Настоящее изобретение направлено на способ выявления/определения антител к лекарству в образце, содержащем сыворотку млекопитающего, с использованием человеческого рецептора I Fc-гамма или его фрагмента, связывающегося с областью Fc, в качестве специфичного выявляющего реактива.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Стандартные твердофазные иммуноанализы с антителами включают образование комплекса между антителом, адсорбированным/иммобилизованным на твердой фазе (захватывающее антитело), антигеном и антителом к другому эпитопу данного антигена, конъюгированным с ферментом или выявляемой меткой (меченое антитело). В данном анализе образуется сэндвич: твердая фаза/ захватывающее антитело/антиген/меченое антитело. В реакции, катализируемой сэндвичем, среди других вещей, активность антитела, конъюгированного с ферментом, является пропорциональной концентрации антигена в инкубационной среде. Упоминаются анализы антиидиотипических антител, например, в US 5219730; WO 87/002778; ЕР 0139389 и ЕР 0170302. Wadhwa, М., et al. (J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17) описывают стратегии выявления, измерения и характеризации нежелательных антител, индуцированных терапевтическими биологическими агентам. Способ получения антиидиотипических антител приводится в ЕР 1917854.

Chen, Y. - P., et al. (Clin. Vac. Immunol. 14 (2007) 720-725) описывают быстрое выявление антигена поверхности вируса гепатита В посредством анализа агглютинации, опосредованной биспецифичным диателом против и человеческих эритроцитов, и антигена поверхности вируса гепатита В. Porter, R., et al описывают электроактивную систему иммуноанализа (анализ EASI) с использованием электродов, модифицированных самособранным монослоем (Biosensors Bioelec. 16 (2001) 9-12). Разработка ферментативного иммуноанализа для измерения человеческого фактора некроза опухолей-альфа (hTNF-альфа) с использованием биспецифичных антител к hTNF-альфа и пероксидазы хрена описывается Berkova, N., et al. (Biotechnol. Appl. Biochem. 23 (1996) 163-171). В ЕР 0962771 описываются детектирующий прибор и способ для того же самого. Reinhartz, H.W., et al. (Analyst 121 (1996) 767-771) описывают биспецифичное многовалентное антитело, исследованное анализом взаимодействий в реальном времени, для разработки твердофазного иммуноферментного анализа с ингибированием антигена. Химическое получение биспецифичных антител описывается Doppalapudi, V.R., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (2010) 22611-22616).

В ЕР 2492689 A1 описывается выявление антител с использованием ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) с улучшенным иммунным комплексом (1С). Способы выявления антител описываются в WO 2011/135024. В WO 2009/077127 описывается различающий анализ. Способ выявления антител к лекарственным средствам описывается в ЕР 2351792. В WO 2012/130831 описываются Fc-варианты антител.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описывается иммуноанализ, а также способ и применение, основанные на специфичном связывании человеческого рецептора I Fc-гамма с областью Fc антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, для определения присутствия, а также количества антитела к лекарству.

Обнаружили, что полезным для выявления и количественного измерения антител к лекарствам в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией является применение человеческого рецептора I Fc-гамма или его фрагмента, связывающегося с областью Fc, в качестве одного соединения в иммуноанализе. Посредством применения человеческого рецептора I Fc-гамма может быть предложен улучшенный иммуноанализ, например, по сравнению с традиционным мостиковым иммуноанализом. Среди других вещей улучшением является улучшенная чувствительность и/или надежность.

Аспекты, описанные в данном документе, являются особенно полезными, если лекарственное антитело представляет собой человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией, т.е. если область Fc лекарственного антитела (полипептиды области Fc) содержит мутации, которые уменьшают или даже устраняют связывание лекарственного антитела с человеческим рецептором III Fc-гамма.

Человеческий рецептор I Fc-гамма можно использовать в качестве захватывающего соединения (когда он иммобилизован на твердой поверхности) или меченого соединения (когда он конъюгирован с выявляемой меткой).

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, включающий следующие стадии в следующем порядке:

- инкубирование образца, содержащего сыворотку крови млекопитающего, с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, таким образом, что образуется комплекс между антителом к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, присутствующим в образце, и человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой, и

- определение комплекса, образовавшегося на предыдущей стадии, посредством выявляемой метки.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, включающий следующие стадии в следующем порядке:

- инкубирование образца, содержащего сыворотку крови млекопитающего, с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, таким образом, что образуется комплекс между антителом к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, присутствующим в образце, и человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой,

- выделение комплекса, образовавшегося между антителом к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией и человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, и

- определение комплекса посредством выявляемой метки.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) инкубирование твердой фазы, на которой было иммобилизовано человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией, с образцом, содержащим сыворотку крови млекопитающего (таким образом, что образуется комплекс лекарственное антитело, связанное с твердой фазой - антитело к лекарству),

б) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс лекарственное антитело - антитело к лекарству, образовавшийся на стадии а)) с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой и

в) определение образования на стадии б) комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) инкубирование твердой фазы, на которой был иммобилизован Fab человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, с образцом, содержащим сыворотку крови млекопитающего (таким образом, что образуется комплекс Fab, связанный с твердой фазой - антитело к лекарству),

б) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс Fab-антитело к лекарству, образовавшийся на стадии а)) с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой и

в) определение образования на стадии б) комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) добавление (избытка) лекарственного антитела в образец (для переноса (любого) антитела к лекарству, присутствующего в образце, в комплекс лекарственное антитело - антитело к лекарству), где образец содержит сыворотку крови млекопитающего,

б) инкубирование твердой фазы, на которой был иммобилизован антиген, с которым специфично связывается EFS-DA, с образцом, полученным на стадии а) (таким образом, что образуется комплекс антиген, связанный с твердой фазой - лекарственное антитело - антитело к лекарству),

в) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс антиген - лекарственное антитело - антитело к лекарству, образовавшийся на стадии б)) с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой и

г) определение образования на стадии в) комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) добавление (избытка) лекарственного антитела в образец (для переноса (любого) антитела к лекарству, присутствующего в образце, в комплекс лекарственное антитело - антитело к лекарству), где образец содержит сыворотку крови млекопитающего,

б) инкубирование твердой фазы, на которой был иммобилизован полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, с образцом, полученным на стадии а) (таким образом, что образуется комплекс рецептор, связанный с твердой фазой - лекарственное антитело - антитело к лекарству),

в) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс рецептор - лекарственное антитело - антитело к лекарству, образовавшийся на стадии б)) с антигеном лекарственного антитела, при этом данный антиген конъюгирован с выявляемой меткой и

г) определение образования на стадии в) комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) добавление (избытка) лекарственного антитела в образец (для переноса (любого) антитела к лекарству, присутствующего в образце, в комплекс лекарственное антитело - антитело к лекарству), где образец содержит сыворотку крови млекопитающего,

б) инкубирование твердой фазы, на которой было иммобилизовано антитело к лекарству в отношении лекарственного антитела, с образцом, полученным на стадии а) (таким образом, что образуется комплекс антитело к лекарству, связанное с твердой фазой - лекарственное антитело - антитело к лекарству),

в) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс антитело к лекарству - лекарственное антитело - антитело к лекарству, образовавшийся на стадии б)) с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой и

г) определение образования на стадии в) комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является способ определения присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, включающий следующие стадии в следующем порядке:

- инкубирование образца, содержащего сыворотку крови млекопитающего, с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, таким образом, что образуется комплекс между антителом к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, присутствующим в образце, и человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой, и

- определение комплекса, образовавшегося на предыдущей стадии, посредством выявляемой метки.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, комплекс между антителом к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, присутствующим в образце, и человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, представляет собой комплекс 1:1. Это означает то, что точно одно антитело к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, присутствующее в образце, и точно один человеческий рецептор I Fc-гамма или фрагмент, связывающийся с областью Fc, присутствуют в образовавшемся комплексе.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, комплекс между антителом к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, присутствующим в образце, и человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, представляет собой мономерный комплекс. Это означает то, что ни одно из соединений в комплексе не является мультимером. Это дополнительно означает то, что в аспектах, как описано в данном документе, не используются эффекты авидности.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, все образующиеся комплексы представляют собой мономерные комплексы.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, все образующиеся комплексы представляют собой комплексы 1:1 или 1:1:1. Это означает то, что только одна молекула каждого соединения, из которых образуется комплекс, присутствует в комплексе, в зависимости от использованного формата комплекса. В одном воплощении комплекс содержит: 1) точно одну молекулу человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, 2) точно одну молекулу антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией и 3) точно одну молекулу человеческого рецептора I Fc-гамма или его фрагмента, связывающегося с областью Fc. В одном воплощении комплекс содержит: 1) точно одну молекулу человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, 2) точно одну молекулу антигена человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией и 3) точно одну молекулу человеческого рецептора I Fc-гамма или его фрагмента, связывающегося с областью Fc. В одном воплощении комплекс содержит: 1) точно одну молекулу Fab человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, 2) точно одну молекулу антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией и 3) точно одну молекулу человеческого рецептора I Fc-гамма или его фрагмента, связывающегося с областью Fc.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) инкубирование твердой фазы, на которой было иммобилизовано человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией, с образцом, содержащим сыворотку крови млекопитающего (таким образом, что образуется мономерный 1:1 комплекс лекарственное антитело, связанное с твердой фазой - антитело к лекарству),

б) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс лекарственное антитело - антитело к лекарству, образовавшийся на стадии а)) с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой и

