ПРИМЕНЕНИЕ ВАРИАНТОВ ПРОТЕАЗЫ Российский патент 2017 года по МПК C12N9/52 

Ссылка на список последовательностей

Заявка содержит список последовательностей в машиночитаемой форме. Машиночитаемая форма включена в настоящую заявку в качестве ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к применению новых вариантов субтилазы, содержащих, по сравнению с исходной субтилазой, изменения в одном или нескольких свойствах, включая характеристики мытья, термическую стабильность, стабильность при хранении или каталитическую активность. Варианты настоящего изобретения особенно подходят, например, для мытья твердых поверхностей, такого как мытье посуды. Следовательно, настоящее изобретение также относится к моющим композициям и композициям для мытья посуды, включающим композиции для автоматического мытья посуды, которые содержат варианты настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к применению композиции настоящего изобретения для удаления белковых пятен, особенно пятен от вареных яиц.

Уровень техники изобретения

В промышленности по производству моющих средств более 30 лет используют моющие композиции, содержащие ферменты. Ферменты, входящие в состав таких композиций, содержат протеазы, липазы, амилазы, целлюлазы, маннозидазы и другие ферменты, или их смеси. Наиболее важными ферментами с коммерческой точки зрения являются протеазы.

Растущее число коммерчески используемых протеаз включает рекомбинантные варианты природных протеаз дикого типа, такие как DURAZYM®, RELASE®, ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURALASE®, ESPERASE®, OVOZYME®, RELASE® и KANNASE® (Novozymes A/S), AXAPEM® (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT® (Genencor International, Inc.), MAXATASE^TM, MAXACAL^TM, MAXAPEM^TM, PROPERASE^TM, PURAFECT^TM, PURAFECT OxP^TM, FN2^TM, FN3^TM и FN4^TM (Genencor International, Inc.).

Кроме того, в данной области существуют описания ряда вариантов, например, WO 04/041979 (NOVOZYMES A/S) описывает варианты субтилазы, содержащие, по сравнению с исходной субтилазой, изменения в таких свойствах, как характеристики мытья, термическая стабильность, стабильность при хранении или каталитическая активность. Такие варианты подходят для применения в составе чистящих или моющих композиций.

Описан ряд полезных вариантов протеаз, многие из которых обладают улучшенными активностью, стабильностью и растворимостью в разных детергентах. Однако разные факторы могут дополнительно улучшить преимущества протеаз.

При мытье посуды особой проблемой является удаление белковых загрязнений, таких как яичные пятна, поэтому предпринимаются попытки разработать протеазы или варианты протеаз, эффективные против таких пятен.

Следовательно, целью настоящего изобретения является получение вариантов субтилизина, обладающих улучшенными характеристиками по сравнению с исходным ферментом.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к применению вариантов исходных субтилизинов, которые могут представлять собой субтилизины, описанные в SEQ ID NO:1. По меньшей мере одно свойство вариантов настоящего изобретения улучшено по сравнению с исходным субтилизином, который может представлять собой субтилизин, описанный в SEQ ID NO:1. В частности, варианты настоящего изобретения имеют улучшенные характеристики при мытье твердых поверхностей, таком как мытье посуды, в одном из аспектов изобретения варианты обладают повышенной способностью к удалению пятен от яиц, например, они могут более эффективно удалять вареные яйца с твердых поверхностей.

Таким образом, один из аспектов изобретения относится к применению варианта субтилизина для мытья твердых поверхностей, где вариант содержит замены 9R, 15T, 68A, 245R и 218{D,G,V} по сравнению с исходным субтилизином, причем положения соответствуют положениям зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN’].

В одном конкретном варианте осуществления замена в положении 218 представляет собой замену на D.

Другой вариант осуществления относится к применению варианта, дополнительно содержащего по меньшей мере одну из следующих модификаций: G61{D,E}, N62{D,E}, N76{D,E}; *97aG, A98{G,S}, S99G, S101G, H120{N,Q,V,D}, P131{T,S}, Q137H, A194P, A228V, A230V, N261D, для мытья твердых поверхностей.

Отдельный вариант осуществления относится к применению варианта, содержащего следующие замены: S9R, A15T, V68A, N218D и Q245R, для мытья твердых поверхностей.

В других вариантах осуществления вариант дополнительно содержит одну или несколько из следующих замен: G61E, A98S и S99G.

Таким образом, отдельный вариант осуществления относится к применению варианта, содержащего следующие замены: S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D и Q245R, для мытья твердых поверхностей.

В другом варианте осуществления исходный субтилизин представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO:1.

Другой вариант осуществления относится к применению варианта, содержащего полипептидную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO:3, для мытья твердых поверхностей.

Другой вариант осуществления относится к применению варианта, содержащего полипептидную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO:4, для мытья твердых поверхностей.

В следующем варианте осуществления одно или несколько свойств варианта улучшены по сравнению с исходным субтилизином, причем улучшенные свойства включают повышенную эффективность мытья твердых поверхностей, например, мытья посуды.

В одном аспекте изобретения варианты обладают повышенной способностью удалять яйца, например, удалять вареные яйца с твердых поверхностей.

Другой вариант осуществления относится к моющей композиции, или к композиции для мытья посуды, содержащей вариант настоящего изобретения, и к применению такой композиции для мытья твердых поверхностей, в особенности, для мытья посуды. Один из аспектов изобретения относится к применению композиции, содержащей варианты настоящего изобретения, для удаления белковых пятен, в особенности пятен от вареных яиц.

В другом варианте осуществления предлагается способ удаления белковых пятен, в особенности пятен от вареных яиц, с твердых поверхностей или с белья, где способ предусматривает приведение в контакт твердых поверхностей, содержащих пятна от яиц или белья содержащего пятна от яиц, с чистящей или моющей композицией, предпочтительно, с композицией для стирки белья, или с композицией для мытья посуды, в состав которой входит вариант субтилизина, содержащий замены 9R, 15T, 68A, 245R и 218 {D,G,V} по сравнению с исходным субтилизином, где положения соответствуют положениям зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN’].

Фигуры

На фигурах 1 и 2 показана дельта-интенсивность в двух разных детергентах при разных концентрациях савиназы и вариантов V1 (S9R, A15T, V68A, Q245R), V2 (S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, Q245R), V3 (S9R, A15T, V68A, N218D, Q245R) и V4 (S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D, Q245R).

Подробное описание изобретения

Определения

Протеолитическая активность: В настоящем описании данный термин определяют как способность к разрушению белков посредством протеолиза, который представляет собой процесс катаболизма белков путем гидролиза пептидных связей, соединяющих аминокислоты в полипептидную цепь, образующую белок. Таким образом, под действием протеаз, обладающих протеолитической активностью, белки разрушаются до аминокислот. Термины "активность протеазы" и "протеолитическая активность" используются как взаимозаменяемые. См. также приведенное ниже определение термина "протеазы".

Вариант: Термин "вариант" в настоящем описании определяют как полипептид, содержащий изменение или модификацию (модификации), такую как замена, вставка и/или делеция, одного или более (нескольких) аминокислотных остатков по одному или более (нескольким) конкретным положениям. Измененный полинуклеотид получают путем модификации полинуклеотидной последовательности, осуществляемой человеком. Варианты могут представлять собой субтилизиновые варианты, т.е. варианты субтилизина, такие как полинуклеотидная последовательность, описанная в SEQ ID NO:1, или гомологичная ей последовательность. Термины "вариант протеазы" и "вариант субтилизина" используются как взаимозаменяемые. Варианты настоящего изобретения, предпочтительно, обладают активностью протеазы, или протеолитической активностью. Термины "один или более", "один или несколько" и "по меньшей мере один" используются как взаимозаменяемые.

Модификация (модификации): Используемый в настоящем описании термин "модификация (модификации)" включает химическую модификацию субтилазы, а также генетические манипуляции с ДНК, кодирующей исходную протеазу. Модификация (модификации) может представлять собой замену (замены) аминокислотной боковой цепи (аминокислотных боковых цепей), замену (замены), делецию (делеции) и/или вставки представляющей интерес аминокислоты (представляющих интерес аминокислот).

Фермент дикого типа: Термин вариант протеазы "дикого типа" обозначает вариант протеазы, экспрессируемый природным микроорганизмом, включающим встречающиеся в природе бактерии, дрожжи или нитчатые грибы, то есть, полинуклеотид, кодирующий указанный вариант протеазы, не подвергался воздействию человека, приводящему к модификации полинуклеотидной последовательности.

Исходный фермент: Термин "исходный" вариант протеазы, например, "исходный" вариант субтилизина, в настоящем описании относится к протеазе, такой как субтилизин, которую подвергают модификации, такой как замена (замены), вставка (вставки), делеция (делеции) и/или усечение (усечения), с получением вариантов ферментов настоящего изобретения. Данный термин также относится к полипептиду, с которым сравнивают, или по отношению к которому выравнивают вариант. Исходный полипептид или вариант может представлять собой природный (дикого типа) полипептид или вариант. Например, исходный полипептид может представлять собой вариант природного полипептида, полученный путем модификации или изменения аминокислотной последовательности. Исходный полипептид также может представлять собой аллельный вариант, то есть полипептид, кодируемый любой из двух или более альтернативных форм гена, находящихся в одном хромосомальном локусе.

Выделенный вариант или полипептид: Термин "выделенный вариант" или "выделенный полипептид" в настоящем описании относится к варианту или полипептиду, выделенному из источника. В одном из аспектов чистота варианта или полипептида составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, более предпочтительно, по меньшей мере 20%, более предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90% по данным анализа SDS-PAGE.

Практически чистый вариант или полипептид: Термин "практически чистый вариант" или "практически чистый полипептид" в настоящем описании относится к препарату полипептида, который содержит максимум 10%, предпочтительно, максимум 8%, более предпочтительно, максимум 6%, более предпочтительно, максимум 5%, более предпочтительно, максимум 4%, более предпочтительно, максимум 3%, еще более предпочтительно, максимум 2%, наиболее предпочтительно, максимум 1% и, еще более предпочтительно, максимум 0,5% по массе другого полипептидного вещества, с которым он нативно связан, или в результате рекомбинирования. Следовательно, чистота практически чистого варианта или полипептида, предпочтительно, составляет по меньшей мере 92%, предпочтительно, по меньшей мере 94%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 97%, более предпочтительно, по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99,5% и, еще более предпочтительно, 100% по отношению к общей массе полипептидного вещества, присутствующего в препарате. Варианты и полипептиды настоящего изобретения, предпочтительно, существуют в практически чистой форме. Практически чистый вариант или полипептид можно получить с помощью хорошо известных рекомбинантных способов или классических методов очистки.

Зрелый полипептид: Термин "зрелый полипептид" определяют в настоящем описании как полипептид, обладающий активностью варианта протеазы, то есть, находящийся в конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как N-концевой процессинг, C-концевое укорачивание, гликозилирование, фосфорилирование и др. В одном из аспектов зрелый полипептид представляет собой полипептид с последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. С помощью сигнальной программы SignallP3.0 можно предсказать структуру зрелого полипептида.

Последовательность, кодирующая зрелый полипептид: Термин "последовательность, кодирующая зрелый полипептид" в настоящем описании относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует зрелый полипептид, обладающий активностью варианта протеазы. В одном из аспектов последовательность, кодирующая зрелый полипептид, включает нуклеотиды, кодирующие SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.

Идентичность: Родство двух аминокислотных или двух нуклеотидных последовательностей определяется параметром "идентичность".

В целях настоящего изобретения степень идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), выполняемого программой Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org), предпочтительно, в версии 3.0.0 или в более поздней версии. Используемые необязательные параметры включают штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5 и подстановочную матрицу EBLOSUM62 (EMBOSS-версия BLOSUM62). Результат Needle, обозначенный "идентичность для максимальной длины" (полученный с использованием опции -nobrief), используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные остатки×100)/(Длина выравнивания-суммарное число гэпов при выравнивании)

В целях настоящего изобретения степень идентичности двух дезоксирибонуклеотидных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), выполняемого программой Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше; http://emboss.org), предпочтительно, в версии 3.0.0 или в более поздней версии. Используемые необязательные параметры включают штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5 и подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS-версия NCBI NUC4.4). Результат Needle, обозначенный "идентичность для максимальной длины" (полученный с использованием опции -nobrief), используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные дезоксирибонуклеотиды×100)/(Длина выравнивания- суммарное число гэпов при выравнивании)

Гомологичная последовательность: Термин "гомологичная последовательность" в настоящем описании относится к полипептиду, который дает значение E (или показатель вероятности) менее 0,001 в поиске tfasty (Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219) при сравнении с вариантом протеазы CBS 100236 Micrododhium nivale.

Фрагмент полипептида: Термин "фрагмент полипептида" в настоящем описании относится к полипептиду, полученному в результате удаления одной или более (нескольких) аминокислот из амино- и/или карбокси-конца зрелого полипептида; или к гомологичной ему последовательности; где фрагмент обладает активностью варианта протеазы.

Субпоследовательность: Термин "субпоследовательность" в настоящем описании относится к полинуклеотидной последовательности, полученной в результате удаления одного или более (нескольких) нуклеотидов из 5’- и/или 3’-конца последовательности, кодирующей зрелый полипептид; или к гомологичной ей последовательности; где субпоследовательность кодирует фрагмент полипептида, обладающий активностью варианта протеазы.

Аллельный вариант: Термин "аллельный вариант" в настоящем описании относится к любой из двух или более альтернативных форм гена, находящихся в одном хромосомальном локусе. Изменение аллели, возникающее в природе в результате мутации, может приводить к образованию полиморфизма в популяциях. Мутации гена могут быть молчащими (не вызывающими изменений в кодируемом полипептиде), или они могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

Выделенный полинуклеотид: Термин "выделенный полинуклеотид" в настоящем описании относится к полинуклеотиду, выделенному из источника. В одном из аспектов чистота выделенного полинуклеотида, определенная методом электрофореза на агарозном геле, составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, более предпочтительно, по меньшей мере 20%, более предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95%.

Практически чистый полинуклеотид: Термин "практически чистый полинуклеотид" в настоящем описании относится к препарату полинуклеотида, который не содержит посторонних или нежелательных нуклеотидов и находится в виде формы, подходящей для применения в рекомбинантных системах получения полипептида. Так, практически чистый полинуклеотид содержит максимум 10%, предпочтительно, максимум 8%, более предпочтительно, максимум 6%, более предпочтительно, максимум 5%, более предпочтительно, максимум 4%, более предпочтительно, максимум 3%, еще более предпочтительно, максимум 2%, наиболее предпочтительно, максимум 1% и, еще более предпочтительно, максимум 0,5% по массе другого полинуклеотидного вещества, с которым он нативно связан, или в результате рекомбинирования. Однако практически чистый полинуклеотид может содержать встречающиеся в природе 5’- и 3’-нетранслируемые участки, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, чистота практически чистого полинуклеотида составляет по меньшей мере 90%, предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 97%, более предпочтительно, по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99,5% по массе. Полинуклеотиды настоящего изобретения, предпочтительно, существуют в практически чистой форме, т.е., в виде препарата полинуклеотида, который практически не содержит другого полинуклеотидного вещества, с которым он нативно связан, или в результате рекомбинирования. Полинуклеотиды могут иметь геномное, кДНК, РНК, полусинтетическое, синтетическое происхождение, или происхождение, представляющее собой сочетание указанных.

Кодирующая последовательность: Используемый в настоящем описании термин "кодирующая последовательность" обозначает полинуклеотид, который непосредственно отвечает за аминокислотную последовательность своего полипептидного продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается с инициирующего кодона ATG или альтернативных инициирующих кодонов, таких как GTG и TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG и TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой ДНК, кДНК, синтетический или рекомбинантный полинуклеотид.

кДНК: Термин "кДНК" в настоящем описании относится к молекуле ДНК, которую можно получить путем обратной транскрипции молекулы зрелой, образовавшейся после сплайсинга, мРНК, полученной из эукариотической клетки. кДНК не содержит последовательности интронов, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный транскрипт РНК представляет собой предшественник мРНК, который подвергается процессингу, включающему ряд стадий, с образованием зрелой сплайсированной мРНК. Указанные стадии включают удаление последовательностей интронов посредством процесса, называемого сплайсингом. Следовательно, кДНК, полученная из мРНК, не содержит последовательностей интронов.

