Способы и композиции, содержащие варианты сериновой протеазы Российский патент 2018 года по МПК C11D3/386 C12N9/54 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к потребительским товарам, содержащим вариант сериновой протеазы. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим вариант сериновой протеазы, имеющий одну или более замен по сравнению со стандартной сериновой протеазой. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения и применения таких потребительских товаров. Протеаза может быть вариантом субтилизина.

Уровень техники

Хотя протеазы, как известно, обеспечивают хорошую чистку пятен (таких как кровь), представляемые рациональное использование природных ресурсов и потребительские предпочтения к более низким температурам стирки, предъявляют требования к моющим средствам, чтобы предоставить потребителю приемлемые преимущества, которые непрерывно растут, и остается потребность в обеспечении композиций, которые обеспечивают очистку и свежесть. Несмотря на то, что сериновые протеазы давно известны из уровня техники промышленных ферментов, остается потребность в сконструированных протеазах, которые являются приемлемыми для конкретных условий и применений, и изобретатели обнаружили, что они могут быть полезными в создании композиций для эффективной очистки и/или обработки, в которых постоянно растет потребность.

Сущность изобретения

В одном варианте осуществления настоящее изобретение включает композицию для очистки и/или обработки, содержащую выделенный вариант субтилизина, при этом упомянутый вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, имеющую протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списков 1-19, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, показанной в SEQ ID NO: 1; и вспомогательное вещество.

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение включает композицию для очистки и/или обработки, содержащую выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, в котором упомянутая Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, и причем упомянутый вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2, и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списков 1-19, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, показанной в SEQ ID NO: 1; и вспомогательное вещество.

В каждом варианте осуществления, перечисленном выше, вариант может демонстрировать улучшенную очистку по сравнению с GG36 протеазой, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает любой из перечисленных выше вариантов, при этом общий суммарный заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 относительно общего суммарного заряда Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает композиции, имеющие, по меньшей мере, один из вариантов, перечисленных выше, при этом упомянутая композиция представляет собой продукт по уходу за тканью и домом.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает способ получения композиции, как описано выше, включающий стадии, на которых получают, по меньшей мере, один из вариантов, перечисленных выше, и смешивают его со вспомогательным веществом или их смесью.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает способ обработки поверхности, в частности ткани, который включает стадию, на которой вводят в контакт поверхность с водным раствором, содержащим, по меньшей мере, один из вариантов, перечисленных выше, и вспомогательное вещество.

Краткое описание перечня последовательностей

ФИГ. 1 представляет выравнивание зрелых стандартных протеаз, включая: BPN' (SEQ ID NO: 1) и GG36 (SEQ ID NO: 2). Положение каждой аминокислоты каждого варианта протеазы, более конкретно вариантов субтилизина, описанных в данной заявке, включая каждый вариант протеазы холодной воды, нумеруется в соответствии с нумерацией соответствующего положения аминокислоты в аминокислотной последовательности протеазы субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 1), как показано на ФИГ. 1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью протеазы субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens. Таким образом, если в данной заявке не указано другое, то положения замен приведены по отношению к BPN'.

Подробное описание изобретения

Определения

Если не указано другое, получение с соответствии с настоящим изобретением включает традиционные способы, которые обычно используют в молекулярной биологии, белковой инженерии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, которые известны специалисту в данной области техники. Такие способы известны специалисту в данной области техники и описаны во многих учебниках и справочных работах, хорошо известных специалисту в данной области техники. Все патенты, заявки на патенты, статьи и публикации, упомянутые в данной заявке, как выше, так и ниже, таким образом, точно включены в данную заявку путем ссылки.

Если в данной заявке не указано другое, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение. Специалисту в данной области техники известно много технических терминологий. Несмотря на то, что некоторые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в данной заявке, находят использование в получении в соответствии с настоящим изобретением, некоторые приемлемые способы и материалы описаны в данной заявке. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно описываются со ссылкой на описание в целом. Кроме того, как используется в данной заявке, единственное число включает множественное число, если в контексте явно не указано другое. Числовые диапазоны включают в себя числа, которые определяют диапазон. Если не указано другое, нуклеиновые кислоты записываются слева направо от 5' к 3' ориентации; аминокислотные последовательности записываются слева направо от амино к карбокси ориентации, соответственно. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными методологией, протоколами и реагентами, так как они могут изменяться в зависимости от контекста, в котором они используются специалистом в данной области техники.

Получение в соответствии с настоящим изобретением использует, если не указано другое, традиционные методики очистки белков, молекулярной биологии, микробиологии, методики рекомбинантной ДНК и секвенирования белка, все из которых находятся в пределах компетентности специалиста в данной области техники.

Кроме того, заголовки, предусмотренные в данной заявке, не ограничиваются различными аспектами или вариантами осуществления изобретения, которые могут быть включены путем ссылки на описание в целом. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно определены путем ссылки на описание в целом. Тем не менее, для того, чтобы облегчить понимание изобретения, ниже определен ряд терминов.

Как используется в данной заявке, термины «протеаза» и «протеиназа» относятся к ферментному белку, который имеет способность к разрушению других белков. Протеаза имеет способность к проведению «протеолиза», который начинает катаболизм белка за счет гидролиза пептидных связей, которые связывают аминокислоты вместе в пептидную или полипептидную цепь, образуя белок. Данная активность протеазы, как белок-переваривающего фермента, называется «протеолитической активностью». Существует много хорошо известных методик для оценки протеолитической активности (см., например, Kalisz, «Microbial Proteinases», In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, (1988)). Например, протеолитическая активность может быть установлена путем сравнительных анализов, которые анализируют соответствующую способность протеазы гидролизовать коммерческий субстрат. Характерные субстраты, пригодные для анализа протеазы или протеолитической активности, включают, но не ограничиваются этим, диметилказеин (Sigma С-9801), бычий коллаген (Sigma С-9879), бычий эластин (Sigma Е-1625) и бычий кератин (ICN Biomedical 902111). Колориметрические анализы с использованием данных субстратов хорошо известны из уровня техники (см., например, WO 99/34011 и патент США No. 6,376,450, оба из которых включены в данную заявку путем ссылки). Также используется анализ pNA (см., например, Del Mar et al, Anal. Biochem. 99:316-320 [1979]) для определения концентрации активного фермента для фракций, собранных в ходе градиентного элюирования. В этом анализе измеряется скорость, с которой высвобождается п-нитроанилин по мере гидролиза ферментом растворимого синтетического субстрата, сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-п-нитроанилид (suc-AAPF-pNA). Скорость образования желтого цвета при реакции гидролиза измеряют при 410 нм на спектрофотометре, и она пропорциональна концентрации активного фермента. Кроме того, измерения оптической плотности при 280 нанометрах (нм) может быть использовано для определения общей концентрации белка. Соотношение активный фермент/общий белок определяет чистоту фермента.

Как используется в данной заявке, термин «субтилизин» относится к любому члену из семейства S8 сериновых протеаз, как описано в MEROPS - базе данных пептидаз (см., Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucl Acids Res, 34 Database issue, D270-272 [2006]). Как описано в том документе, семейство пептидазы S8 включает сериновый эндопептидазный субтилизин и его гомологи (Rawlings and Barrett, Biochem J., 290:205-218, [1993]). Семейство S8, кроме того, известное как семейство субтилазы, является вторым наибольшим семейством сериновых пептидаз. На данный момент определены третичные структуры для некоторых членов семейства S8. Типичная S8 белковая структура состоит из трех слоев с семью скрученными β листами, состоящими из перемежающихся слоев между двумя слоями спиралей. Субтилизин (S08.001) представляет собой типичную структуру для группы SB (SB). Несмотря на различную структуру, активные сайты субтилизина и химотрипсина (S01.001) могут перекрываться, что предполагает сходство, которое является результатом конвергентной эволюции больше, чем дивергентной эволюции.

Как используется в данной заявке, термины «протеазный вариант», «вариантная протеаза», «вариантная сериновая протеаза», «сериновый протеазный вариант», «вариант субтилизина», «мутантная протеаза» используются по отношению к протеазам, которые являются подобными стандартной протеазе (которая может быть субтилизиновой протеазой дикого типа), особенно в их функции, но имеют мутации в своей аминокислотной последовательности, что делает их отличными в последовательности от протеазы дикого типа или любой исходной стандартной протеазы (то есть, «родительской» протеазы), из которой получают вариант протеазы. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает «GG36 варианты» (или «GG36 варианты субтилизинов»), в которых мутации присутствуют в зрелой GG36 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Однако, это не означает, что стандартная протеаза ограничивается любой конкретной аминокислотной последовательностью. Кроме того, имеется в виду, что термин охватывает варианты родительской протеазы, в которых последовательность родительской протеазы является, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

Как используется в данной заявке, термин «вариант протеазы холодной воды» означает вариант протеазы, более конкретно варианты субтилизинов родительской протеазы, в котором В. lentus субтилизин GG36 протеаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, при этом упомянутый вариант протеазы, более конкретно варианты субтилизинов имеют одну или больше из следующих характеристик: а) индекс эффективности способа тестирования 2, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8, или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) индекс эффективности способа тестирования 3, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8, или даже от 1,1 до приблизительно 5; с) индекс эффективности способа тестирования 4, по меньшей мере, 1,0, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) индекс эффективности способа тестирования 6, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или е) индекс эффективности способа тестирования 7, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 15, от 1,1 до приблизительно 10, или даже от 1,1 до приблизительно 7. Способ тестирования 2, способ тестирования 3, способ тестирования 4, способ тестирования 6 и способ тестирования 7 подробно описаны ниже в разделе Примера 1, озаглавленном «Способы тестирования». Кроме того, подразумевается, что термин охватывает варианты родительской протеазы, при этом последовательность родительской протеазы является, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, родительская протеаза варианта протеазы (то есть, «стандартная» или «исходная» протеаза) является коммерчески доступной протеазой, включая, но не ограничиваясь протеазами, продаваемыми под торговыми названиями SAVINASE®, POLARZYME®, KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA®, OVOZYME®, (от Novozymes A/S); MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® и PURAFECT ОХР®, PURAFAST™, PURAFECT® PRIME, PURAMAX® (от Danisco US, Genencor Division); и те, которые доступны от Henkel/Kemira, а именно BLAP (последовательность, показанная на фигуре 29 US 5,352,604 со следующими мутациями S99D+S101R+S103A+V104I+G159S, в дальнейшем именуемые в данной заявке как BLAP) и BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I).

Как используется в данной заявке, термин «вариантный полипептид» относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая отличается, по меньшей мере, на один аминокислотный остаток от аминокислотной последовательности родительского или стандартного полипептида (включая, но не ограничиваясь приведенным, полипептиды дикого типа).

Как используется в данной заявке, «род Васillus» включает все виды рода «Bacillus,» как известно специалисту в данной области техники, включая, но, не ограничиваясь приведенным, В. subtilis, В. licheniformis, В. lentus, В. brevis, В. stearothermophilus, В. alkalophilus, В. amyloliquefaciens, В. clausii, В. halodurans, В. megaterium, В. coagulans, В. circulans, В. lautus и В. thuringiensis. Является общепризнанным, что род Bacillus продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые реклассифицированы, включая, но не ограничиваясь приведенным, такие организмы, как В. stearothermophilus, которые в настоящее время называют «Geobacillus stearothermophilus». Продуцирование устойчивых эндоспор в присутствии кислорода считается определяющим признаком рода Bacillus, хотя данную характеристику, кроме того, применяют к недавно получившим название Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus и Virgibacillus.

Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота», которые взаимозаменяемо используются в данной заявке, относятся к полимеру любой длины из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепь. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), полинуклеотид, содержащий дезоксирибонуклеотиды, и РНК (рибонуклеиновая кислота), полимер из рибонуклеотидов, представляют собой примеры полинуклеотидов или нуклеиновых кислот, которые имеют отличающуюся биологическую функцию. Полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают, но не ограничиваются приведенным, одно-, дву- или три-нитевую ДНК, геномный ДНК, кДНК, РНК, ДНК-РНК гибрид или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически, биохимически модифицированные, неприродные или производные нуклеотидные основания. Ниже представлены неограничивающие примеры полинуклеотидов: гены, фрагменты генов, хромосомные фрагменты, маркер(ы) экспрессированной последовательности (EST), экзоны, интроны, информационная РНК (иРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомальная РНК (рРНК), рибозимы, комплементарная ДНК (кДНК), рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенные ДНК любой последовательности, выделенные РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды содержат модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, урацил, другие сахара и связывающие группы, такие как фторрибоза и тиоат, и нуклеотидные разветвления. В конкретном варианте осуществления, последовательность нуклеотидов прерывается ненуклеотидными компонентами.

Как используется в данной заявке, термин «мутация» относится к изменениям, сделанным в исходной последовательности аминокислоты или нуклеиновой кислоты. Подразумевается, что термин охватывает замены, вставки и делеции.

Как используется в данной заявке, термин «вектор» относится к конструкции нуклеиновой кислоты или полинуклеотидной конструкции, используемой для введения или переноса нуклеиновой(ых) кислоты или полинуклеотида(ов) в клетку-мишень или ткань. Вектор, как правило, используют для введения чужой ДНК в другую клетку или ткань. Вектор, в основном, содержит последовательность ДНК, которая является трансгенной и большей полинуклеотидной последовательностью, которая служит в качестве «скелета» вектора. Вектор, как правило, служит для переносов генетической информации, такой как вставочный трансген, в клетку-мишень или ткань для того, чтобы выделить, размножить или экспрессировать вставку в клетке-мишени или ткани. Векторы включают плазмиды, клонирующие векторы, бактериофаги, вирусы (например, вирусный вектор), космиды, экспрессирующие векторы, шаттл-векторы, кассеты и тому подобное. Вектор, как правило, включает точку начала репликации, сайт множественного клонирования и селектируемый маркер. Процесс включения вектора в клетку-мишень, как правило, называют как трансфекция. Трансфекцию клетки вирусным вектором, как правило, называют как трансдукция. Настоящее изобретение включает, в некоторых вариантах осуществления, вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую вариант протеазы (например, предшественника или зрелый вариант протеазы), которая функционально связана с приемлемой пропоследовательностью (например, секреторной, сигнальной пептидной последовательностью, т.д.), способной осуществлять экспрессию последовательности ДНК в подходящем хозяине.

Как используется в данной заявке, термин «экспрессионная кассета», «экспрессионный плазмид» или «экспрессионный вектор» относится к конструкции нуклеиновой кислоты или вектору, образованному рекомбинантно или синтетически, для экспрессии интересующей нуклеиновой кислоты (например, чужой нуклеиновой кислоты или трансгена) в клетке-мишени. Нуклеиновая кислота, представляющая интерес, как правило, экспрессирует представляющий интерес белок. Экспрессионный вектор или экспрессионная кассета, как правило, содержит промотор нуклеотидной последовательности, который управляет или способствует экспрессии чужой нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор или кассета, кроме того, как правило, включает любые другие специфические элементы нуклеиновой кислоты, которые разрешают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантная экспрессионная кассета может быть включена в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Некоторые экспрессионные вектора имеют способность включать и экспрессировать гетерологичные фрагменты ДНК в клетке-хозяине. Многие прокариотические и эукариотические экспрессионные векторы являются коммерчески доступными. Выбор соответствующих векторов экспрессии находится в пределах знаний специалистов в данной области техники. Выбор соответствующих векторов экспрессии для экспрессии белка из последовательности нуклеиновой кислоты, включенной в вектор экспрессии, находится в пределах знаний специалистов в данной области техники.

Конструкция ДНК представляет собой искусственно сконструированный сегмент нуклеиновой кислоты, который может быть введен в клетку-мишень или ткань. Конструкция ДНК обычно содержит вставку ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, который был субклонирон в вектор. Вектор может содержать бактериальные резистентные гены для роста в бактериях и промотор для экспрессии представляющего интерес белка в организме. ДНК может быть сгенерирована in vitro посредством ПЦР или любого другого подходящего способа(ов), известного(ых) в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления, конструкция ДНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет интерес. В некоторых вариантах осуществления, последовательность функционально связана с дополнительными элементами, такими как элементы контроля (например, промоторы и т.д.). Конструкция ДНК может дополнительно содержать селектируемый маркер и может дополнительно содержать вводимую последовательность, фланкированную гомологичными фрагментами. Конструкция может содержать другие негомологичные последовательности, добавленные к концам (например, спейсерные последовательности или фланкирующие). В некоторых вариантах осуществления, концы последовательности замкнуты так, что конструкция ДНК образует замкнутый круг. Последовательность представляющей интерес нуклеиновой кислоты, которая включена в конструкцию ДНК, используя способы, хорошо известные в данной области техники, может быть мутантной или модифицированной нуклеиновой кислотой дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, конструкция ДНК содержит одну или больше последовательностей нуклеиновых кислот, гомологичных хромосоме клетки-хозяина. В других вариантах осуществления, конструкция ДНК содержит одну или больше негомологичных нуклеотидных последовательностей. После сборки конструкции ДНК in vitro, ее можно использовать, например, для: 1) встраивания гетерологичных последовательностей в желаемую последовательность-мишень клетки-хозяина; и/или 2) осуществления мутагенеза участка хромосомы клетки-хозяина (то есть, замены эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью); 3) удаления генов-мишеней; и/или 4) введения заменяющей плазмиды в хозяина. «ДНК конструкция» в данной заявке используется взаимозаменяемо с «экспрессионной кассетой».

Как используется в данной заявке, термин «плазмида» относится к внехромосомной молекуле ДНК, которая является способной к репликации независимо от хромосомной ДНК. Плазмида является двухцепочечной (ds) и может быть круглой, и, как правило, используется в качестве клонирующего вектора.

Как используется в данной заявке в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, термин «введенный» относится к любому способу приемлемому для переноса последовательности нуклеиновой кислоты в клетку. Такие способы введения включают, но не ограничиваются приведенным, слияние протопластов, трансфекцию, трансформацию, электропорацию, конъюгацию и трансдукцию (см., например, Ferrari et al, «Genetics,» in Hardwood et al. (eds.), Bacillus. Plenum Publishing Corp., pp. 57-72 [1989]).

Трансформация относится к генетической альтерации клетки, которая возникает в результате поглощения, геномного включения и экспрессии генетического материала (например, ДНК).

Как используется в данной заявке, нуклеиновая кислота является «функционально связанной» с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер является функционально связанным с нуклеотидом, кодирующим последовательность, если промотор влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Сайт связывания рибосом может быть функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчить трансляцию кодирующей последовательности. Как правило, «функционально связанные» последовательности ДНК являются смежными. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов нет, могут быть использованы синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с традиционной практикой.

Как используется в данной заявке, термин «ген» относится к полинуклеотиду (например, сегменту ДНК), который кодирует полипептид и включает участки предшествующие кодирующим областям и следующие после них, а также к встроенным последовательностям (интронам) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

Как используется в данной заявке, термин «рекомбинантный», при использовании со ссылкой на клетку, как правило, указывает, что клетка была модифицирована путем введения гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты или что клетка происходит из клетки, модифицированной таким образом. Например, рекомбинантная клетка может содержать ген, не найденный в идентичной форме в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или рекомбинантная клетка может содержать нативный ген (найденный в нативной форме клетки), но который был модифицирован и повторно введен в клетку. Рекомбинантная клетка может содержать нуклеиновую кислоту, эндогенную к клетке, которая была модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты из клетки; такие модификации включают те, которые получены путем замещения гена, сайт-специфических мутаций, и соответствующих способов, известных специалисту в данной области техники. Технология рекомбинантной ДНК включает способы продуцирования рекомбинантной ДНК in vitro и переноса рекомбинантной ДНК в клетки, где она может быть экспрессирована или размножена, таким образом получая рекомбинантный полипептид. «Рекомбинация», «рекомбинирование» и получение «рекомбинированных» полинуклеотидов или нуклеиновых кислот, как правило, означает соединение или комбинирование двух или более нуклеиновых кислот или полинуклеотидных нитей или фрагментов с созданием нового полинуклеотида или нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный полинуклеотид или нуклеиновая кислота иногда называются химерой. Нуклеиновая кислота или полипептид является «рекомбинантным», когда он является искусственным или сконструированным, или полученным из искусственного или сконструированного белка или нуклеиновой кислоты.

Как используется в данной заявке, термин «амплификация» нуклеиновой кислоты или гена относится к процессу, при котором специфические последовательности ДНК являются непропорционально реплицированными, таким образом, что амплифицированная нуклеиновая кислота или ген становится присутствующим в более высоком количестве копий, чем первоначально присутствовало в геноме. В некоторых вариантах осуществления, селекция клеток посредством роста в присутствии лекарственного средства {например, ингибитора ингибируемого фермента) в результате приводит к амплификации либо эндогенного гена, кодирующего генный продукт необходимый для роста в присутствии лекарственного средства, либо амплификации экзогенных (то есть, вводимых) последовательностей, кодирующих данную нуклеиновую кислоту или генный продукт, или оба.

«Амплификация» является частным случаем репликации нуклеиновой кислоты с использованием матрицы специфичности. Ее следует отличать от репликации с неспецифической матрицей (то есть, репликации, которая является матрица-зависимой, но не зависит от конкретной матрицы). Специфичность матрицы в данной заявке отличается от точности репликации (то есть, синтеза подходящей полинуклеотидной последовательность) и специфичности нуклеотида (рибо- или дезоксирибо-). Специфичность матрицы часто описывают в терминах специфичности «мишень». Последовательности-мишени представляют собой «мишени» в том смысле, что следует приложить усилия, чтобы их отсортировать от другой нуклеиновой кислоты. Способы амплификации, в первую очередь, разработаны для данной сортировки.

Как используется в данной заявке, термин «праймер» относится к олигонуклеотиду (полимеру из нуклеотидных остатков), либо встречающемуся в природе в виде очищенного рестриктазный фрагмент, либо полученному синтетически, который способен действовать как точка инициации синтеза при размещении в условиях, в которых инициируется синтез продукта удлинения праймера, который является комплементарным к нити нуклеиновой кислоты (то есть, в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при соответствующей температуре и рН). Праймер предпочтительно является однонитевым для максимальной эффективности в амплификации, но альтернативно может быть двунитевым. Если он является двунитевым, то праймер сначала обрабатывают, чтобы разделить его нити, перед его использованием для получения продуктов удлинения. В некоторых вариантах осуществления, праймер представляет собой олигодезоксирибонуклеотид. Праймер должен быть достаточно длинным, чтобы запустить синтез продуктов удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймера зависит от множества факторов, включая температуру, источник праймера и использование способа.

Как используется в данной заявке, термин «зонд» относится к олигонуклеотиду, либо встречающемуся в природе в виде очищенного рестриктазного фрагмента, либо полученного синтетически, рекомбинантно или путем ПЦР амплификации, который, как правило, способен гибридизироваться с другим олигонуклеотидом, представляющим интерес. Зонд может быть однонитевым или двунитевым. Зонды являются полезными для обнаружения, идентификации и выделения конкретных последовательностей гена. Предполагается, что любой зонд, использованный в настоящем изобретении, будет маркирован любой «репортерной группой», таким образом, что она может быть обнаружена в любой системе обнаружения, включая, но, не ограничиваясь приведенным, ферментные (например, ELISA, а также гистохимические анализы на основе ферментов), флуоресцентные, радиоактивные и люминесцентные системы. Не предполагается, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной системой обнаружения или меткой.

Как используется в данной заявке, термин «мишень», при использовании по отношению к полимеразной цепной реакции, относится к участку нуклеиновой кислоты, связанному с праймерами, используемыми для полимеразной цепной реакции. Таким образом, прилагаются усилия, чтобы «мишень» отсортировать от других последовательностей нуклеиновой кислоты. Нуклеотидный «сегмент» представляет собой участок нуклеиновой кислоты в мишени-последовательности нуклеиновой кислоты.

Как используется в данной заявке, термин «полимеразная цепная реакция» (ПЦР) относится к способам из патентов США №4,683,195 4,683,202 и 4,965,188, включенных в данную заявку путем ссылки, которые включают способы увеличения концентрации сегмента мишени-последовательности в смеси геномной ДНК без клонирования или очистки. Данный процесс амплифилирования мишени-последовательности хорошо известен в данной области техники.

Как используется в данной заявке, термин «реагенты амплификации» относится к тем реагентам (например, трифосфатам дезоксирибонуклеотида, буферу и т.д.), которые необходимы для амплификации, за исключением праймеров, матрицы нуклеиновой кислоты и фермента амплификации. Как правило, реагенты амплификации вместе с другими компонентами реакции помещают и содержат в реакционном сосуде (пробирке, микролунке и т.д.).

Как используется в данной заявке, термин «эндонуклеаза рестрикции» или «фермент рестрикции» относится к ферменту (например, бактериальному ферменту), который способен к резанию двунитевой или однонитевой ДНК в или вблизи конкретной последовательности нуклеотидов, известных как сайт рестрикции. Нуклеотидная последовательность, содержащая сайт рестрикции, распознается и расщепляется с помощью данной эндонуклеазы рестрикции или фермента рестрикции и часто является сайтом для встраивания ДНК фрагментов. Сайт рестрикции может быть сконструирован в вектор экспрессии или конструкцию ДНК.

«Гомологичная рекомбинация» относится к обмену ДНК фрагментов между двумя молекулами ДНК или парными хромосомами на сайте идентичных или близких к идентичным нуклеотидных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления, хромосомная интеграция является гомологичной рекомбинацией.

Нуклеиновая кислота или полинуклеотид, как упоминается, «кодирует» полипептид, если в его нативном состоянии или при обработке способами, известными специалисту в данной области техники, он может быть транскрибирован и/или транслирован, чтобы продуцировать полипептид или его фрагмент. Антисмысловая нить такой нуклеиновой кислоты также, как упоминается, кодирует последовательность.

Как известно из уровня техники, последовательность ДНК может быть транскрибирована с помощью РНК полимеразы, чтобы получить последовательность РНК, но последовательность РНК может быть обратно транскрибирована с помощью обратной транскриптазы, чтобы получить последовательность ДНК.

«Штамм-хозяин» или «клетка-хозяин» относится к подходящему хозяину для вектора экспрессии, содержащего последовательность ДНК, представляющую интерес. Представляющая интерес последовательность ДНК может экспрессировать представляющий интерес белок в штамме-хозяине или клетке-хозяине.

«Белок» или «полипептид» содержит полимерную последовательность аминокислотных остатков. Термины «белок» и «полипептид» используют взаимозаменяемо в данной заявке. Одно и 3-буквенный код для аминокислот, как определено в соответствии с IUРАС-IUВ объединенной комиссией по биохимической номенклатуре (Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)), используют по всей заявке. Однобуквенный X относится к любой из двадцати аминокислот. Кроме того, следует понимать, что полипептид может быть кодирован для более, чем одной нуклеотидной последовательности вследствие вырожденности генетического кода. Мутации названы однобуквенным кодом родительской аминокислоты, с последующими тремя или двумя числами цифровой позиции и затем однобуквенным кодом для вариантной аминокислоты. Например, мутирующий глицин (G) в положении 87 к серину (S) представляют как «G087S» или «G87S». Многократные мутации показывают путем вставки «-» между мутациями. Мутации в положениях 87 и 90 представляют как или «G087S-A090Y», или «G87S-A90Y», или «G87S+A90Y», или «G087S+A090Y». Для делеций используют однобуквенный код «Z». Для вставки относительно родительской последовательности, однобуквенный код «Z» ставят с левой стороны от номера положения. Для делеций, однобуквенный код «Z» ставят с правой стороны от номера положения. Для вставок, номер положения является номером положения перед вставленной(ыми) аминокислотой(ами), плюс 0,01 для каждой аминокислоты. Например, вставка трех аминокислот аланина (А), серина (S) и тирозина (Y) между положениями 87 и 88 показывают как «Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y.» Таким образом, объединяя все мутации, указанные выше, плюс делецию в положении 100 получают: «G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z.»

«Пропоследовательность» или «пропептидная последовательность» относится к аминокислотной последовательности между сигнальной пептидной последовательностью и последовательностью зрелой протеазы, которая необходима для секреции протеазы. Расщепление пропоследовательности или пропептидной последовательности в результате приводит к зрелой активной протеазе.

Термин «сигнальная последовательность» или «сигнальный пептид» относится к последовательности аминокислотных остатков, которые могут принимать участие в секреции или прямом транспорте зрелой или предшествующей формы белка. Сигнальная последовательность, как правило, находится на N-конце последовательности предшественника или зрелого белка. Сигнальная последовательность может быть эндогенной или экзогенной. Одна иллюстративная экзогенная сигнальная последовательность содержит первые семь аминокислотных остатков сигнальной последовательности от субтилизина Bacillus subtilis, слитого с остатком сигнальной последовательности субтилизина от Bacillus lentus (АТСС 21536). Сигнальная последовательность обычно отсутствует в зрелом белке. Сигнальная последовательность, как правило, отщепляется от белка с помощью сигнальной пептидазы, после того как белок транспортируется.

Термин «гибридная сигнальная последовательность» относится к сигнальной последовательности, в которой часть последовательности получают из экспрессионного хозяина, слитого с сигнальной последовательностью гена, который экспрессируется. В некоторых вариантах осуществления используют синтетические последовательности.

Термин «зрелая» форма белка, полипептида или пептида относится к функциональной форме белка, полипептида или пептида без сигнальной пептидной последовательности и пропептидной последовательности.

Термин «предшествующая» форма белка или пептида относится к зрелой форме белка, которая имеет пропоследовательность, функционально связанную с аминным или карбонильным концом белка. Предшественник, кроме того, может иметь «сигнальную» последовательность, функционально связанную с аминным концом пропоследовательности. Предшественник, кроме того, может иметь дополнительные полинуклеотиды, которые вовлечены в пост-трансяционную активность (например, полинуклеотиды, отщепленные от него, чтобы осталась зрелая форма белка или пептида).

Термин «дикого типа» по отношению к аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты показывает, что аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты является нативной или встречающейся в природе последовательностью. Как используется в данной заявке, термин «встречающийся в природе» относится к чему-нибудь (например, белкам, аминокислотам или последовательностям нуклеиновых кислот), что найдено в природе (то есть, не было произведено с помощью рекомбинантных способов).