в) определение образования на стадии б) мономерного 1:1 комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) инкубирование твердой фазы, на которой был иммобилизован Fab человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, с образцом, содержащим сыворотку крови млекопитающего (таким образом, что образуется мономерный 1:1 комплекс Fab, связанный с твердой фазой - антитело к лекарству),

б) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс Fab-антитело к лекарству, образовавшийся на стадии а)) с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой и

в) определение образования на стадии б) мономерного 1:1 комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) добавление (избытка) лекарственного антитела в образец (для переноса (любого) антитела к лекарству, присутствующего в образце, в комплекс лекарственное антитело - антитело к лекарству), где образец содержит сыворотку крови млекопитающего,

б) инкубирование твердой фазы, на которой был иммобилизован антиген, с которым специфично связывается EFS-DA, с образцом, полученным на стадии а) (таким образом, что образуется мономерный 1:1 комплекс антиген, связанный с твердой фазой - лекарственное антитело - антитело к лекарству),

в) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс антиген - лекарственное антитело - антитело к лекарству, образовавшийся на стадии б)) с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой и

г) определение образования на стадии в) мономерного 1:1 комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) добавление (избытка) лекарственного антитела в образец (для переноса (любого) антитела к лекарству, присутствующего в образце, в комплекс лекарственное антитело - антитело к лекарству), где образец содержит сыворотку крови млекопитающего,

б) инкубирование твердой фазы, на которой был иммобилизован полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, с образцом, полученным на стадии а) (таким образом, что образуется мономерный 1:1 комплекс рецептор, связанный с твердой фазой - лекарственное антитело - антитело к лекарству),

в) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс рецептор - лекарственное антитело - антитело к лекарству, образовавшийся на стадии б)) с антигеном лекарственного антитела, при этом данный антиген конъюгирован с выявляемой меткой и

г) определение образования на стадии в) мономерного 1:1 комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), включающий следующие стадии в следующем порядке:

а) добавление (избытка) лекарственного антитела в образец (для переноса (любого) антитела к лекарству, присутствующего в образце, в комплекс лекарственное антитело - антитело к лекарству), где образец содержит сыворотку крови млекопитающего,

б) инкубирование твердой фазы, на которой было иммобилизовано антитело к лекарству в отношении лекарственного антитела, с образцом, полученным на стадии а) (таким образом, что образуется мономерный 1:1 комплекс антитело к лекарству, связанное с твердой фазой - лекарственное антитело - антитело к лекарству),

в) инкубирование твердой фазы (с которой связан комплекс антитело к лекарству - лекарственное антитело - антитело к лекарству, образовавшийся на стадии б)) с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой и

г) определение образования на стадии в) мономерного 1:1 комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и, посредством этого, определение присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является способ определения присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, включающий следующие стадии в следующем порядке:

- инкубирование образца, содержащего сыворотку крови млекопитающего, с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, таким образом, что образуется комплекс между антителом к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, присутствующим в образце, и человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой, и

- определение комплекса, образовавшегося на предыдущей стадии, посредством выявляемой метки.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является применение человеческого рецептора I Fc-гамма или его фрагмента, связывающегося с областью Fc, для определения присутствия или количества антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией в образце, содержащем сыворотку крови млекопитающего.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, после каждой стадии инкубации следует следующая стадия:

- промывка твердой фазы для удаления несвязавшихся соединений.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, анализ предназначен для определения в образце присутствия и количества антитела к лекарству (ADA) в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией (EFS-DA), и он включает в качестве конечных стадий:

- определение образования на предыдущей стадии комплекса, связанного с твердой фазой, посредством определения присутствия выявляемой метки и определение количества антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией в образце посредством связывания количества выявляемой метки с количеством антитела к лекарству с использованием стандартной кривой.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией принадлежит к человеческому подклассу lgG1 или lgG4.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией принадлежит к человеческому подклассу lgG1 и имеет мутации L234A, L235A и P329G в обоих полипептидах области Fc, или человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией принадлежит к человеческому подклассу lgG4 и имеет мутации S228P, L235E и P329G в обоих полипептидах области Fc (нумерация согласно системе нумерации EU (Европейский Союз) согласно Kabat).

В одном воплощении всех аспектов человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией представляет собой биспецифичное антитело, или триспецифичное антитело, или тетраспецифичное антитело, или пентаспецифичное антитело, или гексаспецифичное антитело. В одном воплощении человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией представляет собой биспецифичное антитело.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией не индуцирует ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность).