Конструкция нуклеиновой кислоты: Термин "конструкция нуклеиновой кислоты" в настоящем описании относится к молекуле одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая представляет собой молекулу, выделенную из встречающегося в природе гена, или молекулу, полученную в результате модификации, включающей вставку сегментов нуклеиновых кислот в таком порядке, который не встречается в природе, или синтетическую молекулу. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термину "кассета экспрессии", если конструкция нуклеиновой кислоты содержит регулирующие последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности настоящего изобретения.

Регулирующие последовательности: Термин "регулирующие последовательности" в соответствии с настоящим описанием включает все компоненты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид настоящего изобретения. Каждая регулирующая последовательность может быть нативной или чужеродной по отношению к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, или регулирующие последовательности могут быть нативными или чужеродными по отношению друг к другу. Такие регулирующие последовательности включают, без ограничения, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промоторную последовательность, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, регулирующие последовательности включают промотор и сигналы завершения транскрипции и трансляции. Регулирующие последовательности можно вводить вместе с линкерами, которые обеспечивают вставку специфических участков рестрикции, облегчающих лигирование регулирующих последовательностей с участком полинуклеотида, кодирующим полипептид.

Функционально связанный: Термин "функционально связанный" в настоящем описании относится к такому расположению регулирующей последовательности относительно кодирующей полинуклеотидной последовательности, которое позволяет регулирующей последовательности управлять экспрессией последовательности, кодирующей полипептид.

Экспрессия: Термин "экспрессия" охватывает все стадии, участвующие в продукции полипептида, которые включают, без ограничения, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Вектор экспрессии: Термин "вектор экспрессии" в настоящем описании относится к линейной или циклической молекуле ДНК, содержащей полинуклеотид, который кодирует полипептид настоящего изобретения и находится в функциональной связи с другими нуклеотидами, обеспечивающими его экспрессию.

Клетка-хозяин: Термин "клетка-хозяин" в настоящем описании охватывает все типы клеток, поддающиеся трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. с использованием конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид настоящего изобретения. Термин "клетка-хозяин" включает любое потомство родительской клетки, которое не является идентичным родительской клетке вследствие мутаций, возникающих в процессе репликации.

Улучшенное свойство: Термин "улучшенное свойство" в настоящем описании относится к характеристике варианта, улучшенной по сравнению с исходным вариантом протеазы. Такие улучшенные свойства включают, без ограничения, характеристики мытья, такие как эффективность удаления пятен, например, эффективность удаления белок-содержащих загрязнений и пятен, таких как яичные пятна, стабильность, например, термостабильность, окислительная стабильность, химическая стабильность, pH-стабильность или стабильность в порошкообразных, жидких или гелеобразных моющих составах или композициях для мытья посуды. Варианты настоящего изобретения также могут иметь измененные профиль зависимости активности от температуры и pH, субстратную специфичность, специфичность к продукту. В одном из вариантов осуществления улучшенные свойства включают улучшенные характеристики мытья и улучшенную стабильность, а также сочетание улучшенных характеристик мытья посуды и улучшенной стабильности. В одном из вариантов осуществления улучшенные свойства включают повышенную эффективность стирки или мытья посуды, например, удаления белковых загрязнений, таких как яичные пятна.

Характеристики мытья: В контексте настоящего описания термин "характеристики мытья" используется для обозначения способности фермента удалять белковые или органические пятна, присутствующие на объекте, подлежащем чистке, в процессе, например, стирки или мытья твердых поверхностей. Улучшение характеристик мытья также можно количественно оценить путем расчета так называемой величины интенсивности (Int), определенной в примере 3 настоящего описания. См. также тест на характеристики стирки, приведенный в примере 3 настоящего описания. Термин характеристики стирки и характеристики мытья посуды используются как взаимозаменяемые.

Улучшенные характеристики мытья: Термин "улучшенные характеристики мытья" в настоящем описании относится к измененным характеристикам мытья варианта протеазы по сравнению с характеристиками мытья исходного варианта протеазы, например, к более эффективному удалению пятен. Термин "характеристики мытья" включает характеристики мытья при стирке, а также при мытье посуды.

Мытье твердых поверхностей: Термин включает "мытье посуды" и мытье твердых объектов, таких как типичные объекты для мытья посуды, которые включают, без ограничения, тарелки, чашки, стаканы, чаши, и столовые приборы, такие как ложки, ножи, вилки, сервантные приборы, керамические изделия, пластиковые изделия, металлические изделия, фарфоровые изделия, стеклянные изделия и акриловые изделия.

Композиция для мытья посуды: Термин "композиция для мытья посуды" относится ко всем формам композиций для мытья твердых поверхностей. Настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным типом композиций для мытья посуды или каким-либо конкретным стиральным средством.

Протеазы

Ферменты, расщепляющие амидные связи в белковых субстратах, относят к протеазам или (взаимозаменяемый термин) пептидазам (см. Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3).

Нумерация аминокислотных положений/остатков

Если не указано иначе, используемая здесь нумерация соответствует нумерации последовательности субтилазы BPN’ (BASBPN). Дополнительное описание последовательности BPN’ приведено в SEQ ID NO:2 или Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737.

Сериновые протеазы

Сериновая протеаза представляет собой фермент, который катализирует гидролиз пептидных связей и обязательно содержит остаток серина в активном центре (White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272).

Молекулярная масса бактериальных сериновых протеаз варьирует в диапазоне от 20000 до 45000 Дальтон. Их действие ингибирует диизопропилфторфосфат. Они гидролизуют простые концевые эфиры и обладают таким же действием, как и химотрипсин эукариотов, которые также представляют собой сериновую протеазу. Более узкий термин, щелочная протеаза, охватывает подгруппу сериновых протеаз, обладающих оптимальным уровнем активности при высоких значениях pH, 9,0-11,0 (обзор можно найти в Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753).

Субтилазы

Подгруппа сериновых протеаз, в предварительном варианте названных субтилазы, описана Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Данные ферменты были определены в результате анализа гомологии более 170 аминокислотных последовательностей сериновых протеаз, ранее упоминающихся как субтилизин-подобные протеазы. Ранее субтилизин определяли как сериновую протеазу, продуцируемую грамположительными бактериями или грибками, а сейчас, в соответствии с Siezen et al., относят к подгруппе субтилаз. Идентифицирован широкий ряд субтилаз и определены аминокислотные последовательности некоторых из них. Более подробное описание таких субтилаз и их аминокислотных последовательностей можно найти в Siezen et al. (1997).

Одна подгруппа субтилаз, I-S1 или "истинные" субтилизины, включает "классические" субтилизины, такие как субтилизин 168 (BSS168), субтилизин BPN’, субтилизин Carlsberg (ALCALASE®, NOVOZYMES A/S) и субтилизин DY (BSSDY).

Другая подгруппа субтилаз, I-S2 или высокощелочные субтилизины, описана Siezen et al. (выше). Подгруппа протеаз I-S2 описана как высокощелочные субтилизины и включает такие ферменты, как субтилизин PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Genencor International Inc.), субтилизин 309 (SAVINASE®, NOVOZYMES A/S), субтилизин 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVOZYMES A/S) и щелочная эластаза YaB (BSEYAB).

"SAVINASE®"

SAVINASE® поставляет NOVOZYMES A/S. Она представляет собой субтилизин 309 из B. Lentus и отличается от BAALKP только по одному положению (N87S). SAVINASE® имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Исходная субтилаза

Термин "исходная субтилаза" описывает субтилазу, определенную Siezen et al. (1991 и 1997). Другие детали описаны в приведенном выше разделе "Субтилазы". Исходная субтилаза также может представлять собой субтилазу, выделенную из природного источника, которая была подвергнута модификациям, позволяющим сохранять характеристики субтилазы. Кроме того, исходная субтилаза может представлять собой субтилазу, полученную методом перестановки в ДНК, например, как описано J.E. Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999).

Альтернативно термин "исходная субтилаза" может включать "субтилазу дикого типа".

Ниже приведена таблица сокращенных названий разных упомянутых здесь субтилаз, другие сокращенные названия можно найти в Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523.

Таблица III Организм фермент сокращенное название Бактерии: грамположительные Bacillus subtilis 168 Субтилизин I168,apr BSS168 Bacillus amyloliquefaciens Субтилизин BPN’ (NOVO) BASBPN Bacillus subtilis DY Субтилизин DY BSSDY Bacillus licheniformis Субтилизин Carlsberg BLSCAR Bacillus lentus Субтилизин 309 BLSAVI Bacillus lentus Субтилизин 147 BLS147 Bacillus alcalophilus PB92 Субтилизин PB92 BAPB92 Bacillus YaB щелочная эластаза YaB BYSYAB Bacillus sp. NKS-21 Субтилизин ALP I BSAPRQ Bacillus sp. G-825-6 субтилизин Sendai BSAPRS Thermoactinomyces vulgaris термитаза TVTHER

Модификация (модификации) субтилазы

Термин "модификация (модификации)" в соответствии с настоящим описанием включает химическую модификацию субтилазы, а также генетическую манипуляцию с ДНК, кодирующей субтилазу. Модификация (модификации) может включать замещение (замещения) аминокислотной боковой цепи (цепей), замену (замены), делецию (делеции) и/или вставку (вставки) представляющей интерес аминокислоты (аминокислот).

Вариант субтилазы

Термин "вариант" и термин "вариант субтилазы" определены выше.

Гомологичные последовательности субтилазы

В целях настоящего изобретения гомология двух аминокислотных последовательностей в данном контексте описывается параметром "идентичность", причем степень идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша, как описано выше. Помимо выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью стандартной программы можно рассчитать "процент идентичности" двух последовательностей.

На основе настоящего описания специалист в данной области может легко идентифицировать подходящие гомологичные субтилазы, которые можно модифицировать в соответствии с настоящим изобретением.

В одном из аспектов исходная протеаза содержит аминокислотную последовательность, степень идентичности которой по отношению к SEQ ID NO:1 составляет, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, или даже 100%.

Варианты, практически гомологичные исходной протеазе, могут содержать одну или более (несколько) замен, делеций и/или вставок аминокислот, в контексте настоящего изобретения термин "один или более" используется как взаимозаменяемый с термином "один или несколько". Указанные изменения, предпочтительно, являются минорными по природе, такими как описанные выше консервативные аминокислотные замены и другие замены, которые не оказывают существенного влияния на трехмерную укладку или активность белка или полипептида; небольшие делеции, как правило, примерно от одной до 30 аминокислот; и небольшие амино- или карбокси-концевые удлинения, такие как добавление амино-концевого остатка метионина, небольшого линкерного пептида длиной примерно до 20-25 остатков, или небольшое удлинение, которое облегчает очистку (аффинный маркер), такое как поли-гистидиновый участок или белок A (Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198: 3. Общее описание также можно найти в Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Хотя описанные выше изменения, предпочтительно, являются минорными по природе, они также могут быть значительными, такими как гибриды с более крупными полипептидами, содержащими до 300 аминокислот или более, существующие в виде амино- или карбокси-концевых удлинений.

Исходная протеаза может содержать или включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, обладающий протеазной активностью. В одном из аспектов исходная протеаза содержит или включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Варианты субтилазы

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что варианты, содержащие замены в определенных положениях, обладают повышенной эффективностью, особенно, в отношении белковых пятен, таких как яичные пятна.

В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что варианты, которые содержат замену на R в положении 9, замену на T в положении 15, замену на A в положении 68, замену на R в положении 245, и которые дополнительно содержат замену на D, S, G, V в положении 218, обладают значительно улучшенными характеристиками в отношении мытья твердых поверхностей, особенно, в отношении удаления белковых пятен при мытье посуды.

Таким образом, первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению варианта субтилизина для мытья твердых поверхностей, где вариант содержит замены 9R, 15T, 68A, 245R и 218 {D,G,V} по сравнению с исходным субтилизином, где положения соответствуют положениям зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN’].

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению варианта изобретения, который содержит замену на аминокислоту D в положении 218.

Другой предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению варианта настоящего изобретения, который дополнительно содержит одну или несколько из следующих модификаций: G61{D,E}, N62{D,E}, N76{D,E}; *97aG, A98{G,S}, S99G, S101G, H120{N,V,Q,D}, P131{T,S}, Q137H, A194P, A228V, A230V, N261D.

Предпочтительно, исходная субтилаза принадлежит к подгруппам I-S1 или I-S2, особенно, к подгруппе I-S2, как в случае ферментов природного или искусственного разнообразия, так и в случае конструирования и продуцирования вариантов исходной субтилазы.

При получении вариантов ферментов из подгруппы I-S1 исходную субтилазу, предпочтительно, выбирают из группы, включающей BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP), BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC (сериновая протеаза C) и BSSPRD (сериновая протеаза D), или их функциональные варианты, сохраняющие характеристические признаки подгруппы I-S1.

При получении вариантов ферментов из подгруппы I-S2 исходную субтилазу, предпочтительно, выбирают из группы, включающей BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101), BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL), BYSYAB, BAPB92, TVTHER и BSAPRS, или их функциональные варианты, сохраняющие характеристические признаки подгруппы I-S2.

В частности, исходная субтилаза представляет собой BLSAVI (Savinase®, NOVOZYMES A/S), а предпочтительный вариант субтилазы настоящего изобретения соответственно представляет собой вариант Savinase® (SEQ ID NO:1).

Соглашения по обозначению вариантов

В целях настоящего изобретения аминокислотную последовательность BPN’, описанную в SEQ ID NO:2, используют для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой протеазе, или в варианте протеазы. Аминокислотную последовательность другой протеазы или варианта протеазы выравнивают с аминокислотной последовательностью протеазы, описанной в SEQ ID NO:2, и на основании выравнивания определяют номер положения аминокислоты, соответствующего какому-либо аминокислотному остатку в аминокислотной последовательности варианта протеазы, описанной в SEQ ID NO:2.

Выравнивание полипептидных последовательностей можно осуществить, например, с помощью "ClustalW" (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., 1994, CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680). Выравнивание последовательностей ДНК можно осуществить, используя выравнивание полипептидов в качестве матрицы, заменяя аминокислоты соответствующими кодонами из последовательности ДНК.

Широко используемые алгоритмы попарного сравнения последовательностей подходят для детекции подобия полипептидных последовательностей, различие между которыми не выходит за пределы примерно 20-30% идентичности последовательностей (Doolittle, 1992, Protein Sci. 1: 191-200; Brenner et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6073-6078). Однако действительно гомологичные полипептиды с одинаковыми укладкой и биологической функцией зачастую различаются настолько, что традиционные методы сравнения последовательностей не позволяют детектировать их взаимоотношение (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615). Повышенную чувствительность поиска по последовательностям можно достичь с помощью программы, в которой используется вероятностное представление полипептидных семейств (профилей) для поиска в базах данных. Например, программа PSI-BLAST генерирует профили на протяжении повторяющегося процесса поиска в базе данных и позволяет детектировать незначительную гомологию (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Еще большую чувствительность можно достичь, если семейство или суперсемейство представляющего интерес полипептида имеет один или более (несколько) представителей в базах данных по структуре белка. Такие программы как GenTHREADER (Jones 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) используют информацию из ряда источников (PSI-BLAST, прогнозирование вторичной структуры, профили структурного выравнивания и потенциалы сольватации) в качестве входных данных для нейронной сети с целью предсказания структурной укладки запрашиваемой последовательности. Подобным образом, способ Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, можно использовать для выравнивания последовательности неизвестной структуры с моделями суперсемейства, присутствующими в базе данных SCOP. Указанные выравнивания, в свою очередь, можно использовать для генерирования моделей гомологии представляющего интерес полипептида, правильность которых можно оценить с помощью ряда инструментов, разработанных для этой цели.

Для поиска и генерирования структурных выравниваний белков известной структуры существует несколько инструментов и источников. Например, суперсемейства белков из базы данных SCOP подвергают структурному выравниванию и полученные результаты помещают в открытом доступе с разрешением скачивания. Две белковые структуры или более можно выравнивать с помощью ряда алгоритмов, таких как дистанционная матрица выравнивания (Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96) или комбинаторное удлинение (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747), а результаты выполнения указанных алгоритмов можно дополнительно использовать для запрашивания структурных баз данных по представляющей интерес структуре, чтобы выявить возможные структурные гомологи (например, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567). Указанные структурные выравнивания можно использовать для предсказания структурно- и функционально-подобных аминокислотных остатков в белках, относящихся к одному структурному суперсемейству. Данную информацию, наряду с информацией, полученной в результате моделирования гомологии и профильного поиска, можно использовать для предсказания остатков, которые будут мутировать при переносе представляющих интерес мутаций от одного белка на близкий или отдаленный гомологу.