Как используется в данной заявке, термин «не встречающийся в природе» относится к чему-нибудь, что не найдено в природе (например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, полученные в лаборатории).

Как используется в данной заявке по отношению к положению аминокислотных остатков, «соответствующий» или «соответствует», или «соответственно» относится к аминокислотному остатку в пронумерованном положении в белке или пептиде, или к аминокислотному остатку, который является аналогичным, гомологичным или эквивалентным пронумерованному остатку в белке или пептиде. Как используется в данной заявке, «соответствующий участок», в общем, относится к аналогичному положению в родственных белках или стандартном белке.

Термины «произведенный из» и «полученный из» относятся не только к протеазе, продуцированной или продуцируемой штаммом рассматриваемого организма, но также к протеазе, кодированной последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма и продуцированной в организме хозяина, содержащего такую последовательность ДНК. Кроме того, термин относится к протеазе, которая кодируется последовательностью ДНК синтетического и/или кДНК происхождения и которая имеет идентифицирующие характеристики рассматриваемой протеазы. Как пример, «протеазы, полученные из Васillus» относятся к тем ферментам, которые имеют протеолитическую активность, которые естественным путем вырабатываются Bacillus, а также к сериновым протеазам, подобным тем, которые вырабатываются Bacillus источниками, но которые посредством использования способов генной инженерии продуцируются не Bacillus организмами, трансформированными нуклеиновой кислотой, кодирующей сериновые протеазы.

Термин «идентичный» в контексте двух нуклеиновых кислот или последовательностей полипептидов относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия, как измерено, используя один из следующих алгоритмов сравнения или анализа последовательностей.

Как используется в данной заявке термин «гомологичные гены» относится к паре генов от различных, но обычно родственных видов, которые соответствуют друг другу и которые являются идентичными или очень похожими друг на друга. Термин включает гены, которые разделены путем видообразования (то есть, разработки новых видов) (например, ортологические гены), а также гены, которые разделены путем генетического дублирования (например, паралогичные гены).

Как используется в данной заявке, «гомология» относится к подобности или идентичности последовательности, при этом предпочтение отдается идентичности. Гомология может быть определена, используя стандартные методики, известные из уровня техники (см., например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 [1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; программное обеспечение, такое как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI); и Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387-395 [1984]). Одним примером полезного алгоритма является PILEUP. PILEUP создает многократные выравнивания последовательности из группы родственных последовательностей, используя прогрессивные, попарные выравнивания. Она также может построить дерево, показывающее кластерные взаимосвязи, использованные при создании выравнивания. PILEUP использует упрощение способа прогрессивного выравнивания Фена (Feng) и Дулиттла (Doolittle) (см., Feng and Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 [1987]). Способ является подобным, описанному Хиггинсом (Higgins) и Шарпом (Sharp) (см., Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). Полезные PILEUP параметры, включая массу гэпа по умолчанию 3,00, длину гэпа по умолчанию 0,10, и взвешенные концевые гэпы. Другим примером полезного алгоритма является BLAST алгоритм, описанный Альтшулем (Altschul) и сотрудниками, (см., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990]; и Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). Особенно полезной BLAST программой является WU-BLAST-2 программа (см., Altschul et al., Meth. Enzymol. 266:460-480 [1996]). WU-BLAST-2 использует несколько параметров поиска, большинство из которых установлены как значения по умолчанию. Регулируемые параметры задаются с помощью следующих значений: диапазон перекрывания = 1, фракция перекрывания = 0,125, пороговое слово (Т) = 11. HSP S и HSP S2 параметры являются динамическими величинами и устанавливаются самой программой, в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкрентной базы данных, по отношению к которой осуществляют поиск представляющей интерес последовательности. Однако, значения могут быть скорректированы, чтобы повысить чувствительность.

Процент идентичности последовательности между стандартной последовательностью и исследуемой последовательностью, представляющей интерес, может быть легко определен специалистом в данной области техники. Процентную идентичность совместную с полинуклеотидной или полипептидной последовательностями, определяют путем прямого сравнения информации последовательности между молекулами путем выравнивания последовательностей и определения идентичности, используя способы, известные из уровня техники. Примером алгоритма, который является приемлемым для определения подобности последовательности, является BLAST алгоритм, (см., Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 [1990]). Программное обеспечение для выполнения BLAST анализов является общедоступным через Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information). Данный алгоритм включает, в первую очередь, идентифицирование высокого подсчета пар последовательности (HSP) путем идентифицирования коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которая либо соответствует, либо удовлетворяет некоторому положительно оцененному пороговому подсчету Т, при выравнивании со словом такой же длины последовательности в базе данных. Данное начальное соседнее слова поиска действуют как начальные точки для обнаружения более длинной HSP, содержащей их. Поиски слова расширяют в обоих направлениях вдоль каждой из двух последовательностей, которые сравнивают по мере того, как совокупный счет выравнивания может нарастать. Расширение поисков слова останавливают, когда: совокупный счет выравнивания падает до количества X с максимально достигаемого значения; совокупный счет стремится к нулю или ниже; или достигается конец любой последовательности. Параметры BLAST алгоритма W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. BLAST программа использует по умолчаниям длину слова (W) 11, BLOSUM62 матрицу подсчета (см., Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1992]) выравниваний (В) 50, ожидание (E) 10, M'5, N'-4, и сравнение обеих цепей.

Затем BLAST алгоритм выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin и Altschul, выше). Одно измерение сходства, предусмотренное BLAST алгоритмом, представляет собой наименьшую сумму вероятности (P(N)), которая обеспечивает показание вероятности, с которой случайно могло бы произойти совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновую кислоту рассматривают аналогичной нуклеиновой кислоте сериновой протеазы в соответствии с настоящим изобретением, если вероятность наименьшей суммы по сравнению с исследуемой нуклеиновой кислотой к нуклеиновой кислоте сериновой протеазы составляет меньше, чем приблизительно 0,1, более предпочтительно, меньше, чем приблизительно 0,01, и наиболее предпочтительно, меньше, чем приблизительно 0,001. Когда исследуемая нуклеиновая кислота кодирует полипептид сериновой протеазы, то она считается подобной конкретной нуклеиновой кислоте сериновой протеазы, если сравнение в результате дает вероятность наименьшей суммы меньшую, чем приблизительно 0,5, и более предпочтительно меньшую, чем приблизительно 0,2.

Процент «идентичного» или «идентичности» в контексте двух или больше последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или больше последовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент остатков нуклеиновых кислот или остатков аминокислот, соответственно, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального сходства, как определено, используя алгоритм сравнения последовательности или путем визуальной проверки. «Процентная идентичность последовательности», или «% идентичность», или «% идентичность последовательности», или «% идентичность аминокислотной последовательности» запросной аминокислотной последовательности к стандартной (то есть, заданной) аминокислотной последовательности означает, что запросная аминокислотная последовательность является идентичной (то есть, на основании аминокислота-к-аминокислоте) посредством определенного процента к заданной аминокислотной последовательности путем сравнения длины, когда последовательности оптимально выравнены. Таким образом, 80% идентичность аминокислотной последовательности или 80% идентичность по отношению к двум аминокислотным последовательностям означает, что 80% аминокислотных остатков в двух оптимально выравненных аминокислотных последовательностях являются идентичными.

«Процентная идентичность последовательности» или «% идентичность», или «% идентичность последовательности», или «% идентичность нуклеотидной последовательности» запросной последовательности нуклеиновой кислоты к стандартной (то есть, заданной) последовательности нуклеиновой кислоты означает, что запросная последовательность нуклеиновой кислоты является идентичной (то есть, на основании нуклеотид-к-нуклеотиду для полинуклеотидной последовательности) посредством определенного процента к заданной последовательности путем сравнения длины, когда последовательности оптимально выравнены. Таким образом, 80% идентичность нуклеотидной последовательности или 80% идентичность по отношению к двум последовательностям нуклеиновой кислоты означает, что 80% нуклеотидных остатков в двух оптимально выравненных последовательностях нуклеиновой кислоты являются идентичными.

В некоторых вариантах осуществления, «процентная идентичность последовательности», или «% идентичность последовательности», или «% идентичность» запросной последовательности к заданной последовательности может быть рассчитана путем оптимального выравнивания двух последовательности и сравнивая две оптимально выравненные последовательности посредством сравнения длины. Количество положений в оптимальном выравнивании, в которых идентичные остатки встречаются в обеих последовательностях, определяют, тем самым обеспечивая количество подходящих положений, затем делят на общее количество положений длины сравнения (которая, если не указано другое, является длиной заданной последовательности). Полученное в результате число умножают на 100, чтобы получить процентную идентичность последовательности запросной последовательности к заданной последовательности.

«Оптимальное выравнивание» или «оптимально выравненный» относится к выравниванию двух (или больше) последовательностей, дающих наибольший процент подсчета идентичности. Например, оптимальное выравнивание двух белковых последовательностей может быть достигнуто путем выравнивания последовательностей вручную таким образом, что максимальное число идентичных аминокислотных остатков в каждой последовательности выравниваются вместе, или путем использования программных обеспечений, или способов, описанных в данной заявке или известных из уровня техники. Оптимальное выравнивание двух последовательностей нуклеиновой кислоты может быть достигнуто путем выравнивания последовательностей вручную таким образом, что максимальное число идентичных нуклеотидных остатков в каждой последовательности выравниваются вместе, или путем использования программных обеспечений или процедур, описанных в данной заявке или известных из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления, две полипептидные последовательности считаются «оптимально выравненными», когда они выравнены, используя определенные параметры, такие как определенные матрицы аминокислотных замен, штраф за существование пропуска в последовательности (также называется штраф за внесение пропуска), и штраф за продолжение пропуска, с тем чтобы достичь наиболее высокую вероятность подсчета сходства для такой пары последовательностей. BLOSUM62 матрицу подсчета (см., Henikoff и Henikoff, выше) часто используют по умолчанию как матрицу подсчета замен в алгоритмах выравнивания полипептидной последовательности (например, BLASTP). Штраф за существование пропуска в последовательности накладывается для введения единичного аминокислотного гэпа в одной из выравненных последовательностей, и штраф за продолжение пропуска накладывается для каждого положения остатка в гэпе. Иллюстративными параметрами выравнивания, которые применяются, являются: BLOSUM62 матрица подсчета, штраф за существование пропуска в последовательности = 11 и штраф за продолжение пропуска = 1. Подсчет выравнивания определяется за счет аминокислотных положений каждой последовательности, при которых выравнивание начинается и заканчивается (например, окно выравнивания), и необязательно путем вставки гэпа или множества гэпов в одну или обе последовательности для того, чтобы достичь наиболее высокую вероятность подсчета сходства.

Оптимальное выравнивание между двумя или больше последовательностями может быть определено вручную путем визуальной проверки или путем использования компьютера, такого как, но не ограничиваясь приведенным, например, BLASTP программы для аминокислотных последовательностей и BLASTN программы для последовательностей нуклеиновой кислоты (см., например, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997); См. также, интернет-сайт National Center for Biotechnology Information (NCBI)).

Может упоминаться, что представляющий интерес полипептид является «по существу идентичным» к стандартному полипептиду, если представляющий интерес полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 75%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 91%, по меньшей мере, приблизительно 92%, по меньшей мере, приблизительно 93%, по меньшей мере, приблизительно 94%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 96%, по меньшей мере, приблизительно 97%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или по меньшей мере, приблизительно 99,5% идентичность последовательности к аминокислотной последовательности стандартного полипептида. Процентная идентичность между двумя такими полипептидами может быть определена вручную путем проверки двух оптимально выравненных полипептидных последовательностей или путем использования программных обеспечений или алгоритмов (например, BLAST, ALIGN, CLUSTAL), используя стандартные параметры. Одним признаком того, что два полипептида являются, по существу, идентичными, является то, что первый полипептид является иммунологически перекрестно-реагирующим со вторым полипептидом. Как правило, полипептиды, которые отличаются консервативными аминокислотными заменами, являются иммунологически перекрестно-реагирующими. Таким образом, полипептид является, по существу, идентичным ко второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативной аминокислотной заменой или одним, или больше консервативными аминокислотными заменами.

Может упоминаться, что представляющая интерес нуклеиновая кислота является «по существу идентичной» к стандартной нуклеиновой кислоте, если представляющая интерес нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 75%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 91%, по меньшей мере, приблизительно 92%, по меньшей мере, приблизительно 93%, по меньшей мере, приблизительно 94%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 96%, по меньшей мере, приблизительно 97%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99%, или по меньшей мере, приблизительно 99,5% идентичность последовательности к нуклеотидной последовательности стандартной нуклеиновой кислоты. Процентная идентичность между двумя такими нуклеиновыми кислотами может быть определена вручную путем проверки двух оптимально выравненных последовательностей нуклеиновых кислот или путем использования программных обеспечений или алгоритмов (например, BLAST, ALIGN, CLUSTAL), используя стандартные параметры. Одним признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются, по существу, идентичными, является то, что две молекулы нуклеиновой кислоты гибридизируют друг с другом при жестких условиях (например, в диапазоне от средней до высокой жесткости).

Нуклеиновая кислота или полинуклеотид является «выделенным», когда она/он частично или полностью отделены от других компонентов, включая, но не ограничиваясь приведенным, например, других белков, нуклеиновых кислот, клеток и т.д. Аналогичным образом, полипептид, белок или пептид является «выделенным», когда он частично или полностью отделен от других компонентов, включая, но не ограничиваясь приведенным, например, других белков, нуклеиновых кислот, клеток и т.д. На молярной основе, выделенные виды являются более часто встречающимися, чем другие виды, что присутствуют в композиции. Например, выделенные виды могут содержать, по меньшей мере, приблизительно 50%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% (на молярной основе) от всех присутствующих видов макромолекул. Предпочтительно, представляющие интерес виды очищают до необходимой однородности (то есть, загрязняющие виды не могут быть обнаружены в композиции, используя стандартные способы обнаружения). Чистота и однородность могут быть определены, используя ряд способов, хорошо известных из уровня техники, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или в агарозном геле образца белка или нуклеиновой кислоты, с последующей визуализацией путем окрашивания. Если необходимо, для очистки материала может быть использован способ с высокой разрешающей способностью, такой как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), или подобные способы.

Термин «очищенный», как применяется к нуклеиновым кислотам или полипептидам в общем означает нуклеиновую кислоту или полипептид, который является, по существу, свободным от других компонентов, как определено с помощью аналитических способов, хорошо известных из уровня техники (например, очищенный полипептид или полинуклеотид образует дискретную полосу в электрофоретическом геле, хроматографическом элюате и/или среде, подлежащей центрифугированию в градиенте плотности). Например, нуклеиновая кислота или полипептид, которая приводит, по существу, к одной полосе в электрофоретическом геле, является «очищенной». Очищенная нуклеиновая кислота или полипептид является, по меньшей мере, приблизительно 50% чистой, обычно, по меньшей мере, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,5%, приблизительно 99,6%, приблизительно 99,1%, приблизительно 99,8% или более чистой (например, процент по массе на молярной основе). В определенном смысле, изобретение предусматривает способы обогащения композиций одной или больше молекулами в соответствии с изобретением, такими как один или больше полипептидов или полинуклеотидов, для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении. Композицию обогащают молекулой, когда существует значительное возрастание концентрации молекулы после применения методик очистки или обогащения. По существу чистый полипептид или полинуклеотид в соответствии с изобретением (например, по существу чистая вариантная протеаза или полинуклеотида, кодирующий вариантную протеазу в соответствии с изобретением, соответственно) будет, как правило, содержать, по меньшей мере, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98, приблизительно 99%, приблизительно 99,5% или больше по массе (на молярной основе) всех видов макромолекул в конкретной композиции.

В соответствующем смысле, может быть предусмотрен вариант протеазы, полезный в настоящем изобретении, используя способы обогащения композиций одной или больше молекулами в соответствии с изобретением, такими как один или больше полипептидов в соответствии с изобретением (например, одной или больше вариантными протеазами в соответствии с изобретением), или одной или больше нуклеиновыми кислотами, для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении (например, одной или больше нуклеиновыми кислотами, кодирующими одну или больше вариантных протеаз в соответствии с изобретением). Композицию обогащают молекулой, когда существует значительное возрастание концентрации молекулы после применения способа очистки или обогащения. По существу чистый полипептид или полинуклеотид, как правило, будет содержать, по меньшей мере, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98, приблизительно 99%, приблизительно 99,5% или больше по массе (на молярной основе) всех видов макромолекул в конкретной композиции.

Как используется в данной заявке, термин «комбинаторный мутагенез» или «комбинаторный» относится к способам, в которых создаются библиотеки вариантов нуклеиновой кислоты от стандартной последовательности нуклеиновой кислоты. В данных библиотеках, варианты содержат одну или несколько мутаций, выбранных из предварительно определенных серий мутаций. Способы также предусматривают методики введения случайных мутаций, которые не были членами предварительно определенных серий мутаций. Некоторые такие способы включают те, что представлены в патенте США №6,582,914, включенном в данный документ путем ссылки. Некоторые такие способы комбинаторного мутагенеза включают и/или охватывают способы, реализованные в коммерчески доступных наборах (например, QUIKCHANGE® набор для многократно встречающегося направленного мутагенеза (Stratagene), ПЦР слитие/ПЦР удлинение).

Как используется в данной заявке, «имеющий улучшенные свойства», используемый в связи с вариантной протеазой, относится к вариантной протеазе с улучшенной или повышенной моющей или чистящей характеристикой, и/или улучшенной или повышенной стабильностью, необязательно, с сохраненной моющей или чистящей характеристикой, по отношению к соответствующей стандартной протеазе (например, существующей в природе протеазе или протеазе дикого типа). Улучшенные свойства вариантной протеазы могут включать улучшенную моющую или чистящую характеристику и/или улучшенную стабильность. В некоторых вариантах осуществления, изобретение использует вариантные протеазы, которые демонстрируют одно или больше из следующих свойств: улучшенная характеристика для ручной стирки, улучшенная характеристика для ручного или вручную мытья посуды, улучшенная характеристика для машинного мытья посуды, улучшенная характеристика для стирки, и/или улучшенная стабильность по отношению к стандартной протеазе (например, протеазы дикого типа, такой как субтилизин дикого типа).

Как используется в данной заявке, термин «функциональный анализ» относится к анализу, который обеспечивает обнаружение белковой активности. В некоторых вариантах осуществления, термин относится к системам анализа, в которых анализируют белок на его способность функционировать в его обычной емкости. Например, в случае ферментов, функциональный анализ включает определение эффективности фермента в катализируемой реакции.

Как используется в данной заявке, термин «целевое свойство» относится к свойству исходного гена, которое изменяют. Это не означает, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным целевым свойством. Однако, в некоторых вариантах осуществления, целевым свойством является стабильность генного продукта (например, устойчивость к денатурации, протеолизу или другим разрушающим факторам), в тоже время, в других вариантах осуществления, уровень продуцирования в продуцирующем хозяине изменяется.

Термин «свойство», или его грамматические эквиваленты, в контексте нуклеиновой кислоты, как используется в данной заявке, относится к любой характеристике или признаку нуклеиновой кислоты, которые могут быть выбраны или обнаружены. Данные свойства включают, но не ограничиваются приведенным, свойство, воздействующее на связывание с полипептидом, свойство, предоставленное клетке, содержащей конкретную нуклеиновую кислоту, свойство, воздействующее на транскрипцию гена (например, прочность промотора, узнавание промотора, регулирование промотора, функцию энхансера), свойство, воздействующее на процессинг РНК (например, сплайсинг РНК, стабильность РНК, конформацию РНК и пост-транскрипционную модификацию), свойство, воздействующее на трансляцию (например, уровень, регуляцию, связывание мРНК с рибосомными белками, посттрансляционную модификацию). Например, сайт связывания фактора транскрипции, полимеразы, регуляторного фактора и т.д., нуклеиновой кислоты может быть изменен, чтобы получить требуемые характеристики или распознать нежелательные характеристики.

Термин «свойство», или его грамматические эквиваленты, в контексте полипептида (включая белки), как используется в данной заявке, относится к любой характеристике или признаку полипептида, который может быть выбран или обнаружен. Данные свойства включают, но не ограничиваются приведенным, стабильность к окислению, субстратную специфичность, каталитическую активность, ферментную активность, термическую стабильность, стабильность к щелочам, профиль рН активности, устойчивость к протеолитическому разложению, соотношение К_M, k_cat, k_саt/k_M, сворачивание белка, индуцирование иммунного ответа, способность к связыванию с лигандом, способность к связыванию с рецептором, способность быть секретированным, способность быть проявленной на поверхности клетки, способность к олигомеризации, способность к импульсу, способность стимулировать клеточную пролиферацию, способность ингибировать клеточную пролиферацию, способность индуцировать апоптоз, способность быть модифицированной путем фосфорилирования или гликозилирования, и/или способность лечить заболевание и т.д.

Как используется в данной заявке, термин «скрининг» имеет свое обычное значение в данной области техники. В одном иллюстративном процессе скрининга предусматривается мутантная нуклеиновая кислота или вариантный полипептид, кодированный из нее, и оценивается или определяется свойство мутантной нуклеиновой кислоты или вариантного полипептида, соответственно. Определенное свойство мутантной нуклеиновой кислоты или вариантного полипептида может сравниваться со свойством соответствующей предшествующей (родительской) нуклеиновой кислоты или со свойством соответствующего родительского полипептида, соответственно.

Специалисту будет очевидно, процедура скрининга для получения нуклеиновой кислоты или белка с измененным свойством зависит от свойства исходного материала, модификация которого предназначается для способствования генерации мутантной нуклеиновой кислоты. Квалифицированный специалист, поэтому примет во внимание, что изобретение не ограничивается каким-либо конкретным свойством, которое подвергают скринингу, и что следующее описание списка свойств являются только иллюстративными примерами. Способы скрининга любого конкретного свойства в основном описаны в уровне техники. Например, измеренными могут быть связывание, рН, специфичность и т.д., перед и после мутации, где изменение указывает на модификацию. Предпочтительно, скрининги выполняют высокопроизводительным способом, включая различные образцы, которые скринингуют одновременно, включая, но не ограничиваясь приведенным, анализы, использующие чипы, фаговый дисплей и многократные субстраты и/или индикаторы.

Как используется в данной заявке, в некоторых вариантах осуществления, процесс скрининга охватывает одну или больше стадий отбора, в которых представляющие интерес варианты являются обогащенными из популяции вариантов. Примеры данных вариантов осуществления включают отбор вариантов, которые дают преимущество росту организма хозяина, а также фаговый дисплей или любой другой способ отображения, в котором варианты могут быть захвачены из популяции вариантов, основанной на их связывающих или каталитических свойствах. В некоторых вариантах осуществления, библиотека вариантов подвергается воздействию стрессовых нагрузок (например, нагреванию, денатурации и т.д.), и затем варианты, которые являются еще интактными, идентифицируют путем скрининга или обогащают путем отбора. Имеется в виду, что термин охватывает любые приемлемые средства отбора. В действительности, не имеется в виду, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным способом скрининга.

Термины «модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты» и «модифицированный ген» в данной заявке используются взаимозаменяемо и относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, которая включает делецию, вставку или нарушение в существующей в природе (то есть, дикого типа) последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, продукт экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой процессированный белок (например, если модификация является делецией или нарушением последовательности). В некоторых вариантах осуществления, процессированный белок сохраняет биологическую активность. В альтернативных вариантах осуществления, продукт экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой удлиненный белок (например, модификации, содержащие вставки в последовательность нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления, нуклеотидная вставка в последовательность нуклеиновой кислоты приводит к процессированному белку (например, когда вставка в результате приводит к образованию терминирующего кодона). Таким образом, вставка в результате может привести или к процессированному белку, или удлиненному белку, как продукту экспрессии.

«Мутантная» последовательность нуклеиновой кислоты, как правило, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет изменения, по меньшей мере, в одном кодоне, существующем в последовательности дикого типа клетки-хозяина, таким образом, что продукт экспрессии мутантной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой белок с измененной аминокислотной последовательностью по отношению к белку дикого типа. Продукт экспрессии может иметь измененную функциональную способность (например, повышенную ферментную активность).

Как используется в данной заявке, фраза «изменение в субстратной специфичности» относится к изменениям в субстратной специфичности фермента. В некоторых вариантах осуществления, изменение в субстратной специфичности определяют как изменение в k_cat и/или К_m для конкретного субстрата, получающегося в результате мутации фермента или изменения условий реакции. Субстратную специфичность фермента определяют путем сравнения каталитических эффективностей, она проявляется с различными субстратами. Данные определения находят конкретное применение в оценке эффективности мутантных ферментов, так как это, в основном, требуется для продуцирования вариантных ферментов, которые демонстрируют большие соотношения k_cat/K_m для представляющих интерес субстратов. Однако, не имеется в виду, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным составом субстрата или субстратной специфичностью.

Как используется в данной заявке, «свойство поверхности» используют по отношению к электростатическому заряду, а также свойствам, таким как гидрофобность и гидрофильность, демонстрируемые поверхностью белка.

Как используется в данной заявке, термин «суммарный заряд» определяют как сумму всех зарядов, присутствующих в молекуле. «Изменения суммарного заряда» выполняются с молекулой родительского белка, чтобы получить вариант, который имеет суммарный заряд, который отличается от того, который имеет родительская молекула (то есть, вариант имеет суммарный заряд, который не такой, как тот, что у родительской молекулы). Например, замещение нейтральной аминокислоты на отрицательно заряженную аминокислоту или положительно заряженной аминокислоты на нейтральную аминокислоту в результате дает суммарный заряд -1 относительно родительской молекулы. Замещение положительно заряженной аминокислоты на отрицательно заряженную аминокислоту в результате дает суммарный заряд -2 относительно родительской молекулы. Замещение нейтральной аминокислоты на положительно заряженную аминокислоту или отрицательно заряженной аминокислоты на нейтральную аминокислоту в результате дает суммарный заряд +1 относительно родительской молекулы. Замещение отрицательно заряженной аминокислоты на положительно заряженную аминокислоту в результате дает суммарный заряд +2 относительно родительской молекулы. Суммарный заряд родительского белка также может быть изменен путем делеции и/или вставки заряженных аминокислот.

Термины «термически стабильный», и «термостабильный», и «термостабильность» относится к протеазам, которые сохраняют определенное количество ферментной активности после подвергания воздействию определенных температур в течение заданного периода времени при условиях, преобладающих во время протеолитического, гидролизующего, чистящего или другого процесса в соответствии с изобретением, в тоже время, подвергая воздействию измененным температурам. «Измененные температуры» охватывают повышенные или пониженные температуры. В некоторых вариантах осуществления, протеазы сохраняют, по меньшей мере, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% протеолитической активности после подвергания воздействию измененных температур в течение заданного периода времени, например, по меньшей мере, приблизительно 60 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 180 минут, приблизительно 240 минут, приблизительно 300 минут и т.д.

Термин «повышенная стабильность» в контексте окисления, хелатора, термически и/или рН стабильной протеазы относится к более высокой протеолитической активности, сохраняемой в течение времени, по сравнению с другими протеазами (например, субтилизиновыми протеазами) и/или ферментами дикого типа.

Термин «сниженная стабильность» в контексте окисления, хелатора, термически и/или рН стабильной протеазы относится к более низкой протеолитической активности, сохраняемой в течение времени, по сравнению с другими протеазами (например, субтилизиновыми протеазами) и/или ферментами дикого типа.

Термин «чистящая активность» относится к эффективности очистки, досягаемой с помощью вариантной протеазы или стандартной протеазы при условиях, преобладающих во время протеолитического, гидролизующего, чистящего или другого процесса в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления, эффективность очистки вариантной протеазы или стандартной протеазы может быть определена путем использования различных анализов для очистки одного или больше различных пятен, чувствительных к ферменту, на отдельном предмете или поверхности (например, пятно, которое является результатом от пищи, травы, крови, чернил, молока, масла и/или яичного белка). Эффективность очистки вариантной или стандартной протеазой может быть определена путем подвергания пятна на отдельном предмете или поверхности стандартному(ым) условию(ям) стирки и оценки степени, до которой пятно удаляется, путем использования различных хроматографических, спектрофотометрических или других количественных методик. Иллюстративные анализы и способы очистки известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются приведенным, те, которые описаны в WO 99/34011 и патенте США 6,605,458, оба из которых включены в данную заявку путем ссылки, а также те анализы и способы очистки, которые включены в примеры, представленные ниже.

Термин «эффективное количество для очистки» вариантной протеазы или стандартной протеазы относится к количеству протеазы, которое достигает желаемого уровня ферментной активности в конкретной чистящей композиции. Такие эффективные количества легко устанавливаются специалистом в данной области техники и основываются на многих факторах, таких как используемая конкретная протеаза, применяемая очистка, определенный состав чистящей композиции, и требуется жидкая или сухая (например, гранула, таблетка, кусок) композиция и т.д.

Термин «вспомогательное вещество» относится к любому жидкому, твердому газообразному веществу, включенному в композицию для очистки и/или обработки, другому, чем вариантная протеаза в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления, композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат одно или больше чистящих вспомогательных веществ. Каждое дополнительное вспомогательное вещество обычно выбирают в зависимости от определенного типа и формы чистящей композиции (например, композиция в виде жидкости, гранулы, порошка, куска, пасты, спрея, таблетки, геля, пены или другого). Предпочтительно, каждое чистящее вспомогательное вещество является совместимым с протеазным ферментом, используемым в композиции.

Термин «повышенная эффективность» в контексте чистящей активности относится к повышенной или большей чистящей активности фермента на определенных пятнах, чувствительных к ферменту, таких как пятна от яйца, молока, травы, чернила, масла и/или крови, как определено путем обычной оценки после стандартного цикла стирки и/или многократных циклов стирки.

Термин «сниженная эффективность» в контексте чистящей активности относится к пониженной или меньшей чистящей активности фермента на определенных пятнах, чувствительных к ферменту, таких как пятна от яйца, молока, травы или крови, как определено путем обычной оценки после стандартного цикла стирки.