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, сыворотка крови млекопитающего представляет собой сыворотку крови человека или сыворотку крови яванского макака, или сыворотку крови мыши.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, сыворотка крови млекопитающего была получена от млекопитающего, которому было введено человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией. В одном воплощении образец получают по меньшей мере через 2 суток после первого введения антитела млекопитающему.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, образец содержит от 0,5% (об./об.) до 8% (об./об.) сыворотки млекопитающего, предпочтительно примерно 2% (об./об.) сыворотки млекопитающего.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, антитело к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией принадлежит к классу lgG.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, присутствие и/или колчество метки определяется с использованием цветной реакции связанной с ферментом, поверхностного плазмонного резонанса, электрохемилюминисценции или радиоиммуноанализа.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, иммуноанализ и/или способ, и/или применение представляет собой иммуноанализ in vitro и/или способ in vitro, и/или применение in vitro.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, твердая фаза конъюгирована с первым участником пары связывания, и соединение, подлежащее иммобилизации на твердой фазе, конъюгировано со вторым участником пары связывания.

Такая пара связывания (первый участник/второй участник) в одном воплощении выбрана из следующих: стрептавидин или авидин/биотин, антитело/антиген (см., например, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)), лектин/полисахарид, стероид/стероидсвязывающий белок, гормон/рецептор гормона, фермент/субстрат, lgG/белок А и/или G и т.д.

В одном воплощении второй партнер связывания связывается (иммобилизуется) посредством пары специфичного связывания. Такая пара связывания (первый компонент/второй компонент) в одном воплощении выбрана из следующих: стрептавидин или авидин/биотин, антитело/антиген (см., например, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)), лектин/полисахарид, стероид/стероидсвязывающий белок, гормон/рецептор гормона, фермент/субстрат, lgG/белок А и/или G и т.д. В одном воплощении второй партнер связывания конъюгирован с биотином, и иммобилизация осуществляется посредством иммобилизованного авидина или стрептавидина.

В одном предпочтительном воплощении первый участник пары связывания представляет собой стрептавидин, и второй участник пары связывания представляет собой биотин.

В одном воплощении твердая фаза конъюгирована со стрептавидином, и соединение, подлежащее иммобилизации на твердой фазе, является биотинилированным.

В одном воплощении твердая фаза представляет собой покрытый стрептавидином парамагнитный шарик или покрытый стрептавидином сефарозный шарик, или покрытую стрептавидином лунку многолуночного планшета.

В одном воплощении соединение, подлежащее конъюгированию с твердой фазой, представляет собой смесь, содержащую по меньшей мере два соединения, которые отличаются в сайте, в котором они конъюгируются с биотином, и, посредством этого, затем иммобилизуются на твердой фазе.

В одном воплощении соединение, подлежащее иммобилизации на твердой фазе, конъюгируется со вторым участником пары связывания посредством химического связывания через N-концевую и/или ε-аминогруппы (лизин), ε-аминогруппы разных лизинов, карбоксильную, сульфгидрильную, гидроксильную и/или фенольные функциональные группы аминокислотного остова полипептида и/или сахароспиртовые группы углеводной структуры полипептида.

Такое конъюгирование через разные аминогруппы может осуществляться посредством ацилирования части ε-аминогрупп химическими защитными агентами, например, посредством цитраконилирования, на первом этапе. На втором этапе конъюгирование проводится через остающиеся аминогруппы. Затем удаляется цитраконилирование, и партнер связывания иммобилизируется на твердой фазе через остающиеся свободные аминогруппы, т.е. полученный партнер связывания иммобилизован на твердой фазе через аминогруппы, которые не были защищены посредством цитраконилирования. Подходящие химические защитные агенты образуют связи на незащищенных аминах боковых цепей и являются менее стабильными чем и отличными от тех связей на N-конце. Известны многие такие химические защитные агенты (см., например, ЕР 0651761). В одном воплощении химические защитные агенты включают ангидриды циклических дикарбоновых кислот, подобные ангидриду малеиновой или цитраконовой кислоты.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обнаружили, что полезным для выявления и количественного измерения антител к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией является применение в качестве одного соединения в иммуноанализе человеческого рецептора I Fc-гамма или его фрагмента, связывающегося с областью Fc.

Посредством применения человеческого рецептора I Fc-гамма может быть предложен улучшенный иммуноанализ, например, по сравнению с традиционным мостиковым иммуноанализом.

Данное улучшение, без ограничения, проявляется в чувствительности и/или надежности.

В анализе, как описано в данном документе, уменьшается мешающее воздействие мишени, и, посредством этого, уменьшается число ложных позитивных результатов. Мешающее воздействие от lgM (например, возникающее в результате раннего и/или неспецифичного иммунного ответа) уменьшается.

При использовании анализа, описанного в данном документе, можно выявлять малоаффинные антитела к лекарству.

Обычно применяемый формат мостикового анализа для опредления антител к лекарству требует того, чтобы антитело к лекарству могло одновременно связываться с друмя молекулами лекарственного антитела.

В иммуноанализе и способе, как описано в данном документе, не требуется, чтобы антитело к лекарству образовало мостик с двумя копиями лекарственного антитела. На самом деле в иммуноанализе и способе, как описано в данном документе, последовательно используются разные сайты связывания.