При описании разных вариантов протеаз настоящего изобретения для простоты используют указанную ниже терминологию. Во всех случаях используют принятые IUPAC однобуквенные или трехбуквенные обозначения аминокислот.

При описании разных вариантов фермента субтилазы, получаемых по способу настоящего изобретения, или предлагаемых настоящим изобретением, нижеследующие термины и соглашения адаптируют для простоты применения:

Систему обозначения вначале определяют путем выравнивания выделенного или исходного фермента с субтилизином BPN’ (BASBPN) SEQ ID NO:2, как описано выше.

Варианты исходной протеазы

Замены

Замену аминокислоты обозначают следующим образом: исходная аминокислота, положение, заменяющая аминокислота. Соответственно, замену треонина на аланин в положении 226 обозначают как "Thr226Ala" или "T226A". Несколько мутаций можно разделить дополнительными знаками ("+"), например, "Gly205Arg + Ser411Phe" или "G205R + S411F", что означает присутствие мутаций в положениях 205 и 411, включая замену глицина (G) на аргинин (R), и серина (S) на фенилаланин (F) соответственно. Альтернативно несколько мутаций можно разделить пробелом, например, G205R S411F, или запятой (,), например, G205R, S411F.

Делеции

Делецию аминокислоты обозначают следующим образом: исходная аминокислота, положение*. Соответственно, делецию глицина в положении 195 обозначают как "Gly195*" или "G195*". Несколько делеций можно разделить, как и в случае замен, например, запятой (,) "Gly195*, Ser411*" или "G195*, S411*".

Вставки

Вставку аминокислоты обозначают следующим образом: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, новая вставленная аминокислота. Соответственно, вставку лизина после глицина в положении 195 обозначают "Gly195GlyLys", или "G195GK", или "*195aK". Вставку нескольких аминокислот обозначают как [исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, новая вставленная аминокислота #1, новая вставленная аминокислота #2; и т.д.]. Например, вставку лизина и аланина после глицина в положении 195 обозначают "Gly195GlyLysAla" или "G195GKA".

В таких случаях вставленный аминокислотный остаток (остатки) нумеруют путем добавления букв нижнего регистра к номеру положения аминокислотного остатка, предшествующего вставленному аминокислотному остатку (остаткам). Таким образом, в вышеуказанном примере последовательности могут содержать:

Исходная Вариант 195 195 195a 195b G G - K - A

Исходный вариант протеазы можно получить из любого подходящего источника, такого как микробный источник, например, грибки, включающие нитчатые грибки или дрожжи, или искусственная последовательность, полученная с использованием известной информации о нуклеотидной или аминокислотной последовательности.

Такие штаммы можно легко получить из общедоступных коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH (DSM) и Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS).

В одном из аспектов настоящего изобретения исходный субтилизин представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов настоящего изобретения исходная протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или даже 100%.

В одном из аспектов настоящего изобретения варианты содержат аминокислотную последовательность, которая отличается от SEQ ID NO:1 на тридцать аминокислот, двадцать девять аминокислот, двадцать восемь аминокислот, двадцать семь аминокислот, двадцать шесть аминокислот, двадцать пять аминокислот, двадцать четыре аминокислоты, двадцать три аминокислоты, двадцать две аминокислоты, двадцать одну аминокислоту, двадцать аминокислот, девятнадцать аминокислот, восемнадцать аминокислот, семнадцать аминокислот, шестнадцать аминокислот, пятнадцать аминокислот, четырнадцать аминокислот, тринадцать аминокислот, двенадцать аминокислот, одиннадцать аминокислот, десять аминокислот, девять аминокислот, восемь аминокислот, семь аминокислот, шесть аминокислот, пять аминокислот, четыре аминокислоты, три аминокислоты, две аминокислоты или на одну аминокислоту.

В конкретном аспекте изобретения варианты настоящего изобретения содержат аминокислотную последовательность, которая отличается от SEQ ID NO:1 на двенадцать аминокислот, более предпочтительно, на одиннадцать аминокислот, более предпочтительно, на десять аминокислот, более предпочтительно, на девять аминокислот, более предпочтительно, на восемь аминокислот, более предпочтительно, на семь аминокислот или, еще более предпочтительно, на шесть аминокислот и, наиболее предпочтительно, на пять аминокислот.

В другом аспекте исходная протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или даже 100%, и которая обладает активностью протеазы.

В одном из аспектов число аминокислотных изменений в вариантах настоящего изобретения по сравнению с исходным вариантом (например, с исходным вариантом протеазы, имеющим аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:1) содержит или включает 20 изменений, 19 изменений, 18 изменений, 17 изменений, 16 изменений, 15 изменений, 14 изменений, 13 изменений, 12 изменений, 11 изменений, 10 изменений, 9 изменений, 8 изменений, 7 изменений, 6 изменений, 5 изменений, 4 изменения, более предпочтительно, 3 изменения, еще более предпочтительно, 2 изменения и, наиболее предпочтительно, 1 изменение. В другом аспекте число аминокислотных изменений в вариантах настоящего изобретения включает, предпочтительно, 20 изменений, 19 изменений, 18 изменений, 17 изменений, 16 изменений, 15 изменений, 14 изменений, 13 изменений, 12 изменений, 11 изменений, 10 изменений, 9 изменений, 8 изменений, 7 изменений, 6 изменений, 5 изменений, 4 изменения, 3 изменения, 2 изменения или 1 изменение.

В одном из аспектов число аминокислотных изменений в вариантах настоящего изобретения по сравнению с исходным вариантом (например, с исходным вариантом протеазы, имеющим аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:1) содержит или включает 20 замен, 19 замен, 18 замен, 17 замен, 16 замен, 15 замен, 14 замен, 13 замен, 12 замен, 11 замен, 10 замен, 9 замен, 8 замен, 7 замен, 6 замен, 5 замен, 4 замены, более предпочтительно, 3 замены, еще более предпочтительно, 2 замены и, наиболее предпочтительно, 1 замену. В другом аспекте число аминокислотных замен в вариантах настоящего изобретения включает 20 замен, 19 замен, 18 замен, 17 замен, 16 замен, 15 замен, 14 замен, 13 замен, 12 замен, 11 замен, 10 замен, 9 замен, 8 замен, 7 замен, 6 замен, 5 замен, 4 замены, 3 замены, 2 замены или 1 замену.

В одном из аспектов вариант содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или даже 100%.

В одном из аспектов вариант содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или даже 100%, и которая обладает активностью протеазы.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению варианта, который может содержать или включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, обладающий активностью варианта протеазы. В одном из аспектов вариант содержит или включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению варианта, который может содержать или включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или ее аллельный вариант, для мытья твердых поверхностей. Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу удаления белковых пятен, в особенности, пятен от вареных яиц, с твердых поверхностей, или с белья для стирки, где способ предусматривает приведение в контакт твердых поверхностей, содержащих яичные пятна, или белья для стирки, содержащего яичные пятна, с моющей или стиральной композицией, предпочтительно, со стиральной композицией или композицией для мытья посуды, содержащей вариант субтилизина, который может содержать или включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или ее аллельный вариант.

В одном из аспектов вариант содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или даже 100%.

В одном из аспектов вариант содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или даже 100%, и которая обладает активностью протеазы.

В одном аспекте варианты содержат аминокислотную последовательность, которая отличается от SEQ ID NO:3 на тридцать аминокислот, двадцать девять аминокислот, двадцать восемь аминокислот, двадцать семь аминокислот, двадцать шесть аминокислот, двадцать пять аминокислот, двадцать четыре аминокислоты, двадцать три аминокислоты, двадцать две аминокислоты, двадцать одну аминокислоту, двадцать аминокислот, девятнадцать аминокислот, восемнадцать аминокислот, семнадцать аминокислот, шестнадцать аминокислот, пятнадцать аминокислот, четырнадцать аминокислот, тринадцать аминокислот, двенадцать аминокислот, одиннадцать аминокислот, десять аминокислот, девять аминокислот, восемь аминокислот, семь аминокислот, шесть аминокислот, пять аминокислот, четыре аминокислоты, три аминокислоты, две аминокислоты, или на одну аминокислоту.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению варианта, который может содержать или включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, обладающий активностью варианта протеазы. В одном из аспектов вариант содержит или включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению варианта, который может содержать или включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или ее аллельный вариант, для мытья твердых поверхностей. Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу удаления белковых пятен, в особенности пятен от вареных яиц, с твердых поверхностей, или с белья для стирки, где способ предусматривает приведение в контакт твердых поверхностей, содержащих яичные пятна, или белья для стирки, содержащего яичные пятна, с моющей или стиральной композицией, предпочтительно, со стиральной композицией или композицией для мытья посуды, содержащей вариант субтилизина, который может содержать или включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или ее аллельный вариант.

В одном из аспектов вариант содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или даже 100%.

В одном из аспектов вариант содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или даже 100%, и которая обладает активностью протеазы.

В одном из аспектов варианты содержат аминокислотную последовательность, которая отличается от SEQ ID NO:4 на тридцать аминокислот, двадцать девять аминокислот, двадцать восемь аминокислот, двадцать семь аминокислот, двадцать шесть аминокислот, двадцать пять аминокислот, двадцать четыре аминокислоты, двадцать три аминокислоты, двадцать две аминокислоты, двадцать одну аминокислоту, двадцать аминокислот, девятнадцать аминокислот, восемнадцать аминокислот, семнадцать аминокислот, шестнадцать аминокислот, пятнадцать аминокислот, четырнадцать аминокислот, тринадцать аминокислот, двенадцать аминокислот, одиннадцать аминокислот, десять аминокислот, девять аминокислот, восемь аминокислот, семь аминокислот, шесть аминокислот, пять аминокислот, четыре аминокислоты, три аминокислоты, две аминокислоты или на одну аминокислоту.

Практически гомологичные варианты могут содержать одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок. Указанные изменения, предпочтительно, являются минорными по природе, такими как описанные выше консервативные аминокислотные замены и другие замены, которые не оказывают существенного влияния на трехмерную укладку или активность белка или полипептида; небольшие делеции, как правило, примерно от одной до 30 аминокислот; и небольшие амино- или карбокси-концевые удлинения, такие как добавление амино-концевого остатка метионина, небольшого линкерного пептида длиной примерно до 20-25 остатков, или небольшое удлинение, которое облегчает очистку (аффинный маркер), такое как поли-гистидиновый участок или белок A (Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198: 3. Общее описание также можно найти в Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Хотя описанные выше изменения, предпочтительно, являются минорными по природе, они также могут быть значительными, такими как гибриды с более крупными полипептидами, содержащими до 300 аминокислот или более, существующие в виде амино- или карбокси-концевых удлинений.

Получение вариантов

Варианты исходных вариантов протеаз можно получить с помощью любого известного в данной области способа мутагенеза, такого как сайт-направленный мутагенез, конструирование синтетического гена, конструирование полусинтетического гена, неспецифический мутагенез, перетасовка и др.

Сайт-направленный мутагенез представляет собой способ, включающий получение одной или нескольких мутаций в определенном участке полинуклеотидной молекулы, кодирующей исходный вариант протеазы. Этот способ можно проводить in vitro или in vivo.

Конструирование синтетического гена включает in vitro синтез спроектированной полинуклеотидной молекулы, кодирующей представляющую интерес полипептидную молекулу. Синтез гена можно проводить с помощью ряда способов, таких как технология с использованием сложного микрочипа, описанная Tian, et. al., (Tian, et. al., Nature 432:1050-1054), и подобные способы, в которых синтез и сборку олигонуклеотидов проводят на фото-программируемых жидкостных микрочипах.

Сайт-направленный мутагенез можно проводить in vitro способом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих желательную мутацию. Сайт-направленный мутагенез также можно проводить in vitro способом кассетного мутагенеза, включающим расщепление плазмиды под действием рестриктазы по участку, содержащему полинуклеотид, кодирующий исходный вариант протеазы, и последующее лигирование в полинуклеотид олигонуклеотида, содержащего мутацию. Обычно фермент рестрикции, расщепляющий плазмиду, выбирают в соответствии с используемым олигонуклеотидом, чтобы полученные липкие концы плазмиды можно было лигировать с вставляемой последовательностью. См., например, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949- 4955; and Barton et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 7349-4966.

Сайт-направленный мутагенез можно проводить in vivo с помощью известных в данной области способов. См., например, публикацию патентной заявки США 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnology 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; and Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

В настоящем изобретении можно использовать любой способ сайт-направленного мутагенеза. Существует много коммерческих наборов, подходящих для получения вариантов исходного варианта протеазы.

С помощью известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или перетасовки можно осуществить и тестировать одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок, после чего можно провести подходящую процедуру скрининга, такую как описанная Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; или WO 95/22625. Другие подходящие способы включают ПЦР пониженной точности, метод фагового дисплея (например, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; Патент США № 5223409; WO 92/06204) и мутагенез, направленный на конкретный участок (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

Способы мутагенеза/перетасовки можно объединять со способами автоматизированного и обладающего большой пропускной способностью скрининга, которые позволяют детектировать активность клонированных мутантных полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами. Мутантные молекулы ДНК, кодирующие активные полипептиды, можно извлечь из клеток-хозяев и быстро секвенировать с помощью стандартных способов, используемых в данной области. Указанные способы позволяют быстро определить значение отдельных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде.

Полусинтетическое конструирование гена проводят путем объединения процедур синтетического конструирования гена и/или сайт-направленного мутагенеза, и/или неспецифического мутагенеза, и/или перетасовки. Типичным примером полусинтетического конструирования является процесс, в котором синтезированные полинуклеотидные фрагменты используются в сочетании с методами ПЦР. Таким образом, некоторые участки генов могут быть получены в результате синтеза de novo, а другие участки могут быть получены путем амплификации с использованием праймеров, обеспечивающих сайт-направленный мутагенез, притом, что отдельные участки можно получить путем амплификации методом ПЦР пониженной точности или методом ПЦР, не приводящим к генерированию ошибок. Затем полинуклеотидные фрагменты можно подвергнуть перетасовке.

Варианты и применение вариантов

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению варианта субтилизина для мытья твердых поверхностей, где вариант содержит замены 9R, 15T, 68A, 245R и 218{D,G,V} по сравнению с исходным субтилизином, и где положения соответствуют положениям зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN’].