Термин «сравнительная эффективность» в контексте чистящей активности вариантной протеазы в соответствии с изобретением относится к, по меньшей мере, приблизительно 60%, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 75%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 91%, по меньшей мере, приблизительно 92%, по меньшей мере, приблизительно 93%, по меньшей мере, приблизительно 94%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 96%, по меньшей мере, приблизительно 97%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99%, по меньшей мере, приблизительно 99,5% чистящей активности сравнительной или стандартной протеазы (например, коммерчески доступные протеазы), включая, но не ограничиваясь приведенным, например, OPTIMASE™ протеазу (Genencor), PURAFECT™ протеазные продукты (Genencor), SAVINASE™ протеазу (Novozymes), BPN'-варианты (см., например, патент США № Re 34,606), RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ протеазу (Novozymes), MAXACAL™, МАХАРЕМ™, PROPERASE™ протеазы (Genencor; см. также, патент США № Re 34,606, и патенты США №№5,700,676; 5,955,340; 6,312,936; и 6,482,628), и В. lentus продукты вариантной протеазы (например, те, которые описаны в WO 92/21760, WO 95/23221 и/или WO 97/07770). Эффективность очистки может быть определена путем сравнения вариантных протеаз в соответствии с настоящим изобретения со стандартными субтилизиновыми протеазами в различных анализах очистки касательно пятен, чувствительных к ферменту, таких как пятна от травы, крови, чернила, масла и/или молока, как определено путем обычных спектрофотометрических или аналитических методологий после цикла стирки в стандартных условиях.

Как используется в данной заявке, термин «потребительский продукт» означает продукт по уходу за тканью и домом. Как используется в данной заявке, термин «продукт по уходу за тканью и домом» или «продукт по уходу за тканью и бытом» включает продукты, в основном, предназначенные для того, чтобы быть использованными или потребленными в форме, в которой они продаются, и которая предназначена для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей, и все чистящие системы для ухода и очистки неживых поверхностей, а также кондиционирующие продукты для ткани и другие продукты, созданные специально для ухода и сохранения тканей, и продукты по уходу за воздухом, включая: по уходу за воздухом, включая освежители воздуха и системы доставки аромата, по уходу за автомобилями, по уходу за домашними животными, по уходу за животными, средства личной гигиены, по уходу за ювелирными изделиями, для мытья посуды, для кондиционирования ткани (включая смягчение и/или освежение), для моющего действия при стирке, для добавок и/или уходу при стирке и полоскании, чистящие композиции для предварительной обработки, для очистки и/или обработки твердой поверхности, включая очистители для пола и унитаза, очистители и/или средства для обработки стекла, очистители и/или средства для обработки кафеля, очистители и/или средства для обработки керамики, и другие чистящие средства для потребительского использования или использования в учреждениях. В некоторых вариантах осуществления, продукты по уходу за тканями и домом являются пригодными для использования на ранах и/или коже. «Продукт по уходу за тканями и домом» включает потребительские продукты и продукты для учреждений.

Как используется в данной заявке, термин «продукты по уходу не за тканями и домом» относится к композициям, которые добавляют к другим композициям, чтобы получить конечный продукт, который может быть продуктом по уходу за тканями и домом.

Как используется в данной заявке, термин «чистящая композиция для учреждений» относится к продуктам, пригодным для использования в учреждениях включая, но не ограничиваясь приведенным, школы, больницы, заводы, хранилища, корпорации, строительства, рестораны, офисные комплексы и сооружения, технологические и/или производственные предприятия, ветеринарные больницы, агропромышленные фермы, фермерские предприятия и т.д.

Как используется в данной заявке, термин «композиция для очистки и/или обработки» представляет собой подгруппу продуктов по уходу за тканями и домом, которая включает, если не указано другое, композиции, пригодные для очистки и/или обработки отдельных предметов. Такие продукты включают, но не ограничиваются этим, продукты для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей в области по уходу за тканями и домом, включая: по уходу за воздухом, включая освежители воздуха и системы доставки аромата, по уходу за автомобилями, для мытья посуды, для кондиционирования ткани (включая смягчение и/или освежение), для моющего действия при стирке, для добавок и/или уходу при стирке и полоскании, для очистки и/или обработки твердой поверхности, включая очистители для пола и унитаза, гранулированные или порошкообразные универсальные или «высокопроизводительные» моющие агенты, главным образом, чистящие моющие средства; жидкие, геле- или пастообразные универсальные моющие агенты, главным образом, так называемые высокопроизводительные жидкие типы; жидкие высокоструктурные моющие средства; моющие агенты для ручного мытья посуды или облегченные моющие агенты для мытья посуды, главным образом, тип с высоким пенообразованием; агенты для машинного мытья посуды, включая различные таблетки, гранулы, жидкости и ополаскиватели для использования в быту и на производстве: шампуни для автомобиля или ковра, очистители для ванной комнаты, включая очистители для унитаза; а также чистящие вспомогательные устройства, такие как отбеливающие добавки и «стики для выведения пятен» или типы для предварительной обработки, нагруженные на субстрат продукты, такие как салфетки, добавляемые при сушке.

В действительности, как используется в данной заявке, «чистящая композиция» или «чистящий состав» в соответствии с изобретением относится к любой композиции в соответствии с изобретением, полезной для удаления или устранения соединения (например, нежелательного соединения) с объекта, отдельного предмета или поверхности, которые чистят, включая, но не ограничиваясь приведенным, например, ткань, тканевой предмет, предмет посуды, предмет столовой посуды, предмет стеклянной посуды, контактные линзы, другой твердый субстрат, волосы (шампунь) (включая волосы человека или шерсть животного), кожу (мыло и/или крем), зубы (ополаскиватель для полости рта, зубные пасты), поверхность отдельного предмета или объекта (например, твердые поверхности, такие как твердая поверхность стола, верхняя рабочая поверхность стола, стена, предмет мебели, пол, потолок, предмет, не относящийся к посуде, предмет, не относящийся к столовой посуды и т.д.), фильтры, мембраны (например, мембраны для фильтрации, включая, но не ограничиваясь приведенным, ультрафильтрационные мембрана) и т.д. Термин охватывает любой материал и/или дополнительное соединение, выбранное для конкретного типа желаемой чистящей композиции и формы продукта (например, жидкой, гелевой, гранулированной, в виде спрея или другой композиции), так что композиция является совместимой с протеазой и другим(и) ферментом(ами), используемыми в композиции. Конкретный выбор чистящих композиционных материалов легко делают, принимая во внимание поверхность, объект, отдельный предмет или ткань, которые подвергают очистке, и требуемую форму композиции для условий очистки во время использования.

Чистящие композиции и чистящие составы включают любую композицию, которая является подходящей для очистки, отбеливания, дезинфицирования и/или стерилизации любого объекта, отдельного предмета и/или поверхности. Такие композиции и составы включают, но не ограничиваются приведенным, например, жидкие и/или твердые композиции, включая чистящие композиции или композиции моющих средств (например, композиции в виде жидкости, таблетки, геля, куска, гранулы и/или в виде твердых чистящих композиций для стирки или композиций моющих средств) и композиции моющих средств для тонких тканей; чистящие композиции и составы для твердой поверхности, такой как для стекла, дерева, керамических и металлических столешниц и окон; очистители для ковра; очистители для духовок; освежители для тканей; смягчители для тканей; и текстиля, композиции для стирки с усилителями действия чистящего или моющего средства, чистящие композиции с добавкой для стирки и чистящие композиции для стирки для предупреждения пятен; композиции для мытья посуды, включая композиции для ручного или вручную мытья посуды (например, моющие средства «ручного» или «вручную» мытья посуды) и композиции для автоматического мытья посуды (например, «моющие средства для автоматического мытья посуды»).

Чистящая композиция или чистящие составы, как используется в данной заявке, включают, если не указано другое, гранулярные или порошкоподобные универсальные или высокопроизводительные моющие агенты, главным образом чистящие моющие средства; жидкие, гранулированные, гелевые, твердые, таблетированные или пастообразные универсальные моющие агенты, главным образом так называемые типы высокопроизводительного жидкого (HDL) моющего средства или высокопроизводительного порошкового моющего средства (HDD); жидкие моющие средства для тонких тканей; моющие агенты для ручного или вручную мытья посуды, включая тип с высоким пенообразованием; моющие агенты для ручного или вручную мытья посуды, автоматического мытья посуды, или посуды, или столовой посуды, включая различные типы таблетки, порошка, твердого вещества, гранулы, жидкости, геля и ополаскивателя для использования в быту и промышленности; жидкие чистящие и дезинфицирующие агенты, включая антибактериальные типы для стирки вручную, чистящие куски, ополаскиватели для полости рта, очищающие средства для зубов и полости рта, шампуни для автомобилей, шампуни для ковров, очистители для ванной комнаты; шампуни для волос и/или ополаскиватели для волос для людей и других животных; гели для душа и пены для ванн, и очистители металла; а также чистящие вспомогательные средства, такие как отбеливающие добавки и «стики для выведения пятен» или типы для предварительной обработки. В некоторых вариантах осуществления, гранулированные композиции находятся в «компактной» форме; в некоторых вариантах осуществления, жидкие композиции находятся в «концентрированной» форме.

Как используется в данной заявке, «чистящие композиции для тканей» включают композиции моющего средства для ручной и машинной стирки, включая композиции с добавками для стирки и композиции, подходящие для использования при замачивании и/или предварительной обработки пятен на тканях (например, одежде, белье и других текстильных материалах).

Как используется в данной заявке, «чистящие композиции не для тканей» включают чистящие композиции для нетекстильной (то есть, нетканой) поверхности, включая, но не ограничиваясь приведенным, например, композиции моющего средства для ручной или вручную, или автоматического мытья посуды, чистящие композиции для ротовой полости, чистящие средства для зубов и полости рта и чистящие композиции для личной гигиены.

Как используется в данной заявке, термин «композиция для очистки и/или обработки ткани и/или твердой поверхности» представляет подгруппу композиций для очистки и обработки, которая включает, если не указано другое, гранулированные или порошкообразные универсальные или «высокопроизводительные» моющие агенты, главным образом чистящие моющие средства; жидкие, гелевые или пастообразные универсальные моющие агенты, главным образом так называемые высокопроизводительные жидкие типы; жидкие моющие средства для тонких тканей; моющие агенты для ручного мытья посуды или облегченные моющие агенты для мытья посуды, главным образом, типа с высоким пенообразованием; моющие агенты для машинного мытья посуды, включая различные типы - таблетки, гранулы, жидкости или ополаскиватели для использования в быту и промышленности; жидкие чистящие и дезинфицирующие агенты, шампуни для автомобиля или ковра, очистители для ванной комнаты, включая очистители для унитаза; кондиционирующие продукты для тканей, включая смягчитель и/или освежитель, который может быть в форме жидкости, твердого вещества и/или салфеток для сушки; а также чистящие вспомогательные средства, такие как отбеливающие добавки и «стики для выведения пятен» или типы для предварительной обработки, нагруженные на субстрат продукты, такие как салфетки, добавляемые при сушке. Все из таких продуктов, которые являются приемлемыми, могут быть в стандартной, концентрированной или даже высококонцентрированной форме, даже при условии, что такие продукты, в определенном аспекте, могут быть неводными.

Как используется в данной заявке, термин «композиция моющего средства» или «состав моющего средства» используют по отношению к композиции, предназначенной для использования в моющей среде для очистки загрязненных или грязных объектов, включая определенные тканевые и/или нетканевые объекты или отдельные предметы. Такие композиции в соответствии с настоящим изобретением не ограничиваются какой-либо конкретной композицией или составом моющего средства. В действительности, в некоторых вариантах осуществления, моющие средства в соответствии с изобретением содержат, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с изобретением и, кроме того, одно или больше поверхностно-активных веществ, трансферазу, гидролитические ферменты, оксидоредуктаз, моющие компоненты (например, солевой моющий компонент), отбеливающие агенты, активаторы отбеливания, подсинивающие агенты, флуоресцентные красители, ингибиторы слеживания, маскирующие агенты, ферментные активаторы, антиоксиданты и/или солюбилизаторы. В некоторых случаях, солевой моющий компонент представляет собой смесь силикатной соли и фосфатной соли, предпочтительно, с большим содержанием силиката (например, метасиликата натрия), чем фосфата (например, триполифосфата натрия). Некоторые композиции в соответствии с изобретением, такие как, но не ограничиваясь приведенным, чистящие композиции или композиции моющего средства, не содержат фосфата (например, фосфатной соли или фосфатного моющего компонента).

Как используется в данной заявке, термин «отбеливающий» относится к обработке материала (например, ткани, белья, древесной массы и т.д.) или поверхности в течение достаточной продолжительности времени и/или при соответствующем рН и/или температурных условиях, чтобы осуществить осветление (то есть, отбеливание) и/или очистку материала. Примеры химических веществ, подходящих для отбеливания, включают, но не ограничиваются приведенным, например, ClO₂, Н₂О₂, перкислоты, NO₂ и т.д.

Как используется в данной заявке, «эффективность мытья» протеазы (например, вариантной протеазы в соответствии с изобретением) относится к вкладу вариантной протеазы в мытье, что обеспечивает дополнительную эффективность очистки для моющего средства по сравнению с моющим средством без добавления вариантной протеазы к композиции. Эффективность мытья сравнивают при соответствующих условиях мытья. В некоторых системах тестирования другими соответствующими факторами, такими как композиция моющего средства, концентрация пены, жесткость воды, стиральные механизмы, время, рН и/или температура, можно управлять таким способом, чтобы имитировать условия, типичные для применения в быту в определенном сегменте рынка (например, ручного или вручную мытья посуды, автоматического мытья посуды, очистки посуды, очистки столовой посуды, чистки ткани и т.д.).

Термин «соответствующие условия мытья» используют в данной заявке для указания условий, в частности температуры мытья, времени, стиральных механизмов, концентрации пены, типа моющего средства и жесткости воды, фактически используемых в домашнем хозяйстве при ручном мытье посуды, автоматическом мытье посуды, или сегменте рынка моющих средств для стирки.

Термин «улучшенная эффективность мытья» используются, чтобы показать, что лучший конечный результат получают при удалении пятна при соответствующих условиях мытья, или что необходимо меньшее количество вариантной протеазы, на основе массы, для получения одинакового конечного результата по отношению к соответствующей протеазе дикого типа или исходной родительской протеазе.

Как используется в данной заявке, термин «дезинфицирующий» относится к удалению загрязнений с поверхности, а также ингибированию или уничтожению микробов на поверхности отдельных предметов. Не имеется в виду, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной поверхностью, отдельным предметом или загрязняющим(и) веществом(ами) или микробами, которые удаляют.

«Компактная» форма чистящей композиции в данной заявке наилучшим образом отражается посредством плотности и, в условиях композиции, по количеству неорганических солей-наполнителей. Неорганические соли-наполнители являются традиционными ингредиентами композиций моющего средства в порошковой форме. В традиционных композициях моющего средства, соли-наполнители присутствуют в значительных количествах, как правило, от приблизительно 17 до приблизительно 35% по массе общей композиции. В противоположность этому, в компактных композициях, соль-наполнитель присутствуют в количествах, не превышающих приблизительно 15% от общей композиции. В некоторых вариантах осуществления, соль-наполнитель присутствуют в количествах, которые не превышают приблизительно 10%, или более предпочтительно, приблизительно 5%, по массе общей композиции. В некоторых вариантах осуществления, неорганические соли-наполнители выбраны из солей щелочных и щелочно-земельных металлов сульфатов и хлоридов. В некоторых вариантах осуществления, солью-наполнителем является сульфат натрия.

Положение аминокислотного остатка в заданной аминокислотной последовательности, как правило, нумеруется в данной заявке, используя нумерацию положения соответствующего аминокислотного остатка аминокислотной последовательности В. amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность В. amyloliquefaciens субтилизина BPN' SEQ ID NO: 1, таким образом, служит в качестве стандартной последовательности. Заданная аминокислотная последовательность, такая как аминокислотная последовательность вариантной протеазы, описанная в данной заявке, может быть выравнена с BPN' последовательностью (SEQ ID NO: 1), используя алгоритм выравнивания, как описано в данной заявке, и аминокислотный остаток в заданной аминокислотной последовательности, которую выравнивают (предпочтительно оптимально выравнивают) с аминокислотным остатком в BPN' последовательности, может быть легко пронумерован по отношению к соответствующему аминокислотному остатку в последовательности субтилизина BPN'. Альтернативно, если положения аминокислотных остатков последовательностей вариантной протеазы субтилизина нумеруют, используя фактическую нумерацию положения аминокислотных остатков в GG36 аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2), а не по отношению к соответствующим аминокислотным положениям в BPN' последовательности при выравнивании, вариантная протеаза субтилизина может быть описана, как вариантная протеаза из GG36 протеазы, представленной в SEQ ID NO: 2.

В основном, номенклатура, используемая в данной заявке, и большинство лабораторных процедур в клеточной культуре, молекулярной генетике, молекулярной биологии, химии нуклеиновых кислот и химии белков, описанных ниже, хорошо известны и широко применяются специалистами в данной области техники. Способы получения и манипуляции способами рекомбинантных нуклеиновых кислот, синтез нуклеиновых кислот, способы для клеточных культур и трансгенные внедрения (например, трансфекция, электропорация) хорошо известны специалисту в данной области техники и описаны в ряде стандартных учебников. Стадии синтеза и очистки олигонуклеотида, как правило, выполняют в соответствии с техническими условиями. Способы и методики, в основном, осуществляют в соответствии с традиционными способами, хорошо известными из уровня техники и с разных основных ссылок, которые предусмотрены в данной заявке. Полагается, что методики хорошо известны специалисту в данной области техники и обеспечивают удобство для читателя. Полипептиды для использования в настоящем изобретении Настоящее изобретение включает один или больше вариантов протеазы, то есть новый полипептид, который может быть собирательно назван, как «полипептиды для использования в настоящем изобретении». Полипептиды для использования в настоящем изобретении включают выделенные, рекомбинантные, по существу чистые, или несуществующие в природе вариантные протеазные полипептиды, включая например, вариантные полипептиды субтилизина, имеющие ферментную активность (например, протеолитическую активность). В некоторых вариантах осуществления полипептид, такой как вариант субтилизина, или вариант GG36, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2, имеет улучшенную эффективность очистки по сравнению с родительской, например, GG36 протеазой, имеющей последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления полипептид является полезным для применений в очистке и может быть включен в чистящие композиции, которые являются полезными в способах очистки отдельного предмета или поверхности (например, поверхности отдельного предмета), которая нуждается в очистке.

В некоторых вариантах осуществления, вариантная протеаза для использования в настоящем изобретении содержит «вариантный субтилизин». В некоторых вариантах осуществления, изобретение использует «Bacillus sp. вариантную протеазу». В некоторых вариантах осуществления, изобретение использует «Bacillus sp. вариантный субтилизин». В некоторых вариантах осуществления, изобретение использует выделенный вариант субтилизина. В некоторых вариантах осуществления изобретение использует выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, где указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В любом из упомянутых выше вариантов осуществления, изобретение может включать выделенную, рекомбинантную, по существу чистую или не существующую в природе вариантную протеазу, имеющую протеолитическую активность, полипептид которой содержит полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 86%, по меньшей мере, приблизительно 87%, по меньшей мере, приблизительно 88%, по меньшей мере, приблизительно 89%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 91%, по меньшей мере, приблизительно 92%, по меньшей мере, приблизительно 93%, по меньшей мере, приблизительно 94%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 96%, по меньшей мере, приблизительно 97%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99%, по меньшей мере, приблизительно 99,5% или 100% идентичность последовательности к аминокислотным последовательностям, кодирующим вариантные протеазы, предусмотренные в данной заявке.

Как отмечено выше, полипептиды вариантной протеазы имеют ферментные активности (например, протеолитические активности) и, таким образом, являются полезными в настоящем изобретении, в применениях для очистки, включая, но не ограничиваясь приведенным, способах очистки отдельных предметов посуды, столовых приборов, тканей и предметов, имеющих твердые поверхности (например, твердой поверхности стола, верхней рабочей поверхности стола, стены, мебели, пола, потолка и т.д.). Иллюстративные чистящие композиции, содержащие один или больше полипептидов вариантной протеазы, описаны ниже. Ферментная активность (например, протеазная активность) полипептида вариантной протеазы в соответствии с настоящим изобретением может быть легко определена, используя методики, хорошо известные специалисту в данной области техники. Примеры, представленные ниже, описывают способы оценки ферментной активности, эффективности очистки и/или продуктивности мытья. Эффективность вариантных протеаз в соответствии с настоящим изобретением при удалении пятен (например, белкового пятна), очистке твердых поверхностей или очистке стиркой, посуды или столового(ых) предмета(ов) может быть легко определена, используя методики, хорошо известные из уровня техники, и/или путем использования методик, представленных в Примерах.

Полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть подвергнут различным изменениям, таким как одна или больше аминокислотных вставок, делеций и/или замен, либо консервативных, либо неконсервативных, включая случаи, когда такие изменения значительно не меняют ферментную активность полипептида. Аналогично, нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением также может быть подвергнута различным изменениям, таких как одна или более замен в одной или больше нуклеиновой кислоте в одном или больше кодонах таким образом, что определенный кодон кодирует одну и ту же или разную аминокислоту, давая в результате или «молчащую» вариацию (например, мутация в нуклеотидной последовательности в результате дает «молчащую» мутацию в аминокислотной последовательности, например, когда кодированная аминокислота не изменяется путем мутации нуклеиновой кислоты), или «немолчащую» вариацию, одну или больше делеций в последовательности одной или больше нуклеиновых кислот (или кодонов), одно или больше прибавлений или вставок одной или больше нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности, и/или отщепление одного или больше усечений одной или больше нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности. Многие такие изменения в последовательности нуклеиновой кислоты по существу не меняют ферментную активность полученной кодированной вариантной протеазы по сравнению с вариантной протеазой, кодированной при помощи исходной последовательности нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, может быть модифицирована, чтобы включить один или больше кодонов, которые обеспечивают оптимальную экспрессию в экспрессионной системе (например, бактериальная экспрессионная система), в тоже время, если требуется, указанный один или больше кодонов все еще кодируют одинаковую(ые) аминокислоту(ы).

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает род полипептидов, содержащий полипептиды вариантной протеазы, которые имеют требуемую ферментную активность (например, активность протеазы или активность эффективной очистки), которые содержат последовательности, имеющие аминокислотные замены, описанные в данной заявке, и, кроме того, которые содержат одну или более дополнительных аминокислотных замен, таких как консервативные и неконсервативные замены, в которых полипептид демонстрирует, сохраняет или приблизительно сохраняет требуемую ферментную активность (например, активность протеазы или активность субтилизина, как отображено в чистящей активности или эффективности вариантной протеазы). Аминокислотные замены в соответствии с изобретением могут включать, но не ограничивается приведенным, одну или более неконсервативных замен и/или одну или более консервативных аминокислотных замен. Консервативная замена аминокислотного остатка, как правило, включает обмен члена в одном функциональном классе аминокислотного остатка на остаток, который принадлежит к тому же функциональному классу (идентичные аминокислотные остатки считаются функционально гомологичными или сохранившими расчетный процент функциональной гомологии). Консервативная аминокислотная замена, как правило, включает замену аминокислоты в аминокислотной последовательности на функционально подобную аминокислоту. Например, аланин, глицин, серии и треонин являются функционально подобными и, таким образом, могут служить в качестве консервативных аминокислотных замен друг друга. Аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота могут служить в качестве консервативных замен друг друга. Аспарагин и глутамин могут служить в качестве консервативных замен друг друга. Аргинин, лизин и гистидин могут служить в качестве консервативных замен друг друга. Изолейцин, лейцин, метионин и валин могут служить в качестве консервативных замен друг друга. Фенилаланин, тирозин и триптофан могут служить в качестве консервативных замен друг друга.

Могут быть предвидены другие группы консервативных аминокислотных замен. Например, аминокислоты могут быть сгруппированы по подобной функции или химической структуре, или составу (например, кислотная, основная, алифатическая, ароматическая, серосодержащая). Например, алифатическое группирование может содержать: Глицин (G), Аланин (А), Валин (V), Лейцин (L), Изолейцин (I). Другие группы, содержащие аминокислоты, которые рассматриваются в качестве консервативных замен друг друга, включают: ароматические: Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); серосодержащие: Метионин (М), Цистеин (С); основные: Аргинин (R), Лизин (К), Гистидин (Н); кислотные: Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (Е); неполярные незаряженные остатки: Цистеин (С), Метионин (М) и Пролин (Р); гидрофильные незаряженные остатки: Серии (S), Треонин (Т), Аспарагин (N) и Глутамин (Q). Дополнительные группирования аминокислот хорошо известны специалисту в данной области техники и описаны в различных стандартных учебниках. Перечисление полипептидной последовательности в данной заявке, вместе с указанными выше группами замен, обеспечивает перечисление экспрессии всех консервативно замещенных полипептидных последовательностей.

Более консервативные замены существуют внутри классов аминокислотных остатков, описанных выше, которые также или альтернативно могут быть приемлемыми. Консервативные группы для замен, которые являются более консервативными, включают: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления, изобретение обеспечивает выделенный или рекомбинантный полипептид вариантной протеазы (например, вариантный субтилизин), имеющий протеолитическую активность, при этом указанный полипептид вариантной протеазы содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 99,5% идентичность последовательности к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Не предполагают, что консервативная замена одной аминокислоты на другую в вариантной протеазе в соответствии с изобретением значительно изменит ферментную активность или активность эффективности очистки вариантной протеазы. Ферментная активность или активность эффективности очистки полученной в результате протеазы может быть легко определена, используя стандартные анализы и анализы, описанные в данной заявке.

Консервативно замены вариации полипептидной последовательности в соответствии с изобретением (например, вариантные протеазы в соответствии с изобретением) включает замены с малым процентом, иногда меньше, чем приблизительно 25%, приблизительно 20%, приблизительно 15%, приблизительно 14%, приблизительно 13%, приблизительно 12%, приблизительно 11%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7% или приблизительно 6% аминокислот полипептидной последовательности или меньше, чем приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1%, аминокислот полипептидной последовательности, на консервативно выбранную аминокислоту из такой же группы консервативной замены.

Как описано еще где-то в данной заявке более детально и в Примерах, обеспеченных в данной заявке, полипептиды для использования в изобретении могут иметь чистящую способность, которая может быть сравнима с известными протеазами, включая известные субтилизины. Иллюстративные известные протеазы субтилизина включают, но не ограничиваются приведенным, например, В. lentus субтилизин GG36, В. amyloliquefaciens субтилизин BPN', В. amyloliquefaciens субтилизин BPN'-Y217L и В. clausii РВ92. Аминокислотной последовательностью зрелого белка В. lentus субтилизина GG36 является:

Аминокислотной последовательностью зрелого белка В. amyloliquefaciens субтилизина BPN' является:

Настоящее изобретение может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях (Список 2), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из (Список 3), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из N018R+N076D+A215F или N018R+N076D+G211Q (Список 5), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из S101N+V104I+A232V, S101N+S103A+V104I, S101N+S103A+A232V или S101N+S103A+V104I+A232V (Список 6), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях S101N+S103A+V104I+A232V (Список 7), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: l.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из S101N+V104I+A232V, S101N+S103A+V104I или S101N+S103A+A232V (Список 8), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

(Список 9), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

или (Список 10), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

или

T022A+G159D+S188D+A232V+E271F (Список 11), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: l.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

или (Список 12), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из S103A+V104I+S188D, S188D+Q245R+N248D, S103A+S188D+Q245R, или (Список 13), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: l.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из S101G-

(Список 14), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

(Список 15), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

(Список 16), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

или (Список 17), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

или (Список 18), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из

(Список 19), и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать любые указанные выше выделенные варианты субтилизина, при этом вариант субтилизина является вариантом протеазы Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, где указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2, и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 1, и причем аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 2, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 3, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 4, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 5, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 6, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 7, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 8, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 9, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 10, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: l.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 11, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 12, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 13, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 14, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 15, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 16, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 17, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 18, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 19, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 85% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 90% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 95% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 98% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 99% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать любой из выделенных вариантов субтилизинов, перечисленных выше, при этом общий суммарный заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 относительно общего суммарного заряда Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы. В некоторых вариантах осуществления, общий суммарный заряд получен путем одной или более замен, выбранных из: и при этом аминокислотные положения варианта протеазы, более конкретно вариантов субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенные варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина, при этом указанный вариант протеазы, более конкретно варианты субтилизина, имеет, по меньшей мере, одну или даже две, или больше заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из А273Е и/или R275H/S, предпочтительно, имеющих заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно, 0, -1, -2 или -3, наиболее предпочтительно, -1 или -2 относительно фермента SEQ ID NO: 1. Указанные варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина также могут включать любой из вариантов, перечисленных в заявке.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать выделенные варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина, при этом указанный вариант протеазы, более конкретно варианты субтилизина, имеет одну или две, или больше заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из предпочтительно, имеющих заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно +1, +2 или +3, наиболее предпочтительно +2 относительно фермента SEQ ID NO: 1. Указанные варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина, также могут включать любой из вариантов, перечисленных в заявке.

В некоторых вариантах осуществления, любой из перечисленных выше выделенных вариантов субтилизина может быть введен в композицию моющего средства, подходящую для добавления к воде, с получением моющего раствора, имеющего низкую ионную силу или низкую концентрацию моющего средства. Таким образом, в предпочтительном аспекте изобретения, данные варианты будут образовывать часть композиции моющего средства, которое добавляют в воду, или для ручной стирки, или процесса машинной стирки, как правило, в стиральной машине, с образованием моющего раствора, удельная проводимость которого составляет от приблизительно 0,1 мСм/см до приблизительно 3 мСм/см, от приблизительно 0,3 мСм/см до приблизительно 2,5 мСм/см, или даже от приблизительно 0,5 мСм/см до приблизительно 2 мСм/см. Предпочтительные варианты для использования с низкой ионной силой или низкой концентрацией моющего средства выбраны из вариантов любого из списков 9, 14, 15 или 16, предпочтительно списка 14 или 15, наиболее предпочтительно списка 15, приведенного выше.

