном воплощении всех аспектов Х1 представляет собой Е.

Одним аспектом, как здесь описано, является мультиспецифичная связывающая молекула/биспецифичное антитело, полученное описанным здесь способом.

Одним аспектом является мультиспецифичная связывающая молекула/биспецифичное антитело, содержащее аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула/биспецифичное антитело содержит аминокислотную

последовательность G_nSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, где X1 может быть любым аминокислотным остатком с n, равным 1, 2 или 3) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула/биспецифичное антитело содержит аминокислотную

последовательность G_nSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или P с n, равным 1, 2 или 3) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула/биспецифичное антитело содержит аминокислотную

последовательность X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р) в одной из его тяжелых цепей, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G.

В одном воплощении Х1 представляет собой Е.

Одним аспектом, как здесь описано, является фармацевтическая композиция, содержащая антитело/мультиспецифичную связывающую молекулу, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение биспецифичного антитела/мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано, в изготовлении лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рака.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ лечения индивида, имеющего рак, включающий введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела/мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ разрушения раковых клеток у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела/мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, область Fc представляет собой человеческую область Fc или ее вариант.

В одном воплощении человеческая область Fc принадлежит к человеческому подклассу lgG1 или человеческому подклассу lgG2, или человеческому подклассу lgG3, или человеческому подклассу lgG4. В одном воплощении область Fc представляет собой человеческую область Fc человеческого подкласса lgG1 или человеческого подкласса lgG4.

В одном воплощении человеческая область Fc содержит мутацию встречающегося в природе аминокислотного остатка по меньшей мере в одном из следующих положений аминокислот: 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329 и/или 331 до другого остатка, где остатки в области Fc пронумерованы согласно индексу EU по Kabat.

В одном воплощении человеческая область Fc содержит мутацию встречающегося в природе аминокислотного остатка в положении 329 и по меньшей мере одну другую мутацию по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, содержащей аминокислотные остатки в положении 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 и 331, до другого остатка, где остатки в области Fc пронумерованы согласно индексу EU по Kabat. Замена данных конкретных аминокислотных остатков приводит к изменению эффекторной функции области Fc по сравнению с немодифицированной областью Fc (дикого типа).

В одном воплощении человеческая область Fc имеет пониженную аффинность с человеческим FcγRIIIA и/или FcγRI IA, и/или FcγRI по сравнению с конъюгатом, содержащим соответствующую область Fc IgG дикого типа.

В одном воплощении аминокислотный остаток в положении 329 в человеческой области Fc заменен глицином или аргинином, или достаточно большим аминокислотным остатком для разрушения пролиновой слоистой структуры в области Fc.

В одном воплощении мутацией встречающегося в природе аминокислотного остатка является S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G и/или P331S. В одном воплощении мутацией является L234A и L235A, если область Fc принадлежит к человеческому подклассу lgG1, или S228P и L235E, если область Fc принадлежит к человеческому подклассу lgG4. В одном воплощении область Fc содержит мутацию P329G.

Путем объединения двух мутаций в определенных положениях в области Fc можно добиться полного уменьшения эффекторной функции, ассоциированной с областью Fc.

Выбор области Fc, вызывающей эффекторную функцию, зависит от намеченного применения мультиспецифичных связывающих молекул/биспецифичного антитела.

Если желательным применением является функциональная нейтрализация растворимой мишени, следует выбирать подкласс или вариант, не обладающий эффекторной функцией.

Если желательным применением является удаление (растворимой) мишени, следует выбирать подкласс или вариант, обладающий эффекторной функцией.

Если желательным применением является оказание антагонистического влияния на мишень, связанную с клеткой, следует выбирать подкласс или вариант, не обладающий эффекторной функцией.

Если желательным применением является удаление клетки, презентирующей мишень, следует выбирать подкласс или вариант, обладающий эффекторной функцией.

На период полувыведения антитела или конъюгата с областью Fc антитела в системе кровообращения можно оказывать влияние путем модулирования взаимодействия область Fc-FcRn.

Минимизации или даже устранения антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC) можно добиваться так называемыми изменениями/заменами аминокислот шарнирной области.

Минимизации или даже устранения активации классического каскада комплемента можно добиваться так называемыми изменениями/заменами аминокислот шарнирной области.

Увеличения периода полувыведения антитела или конъюгата с областью Fc антитела в системе кровообращения можно добиваться усиленным связыванием с неонатальным рецептором Fc, и это приводит к улучшенной эффективности, пониженной дозе или частоте введения, или к улучшенной доставке к мишени. Уменьшения периода полувыведения антитела или конъюгата с областью Fc антитела в системе кровообращения можно добиваться ослабленным связыванием с неонатальным рецептором Fc, и это приводит к ослабленному воздействию на весь организм или к улучшенному отношению связывания с мишенью к связыванию не с мишенью.

В общем, описанный в данной заявке способ применим к получению конъюгатов с областью Fc антитела, содержащих либо область Fc дикого типа, либо измененную область Fc/вариант области Fc.

В одном воплощении область Fc представляет собой человеческую область Fc.

В одном воплощении область Fc является «воображаемой» и, в то время как она не существует физически, конструктор антител может принять решение относительно варианта области Fc, который следует использовать.

В одном воплощении нуклеиновую кислоту, кодирующую часть в виде области Fc конъюгата с областью Fc антитела, изменяют для получения варианта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант части в виде области Fc конъюгата с областью Fc антитела.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность части в виде области Fc конъюгата с областью Fc антитела, можно получать целым рядом способов, известных в данной области. Данные способы включают получение приготовленной ранее ДНК, кодирующей полипептиды конъюгата с областью Fc антитела, сайт-направленным (или опосредованным олигонуклеотидом) мутагенезом, ПЦР(полимеразная цепная реакция)-мутагенезом и кассетным мутагенезом, но не ограничиваясь ими.