Неожиданно было обнаружено, что мутации, присутствующие в некоторых вариантах протеазы, могут значительно улучшать характеристики мытья посуды, а также характеристики стирки белья, по сравнению с исходной протеазой. Так, настоящее изобретение предлагает вариант протеазы с характеристиками, значительно улучшенными по сравнению с исходной протеазой. В частности, варианты настоящего изобретения имеют улучшенные характеристики мытья твердых поверхностей, такого как мытье посуды, в одном из аспектов изобретения варианты обладают повышенной способностью к удалению пятен от яиц, таких как пятен от вареных яиц с твердых поверхностей.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, на R, K или H. В другом аспекте вариант содержит R в качестве замены в положении, соответствующем положению 9. В другом аспекте вариант содержит замену S9R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15 на G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит T в качестве замены в положении, соответствующем положению 15. В другом аспекте вариант содержит замену A15T по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 61. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 61, на E или D. В другом аспекте вариант содержит E в качестве замены в положении, соответствующем положению 61. В другом аспекте вариант содержит замену G61E по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 62. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 62, на E или D. В другом аспекте вариант содержит D в качестве замены в положении, соответствующем положению 62. В другом аспекте вариант содержит замену N62D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 68. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 68, на G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит A в качестве замены в положении, соответствующем положению 68. В другом аспекте вариант содержит замену V68A по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 76. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 76, на E или D. В другом аспекте вариант содержит D в качестве замены в положении, соответствующем положению 76. В другом аспекте вариант содержит замену N76D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит вставку в положении, соответствующем положению 97. В другом аспекте вариант содержит вставку G в положении, соответствующем положению 97. В другом аспекте вариант содержит вставку *97aG по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 98. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 98, на G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит S в качестве замены в положении, соответствующем положению 98. В другом аспекте вариант содержит замену A98S по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 99. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 99, на G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 99, на G. В другом аспекте вариант содержит замену S99G по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 101. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 101, на G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 101, на G. В другом аспекте вариант содержит замену S101G по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 120. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 120, на Q, V, N, E или D. В другом аспекте вариант содержит D в качестве замены в положении, соответствующем положению 120. В другом аспекте вариант содержит замену H120D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 120. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 120, на Q, N, E или D. В другом аспекте вариант содержит N в качестве замены в положении, соответствующем положению 120. В другом аспекте вариант содержит замену H120N по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 120. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 120, на Q, V, N, E или D. В другом аспекте вариант содержит V в качестве замены в положении, соответствующем положению 120. В другом аспекте вариант содержит замену H120V по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 120. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 120, на Q, N, E или D. В другом аспекте вариант содержит Q в качестве замены в положении, соответствующем положению 120. В другом аспекте вариант содержит замену H120Q по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 131. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 131, на T или S. В другом аспекте вариант содержит S в качестве замены в положении, соответствующем положению 131. В другом аспекте вариант содержит замену P131S по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 137. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 137, на R, K или H. В другом аспекте вариант содержит H в качестве замены в положении, соответствующем положению 137. В другом аспекте вариант содержит замену Q137H по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 194. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 194, на P. В другом аспекте вариант содержит замену A194P по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 218. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 218, на E, D, L, I, V, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит V в качестве замены в положении, соответствующем положению 218. В другом аспекте вариант содержит замену N218D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 228. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 228, на L, I или V. В другом аспекте вариант содержит V в качестве замены в положении, соответствующем положению 228. В другом аспекте вариант содержит замену A228V по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 230. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 230, на L, I или V. В другом аспекте вариант содержит V в качестве замены в положении, соответствующем положению 230. В другом аспекте вариант содержит замену A230V по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 245, на R, K или H. В другом аспекте вариант содержит R в качестве замены в положении, соответствующем положению 245. В другом аспекте вариант содержит замену Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 261. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 261, на E или D. В другом аспекте вариант содержит D в качестве замены в положении, соответствующем положению 261. В другом аспекте вариант содержит замену N261D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 15. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 15, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R и T в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9 и 15, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R и A15T по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 68. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 68, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R и A в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9 и 68, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R и V68A по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 218. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 218, на R, K, H, E, D, L, I, V, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9 и 218, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R и N218D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 245, на R, K или H. В другом аспекте вариант содержит R в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 9 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15 и 68. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15 и 68, на G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит T и A в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 15 и 68, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены A15T и V68A по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15 и 218. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15 и 218, на E, D, L, I, V, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит T и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 15 и 218, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены A15T и N218D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15 и 245, на G, A, S, T, R, K или H. В другом аспекте вариант содержит T и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 15 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены A15T и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 68 и 218. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 68 и 218, на E, D, L, I, V, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит A и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 68 и 218, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены V68A и N218D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 68 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 68 и 245, на G, A, S, T, R, K или H. В другом аспекте вариант содержит A и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 68 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены V68A и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 218 и 245, на E, D, R, K, H. В другом аспекте вариант содержит D и R в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 61. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 61, на R, K, H, G, A, S, T, M, D или E. В другом аспекте вариант содержит R, T и E в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 61, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и G61E по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 62. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 62, на R, K, H, G, A, S, T, M, D или E. В другом аспекте вариант содержит R, T и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 62, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и N62D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 68. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 68, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и A в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 68, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, V68A по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 76. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 76, на R, K, H, G, A, S, T, M, D или E. В другом аспекте вариант содержит R, T и D в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 76, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и N76D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит модификацию в положении, соответствующем положению 9, 15 и 97. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9 и 15, на R, K, H, G, A, S, T или M, и вставку в положении, соответствующем положению 97. В другом аспекте вариант содержит R и T в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9 и 15, соответственно, и вставку G в положении 97. В другом аспекте вариант содержит модификации S9R, A15T и *97aG по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 98. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 98, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и S в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 98, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и A98S по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 99. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 99, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и G в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 99, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и S99G по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 120. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 120, на R, K, H, G, A, S, T, N, Q, V, D, E или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 120, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и H120D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 120. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 120, на R, K, H, G, A, S, T, N, Q, V, D, E или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и N в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 120, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и H120N по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 120. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 120, на R, K, H, G, A, S, T, N, Q, V, D, E или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и V в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 120, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и H120V по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 120. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 120, на R, K, H, G, A, S, T, N, Q, V, D, E или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и Q в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 120, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и H120Q по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 131. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 131, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и {S,T} в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 131, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и P131{S,T} по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 137. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 137, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и H в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 137, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и Q137H по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 194. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 194, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и P в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 194, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и A194P по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 218. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 218, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 218, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, N218D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 228. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 228, на R, K, H, G, A, S, T, L, I, V или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и V в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 228, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и A228V по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 230. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 230, на R, K, H, G, A, S, T, L, I, V или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и V в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 230, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и A230V по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 245, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 261. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15 и 261, на R, K, H, G, A, S, T, D, E или M. В другом аспекте вариант содержит R, T и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15 и 261, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T и N261D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15, 68 и 218. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15, 68 и 218, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит T, A и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 15, 68 и 218, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены A15T, V68A и N218D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15, 68 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15, 68 и 245, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит T, A и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 15, 68 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены A15T, V68A и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 68, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 68, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит A, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 68, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены V68A, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68 и 218. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68 и 218, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, A и D в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 68 и 218, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, V68A и N218D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68 и 245, на R, K, H, G, A, S, T или M. В другом аспекте вариант содержит R, T, A и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 68 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, V68A и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15, 68, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 15, 68, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит T, A, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 15, 68, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены A15T, V68A, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, A, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 68, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 120, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 120, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, N, L, I, V, Q, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, A, Q, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 68, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, H120Q, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 120, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 120, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, N, L, I, V, Q, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, A, V, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 68, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, H120V, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 120, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 120, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, N, L, I, V, Q, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, A, N, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 68, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, H120N, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 76, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 68, 76, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, A, D, D и R в качестве замены в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 68, 76, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, H76D, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 61, 68, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 61 68, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, E, A, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 61, 68, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, G61E, V68A, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 61, 68, 98 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 61, 68, 98, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, E, A, S, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 61, 68, 98, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 61, 68, 98, 99, 218 и 245. В другом аспекте вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 9, 15, 61, 68, 98, 99, 218 и 245, на R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E или D. В другом аспекте вариант содержит R, T, E, A, S, G, D и R в качестве замен в положениях, соответствующих положениям 9, 15, 61, 68, 98, 99, 218 и 245, соответственно. В другом аспекте вариант содержит замены S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D и Q245R по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:1.

В других вариантах осуществления описанный в настоящем описании вариант субтилазы, предпочтительно, объединяют с одной или несколькими модификациями, которые могут присутствовать в следующих положениях:

27, 36, 56, 87, 95, 96, 100, 102, 103, 104, 123, 159, 167, 170, 206, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 и 274.

А именно, нижеследующие модификации BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK и BAALKP считаются подходящими для сочетания:

K27R, *36D, S56P, S87N, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, S106A, N123S, G159D, Y167A, R170S, R170L, N204D, V205I, Q206E, L217D, M222S, M222A, T224S, A232V, K235L, Q236H, N248D, N252K и T274A.

Кроме того, полезные варианты, содержащие одну из модификаций S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I, S99D+S101R+S103A+V104I+G160S, S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V199M+V205I+L217D, S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D, S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V205I или N76D+V104A, или другие сочетания модификаций K27R, *36D, S56P, S87N, G97N, S99SE, S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, S106A, N123S, G159D, Y167A, R170S, R170L, N204D, V205I, Q206E, L217D, M222S, M222A, T224S, A232V, K235L, Q236H, N248D, N252K и T274A, наряду с одной или несколькими из указанных выше модификаций, обладают улучшенными свойствами.

В отдельном аспекте вариант содержит модификацию в положении, соответствующем одному или нескольким из следующих положений: 61{D,E}, 62{D,E}, 76{D,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{N,D}, 131{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:3.

В отдельном аспекте вариант содержит модификацию в положении, соответствующем одному или нескольким из следующих положений: 61{D,E}, 62{D,E}, 76{D,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{N,D}, 131{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D по сравнению с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:4.

Кроме того, варианты субтилазы основного аспекта (аспектов) изобретения, предпочтительно, объединяют с одной или несколькими модификациями в любом из положений 61, 62, 76, 97, 98, 99, 101, 120, 131, 137, 194, 228, 230 и 261, предпочтительно, такими как модификации 61{D,E}, 62{D,E}, 76{D,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{D,N,V,Q}, 131{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D. Еще более предпочтительно, такими как 61E, 62D, 76D, *97aG, 98S, 99G, 101G, 120D, 131T, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D. Любая из указанных модификаций предположительно обеспечивает более высокий уровень экспрессии варианта субтилазы в способе его получения.

В настоящем изобретении в отношении мытья твердых поверхностей особое внимание уделяется применению варианта, который содержит следующие замены: S9R, A15T, V68A, N218D и Q245R.

В настоящем изобретении в отношении мытья твердых поверхностей особое внимание уделяется применению варианта, который содержит следующие замены: S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D и Q245R.

В одном из аспектов изобретение относится к применению вариантов настоящего изобретения, которые по сравнению с исходным субтилизином имеют одну или несколько улучшенных характеристик, включая улучшенные характеристики мытья твердых поверхностей, такого как мытье посуды. В одном из аспектов изобретения варианты обладают повышенной способностью к удалению яичных загрязнений, такой как повышенная способность к удалению вареных яиц с твердых поверхностей.

Белковые пятна, такие как яичные пятна, в особенности, пятна от вареного яичного желтка, очень трудно удалять. Поэтому варианты изобретения обладают улучшенными характеристиками в отношении белковых пятен, таких как яичные пятна, в особенности, улучшенными характеристиками в отношении вареного яичного желтка по сравнению с исходной протеазой и даже по сравнению с подобным вариантом субтилизина.

Один из аспектов изобретения относится к применению варианта, содержащего замены S9R, A15T, V68A, Q245R и N218{D, S, G, V}, для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка.

Отдельный аспект изобретения относится к применению варианта, содержащего замены S9R, A15T, V68A, N218D и Q245R, для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка.

Один из аспектов изобретения относится к применению варианта для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка, где вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, Q245R и N218D, и где вариант дополнительно содержит замену G61E.

Один из аспектов изобретения относится к применению варианта для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка, где вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, Q245R и N218D, и где вариант дополнительно содержит замену A98S.

Один из аспектов изобретения относится к применению варианта для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка, где вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, Q245R и N218D, и где вариант дополнительно содержит замену S99G.

Один из аспектов изобретения относится к применению варианта для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка, где вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, Q245R и N218D, и где вариант дополнительно содержит замену H120N.

Один из аспектов изобретения относится к применению варианта для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка, где вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, Q245R и N218D, и где вариант дополнительно содержит замену H120Q.

Один из аспектов изобретения относится к применению варианта для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка, где вариант содержит замены S9R, A15T, V68A, Q245R и N218D, и где вариант дополнительно содержит замену H120V.

Другой аспект изобретения относится к применению варианта для мытья посуды, предпочтительно, для удаления вареного яичного желтка, где вариант содержит замены S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D и Q245R.

Один из аспектов изобретения относится к композиции для мытья посуды, содержащей вариант настоящего изобретения. В другом аспекте композиция дополнительно содержит один другой фермент, выбранный из группы, включающей липазу, амилазу и целлюлазу.

Таким образом, один из аспектов изобретения относится к применению таких композиций для мытья твердых поверхностей, в особенности, для мытья посуды. Так, примером конкретного применения композиции настоящего изобретения является применение композиции, содержащей варианты изобретения, для мытья посуды.

Другой аспект относится к применению композиции настоящего изобретения для удаления белковых пятен, в особенности пятен от вареных яиц.

Следовательно, изобретение дополнительно включает композиции, содержащие варианты настоящего изобретения, такие как композиции для мытья посуды, содержащие вариант настоящего изобретения.

Один из аспектов изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, V68A, N218{D, S, G, V} и Q245R.

Один из аспектов изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, V68A, N76D, N218{D, S, G, V} и Q245R.

Один важный аспект изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, V68A, N76D, N218D и Q245R.

Другой аспект изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, V68A, H120D, N218D и 245R.

Один из аспектов изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, V68A, H120N, N218D и 245R.

Другой аспект изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, V68A, H120V, N218D и 245R.

Один из аспектов изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, V68A, H120Q, N218D и 245R.

Отдельный аспект изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, V68A, N218D и Q245R.

Другой аспект изобретения относится к композиции для мытья посуды, в состав которой входит вариант, содержащий замены S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D и Q245R.

Композиции для мытья посуды настоящего изобретения можно использовать для удаления белковых пятен, таких как пятна от вареного яичного желтка.

Соответственно, настоящее изобретение также предлагает способ удаления белковых пятен, в особенности, пятен от вареных яиц, с твердых поверхностей или с белья для стирки, где способ предусматривает приведение в контакт твердых поверхностей, содержащих яичные пятна, или белья, содержащего яичные пятна, с чистящей или моющей композицией, предпочтительно, с композицией стирального средства или с композицией для мытья посуды настоящего изобретения.

Кроме того, заслуживают внимания следующие варианты:

S9R,V68A,S99G,Q245R,N261D S9R,A15T,*97aG,P131S,Q137H S9R,A15T,V68A,Q245R S9R,A15T,H120N,P131T,N218D S9R,A15T,V68A,H120N,N218D,Q245R S9R,A15T,V68A,S99G,Q245R,N261D S9R,A15T,G61E,V68A,A98S,S99G,Q245R S9R,A15T,V68A,H120D,P131S,Q137H,Q245R S9R,A15T,V68A,S99G,A194P,Q245R,N261D S9R,A15T,V68A,S99G,A228V,Q245R,N261D S9R,A15T,V68A,N76D,S99G,Q245R,N261D S9R,A15T,*97aG,S101G,P131S,Q137H S9R,A15T,*97aG,P131S,Q137H, N218D S9R,A15T,S101G,H120N,P131T,N218D S9R,A15T,V68A,S101G,Q245R S9R,A15T,V68A,N218S,Q245R

S9R,A15T,V68A,N218D,Q245R S9R,A15T,V68A,N218G,Q245R S9R,A15T,V68A,N218V,Q245R S9R,A15T,V68A,N76D,Q245R S9R,A15T,V68A,Q245R,N261D S9R,A15T,N62D,*97aG,P131S,Q137H S9R,A15T,N62D,V68A,Q245R S9R,A15T,V68A,A194P,Q245R S9R,A15T,V68A,A228V,Q245R S9R,A15T,V68A,A230V,Q245R S9R,A15T,G61E,V68A,A98S,S99G,N218D,Q245R S9R,A15T,G61E,N76D,V68A,A98S,S99G,Q245R S9R,A15T,V68A,S99G,A194P,N218D,Q245R,N261D S9R,A15T,V68A,S99G,N218D,A228V,Q245R,N261D S9R,V68A,S99G,N218G,Q245R,N261D S9R,V68A,S99G,N218V,Q245R,N261D S9R,A15T,V68A,S99G,A194P,N218S,Q245R,N261D S9R,A15T,V68A,S99G,A194P,N218G,Q245R,N261D S9R,A15T,V68A,S99G,A194P,N218V,Q245R,N261D S9R,A15T,V68A,H120V,N218D,Q245R S9R,A15T,V68A,H120Q,N218D,Q245R S9R,A15T,V68A,N76D,N218D,Q245R

Настоящее изобретение предлагает вариант протеазы с существенно улучшенными характеристиками по сравнению с исходной протеазой.

Характеристики мытья выбранного варианта изобретения можно тестировать с помощью теста характеристик мытья, раскрытого в примере 3 настоящего описания. Тест характеристик мытья можно использовать для анализа способности варианта, входящего в состав стандартной или коммерческой моющей композиции, удалять белковые пятна с твердых поверхностей по сравнению со стандартной системой, а именно, с исходной субтилазой или подобной субтилазой, обладающей даже лучшими характеристиками мытья (входящей в состав такой же детергентной системы и тестируемой в таких же условиях). Варианты ферментов настоящего изобретения тестируют с помощью автоматического анализа механического усилия (AMSA). С помощью теста характеристик мытья AMSA можно быстро анализировать большое число фермент-содержащих детергентных растворов маленького объема. С помощью данного теста проводят первичный анализ характеристик мытья выбранного варианта и если в этом тесте выбранный вариант не демонстрирует значительного улучшения по сравнению с исходной субтилазой, как правило, дополнительное тестирование не проводят.