Более подробно, иммуноанализ, как описано в данном документе, улучшается, наряду с другими вещами, в отношении чувствительности, требующегося объема образца, способа связывания соединений. К тому же, число антител к лекарству, распознаваемых в данном иммуноанализе антител к лекарству, больше, чем, например, при использовании традиционного мостикового иммуноанализа, поскольку также выявляются не образующие мостик антитела к лекарству.

Кроме того, иммуноанализ, как описано в данном документе, имеет улучшенные свойства в отношении выявления антител к лекарству класса lgG (вторичный иммунный ответ) по сравнению с антителами к лекарству класса lgM (первичный иммунный ответ).

В данном документе описан иммуноанализ антитела к лекарству для определения присутствия в образце антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, включающий следующие стадии в следующем порядке:

- инкубирование образца, содержащего сыворотку крови млекопитающего, с полноразмерным человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, таким образом, что образуется комплекс между антителом к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией, присутствующим в образце, и человеческим рецептором I Fc-гамма или его фрагментом, связывающимся с областью Fc, при этом полноразмерный человеческий рецептор I Fc-гамма или его фрагмент, связывающийся с областью Fc, конъюгирован с выявляемой меткой, и

- определение комплекса, образовавшегося на предыдущей стадии, посредством выявляемой метки.

В анализе, как описано в данном документе, предложен улучшенный способ выявления терапевтических лекарственных антител с подавленной эффекторной функцией. Данные человеческие или гуманизированные лекарственные антитела с подавленной эффекторной функцией (они являются единственными антителами, полезными для терапии пациента-человека) не связываются с человеческими рецепторами Fc-гамма, или, наоборот, человеческие рецепторы Fc-гамма не связываются с областью Fc человеческих или гуманизированных лекарственных антител с подавленной эффекторной функцией, поскольку сайт связывания был модифицирован для подавления эффекторной функции, которая опосредована человеческими рецепторами Fc-гамма.

Человеческий рецептор I Fc-гамма (CD64) является высокоаффинным (в отношении человеческой области Fc) рецептором, тогда как человеческие рецепторы II и III Fc-гамма (CD32 и CD16 соответственно) являются низкоаффинными рецепторами.

Термин «антитело» используется в данном документе в самом широком смысле и охватывает разные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, но не ограничиваясь ими, при условии, что они демонстрируют желательную антигенсвязывающую активность.

В некоторых воплощениях антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух разных сайтов. В некоторых воплощениях одна из специфичностей связывания направлена на первый антиген, и другая - на отличный второй антиген. В некоторых воплощениях биспецифичные антитела могут связываться с двумя разными эпитопами того же самого антигена. Биспецифичные антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, которое специфично связывается с первым и вторым антигеном. В одном воплощении биспецифичное антитело имеет i) первую специфичность связывания, которая обеспечивает специфичное связывание с первым антигеном или первым эпитопом на антигене, и ii) вторую специфичность связывания, которая обеспечивает специфичное связывание со вторым антигеном или вторым эпитопом на том же самом антигене. В одном воплощении второй эпитоп на том же самом антигене представляет собой неперекрывающийся эпитоп.

Мультиспецифичные антитела описываются в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 или WO 2010/145793.

Термин «фрагмент антитела» относится к любой молекуле, отличающейся от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифичные антитела, образующиеся из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

Термин «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, которыми обладает его тяжелая цепь. Существуют пять главных классов антител: lgA, lgD, lgE, lgG и lgM, и некоторые из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, lgG₁, lgG₂, lgG₃, lgG₄, lgA₁ и lgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно.

«Эффекторные функции» относятся к тем биологическим активностям, приписываемым области Fc антитела, которые варьируют в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов поверхности клетки (например, рецептора В-клеток) и активацию В-клеток.

Термин «человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией» обозначает антитело, которое не вызывает ADCC.

В одном воплощении антитело с подавленной эффекторной функцией не связывается с человеческим рецептором III Fc-гамма.

В одном воплощении человеческое или гуманизированное лекарственное антитело с подавленной эффекторной функцией принадлежит к подклассу lgG1 или к подклассу lgG4. В одном воплощении человеческое или гуманизированное антитело подкласса lgG1 с подавленной эффекторной функцией содержит аминокислотный остаток аланина в положении 234 и в положении 235 константной области тяжелой цепи (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении человеческое или гуманизированное антитело с подавленной эффекторной функцией содержит в константной области тяжелой цепи аминокислотный остаток аланина в положении 234 и в положении 235 и аминокислотный остаток глицина в положении 329 (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении человеческое или гуманизированное антитело с подавленной эффекторной функцией подкласса lgG4 содержит в константной области тяжелой цепи аминокислотный остаток аланина в положении 235 и аминокислотный остаток пролина в положении 228 (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении человеческое или гуманизированное антитело с подавленной эффекторной функцией содержит в константной области тяжелой цепи аминокислотный остаток аланина в положении 235, аминокислотный остаток пролина в положении 228 и аминокислотный остаток глицина в положении 329 (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Термин «область Fc» в данном документе используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Данный термин включает области Fc с природной последовательностью и варианты областей Fc. В одном воплощении область Fc тяжелой цепи человеческого lgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) области Fc может присутствовать или может не присутствовать. Если в данном документе не определено иначе, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или в константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также именуемой индекс EU, как описано в Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