Область Fc взаимодействует с целым рядом рецепторов или лигандов, включающих рецепторы Fc (например, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA), белок C1q комплемента и другие молекулы, такие как белки А и G, но не ограничиваясь ими. Данные взаимодействия являются существенными для целого ряда эффекторных функций и последующих событий сигнализации, включающих антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC), но не ограничивающихся ими.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела (полученный описанным здесь способом) имеет по меньшей мере одно или более чем одно из следующих свойств: пониженную или устраненную эффекторную функцию (ADCC и/или CDC, и/или ADCP), ослабленное или устраненное связывание с рецепторами Fc, ослабленное или устраненное связывание с C1q или ослабленную или устраненную токсичность.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела (полученный описанным здесь способом) содержит область Fc дикого типа, которая имеет по меньшей мере две мутации, присоединения или делеции аминокислот.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела (полученный описанным здесь способом) имеет пониженную аффинность к человеческому рецептору Fc (FcγR) и/или к человеческому рецептору комплемента по сравнению с антителом или конъюгатом с областью Fc антитела, содержащим человеческую область Fc дикого типа.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела (полученный описанным здесь способом) содержит область Fc, которая имеет пониженную аффинность к человеческому рецептору Fc (FcγR) и/или к человеческому рецептору комплемента по сравнению с антителом или конъюгатом с областью Fc антитела, содержащим человеческую область Fc дикого типа.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела (полученный описанным здесь способом) имеет пониженную аффинность к по меньшей мере одному из FcγRI, FcγRII и/или FcγRIIIA. В одном воплощении снижена аффинность к FcγRI и FcγRIIIA. В одном воплощении снижена аффинность к FcγRI, FcγRII и FcγRIIIA.

В одном воплощении снижена аффинность к FcγRI, FcγRIIIA и C1q.

В одном воплощении снижена аффинность к FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA и C1q.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела (полученный описанным здесь способом) имеет ослабленную ADCC по сравнению с антителом или конъюгатом с Fc антитела, содержащим область Fc дикого типа. В одном воплощении ADCC снижена по меньшей мере на 20% по сравнению с ADCC, индуцированной слитым полипептидом с областью Fc или конъюгатом, содержащим область Fc дикого типа.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела (полученный описанным здесь способом) имеет ADCC и CDC, индуцированные областью Fc, которые ослаблены или устранены по сравнению с конъюгатом с областью Fc антитела, содержащим область Fc дикого типа.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела (полученный описанным здесь способом) имеет ослабленные ADCC, CDC и ADCP по сравнению с конъюгатом с OA-область Fc, содержащим область Fc дикого типа.

В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в области Fc, которая выбрана из группы, включающей S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G и P331S.

В одном воплощении область Fc дикого типа представляет собой область Fc человеческого lgG1 или область Fc человеческого lgG4.

В одном воплощении область Fc антитела, помимо мутации аминокислотного остатка пролина в положении 329, содержит по меньшей мере одно другое присоединение, мутацию или делецию аминокислотного остатка в области Fc, которые коррелируют с повышенной стабильностью конъюгата с областью Fc антитела.

В одном воплощении другое присоединение, мутация или делеция аминокислотного остатка в области Fc находится в положении 228 и/или 235 области Fc, если область Fc принадлежит к подклассу lgG4. В одном воплощении аминокислотный остаток серина в положении 228 и/или аминокислотный остаток лейцина в положении 235 заменен(ны) другой аминокислотой. В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела содержит остаток пролина в положении 228 (мутация остатка серина на остаток пролина). В одном воплощении конъюгат с областью Fc антитела содержит остаток глутаминовой кислоты в положении 235 (мутация остатка лейцина на остаток глутаминовой кислоты).

В одном воплощении область Fc содержит три мутации аминокислот. В одном воплощении тремя мутациями аминокислот являются мутации P329G, S228P и L235E (P329G/SPLE).

В одном воплощении другое присоединение, мутация или делеция аминокислотного остатка в области Fc находится в положении 234 и/или 235 области Fc, если область Fc принадлежит к подклассу lgG1. В одном воплощении аминокислотный остаток лейцина в положении 234 и/или аминокислотный остаток лейцина в положении 235 мутирован(ны) до другой аминокислоты.

В одном воплощении область Fc содержит мутацию аминокислоты в положении 234, где аминокислотный остаток лейцина мутирован до аминокислотного остатка аланина.

В одном воплощении область Fc содержит мутацию аминокислоты в положении 235, где аминокислотный остаток лейцина мутирован до аминокислотного остатка аланина.

В одном воплощении область Fc содержит мутацию аминокислоты в положении 329, где аминокислотный остаток пролина мутирован до аминокислотного остатка глицина, мутацию аминокислоты в положении 234, где аминокислотный остаток лейцина мутирован до аминокислотного остатка аланина, и мутацию аминокислоты в положении 235, где аминокислотный остаток лейцина мутирован до аминокислотного остатка аланина.

Варианты области Fc с повышенной аффинностью в отношении FcRn имеют более длительные периоды полувыведения в сыворотке, и такие молекулы будут иметь полезные применения в способах лечения млекопитающих, когда желательным является длительный системный период полувыведения введенного конъюгата с областью Fc антитела, например, для лечения хронического заболевания или расстройства.

Конъюгаты с областью Fc антитела с пониженной аффинностью связывания с FcRn имеют более короткие периоды полувыведения в сыворотке, и такие молекулы будут иметь полезные применения в способах лечения млекопитающих, когда желательным является более короткий системный период полувыведения введенного конъюгата с областью Fc антитела, например, для избегания токсических побочных эффектов или для приложений по диагностической визуализации in vivo. Слитые полипептиды или конъюгаты с областью Fc с пониженной аффинностью связывания с FcRn с меньшей вероятностью пройдут через плаценту и, таким образом, могут использоваться в лечении заболеваний или расстройств у беременных женщин.

Области Fc с измененной аффинностью связывания с FcRn в одном воплощении представляют собой область Fc с изменением аминокислоты в одном или более чем одном положении аминокислоты 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447.

Область Fc в одном воплощении представляет собой область Fc с одним или более чем одним изменением аминокислоты в положениях аминокислот 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 и/или 447.

Области Fc, которые демонстрируют усиленное связывание с FcRn, в одном воплощении содержат одно или более чем одно изменение аминокислоты в положениях аминокислот 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 и/или 434.

В одном воплощении область Fc представляет собой область Fc подкласса lgG1 и содержит мутации аминокислот P329G и/или L234A и L235A.

В одном воплощении область Fc представляет собой область Fc подкласса lgG4 и содержит мутации аминокислот P329G и/или S228P и L235E.

В одном воплощении область Fc антитела содержит мутацию T366W в полипептиде области Fc первой тяжелой цепи и мутации T366S, L368A и Y407V в полипептиде области Fc второй тяжелой цепи, где нумерация осуществляется согласно индексу EU по Kabat.

В одном воплощении область Fc антитела содержит мутацию S354C в полипептиде области Fc первой тяжелой цепи и мутацию Y349C в полипептиде области Fc второй тяжелой цепи.

Ферментативная конъюгация с использованием сортазы А Биспецифичное антитело, содержащее одноплечее антитело (OA-Fc) и один или более чем один антигенсвязывающий домен, можно получать с использованием фермента сортазы А.