Следовательно, варианты, которые с точки зрения описанных здесь целей вызывают особый интерес, представляют собой такие варианты, которые при тестировании в составе коммерческой детергентной композиции, такой как европейское средство для мытья посуды, средство для мытья посуды США, азиатское стиральное средство, европейское стиральное средство или латиноамериканское стиральное средство, отдельные примеры которых описаны в тесте характеристик мытья (пример 3), демонстрируют улучшенные характеристики мытья по сравнению с исходной субтилазой, тестируемой в идентичных условиях.

Очевидно, предпочтительный вариант изобретения удовлетворяет вышеуказанным критериям по меньшей мере на низшем указанном уровне, более предпочтительно, на высшем указанном уровне.

Конструкции нуклеиновой кислоты

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант протеазы настоящего изобретения, функционально связанный с одной или несколькими регулирующими последовательностями, которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, соответствующих регулирующей последовательности.

Выделенный полинуклеотид, кодирующий вариант протеазы настоящего изобретения, можно подвергнуть разным манипуляциям, обеспечивающим экспрессию варианта. Проведение манипуляции с полинуклеотидом перед вставкой в вектор может быть желательным или необходимым в зависимости от вектора экспрессии. Способы модификации полинуклеотидов с использованием способов рекомбинирования ДНК хорошо известны в данной области.

Регулирующая последовательность может представлять собой подходящую промоторную последовательность, которая распознается клеткой-хозяином и обеспечивает экспрессию полинуклеотида. Промоторная последовательность содержит регулирующие транскрипцию последовательности, которые опосредуют экспрессию варианта протеазы. Промотор может представлять собой любую нуклеотидную последовательность, которая обладает транскрипционной активностью в выбранной клетке-хозяине и включает мутантные, укороченные и гибридные промоторы, которые можно получить из гомологичных или гетерологичных по отношению к клетке-хозяину генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды.

Примеры промоторов, подходящих для управления транскрипцией конструкций нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, в особенности, в бактериальной клетке-хозяине, включают промоторы, полученные из оперона E. coli lac, гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансукразы Bacillus subtilis (sacB), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенной амилаза Bacillus stearothermophilus (amyM), гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), генов xylA и xylB Bacillus subtilis и прокариотического гена бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), а также промотор tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Другие промоторы описаны в "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; и в Sambrook et al., 1989, выше.

Примеры подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в клетках хозяевах, представляющих собой клетки нитчатых грибов, включают промоторы, полученные из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, кислотоустойчивой альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori (glaA), липазы Rhizomucor miehei, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, ацетамидазы Aspergillus nidulans, амилоглюкозидазы Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), трипсин-подобной протеазы Fusarium oxysporum (WO 96/00787), бета-глюкозидазы Trichoderma reesei, целлобиогидролазы I Trichoderma reesei, целлобиогидролазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы I Trichoderma reesei, эндоглюканазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы III Trichoderma reesei, эндоглюканазы IV Trichoderma reesei, эндоглюканазы V Trichoderma reesei, ксиланазы I Trichoderma reesei, ксиланазы II Trichoderma reesei, бета-ксилозидазы Trichoderma reesei, и промотор NA2-tpi (гибрид промоторов генов нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae); а также мутантные, укороченные и гибридные формы указанных промоторов.

Промоторы, используемые в дрожжевом хозяине получают из генов энолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), триозофосфатизомеразы Saccharomyces cerevisiae (TPI), металлотионеина Saccharomyces cerevisiae (CUP1) и 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae. Другие промоторы, подходящие для дрожжевых клеток-хозяев, описаны Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

Регулирующая последовательность также может представлять собой подходящую последовательность-терминатор транскрипции, которая распознается клеткой-хозяином и служит для терминации транскрипции. Терминаторная последовательность функционально связана с 3’-концом полинуклеотида, кодирующего вариант протеазы. В настоящем изобретении можно использовать любой терминатор, способный функционировать в выбранной клетке-хозяине.

Терминаторы, предпочтительные для клеток-хозяев, представляющих собой нитчатые грибы, получают из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger и трипсин-подобной протеазы Fusarium oxysporum.

Терминаторы, предпочтительные для дрожжевых клеток-хозяев, получают из генов энолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома C (CYC1) Saccharomyces cerevisiae и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae. Другие подходящие для дрожжевых клеток-хозяев терминаторы описаны Romanos et al., 1992, выше.

Регулирующая последовательность также может представлять собой подходящую лидерную последовательность, нетранслируемый участок мРНК, необходимый для трансляции в клетке-хозяине. Лидерная последовательность находится в функциональной связи с 5’-концом полинуклеотида, кодирующего вариант варианта протеазы. В настоящем изобретении можно использовать любую лидерную последовательность, способную функционировать в выбранной клетке-хозяине.

Лидерные последовательности, предпочтительные для клеток-хозяев, представляющих собой нитчатые грибы, получают из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans.

Лидерные последовательности, предпочтительные для дрожжевых клеток-хозяев, получают из генов энолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

Регулирующая последовательность также может представлять собой последовательность полиаденилирования, то есть последовательность, которая находится в функциональной связи с 3’-концом полипептид-кодирующей последовательности и в процессе транскрипции распознается клеткой-хозяином как сигнал к добавлению полиаденозина к транскрибируемой мРНК. В настоящем изобретении можно использовать любую последовательность полиаденилирования, способную функционировать в выбранной клетке-хозяине.

Последовательности полиаденилирования, предпочтительные для клеток-хозяев, представляющих собой нитчатые грибы, получают из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, трипсин-подобной протеазы Fusarium oxysporum и альфа-глюкозидазы Aspergillus niger.

Последовательности полиаденилирования, подходящие для дрожжевых клеток-хозяев, описаны Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

Регулирующая последовательность также может представлять собой участок, кодирующий сигнальный пептид, то есть участок, который кодирует аминокислотную последовательность, связанную с амино-концом варианта варианта протеазы и способную направлять кодируемый полипептид в секреторный путь клетки. 5’-Конец кодирующей последовательности полинуклеотида может наследственно содержать участок, кодирующий сигнальный пептид, который в природе связан в рамке трансляционного считывания с сегментом участка, кодирующего секретируемый вариант варианта протеазы. Альтернативно 5’-конец кодирующей последовательности может содержать участок, кодирующий сигнальный пептид, который является чужеродным по отношению к кодирующей последовательности. Чужеродный участок, кодирующий сигнальный пептид, может быть необходим в тех случаях, когда кодирующая последовательность по природе не содержит участок, кодирующий сигнальный пептид. Альтернативно чужеродный участок, кодирующий сигнальный пептид, можно использовать просто для замены природного участка, кодирующего сигнальный пептид, с целью повышения секреции варианта варианта протеазы. Однако в настоящем изобретении можно использовать любой участок, кодирующий сигнальный пептид, который способен направить экспрессируемый полипептид в секреторный путь выбранной клетки-хозяина.

В клетках-хозяевах, представляющих собой клетки нитчатых грибов, можно эффективно использовать последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, полученные из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae, нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, аспартильной протеиназы Rhizomucor miehei, целлюлазы Humicola insolens, эндоглюканазы V Humicola insolens и липазы Humicola lanuginosa.

Для дрожжевых клеток-хозяев используют последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые получают из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae. Другие последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, описаны в Romanos et al., 1992, выше.

Регулирующая последовательность также может представлять собой пропептид-кодирующий участок, который кодирует аминокислотную последовательность, расположенную на амино-конце варианта варианта протеазы. Образующийся в результате полипептид также известен как профермент или прополипептид (или зимоген в некоторых случаях). Прополипептид обычно является неактивным и может превращаться в зрелый активный полипептид в результате каталитического или аутокаталитического отщепления пропептида от прополипептида. Пропептид-кодирующий участок можно получить из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и лакказы Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Если на амино-конце полипептида присутствует как участок сигнального пептида, так и участок пропептида, участок пропептида располагают за амино-концом полипептида, а участок сигнального пептида располагают за амино-концом пропептидного участка.

Иногда также желательно добавлять регуляторные последовательности, которые обеспечивают регуляцию экспрессии варианта варианта протеазы относительно роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных систем являются системы, которые индуцируют экспрессию гена, подлежащего включению или выключению в ответ на химический или физический стимул, включающий присутствие регуляторного соединения. Регуляторные системы в прокариотических организмах включают операторные системы lac, tac и trp. В дрожжах можно использовать систему ADH2 или систему GAL1. В нитчатых грибах в качестве регуляторных последовательностей можно использовать промотор альфа-амилазы TAKA, промотор глюкоамилазы Aspergillus niger и промотор глюкоамилазы Aspergillus oryzae. Другими примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, обеспечивающие амплификацию гена. Регуляторные последовательности, подходящие для эукариотических систем, включают ген дигидрофолатредуктазы, который амплифицируется в присутствии метотрексата, и гены металлотионеина, которые амплифицируются в присутствии тяжелых металлов. В указанных случаях полинуклеотид, кодирующий вариант варианта протеазы, может находиться в функциональной связи с регуляторной последовательностью.

Векторы экспрессии

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, которые содержат полинуклеотид, кодирующий вариант варианта протеазы настоящего изобретения, промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Разные описанные выше нуклеотидные и регулирующие последовательности можно соединить с получением рекомбинантного вектора экспрессии, который может содержать один или более (несколько) подходящих участков рестрикции, обеспечивающих вставку или замену полинуклеотида, кодирующего вариант. Альтернативно экспрессию полинуклеотида можно обеспечить путем вставки полинуклеотида или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, в подходящий вектор экспрессии. При конструировании вектора экспрессии кодирующую последовательность располагают в векторе так, чтобы она находилась в функциональной связи с подходящей последовательностью, регулирующей экспрессию.

Рекомбинантный вектор экспрессии может представлять собой любой вектор (такой как плазмида или вирус), подходящий для применения в рекомбинантных технологиях ДНК и способный обеспечивать экспрессию полинуклеотида. Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую вводят вектор. В качестве векторов можно использовать линейные или замкнутые циклические плазмиды.

Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует вне хромосомы и реплицируется независимо от репликации хромосом, такой как плазмида, внехромосомный элемент, минихромосома или искусственная хромосома. Вектор может содержать любые средства, обеспечивающие саморепликацию. Альтернативно, вектор может представлять собой конструкцию, которая после введения в клетку-хозяина интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой (хромосомами), в которую она встроена. Кроме того, можно использовать один вектор или одну плазмиду, или два (две) или более векторов или плазмид, которые вместе содержат общую ДНК, подлежащую введению в геном клетки-хозяина или транспозон.

Векторы настоящего изобретения, предпочтительно, содержат один или более (несколько) селектируемых маркеров, которые обеспечивают простой отбор трансформированных, трансфицированных, трансдуцированных или подобных клеток. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам, вирусам или тяжелым металлам, или введение которого приводит к образованию ауксотрофов и т.п.

Маркеры, подходящие для дрожжевых клеток-хозяев, включают ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Селектируемые маркеры, подходящие для применения в клетках-хозяевах, представляющих собой клетки нитчатых грибов, включают, без ограничения, amdS (ацетамидаза), argB (орнитинкарбамоилтрансфераза), bar (фосфинотрицинацетилтрансфераза), hph (гигромицинфосфотрансфераза), niaD (нитратредуктаза), pyrG (оротидин-5’-фосфатдекарбоксилаза), sC (сульфатаденилтрансфераза) и trpC (антранилатсинтаза), а также их эквиваленты. В клетках Aspergillus, предпочтительно, использовать гены amdS и pyrG Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae и ген bar Streptomyces hygroscopicus.

Векторы настоящего изобретения, предпочтительно, содержат элемент (элементы), который обеспечивает либо интеграцию вектора в геном клетки-хозяина, либо автономную репликацию вектора в клетке, независимо от генома.

В состав вектора, предназначенного для интеграции в геном клетки-хозяина, может входить полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, или любой другой элемент вектора для интеграции в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации. Альтернативно вектор может содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, управляющие интеграцией в точное положение (положения) хромосомы (хромосом) генома клетки-хозяина путем гомологичной рекомбинации. Чтобы повысить вероятность интеграции в точное положение, интеграционные элементы, предпочтительно, должны содержать достаточное число нуклеиновых кислот, например, 100-10000 пар оснований, предпочтительно, 400-10000 пар оснований и, наиболее предпочтительно, 800-10000 пар оснований, которые должны обладать высокой степенью идентичности соответствующей последовательности-мишени, чтобы повысить вероятность гомологичной рекомбинации. Интеграционные элементы могут иметь любую последовательность, гомологичную последовательности-мишени, присутствующей в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интеграционные элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие нуклеотидные последовательности. С другой стороны, вектор может интегрироваться в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации.

Вектор, предназначенный для автономной репликации, может дополнительно содержать участок начала репликации, обеспечивающий автономную репликацию вектора в выбранной клетке-хозяине. Участок начала репликации может представлять собой любой плазмидный репликатор, опосредующий автономную репликацию и способный функционировать в клетке. Термин "участок начала репликации" или "плазмидный репликатор" в настоящем документе определяют как нуклеотидную последовательность, обеспечивающую репликацию плазмиды или вектора in vivo.

Примеры участков начала репликации, подходящих для применения в дрожжевых клетках-хозяевах, включают участки начала репликации размером 2 микрона, ARS1, ARS4, сочетание ARS1 и CEN3 и сочетание ARS4 и CEN6.

Примеры участков начала репликации, подходящих для применения в клетках нитчатых грибов, включают AMA1 и ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Выделение гена AMA1 и конструирование плазмид или векторов, содержащих этот ген, можно проводить по способам, раскрытым в WO 00/24883.

Чтобы увеличить продукцию варианта протеазы, в клетку-хозяина можно ввести несколько копий полинуклеотида настоящего изобретения. Увеличение числа копий полинуклеотида можно достичь путем интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина, или путем введения вместе с полинуклеотидом амплифицируемого селектируемого маркерного гена, при этом клетки, содержащие амплифицированные копии селектируемого маркерного гена и, следовательно, дополнительные копии полинуклеотида, можно отбирать путем культивирования клеток в присутствии подходящего селектируемого средства.

Способы лигирования описанных выше элементов с получением рекомбинантных векторов экспрессии настоящего изобретения (см., например, Sambrook et al., 1989, выше), позволяющих получать практически чистые варианты вариантов протеазы, хорошо известны специалистам в данной области.

Клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант варианта протеазы, которые, предпочтительно, используют в рекомбинантных способах получения варианта. Вектор, содержащий полинуклеотид настоящего изобретения, вводят в клетку-хозяина так, чтобы вектор существовал в виде элемента, интегрированного в хромосому, или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано выше. Выбор клетки-хозяина в большой степени зависит от гена, кодирующего полипептид, и его источника.

Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, подходящую для рекомбинатного получения варианта варианта протеазы. Клетка-хозяин также может представлять собой эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего, насекомого, растения или гриба.

В одном аспекте клетка-хозяин представляет собой клетку гриба. "Гриб" в соответствии с настоящим описанием включает типы Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota и Zygomycota (как описано Hawksworth et al., In Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), а также Oomycota (описанные Hawksworth et al., 1995, выше, page 171) и все грибы, образующие митоспоры (Hawksworth et al., 1995, supra).

В другом аспекте грибковая клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. "Дрожжи" в соответствии с настоящим описанием включают аскоспорогенные дрожжи (Endomycetales), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Поскольку классификация дрожжей может изменяться со временем, в целях настоящего изобретения дрожжи определяют в соответствии с описанием, приведенным в Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

В другом аспекте дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia.

В другом аспекте дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis. В другом аспекте дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Kluyveromyces lactis. В другом аспекте дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Yarrowia lipolytica.

В другом аспекте грибковая клетка-хозяин представляет собой клетку нитчатого гриба. "Нитчатые грибы" включают все нитчатые формы подгрупп Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth et al., 1995, выше). Нитчатые грибы обычно характеризуются наличием мицелиальной стенки, состоящей из хитина, целлюлозы, гликана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит за счет удлинения гифов, а углеродный катаболизм является облигатно аэробным. И наоборот, вегетативный рост дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae, происходит путем почкования одноклеточного таллома, а углеродный катаболизм может быть ферментативным.

В другом аспекте клетка-хозяин нитчатого гриба представляет собой клетку Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes или Trichoderma.