Термин «каркас» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным, от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельнго домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в VH (или VL) обычно проявляются в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком или человеческой клеткой, или происходит из источника, не являющегося человеческим, в котором используются репертуары человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Данное определение человеческого антитела конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки, не являющиеся человеческими.

«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR, не являющихся человеческими, и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVR (например, CDR (область, определяющая комплементарность)) соответствуют HVR антитела, не являющегося человеческим, и все или по существу все из FR соответствуют FR человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящую из человеческого антитела. Термин «гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое подверглось гуманизации.

Термин «гипервариабельная область» или «HVR» в том виде, как он используется в данном документе, относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которая является гипервариабельной по последовательности и/или образует структурно определенные петли («гипервариабельные петли»). В общем, природные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR обычно содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из «областей, определяющих комплементарность» (CDR), причем последние имеют наивысшую вариабельность последовательности и/или участвуют в распознавании антигена. Типичные гипервариабельные петли встречаются в аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) (Chothia, С. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Типичные CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) встречаются в аминокислотных остатках 24-34 L1, 50-56 L2, 89-97 L3, 31-35 В Н1, 50-65 Н2 и 95-102 Н3 (Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). За исключением CDR1 в VH, CDR обычно содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. CDR также содержат «остатки, определяющие специфичность» или «SDR», которые представляют собой остатки, которые контактируют с антигеном. SDR содержатся в областях CDR, именуемых сокращенные CDR или a-CDR. Типичные a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) встречаются в аминокислотных остатках 31-34 L1, 50-55 L2, 89-96 L3, 31-35 В Н1, 50-58 Н2 и 95-102 Н3 (Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) пронумерованы в данном документе согласно Kabat et al., выше.

Термин «моноклональное антитело» в том виде, как он используется в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с тем же самым эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации или возникающие во время получения препарата моноклонального антитела, причем такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, модификатор «моноклональное» указывает на характер антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела любым конкретным способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению согласно настоящему изобретению, можно получать целым рядом методик, включая способ гибридомы, способы генной инженерии, способы фагового дисплея и способы с использованием трансгенных животных, содержащих все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть, но не ограничиваясь ими, причем такие способы и другие типичные способы получения моноклональных антител описываются в данном документе.

«Полипептид» представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, независимо от того, продуцируется ли он в природе или синтетически. Полипептиды из меньше чем примерно 20 аминокислотных остатков могут называться «пептидами», тогда как молекулы, состоящие из двух или более чем двух полипептидов или содержащие один полипептид из более чем 100 аминокислотных остатков, могут называться «белками». Полипептид также может содержать неаминокислотные компоненты, такие как углеводные группы, ионы металлов или сложные эфиры карбоновых кислот. Неаминокислотные компоненты могут добавляться клеткой, в которой экспрессируется полипептид, и могут варьировать в зависимости от типа клетки. Полипептиды определяются в данном документе в показателях структуры их аминокислотного остова или нуклеиновой кислоты, кодирующей данный остов. Присоединения, такие как углеводные группы, обычно не определяются, но, тем не менее, могут присутствовать.

Термин «вариабельная область» или «вариабелный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела обычно имеют аналогичные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR) (см., например, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), страница 91). Одиночный домен VH или VL может быть достаточным для придания специфичности связывания с антигеном. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH соответственно (см., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин «антиидиотипическое антитело» обозначает антитело, которое специфично связывается со специфичностью связывания, такой как сайт связывания родительского антитела, т.е. которое направлено, например, против антигенсвязывающего сайта родительского антитела. В одном воплощении антиидиотипическое антитело специфично связывается с одним или более чем одним из CDR родительского антитела. В одном воплощении родительское антитело представляет собой терапевтическое антитело. В одном воплощении родительское антитело представляет собой мультиспецифичное антитело. В одном воплощении родительское антитело представляет собой биспецифичное антитело.

Принципы разных иммуноанализов описываются, например, Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R). Lu, В., et al. (Analyst 121 (1996) 29R-32R) описывают ориентированную иммобилизацию антител для применения в иммуноанализах. Иммуноанализы, опосредованные авидин-биотином, описываются, например, Wilchek, М. и Bayer, Е.А., в Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469.