Многие грамположительные бактерии используют сортазу для ковалентного заякоривания целого ряда поверхностных белков, включая факторы вирулентности, на их клеточной стенке (пептидогликане). Сортазы представляют собой внеклеточные мембраноассоциированные ферменты. Сортаза A (SrtA) Staphylocossus aureus дикого типа представляет собой полипептид из 206 аминокислот с N-концевой трансмембранной областью. На первом этапе сортаза А распознает белки-субстраты, которые содержат мотив аминокислотной последовательности LPX1TG, и расщепляет амидную связь между Thr и Gly посредством Cys активного сайта. Эта реакция расщепления пептида приводит к тиоэфирному промежуточному соединению сортазы А. На втором этапе промежуточное соединение тиоэфир ацил-фермент распадается посредством нуклеофильной атаки аминогруппы второго полипептида-субстрата, содержащего олигоглицин (соответствующего пентаглициновой единице пептидогликана S. aureus), приводя к образованию ковалентно связанного белка клеточной стенки и регенерации сортазы А. В отсутствие олигоглициновых нуклеофилов промежуточное соединение ацил-фермент гидролизуется молекулой воды.

Опосредованное сортазой лигирование/конъюгацию начали применять для целого ряда целей белковой инженерии и биоконъюгации. Эта новая методика обеспечивает введение природных и неприродных функциональных групп в рекомбинантные или химически синтезированные полипептиды, меченные LPX1TG. Примеры включают ковалентное присоединение полимеров, дериватизированных олигоглицином (например, PEG (полиэтиленгликоль)), флуорофоров, витаминов (например, биотин и фолиевая кислота), липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, синтетических пептидов и белков (например, GFP) (Tsukiji, S. and Nagamune, Т., ChemBioChem 10 (2009) 787-798; Рорр, M.W.-L. и Ploegh, H.L., Angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 5024-5032).

Показали, что триглициновый и даже диглициновый мотив аминокомпонента является достаточным для стадии лигирования, опосредованного SrtA (Clancy, K.W., et al., Peptide Science 94 (2010) 385-396).

Для ферментативной конъюгации можно использовать растворимую усеченную сортазу А, лишенную трансмембранной области (SrtA; аминокислотные остатки 60-206 SrtA Staphylocossus aureus) (Ton-That, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; llangovan, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061). Усеченный растворимый вариант сортазы А можно продуцировать в Е. coli.

Область Fc антитела, содержащую олигоглицин по меньшей мере на одном из ее N-концов (G_m, m равен 2 или 3, или 4, или 5), можно экспрессировать и очищать из супернатанта эукариотических клеток (например, клеток НЕК293 (клетки эмбриональной почки человека), клеток СНО (яичники китайского хомяка)).

Связывающую группировку (например, одноцепочечный антигенсвязывающий полипептид, такой как scFv, scFab или дарпин, или многоцепочечный антигенсвязывающий полипептид, такой как dsFv или Fab), содержащую сайт распознавания SrtA на С-конце одной полипептидной цепи, можно экспрессировать и очищать из супернатанта эукариотических клеток (например, клеток НЕК293, клеток СНО).

Одним аспектом, как раскрыто в данном документе, является биспецифичное антитело, которое получают конъюгированием антигенсвязывающего полипептида/домена (например, scFv или Fab) с вариантом одноплечего антитела (OA-Fc) с использованием фермента сортазы А, где последовательность распознавания сортазы расположена на С-конце одноцепочечного антигенсвязывающего полипептида (например, scFv, scFab или дарпина) или на С-конце одной полипептидной цепи многоцепочечного антигенсвязывающего комплекса (например, dsFv или Fab), и где мотив из двух или трех глицинов расположен на N-конце цепи Fc варианта одноплечего антитела (OA-Fc-Gm; m равен 2 или 3). Конъюгат Fab или scFv с одноплечим антителом, содержащий фрагмент антитела Fab (OA-Fc~Fab) или фрагмент антитела scFv (OA-Fc~scFv) и одноплечее антитело (OA-Fc), может быть получен с высоким выходом при ферментативной конъюгации с использованием (i) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность G_nSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в его С-концевой области, (ii) полипептида области Fc тяжелой цепи, содержащего олигоглицин на его N-конце, и (iii) и фермента сортазы А.

При использовании данной комбинации реактивов

i) обратная реакция с распознаванием аминокислотной последовательности LPX1TG в продукте - конъюгате в качестве субстрата и/или

ii) получение тупикового фрагмента гидролиза полипептида (полипептид с/без расщепленной последовательности распознавания LPX1TG, полученный посредством расщепления промежуточного соединения тиоацил-связывающая группировка сортазы А водой вместо нуклеофила в виде области Fc G_m-антитела),

которая обычно происходит при увеличенном времени реакции, может быть ослаблена или даже устранена.

Были протестированы разные комбинации С-концевых и N-концевых аминокислотных последовательностей.

Более подробно, в качестве типичной связывающей группировки использовали фрагмент Fab антитела, и в качестве типичной области Fc антитела использовали область Fc одноплечего антитела (OA-область Fc представляет собой пару, образованную тяжелой цепью полноразмерного антитела и ее когнатной легкой цепью, и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела). Три разные последовательности на С-конце VH-CH1 тяжелой цепи фрагмента Fab антитела и на N-конце OA-область Fc соответственно конъюгировали с использованием типичной транспептидазы - сортазы А. Получали девять разных конъюгатов. Ход/эффективность реакции связывания определяли в разные моменты времени. С этой целью анализировали аликвоты реакций транспептидации посредством SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Эффективность лигирования оценивали денситометрически в геле. Результаты приведены в следующей Таблице 1.

В одном воплощении фрагмент Fab антитела или фрагмент scFv антитела содержит аминокислотную последовательность GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, в которой Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении фрагмент Fab антитела или фрагмент scFv антитела содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, в которой Х1 может быть любым аминокислотным остатком, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G).

В одном воплощении фрагмент Fab антитела или фрагмент scFv антитела содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, в которой Х1 может быть любым аминокислотным остатком с n, равным 1, 2 или 3) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х3 представляет собой метку в виде аминокислотной последовательности.

В одном воплощении фрагмент Fab антитела или фрагмент scFv антитела содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, в которой Х1 может быть любым аминокислотным остатком с n, равным 1, 2 или 3) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G, и Х3 представляет собой метку в виде аминокислотной последовательности.