В другом аспекте клетка-хозяин нитчатого гриба представляет собой клетку Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae. В другом аспекте клетка-хозяин нитчатого гриба представляет собой клетку Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides или Fusarium venenatum. В другом аспекте клетка-хозяин нитчатого гриба представляет собой клетку Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

Клетки грибов можно трансформировать с помощью способа, включающего образование протопласта, трансформацию протопласта и регенерацию клеточной стенки с помощью способа, известного как таковой. Подходящие способы трансформации клеток-хозяев Aspergillus и Trichoderma описаны в EP 238023 и Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Подходящие способы трансформации видов Fusarium описаны в Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 и WO 96/00787. Дрожжи можно трансформировать с помощью способов, описанных Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; и Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Способ получения варианта субтилазы

Настоящее изобретение предлагает способ получения выделенного фермента настоящего изобретения, где подходящую клетку-хозяина, трансформированную последовательностью ДНК, кодирующей фермент, культивируют в условиях, обеспечивающих получение фермента, с последующим извлечением полученного фермента из культуры.

Трансформация гетерологичной клетки-хозяина вектором экспрессии, который содержит последовательность ДНК, кодирующую фермент, обеспечивает гетерологичную рекомбинантную продукцию фермента настоящего изобретения. Указанный способ позволяет получить высокоочищенную композицию субтилазы, которая не содержит гомологичных примесей.

Среда, используемая для культивирования трансформированных клеток-хозяев, может представлять собой любую традиционную среду, подходящую для выращивания желательных клеток-хозяев. Экспрессированная субтилаза, предпочтительно, секретируется в культуральную среду, из которой ее можно извлечь с помощью хорошо известных способов, включая отделение клеток от среды путем центрифугирования или фильтрации, осаждение белковых компонентов среды солью, такой как сульфат аммония, с последующим применением хроматографических способов, таких как ионообменная хроматография, аффинная хроматография или т.п.

МОЮЩИЕ И СТИРАЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ

К стиральной композиции можно добавить фермент настоящего изобретения, который становится ее компонентом. Вообще чистящие и стиральные композиции широко описаны в данной области, например, подробное описание чистящих и стиральных композиций можно найти в WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011.

Стиральная композиция настоящего изобретения может быть получена, например, в виде композиции для ручной или машинной стирки, включающей композицию, содержащую стиральную добавку, подходящую для предварительной обработки тканей с пятнами, и композицию, содержащую ополаскиватель для смягчения ткани, или в виде моющей композиции для мытья любых хозяйственных твердых поверхностей, или для ручного или машинного мытья посуды.

В отдельном аспекте изобретение предлагает моющую добавку, содержащую фермент настоящего изобретения. Моющая добавка, как и моющая композиция, может содержать один или несколько других ферментов, таких как протеаза, липаза, кутиназа, амилаза, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, оксидаза, например, лакказа и/или пероксидаза.

Как правило, свойства используемого фермента (ферментов) (такие как оптимальное значение pH, совместимость с другими ферментными и неферментными ингредиентами и др.) должны быть совместимыми с выбранным детергентом, и фермент (ферменты) должен присутствовать в эффективном количестве.

Протеазы: Подходящие протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения. Микробное происхождение является предпочтительным. Протеазы включают химически модифицированные или рекомбинантные мутанты. Протеаза может представлять собой сериновую протеазу или металлопротеазу, предпочтительно, щелочную микробную протеазу или трипсин-подобную протеазу. Примерами щелочной протеазы являются субтилизины, в особенности, полученные из Bacillus, например, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168 (описанные в WO 89/06279). Примерами трипсин-подобной протеазы являются трипсин (например, свиной или бычий) и протеаза Fusarium, описанные в WO 89/06270 и WO 94/25583.

Примеры подходящих протеаз включают варианты, описанные в WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 и WO 98/34946, особенно варианты, содержащие замену в одном или нескольких из следующих положений: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 и 274. Предпочтительные коммерчески доступные протеазные ферменты включают Durazym®, Relase®, Alcalase®, Savinase®, Primase®, Duralase®, Esperase®, Ovozyme® и Kannase® (Novozymes A/S), Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect, Purafect OxP, FN2, FN3 и FN4^TM (Genencor International, Inc.).

Липазы: Подходящие липазы включают липазы бактериального или грибкового происхождения. Липазы также включают химически модифицированные или рекомбинантные белки. Примеры подходящих липаз включают липазы из Humicola (синоним Thermomyces), например, из H. lanuginosa (T. lanuginosus), описанные в EP 258068 и EP 305216, или из H. insolens, описанные в WO 96/13580, липазы Pseudomonas, например, из P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1372034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. штамм SD 705 (WO 95/06720 и WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), липазы Bacillus, например, из B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) или B. pumilus (WO 91/16422).

Другими примерами являются варианты липаз, например, описанные в WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 и WO 97/07202.

Предпочтительные коммерчески доступные липазные ферменты включают Lipex®, Lipolase® и Lipolase Ultra® (Novozymes A/S).

Амилазы: Подходящие амилазы (α и/или β) включают амилазы бактериального или грибкового происхождения. Амилазы также включают химически модифицированные или рекомбинантные белки. Амилазы включают, например, α-амилазы, полученные из Bacillus, например, из отдельного штамма B. licheniformis, описанного более подробно в GB 1296839.

Примерами подходящих амилаз являются варианты, описанные в WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 и WO 97/43424, в особенности варианты, содержащие замену в одном или нескольких из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 и 444.

Коммерчески доступные амилазы включают Duramyl®, Termamyl®, Fungamyl® и BAN® (Novozymes A/S), Rapidase^TM и Purastar^TM (от Genencor International Inc.).

Целлюлазы: Подходящие целлюлазы включают целлюлазы бактериального или грибкового происхождения. Целлюлазы также включают химически модифицированные или рекомбинантные мутанты. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы родов Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, например, грибковые целлюлазы, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, описанные в US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 и WO 89/09259.

Особенно подходящие целлюлазы включают щелочные или нейтральные целлюлазы, способные сохранять цвет. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Другими примерами являются варианты целлюлаз, например, описанные в WO 94/07998, EP 0531315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 и PCT/DK98/00299.

Коммерчески доступные целлюлазы включают Celluzyme®, и Carezyme® (Novozymes A/S), Clazinase^TM, Puradax HA^TM (Genencor International Inc.) и KAC-500(B)^TM (Kao Corporation).

Пероксидазы/Оксидазы: Подходящие пероксидазы/оксидазы включают ферменты растительного, бактериального или грибкового происхождения. Указанные ферменты включают химически модифицированные или рекомбинантные мутанты. Примерами подходящих пероксидаз являются пероксидазы Coprinus, например, из C. cinereus, и их варианты, например, описанные в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257. Коммерчески доступные пероксидазы включают Guardzyme® (Novozymes A/S).

Детергентный фермент (ферменты) можно ввести в состав моющей композиции путем добавления отдельных добавок, содержащих один или несколько ферментов, или путем добавления комбинированной добавки, содержащей все указанные ферменты. Детергентная добавка настоящего изобретения, т.е. отдельная добавка или комбинированная добавка, может быть получена, например, в виде гранул, жидкости, взвеси и т.п. Предпочтительные композиции детергентных добавок находятся в виде гранул, в особенности, непылящих гранул, жидкостей, в особенности, стабилизированных жидкостей, или взвесей.

Непылящие гранулы, которые можно получить, например, по способу, описанному в US 4106991 и 4661452, необязательно, могут иметь покрытие, нанесенное с помощью известных в данной области способов. Примеры восковых материалов для покрытия включают поли(этиленоксидные) продукты (полиэтиленгликоль, ПЭГ) со средней молекулярной массой 1000-20000; этоксилированные полифенолы, содержащие 16-50 этиленоксидных элементов; этоксилированные жирные спирты, в состав которых входит спирт, содержащий 12-20 атомов углерода, и 15-80 этиленоксидных элементов; жирные спирты; жирные кислоты; и моно-, ди- и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих материалов для покрытия, подходящих для нанесения методом псевдоожиженного слоя, приведены в GB 1483591. Жидкие ферментные препараты можно, например, стабилизировать путем добавления полиола, такого как пропиленгликоль, сахара или сахарного спирта, молочной или борной кислоты в соответствии с традиционными способами. Защищенные ферменты можно получить по способу, описанному в EP 238216.

Моющая композиция настоящего изобретения может находиться в виде любой подходящей формы, такой как брикет, таблетка, порошок, гранула, паста, жидкость, гранулярная или порошкообразная универсальная форма или моющее средство "повышенной эффективности", в особенности, стиральное средство; жидкость, гелеобразное или пастообразное универсальное моющее средство, в особенности, относящееся к так называемому высокоэффективному жидкому типу; жидкое средство для стирки деликатных тканей; средство для мытья посуды вручную или средство для мытья посуды в легком режиме, в особенности, средство с высоким пенообразованием; средство для посудомоечных машин, в том числе разные таблетки, гранулы, жидкости и ополаскиватели для применения дома и в учреждениях. Композиции также могут находиться в упаковках, содержащих одну дозу средства, включая известные в данной области, водорастворимые, не растворимые в воде и/или водопроницаемые. Жидкое моющее средство может быть водным, которое обычно содержит до 70% воды и 0-30% органического растворителя, или неводным.

Моющая композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, отбеливатели, активаторы отбеливания, катализаторы отбеливания, красители, усилители отбеливания, хелатирующие средства, средства, переносящие краситель, средства от накипи, диспергирующие средства, дополнительные ферменты, стабилизаторы ферментов, каталитические вещества, активаторы отбеливания, пероксид водорода, источники пероксида водорода, оптические отбеливатели, фотоактиваторы, флуоресцирующие вещества, кондиционеры для тканей, предварительно полученные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для удаления глинистой почвы/средства против повторного отложения, соли-наполнители, гидротропные вещества, блескообразователи, средства, подавляющие образование пены, структурные эластификаторы, мягчители тканей, гидролизуемые поверхностно-активные вещества, консерванты, антиоксиданты, средства против усадки, гермициды, фунгициды, антикоррозийные средства, антикоррозийные средства, источники щелочности, солюбилизирующие средства, носители, технологические добавки, пигменты, красители, отдушки, средства, регулирующие pH, другие ферменты, системы, стабилизирующие ферменты.

Так, моющая композиция содержит одно или несколько поверхностно-активных веществ, которые могут представлять собой неионные, в том числе полуполярные, и/или анионные, и/или катионные, и/или цвиттер-ионные, и/или амфолитические и/или полуполярные неионные, и/или их смеси. Поверхностно-активные вещества обычно присутствуют на уровне, составляющем 0,1%-60% по массе, хотя в альтернативных вариантах осуществления уровень составляет примерно 1-50 процентов, а в других вариантах осуществления уровень составляет примерно 5-40 процентов по отношению к массе моющей композиции.

Как правило, моющее средство содержит примерно от 1% до 40% анионного поверхностно-активного вещества, такого как линейный алкилбензолсульфонат, альфа-олефинсульфонат, алкилсульфат (сульфат жирного спирта), этоксисульфат спирта, вторичный алкансульфонат, метиловый эфир жирной альфа-сульфокислоты, алкил- или алкенилянтарная кислота или омыляющее вещество.

Другие подходящие анионные поверхностно-активные вещества представляют собой омыляющие вещества и вещества, содержащие сульфатные или сульфонатные группы. Также рассматриваются поверхностно-активные вещества сульфонатного типа, которые включают (C9-C13-алкил)бензолсульфонаты и олефинсульфонаты, где последние представляют собой смеси алкенсульфонатов, гидроксиалкансульфонатов и -дисульфонатов, полученных, например, путем сульфонирования C12-C18 моноолефинов, содержащих двойную связь на конце или в середине молекулы. Также можно использовать (C12-C18)алкансульфонаты и эфиры жирных альфа-сульфокислот (сложноэфирные сульфонаты), например, альфа-сульфонированные метиловые эфиры гидрированных жирных кислот кокоса, ядра кокосового ореха или таллового жира, альфа-сульфокарбоновые кислоты, полученные в результате омыления MES.

Другие подходящие анионные поверхностно-активные вещества представляют собой эфиры сульфонированных жирных кислот и глицерина, содержащие сложные моно-, ди- и три-эфиры и их смеси.

Алк(ен)илсульфаты, которым отдается предпочтение, включают соли щелочных металлов и натриевые соли моноэфиров серной кислоты и C12-C18 жирных спиртов, таких как кокосовый жирный спирт, талловый жирный спирт, лауриловый, миристиловый, цетиловый или стеариловый спирт, или C10-C20 оксоспиртов и моноэфиров серной кислоты и вторичных спиртов с указанной длиной цепи. С точки зрения технологии мытья особое предпочтение отдается C12-C16 алкилсульфатам и C12-C15 алкилсульфатам, а также C14-C15 алкилсульфатам. Подходящие анионные поверхностно-активные вещества также включают алкан-2,3-диилбис(сульфаты), которые получают, например, по способу, описанному в US3234258 или US5075041.

Также можно использовать моноэфиры серной кислоты и линейных или разветвленных C7-C21 спиртов, этоксилированных с использованием 1-6 молей этиленоксида, такие как 2-метил-разветвленные C9-C11 спирты, содержащие, в среднем, 3,5 молей этиленоксида (EO) или C12-C18 жирные спирты, содержащие 1-4 EO. Вследствие высокой способности к пенообразованию они обычно присутствуют в моющих и чистящих композициях на относительно низких уровнях, например, на уровнях, составляющих 1%-5% по массе.

Анионные поверхностно-активные вещества также могут включать диэфиры и/или соли моноэфиров сульфоянтарной кислоты и остатков жирных спиртов C8-C18 или их смеси. Особое предпочтение отдается сульфосукцинатам, которые содержат остатки жирных спиртов с узким распределением длин цепей. Подобным образом, можно использовать алк(ен)илсульфосукцинаты, алк(ен)ильная цепь которых содержит, предпочтительно, 8-18 атомов C, или их соли.

Другие подходящие анионные поверхностно-активные вещества представляют собой жирнокислотные производные аминокислот, например, метилтаурина (тауриды) и/или метилглицина (саркозиды). Другие подходящие анионные поверхностно-активные вещества включают омыляющие вещества. Можно использовать омыляющие вещества на основе насыщенных жирных кислот, такие как соли лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, гидрированной эруковой кислоты и бегеновой кислоты, а также смеси омыляющих веществ, полученных из природных жирных кислот, например, из жирных кислот кокоса, ядра кокосового ореха или таллового жира. Анионные поверхностно-активные вещества, включающие омыляющие вещества, могут присутствовать в виде натриевых, калиевых или аммониевых солей и в виде растворимых солей органических оснований, таких как моно-, ди- или триэтаноламин. Анионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в виде натриевых или калиевых солей. В качестве неионных поверхностно-активных веществ, предпочтительно, используют алкоксилированные, преимущественно этоксилированные и/или пропоксилированные, главным образом, первичные спирты, содержащие 8-18 атомов C и, в среднем, 1-12 молей этиленоксида (EO) и/или 1-10 молей пропиленоксида (PO) на моль спирта. Особое предпочтение отдается алкоксилатам C8-C16 спиртов, предпочтительно, этоксилированным и/или пропоксилированным алкоксилатам C10-C15 спиртов, особенно алкоксилатам C12-C14 спиртов, имеющих степень этоксилирования 2-10, или 3-8, и/или степень пропоксилированием 1-6, или 1,5-5. Остаток спирта, предпочтительно, является линейным или, особенно в положении 2, метил-разветвленным, или он может представлять собой смесь линейных и метил-разветвленных цепей, как правило, присутствующую в оксо-спиртах. Однако особое предпочтение отдается этоксилатам спиртов, полученных из линейных спиртов природного происхождения, которые содержат 12-18 атомов C, таких как жирные кокосовый, пальмовый и талловый спирты, или олеиловый спирт, и в среднем 2-8 EO на моль спирта. Этоксилированные спирты включают, например, C12-C14 спирты, содержащие 3 EO или 4 EO, C9-C11 спирты, содержащие 7 EO, C13-C15 спирты, содержащие 3 EO, 5 EO, 7 EO или 8 EO, C12-18 спирты, содержащие 3 EO, 5 EO или 7 EO, их смеси, такие как смесь C12-C14 спирта, содержащего 3 EO и C12-C18 спирта, содержащего 5 EO. Указанные степени этоксилирования и пропоксилирования являются статистическими средними значениями, которые для конкретного продукта могут представлять собой целое или дробное число. Предпочтительные этоксилаты и пропоксилаты спиртов характеризуются ограниченным распределением гомологов (острый диапазон этоксилатов/пропоксилатов, NRE/NRP). Помимо указанных неионных поверхностно-активных веществ также можно использовать этоксилаты жирных спиртов, содержащих более 12 EO. Их примеры включают этоксилат талового жирного спирта, содержащий 14 EO, 25 EO, 30 EO или 40 EO.