Полипептиды и моноклональные антитела, и их константные домены содержат целый ряд реакционноспособных боковых цепей аминокислот для конъюгирования с участником пары связывания, таким как полипептид/белок, полимер (например, ПЭГ (полиэтиленгликоль), целлюлоза или полистирол) или фермент. Химически реакционноспособными группами аминокислот являются, например, аминогруппы (лизины, альфа-аминогруппы), тиольные группы (цистины, цистеины и метионины), группы карбоновых кислот (аспарагиновые кислоты, глутаминовые кислоты) и сахароспиртовые группы. Такие способы, например, описываются Aslam М. и Dent, А. в "Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, страницы 50-100.

Одной из самых обычных реакционноспособных групп полипептидов и антител является алифатический е-амин аминокислоты лизина. В общем, почти все полипептиды и антитела содержат многочисленные остатки лизина. Амины лизина представляют собой достаточно хорошие нуклеофилы при pH более 8,0 (pK_a равен 9,18) и, следовательно, легко и чисто реагируют с целым рядом реактивов с образованием стабильных связей. Реакционноспособные в отношении аминогрупп реактивы, главным образом, реагируют с лизинами и α-аминогруппами белков. Реакционноспособные сложные эфиры, в частности, N-гидроксисукцинимидиловые (NHS) сложные эфиры, находятся среди чаще всего используемых реактивов для модификации аминогрупп.Оптимальным pH для реакции в водной среде является pH от 8,0 до 9,0. Изотиоцианаты представляют собой аминомодифицирующие реактивы и образуют с белками связи, опосредованные тиомочевиной. Они реагируют с аминами белков в водном растворе (оптимально при pH от 9,0 до 9,5). Альдегиды реагируют с алифатическими и ароматическими аминами, гидразинами и гидразидами при мягких водных условиях с образованием иминного промежуточного соединения (основания Шиффа). Основание Шиффа может селективно восстанавливаться мягкими или сильными восстанавливающими агентами (такими как боргидрид натрия или цианоборгидрид натрия) с получением стабильной алкиламинной связи. Другими реактивами, которые использовали для модификации аминов, являются ангидриды кислот.Например, диэтилентриаминпентауксусный ангидрид (DTPA) представляет собой бифункциональный хелатирующий агент, который содержит две ангидридные группы, реакционноспособные в отношении аминов. Он может реагировать с N-концевыми и ε-аминогруппами аминокислот с образованием амидных связей. Ангидридные кольца открываются с образованием многовалентных, хелатирующих металл ручек, способных к прочному связыванию с металлами в координационном комплексе.

Другой обычной реакционноспособной группой в полипептидах и антителах является тиольный остаток из серосодержащей аминокислоты цистина и ее продукта восстановления - цистеина (или полуцистина). Цистеин содержит свободную тиольную группу, которая является более нуклеофильной, чем амины и обычно является самой реакционноспособной функциональной группой в белке. Тиолы обычно являются реакционноспособными при нейтральном pH и, следовательно, могут селективно связываться с другими молекулами в присутствии аминов. Поскольку свободные сульфгидрильные группы являются относительно реакционноспособными, белки с данными группами часто существуют с ними в окисленной форме в виде дисульфидных групп или дисульфидных связей. В таких белках для получения реакционноспособного свободного тиола требуется восстановление дисульфидных связей таким реактивом, как дитиотрейтол (DTT). Реакционноспособные в отношении тиола реактивы представляют собой реактивы, которые будут связываться с тиольными группами на полипетидах, образуя продукты, связанные тиоэфиром. Данные реактивы быстро реагируют при рН от слегка кислотного до нейтрального и, следовательно, могут селективно реагировать в присутствии аминогрупп. В литературе описано применение нескольких тиолирующих поперечно связывающих реактивов, таких как реактив Траута (2-иминотиолан), сукцинимидил(ацетилтио)ацетат (SATA) и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилтио)пропионамидо]гексаноат (сульфо-LC-SPDP), с обеспечением эффективных способов введения многочисленных сульфгидрильных групп через реакционноспособные аминогруппы. Галогенацетильные производные, например, йодацетамиды, образуют тиоэфирные связи и также представляют собой реактивы для модификации тиолов. Дополнительными полезными реактивами являются малеимиды. Реакция малеимидов с реакционноспособными в отношении тиолов реактивами является по существу такой же, как и с йодацетамидами. Малеимиды быстро реагируют при pH от слегка кислотного до нейтрального.

Другой обычной реакционноспособной группой в полипептидах и антителах являются карбоновые кислоты. Полипептиды и антитела содержат группы карбоновых кислот в С-концевом положении и в пределах боковых цепей аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Относительно низкая реакционная способность карбоновых кислот в воде обычно затрудняет применение данных групп для селективной модификации полипептидов и антител. Когда это осуществляется, группа карбоновой кислоты обычно превращается до реакционноспособного сложного эфира посредством применения водорастворимого карбодиимида и реагирует с нуклеофильным реактивом, таким как амин, гидразид или гидразин. Аминосодержащий реактив должен быть слабоосновным для того, чтобы селективно реагировать с активированной карбоновой кислотой в присутствии более сильно основных ε-аминов лизина с образованием стабильной амидной связи. Поперечное связывание белков может происходить при возрастании pH до значений выше 8,0.