Не желая быть связанными теорией, предполагают, что данные мутации для достижения желаемого суммарного заряда обеспечивают повышенную общую эффективность протеазы путем обеспечения оптимального заряда молекулы для состояний с низкой ионной силой, или моющих растворов, содержащих низкую концентрацию моющего средства - это существует только вследствие точной комбинации определенных мутаций, из которых они являются предпочтительными, так что могут быть получены такие предпочтительные протеазы.

В некоторых вариантах осуществления, любой из перечисленных выше выделенных вариантов субтилизина может быть введен в композицию моющего средства, подходящую для добавления к воде, с получением моющего раствора, имеющего высокую ионную силу или высокую концентрацию моющего средства. Таким образом, в предпочтительном аспекте изобретения, данные варианты будут образовывать часть композиции моющего средства, которое добавляют в воду, или для ручной стирки или процесса машинной стирки, как правило, в стиральной машине, с образованием моющего раствора, удельная проводимость которого составляет от выше приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см, или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см. Предпочтительные варианты для использования в композиции с высокой ионной силой или с высокой концентрацией моющего средства выбраны из вариантов любого списков 1 или 17, 18 или 19, предпочтительно списка 17 или 18, наиболее предпочтительно списка 17, приведенного выше.

Предпочтительно данные протеазы образуют часть композиции моющего средства, которую добавляют к воде при ручной стирке или процессе машинной стирки, как правило, в стиральной машине, с образованием моющего растовра, удельная проводимость которого составляет от выше приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см.

Не желая быть связанными теорией, предполагают, что данные мутации для достижения желаемого суммарного заряда обеспечивают повышенную общую эффективность протеазы в состояниях с высокой ионной силой или высокой концентрацией моющего средства - это существует только вследствие точной комбинации определенных мутаций, из которых они являются предпочтительными, так что могут быть получены такие предпочтительные протеазы.

Настоящее изобретение, кроме того, может содержать любой из выделенных вариантов субтилизина, перечисленных выше, имеющих одну или больше из следующих характеристик: а) индекс эффективности способа тестирования 2, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8, или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) индекс эффективности способа тестирования 3, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8, или даже от 1,1 до приблизительно 5; с) индекс эффективности способа тестирования 4, по меньшей мере, 1,0, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) индекс эффективности способа тестирования 6, по меньшей мере, 1,0, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или е) индекс эффективности способа тестирования 7, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 15, от 1,1 до приблизительно 10, или даже от 1,1 до приблизительно 7. Способ тестирования 2, способ тестирования 3, способ тестирования 4, способ тестирования 6 и способ тестирования 7 детально описаны ниже в разделе Примера 1, озаглавленном «Способы тестирования».

Нуклеиновые кислоты для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении

В данной заявке описаны выделенные, несуществующие в природе или рекомбинантные нуклеиновые кислоты (также называемые в данной заявке как «полинуклеотиды»), которые собирательно могут упоминаться как «нуклеиновые кислоты для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении» или «полинуклеотиды для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении», которые кодируют полипептиды для использования в настоящем изобретении. Нуклеиновые кислоты для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении, включая все описанное ниже, являются полезными в рекомбинантном продуцировании (например, экспрессии) полипептидов для использования в настоящем изобретении, как правило, через экспрессию плазмидного вектора экспрессии, содержащего последовательность, кодирующую полипептид, представляющий интерес, или его фрагмент. Как обсуждалось выше, полипептиды включают полипептиды вариантной протеазы, включая полипептиды вариантного субтилизина, имеющие ферментную активность (например, протеолитическую активность), которые являются полезными в применениях для очистки и в чистящих композициях для очистки отдельного предмета или поверхности (например, поверхности предмета), которые нуждаются в очистке.

В данной заявке описаны выделенные, рекомбинантные, по существу чистые или несуществующие в природе нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую любой полипептид (включая любой слитый белок и т.д.) в соответствии с изобретением, описанный выше в разделе, озаглавленном «полипептиды для использования в настоящем изобретении» и где-либо еще в данной заявке. Кроме того, в данной заявке раскрыта выделенная, рекомбинантная, по существу чистая или несуществующая в природе нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующая комбинацию двух или более любых полипептидов в соответствии с изобретением, описанных выше и где-либо еще в данной заявке.

Кроме того, описана выделенная, рекомбинантная, по существу чистая или несуществующая в природе нуклеиновая кислота, содержащая полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариантную протеазу для использования в настоящем изобретении, имеющую протеолитическую активность, при этом указанная вариантная протеаза (например, вариантный субтилизин) содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 не больше, чем на 50, не больше, чем на 40, не больше, чем на 30, не больше, чем на 35, не больше, чем на 25, не больше, чем на 20, не больше, чем на 19, не больше, чем на 18, не больше, чем на 17, не больше, чем на 16, не больше, чем на 15, не больше, чем на 14, не больше, чем на 13, не больше, чем на 12, не больше, чем на 11, не больше, чем на 10, не больше, чем на 9, не больше, чем на 8, не больше, чем на 7, не больше, чем на 6, не больше, чем на 5, не больше, чем на 4, не больше, чем на 3, не больше, чем на 2 или не больше, чем на 1 аминокислотный(ые) остаток(и), причем аминокислотные положения вариантного субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN'.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 1, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 2, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 3, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 4, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 5, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 6, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 7, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описан выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 8, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 9, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 10, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 11, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 12, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описан выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 13, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 14, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 15, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 16, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: l.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 17, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описан выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 18, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списка 19, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из указанных выше выделенных вариантов субтилизина, при этом вариант субтилизина представляет собой вариант протеазы Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, причем указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и причем указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 1, и причем аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 2, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 3, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 4, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: l.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 5, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 6, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 7, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 8, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 9, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 10, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: l.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 11, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 12, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 13, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 14, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 15, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 16, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 17, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 18, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списка 19, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 85% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 90% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 95% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 98% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В данной заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, как перечислено выше, при этом указанный вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 99% аминокислотную идентичность с указанной Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазой, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение, кроме того, предусматривает нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из выделенных вариантов субтилизина, перечисленных выше, в которых общий суммарный заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 относительно общего суммарного заряда Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы. В некоторых вариантах осуществления общий суммарный заряд получен путем одной или более замен, выбранных из: А001Е, V004E, R010H/A, Q012E, A015D, N018D, R019H/S, V026D, К027Е, N043D, R045C/T/S/P, S049D, V051E, G061E, N062D/E, N076D, N077D, S078D, S087D, А098Е, S101D, S106E, G115E, G118D, N123D, S128D, и при этом аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенные варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина, при этом указанный вариант протеазы имеет, по меньшей мере, одну или даже две, или больше заряженных мутаций, выбранных из группы, содержащей предпочтительно имеющих заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно 0, -1, -2 или -3, наиболее предпочтительно -1 или -2 относительно фермента SEQ ID NO: 1. Указанные варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина, также могут включать любой из вариантов, перечисленных в заявке.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает выделенные варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина, при этом указанный вариант протеазы имеет одну, или две, или больше заряженных мутаций, выбранных из группы состоящей из N248R, H249R, N252R/K, S256R, G258R, Т260К, N269R/K, и/или E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V и/или N269R, предпочтительно, имеющих заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно, +1, +2 или +3, наиболее предпочтительно +2 относительно фермента SEQ ID NO: 1. Указанные варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина, также могут включать любой из вариантов, перечисленных в заявке.

Как показано в данной заявке, приемлемые варианты протеазы холодной воды или варианты субтилизина являются вариантами родительской протеазы, при этом последовательность указанной родительской протеазы является, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный вариант протеазы имеет одну или больше из следующих характеристик:

а) индекс эффективности способа тестирования 2, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8, или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) индекс эффективности способа тестирования 3, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8, или даже от 1,1 до приблизительно 5; с) индекс эффективности способа тестирования 4, по меньшей мере, 1,0, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) индекс эффективности способа тестирования 6, по меньшей мере, 1,0, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или е) индекс эффективности способа тестирования 7, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 15, от 1,1 до приблизительно 10, или даже от 1,1 до приблизительно 7. Способ тестирования 2, способ тестирования 3, способ тестирования 4, способ тестирования 6 и способ тестирования 7 детально описаны ниже в разделе Примера 1, озаглавленном «Способы тестирования». Все мутации, представленные в данной заявке, используют схему нумерации BPN', как представлено на Фигуре 1. В некоторых вариантах осуществления, варианты, представленные в данной заявке, относятся к вариантам, имеющим аминокислотные последовательности, сопоставимые с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, используя схему нумерации BPN'.

В некоторых вариантах осуществления, указанные выше варианты протеазы холодной воды с высокой ионной силой, более конкретно варианты субтилизина, образуют часть композиции моющего средства, которое разбавляют в воде, как правило, в стиральной машине, с получением моющего раствора с моющим средством для стирки, удельная проводимость которого составляет от приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см, или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см.

Заряд вариантов протеазы холодной воды, более конкретно вариантов субтилизина выражен относительно В. lentus субтилизин GG36 протеазы дикого типа, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Аминокислотами, которые сообщают один отрицательный заряд, являются D и Е, а теми, что сообщают один положительный заряд, являются R, Н и К. Для расчета заряда варианта протеазы холодной воды используют любое изменение аминокислоты по сравнению с SEQ ID NO: 2, что меняет заряд. Например, введение мутации с отрицательным зарядом из нейтрального положения дикого типа будет добавлять суммарный заряд -1 к варианту протеазы холодной воды, поскольку введение мутации с отрицательным зарядом (D или Е) от положительного аминокислотного остатка дикого типа (R, Н или К) будет добавлять суммарный заряд -2. Суммирование изменений заряда от всех аминокислотных остатков, которые отличаются для варианта протеазы холодной воды по сравнению с В. lentus субтилизин GG36 протеазой немутантного типа, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, дает изменение заряда варианта протеазы холодной воды. Не желая быть связанными теорией, предполагают, что: предпочтительный диапазон заряда для протеаз холодной воды, которые используются в растворах моющего средства для стирки с низкой удельной проводимостью, составляет -5, -4, -3, -2, -1, 0, в частности -2, -1; предпочтительный диапазон заряда для протеаз холодной воды, которые используются в растворах моющего средства для стирки с высокой удельной проводимостью, составляет +5, +4, +3, +2, +1, 0, в частности +2, +1. Путем корректного отбора заряда могут быть получены неожиданно улучшенные уровни эффективности очистки в холодной воде. «Растворы моющего средства для стирки с низкой удельной проводимостью» определяют как такие, что имеют удельную проводимость от приблизительно 0,1 мСм/см до приблизительно 3 мСм/см, от приблизительно 0,3 мСм/см до приблизительно 2,5 мСм/см, или даже от приблизительно 0,5 мСм/см до приблизительно 2 мСм/см. «Растворы моющего средства для стирки с высокой удельной проводимостью» определяют как такие, что имеют удельную проводимость от приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см, или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см. Имеется в виду, что приведенные выше примеры не являются ограничивающими. После того, как мутацию комбинируют, чтобы оптимизировать эффективность в холодной воде, заряд фермента также может быть уравновешен мутациями в дополнительных положениях.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение обеспечивает выделенную, рекомбинантную, по существу чистую или несуществующую в природе вариантную протеазу (например, вариантный субтилизин), имеющую протеолитическую активность, при этом указанная вариантная протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, не больше, чем на 50, не больше, чем на 45, не больше, чем на 40, не больше, чем на 35, не больше, чем на 30, не больше, чем на 25, не больше, чем на 20, не больше, чем на 19, не больше, чем на 18, не больше, чем на 17, не больше, чем на 16, не больше, чем на 15, не больше, чем на 14, не больше, чем на 13, не больше, чем на 12, не больше, чем на 11, не больше, чем на 10, не больше, чем на 9 или не больше, чем на 8 аминокислотных остатков, причем аминокислотные положения пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1, как определено выравниванием аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN'.

Нуклеиновые кислоты для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении могут быть созданы путем использования любых подходящих способов синтеза, манипуляции и/или выделения, или их комбинаций. Например, полинуклеотид в соответствии с изобретению может быть получен, используя стандартные способы синтеза нуклеиновой кислоты, такие как способы твердофазного синтеза, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. В таких способах, как правило, синтезируют фрагменты из до 50 или более нуклеотидных оснований, потом соединяют (например, с использованием способов ферментного или химического сшивания, или способов рекомбинации, опосредованных полимеразой), с образованием, в принципе, любой желаемой непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты. Синтезу нуклеиновых кислот для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении также может способствовать (или альтернативно завершать) любой приемлемый способ, известный из уровня техники, включая, но не ограничиваясь приведенным, химический синтез, используя классический фосфорамидитный способ (см., например, Beaucage et al. Tetrahedron Letters 22:1859-69 [1981]); или способ, описанный Matthes et al. (смотри, Matthes et al., EMBO J. 3:801-805 [1984], который, как правило, практикуют в автоматизированных способах синтеза. Нуклеиновые кислоты для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении также могут быть получены путем использования автоматического ДНК синтезатора. Получаемые на заказ нуклеиновые кислоты могут быть заказаны из различных коммерческих источников (например, The Midland Certified Reagent Company, the Great American Gene Company, Operon Technologies Inc., и DNA2.0). Другие способы для синтезирования нуклеиновых кислот и соответствующие принципы известны из уровня техники (см., например, Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323 [1984]; и Itakura et al., Science 198:1056 [1984]).

Как показано выше, способы для рекомбинантных ДНК, полезных для модификации нуклеиновых кислот, хорошо известные из уровня техники. Например, способы, такие как расщепление эндонуклеазы рестрикции, сшивание, обратная транскрипция и продуцирование кДНК, и реакция цепи полимеразы (например, ПЦР) известны и легко применимы специалистом в данной области техники. Нуклеотиды в соответствии с изобретением также могут быть получены путем скрининга кДНК библиотек (например, кДНК библиотек, созданных с использованием способов мутагенеза, которые обычно используются в данной области техники, включая те, которые описаны в данной заявке), используя один или больше олигонуклеотидных зондов, которые могут гибридизировать до или ПЦР-амплифицировать полинуклеотиды, которые кодируют полипептид(ы) вариантной протеазы в соответствии с изобретением. Методики скрининга и выделения клонов кДНК и методики ПЦР амплификации хорошо известны специалисту в данной области техники и описаны в стандартных материалах, известных специалисту в данной области техники. Некоторые нуклеиновые кислоты для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении могут быть получены путем изменения существующего в природе полинуклеотидного скелета (например, который кодирует фермент или родительскую протеазу), используя, например, известную методику мутагенеза (например, сайт-направленный мутагенез, сайт-насыщенный мутагенез и in vitro рекомбинацию).

Способы получения модифицированных вариантных протеаз в соответствии с изобретением

Из уровня техники известно множество способов, приемлемым для получения модифицированных полинуклеотидов для кодирования полипептидов для использования в настоящем изобретении, которые кодируют вариантные протеазы в соответствии с изобретением, включая, но не ограничиваясь приведенным, например, сайт-насыщенный мутагенез, сканирующий мутагенез, мутагенез методом микроинъекций, делеционный мутагенез, случайный мутагенез, сайт-направленный мутагенез и направленное развитие, а также различные другие рекомбинантные подходы. Способы получения модифицированных полинуклеотидов и белков (например, вариантных протеаз) включают методологии перестановки в ДНК, способы, основанные на негомологичной рекомбинации генов, такие как ITCHY (см., Ostermeier et al., 7:2139-44 [1999]), SCRACHY (см., Lutz et al. 98:11248-53 [2001]), SHIPREC (см., Sieber et al., 19:456-60 [2001]) и NRR (см., Bittker et al., 20:1024-9 [2001]; Bittker et al., 101:7011-6 [2004]), и способы, которые основываются на использовании олигонуклеотидов для введения случайных или целевых мутаций, делеций и/или вставок (см., Ness et al., 20:1251-5 [2002]; Coco et al., 20:1246-50 [2002]; Zha et al., 4:34-9 [2003]; Glaser et al., 149:3903-13 [1992]).

Векторы, клетки и способы получения вариантных протеаз в соответствии с изобретением

В данной заявке описаны выделенные или рекомбинантные векторы, содержащие, по меньшей мере, один полинуклеотид в соответствии с изобретением, описанным в данной заявке (например, полинуклеотид, кодирующий вариантную протеазу в соответствии с изобретением, описанным в данной заявке), выделенные или рекомбинантные векторы экспрессии или кассеты экспрессии, содержащие, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид в соответствии с изобретением, выделенные, по существу чистые или рекомбинантные конструкции ДНК, содержащие, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид в соответствии с изобретением, выделенные или рекомбинантные клетки, содержащие, по меньшей мере, один полинуклеотид в соответствии с изобретением, клеточные культуры, содержащие клетки, содержащие, по меньшей мере, один полинуклеотид в соответствии с изобретением, клеточные культуры, содержащие, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид в соответствии с изобретением, и композиции, содержащие один или больше таких векторов, нуклеиновых кислот, векторов экспрессии, кассет экспрессии, конструкций ДНК, клеток, клеточных культур или их любая комбинация или смесь.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение предусматривает рекомбинантные клетки, содержащие, по меньшей мере, один вектор (например, вектор экспрессии или конструкцию ДНК) в соответствии с изобретением, который содержит, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид в соответствии с изобретением. Некоторые такие рекомбинантные клетки трансформируют или трансфектируют таким, по меньшей мере, одним вектором. Такие клетки, как правило, именуют как клетки-хозяева. Некоторые такие клетки содержат бактериальные клетки, включая, но, не ограничиваясь приведенным, Bacillus sp.клетки, такие как В. subtilis клетки. Изобретение также предусматривает рекомбинантные клетки (например, рекомбинантные клетки-хозяева), содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с изобретением.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение предусматривает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту или полинуклеотид в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления, вектор является вектором экспрессии или кассетой экспрессии, в которой полинуклеотидная последовательность в соответствии с изобретением, которая кодирует вариантную протеазу в соответствии с изобретением, функционально связана с одним или дополнительными сегментами нуклеиновой кислоты, требуемыми для эффективной экспрессии гена (например, промотор функционально связан с полинуклеотидом в соответствии с изобретением, который кодирует вариантную протеазу в соответствии с изобретением). Вектор может включать терминатор транскрипции и/или ген отбора, такой как ген устойчивости к антибиотикам, который дает непрерывную культуральную устойчивость клеток-хозяев, инфицированных плазмидой, путем роста в антимикробной среде.

Вектор экспрессии может быть получен из плазмиды или вирусной ДНК, или в альтернативных вариантах осуществления, содержит элементы обоих. Иллюстративные векторы включают, но не ограничиваются приведенным, рХХ, рС194, pJH101, рЕ194, рНР13 (см., Harwood and Cutting [eds.], Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]; приемлемые реплицирующие плазмиды для В. subtilis включают те, что перечислены на странице 92; см. также, Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, in Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C. [1993], pp. 615-624).

Для экспрессии и продуцирования представляющего интерес белка (например, вариантной протеазы) в клетке, по меньшей мере, один вектор экспрессии, содержащий, по меньшей мере, одну копию полинуклеотида, кодирующего модифицированную протеазу, и, предпочтительно, содержащий несколько копий, трансформируют в клетку в условиях, приемлемых для экспрессии протеазы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариантную протеазу (а также другие последовательности, включенные в вектор) интегрирована в геном клетки-хозяина, в тоже время, в других вариантах осуществления, плазмидный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариантную протеазу, сохраняется как функционально независимый экстрахромосомный элемент в клетке. Изобретение предусматривает как экстрахромосомные элементы нуклеиновой кислоты, также и вводимые нуклеотидные последовательности, которые интегрированы в геном клетки-хозяина. Векторы, описанные в данной заявке, являются полезными для продуцирования вариантных протеаз в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотидная конструкция, кодирующая вариантную протеазу, присутствует на интегрирующем векторе, что позволяет интеграцию и необязательно амплификацию полинуклеотида, кодирующего вариантную протеазу в бактериальной хромосоме. Примеры сайтов для интеграции хорошо известны специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления, транскрипция полинуклеотида, кодирующего вариантную протеазу в соответствии с изобретением, выполняется с помощью промотора, который является промотором дикого типа для выбранного предшественника протеазы. В некоторых других вариантах осуществления промотор является гетерологичным к предшественнику протеазы, однако, является функциональным в клетке-хозяине. В частности, примеры приемлемых промоторов для использования в бактериальных клетках-хозяевах включают, но не ограничиваются приведенным, например, amyE, amyQ, amyL, pstS, sacB, pSPAC, pAprE, pVeg, pHpaII промоторы, промотор В. stearothermophilus гена мальтогенной амилазы, В. amyloliquefaciens (BAN) гена амилазы, В. subtilis гена щелочной протеазы, В. clausii гена щелочной протеазы, В. pumilis гена ксилозидазы, В. thuringiensis сryIIIА и В. licheniformis гена альфа-амилазы. Дополнительные промоторы включают, но не ограничиваются приведенным, А4 промотор, а также фаг лямбда P_R или P_L промоторы и Е. coli lac, trp или tac промоторы.

Вариантные протеазы в соответствии с настоящим изобретением могут быть продуцированы в клетках-хозяевах любого приемлемого грам-положительного микроорганизма, включая бактерии и грибы. Например, в некоторых вариантах осуществления, вариантная протеаза продуцируется в клетках-хозяевах грибкового и/или бактериального происхождения. В некоторых вариантах осуществления, клетками-хозяевами являются Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp. или Aspergillus sp. В некоторых вариантах осуществления, варианты протеаз продуцируются Bacillus sp. клетками-хозяевами. Примеры Bacillus sp. клеток-хозяев, которые находят использование в продуцировании вариантных протеаз в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваются приведенным, В. licheniformis, В. lentus, В. subtilis, В. amyloliquefaciens, В. lentus, В. brevis, В. stearothermophilus, В. alkalophilus, В. coagulans, В. circulans, В. pumilis, В. thuringiensis, В. clausii и В. megaterium, а также другие организмы рода Bacillus. В некоторых вариантах осуществления, В. subtilis клетки-хозяева используют для продуцирования вариантных протеаз. Патенты США 5,264,366 и 4,760,025 (RE 34,606) описывают различные штаммы-хозяева Bacillus, которые могут быть использованы для продуцирования вариантных протеаз в соответствии с изобретением, хотя могут быть использованы другие приемлемые штаммы.

Некоторые промышленные штаммы бактерий, которые могут быть использованы для продуцирования вариантных протеаз в соответствии с изобретением, включают нерекомбинантные (то есть, дикого типа) штаммы Bacillus sp., а также варианты штаммов, существующих в природе, и/или рекомбинантных штаммов. В некоторых вариантах осуществления, штамм-хозяин представляет собой рекомбинантный штамм, где полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, может быть введен в хозяина. В некоторых вариантах осуществления, штамм-хозяин представляет собой штамм-хозяин В. subtilis и, в частности, рекомбинантный штамм-хозяин Bacillus subtilis. Известны многочисленные В. subtilis штаммы, включая, но не ограничиваясь приведенным, например, 1А6 (АТСС 39085), 168 (1А01), SB19, W23, Ts85, В637, РВ1753-РВ1758, РВ3360, JH642, 1А243 (АТСС 39,087), АТСС 21332, АТСС 6051, МI113, DE100 (АТСС 39,094), GX4931, РВТ 110 и PEP 211 штамм (см., например, Hoch et al., Genetics 73:215-228 [1973]; см. также, патенты США №№4,450,235, и 4,302,544, и ЕР 0134048, каждый из которых включен полностью путем ссылки). Использование В. subtilis, в качестве клеток-хозяев экспрессии, хорошо известно из уровня техники (см., например, Palva et al., Gene 19:81-87 [1982]; Fahnestock and Fischer, J. Bacteriol., 165:796-804 [1986]; и Wang et al., Gene 69:39-47 [1988]).

В некоторых вариантах осуществления, Bacillus клеткой-хозяином является Bacillus sp., которая включает мутацию или делецию, по меньшей мере, в одном из следующих генов, degU, degS, degR и degQ. Предпочтительно, мутация происходит в degU гене, и более предпочтительно мутация представляет собой degU(Hy)32 (см., например, Msadek et al., J. Bacteriol. 172:824-834 [1990]; и Olmos et al., Mol. Gen. Genet. 253:562-567 [1997]). Одним приемлемым штаммом-хозяином является Bacillus subtilis, несущий degU32(Hy) мутацию. В некоторых вариантах осуществления, Bacillus хозяин содержит мутацию или делецию в scoC4 (см., например, Caldwell et al., J. Bacteriol. 183:7329-7340 [2001]); spoIIE (см., например, Arigoni et al, Mol. Microbiol. 31:1407-1415 [1999]); и/или oppA или другие гены opp оперона (см., например, Perego et al, Mol. Microbiol. 5:173-185 [1991]). В действительности, предполагается, что любая мутация в орр опероне, которая вызывает такой же фенотип, как мутация в оррА гене, найдет использование в некоторых вариантах осуществления измененного Bacillus штамма в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления, данные мутации происходят в одиночку, тогда как в других вариантах осуществления, присутствуют комбинации мутаций. В некоторых вариантах осуществления, измененный штамм Bacillus клетки-хозяина, который может быть использован для продуцирования вариантной протеазы в соответствии с изобретением, является штаммом-хозяином Bacillus, который уже включает мутацию в одном или более из упомянутых выше генов. Кроме того, находят применение Bacillus sp. клетки-хозяева, которые содержат мутацию(и) и/или делеции эндогенных генов протеазы. В некоторых вариантах осуществления, Bacillus клетка-хозяин содержит делецию арrЕ и nрrЕ генов. В других вариантах осуществления, Bacillus sp. клетка-хозяин содержит делецию генов 5 протеазы, в то время как в других вариантах осуществления Bacillus sp. клетка-хозяин содержит делецию генов 9 протеазы (см., например, опубликованная заявка на патент США №2005/0202535, включенная в данный документ путем ссылки).

Клетки-хозяева трансформированы, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислотой, кодирующей, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с изобретением, используя любой приемлемый способ, известный из уровня техники. Если нуклеиновую кислоту встраивают в вектор, или используют без присутствия плазмидную ДНК, то, как правило, ее вводят в микроорганизм, в некоторых вариантах осуществления, предпочтительно, в клетку Е. coli или компетентную клетку Bacillus. Хорошо известны способы введения нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетки Bacillus или клетки Е. coli, используя конструкции плазмидной ДНК или векторы и трансформируя такие конструкции плазмидной ДНК или векторы в такие клетки. В некоторых вариантах осуществления, плазмиды позже выделяют из клеток Е. coli и трансформируют в клетки Bacillus. Однако, не является важным использование промежуточных микроорганизмов, таких как Е. coli, и в некоторых вариантах осуществления, конструкцию ДНК или вектор прямо вводят в хозяина Bacillus.

Специалист в данной области техники хорошо осведомлен о приемлемых способах введения последовательностей нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов в соответствии с изобретением в клетки Bacillus (см., например, Ferrari et al., «Genetics,» in Harwood et al. [eds.], Bacillus, Plenum Publishing Corp. [1989], pp. 57-72; Saunders et al, J. Bacteriol. 157:718-726 [1984]; Hoch et al., J. Bacteriol. 93:1925-1937 [1967]; Mann et al., Current Microbiol. 13:131-135 [1986]; Holubova, Folia Microbiol. 30:97 [1985]; Chang et al., Mol. Gen. Genet. 168:11-115 [1979]; Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett. 7:261-263 [1980]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol. 51:634 [1986]; Fisher et al., Arch. Microbiol. 139:213-217 [1981]; и McDonald, J. Gen. Microbiol. 130:203 [1984]). Действительно, такие способы как трансформация, включая протопластную трансформацию и конгрессию, трансдукцию и протопластное слияние, хорошо известны и приемлемы для использования в настоящем изобретении. Способы трансформации используют для введения конструкции ДНК или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу в соответствии с настоящим изобретением, в клетку-хозяин. Способы, известные из уровня техники, для трансформации клеток Bacillus, включают такие способы, как плазмидная трансформация «спасения генетического маркера», которая включает поглощение донорной плазмиды компетентными клетками, несущими частично гомологичную резидентную плазмиду (см., Contente et al, Plasmid 2:555-571 [1979]; Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223:185-191 [1990]; Weinrauch et al., J. Bacteriol. 154:1077-1087 [1983]; и Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169:1205-1211 [1987]). В данном способе вводимая донорная плазмида рекомбинирует с гомологичным участком резидентной плазмиды-помощника в процессе, который имитирует хромосомную трансформацию.

Вдобавок к обычно используемым способам, в некоторых вариантах осуществления, клетки-хозяева напрямую трансформированы с конструкцией ДНК или вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу в соответствии с изобретением (то есть, промежуточную клетку не используют для амплификации или других процессов, конструкции ДНК или вектора перед введением в клетку-хозяина). Введение конструкции ДНК или вектора в соответствии с изобретением в клетку-хозяина включает те физические и химические способы, которые известны из уровня техники, для введения последовательности нуклеиновой кислоты (например, последовательности ДНК) в клетку-хозяина без вставки в плазмид или вектор. Такие способы включают, но не ограничиваются приведенным, осаждение хлоридом кальция, электропорацию, депротеинизированная ДНК, липосомы и т.д. В дополнительных вариантах осуществления, конструкции ДНК или вектор, не будучи вставленными в плазмиду, со-трансформируют плазмидой. В дополнительных вариантах осуществления, селективный маркер удаляют из измененного штамма Bacillus, используя способы, известные из уровня техники (см., Stahl et al., J. Bacteriol. 158:411-418 [1984]; и Palmeros et al., Gene 247:255-264 [2000]).

В некоторых вариантах осуществления трансформированные клетки в соответствии с настоящим изобретением культивируют в традиционной питательной среде. Приемлемые специфические условия культивирования, такие как температура, рН и т.д., известны специалисту в данной области техники и хорошо описаны в научной литературе. В некоторых вариантах осуществления, изобретение предусматривает культуру (например, клеточную культуру), содержащую, по меньшей мере, одну вариантную протеазы или, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением. Кроме того, предусмотрены композиции, содержащие, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, вектор или конструкцию ДНК в соответствии с изобретением.