Подход «комбиматрикс»

Желательно объединить первую связывающую группировку, такую как фрагмент Fab антитела, с другой специфичной связывающей группировкой, такой как второй фрагмент Fab антитела, или фрагмент в виде одноплечего антитела, содержащего полноразмерную тяжелую цепь, ее когнатную легкую цепь и полипептид области Fc тяжелой цепи, связанный дисульфидной связью. Кроме того, можно осуществить скрининг на то, демонстрирует ли первая связывающая группировка лучшие свойства при ее связывании с целым рядом других отличных связывающих группировок. С использованием так называемого подхода Combimatrix можно легко рассмотреть множество комбинаций связывающих группировок. Следует отметить, что вторые связывающие группировки могут связываться либо с другими мишенями/эпитопами/антигенами, либо могут связываться с тем же самым антигеном, но с другими эпитопами, либо могут связываться с тем же самым эпитопом, но представлять собой разные варианты одной связывающей группировки (например, кандидаты, подвергнутые гуманизации).

В данном сценарии автоматизированная платформа может выполнять задачи по пипетированию, очистке и объединению связывающих группировок и их реакциям или получению их производных. Подходит любая платформа, в которой используются, например, 96-луночные планшеты или другие высокопроизводительные форматы, такие как робот для пипетирования Eppendorf epMotion 5075vac.

Во-первых, осуществляется клонирование конструкций, кодирующих связывающие группировки. Плазмиды с нуклеиновыми кислотами, кодирующими связывающие группировки, обычно получают синтезом генов, при этом С-концевая область одной кодируемой связывающей группировки содержит мотив для сортазы и His метку, и одна N-концевая область другой соответствующей связывающей группировки содержит олигоглициновый мотив, или посредством клонирования вариабельных доменов через ПЦР В-клеток и клонирование, независимое от последовательности и лигирования (SLIC), в подходящий вектор, содержащий необходимые элементы, подобные константной области, мотиву для сортазы и His метке соответственно. Данные плазмиды индивидуально переносят в отдельную лунку многолуночного планшета (можно загрузить целый планшет). Затем плазмиды расщепляют смесью рестрикционных ферментов, которые вырезают область, кодирующую связывающую группировку. Желательно продумать синтез всех генов таким образом, чтобы для всех плазмид требовалась только одна смесь рестрикционных ферментов. Затем возможная стадия очистки дает очищенные фрагменты ДНК. Данные фрагменты лигируют в остов плазмиды, который был вырезан из акцепторного вектора такой же рестрикционной смесью, которая была упомянута выше. В качестве альтернативы, процедуру клонирования можно осуществлять посредством стадии клонирования, опосредованного SLIC (см., например, РСТ/ЕР 2012/076155). После лигирования автоматизированные платформы переносят все смеси лигирования в другой многолуночный планшет с компетентными клетками Е. coli (например, Тор10 Multi Shot, Invitrogen), и осуществляется реакция трансформации. Клетки культивируются до желательной плотности. Из аликвоты среды культивирования можно получать глицериновые маточные растворы. Из культуры выделяют плазмиду (например, с использованием мини набора для выделения плазмид (например, NucleoSpin 96 Plasmid, Macherey& Nagel)). Идентичность плазмиды проверяют расщеплением аликвоты подходящей рестрикционной смесью и электрофорезом в полиакриламидном геле (например, E-Gel 48, Invitrogen). Затем аликвоту плазмиды можно загружать на новый планшет для проведения контрольной реакции секвенирования.

На следующей стадии экспрессируются связывающие группировки. Следовательно, клетки НЕК высевают на многолуночный планшет (например, 48-луночный планшет) или в маленькие колбы для шейкера и трансфицируют выделенными плазмидами (содержащими кодирующую область связывающей группировки в подходящем остове вектора). Трансфицированные клетки НЕК культивируют в течение нескольких суток и отбирают (например, посредством фильтрования через 1,2 мкм и 0,22 мкл фильтровальную пластинку с использованием вакуумной установки). Титры можно отслеживать путем проведения, например, ELISA.

Связывающие группировки можно связывать друг с другом с использованием реакции транспептидации, опосредованной сортазой. Первую связывающую группировку, вторую связывающую группировку и реакционную смесь для сортазы можно объединять в многолуночном формате. После инкубации при 37°С в течение 4-72 ч (например, 16 часов) конъюгаты можно отбирать с использованием методики негативной селекции на His метку (смесь наносят, например, на пластинки His MultiTrap HP (GE Healthcare) и фильтруют, при этом все молекулы, которые все еще имеют His метку связываются с хроматографической колонкой, тогда как конъюгаты находятся в фильтрате; причем в фильтрате следует заменить буфер, например, путем нанесения конъюгата на мембрану для ультрафильтрации или с использованием пластинки, содержащей аффинную среду, которая является специфичной в отношении одной из связывающих группировок.

Мультиспецифичные связывающие молекулы можно получать с использованием подхода Combimatrix, см. Таблицу, приведенную ниже).

В первый горизонтальный ряд многолуночного планшета в каждую лунку (за исключением первой лунки первого горизонтального ряда), обозначенную арабскими числами (например, от 1 до 11), вносят пипеткой разные первые связывающие группировки, содержащие С-концевой мотив для сортазы, в эквимолярных концентрациях. В первый вертикальный ряд того же самого планшета в каждую лунку (за исключением первой лунки первого вертикального ряда), обозначенную буквами (например, от А до G), вносят пипеткой разные вторые связывающие группировки, содержащие олигоглицин в N-концевой области, в эквимолярных концентрациях. Затем все первые связывающие группировки из первого горизонтального ряда объединяют со всеми вторыми связывающими группировками из первого вертикального ряда (например, что приводит к 77 комбинациям в 96-луночном планшете), что обозначается комбинацией числа и буквы (например, от 1А до 11G). Во все комбинации добавляют сортазу в подходящем буфере. После проведения ферментативной конъюгации можно осуществлять возможную стадию очистки. Мультиспецифичные связывающие молекулы затем готовы для оценки в анализах на основе клеток.

III. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Компоненты лигирования конъюгата с OA-область Fc, в частности, вариант одноплечего антитела (OA-Fc-Gm) и одноцепочечный антигенсвязывающий полипептид (например, scFv, scFab или дарпин) или многоцепочечный антигенсвязывающий комплекс (например, dsFv или Fab) можно получать с использованием способов и композиций генной инженерии, см., например, US 4816567.

В одном аспекте предложен способ получения конъюгата ОА-Fс~полипептид, где данный способ включает (i) культивирование первой клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую часть конъюгата - вариант одноплечего антитела (OA-Fc-Gm), при подходящих условиях для экспрессии/секреции варианта одноплечего антитела (OA-Fc-Gm) и возможно выделение части в виде OA-Fc-Gm из клетки-хозяина (или из культуральной среды клетки-хозяина) и (ii) культивирование второй клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептидную часть конъюгата, при подходящих условиях для экспрессии/секреции полипептида и возможно выделение полипептидной части из клетки-хозяина (или из культуральной среды клетки-хозяина), и (iii) ферментативное конъюгирование полученных рекомбинантно частей конъюгата ОА-Fс~полипептид с использованием транспептидирования, опосредованного сортазой А.