Для окисления спиртовой части сахара в пределах углеводной группировки, присоединенной к антителу, до альдегида можно использовать перйодат натрия. Каждую альдегидную группу можно подвергать взаимодействию с амином, гидразидом или гидразином, как описано для карбоновых кислот. Поскольку углеводная группировка преимущественно находится на области кристаллизуемого фрагмента (Fc) антитела, конъюгирование может достигаться через сайт-направленную модификацию углевода, удаленного от антигенсвязывающего сайта. Образуется промежуточное соединение в виде основания Шиффа, которое может восстанавливаться до алкиламина через восстановление промежуточного соединения водорастворимыми восстанавливающими агентами цианоборгидридом натрия (мягкий и селективный) или боргидридом натрия (сильный).

Термин «образец» включает любое количество вещества из живого существа или того, что ранее было живым существом, но не ограничивается им. Такие живые существа включают людей, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных, но не ограничиваются ими. В одном воплощении образец получают от обезьяны, особенно яванского макака, или кролика, или мыши, или крысы, или человека. Такие вещества включают в одном воплощении цельную кровь или сыворотку от индивида, которые являются чаще всего используемыми источниками образцов в клинической практике, но не ограничиваются ими.

Термин «твердая фаза» обозначает нежидкое вещество и включает частицы (включающие микрочастицы и шарики), сделанные из таких материалов, как полимер, металл (парамагнитные, ферромагнитные частицы), стекло и кермика; гелевые вещества, такие как гели на основе диоксида кремния, оксида алюминия и полимеров; капилляры, которые могут быть сделаны из полимера, металла, стекла и/или кермики; цеолиты и другие пористые вещества; электроды; планшеты для микротитрования; твердые полоски и кюветы, пробирки или другие контейнеры для спектрометрических образцов. Компонент твердой фазы отличается от инертных твердых поверхностей тем, что «твердая фаза» содержит на ее поверхности по меньшей мере одну группировку, которая предназначена для взаимодействия с веществом в образце. Твердая фаза может представлять собой стационарный компонент, такой как такой как пробирка, полоска, кювета или планшет для микротитрования, или может представлять собой нестационарные компоненты, такие как шарики и микрочастицы. Можно использовать целый ряд микрочастиц, котрые обеспечивают либо нековалентное, либо ковалентное присоединение белков и других веществ. Такие частицы включают полимерные частицы, такие как полистирольные и поли(метилметакрилатовые); частицы золота, такие как наночастицы золота и коллоиды золота; и керамические частицы, такие как частицы из диоксида кремния, стекла и оксида металла. См., например, Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A или Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23.

В одном воплощении выявляемая метка выбирается из хромогенов (флуоресцентных или люминисцентных групп и красителей), ферментов, групп, активных в ЯМР (ядерный магнитный резонанс), частиц металлов или гаптенов, таких как дигоксигенин. Выявляемая метка также может представлять собой фотоактивируемую поперечно связывающую группу, например, азидо или азириновую группу. Хелаты металлов, которые можно выявлять электрохемилюминисценцией, в одном воплощении также являются группами, испускающими сигнал, с особым предпочтением, отдаваемым хелатам рутения, например, хелату рутений(биспиридил)₃²⁺. Подходящие рутениевые метящие группы описываются, например, в ЕР 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 и WO 92/14138.

В данном документе описывается способ определения присутствия и количества антитела к лекарству в отношении человеческого или гуманизированного лекарственного антитела с подавленной эффекторной функцией в образце, содержащем сыворотку млекопитающего, с использованием человеческого рецептора I Fc-гамма.

Термин «человеческий рецептор I Fc-гамма» обозначает белок с трансмембранным доменом SEQ ID NO: 01 (см. также запись Р12341 UniProt, FCGR1A). Человеческий рецептор I Fc-гамма также называется кластер дифференциации 64 (CD64). Он с высокой аффинностью связывается с областью Fc иммуноглобулинов-гамма. Человеческий рецептор I Fc-гамма, который опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность и клиренс иммунного комплекса, играет важную роль в иммунитете и в устойчивости к инфекциям как у человека, так и у мыши. Человеческий рецептор I Fc-гамма, используемый в иммуноанализе и способе, как описано в данном документе, может представлять собой фрагмент полноразмерного человеческого рецептора I Fc-гамма, связывающийся с областью Fc, такой как, например, в одном воплощении - только три внеклеточных домена. В одном воплощении человеческий рецептор I Fc-гамма имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01. В одном воплощении человеческий рецептор I Fc-гамма имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02. В одном предпочтительном воплощении человеческий рецептор I Fc-гамма имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03.