Также можно использовать алкоксилированные амины, которые включают этоксилированные и/или пропоксилированные, главным образом первичные и вторичные амины, содержащие 1-18 атомов C в алкильной цепи, и в среднем 1-12 молей этиленоксида (EO) и/или 1-10 молей пропиленоксида (PO) на моль амина.

Кроме того, в качестве других неионных поверхностно-активных веществ также можно использовать алкилполигликозиды общей формулы R₁O(G)_x, где R₁ обозначает, в первую очередь, линейную или метил-разветвленную (особенно метил-разветвленную по 2 положению) алкильную группу, содержащую 8-22, предпочтительно, 12-18 атомов C, а символ ‘G’ обозначает гликозидный остаток (моносахарид), содержащий 5 или 6 атомов C; предпочтительно, G обозначает глюкозу. Степень олигомеризации x, которая обозначает среднее число гликозидных остатков, как правило, составляет 1-10; x предпочтительно находится в диапазоне 1,2-1,4.

Другой класс подходящих неионных поверхностно-активных веществ, которые можно использовать либо в виде отдельных неионных поверхностно-активных веществ, либо в сочетании с другими неионными поверхностно-активными веществами, включает алкильные эфиры алкоксилированных, предпочтительно, этоксилированных и пропоксилированных жирных кислот, содержащие 1-4 атомов C в алкильной цепи, в особенности, метильные эфиры жирных кислот, описанные, например, в JP58/217598.

Также можно использовать неионные поверхностно-активные вещества, представляющие собой аминоксиды, например, N-(кокосовый-алкил)-N,N-диметиламиноксид и N-(талловый-алкил)-N,N-бис(2-гидроксиэтил)аминоксид, и алканоламиды жирных кислот или алканоламиды этоксилированных жирных кислот.

В более предпочтительном варианте осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой додецилсульфат натрия, соединения четвертичного аммония, иодиды алкилпиридиния, твин 80, твин 85, тритон X-100, Brij 56, биологические поверхностно-активные вещества, рамнолипид, сурфактин, вискозин или сульфонаты.

Как правило, моющее средство может содержать примерно от 0,2% до 40% неионного поверхностно-активного вещества, такого как этоксилат спирта, этоксилат нонилфенола, алкилполигликозид, алкилдиметиламиноксид, моноэтаноламид этоксилированной жирной кислоты, моноэтаноламид жирной кислоты, амид полигидроксиалкилжирной кислоты или N-ацил N-алкильные производные глюкозамина ("глюкамиды").

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу, где концентрация по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества составляет 0-500, 0,00001-100, 0,0001-50, 0,0001-40, 0,001-30, 0,01-20, 0,1-15, 1-10 миллиграмм на грамм ткани.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу, где концентрация по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества составляет 0-50, 0,0001-40, 0,001-30, 0,01-20, 0,1-10, или 1-5 г на л раствора.

Моющее средство может содержать 0-65% моющего компонента или комплексообразующего вещества, такого как цеолит, дифосфат, трифосфат, фосфонат, карбонат, цитрат, нитрилотриуксусная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота, диэтилентриаминпентауксусная кислота, алкил- или алкенилянтарная кислота, растворимые силикаты или слоистые силикаты, например, MGDA (метилглициндиуксусная кислота) или, альтернативно, GLDA (L-глутаминовая кислота, N,N-диуксусная кислота, тетранатриевая соль). Моющая композиция может быть не готовой, т.е. она может практически не содержать моющего компонента.

Количество моющего компонента может превышать 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, и оно может быть ниже 80%, 65%. В средстве для мытья посуды уровень моющего компонента обычно составляет 40-65%, предпочтительно, 50-65%.

Моющий компонент, в частности, может представлять собой хелатирующее средство, которое образует водорастворимые комплексы с Ca и Mg. Прочность комплекса, образованного моющим компонентом и Ca++ и/или Mg++, выраженная в виде значения log K (определяемого либо как константа равновесия или стабильности, либо как константа условной устойчивости при заданном pH), может находиться в диапазоне 3-8, предпочтительно, 5-8. Константу стабильности можно измерить при 25°C и ионной силе 0,1M, а константу условной устойчивости можно измерить в таких же условиях при pH 8,5 или 9.

Моющий компонент может содержать аминогруппу и может представлять собой, например, аминокарбоксилат, аминополикарбоксилат или фосфонат. Он может представлять собой мономерную молекулу, содержащую одну, две или три аминогруппы (как правило, вторичные или третичные аминогруппы), и две, три, четыре или пять карбоксильных групп. Примерами подходящих моющих компонентов являются метилглициндиуксусная кислота (MGDA), глутаминовая кислота N,N-диуксусная кислота (N,N-дикарбоксиметилглутаминовой кислоты тетранатриевая соль, GLDA), нитрилотриуксусная кислота (NTA), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), этилендиамин-N,N’-диянтарная кислота (EDDS), N-(1,2-дикарбоксиэтил)-D,L-аспарагиновая кислота (IDS) и N-(2-гидроксиэтил)иминодиуксусная кислота (EDG) и их соли.

Моющий компонент, предпочтительно, имеет буферную емкость (также называемую резерв щелочности) более 4 (число эквивалентов сильной кислоты, необходимое для изменения рН одного литра буферного раствора на одну единицу, при условии, что общее количество кислоты и соли в буфере остается постоянным).

Моющий компонент может представлять собой экологически чистое комплексообразующее соединение, например, описанное в WO09/102854. Подходящие экологически чистые комплексообразующие соединения включают один или несколько комплексообразователей на основе аминокислоты, на основе сукцината, лимонной кислоты и их солей.

Примеры подходящих соединений на основе аминокислоты включают MGDA (метилглициндиукусная кислота), ее соли и производные и GLDA (глутамин-N,N-диукусная кислота) ее соли и производные. Другие подходящие моющие компоненты описаны в US6426229. Конкретные подходящие моющие компоненты включают, например, такие соединения, как аспарагиновая кислота-N-моноукусная кислота (ASMA), аспарагиновая кислота-N,N-диукусная кислота (ASDA), аспарагиновая кислота-N-монопропионовая кислота (ASMP), иминодиянтарная кислота (IDA), N-(2-сульфометил) аспарагиновая кислота (SMAS), N-(2-сульфоэтил) аспарагиновая кислота (SEAS), N-(2-сульфометил)глутаминовая кислота (SMGL), N-(2-сульфоэтил)глутаминовая кислота (SEGL), N- метилиминодиукусная кислота (MIDA), α-аланин-N,N-диукусная кислота (α-ALDA), серин-N,N-диукусная кислота (SEDA), изосерин-N,N-диукусная кислота (ISDA), фенилаланин-N,N-диукусная кислота (PHDA), антраниловая кислота-N,N-диукусная кислота (ANDA), сульфаниловая кислота-N,N-диукусная кислота (SLDA), таурин-N,N-диукусная кислота (TUDA) и сульфометил-N,N-диукусная кислота (SMDA), а также их соли с щелочными металлами или аммонием. В одном из аспектов можно использовать соли GLDA и их производные. В одном из аспектов можно использовать тетранатриевую соль GLDA.

Другие примеры подходящих моющих компонентов включают N-(гидроксиэтил)-этилидендиаминтриацетат (HEDTA), диэтанолглицин (DEG), 1-гидроксиэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту (HEDP), диэтилентриамин пента(метиленфосфоновой кислоты) (DTPMP), этилендиамин тетра(метиленфосфоновой кислоты) (EDTMPA) и аминотрис(метиленфосфоновой кислоты) (ATMP).

Примеры подходящих соединений янтарной кислоты описаны в US5977053. В одном из аспектов подходящие соединения янтарной кислоты включают иминосукцинат тетранатрия.

Моющие компоненты можно классифицировать с помощью теста, описанного M.K.Nagarajan et al., JAOCS, Vol. 61, no. 9 (September 1984), p. 1475-1478, чтобы определить минимальный уровень моющего средства, необходимый для снижения жесткости воды при pH 10,5 от 200 м.д. (CaCO₃) до 10 м.д. в растворе гипотетического детергента с концентрацией 0,200 процента, приведенной в виде массового содержания моющего средства в гипотетическом детергенте. Альтернативно, определение можно проводить при pH 8,5, чтобы учесть снижение pH при применении типичных современных стиральных средств. С помощью данного метода, проводимого при любом значении pH, определяют, что необходимый уровень может составлять 0-25% (сильные), 25-35% (средние) или >35% (слабые). Более предпочтительными являются композиции, содержащие сильные и средние моющие компоненты, наиболее предпочтительными являются композиции, содержащие сильные моющие компоненты.

Моющий компонент может представлять собой сильный моющий компонент, такой как метилглициндиукусная кислота ("MGDA") или тетранатриевая соль N,N-дикарбоксиметилглутаминовой кислоты (GLDA); он может представлять собой средний моющий компонент, такой как триполифосфат натрия (STPP), или он может представлять собой слабый моющий компонент, такой как цитрат натрия. Более предпочтительными являются композиции, содержащие сильные и средние моющие компоненты, наиболее предпочтительными являются композиции, содержащие сильные моющие компоненты. Другие примеры моющих компонентов включают цеолит, дифосфат, трифосфат, фосфонат, карбонат, нитрилотриукусная кислота, этилендиаминтетраукусная кислота (EDTA), диэтилентриаминпентаукусная кислота, алкил- или алкенилянтарная кислота, растворимые силикаты и слоистые силикаты (например, SKS-6 от Hoechst).

Детергент может содержать один или несколько полимеров. Примерами являются карбоксиметилцеллюлоза, поли(винилпирролидон), поли(этиленгликоль), поливиниловый спирт), поли(винилпиридин-N-оксид), поли(винилимидазол), поликарбоксилаты, такие как полиакрилаты, сополимеры малеиновой и акриловой кислот и сополимеры лаурилметакриловой и акриловой кислот.

Детергент может содержать отбеливающую систему, или одно или несколько отбеливающих средств, которые могут содержать источник H₂O₂, такой как перборат или перкарбонат, который можно объединить с активатором отбеливания, образующим перкислоту, таким как тетраацетилэтилендиамин или нонаноилоксибензолсульфонат. Альтернативно, отбеливающая система может содержать пероксикислоты, например, амидного, имидного или сульфонового типа. Другие подходящие отбеливающие средства включают другие фотоотбеливающие соединения, предварительно образованные перкислоты, источники пероксида водорода, активаторы отбеливания, пероксид водорода, катализаторы отбеливания и их смеси. Как правило, если отбеливающее средство входит в состав композиции настоящего изобретения, его содержание может составлять примерно 0,1%-50%, или даже примерно 0,1%-25%, по отношению к массе моющей композиции.

Моющее средство также может содержать другие традиционные ингредиенты, такие как кондиционеры для тканей, включающие глины, пенообразующие средства, средства, подавляющие пенообразование, антикоррозионные средства, средства, суспендирующие почву, средства, препятствующие повторному осаждению почвы, красители, бактерицидные средства, оптические отбеливатели, гидротропы, ингибиторы блеска или отдушки.

Различия в местных и региональных условиях, таких как жесткость воды и температура мытья, обуславливают потребность в региональных моющих композициях. Примеры моющих средств 1 и 2 демонстрируют диапазоны составов типичного европейского средства для посудомоечных машин (ADW) и типичного европейского порошкообразного моющего средства, соответственно.

Пример моющего средства 1. Состав типичного европейского моющего средства ADW

Р-содержащая композиция Композиция, не содержащая Р 50% STPP 30% Цитрат натрия (или хелатирующее средство) 20% Сода (карбонат натрия) 20% Сода (карбонат натрия) 10% Перкарбонат натрия 10% Перкарбонат натрия 5% Дисиликат натрия 5% Дисиликат натрия 2% TAED 5% TAED <5% Полимеры 10% Полимеры <5% Фосфонат Сульфат натрия 2% Поверхностно-активные вещества <5% Поверхностно-активные вещества 3% Ферменты <5% Ферменты До 100% оставшиеся компоненты (отдушка, краситель, ингибитор коррозии и др.) рН 9-11 До 100% оставшиеся компоненты (отдушка, краситель, ингибитор коррозии и др.) рН 9-11

Пример моющего средства 2. Состав типичного европейского порошкообразного моющего средства

Группа Уточняющее название Содержание Поверхностно-активные вещества 0-30% Сульфонаты 0-20% Сульфаты 0-15% Омыляющие вещества 0-10% Неионные 0-10% Катионные 0-10% Другие 0-10% Отбеливающие средства 0-30% SPT / SPM 0-30% NOBS+TAED 0-10%

Моющие компоненты 0-60% Фосфаты 0-40% Цеолит 0-40% Na2OSiO2 0-20% Na2CO3 0-20% Наполнители 0-40% Na2SO4
NaCl 0-40%
0-40% Другие до 100% Полимеры Ферменты Регуляторы пенообразования Вода Гидротропы Другие

Фермент (ферменты) моющей композиции настоящего изобретения можно стабилизировать, используя традиционные стабилизирующие средства и ингибиторы протеаз, такие как полиол, например, пропиленгликоль или глицерин, сахар или сахарный спирт, разные соли, например, NaCl; KCl; молочная кислота, муравьиная кислота, борная кислота или производное борной кислоты, например, ароматический боратный эфир или производное фенилбороновой кислоты, такое как 4-формилфенилбороновая кислота, или пептидный альдегид, например, ди-, три- или тетрапептидные альдегиды или аналоги альдегидов (либо находящиеся в виде B1-B0-R, где R обозначает H, CH₃, CX₃, CHX₂ или CH₂X (X=галоген), BO обозначает один аминокислотный остаток (предпочтительно, содержащий необязательно замещенную алифатическую или ароматическую боковую цепь); а B1 обозначает один или несколько аминокислотных остатков (предпочтительно, один, два или три), необязательно содержащих N-концевую защитную группу, либо описанные в WO09118375, W098/13459), или ингибитор протеаз белкового типа, например, BASI, WASI (бифункциональные ингибиторы альфа-амилазы/субтилизина риса, ячменя и пшеницы), или CI2 или SSI. Композиции можно получить по способу, описанному, например, в WO 92/19709, WO 92/19708 и US6472364. В некоторых вариантах осуществления используемые в настоящем описании ферменты стабилизируют путем введения в состав конечных композиций водорастворимых источников ионов цинка (II), кальция (II) и/или магния (II), которые предоставляют такие ионы ферментам, а также источников других ионов металлов (например, бария (II), скандия (II), железа (II), марганца (II), алюминия (III), олова (II), кобальта (II), меди (II), никеля (II) и оксованадия (IV)).

В настоящее время предполагают, что любой отдельный фермент, в частности фермент настоящего изобретения, можно добавить в моющую композицию в количестве, соответствующем 0,01-200 мг ферментного белка на литр моющего раствора, предпочтительно, 0,05-50 мг ферментного белка на литр моющего раствора, в особенности, 0,1-10 мг ферментного белка на литр моющего раствора.

Как правило, моющие композиции настоящего изобретения содержат по меньшей мере 0,0001 массового процента, примерно 0,0001-10, примерно 0,001-1, или примерно 0,01-0,1, или примерно 0,05-15% массовых, или примерно 0,05-20%, или примерно 1-20%, или примерно 1-15% по меньшей мере одного фермента настоящего изобретения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предлагаемые в настоящем описании моющие композиции, как правило, имеют состав, который, при применении композиций в водных моющих операциях, обеспечивает pH моечной воды примерно 5,0-11,5, или, в альтернативных вариантах осуществлениях, даже примерно 6,0-10,5. В некоторых предпочтительных вариантах осуществлениях гранулярные или жидкие стиральные средства имеют состав, обеспечивающий pH примерно 6-8. Хорошо известные в данной области способы поддерживания pH на рекомендуемых уровнях включают применение буферов, щелочей, кислот и др.

Фермент настоящего изобретения также можно ввести в состав моющих композиций, раскрытых в WO 97/07202, который включен в данное описание в качестве ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Способы определения активности варианта протеазы

МЕЛАМИНОВАЯ ПЛИТКА:

Стандартные меламиновые плитки получают от Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, the Netherlands. Главным образом, тип DM-21 (яичный желток).