В некоторых вариантах осуществления, клетки-хозяева, трансформированные, по меньшей мере, одной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с изобретением, культивируют в приемлемой питательной среде в условиях, позволяющих экспрессию присутствующей протеазы, после чего полученную в результате протеазу выделяют из культуры. Среда, используемая для культивирования клеток, содержит любую традиционную среду, приемлемую для роста клеток-хозяев, такую как минимальные или комплексные среды, содержащие соответствующие добавки. Приемлемые среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть приготовлены в соответствии с опубликованными рецептами (см., например, каталоги American Type Culture Collection). В некоторых вариантах осуществления, протеазу, продуцированную клетками, выделяют из культуральной среды, используя традиционные способы, включая, но не ограничиваясь приведенным, например, отделение клеток-хозяев от среды путем центрифугирования или фильтрации, осаждая белковые компоненты супернатанта или фильтрата посредством соли (например, сульфата аммония), хроматографической очистки (например, ионный обмен, гель-фильтрация, аффинность, т.д.). Любой способ, приемлемый для выделения или очистки вариантной протеазы, находит использование в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления, вариантную протеазу, продуцированную рекомбинантной клеткой-хозяином, выделяют в культуральную среду. Чтобы облегчить очистку растворимых белков, может быть использована последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует домен, облегчающий очистку. Вектор или конструкция ДНК, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариантную протеазу, может дополнительно содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую домен, облегчающий очистку, чтобы облегчить очистку варианта протеазы (см., например, Kroll et al., ДНК Cell Biol. 12:441-53 [1993]). Такие домены, облегчающие очистку, включают, но не ограничиваются приведенным, например, пептиды, хелатирующие металл, такие как гистидин-триптофан модули, которые позволяют очистку на иммобилизированных металлах (см., Porath, Protein Expr. Purif. 3:263-281 [1992]), домены белка А, которые позволяют очистку на иммобилизированном иммуноглобулине, и домен, использованный в FLAGS системах удлиненной/афинной очистки (например, домены белка А, доступные от Immunex Corp., Seattle, WA). Включение последовательности расщепляемого линкера, такого как Factor ХА или энтерокиназа (например, последовательности, доступные от Invitrogen, San Diego, СА), между доменом очистки и гетерологичным белком, также находит применение для облегчения очистки.

Хорошо известны анализы для обнаружения и измерения ферментной активности фермента, такого как вариантная протеаза в соответствии с изобретением. Также специалисту в данной области техники известны различные анализы для обнаружения и измерения ферментной активности протеаз (например, вариантных протеаз в соответствии с изобретением). В частности, для измерения активности протеазы пригодны анализы, которые основываются на высвобождении растворимых в кислоте пептидов от казеина или гемоглобина, измеренные как поглощение при 280 нм или колориметрически, используя способ Фолина, хорошо известный специалисту в данной области техники. Другие иллюстративные анализы включают солюбилизацию хромогенных субстратов (см., например, Ward, «Proteinases,» in Fogarty (ed.)., Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, London, [1983], pp. 251-317). Другие иллюстративные анализы включают, но не ограничиваются приведенным, сукцинил-Ala-Ala-Pro-Phe-пара-нитроанилидный анализ (suc-AAPF-pNA) и анализ с натриевой солью 2,4,6-тринитробензолсульфоната (TNBS анализ). Многочисленные дополнительные ссылки, известные специалисту в данной области техники, предусматривают приемлемые способы (см., например, Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7911-7925 [1983]; Christianson et al., Anal. Biochem. 223:119-129 [1994]; и Hsia et al., Anal Biochem. 242:221-227 [1999]).

Может быть использовано множество способов для определения уровня продуцирования зрелой протеазы (например, зрелых вариантных протеаз в соответствии с настоящим изобретением) в клетке-хозяине. Такие способы включают, но не ограничиваются приведенным, например, способы, которые используют или поликлональные, или моноклональные антитела, специфические для протеазы. Иллюстративные способы включают, но не ограничиваются приведенным, фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), радио-иммунные анализы (RIA), флуоресцентные иммунные анализы (FIA) и сортировку флюоресцентно-активированных клеток (FACS). Эти и другие анализы хорошо известны из уровня техники (см., например, Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211 [1983]).

В некоторых других вариантах осуществления, изобретение предусматривает способы получения или продуцирования зрелой вариантной протеазы в соответствии с изобретением. Зрелая вариантная протеаза не включает последовательность сигнального пептида или пропептида. Некоторые способы включают получение или продуцирование вариантной протеазы в соответствии с изобретением в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине, такой как, например, клетка Bacillus sp. (например, клетка В. subtilis). В некоторых вариантах осуществления, изобретение обеспечивает способ продуцирования вариантной протеазы в соответствии с изобретением, при этом способ включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу в соответствии с изобретением, в условиях, способствующих продуцированию вариантной протеазы. Некоторые такие способы дополнительно включают выделение вариантной протеазы из культуры.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение предусматривает способы продуцирования вариантной протеазы в соответствии с изобретением, при этом способы включают: (а) введение рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу в соответствии с изобретением, в популяцию клеток (например, бактериальных клеток, таких как клетки В. subtilis); и (b) культивирование клеток в культуральной среде в условиях, способствующих продуцированию вариантной протеазы, кодированной вектором экспрессии. Некоторые такие способы дополнительно включают: (с) выделение вариантной протеазы из клеток или из культуральной среды.

Продукты по уходу за тканями и домом

В некоторых вариантах осуществления, варианты протеазы, более конкретно варианты субтилизина в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в композициях, содержащих вспомогательное вещество и вариант протеазы, при этом композиция является продуктом по уходу за тканями и домом.

В некоторых вариантах осуществления композиции продукта по уходу за тканями и домом содержит, по меньшей мере, один вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списков 1-19, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение, кроме того, предусматривает любой из указанные выше выделенных вариантов субтилизина, при этом вариант субтилизина представляет собой вариант протеазы Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления, композиции продукта по уходу за тканями и домом содержат, по меньшей мере, один вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, при этом указанная Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и при этом указанная GG36 протеаза является зрелой формой, имеющей протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списков 1-19, и при этом аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления композиции продукта по уходу за тканями и домом содержат любой из выделенных вариантов субтилизина, перечисленные выше, в которых общий суммарный заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 относительно общего суммарного заряда Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы. В некоторых вариантах осуществления, общий суммарный заряд получают путем одной или больше замен, выбранных из: А001Е, V004E, и при этом аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления, вариант(ы) субтилизина в композициях продукта по уходу за тканями и домом произведены из родительского субтилизина, который является коммерчески доступным (например, SAVINASE®, POLARZYME®, KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA® или OVOZYME® от Novozymes A/S); MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® and PURAFECT ОХР®, PURAFAST™, PURAFECT® PRIME или PURAMAX® от Genencor International) и те, которые доступны от Henkel/Kemira, а именно BLAP (последовательность, представленную на Фигуре 29 из США 5,352,604 со следующими мутациями S99D+S101R+S103A+V104I+G159S, в дальнейшем именуемым как BLAP) и BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I).

В некоторых вариантах осуществления, композиции продукта по уходу за тканями и домом содержат, по меньшей мере, один вариант протеазы, родитель которой имеет протеолитическую активность, при этом вариантная протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, не больше, чем на 50, не больше, чем на 40, не больше, чем на 35, не больше, чем на 30, не больше, чем на 25, не больше, чем на 20, не больше, чем на 19, не больше, чем на 18, не больше, чем на 17, не больше, чем на 16, не больше, чем на 15, не больше, чем на 14, не больше, чем на 13, не больше, чем на 12, не больше, чем на 11, не больше, чем на 10, не больше, чем на 9, или не больше, чем на 8 аминокислотных остатков, при этом аминокислотные положения пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательностью Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', представленной в SEQ ID NO: 1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN'.

Композиции для очистки и/или обработки

В некоторых вариантах осуществления потребительский продукт, который содержит композицию для очистки и/или обработки, содержит, по меньшей мере, один вариант протеазы, в частности вариант субтилизина, и, по меньшей мере, одно вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления, эти вспомогательные вещества вводят, например, чтобы способствовать или увеличивать эффективность чистки, для обработки субстрата, который нужно почистить, или чтобы модифицировать органолептические свойства чистящей композиции, как происходит в случае с отдушками, окрашивающими веществами, красителями или подобным. Следует понимать, что такие вспомогательные вещества являются дополнительными к вариантным протеазам в соответствии с настоящим изобретением. Определенная природа данных дополнительных компонентов, и уровни их введения, будут зависеть от физической формы композиции и природы чистящей операции, для которой она используется. Вспомогательные вещества для очистки и/или обработки могут быть выбраны из одного или больше из списка, включая, но не ограничиваясь приведенным, поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, отбеливатели, активаторы отбеливания, катализаторы отбеливания, другие ферменты, системы, стабилизирующие ферменты, хелаты, полимеры, высвобождающие грязь, агенты переноса красителей, диспергирующие агенты, гасители пены, красители, отдушки, окрашивающие вещества, солевые наполнители, гидротропы, фотоактиваторы, люминофоры, кондиционеры для ткани, смягчители для ткани, гидролизуемые поверхностно-активные вещества, консерванты, антиоксиданты, противоусадочные агенты, средства против сминания, гермициды, фунгициды, цветные спеклы, агенты по уходу за серебром, агенты против тусклости и/или противокоррозионные агенты, источники щелочности, солюбилизирующие агенты, носители, технологические добавки, пигменты и агенты, контролирующие рН, инкапсуляты, содержащие отдушку, оттеночный агент, поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, хелатирующие агенты, агенты ингибирующие перенос красителя, диспергирующие агенты, дополнительные ферменты, стабилизаторы ферментов, каталитические вещества, активаторы отбеливания, перекись водорода, источники перекись водорода, предварительно сформированые перкислоты, полимерные диспергирующие агенты, агенты, удаляющие/предупреждающие переосаждение глинистых загрязнений, осветлители, гасители пены, красители, отдушки, агенты, делающие структуру эластичной, смягчители для ткани, гидротропы, растворители и их смеси (см., например, патенты США №№6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 и 5,646,101, все из которых включены в данную заявку путем ссылки). Варианты осуществления специфических веществ чистящей композиции проиллюстрированы детально ниже. В вариантах осуществления, в которых вспомогательные вещества для очистки и/или обработки не являются совместимыми с вариантными протеазами в соответствии с настоящим изобретением в чистящих композициях, потом используют приемлемые способы сохранения разделенных вспомогательных веществ для очистки и протеазы(протеаз) (то есть, они не находятся в контакте друг с другом) до тех пор, пока комбинация двух компонентов не будет соответствующей. Такие способы разделения включают любой приемлемый способ, известный из уровня техники (например, гелевые капсулы, инкапсуляцию, таблетки, физическое разделение и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления, композиция для очистки и/или обработки содержит, по меньшей мере, один вариант протеазы, дополнительно содержит, по меньшей мере, одну дополнительную неиммуноэквивалентную протеазу, выбранную из субтилизинов (ЕС 3.4.21.62); трипсин-подобных или химотрипсин-подобных протеаз; металлопротеаз; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления, композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы, дополнительно содержат, по меньшей мере, одну дополнительную неиммуноэквивалентную протеазу, выбранную из: субтилизинов (ЕС 3.4.21.62), полученных из В. subtilis, В. amyloliquefaciens, В. pumilus и В. gibsonii; трипсиновых протеаз и/или химотрипсиновых протеаз, полученных из Cellulomonas; металлопротеаз, полученных из Bacillus amyloliquefaciens; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления, композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы, дополнительно содержат, по меньшей мере, один дополнительный фермент, выбранный из гемицеллюлаз, пероксидаз, протеаз, целлюлаз, целлобиоз-дегидрогеназ, ксилоглюканаз, ксиланаз, липаз, фосфолипаз, эстераз, кутиназ, пектиназ, маннаназ, пектат-лиаз, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, липоксигеназ, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, лихеназ глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидаз, хондроитиназ, лакказ, амилаз, и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления, композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы, дополнительно содержат, по меньшей мере, один дополнительный фермент, выбранный из липаз «первого цикла стирки»; альфа-амилаз; бактериальных чистящих целлюлаз; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы, дополнительно содержат, по меньшей мере, один из следующих: инкапсулята, содержащего отдушку, содержит микрокапсулы отдушки; оттеночного агента, содержащего вещество, выбранное из основных, кислотных, гидрофобных, прямых и полимерных красителей, и красителей-конъюгатов, имеющих пик поглощения с длиной волны от 550 нм до 650 нм, и их смесей; моющего поверхностно-активного вещества, содержащего вещество, выбранное из анионных моющих поверхностно-активных веществ, неионных моющих поверхностно-активных веществ, катионных моющих поверхностно-активные веществ, цвитерионных моющих поверхностно-активных веществ и амфотерных моющих поверхностно-активных веществ и их смесей; моющего компонента, содержащего вещества, выбранные из цеолитов, фосфатов и их смесей; силикатной соли, содержащей вещество, выбранное из силиката натрия, силиката калия и их смесей; осветлителя, содержащего вещество, выбранное из осветлителей, растворимых в холодной воде, и их смесей; карбоксилатного полимера, содержащего вещество, выбранное из малеат/акрилатного статистического сополимера или полиакрилатного гомополимера и их смесей; полимера, высвобождающего грязь, содержащего вещество, выбранное из терефталатных сополимеров и их смесей; целлюлозного полимера, содержащего вещество, выбранное из алкилцеллюлозы, алкилалкоксиалкилцеллюлозы, карбоксиалкилцеллюлозы, алкилкарбоксиалкилцеллюлозы и их смесей; катализатора отбеливания, содержащего вещество, выбранное из иминиевых катионов, иминиевых полиионов; иминиевых цвитерионов; модифицированных аминов; модифицированных оксидов аминов; N-сульфонилиминов; N-фосфонилиминов; N-ацилиминов; тиадиазолдиоксидов; перфториминов; циклических кетонов сахаров и их смесей; активатора отбеливания, содержащего вещество, выбранное из додеканоилоксибензолсульфоната, деканоилоксибензолсульфоната, деканоилоксибензойной кислоты или ее солей, 3,5,5-триметилгексаноилоксибензолсульфоната, тетраацетилэтилендиамина (TAED), нонаноилоксибензолсульфоната (NOBS) и их смесей; источника перекиси водорода, содержащего вещество, выбранное из неорганических пергидратных солей, включая соли щелочных металлов, такие как натриевые соли пербората (обычно моно- или тетрагидраты), перкарбонатные, персульфатные, перфосфатные, персиликатные соли и их смеси; хелата, содержащего вещество, выбранное из DTP А (диэтилентриаминпентауксусная кислота), HEDP (гидроксиэтандифосфоновая кислота), DTPMP (диэтилентриаминпента(метиленфосфоновая кислота)), этилендиаминдиянтарная кислота (EDDS), гидрата динатриевой соли 1,2-дигидроксибензол-3,5-дисульфоновой кислоты, производных указанных хелантов; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления, композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы, содержат оттеночный агент для ткани, выбранный из группы, состоящей из красителей; конъюгатов краситель-глина, содержащих, по меньшей мере, один катионно-основный краситель и смектитовую глину; и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления, композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы, содержат, по меньшей мере, один оттеночный агент для ткани, выбранный из красителей с малыми молекулами и полимерных красителей, и их смесей необязательно со смектитовой глиной.

В некоторых вариантах осуществления, композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы, обеспечены в стандартных дозах в одном или множественных отделениях. В некоторых вариантах осуществления, композиция представляет собой стандартную дозу во множественных отделениях, в которой вариант протеазы находится в другом отделении, чем любой источник перекиси водорода и/или хеланта, и/или дополнительного фермента.

В некоторых вариантах осуществления, композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы содержит один или больше из следующих ингредиентов (исходя из массы общей композиции): от приблизительно 0,0005 мас. % до приблизительно 0,1 мас. %, от приблизительно 0,001 мас. % до приблизительно 0,05 мас. %, или даже от приблизительно 0,002 мас. % до приблизительно 0,03 мас. % указанного варианта протеазы; и один или больше из следующего: от приблизительно 0,00003 мас. % до приблизительно 0,1 мас. % оттеночного агента для ткани; от приблизительно 0,001 мас. % до приблизительно 5 мас. %, капсул отдушки; от приблизительно 0,001 мас. % до приблизительно 1 мас. %, осветлителей, растворимых в холодной воде; от приблизительно 0,00003 мас. % до приблизительно 0,1 мас. % катализаторов отбеливания; от приблизительно 0,00003 мас. % до приблизительно 0,1 мас. % липаз «первого цикла стирки»; от приблизительно 0,00003 мас. % до приблизительно 0,1 мас. % бактериальных чистящих целлюлаз; и/или от приблизительно 0,05 мас. % до приблизительно 20 мас. % неионных поверхностно-активных веществ Гербе (Guerbet).

В некоторых вариантах осуществления, композиция для очистки и/или обработки представляет собой жидкое моющее средство для стирки, моющее средство для мытья посуды.

Имеется в виду, что композиция для очистки и/или обработки обеспечена в любой приемлемой форме, включая жидкую или твердую. Композиция для очистки и/или обработки может быть в форме единичного дозированного пакета, главным образом, когда она находится в форме жидкости, и, как правило, композиция для очистки и/или обработки, по меньшей мере, частично, или даже полностью, помещена в водорастворимый пакет. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления композиции для очистки и/или обработки, содержащие, по меньшей мере, один вариант протеазы, композиция для очистки и/или обработки может иметь любую комбинацию параметров и/или характеристик, детально описанных выше. Если не указано другое, все уровни компонентов или композиций, предусмотренные в данной заявке, сделаны по отношению к активному уровню этого компонента или композиции, и являются без примесей, например, остаточных растворителей или побочных продуктов, которые могут присутствовать в коммерчески доступных источниках. Массы ферментных компонентов основываются на общем активном белке. Все проценты и соотношения рассчитывают по массе, если не указано другое. Все проценты и соотношения рассчитывают, исходя из общей массы композиции, если не указано другое. В иллюстративных композициях моющего средства, уровни ферментов выражены посредством чистого фермента по массе общей композиция и, если не указано другое, компоненты моющего средства выражены по массе общих композиций.

Чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением преимущественно используют, например, для стирки, для очистки твердой поверхности, мытья посуды, а также для косметических применений, таких как для зубов, зубов, волос и кожи. Кроме того, благодаря уникальным преимуществам повышенной эффективности при более низких температурах растворов, ферменты в соответствии с настоящим изобретением идеально подходят для применений для стирки. Более того, ферменты в соответствии с настоящим изобретением находят использование в гранулированных и жидких композициях.

Настоящее изобретение, кроме того, предусматривает чистящие аддитивные продукты, содержащие описанные варианты протеазы и вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления, находят использование применения чистящего раствора при низких температурах. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает чистящие аддитивные продукты, включающие, по меньшей мере, один фермент в соответствии с настоящим изобретением, которые идеально подходят для включения в процесс мытья, когда требуется дополнительная отбеливающая эффективность. Такие примеры включают, но не ограничиваются приведенным, применения чистящего раствора при низких температурах. В некоторых вариантах осуществления, аддитивный продукт находится в своей простейшей форме, одной или больше протеаз. В некоторых вариантах осуществления, добавку упаковывают в дозированную форму для добавления в процесс очистки. В некоторых вариантах осуществления, добавку упаковывают в дозированную форму для добавления в процесс очистки, где применяют источник пероксида и требуется повышенная отбеливающая эффективность. Любая приемлемая отдельная дозированная единичная форма находит использование в настоящем изобретении, включая, но не ограничиваясь приведенным, гранулы, таблетки, гелевые капсулы или другие отдельные дозированные единицы, такие как предварительно отмеренные порошки или жидкости. В некоторых вариантах осуществления, для увеличения объема таких композиций включены наполнитель(и) или вещество(а)-носитель(и). Приемлемые наполнители или вещества-носители включают, но не ограничиваются приведенным, различные соли сульфата, карбоната и силиката, а также тальк, глину и подобные. Приемлемые наполнители или вещества-носители для жидких композиций включают, но не ограничиваются приведенным, воду или низкомолекулярные первичные и вторичные спирты, включая полиолы и диолы. Примеры таких спиртов включают, но не ограничиваются приведенным, метанол, этанол, пропанол и изопропанол. В некоторых вариантах осуществления, композиции содержат от приблизительно 5% до приблизительно 90% таких веществ. Кислотные наполнители находят использование, чтобы понизить рН. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления, чистящая добавка включает вспомогательные ингредиенты, как более полно описано ниже.

Представленные чистящие композиции и чистящие добавки требуют эффективное количество, по меньшей мере, одного из вариантов протеазы, более конкретно, вариантов субтилизина, предусмотренных в данной заявке, самостоятельно или в комбинации с другими протеазами и/или дополнительными ферментами. Требуемый уровень фермента достигается путем добавления одного или больше вариантов протеазы, более конкретно, вариантов субтилизина в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, представленные чистящие композиции содержат, по меньшей мере, приблизительно 0,0001 массового процента, от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10, от приблизительно 0,001 до приблизительно 1, или даже от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мас. %, по меньшей мере, одного из вариантов протеаз в соответствии с настоящим изобретением.

Чистящие композиции в данной заявке, как правило, приготавливают таким образом, что во время использования в водных чистящих операциях, вода для мытья будет иметь рН от приблизительно 5,0 до приблизительно 11,5 или даже от приблизительно 7,5 до приблизительно 10,5. Жидкие составы продукта, как правило, приготавливают таким образом, чтобы иметь чистый рН от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0 или даже от приблизительно 3 до приблизительно 5. Гранулированные продукты для стирки, как правило, приготавливают таким образом, чтобы иметь рН от приблизительно 9 до приблизительно 11. Способы контролирования рН при рекомендованных уровнях употребления включают использование буферов, щелочей, кислот, и т.д., и хорошо известны специалисту в данной области техники.

Приемлемые «чистящие композиции с низким рН», как правило, имеют чистый рН от приблизительно 3 до приблизительно 5, и, как правило, являются свободными от поверхностно-активных веществ, которые гидролизуют при таких рН окружающей среды. Такие поверхностно-активные вещества включают натрий алкилсульфатные поверхностно-активные вещества, которые включают, по меньшей мере, один фрагмент этиленоксида или даже от приблизительно 1 до приблизительно 16 моль этиленоксида. Такие чистящие композиции, как правило, содержат достаточное количество рН модификатора, такого как гидроксид натрия, моноэтаноламин или соляная кислота, чтобы обеспечить такую чистящую композицию с чистым рН от приблизительно 3 до приблизительно 5. Такие композиции, как правило, содержат, по меньшей мере, один кислотно-стабильный фермент. В некоторых вариантах осуществления, композиции являются жидкими, в то время как в других вариантах осуществления, они являются твердыми. рН таких жидких композиций, как правило, измеряют как чистый рН. рН таких твердых композиций измеряют в виде 10% раствора твердых веществ указанной композиции, где растворителем является дистиллированная вода. В данных вариантах осуществления, все измерения рН выполняют при 20°С, если не указано другое.

В некоторых вариантах осуществления, когда вариантную протеазу(ы) используют в гранулированной композиции или жидкости, для вариантной протеазы требуется, чтобы она была в форме инкапсулированной частицы, чтобы защитить вариантную протеазу от других компонентов гранулированной композиции во время хранения. Кроме того, инкапсуляция также является средством контролирования доступности вариантной протеазы во время процесса очистки. В некоторых вариантах осуществления, инкапсуляция усиливает производительность вариантной протеазы(протеаз) и/или дополнительных ферментов. В этом отношении, вариантные протеазы в соответствии с настоящим изобретением инкапсулируют с любым приемлемым инкапсулирующим веществом, известным из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления, инкапсулирующее вещество, как правило, инкапсулирует, по меньшей мере, часть катализатора для вариантной протеазы(протеаз) в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, инкапсулирующее вещество является водорастворимым и/или вод о диспергируемым. В некоторых вариантах осуществления, инкапсулирующее вещество имеет температуру стеклования (Tg) 0°С или выше. Температура стеклования описана более детально в WO 97/11151. Инкапсулирующее вещество, как правило, выбрано из группы, состоящей из углеводов, природных или синтетических смол, хитина, хитозана, целлюлозы и производных целлюлозы, силикатов, фосфатов, боратов, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, парафиновых восков, и их комбинаций. Когда инкапсулирующее вещество представляет собой углевод, как правило, его выбирают из моносахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинаций. В некоторых типичных вариантах осуществления, инкапсулирующее вещество является крахмалом (см., например, ЕР 0922499; US 4,977,252; US 5,354,559, и US 5,935,826). В некоторых вариантах осуществления, инкапсулирующее вещество представляет собой микросферу, сделанную из пластика, такого как термопластики, акрилонитрил, метакрилонитрил, полиакрилонитрил, полиметакрилонитрил и их смеси; коммерчески доступные микросферы, которые находят применение, включают, но не ограничиваются приведенным, микросферы, которые поставляются EXPANCEL® (Stockviksverken, Sweden), и РМ 6545, РМ 6550, РМ 7220, РМ 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL®, и SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA).

Как описано в данной заявке, вариантные протеазы для использования в представленном изобретении находят определенное применение в чистящей промышленности, включая, но не ограничиваясь приведенным, моющие средства для стирки белья и мытья посуды. Данные применения размещают ферменты при различных стрессовых условиях окружающей среды. Композиции в соответствии с изобретением обеспечивают преимущества над многими существующими на данный момент используемыми фермент-содержащими продуктами, благодаря их стабильности в различных условиях.

В действительности, существует множество условий мытья, включая различные составы моющего средства, объемы воды для мытья, температуры воды для мытья и продолжительность времени мытья, действию которых подвергаются протеазы, вовлеченные в мытье. Кроме того, составы моющего средства, используемые в различных географических регионах, имеют различные концентрации их значимых компонентов, присутствующих в воде для мытья. Например, Европейские моющие средства, как правило, имеют приблизительно 4500-5000 м.д. компонентов моющего средства в воде для мытья, в то время как Японские моющие средства, как правило, имеют приблизительно 667 м.д. компонентов моющего средства в воде для мытья. В Северной Америке, а именно Соединенных Штатах, моющие средства, как правило, имеют приблизительно 975 м.д. компонентов моющего средства, присутствующих в воде для мытья.

Система с низкой концентрацией моющего средства включает моющие средства, где в воде для мытья присутствует меньше, чем приблизительно 800 м.д. компонентов моющего средства. Японские моющие средства, как правило, рассматриваются как система с низкой концентрацией моющего средства, поскольку они имеют приблизительно 667 м.д. компонентов моющего средства, присутствующих в воде для мытья.

Средняя концентрация моющего средства включает моющие средства, где в воде для мытья присутствует от приблизительно 800 м.д. до приблизительно 2000 м.д. компонентов моющего средства. Как правило, полагают, что моющие средства Северной Америки являются системами со средней концентрацией моющего средства, так как они имеют приблизительно 975 м.д. компонентов моющего средства, присутствующих в воде для мытья. В Бразилии типично имеют приблизительно 1500 м.д. компонентов моющего средства, присутствующих в воде для мытья.

Система с высокой концентрацией моющего средства включает моющие средства, в которых больше, чем приблизительно 2000 м.д. компонентов моющего средства присутствует в воде для мытья. Считается, что Европейские моющие средства в общем представляют собой системы с высокими концентрациями моющего средства, так как они имеют приблизительно 4500-5000 м.д. компонентов моющего средства в воде для мытья.

В Латинской Америке моющие средства в общем представляют собой моющие средства с высокопенным фосфатным моющим компонентом и диапазон моющих средств, используемых в Латинской Америке, может попадать в моющие средства как со средними концентрациями, так и с высокими концентрациями, так как они содержат в диапазоне от 1500 м.д. до 6000 м.д. компонентов моющего средства в воде для мытья. Как упоминалось выше, в Бразилии, как правило, имеют приблизительно 1500 м.д. компонентов моющего средства, присутствующих в воде для мытья. Однако, другие регионы использования моющих средств с высокопенным фосфатным моющим компонентом, не ограниченные другими странами Латинской Америки, могут иметь системы с высокой концентрацией моющего средства вплоть до приблизительно 6000 м.д. компонентов моющего средства, присутствующих в воде для мытья.

В свете вышесказанного, является очевидным, что концентрации композиций моющего средства в типичных моющих растворах по всему миру варьирует от меньше, чем приблизительно 800 м.д. композиции моющего средства («регионы с низкой концентрацией моющего средства»), например, приблизительно 667 м.д. в Японии, до между приблизительно 800 м.д. и приблизительно 2000 м.д. («регионы со средней концентрацией моющего средства»), например, приблизительно 975 м.д. в США и приблизительно 1500 м.д. в Бразилии, до больших, чем приблизительно 2000 м.д. («регионы с высокой концентрацией моющего средства»), например, от приблизительно 4500 м.д. до приблизительно 5000 м.д. в Европе и приблизительно 6000 м.д. в регионах с высокопенным фосфатным моющим компонентом.

Концентрации типичных моющих растворов определяют эмпирически. Например, в США, типичная стиральная машина вмещает объем приблизительно 64,4 л моющего раствора. Соответственно, для того, чтобы получить концентрацию приблизительно 975 м.д. моющего средства в моющем растворе должно быть добавлено приблизительно 62,79 г композиции моющего средства к 64,4 л моющего раствора. Данное количество является типичным количеством, отмеренным в воду для мютья потребителем, используя мерную чашку, предусмотренную с моющим средством.