Для рекомбинантного получения части конъюгата ОА-Fс~полипептид в виде OA-Fc-Gm и полипептидной части нуклеиновую кислоту, кодирующую часть в виде OA-Fc-Gm и полипептидную часть конъюгата OA-Fc-полипептид, например, выделяют и вставляют в один или более чем один вектор для дальнейшего клонирования и/или экспрессии/секреции в клетке-хозяине, как описано выше. Такую нуклеиновую кислоту можно легко выделять и/или получать с использованием традиционных методик.

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии/секреции векторов, кодирующих полипептиды, включают описанные в данном изобретении прокариотические или эукариотические клетки. Например, полипептиды можно продуцировать в бактериях, в частности, когда не требуются гликозилирование и эффекторная функция Fc (см., например, US 5648237, US 5789199 и US 5840523, Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ), описывающие экспрессию фрагментов антител в Е. соli.). После экспрессии полипептид можно выделять из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции или можно выделять из нерастворимой фракции так называемых телец включения, которые могут быть солюбилизированы и повторно свернуты до биоактивных форм. Затем полипептид можно очищать далее.

Помимо прокариот, эукариотические микробы, такие как нитчатые грибки или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих полипептиды, включая штаммы грибков и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что приводит к продукции полипептида с частично или полностью человеческой картиной гликозилирования (см., например, Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 и Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215).

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированных полипептидов также происходят из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвончных включают растительные клетки и клетки насекомых. Идентифицировали многочисленные штаммы бакуловирусов, которые можно использовать в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев также можно использовать культуры растительных клеток (см., например, US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978 и US 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для продукции антител в трансгенных растениях)).

В качестве хозяев также можно использовать клетки позвоночных. Например, могут быть полезными линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами полезных линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток COS-7 (клетка CV1 почки обезьяны, трансформированная SV40; линия клеток НЕК293 (эмбриональная почка человека); линия клеток ВНК (почки новорожденного хомяка); линия клеток Сертоли мыши ТМ4 (клетки ТМ4, как описано, например, в Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251); линия клеток CV1 (клетка почки обезьяны); линия клеток VERO-76 (клетки почки африканской зеленой мартышки); линия клеток HELA (клетка карциномы шейки матки человека); линия клеток MDCK (клетка почки собаки); линия клеток BRL-3A (клетка печени серой крысы); линия клеток W138 (клетка легкого человека); линия клеток HepG2 (клетка печени человека); линия клеток ММТ 060562 (клетка опухоли молочной железы мыши); линия клеток TRI, как описано, например, в Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; линия клеток MRC5 и линия клеток FS4. Другие полезные линии клеток-хозяев млекопитающих включают линию клеток СНО (клетка яичника китайского хомяка), включая линии клеток СНО, негативные в отношении DHFR (дигидрофолатрезуктаза) (Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216), и линии клеток миеломы, такие как линия клеток Y0, NS0 и Sp2/0. Относительно обзора определенных линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для продукции полипептидов, см., например, Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ).

IV. Способы и композиции для диагностики и детекции

В определенных воплощениях любое из предложенных здесь биспецифичных антител является полезным для детекции присутствия одного или обоих антигенов в биологическом образце. Термин «детектирование» в том виде, как он здесь используется, охватывает количественную или качественную детекцию. В определенных воплощениях биологический образец содержит клетку или ткань, как, например, биопсии раковых клеток.

В одном воплощении предложено биспецифичное антитело для применения в способе диагностики или детектирования. В другом аспекте предложен способ детектирования присутствия раковых клеток в биологическом образце. В определенных воплощениях данный способ включает приведение в контакт биологического образца с биспецифичным антителом, как здесь описано, при пермиссивных условиях для связывания биспецифичного антитела с его антигеном или антигнами и детектирование того, образуется ли комплекс между биспецифичным антителом и его антигеном или антигенами. Таким способом может быть способ in vitro или in vivo.

Типичные расстройства, которые можно диагностировать с использованием антитела по изобретению, включают рак.

В определенных воплощениях предложены меченые биспецифичные антитела. Метки включают метки или группировки, которые детектируются непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронноплотные, хемилюминисцентные и радиоактивные метки), а также группировки, такие как ферменты или лиганды, которые детектируются опосредованно, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия, но не ограничиваются ими. Типичные метки включают радиоактивные изотопы ³²Р, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³Н и ¹³¹I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уриказа и ксантиноксидаза, связанные с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, таким как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, метки в виде бактериофага, стабильные свободные радикалы и тому подобное, но не ограничиваются ими.

V. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции биспецифичного антитела, как здесь описано, получают смешиванием такого антитела, имеющего желательную степень чистоты, с одним или более чем одним возможным фармацевтически приемлемым носителем (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.), (1980)), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях и включают: буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (из менее, чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комлексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG), но не ограничиваются ими. Типичные фармацевтически приемлемые носители здесь, кроме того, включают агенты, диспергирующие лекарственное средство в интерстициальной ткани, такие как растворимые активные при нейтральном рН гиалуронидазные гликопротеины (sHASEGP), например, человеческие растворимые гиалуронидазные гликопротеины РН-20, такие как rhuPH20 (HYLENEX^®, Baxter International, Inc.). Определенные типичные sHASEGP и способы применения, включающие применение rhuPH20, описаны в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP объединяют с одной или более чем одной дополнительной гликозаминогликаназой, такой как хондроитиназы.

Типичные композиции лиофилизированного антитела описаны в US 6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в US 6171586 и WO 2006/044908, причем последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.

Приведенная здесь композиция также может содержать более чем один активный ингредиент по мере необходимости для конкретного показания, которое лечат, предпочтительно ингредиенты с взаимодополняющими активностями, которые не оказывают вредного влияния друг на друга. Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели.

Активные ингредиенты могут захватываться в микрокапсулах, полученных, например, методиками коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, в гидроксиметилцеллюлозных или желатиновых микрокапсулах и в поли-(метилметакрилатных) микрокапсулах соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственного средства (например, в липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980).

Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, которые находятся в виде формованных предметов, например, пленок или микрокапсул.

Композиции, подлежащие введению in vivo, обычно являются стерильными. Стерильности можно легко достигать, например, фильтрованием через мембраны для стерилизующей фильтрации.

VI. Терапевтические способы и композиции

В терапевтических способах можно использовать любое из предложенных здесь биспецифичных антител.