ШТАММЫ И ПЛАЗМИДЫ:

Штамм Bacillus lentus 309, депонированный в NCIB под номером доступа NCIB 10309, описан в патенте США № 3723250, включенном в настоящее описание в качестве ссылки. Исходную субтилазу 309 или Savinase® можно получить из штамма 309. В качестве организма-хозяина для экспрессии используют Bacillus subtilis.

Плазмиду pSX222 используют в качестве челночного вектора E. coli - B. subtilis и вектора экспрессии B. subtilis (как описано в WO 96/34946).

ОБЩИЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ:

Если не указано иначе, манипуляции с ДНК и трансформации ДНК проводят, используя стандартные методы молекулярной биологии (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).

ФЕРМЕНТЫ ДЛЯ МАНИПУЛЯЦИЙ С ДНК:

Если не указано иначе, все ферменты, используемые для манипуляций с ДНК, такие как, например, рестрикционные эндонуклеазы, лигазы и др., получают от New England Biolabs, Inc. Ферменты для манипуляций с ДНК используют в соответствии с инструкциями поставщиков.

ФЕРМЕНТАЦИЯ:

Ферментацию с целью получения ферментов-субтилаз проводят при pH 7,3 и 37°C на вращательно-качающемся столе при 225 об/мин в пробирках объемом 50 мл, содержащих 15 мл двойной среды TY в течение 2-3 дней.

Описание среды TY приведено на стр. 1.1.3, Media Preparation and Bacteriological Tools in "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.).

ОЧИСТКА:

Вариант субтилазы, секретированный клетками-хозяевами, можно извлечь из культуральной среды с помощью хорошо известных способов, включая выделение клеток из среды путем центрифугирования или фильтрации и осаждение белковых компонентов среды с помощью соли, такой как сульфат аммония, с последующим применением хроматографических процедур, таких как ионообменная хроматография, аффинная хроматография и т.п.

КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Каталитическую активность вариантов настоящего изобретения можно определить с помощью описанного ниже анализа "Kinetic Suc AAPF-pNA":

Субстрат pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).

Температура: комнатная.

Буфер для анализа: 50 мМ Tris/HCl, 1 мМ CaCl2, pH 9,0.

20 мл препарата протеазы (разбавленной 0,01% раствором тритона X-100) смешивают со 100 мл буфера для анализа. Реакцию инициируют путем добавления 100 мл препарата субстрата pNA (полученного путем растворения 50 мг в 1,0 мл DMSO с последующим 45x разбавлением 0,01% раствором тритона X-100). Увеличение значений OD₄₀₅ регистрируют как показатель активности протеазы.

ТЕСТИРОВАНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК МЫТЬЯ:

Чтобы определить характеристики мытья выбранных вариантов субтилазы, входящих в состав моющих композиций, проводят моечные эксперименты. Варианты ферментов настоящего изобретения тестируют, используя Автоматический анализ механического усилия (AMSA). С помощью теста AMSA можно определить характеристики мытья большого числа фермент-содержащих моющих растворов, имеющих маленький объем. Более подробное описание приведено в примере 3.

МОЮЩИЕ СРЕДСТВА:

Для тестирования характеристик мытья ферментов-субтилаз настоящего изобретения можно использовать готовые коммерческие моющие средства, которые после приобретения на рынке подвергают тепловой обработке с целью инактивации ферментных компонентов (5 минут при 85°C в водном растворе). Кроме того, у производителя можно сразу приобрести основу коммерческого детергента без ферментов. Для тестирования характеристик мытья также можно использовать подходящую модель моющего средства, полученную по способу, описанному на страницах 19-24 настоящего описания.

ПРИМЕР 1

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ВАРИАНТОВ ФЕРМЕНТОВ:

Варианты настоящего изобретения можно конструировать и экспрессировать с помощью способов, известных специалистам в данной области. Ниже приведен пример получения вариантов настоящего изобретения.

Сайт-направленный мутагенез:

Методом сайт-направленного мутагенеза получают варианты субтилизина 309 (Savinase®) настоящего изобретения, содержащие конкретные вставки/делеции/замены, используя традиционное клонирование фрагментов ДНК (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989), полученных методом ПЦР с использованием олигонуклеотидов, содержащих желательные мутации.

В качестве матрицы используют плазмидную ДНК pSX222 или ее аналог, который содержит участок, кодирующий вариант субтилизина 309. Для конструирования вариантов мутации вводят путем олиго-направленного мутагенеза.

Варианты субтилизина 309 используют для трансформации E. coli. ДНК, выделенную из культуры полученных трансформантов после культивирования в течение ночи, расщепляют рестрикционной эндонуклеазой, фрагменты ДНК выделяют, лигируют и используют для трансформации B. subtilis. Трансформацию B. subtilis проводят по способу, описанному Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221.

Сайт-направленный мутагенез с целью введения мутаций в конкретный участок:

Синтезируют мутагенные праймеры (олигонуклеотиды), соответствующие последовательностям ДНК, фланкирующим участки мутаций, разделенные парами оснований ДНК, определяющими вставки/делеции/замены.

Затем проводят реакцию ПЦР, используя полученные мутагенные праймеры и модифицированную плазмиду pSX222. Полученный фрагмент ПЦР выделяют и удлиняют с помощью второй реакции ПЦР, продукт которой выделяют и удлиняют с помощью третьей реакции ПЦР, после чего полученный продукт расщепляют эндонуклеазами и клонируют в челночном векторе pSX222 E. coli - B. subtilis. Реакции ПЦР проводят в нормальных условиях. Плазмидную ДНК используют для трансформации E. coli с помощью хорошо известных способов и одну колонию E. coli секвенируют, чтобы подтвердить введение мутации.

Чтобы выделить варианты субтилазы изобретения, компетентный штамм B. subtilis трансформируют экспрессионной плазмидой pSX222, содержащей участок, кодирующий вариант настоящего изобретения, и ферментируют по указанному выше способу.

ПРИМЕР 2

ОЧИСТКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА:

После ферментации очистку вариантов субтилизина проводят методом гидрофобной хроматографии с индукцией заряда (HCIC) с последующей вакуумной фильтрацией.

Для улавливания фермента в методе HCIC используют целлюлозную матрицу, с которой связан 4-меркаптоэтилпиридин (4-MEP).

Гранулы целлюлозной матрицы размером 80-100 мкм смешивают со средой, содержащей дрожжевой экстракт, и трансформированными B. subtilis, способными секретировать варианты субтилизина, и инкубируют при pH 9,5 в микропланшетах Unifilter®.

Поскольку 4-MEP является гидрофобным при pH>7, а варианты субтилизина являются гидрофобными при pH 9,5, между секретированным ферментом и 4-MEP, присутствующим на гранулах, образуется гидрофобная связь. После инкубации среду и клеточный дебрис удаляют вакуумной фильтрацией, а гранулы и фермент остаются на фильтре.

Чтобы элюировать фермент с гранул, pH снижают путем промывания фильтра буфером для элюирования (pH 5). В результате фермент удаляют с гранул, после чего его можно извлечь из буфера.

Концентрацию очищенных ферментных вариантов субтилизина определяют путем титрования активного центра (AST).

Очищенный фермент инкубируют с высокоаффинным ингибитором CI-2A в разных концентрациях, чтобы ингибировать разное число активных центров. Протеаза и ингибитор связываются друг с другом в соотношении 1:1 и, соответственно, концентрация фермента непосредственно соответствует концентрации ингибитора, при которой все молекулы протеазы являются неактивными. Чтобы измерить остаточную активность протеазы, после инкубации с ингибитором добавляют субстрат (0,6 мМ Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA в буфере Tris/HCl) и в течение следующих 4 минут периодически измеряют развитие окрашивания при 405 нм, соответствующее количеству продукта распада pNA (паранитрофенола), на ридере Elisa.

ПРИМЕР 3

Характеристики мытья вариантов настоящего изобретения тестируют методом AMSA на твердых поверхностях. Указанный метод и результаты описаны ниже.

ХАРАКТЕРИСТИКИ МЫТЬЯ ВАРИАНТОВ СУБТИЛИЗИНА НА ТВЕРДЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ:

Описание тестирования методом AMSA:

Моечные эксперименты проводят, чтобы определить характеристики мытья выбранных вариантов протеазы в составе композиций для мытья посуды, т.е. модели моющего средства ADW, содержащей MGDA, и модели моющего средства ADW, содержащей STPP. Протеазы настоящего изобретения тестируют методом Автоматического анализа механического усилия (AMSA). С помощью теста AMSA можно определить характеристики мытья большого числа фермент-содержащих моющих растворов, имеющих маленький объем. Планшет AMSA содержит ряд бороздок для тестируемых растворов и крышку, плотно прижимающую образец для мытья посуды, меламиновую плитку, подлежащую мытью против всех пазов. Во время мытья планшет, тестируемые растворы, меламиновую плитку и крышку энергично встряхивают, чтобы привести тестируемый раствор в контакт с загрязненной меламиновой плиткой и приложить механическое усилие в виде регулярных периодических колебаний. Более подробное описание метода можно найти в WO 02/42740, главным образом, в параграфе "Отдельные варианты осуществления способа" на страницах 23-24.

Эксперимент проводят в описанных ниже условиях:

Модель моющего средства ADW, содержащая MGDA * MGDA(40%) 30%
Карбонат натрия 20%
Перкарбонат натрия 10%
дисиликат натрия 5%
TAED 5%
Сокалан CP5 (39,5%) 10%
Поверхностно-активные вещества 23-6.5 (100%) 5%
Сульфат натрия 15% Доза моющего средства 3,33 г/л Объем тестируемого раствора 160 мкл pH Как есть Время мытья 20 минут

Температура 50°C Жесткость воды 17 градусов жесткости Концентрация фермента в тестируемом растворе 0,925-1,85-5,55-11 мг ферментного белка/л Тестируемое вещество Меламиновая плитка, загрязненная вареным яичным желтком (DM-21) * MGDA: метилглициндиукусная кислота или, альтернативно, GLDA: L-Глутаминовая кислота, N,N-диукусная кислота, тетранатриевая соль

Модель моющего средства ADW, содержащая STPP * STPP 50%
Карбонат натрия 20%
Перкарбонат натрия 10%
дисиликат натрия 5%
TAED 2%
Сокалан CP5 (39,5%) 5%
Поверхностно-активные вещества 23-6.5 (100%) 2%
Фосфонат 6% Доза моющего средства 3,33 г/л Объем тестируемого раствора 160 мкл pH Как есть Время мытья 20 минут Температура 50°C Жесткость воды 17 градусов жесткости

Концентрация фермента в тестируемом растворе 0,925-1,85-5,55-11 мг ферментного белка/л Тестируемое вещество Меламиновая плитка, загрязненная вареным яичным желтком (DM-21) * Триполифосфат натрия

Результаты ADW-тестирования разных вариантов приведены ниже. В результате индекс равен 1. Значение характеристики савиназы принимают за 1 и результаты, полученные для вариантов, сравнивают с этим значением.

Тестирование вариантов в моющем средстве, содержащем MGDA, на меламиновых пластинах, загрязненных яичным желтком (вареным)

Вариант Среднее значение RP мытья (по сравнению с савиназой) Савиназа 1,00 S9R A15T V68A Q245R 1,33 S9R A15T V68A N218D Q245R 1,64 S9R A15T G61E V68A A98S S99G Q245R 1,44 S9R,A15T,G61E,V68A,A98S,S99G,N218D,Q245R 1,67

Тестирование вариантов в моющем средстве, содержащем STPP, на меламиновых пластинах, загрязненных яичным желтком (вареным)

Вариант Среднее значение RP мытья (по сравнению с савиназой) Савиназа 1,00 S9R A15T V68A Q245R 1,36 S9R A15T V68A N218D Q245R 1,70 S9R A15T G61E V68A A98S S99G Q245R 1,36 S9R,A15T,G61E,V68A,A98S,S99G,N218D,Q245R 1,76

Результаты отчетливо демонстрируют, что варианты настоящего изобретения хорошо действуют на белковые загрязнения, такие как пятна от вареных яиц.

ХАРАКТЕРИСТИКИ МЫТЬЯ ДРУГИХ ВАРИАНТОВ СУБТИЛИЗИНА НА ТВЕРДЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ

Характеристики мытья других вариантов настоящего изобретения определяют методом AMSA на твердых поверхностях в указанных выше условиях:

Тестирование вариантов в моющем средстве, содержащем MGDA, на меламиновых пластинах, загрязненных яичным желтком (вареным)

Вариант Среднее значение RP мытья (по сравнению с савиназой) Савиназа 1,00 S9R A15T V68A N218D Q245R 1,67 S9R A15T V68A H120N N218D Q245R 1,57 S9R A15T V68A H120V N218D Q245R 1,47 S9R A15T V68A H120Q N218D Q245R 1,62 S9R A15T V68A N76D Q245R 1,55 S9R A15T V68A N76D N218D Q245R 1,57

Тестирование вариантов в моющем средстве, содержащем STPP, на меламиновых пластинах, загрязненных яичным желтком (вареным)

Вариант Среднее значение RP мытья (по сравнению с савиназой) Савиназа 1,00 S9R A15T V68A N218D Q245R 1,53 S9R A15T V68A H120N N218D Q245R 1,53 S9R A15T V68A H120V N218D Q245R 1,47 S9R A15T V68A H120Q N218D Q245R 1,58 S9R A15T V68A N76D Q245R 1,55 S9R A15T V68A N76D N218D Q245R 1,62

Результаты отчетливо демонстрируют, что варианты настоящего изобретения хорошо действуют на белковые загрязнения, такие как пятна от вареных яиц.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено применение варианта субтилизина 309, имеющего 80% идентичность по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного субтилизина и содержащего замены 9R, 15T, 68A, 245R, 218D, а также композиции, содержащей указанный вариант субтилизина, для удаления пятен от вареных яиц на твердой поверхности. Группа изобретений позволяет более эффективно осуществлять способ очистки твердых поверхностей от указанного типа загрязнений. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 11 табл., 3 пр.

1. Применение варианта 309 субтилизина на твердой поверхности для удаления пятен от вареных яиц,

где вариант содержит замены 9R, 15Т, 68А, 245R и 218D по сравнению с субтилизином 309,

где вариант по меньшей мере на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO:1 и

где положения соответствуют положениям зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN'].

2. Применение по п.1, где в положении 218 осуществляют замену на D.

3. Применение по п.1, где вариант дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих модификаций: G61{D,E}, N62{D,E}, N76{D,E}; *97aG, A98{G,S}, S99G, S101G, H120{N,V,Q,D}, P131{T,S}, Q137H, A194P, A228V, A230V, N261D.

4. Применение по п.1, где вариант содержит следующие замены: S9R, А15Т, V68A, N218D и Q245R.

5. Применение по п.4, где вариант дополнительно содержит замену G61E.

6. Применение по п.4, где вариант дополнительно содержит замену A98S.

7. Применение по п.4, где вариант дополнительно содержит замену S99G.

8. Применение по любому из пп.1-7, где вариант содержит следующие замены: S9R, А15Т, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D и Q245R.

9. Применение по любому из пп.1-7, где исходный субтилизин принадлежит к подгруппе I-S2.

10. Применение по любому из пп.1-7, где исходный субтилизин представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

11. Применение по п.1, где вариант представляет собой полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO:3.

12. Применение по п.1, где вариант представляет собой полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO:4.

13. Применение по любому из пп.1-7, где вариант обладает одним или несколькими улучшенными свойствами по сравнению с исходным субтилизином,

где улучшенные свойства включают улучшенные характеристики мытья твердых поверхностей, такого так мытье посуды.

14. Применение композиции для удаления пятен от вареных яиц с твердых поверхностей,

где указанная композиция содержит эффективное количество варианта 309 субтилизина, содержащего замены 9R, 15Т, 68А, 245R и 218D по сравнению с субтилизином 309,

где вариант по меньшей мере на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO:1 и

где положения соответствуют положениям зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN'].

15. Применение по п.14, где указанный вариант 309 субтилизина дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих модификаций: N76E, *97aG и A228V.

16. Применение по п.14 или 15, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один другой фермент, выбранный из группы, включающей липазу, амилазу и целлюлазу.

17. Способ удаления пятен от вареных яиц с твердых поверхностей,

где способ предусматривает приведение в контакт твердых поверхностей с вариантом 309 субтилизина, который содержит замены 9R, 15Т, 68А, 218D и 245R по сравнению с субтилизином 309, где вариант по меньшей мере на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO:1, для очистки от пятен от вареных яиц,

где положения соответствуют положениям последовательности SEQ ID NO:2 и субтилизин 309 обладает протеазной активностью.