В качестве дополнительного примера, различные регионы используют различные температуры мытья. Температура воды для мытья в Японии, как правило, является меньшей, чем та, что используется в Европе. Например, температура воды для мытья в Северной Америке и Японии, как правило, составляет от приблизительно 10 до приблизительно 30°С (например, приблизительно 20°С), тогда как температура воды для мытья в Европе, как правило, составляет от приблизительно 30 до приблизительно 60°С (например, приблизительно 40°С). Однако, в интересах сбережения энергии, многие потребители переключаются на использование холодной воды для мытья. Кроме того, в некоторых дополнительных областях, холодную воду, как правило, используют для стирки белья, а также в применениях для мытья посуды. В некоторых вариантах осуществления, при «мытье в холодной воде» в соответствии с настоящим изобретением применяют «моющее средство для холодной воды», приемлемое для мытья при температурах от приблизительно 10°С до приблизительно 40°С, или от приблизительно 20°С до приблизительно 30°С, или от приблизительно 15°С до приблизительно 25°С, а также всех других комбинациях в диапазоне от приблизительно 15°С до приблизительно 35°С, и все диапазоны в пределах от 10°С до 40°С.

В качестве дополнительного примера, различные регионы, как правило, имеют разную жесткость воды. Жесткость воды, как правило, описывают в терминах гран на галлон смешанного Ca²⁺/Mg²⁺. Жесткость является мерой количества кальция (Са²⁺) и магния (Mg) в воде. Большая часть воды в Соединенных Штатах является жесткой, но степень жесткости варьирует. Вода от средней жесткости (60-120 м.д.) до жесткой (121-181 м.д.) имеет от 60 до 181 миллионных долей (миллионные доли, преобразованные в граны на галлон США, представляют собой м.д., деленные на 17,1, равно граны на галлон) жесткости минералов.

Европейская жесткость воды, как правило, больше, чем приблизительно 10,5 (например, от приблизительно 10,5 до приблизительно 20,0) гран на галлон смешанного Са²⁺/Mg²⁺ (например, приблизительно 15 гран на галлон смешанного Са²⁺/Mg²⁺). В Северной Америке жесткость воды, как правило, больше, чем жесткость воды в Японии, но меньше, чем жесткость воды в Европе. Например, в Северной Америке жесткость воды может составлять от приблизительно 3 до приблизительно 10 гран, от приблизительно 3 до приблизительно 8 гран или приблизительно 6 гран. В Японии жесткость воды, как правило, составляет меньше, чем жесткость воды в Северной Америке, обычно, меньше, чем приблизительно 4, например, приблизительно 3 грана на галлон смешанного Ca²⁺/Mg²⁺.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает потребительские товары или композиции для очистки и/или обработки, содержащие вариантные протеазы, которые показывают неожиданную эффективность мытья, по меньшей мере, в одной серии условий мытья (например, температура воды, жесткость воды и/или концентрация моющего средства). В некоторых вариантах осуществления, вариантные протеазы в соответствии с настоящим изобретением являются сопоставимыми по эффективности мытья с другими протеазами субтилизина. В некоторых вариантах осуществления, вариантные протеазы в соответствии с настоящим изобретением демонстрируют повышенную эффективность мытья по сравнению с протеазами субтилизина, коммерчески доступными на данный момент. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, вариантные протеазы, предусмотренные в данной заявке, демонстрируют повышенную окислительную стабильность, повышенную термическую стабильность, повышенную чистящую способность в различных условиях, и/или повышенную хелаторную стабильность. Кроме того, вариантные протеазы в соответствии с настоящим изобретением находят применение в чистящих композициях, которые не включают моющие средства, к тому же, или самостоятельно, или в комбинации с моющими компонентами и стабилизаторами.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции содержат, по меньшей мере, одну из определенных вариантных протеаз на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% по массе композиции и остаток (например, от приблизительно 99,999% до приблизительно 90,0%), содержащий вспомогательные вещества по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат, по меньшей мере, одну вариантную протеазу на уровне 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% по массе композиции и остаток чистящей композиции (например, от приблизительно 99,9999% до приблизительно 90,0%, от приблизительно 99,999% до приблизительно 98%, от приблизительно 99,995% до приблизительно 99,5% по массе), содержащий чистящие вспомогательные вещества.

В некоторых вариантах осуществления, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат один или больше дополнительных моющих ферментов, которые обеспечивают эффективность очистки и/или преимущества ухода за тканью и/или при мытье посуды. Примеры приемлемых ферментов включают, но не ограничиваются приведенным, гемицеллюлазы, целлюлазы, пероксидазы, протеазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, пектат-лиазы, маннаназы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, маланазы, β-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазы, хондроитиназы, лакказы и амилазы или любые их комбинации или смеси. В некоторых вариантах осуществления, используют комбинацию ферментов (то есть, «коктейль»), содержащую традиционно применяемые ферменты, подобные протеазе, липазе, кутиназе и/или целлюлазе в сочетании с амилазой.

В дополнение к вариантам протеазы, более конкретно вариантам субтилизина, предусмотренным в данной заявке, любая другая приемлемая протеаза находит применение в композициях в соответствии с настоящим изобретением. Приемлемые протеазы включают те, что имеют животное, растительное или микробное происхождение. В некоторых вариантах осуществления, используют микробные протеазы. В некоторых вариантах осуществления, включены химически или генетически модифицированные мутанты. В некоторых вариантах осуществления, протеаза представляет собой сериновую протеазу, предпочтительно щелочную микробную протеазу или трипсин-подобную протеазу. Примеры щелочных протеаз включают субтилизины, главным образом те, которые произведены из Bacillus (например, субтилизин, lentus, amyloliquefaciens, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168). Дополнительные примеры включают те мутантные протеазы, которые описаны в патентах США №№RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, и 6,482,628, все из которых включены в данную заявку путем ссылки. Дополнительные примеры протеазы включают, но не ограничиваются приведенным, трипсин (например, свинного или коровьего происхождения), и Fusarium протеазу, описанную в WO 89/06270. В некоторых вариантах осуществления, коммерчески доступные ферменты протеазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются приведенным, MAXATASE®, MAXACAL™, МАХАРЕМ™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® ОХР, PURAMAX™, EXCELLASE™ и PURAFAST™ (Genencor); ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, NEUTRASE®, RELASE® и ESPERASE® (Novozymes); BLAP™ и BLAP™ варианты (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany), и КАР (В. алкалофильный субтилизин; Као Corp., Tokyo, Japan). Различные протеазы описаны в W095/23221, WO 92/21760, публикации заявки на патент США №2008/0090747 и патентах США №№5,801,039, 5,340,735, 5,500,364, 5,855,625, US RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, и 6,482,628, и разных других патентах. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, металлопротеазы находят применение в настоящем изобретении, включая, но не ограничиваясь приведенным, нейтральную металлопротеазу, описанную в WO 07/044993.

Кроме того, любая приемлемая липаза находит применение в настоящем изобретении. Приемлемые липазы включают, но не ограничиваются приведенным, липазы, которые имеют бактериальное или грибковое происхождение. Химически или генетически модифицированные мутанты охвачены настоящим изобретением. Примеры подходящих липаз включают Humicola lanuginosa липазу (см., например, ЕР 258068 и ЕР 305216), Rhizomucor miehei липазу (см., например, ЕР 238023), Candida липазу, такую как С.antarctica липаза (например, С.antarctica липаза А или В; см., например, ЕР 214761), Pseudomonas липазы, такие как P. alcaligenes липаза и Р. pseudoalcaligenes липаза (см., например, ЕР 218272), P. cepacia липазу (см., например, ЕР 331376), P. stutzeri липазу (см., например, GB 1,372,034), P. fluorescens липазу, Bacillus липазу (например, В. subtilis липазу [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); B. stearothermophilus липазу [см., например, JP 64/744992]; и В. pumilus липазу [см., например, WO 91/16422]).

Более того, ряд клонированных липаз находит применение в некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, включая, но не ограничиваясь приведенным, Penicillium camembertii липазу (см., Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991]), Geotricum candidum липазу (см., Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989]), и различные Rhizopus липазы, такие как R. delemar липаза (см., Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]), R. niveus липазу (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) и R. oryzae липазу.

Другие типы липолитических ферментов, такие как кутиназы, также находят применение в некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, включая, но не ограничиваясь приведенным, кутиназу, произведенную от Pseudomonas mendocina (см., WO 88/09367), и кутиназу, произвееднную от Fusarium solanipisi (см., WO 90/09446).

Дополнительные приемлемые липазы включают коммерчески доступные липазы, такие как M1 LIPASE™, LUMA FAST™ и LIPOMAX™ (Genencor); LIPEX®, LIPOLASE® и LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); и LIPASE P™ «Аmаnо» (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japan).

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат липазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной липазы по массе композиции и остаток чистящих дополнительных веществ по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением также содержат липазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% липазы по массе композиции.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, любая приемлемая амилаза находит применение в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, любая амилаза (например, альфа и/или бета), приемлемая для использования в щелочных растворах, также находит применение. Приемлемые амилазы включают, но не ограничиваются приведенным, те, которые имеют бактериальное или грибковое происхождение. Химически или генетически модифицированные мутанты являются включенными в некоторые варианты осуществления. Амилазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются приведенным, α-амилазы, полученные из В. licheniformis (см., например, GB 1,296,839). Коммерчески доступные амилазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются приведенным, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA® и BAN™ (Novozymes), а также POWERASE™, RAPIDASE® и MAXAMYL® Р (Genencor).

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат амилазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной амилазы по массе композиции и остаток чистящих вспомогательных веществ по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением также содержат амилазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% амилазы по массе композиции.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления, любая приемлемая целлюлаза находит применение в чистящих композициях в соответствии с настоящим изобретением. Приемлемые целлюлазы включают, но не ограничиваются приведенным, те, которые имеют бактериальное или грибковое происхождение. Химически или генетически модифицированные мутанты являются включенными в некоторые варианты осуществления. Приемлемые целлюлазы включают, но не ограничиваются приведенным, Humicola insolens целлюлазы (см., например, патент США №4,435,307). Главным образом, приемлемые целлюлазы являются целлюлазами, имеющими преимущества при уходе за цветом (см., например, ЕР 0495257). Коммерчески доступные целлюлазы, которые находят применение на данный момент, включают, но не ограничиваются приведенным, CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes) и КАС-500(B)™ (Као Corporation). В некоторых вариантах осуществления, целлюлазы являются включенными как части или фрагменты зрелого дикого типа или вариантных целлюлаз, в которых удалена часть N-конца (см., например, патент США №5,874,276). В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно содержат целлюлазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной целлюлазы по массе композиции и остаток чистящих вспомогательных веществ по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением также содержат целлюлазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% целлюлазы по массе композиции.

Любая маннаназа, приемлемая для использования в композициях моющего средства, також находит применение в настоящем изобретении. Приемлемые маннаназы включают, но не ограничиваются приведенным, те, которые имеют бактериальное или грибковое происхождение. Химически или генетически модифицированные мутанты являются включенными в некоторые варианты осуществления. Известны различные маннаназы, которые находят применение в настоящем изобретении (см., например, патент США №6,566,114, патент США №6,602,842 и патент США №6,440,991, все из которых включены в данную заявку путем ссылки). В некоторых вариантах осуществления, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат маннаназы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной маннаназы по массе композиции и остаток чистящих вспомогательных веществ по массе композиции. В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением также содержат маннаназы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% маннаназы по массе композиции.

В некоторых вариантах осуществления, пероксидазы используют в комбинации с перекисью водорода или его источником (например, перкарбонатом, перборатом или персульфатом) в композициях в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых альтернативных вариантах осуществления, оксидазы используют в комбинации с кислородом. Оба типа ферментов используют для «отбеливающего раствора» (то есть, чтобы предотвратить переход текстильного красителя от окрашенной ткани к другой ткани, когда ткани стирают вместе в моющей жидкости), предпочтительно вместе с усиливающим агентом (см., например, WO 94/12621 и WO 95/01426). Приемлемые пероксидазы/оксидазы включают, но не ограничиваются приведенным, те которые имеют растительное, бактериальное или грибковое происхождение. Химически или генетически модифицированные мутанты являются включенными в некоторые варианты осуществления. В некоторых вариантах осуществления, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат пероксидазные и/или оксидазные ферменты на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной пероксидазы и/или оксидазы по массе композиции и остаток чистящих вспомогательных веществ по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением, чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением также содержат пероксидазные и/или оксидазные ферменты на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% пероксидазных и/или оксидазных ферментов по массе композиции.

В некоторых вариантах осуществления, дополнительные ферменты находят применение, включая, но не ограничиваясь приведенным, пергидролазы (см., например, WO 05/056782). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления, смеси упомянутых выше ферментов охвачены в данной заявке, в частности одна или больше дополнительная протеаза, амилаза, липаза, маннаназа и/или, по меньшей мере, одна целлюлаза. В действительности, предполагается, что различные смеси данных ферментов будут находить применение в настоящем изобретении. Кроме того, предполагается, что различные уровни вариантной протеазы(протеаз) и одного или больше дополнительных ферментов оба могут независимо находится в диапазоне до приблизительно 10%, оставшаяся часть чистящей композиции представляет собой дополнительные чистящие вещества. Конкретный выбор дополнительных чистящих веществ легко делают, принимая во внимание поверхность, отдельный предмет или ткань, которые подвергают очистке, и требуемую форму композиции для условий очистки во время использования (например, посредством использования моющего средства для мытья).

В некоторых вариантах осуществления, эффективное количество одной или больше вариантной протеазы(протеаз), предусмотренных в данной заявке, является включенным в композиции, подходящие для очистки множества поверхностей, которые нуждаются в удалении белкового пятна. Такие чистящие композиции включают чистящие композиции для таких применений как чистящие твердые поверхности, ткани и посуда. В действительности, в некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает чистящие композиции для тканей, тогда как в других вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает чистящие композиции не для тканей. В особенности, настоящее изобретение также предусматривает чистящие композиции, приемлемые для личной гигиены, включая чистящие композиции по уходу за ротовой полостью (включая зубные порошки, зубные пасты, ополаскиватели для полости рта и т.д., а также чистящие композиции для зубов и ротовой полости), кожей и волосами. Имеется в виду, что настоящее изобретение охватывает композиции моющего средства в любой форме (то есть, жидкость, гранулы, кусок, полутвердые, гели, эмульсии, таблетки, капсулы и т.д.).

В виде примера, некоторые чистящие композиции, в которых вариантные протеазы в соответствии с настоящим изобретением находят применение, описаны более подробно ниже. В некоторых вариантах осуществления, в которых чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением формулируют как композиции, приемлемые для использования в моющем способе(ах) машинной стирки, композиции в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержат, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество и, по меньшей мере, одно моющее соединение, а также одно или больше вспомогательных чистящих веществ, предпочтительно выбранных из органический полимерных соединений, отбеливающих агентов, дополнительных ферментов, гасителей пены, диспергирующих агентов, агентов, диспергирующих кальциевое мыло, агентов, суспендирующих и предупреждающих переосаждение глинистых загрязнений и ингибиторов коррозии. В некоторых вариантах осуществления, композиции для стирки также содержат агенты для смягчения (то есть, в качестве дополнительных чистящих вспомогательных веществ). Композиции в соответствии с настоящим изобретением также находят применение в качестве аддитивных продуктов моющего средства в твердой или жидкой форме. Такие аддитивные продукты предназначены для дополнения и/или повышения производительности композиций традиционных моющих средств и могут быть добавлены на любой стадии процесса очистки. В некоторых вариантах осуществления, плотность композиций моющего средства для стирки в данной заявке находится в диапазоне от приблизительно 400 до приблизительно 1200 г/литр, тогда как в других вариантах осуществления, она находится в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 950 г/литр композиции, измеренная при 20°С.

В вариантах осуществления сформулированных как композиции для использования в способах для ручного мытья посуды, композиции в соответствии с изобретением предпочтительно содержат, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество и предпочтительно, по меньшей мере, одно дополнительное чистящее вспомогательное вещество, выбранное из органических полимерных соединений, агентов, усиливающих пену, ионов металлов группы II, растворителей, гидротропов и дополнительных ферментов.

В некоторых вариантах осуществления, различные чистящие композиции, такие как те, что представлены в патенте США №6,605,458, находят применение с вариантными протеазами в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, композиции, содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с настоящим изобретением, являются компактной гранулированной чистящей композицией для ткани, в тоже время в других вариантах осуществления, композиция является гранулированной чистящей композицией для ткани, пригодной для стирки окрашенных тканей, в дополнительных вариантах осуществления, композиция является гранулированной чистящей композицией для ткани, которая предусматривает смягчитель вследствие моющей способности, в дополнительных вариантах осуществления, композиция представляет собой высокопроизводительную жидкую чистящую композицию для ткани. В некоторых вариантах осуществления, композиции, содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с настоящим изобретением представляют собой чистящие композиции для тканей, такие как те, что описаны в патентах США №№6,610,642 и 6,376,450. Кроме того, вариантные протеазы в соответствии с настоящим изобретением находят применение в гранулированных композициях моющего средства для стирки, особенно полезных в европейских или японских условиях стирки (см., например, патент США №6,610,642).

В некоторых альтернативных вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает чистящие композиции для твердой поверхности, содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу, предусмотренную в данной заявке. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, композиции, содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с настоящим изобретением, являются чистящими композициями для твердой поверхности, такими как те, что описаны в патентах США №№6,610,642, 6,376,450 и 6,376,450.

В еще других вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает композиции для мытья посуды, содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу, предусмотренную в данной заявке. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, композиции, содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с настоящим изобретением является чистящей композицией для твердой поверхности, такой как та, что в патентах США №№6,610,642 и 6,376,450. В некоторых еще дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает композиции для мытья посуды, содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу, предусмотренную в данной заявке. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, композиции, содержащие, по меньшей мере, одну вариантную протеазу в соответствии с настоящим изобретением, содержат композиции по уходу за полостью рта, такие как те, что в патентах США №№6,376,450, и 6,376,450. Составы и описания соединений и чистящих вспомогательных веществ, содержащиеся в упомянутых выше патентах США №№6,376,450, 6,605,458, 6,605,458 и 6,610,642, находят применение с вариантными протеазами, предусмотренными в данной заявке.

Чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением приготавливают в любой приемлемой форме и получают, используя любой процесс, выбранный разработчиком рецептур, неограничивающие примеры которых описаны в патентах США №№5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392 и 5,486,303, все из которых включены в данную заявку путем ссылки. Когда требуется чистящая композиция с низким рН, рН такой композиции регулируют путем добавления вещества, такого как моноэтаноламин или кислотного вещества, такого как НСl.

Чистящие композиции, раскрытые в данной заявке, находят применение при очистке места (например, поверхности, отдельного предмета, посуды или ткани). Как правило, по меньшей мере, часть места контактирует с вариантом представленной чистящей композиции, в чистой форме или разбавленной в моющем растворе, и затем место необязательно моют и/или промывают. ля целей настоящего изобретения, «мытье» включает, но не ограничивается приведенным, чистку щеткой и механическое перемешивание. В некоторых вариантах осуществления, чистящие композиции, как правило, используют при концентрациях от приблизительно 500 м.д. до приблизительно 15000 м.д. в растворе. Когда моющим растворителем является вода, температура воды, как правило, находится в диапазоне от приблизительно 5°С до приблизительно 90°С и, когда местом является ткань, при этом массовое соотношение воды к ткани, как правило, составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 30:1.

Более подробно приемлемые вспомогательные вещества для очистки и/или обработки приведены ниже:

Оттеночные агенты для тканей. Несмотря на то, что включение дополнительных оттеночных красителей для ткани, в дополнение к тиофеназокрасителю не является предпочтительным, композиция может содержать один или больше дополнительных оттеночных агентов для ткани. Приемлемые оттеночные агенты для ткани включают красители, конъюгаты краситель-глина и пигменты. Приемлемые красители включают те, которые осаждаются больше на хлопчатобумажных тканях по сравнению с осаждением на синтетические ткани, такие как полиэфирные и/или нейлон. К тому же, приемлемые красители включают те, которые осаждаются больше на синтетических тканях, таких как полиэфирные и/или нейлон, по сравнению с хлопчатобумажными тканями. Приемлемые красители включают красители с малыми молекулами и полимерные красители. Приемлемые красители с малыми молекулами включают красители с малыми молекулами, выбранные из группы, состоящей из красителей, попадающих под классификации цветового показателя (С.I.): прямого голубого, прямого красного, прямого фиолетового, кислотного голубого, кислотного красного, кислотного фиолетового, основного голубого, основного фиолетового и основного красного, или их смесей. Примеры красителей с малыми молекулами включают те, которые выбраны из группы, состоящей из цветового показателя (Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK) из числа прямого фиолетового 9, прямого фиолетового 35, прямого фиолетового 48, прямого фиолетового 51, прямого фиолетового 66, прямого фиолетового 99, прямого голубого 1, прямого голубого 71, прямого голубого 80, прямого голубого 279, кислотного красного 17, кислотного красного 73, кислотного красного 88, кислотного красного 150, кислотного фиолетового 15, кислотного фиолетового 17, кислотного фиолетового 24, кислотного фиолетового 43, кислотного красного 52, кислотного фиолетового 49, кислотного фиолетового 50, кислотного голубого 15, кислотного голубого 17, кислотного голубого 25, кислотного голубого 29, кислотного голубого 40, кислотного голубого 45, кислотного голубого 75, кислотного голубого 80, кислотного голубого 83, кислотного голубого 90 и кислотного голубого 113, кислотного черного 1, основного фиолетового 1, основного фиолетового 3, основного фиолетового 4, основного фиолетового 10, основного фиолетового 35, основного голубого 3, основного голубого 16, основного голубого 22, основного голубого 47, основного голубого 66, основного голубого 75, основного голубого 159, красителей с малыми молекулами, выбранными из группы, состоящей из цветового показателя (Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK) из числа кислотного фиолетового 17, кислотного фиолетового 43, кислотного красного 52, кислотного красного 73, кислотного красного 88, кислотного красного 150, кислотного голубого 25, кислотного голубого 29, кислотного голубого 45, кислотного голубого 113, кислотного черного 1, прямого голубого 1, прямого голубого 71. Прямой фиолетовый, краситель с малой молекулой, может быть предпочтительным. Красители, выбранные из группы, состоящей из кислотного фиолетового 17, прямого голубого 71, прямого фиолетового 51, прямого голубого 1, кислотного красного 88, кислотного красного 150, кислотного голубого 29, кислотного голубого 113 и их смесей, могут быть предпочтительными.

Приемлемые полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из полимеров, содержащих ковалентно связанные хромогены (конъюгаты краситель-полимер) и полимеров с хромогенами, сополимеризованными в скелет полимера и их смеси, и полимерных красителей, выбранных из группы, состоящей из окрашивающих веществ, имеющим сродство к тканям, которые продаются под названием Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, USA), конъюгаты краситель-полимер, образованные из, по меньшей мере, одного реакционноспособного красителя и полимера, выбранного из группы, состоящей из полимеров, содержащих фрагмент, выбранный из группы, состоящей из гидроксильного фрагмента, фрагмента первичного амина, фрагмента вторичного амина, тиольного фрагмента и их смесей. В еще другом аспекте приемлемые полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, USA) Фиолетового CT, карбоксиметилцеллюлозы (CMC), конъюгированной с реактивным голубым, реактивным фиолетовым или реактивным красным красителем, таким как CMC, конъюгированная с C.I. реактивным голубым 19, продаваемая Megazyme, Wicklow, Ireland под торговым названием AZO-CM-CELLULOSE, код продукта S-ACMC, алкоксилированные трифенилметановые полимерные красители, алкоксилированные тиофеновые полимерные красители, и их смеси. Предпочтительные дополнительные оттеночные красители включают отбеливающие агенты, описанные в WO 08/87497 А1. Данные отбеливающие агенты могут быть охарактеризованы следующей структурой (I):

где R₁ и R₂ независимо могут быть выбраны из: а) [(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH], где R' выбран из группы, состоящей из Н, СН₃, CH₂О(CH₂CH₂О)_zH, и их смесей; где R" выбран из группы, состоящей из Н, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH, и их смесей; где х+у≤5; где у≥1; и где z = от 0 до 5;

b) R₁=алкил, арил или арилалкил и R₂=[(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH],

где R' выбран из группы, состоящей из Н, СН₃, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH, и их смесей; где R" выбран из группы, состоящей из Н, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH, и их смесей; где х+у≤10; где у≥1; и где z = от 0 до 5;

c) R₁=[CH₂CH(OR₃)CH₂OR₄] и R₂=[CH₂CH(OR₃)CH₂OR₄],

где R₃ выбран из группы, состоящей из Н, (СН₂СН₂О)_zН, и их смесей; и где z = от 0 до 10;

где R₄ выбран из группы, состоящей из (С₁-С₁₆)алкильной, арильной групп, и их смесей; и

d) где R1 и R2 независимо могут быть выбраны из продукта присоединения амина с оксидом стирола, глицидилметилового эфира, изобутилглицидилового эфира, изопропилглицидилового эфира, трет-бутилглицидилового эфира, 2-этилгексилглицидилового эфира или глицидилгексадецилового эфира, с последующим добавлением от 1 до 10 алкиленоксидных единиц.

Предпочтительный дополнительный оттеночный агент для ткани, который может быть включен в композиции в соответствии с изобретением, может быть охарактеризован следующей структурой (II):

где R' выбран из группы, состоящей из Н, СН₃, CH₂O(CH₂CH₂O)_zH, и их смесей; где R" выбран из группы, состоящей из Н, СН₂O(СН₂СН₂О)_zН, и их смесей; где х+у≤5; где у≥1; и где z = от 0 до 5.

Следующий предпочтительный дополнительный оттеночный краситель может быть охарактеризован следующей структурой (III):

Данный краситель, как правило, является смесью соединений, имеющих среднее значение 3-10 ЕО групп, предпочтительно 5 ЕО групп на молекулу.

Следующие дополнительные оттеночные красители представляют собой те, что описаны в USPN 2008 34511 A1 (Unilever). Предпочтительным агентом является «фиолетовый растворитель 13».

Приемлемые конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина выбранные из группы, содержащей, по меньшей мере, один катионный/основной краситель и смектитовую глину, и их смеси. В другом аспекте, приемлемые конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из одного катионного/основного красителя, выбранного из группы, состоящей из С.I. основного желтого от 1 до 108, С.I. основного оранжевого от 1 до 69, С.I. основного красного от 1 до 118, C.I. основного фиолетового от 1 до 51, С.I. основного голубого от 1 до 164, C.I. основного зеленого от 1 до 14, С.I. основного коричневого от 1 до 23, CI основного черного от 1 до 11, и глины, выбранной из группы, состоящей из монтмориллонитной глины, гекторитной глины, сапонитной глины и их смесей. В еще другом аспекте приемлемые конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из: монтмориллонитного основного голубого В7 С.I. 42595 конъюгата, монтмориллонитного основного голубого В9 С.I. 52015 конъюгата, монтмориллонитного основного фиолетового V3 С.I. 42555 конъюгата, монтмориллонитного основного зеленого G1 С.I. 42040 конъюгата, монтмориллонитного основного красного R1 С.I. 45160 конъюгата, монтмориллонитного С.I. основного черного 2 конъюгата, гекторитного основного голубого В7 С.I. 42595 конъюгата, гекторитного основного голубого В9 С.I. 52015 конъюгата, гекторитного основного фиолетового V3 С.I. 42555 конъюгата, гекторитного основного зеленого G1 С.I. 42040 конъюгата, гекторитного основного красного R1 С.I. 45160 конъюгата, гекторитного С.I. основного черного 2 конъюгата, сапонитного основного голубого В7 С.I. 42595 конъюгата, сапонитного основного голубого В9 С.I. 52015 конъюгата, сапонитного основного фиолетового V3 С.I. 42555 конъюгат, сапонитного основного зеленого G1 С.I. 42040 конъюгата, сапонитного основного красного R1 С.I. 45160 конъюгата, сапонитного С.I. основного черного 2 конъюгата и их смесей.

Приемлемые пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состоящей из флавантрона, индантрона, хлорированного индантрона, содержащего от 1 до 4 атомов хлора, пирантрона, дихлорпирантрона, монобромдихлорпирантрона, дибромдихлорпирантрона, тетрабромпирантрона, диимида перилен-3,4,9,10-тетракарбоновой кислоты, где имидные группы могут быть незамещенными или замещенными C₁-С₃-алкильным, или фенильным, или гетероциклическим радикалом, и где фенильные и гетероциклические радикалы могут дополнительно нести заместители, которые не способствуют растворимости в воде, амидов антрапиримидинкарбоновой кислоты, виолантрона, изовиолантрона, диоксазиновых пигментов, фталоцианина меди, который может содержать до 2 атомов хлора на молекулу, полихлор-фталоцианина меди или полибромхлор-фталоцианина меди, содержащего до 14 атомов брома на молекулу и их смеси. Особенно предпочтительными являются пигменты голубые от 15 до 20, главным образом пигмент голубой 15 и/или 16. Другие приемлемые пигменты включают те, которые выбраны из группы, состоящей из ультрамаринового голубого (C.I. пигмент голубой 29), ультрамаринового фиолетового (С.I. пигмент фиолетовый 15) и их смеси. Приемлемые оттеночные агенты описаны более детально в US 7,208,459 В2.