В одном аспекте предложено биспецифичное антитело для применения в качестве лекарственного средства. В других аспектах предложено биспецифичное антитело для применения при лечении рака. В определенных воплощениях предложено биспецифичное антитело для применения в способе лечения. В определенных воплощениях согласно изобретению предложено биспецифичное антитело для применения в способе лечения индивида, имеющего рак, включающем введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела. В одном таком воплощении данный способ, кроме того, включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже. В других воплощениях согласно изобретению предложено биспецифичное антитело для применения в устранении/умерщвлении/лизировании раковых клеток. В определенных воплощениях согласно изобретению предложено биспецифичное антитело для применения в способе устранения/умерщвления/лизирования раковых клеток у индивида, включающем введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела для устранения/умерщвления/лизирования раковых клеток. «Индивидом» согласно любому из приведенных выше воплощений может быть человек.

В другом аспекте согласно изобретению предложено применение биспецифичного антитела в изготовлении или получении лекарственного средства. В одном воплощении данное лекарственное средство предназначено для лечения рака. В другом воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения рака, включающем введение индивиду, имеющему рак, эффективного количества лекарственного средства. В одном таком воплощении данный способ, кроме того, включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже. В другом воплощении лекарственное средство предназначено для

устранения/умерщвления/лизирования раковых клеток. В другом воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе устранения/умерщвления/лизирования раковых клеток у индивида, включающем введение индивиду эффективного количества лекарственного средства для устранения/умерщвления/лизирования раковых клеток. «Индивидом» согласно любому из приведенных выше воплощений может быть человек.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ лечения рака. В одном воплощении данный способ включает введение индивиду, имеющему рак, эффективного количества биспецифичного антитела. В одном таком воплощении данный способ, кроме того, включает введение индивиду, эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, как описано ниже. «Индивидом» согласно любому из приведенных выше воплощений может быть человек.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ устранения/умерщвления/лизирования раковых клеток у индивида. В одном воплощении данный способ включает введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела для устранения/умерщвления/лизирования раковых клеток. В одном воплощении «индивидом» является человек.

В другом аспекте согласно изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие любое из предложенных здесь биспецифичных антител, например, для применения в любом из приведенных выше терапевтических способов. В одном воплощении фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных здесь биспецифичных антител и фармацевтически приемлемый носитель. В другом воплощении фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных здесь биспецифичных антител и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, как описано ниже.

Антитела по изобретению можно использовать в терапии либо одни, либо в комбинации с другими агентами. Например, антитело по изобретению можно вводить совместно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом. В определенных воплощениях дополнительный терапевтический агент представляет собой цитотоксический агент или химиотерапевтический агент.

Такие комбинированные терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (где два или более чем два терапевтических агента включены в ту же самую или в отдельные композиции) и раздельное введение, причем в данном случае введение антитела по изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитела по изобретению также можно использовать в комбинации с лучевой терапией.

Антитело по изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любым подходящим способом, включающим парентеральное, внутрилегочное и интраназальное введение и, если это желательно для местного лечения, введение в область поражения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может осуществляться любым подходящим путем, например, инъекциями, такими как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение кратковременным или хроническим. Здесь рассматриваются разные схемы дозирования, включающие однократные или многократные введения на протяжении разных моментов времени, болюсное введение и импульсную инфузию, но не ограничивающиеся ими.

Антитела по изобретению следовало бы готовить, дозировать и вводить способом, согласующимся с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в данном контексте включают конкретное расстройство, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние индивидуального пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело не должно быть, но возможно приготовлено с одним или более чем одним агентом, используемым в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа расстройства или лечения и других факторов, обсуждавшихся выше. Они обычно используются в таких же дозировках и с использованием таких же путей введения, которые здесь описаны, или в количестве от примерно 1 до 99% от описанных здесь дозировок, или в любой дозировке и любым путем, который эмпирически/клинически определен как подходящий.

Для предупреждения или лечения заболевания подходящая дозировка антитела по изобретению (при использовании его одного или в комбинации с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим агентом) будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и хода заболевания, от того, вводится ли антитело для предупредительных или терапевтических целей, от предыдущей терапии, клинической истории пациента и ответа на антитело, и от решения лечащего врача. Антитело подходящим образом вводят пациенту один раз или на протяжении серии обработок. В зависимости от типа и тяжести заболевания исходная подходящая дозировка для введения пациенту может составлять примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг) антитела, независимо от того, вводится ли она, например, одним или более чем одним отдельным введением или непрерывной инфузией. Одна типичная суточная дозировка может варьировать от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. В том, что касается повторных введений на протяжении нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение обычно продолжалось бы до тех пор, пока не произойдет желательное подавление симптомов заболевания. Одна типичная дозировка антитела находилась бы в интервале от примерно 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту может вводиться одна или более чем одна доза, составляющая примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любая их комбинацию). Такие дозы могут вводиться периодически, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так что пациент получает от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз антитела). Можно вводить исходную более высокую ударную дозу, с последующими одной или более чем одной меньшими дозами. Типичная схема дозировки включает введение [[добавить типичную схему дозировки, если она известна, например «исходная ударная доза примерно 4 мг/кг, с последующей еженедельной поддерживающей дозой примерно 2 мг/кг антитела»]]. Однако могут быть полезными другие схемы дозировки. Прогресс данной терапии легко отслеживать традиционными методиками и анализами.

Понятно, что введение любой из приведенных выше композиций или любые из приведенных выше терапевтических способов можно осуществлять с использованием иммуноконъюгата по изобретению вместо или помимо биспецифичного антитела.

VII. Изделия

В другом аспекте изобретения предложено изделие, содержащее материалы, полезные для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше расстройств. Данное изделие содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковке на или ассоциированные с контейнером.

Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, мешки с в.в. (внутривенный) раствором и т.д. Контейнеры могут быть сделаны из целого ряда материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок с внутривенным раствором или флакон, имеющий пробку, проницаемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антитело по изобретению. На этикетке или на листке-вкладыше в упаковке указано то, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где данная композиция содержит антитело по изобретению; и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где данная композиция содержит другой цитотоксический или оказывающий иное терапевтическое действие агент. Изделие в данном воплощении изобретения может, кроме того, содержать листок-вкладыш в упаковке, на котором указано то, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. Альтернативно или дополнительно, изделие может, кроме того, содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекции (BWFI), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно, кроме того, может включать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Понятно, что любое из приведенных выше изделий может включать иммуноконъюгат по изобретению вместо или помимо биспецифичного антитела.