Инкапсуляты. Композиция может содержать инкапсулят. В одном аспекте, инкапсулят содержит сердцевину, оболочку, имеющую внутреннюю и внешнюю поверхности, при этом указанная оболочка инкапсулирует указанную сердцевину. Сердцевина может содержать любую добавку по уходу для стирки, как правило, сердцевина может содержать вещество, выбранное из группы, состоящей из отдушки; осветлителей; красителей; отпугивателей насекомых; силиконов; восков; ароматизаторов; витаминов; агентов для смягчения ткани; агентов по уходу за кожей в одном аспекте, парафины; ферменты; антибактериальные агенты; отбеливатели; сенсаторы; и их смесей; и указанная оболочка может содержать вещество, выбранное из группы, состоящей из полиэтиленов; полиамидов; поливиниловых спиртов, необязательно содержащих другие со-мономеры; полистиролов; полиизопренов; поликарбонатов; сложных полиэфиров; полиакрилатов; аминопластов, в одном аспекте указанный аминопласт может содержать полимочевину, полиуретан, и/или полимочевинауретан, в одном аспекте указанная полимочевина может содержать полиоксиметиленмочевину и/или меламинформальдегид; полиолефины; полисахариды, в одном аспекте указанный полисахарид может содержать альгинат и/или хитозан; желатин; шеллак; эпоксидные смолы; виниловые полимеры; нерастворимые в воде неорганические вещества; силикон; и их смеси. Предпочтительные инкапсуляты содержат отдушку. Предпочтительные инкапсуляты содержат оболочку, которая может содержать меламинформальдегид и/или поперечно связанный меламинформальдегид. Предпочтительные инкапсуляты содержат вещество сердцевины и оболочку, при этом указанная оболочка, по меньшей мере, частично окружает указанное вещество сердцевины. По меньшей мере, 75%, 85% или даже 90% указанных инкапсулятов могут иметь прочность на разрыв от 0,2 МПа до 10 МПа, и просачивание полезного агента от 0% до 20%, или даже меньше, чем 10% или 5%, исходя из общего исходного инкапсулированного полезного агента. Предпочтительными являются те, в которых, по меньшей мере, 75%, 85% или даже 90% от указанных инкапсулятов могут иметь (i) размер частицы от 1 микрона до 80 микрон, от 5 микрон до 60 микрон, от 10 микрон до 50 микрон, или даже от 15 микрон до 40 микрон, и/или (ii), по меньшей мере, 75%, 85% или даже 90% указанных инкапсулятов могут иметь толщину стенки частицы от 30 нм до 250 нм, от 80 нм до 180 нм, или даже от 100 нм до 160 нм. Поглотители формальдегида могут быть использованы с инкапсулятами, например, в капсульной суспензии, и/или могут быть добавленными к композиции перед, во время или после того как добавляют инкапсуляты к такой композиции. Приемлемые капсулы могут быть изготовлены, как представлено в USPA 2008/0305982 А1; и/или USPA 2009/0247449 А1. Альтернативно, приемлемые капсулы могут быть поставлены от Appleton Papers Inc. of Appleton, Wisconsin USA.

В предпочтительном аспекте композиция может содержать осажденное вспомогательное вещество, предпочтительно, в дополнение к инкапсулятам. Предпочтительные осажденные вспомогательные вещества выбирают из группы, состоящей из катионных и неионных полимеров. Приемлемые полимеры включают катионные крахмалы, катионную гидроксиэтилцеллюлозу, поливинилформальдегид, смолу плодоворожкового дерева, маннаны, ксилоглюканы, тамариндовую смолу, полиэтилентерефталат и полимеры, содержащие диметиламиноэтилметакрилат, необязательно с одним или больше мономерами, выбранными из группы, содержащей акриловую кислоту и акриламид.

Отдушка. Предпочтительные композиции в соответствии с изобретением содержат отдушку. Как правило, композиция содержит отдушку, которая содержит одно или больше ароматных сырьевых материалов, выбранных из группы, как описано в WO 08/87497. Однако, может быть использована любая отдушка, полезная в композиции по уходу за бельем. Предпочтительный способ включения отдушки в композиции в соответствии с изобретением представляет собой инкапсулирование частиц отдушки, содержащих или водорастворимое гидроксильное соединение, или меламинформальдегид, или модифицированный поливиниловый спирт. В одном аспекте инкапсулят содержит (а) по меньшей мере, частично водорастворимую твердую матрицу, содержащую одно или больше водорастворимых гидроксильных соединений, предпочтительно крахмал; и (b) парфюмерное масло, инкапсулированное твердой матрицей. В дополнительном аспекте, отдушка может быть предварительно связана в комплекс с полиамином, предпочтительно полиэтиленимином, для того, чтобы образовать основание Шиффа.

Полимеры. Композиция может содержать один или больше полимеров. Примерами являются необязательно модифицированная карбоксиметилцеллюлоза, поли(винил-пирролидон), полиэтиленгликоль, поли(виниловый спирт), поли(винилпиридин-N-оксид), поли(винилимидазол), поликарбоксилаты, такие как полиакрилаты, сополимеры малеиновой/акриловой кислот и сополимеры лаурилметакрилата/акриловой кислоты.

Композиция может содержать один или больше амфифильных чистящих полимеров, таких как соединение, имеющее следующую общую структуру: бис((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)(CH₃)-N⁺-C_xH_2x-N⁺-(CH₃)-бис((C₂H₅О)(C₂H₄О)n), где n = от 20 до 30, и х = от 3 до 8, или их сульфатированные, или сульфонированные варианты. В одном аспекте, данный полимер является сульфатированным или сульфонированным, чтобы обеспечить цвитерионный полимер, суспензирующий загрязнение.

Композиция предпочтительно содержит амфифильные алкоксилированные жироочистящие полимеры, которые имеют сбалансированные гидрофильные и гидрофобные свойства, такие, что они удаляют частицы жира с тканей и поверхности. Предпочтительные амфифильные алкоксилированные жироочистящие полимеры содержат ядро структуры и множество алкоксилированных групп, присоединенных к такому ядру структуры. Они могут содержать алкоксилированные полиалкиленимины, предпочтительно, имеющие внутренний полиэтиленоксидный блок и внешний полипропиленоксидный блок. Как правило, они могут быть включены в композиции в соответствии с изобретением в количествах от 0,005 до 10 мас. %, как правило, от 0,5 до 8 мас. %.

Алкоксилированные поликарбоксилаты, такие как те, которые получают из полиакрилатов, являются полезными в данной заявке, чтобы обеспечить дополнительную эффективность по удалению жира. Такие вещества описаны в WO 91/08281 и РСТ 90/01815. Химически, данные вещества содержат полиакрилаты, имеющие одну этокси боковую цепь на каждых 7-8 акрилатных единиц. Боковые цепи представляют собой формулу -(СН₂СН₂O)_m(СН₂)_nСН₃, где m означает 2-3 и n означает 6-12. Боковые цепи представляют собой сложный эфир, связанный с полиакрилатным «скелетом» с обеспечением «комбинированного» типа полимерной структуры. Молекулярная масса может варьировать, но, как правило, находится в диапазоне от приблизительно 2000 до приблизительно 50000. Такие алкоксилированные поликарбоксилаты могут содержать от приблизительно 0,05% до приблизительно 10%, по массе, композиций в данной заявке.

Смеси вспомогательных поверхностно-активных веществ и других вспомогательных ингредиентов являются особенно приемлемыми для использования с амфифильным привитым сополимером. Предпочтительный амфифильный привитой сополимер(ы) содержит (i) полиэтиленгликолевый скелет; и (ii) по меньшей мере, один подвесной фрагмент, выбранный из поливинилацетата, поливинилового спирта и их смеси. Предпочтительный амфифильный привитой сополимер представляет собой Sokalan НР22, поставляемый компанией BASF. Приемлемые полимеры включают статистические привитые сополимеры, предпочтительно поливинилацетат, привитой полиэтиленоксидный сополимер, имеющий полиэтиленоксидный скелет и многократные поливинилацетатные боковые цепи. Молекулярная масса полиэтиленоксидного скелета составляет предпочтительно приблизительно 6000 и массовое соотношение полиэтиленоксида к поливинилацетату составляет приблизительно от 40 до 60 и не больше, чем 1 точка привития на 50 этиленоксидных единиц. Как правило, они являются включенными в композиции в соответствии с изобретением в количествах от 0,005 до 10 мас. %, более обычно от 0,05 до 8 мас. %. Предпочтительно композиция содержит один или больше карбоксилатных полимеров, таких как малеат/акрилатный статистический сополимер или полиакрилатный гомополимер. В одном аспекте карбоксилатный полимер является полиакрилатным гомополимером, имеющим молекулярную массу от 4000 Да до 9000 Да, или от 6000 Да до 9000 Да. Как правило, они являются включенными в композиции в соответствии с изобретением в количествах от 0,005 до 10 мас. %, или от 0,05 до 8 мас. %.

Предпочтительно, композиция содержит один или больше полимеров, высвобождающих грязь. Примеры включают полимер, высвобождающий грязь, имеющий структуру, как описано одной из следующих формул (IV), (V) или (VI):

где:

a, b и с означают от 1 до 200;

d, е и f означают от 1 до 50;

Аr является 1,4-замещенным фениленом;

sAr является 1,3-замещенным фениленом, замещенным в положении 5 SО₃Ме;

Me является Li, К, Mg/2, Са/2, Аl/3, аммиаком, моно-, ди-, три- или тетраалкиламмонием, где алкильные приппы являются С₁-С₁₈-алкилом, или С₂-С₁₀-гидроксиалкилом, или их смесями;

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ независимо выбраны из Н или С₁-С₁₈ н- или изо-алкилов; и

R⁷ является линейным или разветвленным С₁-С₁₈-алкилом, или линейным или разветвленным С₂-С₃₀-алкенилом, или циклоалкильной группой с от 5 до 9 атомами углерода, или C₈-С₃₀-арильной группой, или С₆-С₃₀-арилалкильной группой.

Приемлемые полимеры, высвобождающие грязь, представляют собой сложнополиэфирные полимеры, высвобождающие грязь, такие как Repel-o-tex полимеры, включая Repel-o-tex SF, SF-2 и SRP6, поставляемые фирмой Rhodia. Другие приемлемые полимеры, высвобождающие грязь, включают Техсаrе полимеры, включая Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 и SRN325, поставляемые фирмой Clariant. Другие приемлемые полимеры, высвобождающие грязь, представляют собой Marloquest полимеры, такие как Marloquest SL, поставляемые фирмой Sasol.

Предпочтительно композиция содержит один или больше целлюлозных полимеров, включая те, которые выбраны из алкилцеллюлозы, алкилалкоксиалкилцеллюлозы, карбоксиалкилцеллюлозы, алкилкарбоксиалкилцеллюлозы. Предпочтительные целлюлозные полимеры выбраны из группы, содержащей карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, метил гидроксиэтилцеллюлозу, метил карбоксиметилцеллюлозу и их смеси. В одном аспекте карбоксиметилцеллюлоза имеет степень карбоксиметилзамещения от 0,5 до 0,9 и молекулярную массу от 100000 Да до 300000 Да.

Ферменты. Предпочтительно композиция содержит один или больше ферментов. Предпочтительные ферменты обеспечивают эффективность очистки и/или преимущества по уходу за тканью. Примеры приемлемых ферментов включают, но не ограничиваются приведенным, гемицеллюлазы, пероксидазы, протеазы, целлюлазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, маннаназы, пектат-лиазы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, маланазы, β-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазы, хондроитиназы, лакказы и амилазы или их смеси. Типичная комбинация представляет собой ферментный коктейль, который может содержать, например, протеазу и липазу в сочетании с амилазой. Когда они представлены в композиции, упомянутые выше дополнительные ферменты могут присутствовать на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,0001% до приблизительно 1% или даже от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5% ферментного белка по массе композиции.

Протеазы. Предпочтительно композиция содержит одну или больше протеаз. Приемлемые протеазы включают металлопротеазы и сериновые протеазы, включая нейтральные или щелочные микробные сериновые протеазы, такие как субтилизины (ЕС 3.4.21.62). Приемлемые протеазы включают те, что имеют животное, растительное или микробное происхождение. В одном аспекте, такая приемлемая протеаза может быть микробного происхождения. Приемлемые протеазы включают химически или генетически модифицированные мутанты упомянутых выше приемлемых протеаз. В одном аспекте, приемлемая протеаза может быть сериновой протеазой, такой как щелочная микробная протеаза, или/и трипсинового типа протеазой. Примеры приемлемых нейтральных или щелочных протеаз включают:

(a) субтилизины (ЕС 3.4.21.62), включая те, которые произведены из Bacillus, такой как Bacillus lentus, В. alkalophilus, В. subtilis, В. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus and Bacillus gibsonii, описанных в US 6,312,936 B1, US 5,679,630, US 4,760,025, US 7,262,042 и WO 09/021867.

(b) трипсинового типа или химотрипсинового типа протеазы, такие как трипсин (например, свинного или коровьего происхождения), включая Fusarium протеазу, описанную в WO 89/06270, и химотрипсиновые протеазы, произведенные из Cellumonas, описанные в WO 05/052161 и WO 05/052146.

(c) металлопротеазы, включая те, которые произведены Bacillus amyloliquefaciens, описанные в WO 07/044993А2.

Предпочтительные протеазы включают те, которые произведены из Bacillus gibsonii или Bacillus Lentus.

Приемлемые коммерчески доступные ферменты протеазы включают те, которые продаются под торговыми названиями Alcalase®, Savinase®, Primase®, Durazym®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme®, Neutrase®, Everlase® и Esperase® компанией Novozymes A/S (Denmark), те, которые продаются под торговыми названиями Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect Ox®, FN3®, FN4®, Excellase® и Purafect ОХР® компанией Genencor International, те, которые продаются под торговыми названиями Opticlean® и Optimase® компанией Solvay Enzymes, те, которые доступны от компании Henkel/Kemira, под названием BLAP (последовательность, представленная на фигуре 29 US 5,352,604 со следующими мутациями S99D+S101R+S103A+V104I+G159S, в дальнейшем в этом документе рассматривается как BLAP), BLAP R (BLAP с S3T+V4I+V199M+V205I+L217D), BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I) и BLAP F49 (BLAP с S3T+V4I+A194P+V199M+V205I+L217D) - все от Henkel/Kemira; и КАР (Bacillus alkalophilus субтилизина с мутациями A230V+S256G+S259N) от Као.

Амилазы. Предпочтительно композиция может содержать амилазу. Приемлемые альфа-амилазы включают те, которые имеют бактериальное или грибковое происхождение. Химически или генетически модифицированные мутанты (варианты) являются включенными. Предпочтительную щелочную альфа-амилазу получают из штамма Bacillus, такого как Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, или других Bacillus sp., таких как Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513, DSM 9375 (USP 7,153,818) DSM 12368, DSMZ no. 12649, KSM AP1378 (WO 97/00324), KSM K36 или KSM K38 (EP 1,022,334). Предпочтительные амилазы включают:

(a) варианты, описанные в WO 94/02597, WO 94/18314, W096/23874 и WO 97/43424, особенно варианты с заменами в одном или больше из следующих положений в сопоставлении с ферментом, перечисленным как SEQ ID No. 2 в WO 96/23874: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 и 444.

(b) варианты, описанные в USP 5,856,164 и WO 99/23211, WO 96/23873, WO 00/60060 и WO 06/002643, особенно варианты с одной или больше заменами в следующих положениях в сопоставлении с ферментом АА560, перечисленным как SEQ ID No. 12 в WO 06/002643:

26, 30, 33, 82, 37, 106, 118, 128, 133, 149, 150, 160, 178, 182, 186, 193, 203, 214, 231, 256, 257, 258, 269, 270, 272, 283, 295, 296, 298, 299, 303, 304, 305, 311, 314, 315, 318, 319, 339, 345, 361, 378, 383, 419, 421, 437, 441, 444, 445, 446, 447, 450, 461, 471, 482, 484, предпочтительно, которые также содержат делении D183* и G184*.

(c) варианты, демонстрирующие, по меньшей мере, 90% идентичность с SEQ ID No. 4 в WO 06/002643, ферментом дикого типа от Bacillus SP722, особенно варианты с делениями в 183 и 184 положениях и варианты, описанные в WO 00/60060, которые включены в данную заявку путем ссылки.

(d) варианты, демонстрирующие, по меньшей мере, 95% идентичность с ферментом дикого типа от Bacillus sp. 707 (SEQ ID NO: 7 в US 6,093, 562), особенно те, которые включают одну или больше из следующих мутаций М202, М208, S255, R172 и/или М261. Предпочтительно, указанная амилаза содержит одну или больше из M202L, M202V, M202S, М202Т, M202I, M202Q, M202W, S255N и/или R172Q. Особенно предпочтительными являются те, которые включают M202L или М202Т мутации.

(e) варианты, описанные в WO 09/149130, предпочтительно те, которые демонстрируют, по меньшей мере, 90% идентичность с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 в WO 09/149130, ферментом дикого типа от Geobacillus Stearophermophilus или его усеченной версией.

Приемлемые коммерчески доступные альфа-амилазы включают DURAMYL®, LIQUEZYME®, TERMAMYL®, TERMAMYL ULTRA®, NATALASE®, SUPRAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, FUNGAMYL® и BAN® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200 Wien Austria, RAPIDASE®, PURASTAR®, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS®, POWERASE® и PURASTAR OXAM® (Genencor International Inc., Palo Alto, California) и KAM® (Kao, 14-10 Nihonbashi Kayabacho, 1-chome, Chuo-ku Tokyo 103-8210, Japan). В одном аспекте, приемлемые амилазы включают NATALASE®, STAINZYME® и STAINZYME PLUS® и их смеси.

Липазы. Предпочтительно изобретение содержит одну или больше липаз, включая «липазы первого цикла стирки», такие как те, что описаны в патенте США 6,939,702 В1 и US РА 2009/0217464. Предпочтительные липазы представляют собой липазы первого цикла стирки. В одном варианте осуществления в соответствии с изобретением, композиция содержит липазу первого цикла стирки. Липазы первого цикла стирки включают липазу, которая является полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, которая: (а) имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с липазой дикого типа, произведенной штаммом Humicola lanuginosa DSM 4109; (b) по сравнению с указанной липазой дикого типа, содержит замену электрически нейтральной или отрицательно заряженной аминокислоты на поверхности трехмерной структуры в пределах 15А Е1 или Q249 на положительно заряженную аминокислоту; и (с) содержит пептидное присоединение на С-конце; и/или (d) содержит пептидное присоединение на N-конце и/или (е) удовлетворяет следующим ограничениям: i) содержит отрицательную аминокислоту в положении Е210 указанной липазы дикого типа; и) содержит отрицательно заряженную аминокислоту в области, соответствующей положениям 90-101 указанной липазы дикого типа; и iii) содержит нейтральную или отрицательную аминокислоту в положении, соответствующему N94 или указанной липазе дикого типа и/или имеет отрицательный или нейтральный сетевой электрический заряд в области, соответствующей положениям 90-101 указанной липазы дикого типа. Предпочтительными являются варианты липазы дикого типа Thermomyces lanuginosus, содержащей одну или больше из T231R и N233R мутаций. Последовательность дикого типа представляет собой 269 аминокислот (аминокислоты 23-291) со Swissprot номером доступа Swiss-Prot 059952 (полученная из Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa)). Предпочтительные липазы должны включать те, которые продаются под торговыми названиями Lipex®, и Lipolex®, и Lipoclean®.

Эндоглюканазы. Другие предпочтительные ферменты включают микробно-полученные эндоглюканазы, демонстрирующие активность эндо-бета-1,4-глюканазы (Е.С. 3.2.1.4), включая бактериальный полипептид, эндогенный к члену из рода Bacillus, который имеет последовательность, по меньшей мере, с 90%, 94%, 97% и даже 99% идентичностью к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 в US 7,141,403 B2) и их смеси. Приемлемые эндоглюканазы продают под торговыми названиями Celluclean® и Whitezyme® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark).

Пектат-лиазы. Другие предпочтительные ферменты включают пектат-лиазы, продаваемые под торговыми названиями Pectawash®, Pectaway®, Xpect® и маннаназы, продаваемые под торговыми названиями Mannaway® (все от Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark), и Purabrite® (Genencor International Inc., Palo Alto, California).

Отбеливающие агенты. Для композиции предпочтительным может быть содержание одного или больше отбеливающих агентов. Приемлемые отбеливающие агенты, другие, чем катализаторы отбеливания, включают фотоотбеливатели, активаторы отбеливания, перекись водорода, источники перекиси водорода, предварительно сформированные перкислоты и их смеси. В основном, когда используют отбеливающий агент, композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать от приблизительно 0,1% до приблизительно 50% или даже от приблизительно 0,1% до приблизительно 25% отбеливающего агента или смеси отбеливающих агентов по массе данной композиции. Примеры приемлемых отбеливающих агентов включают:

(1) фотоотбеливатели, например, сульфированный фталоцианин цинка, сульфированные фталоцианины алюминия, ксантеновые красители и их смеси;

(2) предварительно сформированные перкислоты: приемлемые предварительно сформированные перкислоты включают, но не ограничиваются приведенным, соединения, выбранные из группы, состоящей из предварительно сформированных пероксикислот или их солей, как правило, перкарбоновых кислот и солей, перугольных кислот и солей, перимидных кислот и солей, пероксимоносерных кислот и солей, например, Охоnе®, и их смеси. Приемлемые примеры включают пероксикарбоновые кислоты или их соли, или пероксисульфоновые кислоты или их соли. Типичные соли пероксикарбоновой кислоты, приемлемые для использования в данной заявке, имеют химическую структуру, соответствующую следующую химическую формулу:

где: R¹⁴ выбран из алкильных, арилалкильных, циклоалкильных, арильных или гетероциклических групп; R¹⁴ группа может быть линейной или разветвленной, замещенной или незамещенной; имеющей, когда перкислота является гидрофобной, от 6 до 14 атомов углерода, или от 8 до 12 атомов углерода и, когда перкислота является гидрофильной, меньше, чем 6 атомов углерода или даже меньше, чем 4 атома углерода и Y является любым приемлемым противоионом, что достигает нейтральность электрического заряда, предпочтительно Y выбран из водорода, натрия или калия. Предпочтительно, R¹⁴ представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный С_6-9-алкил. Предпочтительно, пероксикислоту или ее соль выбирают из пероксигексановой кислоты, пероксигептановой кислоты, пероксиоктановой кислоты, пероксинонановой кислоты, пероксидекановой кислоты, их любой соли, или их любая комбинация. Особенно предпочтительными пероксикислотами являются фталимидо-перокси-алкановые кислоты, в частности ε-фталимидопероксигексановая кислота (РАР). Предпочтительно, пероксикислота или ее соль имеет температуру плавления в диапазоне от 30°С до 60°С.

Предварительно сформированные пероксикислота или ее соль, кроме того, может быть пероксисульфоновой кислотой или ее солью, как правило, имеющей химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:

где: R¹⁵ выбран из алкильных, арилалкильных, циклоалкильных, арильных или гетероциклических групп; R¹⁵ группа может быть линейной или разветвленной, замещенной или незамещенной; и Z является любым приемлемым противоионом, что достигает нейтральность электрического заряда, предпочтительно Z выбран из водорода, натрия или калия. Предпочтительно, R¹⁵ представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный С_4-14, предпочтительно С_6-14-алкил. Предпочтительно, такие отбеливающие компоненты могут присутствовать в композициях в соответствии с изобретением в количестве от 0,01 до 50%, наиболее предпочтительно от 0,1% до 20%.

(3) источники перекиси водорода, например, неорганические пергидратные соли, включая соли щелочных металлов, такие как натриевые соли пербората (обычно моно- или тетрагидрат), перкарбоната, персульфата, перфосфата, персиликата и их смеси. В одном аспекте в соответствии с изобретением неорганические пергидратные соли выбраны из группы, состоящей из натриевых солей пербората, перкарбоната и их смеси. Когда используются, неорганические пергидратные соли, как правило, присутствуют в количествах от 0,05 до 40 мас. %, или от 1 до 30 мас. % от всей для очистки и/или обработки и, как правило, являются включенными в такие композиции для очистки и/или обработки в виде кристаллических твердых веществ, которые могут быть покрыты. Приемлемые покрытия включают, неорганические соли, такие как силикатные, карбонатные или боратные соли щелочных металлов или их смеси, или органические вещества, такие как водорастворимые или диспергируемые полимеры, воски, масла или жирные мыла; и

(4) активаторы отбеливания, имеющие R-(C=О)-L, где R является алкильной группой, необязательно разветвленной, имеющей, когда активатор отбеливания является гидрофобным, от 6 до 14 атомов углерода, или от 8 до 12 атомов углерода и, когда активатор отбеливания является гидрофильным, меньше, чем 6 атомов углерода или даже меньше, чем 4 атома углерода; и L является уходящей группой. Примерами приемлемых уходящих групп являются бензойная кислота и ее производные - главным образом бензолсульфонат. Приемлемые активаторы отбеливания включают додеканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензойная кислота и ее соли, 3,5,5-триметилгексаноилоксибензола сульфонат, тетраацетилэтилендиамина (TAED) и нонаноилоксибензола сульфонат (NOBS). Приемлемые активаторы отбеливания также раскрыты в WO 98/17767. В то время как может быть применен любой приемлемый активатор отбеливания, в одном аспекте в соответствии с изобретением данная композиция может содержать NOBS, TAED или их смеси.

(5) Катализаторы отбеливания. Композиции в соответствии с настоящим изобретением также могут включать один или больше катализаторов отбеливания, способных к акцептированию атома кислорода от пероксикислоты и/или ее соли, и переносу атома кислорода к субстрату, способному к окислению. Приемлемые катализаторы отбеливания включают, но не ограничиваются приведенным: иминиевые катионы и полиионы; иминиевые цвитерионы; модифицированные амины; модифицированные оксиды аминов; N-сульфонилимины; N-фосфонилимины; N-ацилимины; тиадиазола диоксиды; перфторимины; циклические кетоны Сахаров и альфа аминокетоны и их смеси. Приемлемые альфа аминокетоны является теми, например, как описано в WO 2012/000846 A1, WO 2008/015443 А1 и WO 2008/014965 А1. Приемлемые смеси описаны в USPA 2007/0173430 А1.

Не желая быть связанными с теорией, изобретатели предполагают, что контролирование электрофильности и гидрофобности в данном описанном выше способе дает возможность отбеливающему ингредиенту быть доставленным по существу только на области ткани, которые являются более гидрофобными, и которые содержат богатые электронами загрязнения, включая видимые хромофоры, которые являются восприимчивыми к отбеливанию высокоэлектрофильными окислителями.

В одном аспекте, катализатор отбеливания имеет структуру, соответствующую общей формуле, приведенной ниже:

где R¹³ выбран из группы, состоящей из 2-этилгексила, 2-пропилгептила, 2-бутилоктила, 2-пентилнонила, 2-гексилдецила, н-додецила, н-тетрадецила, н-гексадецила, н-октадецила, изо-нонила, изо-децила, изо-тридецила и изо-пентадецила;

(6) Композиция может предпочтительно содержать каталитические комплексы металлов. Один предпочтительный тип металл-содержащего катализатора отбеливания представляет собой каталитическую систему, содержащую катион переходного металла определенной каталитической активности отбеливания, такой как катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца, вспомогательный катион металла, имеющий маленькую или не имеющий каталитической активности отбеливания, такой как катионы цинка или алюминия, и изолирующий реагент, имеющий определенные константы стабильности для каталитических и вспомогательных катионов металла, в частности этилендиаминтетрауксусная кислота, этилендиаминтетра(метиленфосфоновая кислота) и ее водорастворимые соли. Такие катализаторы раскрыты в U.S. 4,430,243.

Если требуется, композиции в данной заявке могут быть катализированы посредством соединения марганца. Такие соединения и уровни использования хорошо известны из уровня техники и включают, например, катализаторы на основе марганца, раскрытые в U.S. 5,576,282.

Катализаторы отбеливания на основе кобальта, приемлемые в данной заявке, известны, и раскрыты, например, в U.S. 5,597,936; U.S. 5,595,967. Такие катализаторы на основе кобальта легко получают по известным методикам, таким как те, что изложены, например, в U.S. 5,597,936, и U.S. 5,595,967.

Композиции в данной заявке могут также приемлемо включать комплекс переходного металла с лигандами, такими как биспидоны (WO 05/042532 А1) и/или макрополициклические жесткие лиганды - сокращенно как «MRL». На практике, и не в виде ограничения, композиции и процессы в данной заявке могут быть регулированы так, чтобы обеспечить приблизительно, по меньшей мере, одну часть на сто миллионов активных MRL видов в водной моющей среде, и будут, как правило, обеспечивать от приблизительно 0,005 м.д. до приблизительно 25 м.д., от приблизительно 0,05 м.д. до приблизительно 10 м.д. или даже от приблизительно 0,1 м.д. до приблизительно 5 м.д., MRL в моющем растворе.

Приемлемые переходные металлы в немедленном катализаторе отбеливания на основе переходных металлов включают, например, марганец, железо и хром. Приемлемые MRL включают 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6.6.2]гексадекан.

Приемлемые MRL переходных металлов легко получают с помощью известных методик, таких как изложены, например, в WO 00/32601 и U.S. 6,225,464.

Когда присутствуют, источник перекиси водорода/перкислоты и/или активатора отбеливания, в основном, присутствуют в композиции в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 60 мас. %, от приблизительно 0,5 до приблизительно 40 мас. % или даже от приблизительно 0,6 до приблизительно 10 мас. % на основе композиции для очистки и/или обработки. Одна или больше гидрофобных перкислот или их предшественников могут быть использованы в комбинации с одной или больше гидрофильных перкислот или их предшественников.

Как правило, источник перекиси водорода и активатор отбеливания будут включены вместе. Количества источника перекиси водорода, и перкислоты или активатора отбеливания могут быть выбраны таким образом, что молярное соотношение доступного кислорода (из источника пероксида) к перкислоте составляет от 1:1 до 35:1, или даже от 2:1 до 10:1.

Поверхностно-активное вещество. Предпочтительно композиция содержит поверхностно-активное вещество или систему поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активное вещество может быть выбрано из неионных, анионных, катионных, амфотерных, амфолитических, амфифильных, цвитерионных, полуполярных неионных поверхностно-активных веществ и их смесей. Предпочтительные композиции содержат смесь поверхностно-активных веществ/систем поверхностно-активных веществ. Предпочтительные системы поверхностно-активных веществ содержат одно или больше анионных поверхностно-активных веществ, наиболее предпочтительно в комбинации со вспомогательным поверхностно-активным веществом, наиболее предпочтительно неионных и/или амфотерных и/или цвитерионных поверхностно-активных веществ. Предпочтительные системы поверхностно-активных веществ содержат, как анионное, так и неионное поверхностно-активное вещество, предпочтительно в массовых соотношениях от 90:1 до 1:90. В некоторых примерах предпочтительным является массовое соотношение анионного к неионному поверхностно-активному веществу, по меньшей мере, 1:1. Однако, может быть предпочтительным соотношение ниже 10:1. Когда присутствует, общий уровень поверхностно-активного вещества составляет, предпочтительно, от 0,1% до 60%, от 1% до 50% или даже от 5% до 40% по массе данной композиции.