Описание перечня последовательностей:

SEQ ID NO: 01-07 и 66-67 Мотивы для сортазы

SEQ ID NO: 08 Нуклеофил области Fc

SEQ ID NO: 09-10 Остальные части мотива для сортазы в

иммуноконъюгате

SEQ ID NO: 11-29 Метка в виде аминокислотной последовательности

SEQ ID NO: 30 Человеческий домен СН2

SEQ ID NO: 31 Человеческий домен СН3

SEQ ID NO: 32-46 Типичные полипептиды области

Fc тяжелой цепи антитела дикого

типа и варианта антитела

SEQ ID NO: 47-65 Последовательности, используемые

в примерах.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры являются примерами способов и композиций по изобретению. Понятно, что на практике можно воплощать разные другие воплощения, принимая во внимание приведенное выше общее описание.

Несмотря на то, что вышеописанное изобретение было описано в некоторых подробностях посредством иллюстрации и примера с целью ясности понимания, данные описания и примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения.

Материалы и методы

Методики генной инженерии

Для манипуляции с ДНК использовали стандартные способы, как описано в Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Реактивы для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям изготовителя.

Синтез генов

Желательные сегменты генов получали химическим синтезом в Geneart GmbH (Регенсбург, Германия). Синтезированные фрагменты генов клонировали в плазмиду Е. coli для размножения/амплификации. Последовательность ДНК субклонированных фрагментов генов подтверждали секвенированием ДНК.

Определение белка

Концентрацию белка очищенных полипептидов определяли путем определения оптической плотности (ОП) при 280 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности полипептида.

Пример 1

Получение экспрессионных плазмид

Получение базовой/стандартной экспрессионной плазмиды млекопитающих

Желательные белки экспрессировались посредством временной трансфекции клеток эмбриональных почки человека (НЕК 293). Для экспрессии желательного гена/белка (например, тяжелой цепи полноразмерного антитела, легкой цепи полноразмерного антитела или цепи Fc, содержащей на ее N-конце олигоглицин) использовали транскрипционную единицу, содержащую следующие функциональные элементы:

- немедленный ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (P-CMV), включая интрон А,

- 5'-нетранслируемая область (5'UTR) тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,

- сигнальная последовательность (SS) тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина,

- ген/белок, подлежащий экспрессии (например, полноразмерная тяжелая цепь антитела) и

- последовательность полиаденилирования коровьего гормона роста (BGH рА).

Помимо экспрессионной единицы/кассеты, включающей желательный ген, подлежащий экспрессии, базовая/стандартная экспрессионная плазмида млекопитающего содержит:

- репликатор из вектора pUC18, который обеспечивает репликацию данной плазмиды в Е. coli, и

- ген бета-лактамазы, который придает Е. coli устойчивость к ампициллину. Сконструировали экспрессионные плазмиды, кодирующие следующие полипептиды/белки:

- вариабельный домен тяжелой цепи пертузумаба, объединенный с константной областью человеческой тяжелой цепи подкласса lgG1, содержащей мутацию T366W:

- вариабельный домен легкой цепи пертузумаба, объединенный с константной областью человеческой легкой цепи каппа:

- вариабельный домен тяжелой цепи трастузумаба, объединенный с константной областью человеческой тяжелой цепи подкласса lgG1, содержащей мутации T366S, L368A и Y407V:

- вариабельный домен легкой цепи трастузумаба, объединенный с константной областью человеческой легкой цепи каппа:

- фрагмент Fab антитела, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи пертузумаба и константную область 1 (СН1) человеческой тяжелой цепи подкласса lgG1, содержащую С-концевую аминокислотную последовательность

- фрагмент Fab антитела, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи пертузумаба и константную область 1 (СН1) человеческой тяжелой цепи подкласса lgG1, содержащую С-концевую последовательность

- фрагмент Fab антитела, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи пертузумаба и константную область 1 (СН1) человеческой тяжелой цепи подкласса lgG1, содержащую С-концевую последовательность

- фрагмент Fab антитела, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи трастузумаба и константную область 1 (СН1) человеческой тяжелой цепи подкласса lgG1, содержащую С-концевую последовательность

- фрагмент Fab антитела, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи трастузумаба и константную область 1 (СН1) человеческой тяжелой цепи подкласса lgG1, содержащую С-концевую последовательность

- фрагмент Fab антитела, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи трастузумаба и константную область 1 (СН1) человеческой тяжелой цепи подкласса lgG1, содержащую С-концевую последовательность

- полипептид области Fc тяжелой цепи (человеческий lgG1(CH2-CH3)) с мутациями T366S, L368A и Y407V, содержащий N-концевую последовательность

- полипептид области Fc тяжелой цепи (человеческий lgG1(CH2-CH3)) с мутациями T366S, L368A и Y407V, содержащий N-концевую последовательность

- полипептид области Fc тяжелой цепи (человеческий lgG1(CH2-CH3)) с мутациями T366S, L368A и Y407V, содержащий N-концевую последовательность

- полипептид области Fc тяжелой цепи (человеческий lgG1(CH2-CH3)) с мутацией T366VV, содержащий N-концевую последовательность

- полипептид области Fc тяжелой цепи (человеческий lgG1(CH2-CH3)) с мутацией T366W, содержащий N-концевую последовательность GGHTCPPC:

- полипептид области Fc тяжелой цепи (человеческий lgG1(CH2-CH3)) с мутацией T366W, содержащий N-концевую последовательность GGCPPC:

Пример 2

Временная экспрессия, очистка и аналитическая характеризация Цепи антитела получали временной трансфекцией клеток НЕК293 (происходящие от линии клеток 293 человеческой эмбриональной почки), культивируемых в среде F17 (Invitrogen Corp.). Для трансфекции использовали трансфекционный реактив «293-Fectin» (Invitrogen). Цепи антитела экспрессировались из трех разных плазмид, кодирующих полноразмерную тяжелую цепь (либо выступ - пертузумаб, либо впадину - трастузумаб), соответствующую полноразмерную легкую цепь и полипептид области Fc тяжелой цепи, содержащий одну из N-концевых олигоглициновых последовательностей либо в виде варианта выступа, либо впадины. При трансфекции три данные плазмиды использовали в эквимолярном соотношении плазмид. Трансфекции проводили, как определено в инструкциях изготовителей. Супернатанты культуры клеток, содержащие область Fc антитела, отбирали через семь суток после трансфекции. Супернатанты хранили замороженными до очистки.

Супернатанты культуры, содержащие область Fc антитела, фильтровали и очищали двумя стадиями хроматографии. Области Fc антитела захватывали посредством аффинной хроматографии с использованием HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare), уравновешенной PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (1 мМ КН₂РO₄, 10 мМ Na₂HPO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl), рН 7,4. Несвязавшиеся белки удаляли промывкой буфером для уравновешивания, и область Fc антитела выделяли 0,1 М цитратным буфером, рН 3,0. Сразу после элюции раствор нейтрализовали до рН 6,0 1 М основанием Tris, рН 9,0. В качестве второй стадии очистки использовали гель-фильтрацию на Superdex 200™ (GE Healthcare). Гель-фильтрацию проводили в 40 мМ Tris-HCl буфере, 0,15 М NaCl, рН 7,5. Элюированные области Fc антитела концентрировали с использованием центрифужного фильтровального блока Ultrafree-CL, оснащенного мембраной Biomax-SK (Millipore, Billerica, MA), и хранили при -80°С.

Концентрации белка областей Fc антител определяли измерением оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и правильное образование области Fc антитела анализировали SDS-PAGE в присутствии или в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотрейтол) и окрашивания кумасси бриллиантовым синим.

Пример 3

Временная экспрессия, очистка и аналитическая характеризация фрагментов Fab антитела, содержащих С-концевой мотив LPX1TG

Фрагменты Fab антитела получали временной трансфекцией клеток НЕК293 (происходящие от линии клеток 293 человеческой эмбриональной почки), культивируемых в среде F17 (Invitrogen Corp.). Для трансфекции использовали трансфекционный реактив «293-Fectin» (Invitrogen). Фрагменты Fab антител экспрессировали из двух разных плазмид, кодирующих полноразмерную легкую цепь (либо пертузумаб, либо трастузумаб) и соответствующую усеченную тяжелую цепь, содержащую одну из С-концевых последовательностей LPX1TG. При трансфекции две данные плазмиды использовали в эквимолярном соотношении плазмид. Трансфекции проводили, как определено в инструкциях изготовителя. Супернатанты культуры клеток, содержащие фрагменты Fab, отбирали через семь суток после трансфекции. Супернатанты хранили в замороженном состоянии до очистки.

Супернатанты культуры, содержащие фрагмент Fab, фильтровали и очищали двумя стадиями хроматографии. Фрагменты Fab захватывали посредством аффинной хроматографии с использованием колонок HisTrap HP Ni-NTA (GE Healthcare), уравновешенных PBS и 20 мМ имидазолом (1 мМ КН₂РO₄, 10 мМ Na₂HPO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 20 мМ имидазол), рН 7,4. Несвязавшиеся белки удаляли промывкой буфером для уравновешивания. Белок, меченный гистидиновой меткой, элюировали линейным градиентом имидазола от 20 мМ до 400 мМ в PBS (1 мМ КН₂РO₄, 10 мМ Na₂HPO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 400 мМ имидазол) в 10 объемах колонки. В качестве второй стадии очистки использовали гель-фильтрацию на Superdex 200™ (GE Healthcare). Гель-фильтрацию проводили в 40 мМ Tris-HCl буфере, 0,15 М NaCl, рН 7,5. Фрагменты Fab концентрировали с использованием центрифужного фильтровального блока Ultrafree-CL, оснащенного мембраной Biomax-SK (Millipore, Billerica, MA), и хранили при -80°С.

Концентрации белка фрагментов Fab определяли измерением оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и правильное образование Fab анализировали SDS-PAGE в присутствии или в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотрейтол) и окрашивания кумасси бриллиантовым синим.

Пример 4

Опосредованное сортазой А лигирование области Fc антитела и связывающей группировки (фрагмента Fab)

Для опосредованной сортазой реакции транспептидации использовали сортазу A Staphylococcus aureus, усеченную на N-конце (Δ_1-59). Реакцию проводили в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (буфер для сортазы). В данной реакции связывали фрагмент Fab, имеющий мотив для сортазы (LPETG) на его С-конце VH-CH1 тяжелой цепи, включающий или не включающий 2 разные соединительные короткие аминокислотные последовательности между С-концом VH-CH1 тяжелой цепи (…KSC) и N-концом мотива для сортазы (LPETGGSGSHHHHHH, SEQ ID NO: 63, GSLPETGGSGSHHHHHH, SEQ ID NO: 64 и GGGSLPETGGSGSHHHHHH, SEQ ID NO: 65), и одноплечее антитело, имеющее олигоглициновый мотив и три разные шарнирные последовательности (GGCPPC, SEQ ID NO: 8 с Х4, представляющим собой Р, GGHTCPPC, SEQ ID NO: 66 и GGGDKTHTCPPC, SEQ ID NO: 67 соответственно) на N-конце его полипептида области Fc тяжелой цепи, что приводило к получению конъюгата с областью Fc антитела. Для проведения реакции все реактивы переносили в раствор в буфере для сортазы. На первом этапе смешивали область Fc антитела и фрагмент Fab антитела, и реакция начиналась после добавления сортазы А и 5 мМ CaCl₂. Компоненты смешивали посредством переноса пипеткой и инкубировали при 37°С в течение 72 ч. Затем реакцию останавливали замораживанием реакционной смеси, и ее хранили при -20°С до анализа.

Молярное соотношение Fаb:одноплечее антитело:сортаза составляет 20:4:1.

Результаты

Посредством сортазы А были конъюгированы три разные последовательности на С-конце Fab и на N-конце антитела соответственно с получением девяти разных комбинаций конъюгатов с областью Fc антитела. Эффективность реакции связывания оценивали в разные моменты времени. С этой целью анализировали аликвоты реакций транспептидации посредством SDS-PAGE. Эффективность лигирования оценивали денситометрически на геле SDS-PAGE. Результаты для соответствующих последовательностей после 72 ч реакции описаны в Таблице 2.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения биспецифичного антитела. Также раскрыт способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов. Изобретение позволяет получать биспецифичные антитела. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. Способ получения биспецифичного антитела, включающий следующие стадии:

(i) определение маркеров поверхности клетки, присутствующих в образце, содержащем клетки, и выбор из них по меньшей мере первого маркера поверхности клетки и второго маркера поверхности клетки,

(ii) инкубирование (а) фрагмента Fab антитела или scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab антитела или scFv антитела специфично связывается с первым маркером поверхности клетки или его лигандом, (б) фрагмента в виде неполного одноплечего антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым маркером поверхности клетки или его лигандом, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А

и получение, посредством этого, биспецифичного антитела.

2. Способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов, включающий следующие стадии:

(i) определение специфичности связывания, и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полувыведения in vivo множества биспецифичных антител, полученных объединением (а) каждого члена первого множества фрагментов Fab антитела или фрагментов scFv антитела, при этом каждый член содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab или scFv антитела специфично связывается с первым эпитопом или антигеном, с (б) каждым членом из множества фрагментов в виде неполного одноплечего антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым эпитопом или антигеном, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) ферментом сортазой А и

(ii) выбор биспецифичного антитела с подходящей специфичностью связывания, и/или селективностью, и/или аффинностью, и/или эффекторной функцией, и/или периодом полувыведения in vivo и, посредством этого, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.