Предпочтительно композиция содержит анионное моющее поверхностно-активное вещество, предпочтительно сульфатные и/или сульфонатные поверхностно-активные вещества. Предпочтительные примеры включают алкилбензолсульфонаты, алкилсульфаты и алкилалкоксилированные сульфаты. Предпочтительные сульфонаты представляют собой С_10-13-алкилбензолсульфонат. Приемлемый алкилбензолсульфонат (LAS) может быть получен путем сульфонирования коммерчески доступного линейного алкилбензола (LAB); приемлемый LAB включает низший 2-фенил LAB, такой как те, что поставляются компанией Sasol под торговым названием Isochem®, или такой как тот, что поставляется компанией Petresa под торговым названием Petrelab®, другой приемлемый LAB включают высший 2-фенил LAB, такой как тот, что поставляется компанией Sasol под торговым названием Hyblene®. Приемлемым анионным моющим поверхностно-активным веществом является алкилбензолсульфонат, который получают, используя DETAL катализируемый процесс, несмотря на то, что также могут быть приемлемыми другие пути синтеза, такие как HF. В одном аспекте используют магниевую соль LAS.

Предпочтительные сульфатные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилсульфат, как правило C_8-18-алкилсульфат, или преимущественно С₁₂-алкилсульфат. Дополнительный предпочтительный алкилсульфат представляет собой алкилалкоксилированный сульфат, предпочтительно С_8-18-алкилалкоксилированный сульфат. Предпочтительно алкоксилирующая группа является этоксилирующей группой. Как правило, алкилалкоксилированный сульфат имеет среднюю степень алкоксилирования от 0,5 до 30 или 20, или от 0,5 до 10. Особенно предпочтительным является С_8-18-алкилэтоксилированный сульфат, имеющий среднюю степень этоксилирования от 0,5 до 10, от 0,5 до 7, от 0,5 до 5 или даже от 0,5 до 3.

Алкилсульфат, алкилалкоксилированный сульфат и алкилбензолсульфонаты могут быть линейными или разветвленными, замещенными или незамещенными. Когда поверхностно-активное вещество является разветвленным, предпочтительно поверхностно-активное вещество будет содержать сульфат с разветвлением в середине цепи или сульфонатное поверхностно-активное вещество. Предпочтительно разветвленные группы содержат С_1-4-алкильные группы, как правило, метальные и/или этильные группы.

Предпочтительно композиция содержит неионное моющее поверхностно-активное вещество. Приемлемые неионные поверхностно-активные вещества выбраны из группы, состоящей из: C₈-C₁₈-алкилэтоксилатов, таких как NEODOL® неионные поверхностно-активные вещества от Shell; С₆-С₁₂-алкилфенолалкоксилатов, где алкоксилатные единицы могут быть этиленоксиединицами, пропиленоксиединицами или их смесями; конденсатов С₁₂-С₁₈-спирта и С₆-С₁₂-алкилфенола с блокполимерами на основе этиленоксида/пропиленоксида, таких как Pluronic® от BASF; С₁₄-С₂₂-спиртов с разветвлением в середине цепи; С₁₄-С₂₂-алкилалкоксилатов с разветвлением в середине цепи, как правило, имеющих среднюю степень алкоксилирования от 1 до 30; алкилполисахаридов, в одном аспекте, алкилполигликозидов; амидов полигидроксижирных кислот; закрытых поли(оксиалкилированных) спиртовых поверхностно-активных веществ с блокированными эфирными группами; и их смеси.

Приемлемые неионные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилполигликозид и/или алкилалкоксилированный спирт.

В одном аспекте неионные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилалкоксилированные спирты, в одном аспекте С_8-18-алкилалкоксилированный спирт, например С_8-18-алкилэтоксилированный спирт, при этом алкилалкоксилированный спирт может иметь среднюю степень алкоксилирования от 1 до 80, предпочтительно от 1 до 50, наиболее предпочтительно от 1 до 30, от 1 до 20 или от 1 до 10. В одном аспекте алкилалкоксилированный спирт может быть C_8-18-алкилэтоксилированным спиртом, имеющим среднюю степень этоксилирования от 1 до 10, от 1 до 7, более от 1 до 5 или от 3 до 7, или даже ниже 3 или 2.

Алкилалкоксилированный спирт может быть линейным или разветвленным, и замещенным или незамещенным.

Приемлемые неионные поверхностно-активные вещества включают поверхностно-активные вещества с торговым названием Lutensol® от BASF.

Приемлемые катионные моющие поверхностно-активные вещества включают алкильные соединения пиридиния, алкильные соединения четвертичного аммония, алкильные соединения четвертичного фосфония, алкильные соединения третичного сульфония, и их смеси.

Приемлемые катионные моющие поверхностно-активные вещества представляют собой четвертичные аммониевые соединения, имеющие общую формулу:

(R)(R₁)(R₂)(R₃)N⁺X^-,

где R представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный С_6-18-алкильный или алкенильный фрагмент, R₁ и R₂ независимо выбраны из метильного или этильного фрагментов, R₃ представляет собой гидроксильный, гидроксиметильный или гидроксиэтильный фрагмент, X представляет собой анион, который обеспечивает нейтральность заряда, приемлемые анионы включают: галогениды, например хлорид; сульфат; и сульфонат. Приемлемые катионные моющие поверхностно-активные вещества представляет собой хлориды четвертичного моно-С_6-18-алкилмоногидроксиэтилдиметиламмония. Особо приемлемые катионные моющие поверхностно-активные вещества представляют собой хлорид четвертичного моно-С_8-10-алкилмоногидроксиэтилдиметиламмония, хлорид четвертичного моно-С_10-12-алкилмоногидроксиэтиллиметиламмония и хлорид четвертичного моно-С₁₀-алкилмоногидроксиэтилдиметиламмония.

Приемлемые амфотерные/цвитерионные поверхностно-активные вещества включают аминоксиды и бетаины.

Амин-нейтрализованные анионные поверхностно-активные вещества Анионные поверхностно-активные вещества в соответствии с настоящим изобретением и вспомогательные анионные соповерхностно-активные вещества, могут существовать в кислотной форме, и указанная кислотная форма может быть нейтрализована с образованием солевой формы поверхностно-активного вещества, которая необходима для использования в представленных композициях моющего средства. Типичные агенты для нейтрализации включают метал-противоионные основания, такие как гидроксиды, например, NaOH или КОН. Дополнительные предпочтительные агенты для нейтрализации анионных поверхностно-активных веществ в соответствии с настоящим изобретением и вспомогательных анионных поверхностно-активных веществ или соповерхностно-активных веществ в их кислотных формах включают аммиак, амины или аминоспирты. Аминоспирты являются предпочтительными. Приемлемые, неограничивающие примеры включают моноэтаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин и другие линейные или разветвленные аминоспирты, известные из уровня техники; например, особо предпочтительные аминоспирты включают 2-амино-1-пропанол, 1-аминопропанол, моноизопропаноламин или 1-амино-3-пропанол. Аминная нейтрализация может быть осуществлена до полной или частичной степени, например, часть смеси анионных поверхностно-активных веществ может быть нейтрализована натрием или калием и часть смеси анионных поверхностно-активных веществ может быть нейтрализована аминами или аминоспиртами.

Моющие компоненты. Предпочтительно композиция содержит один или больше моющих компонентов или систем моющих компонентов. Когда используют моющий компонент, композиция в соответствии с изобретением, как правило, будет содержать, по меньшей мере, 1%, от 2% до 60% моющего компонента. Предпочтительным может быть то, что композиция содержит низкие уровни фосфатной соли и/или цеолита, например от 1 до 10 или 5 мас. %. Композиция даже может быть по существу свободной от сильного моющего компонента; по существу свободная от сильного моющего компонента означает «не преднамеренно добавленный» цеолит и/или фосфат. Типичные цеолитные моющие компоненты включают цеолит А, цеолит Р и цеолит MAP. Типичный фосфатный моющий компонент представляет собой триполифосфат натрия.

Хелатирующий агент. Предпочтительно композиция содержит хелатирующие агенты и/или ингибитор роста кристаллов. Приемлемые молекулы включают хелатирующие агенты меди, железа и/или марганца и их смеси. Приемлемые молекулы включают аминокарбоксилаты, аминофосфонаты, сукцинаты, их соли и их смеси. Неограничивающие примеры приемлемых хелантов для использования в данной заявке включают этилендиаминтетраацетаты, N-(гидроксиэтил)этилендиаминтриацетаты, нитрилотриацетаты, этилендиаминтетрапропионаты, триэтилентетраамингексацетаты, диэтилентриаминпентаацетаты, этанолдиглицины, этилендиаминтетра(метиленфосфонаты), диэтилентриаминпента(метиленфосфоновая кислота) (DTPMP), этилендиаминдисункцинат (EDDS), гидроксиэтандиметиленфосфоновая кислота (HEDP), метилглициндиуксусная кислота (MGDA), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPА), их соли и их смеси. Другие неограничивающие примеры хелантов для использования в настоящем изобретении описаны в патентах США №№7445644, 7585376 и 2009/0176684 А1. Другие приемлемые хелатирующие агенты для использования в данной заявке представляют собой коммерческие серии DEQUEST, и хеланты от Monsanto, DuPont и Nalco, Inc.

Ингибитор переноса красителя (DTI). Композиция может содержать один или больше агентов, ингибирующих перенос красителя. В одном варианте осуществления в соответствии с изобретением изобретатели неожиданно обнаружили, что композиции, содержащие полимерные агенты, ингибирующие перенос красителей, в дополнение к определенным красителям дают улучшенную эффективность. Это является неожиданным, потому что данные полимеры предотвращают смещение красителя. Приемлемые ингибиторы переноса красителя включают, но не ограничиваются этим, поливинилпирролидоновые полимеры, полиамин-N-оксидные полимеры, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. Приемлемые примеры включают PVP-K15, PVP-K30, ChromaBond S-400, ChromaBond S-403E и Chromabond S-100 от Ashland Aqualon, и Sokalan HP 165, Sokalan HP50, Sokalan HP53, Sokalan HP59, Sokalan® HP 56K, Sokalan® HP 66 от BASF. Другие приемлемые DTI являются такими, как описано в WO 2012/004134. Когда они присутствуют в данной композиции, агенты, ингибирующие перенос красителей, могут присутствовать на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% или даже от приблизительно 0,1% до приблизительно 3% по массе композиции.

Флуоресцентный осветлитель. Предпочтительно композиция содержит один или больше флуоресцентных осветлителей. Коммерческие оптические осветлители, которые могут быть пригодными в настоящем изобретении могут быть классифицированы на подгруппы, которые включают, но не ограничиваются приведенным, производные стильбена, пиразолин, кумарин, карбоновую кислоту, метинцианины, дибензотиофен-5,5-диоксид, азолы, 5- и 6-членные кольцевые гетероциклы, и другие смешанные агенты. Особенно предпочтительные осветлители выбраны из: 2-(4-стирил-3-сульфофенил)-2Н-нафтол[1,2-d]триазола натрия, динатрия 4,4'-бис{[(4-анилино-6-(N-метил-N-2-гидроксиэтил)амино-1,3,5-триазин-2-ил)]амино}стильбен-2-2-дисульфоната, динатрия 4,4'-бис{[(4-анилино-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)]амино}стильбен-2-2'-дисульфоната и динатрия 4,4'-бис(2-сульфостирил)бифенила. Другие примеры таких осветлителей раскрыты в «The Production and Application of Fluorescent Brightening Agents», M. Zahradnik, Published by John Wiley & Sons, New York (1982). Конкретные неограничивающие примеры оптических осветлителей, которые являются пригодными в представленных композициях, являются те, которые идентифицированы в патенте США №4,790,856 и патенте США №3,646,015.

Предпочтительный осветлитель имеет структуру, приведенную ниже:

Приемлемые уровни флуоресцентного осветлителя включают более низкие уровни от приблизительно 0,01, от приблизительно 0,05, от приблизительно 0,1 или даже от приблизительно 0,2 мас. % до более высоких уровней 0,5 или даже 0,75 мас. %.

В одном аспекте осветлитель может быть загружен в глину с образование частиц.

Предпочтительные осветлители находятся полностью или преимущественно (как правило, по меньшей мере, 50 мас. %, по меньшей мере, 75 мас. %, по меньшей мере, 90 мас. %, по меньшей мере, 99 мас. %), в альфа кристаллической форме. Особо предпочтительный осветлитель содержит C.I. флуоресцентный осветлитель 260, предпочтительно, имеющий следующую структуру:

Данный осветлитель может быть особенно пригодным, так как он хорошо растворим в холодной воде, например, ниже 30 или 25 или даже 20°С.

Предпочтительно, осветлители включены в композицию в микронизированной порошковой форме, наиболее предпочтительно, имеющую средневзвешенный первичный размер частицы от 3 до 30 микрометров, от 3 микрометров до 20 микрометров, или от 3 до 10 микрометров.

Композиция может содержать С.I. флуоресцентный осветлитель 260 в бета-кристаллической форме, и массовое соотношение: (i) С.I. флуоресцентного осветлителя 260 в альфа-кристаллической форме к (ii) С.I. флуоресцентному осветлителю 260 в бета-кристаллической форме может составлять, по меньшей мере, 0,1, или, по меньшей мере, 0,6.

ВЕ 680847 касается процесса приготовления C.I флуоресцентного осветлителя 260 в альфа-кристаллической форме.

Силикатные соли. Композиция предпочтительно также может содержать силикатные соли, такие как силикаты натрия или калия. Композиция может содержать от 0 мас. % до меньше, чем 10 мас. % силикатной соли, до 9 мас. %, или до 8 мас. %, или до 7 мас. %, или до 6 мас. %, или до 5 мас. %, или до 4 мас. %, или до 3 мас. %, или даже до 2 мас. %, и предпочтительно от выше 0 мас. %, или от 0,5 мас. %, или даже от 1 мас. % силикатной соли. Приемлемой силикатной солью является силикат натрия.

Диспергирующие агенты. Композиция предпочтительно также может содержать диспергирующие агенты. Приемлемые водорастворимые органические вещества включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота содержит, по меньшей мере, два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более, чем двумя атомами углерода.

Стабилизаторы ферментов. Композиция предпочтительно может содержать стабилизаторы ферментов. Может быть использован любой традиционный стабилизатор фермента, например, путем присутствия водорастворимых источников ионов кальция и/или магния в конечных композициях для очистки и/или обработки, которые обеспечивают такие ионы для ферментов. В случае водных композиций, содержащих протеазу, обратимо действующий ингибитор протеазы, такой как бороновое соединение, включая борат, или предпочтительно 4-формилфенилбороновая кислота, фенилбороновая кислота и их производные, или соединения, такие как формиат кальция, формиат натрия и 1,2-пропандиол, может быть добавлен, для дальнейшего улучшения стабильности.

Система растворителей. Система растворителей в данных композициях может быть системой растворителей, содержащей только воду или смеси органических растворителей, или без, или, предпочтительно, с водой. Предпочтительные органические растворители включают 1,2-пропандиол, этанол, глицерин, дипропиленгликоль, метилпропандиол и их смеси. Также могут быть использованы другие низшие спирты, С1-С4-алканоламины, такие как моноэтаноламин и триэтаноламин. Система растворителей может отсутствовать, например, для безводных твердых вариантов осуществления в соответствии с изобретением, но больше, как правило, присутствует на уровнях в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 98%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно от 1% до приблизительно 50%, более обычно от приблизительно 5% до приблизительно 25%.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с изобретением композиция находится в форме структурированной жидкости. Такие структурированные жидкости могут быть или внутри структурированными, в соответствии с чем структуру образуют первичные ингредиенты (например, поверхностно-активное вещество), и/или внешне структурированными путем обеспечения трехмерной матричной структуры, используя вторичные ингредиенты (например, полимеры, глину и/или силикатное вещество), для использования, например, в качестве загустителей. Композиция может содержать структурирующий агент, предпочтительно от 0,01 мас. % до 5 мас. %, от 0,1 мас. % до 2,0 мас. % структурирующего агента. Примеры приемлемых структурирующих агентов приведены в US 2006/0205631 А1, US 2005/0203213 A1, US 7294611, US 6855680. Структурирующий агент, как правило, выбран из группы, состоящей из диглицеридов и триглицеридов, этиленгликоль дистеарата, микрокристаллической целлюлозы, материалов на основе целлюлозы, микроволокнистой целлюлозы, гидрофобно модифицированной щелочью поддающийся разбуханию эмульсии, такой как полигель W30 (3VSigma), биополимеров, ксантановой смолы, геллановой смолы, гидрогенизированного касторового масла, производных гидрогенизированного касторового масла, таких как их неэтоксилированные производные и их смеси, в частности те, что выбраны из группы гидрогенизированного касторового масла, производных гидрогенизированного касторового масла, микроволокнистой целлюлозы, гидроксифункциональных кристаллических материалов, жирных спиртов с длинной цепью, 12-гидроксистеариновых кислот, глин и их смеси. Предпочтительный структурирующий агент описан в патенте США №6,855,680, в котором детально определены приемлемые гидроксифункциональные кристаллические материалы. Предпочтительным является гидрогенизированное касторовое масло. Неограничивающие примеры приемлемых структурирующих агентов включают. Такие структурирующие агенты имеют нитеподобную структурирующую систему, имеющую ряд соотношений аспектов. Другие приемлемые структурирующие агенты и процессы их получения описаны в WO 2010/034736.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать жирное соединение с высокой температурой плавления. Жирное соединение с высокой температурой плавления, полезное в данной заявке, имеет температуру плавления 25°С или выше, и выбрано из группы, состоящей из жирных спиртов, жирных кислот, производных жирных спиртов, производных жирных кислот и их смесей. Такие соединения с низкой температурой плавления не предназначены для того, чтобы быть включенным в данный раздел. Неограничивающие примеры соединений с высокой температурой плавления найдены в International Cosmetic Ingredient Dictionary, Fifth Edition, 1993, and CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992. Когда оно присутствует, жирное соединение с высокой температурой плавления, предпочтительно, включено в композицию на уровне от 0,1% до 40%, предпочтительно от 1% до 30%, более предпочтительно от 1,5% до 16% по массе композиции, от 1,5% до 8% с точки зрения обеспечения улучшенных кондиционирующих преимуществ, таких как чувство скольжения во время применения к влажным волосам, смягчение и увлажняющее чувство на сухих волосах.

Катионный полимер. Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать катионный полимер. Концентрации катионного полимера в композиции, как правило, находится в диапазоне от 0,05% до 3%, в другом варианте осуществления от 0,075% до 2.0%, и в еще другом варианте осуществления от 0,1% до 1,0%. Приемлемый катионные полимеры будут иметь плотности катионного заряда, по меньшей мере, 0,5 мэкв./г, в другом варианте осуществления, по меньшей мере, 0,9 мэкв./г, в другом варианте осуществления, по меньшей мере, 1,2 мэкв./г, в еще другом варианте осуществления, по меньшей мере, 1,5 мэкв./г, но в одном варианте осуществления также меньше, чем 7 мэкв./г, а в другом варианте осуществления меньше, чем 5 мэкв./г, при рН для предназначенного использования композиции, где рН, в основном, будет находиться в диапазоне от рН 3 до рН 9, в одном варианте осуществления от рН 4 до рН 8. В данной заявке, «плотность катионного заряда» полимера относится к соотношению числа положительных зарядов на полимер к молекулярной массе полимера. Средняя молекулярная масса таких приемлемых катионных полимеров, в основном, будет составлять от 10000 до 10 миллионов, в одном варианте осуществления от 50000 до 5 миллионов, и в другом варианте осуществления от 100000 до 3 миллионов.

Приемлемые катионные полимеры для использования в композициях в соответствии с настоящим изобретением содержат катионные фрагменты, содержащие азот, такие как четвертичный аммоний или катионные протонированные аминные фрагменты. Любые анионные противоионы могут быть использованы в ассоциации с катионными полимерами при условии, что полимеры остаются растворимыми в воде, в композиции, или в коацерватной фазе композиции, и при условии, что противоионы являются физически и химически совместимыми с основными компонентами композиции, или, в противном случае, чрезмерно не ухудшают эффективность продукта, стабильность или эстетические свойства. Неограничивающие примеры таких противоионов включают галогениды (например, хлорид, фторид, бромид, йодид), сульфат и метилсульфат.

Неограничивающие примеры таких полимеров описаны в CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary, 3rd edition, edited by Estrin, Crosley, and Haynes, (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. (1982)).

Другие приемлемые катионные полимеры для использования в композиции включают полисахаридные полимеры, производные катионной гуаровой смолы, эфиры целлюлозы, содержащей четвертичный азот, синтетические полимеры, сополимеры этерефицированной целлюлозы, гуар и крахмал. Когда используются, катионные полимеры в данной заявке являются или растворимыми в композиции, или являются растворимыми в комплексе коацерватной фазы в композиции, образованной катионным полимером и анионным, амфотерным и/или цвитерионным компонентом поверхностно-активного вещества, описанным в данной заявке ранее. Комплексные коацерваты катионного полимера также могут быть образованы с другими заряженными веществами в композиции.

Приемлемые катионные полимеры описаны в патентах США №3,962,418; 3,958,581; и публикации заявки на патент США №2007/0207109 А1.

Неионный полимер. Композиция в соответствии с настоящим изобретением может включать неионный полимер в качестве кондиционирующего агента. Полиалкиленгликоли, имеющие молекулярную массу от более, чем 1000, являются полезными в данной заявке. Полезными являются те, которые имеют следующую общую формулу:

где R⁹⁵ выбран из группы, состоящей из Н, метила и их смеси. Кондиционирующие агенты и, в частности, силиконы, могут быть включены в композицию. Кондиционирующие агенты, полезные в композициях в соответствии с настоящим изобретением, как правило, содержат нерастворимые в воде, диспергируемые в воде, нелетучие, жидкие, которые образуют эмульгированные жидкие частицы. Приемлемые кондиционирующие агенты для использования в композиции представляют собой такие кондиционирующие агенты, в основном, которые характеризуются как силиконы (например, силиконовые масла, катионные силиконы, силиконовые смолы, высоко рефракционные силиконы и силиконовые резины), органические кондиционирующие масла (например, углеводородные масла, полиолефины и жирные сложные эфиры) или их комбинации, или их кондиционирующие агенты, которые в противном случае образуют жидкие, диспергированные частицы в водной матрице поверхностно-активного вещества в данной заявке. Такие кондиционирующие агенты должны быть физически и химически совместимыми с основными компонентами композиция, и, в противном случае, не должны неоправдано ухудшать стабильность, эстетические свойства или эффективность продукта.

Концентрация кондиционирующего агента в композиции должна быть достаточной для обеспечения требуемых кондиционирующих преимуществ. Такая концентрация может варьировать с кондиционирующим агентом, требуемой кондиционирующей эффективностью, средним размером частиц кондиционирующего агента, типом и концентрацией других компонентов, и другими подобными факторами.

Концентрация силиконового кондиционирующего агента, как правило, находится в диапазоне от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%. Неограничивающие примеры приемлемых силиконовых кондиционирующих агентов, и необязательных суспендирующих агентов для силикона, описаны в переизданном патенте США №34,584, патентах США №№5,104,646; 5,106,609; 4,152,416; 2,826,551; 3,964,500; 4,364,837; 6,607,717; 6,482,969; 5,807,956; 5,981,681; 6,207,782; 7,465,439; 7,041,767; 7,217,777; заявках на патент США №№2007/0286837 А1; 2005/0048549 А1; 2007/0041929 А1; патенте Британии №849,433; патенте Германии №DE 10036533, все из которых включены в данную заявку путем ссылки; Chemistry and Technology of Silicones, New York: Academic Press (1968); General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 and SE 76; Silicon Compounds, Petrarch Systems, Inc. (1984); и в Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 15, 2d ed., pp 204-308, John Wiley & Sons, Inc. (1989).

Органическое кондиционирующее масло. Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать от приблизительно 0,05% до приблизительно 3%, по меньшей мере, одного органического кондиционирующего масла в качестве кондиционирующего агента, или самостоятельно или в комбинации с другими кондиционирующими агентами, такими как силиконы (описанные в данной заявке). Приемлемые кондиционирующие масла включают углеводородные масла, полиолефины и жирные сложные эфиры. Кроме того, приемлемыми для использования в композициях в данной заявке являются кондиционирующие агенты, описанные Procter & Gamble Company в патентах США №№5,674,478 и 5,750,122. Кроме того, приемлемыми для использования в данной заявке являются те кондиционирующие агенты, которые описаны в патентах США №№4,529,586, 4,507,280, 4,663,158, 4,197,865, 4,217, 914, 4,381,919 и 4,422, 853.

Гигиенический агент. Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать компоненты для доставки гигиенических преимуществ и/или преимуществ борьбы с неприятным запахом, таких как один или больше из рицинолеата цинка, тимола, четвертичной аммонийной соли, такой как Bardac®, полиэтилениминов (таких как Lupasol® от BASF) и их цинковые комплексы, серебро и соединения серебра, главным образом те, что разрабтаны для медленного высвобождения Ag+ или дисперсий нано-серебра.

Пробиотики. Композиция может содержать пробиотики, такие как те, что описаны в WO 2009/043709.

Усилители пены. Композиция предпочтительно может содержать усилители пены, если требуется высокое пенообразование. Приемлемые примеры представляют собой С10-С16 амидоспирты или С10-С14 алкилсульфаты, которые предпочтительно являются включенными на уровнях 1%-10%. С10-С14 моноэтанол- и диэтаноламиды иллюстрируют типичный класс таких усилителей пены. Также являются полезным использование таких усилителей пены со вспомогательными поверхностно-активными веществами с высоким пенообразованием, такими как аминоксиды, бетаины и султаины, указанными выше. Если требуется, водорастворимые соли магния и/или кальция, такие как MgCl₂, MgSO₄, СаСl₂, CaSO₄ и подобные, могут быть добавлены на уровнях, как правило, 0,1%-2%, чтобы обеспечить дополнительную пену и чтобы увеличить эффективность удаления загрязнений.

Гаситель пены. Соединения для уменьшения или гашения образования пены могут быть включены в композиции в соответствии с настоящим изобретением. Гаситель пены может быть особенно важным в так называемых «высоко концентрированных чистящих процессах», как описано в патентах США №№4,489,455 и 4,489,574, и в стиральных машинах с фронтальной загрузкой. Широкое разнообразие веществ может быть использовано в качестве гасителей пены, и гасители пены хорошо известны специалисту в данной области техники. См., например, Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Third Edition, Volume 7, pages 430-447 (John Wiley & Sons, Inc., 1979). Примеры гасителей пены включают монокарбоновую жирную кислоту и растворимые соли в данной заявке, углеводороды с высокой молекулярной массой, такие как парафины, сложные эфиры жирных кислот (например, триглицериды жирных кислот), сложные эфиры жирной кислоты с моновалентными спиртами, алифатические С18-С40 кетоны (например, стеароны), N-алкилированные аминотриазины, углеводородные воски, предпочтительно, имеющие температуру плавления ниже приблизительно 100°С, силиконовые гасители пены и вторичные спирты. Гасители пены описаны в патентах США №№2,954,347; 4,265,779; 4,265,779; 3,455,839; 3,933,672; 4,652,392; 4,978,471; 4,983,316; 5,288,431; 4,639,489; 4,749,740; и 4,798,679; 4,075,118; заявках на Европейский патент №№89307851.9; ЕР 150,872; и DOS 2,124,526.

Для любых композиций моющего средства, которые используют в автоматических стиральных машинах для белья, пена не должна образовываться до объема, который они заливают в стиральную машину. Гасители пены, когда используются, предпочтительно присутствуют в «количестве, которое гасит пену». Под «количеством, которое гасит пену» подразумевают, что создатель композиции может выбрать количество данного агента, контролирующего пенообразование, таким образом, что он будет в достаточной мере контролировать пенообразование, чтобы в результате получить моющее средство для стирки с низким пенообразованием для использования в автоматических стиральных машинах для белья. Композиции в данной заявке, в основном, будут содержать от 0% до 10% гасителя пены. Когда используются в качестве гасителей пены, монокарбоновые жирные кислоты и соли, в данной заявке, будут присутствовать, как правило, в количествах до 5% по массе композиции моющего средства. Предпочтительно используют от 0,5% до 3% гасителя пены на основе жирного монокарбоксилата. Силиконовые гасители пены, как правило, используют в количествах до 2,0%, по массе композиции моющего средства, несмотря на то, что более высокие количества могут быть использованы. Моностеарилфосфатные гасители пены, в основном, используют в количествах в диапазоне от 0,1% до 2% по массе композиции. Углеводородные гасители пены, как правило, используют в количествах в диапазоне от 0,01% до 5,0%, несмотря на то, что могут быть использованы более высокие количества. Спиртовые гасители пены, как правило, используют в количествах 0,2%-3% по массе конечных композиций.

Агенты с перламутровым эффектом. Агенты с перламутровым эффектом, как описано в WO 2011/163457 могут быть включены в композиции в соответствии с изобретением.

Отдушка. Предпочтительно композиция содержит отдушку, предпочтительно, в диапазоне от 0,001 до 3 мас. %, наиболее предпочтительно, от 0,1 до 1 мас. %. Много приемлемых примеров отдушки представлено в CTFA (Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association) 1992 International Buyers Guide, опубликованном CFTA Publications and OPD 1993 Chemicals Buyers Directory 80^th Annual Edition, опубликованном Schnell Publishing Co. Обычно существуют многочисленные компоненты, которые присутствуют в композициях в соответствии с изобретением, например четыре, пять, шесть, семь или больше. В смеси отдушки предпочтительно от 15 до 25 мас. % представляют собой верхние ноты. Верхние ноты определены Poucher (Journal of the Society of Cosmetic Chemists 6(2):80 [1995]). Предпочтительные верхние ноты включают розеноксид, цитрусовые масла, линалилацетат, лаванда, линалоол, дигидромирценол и цис-3-гексанол.

Процессы получения и использования чистящих композиций

Настоящее изобретение также предусматривает способ получения композиции, как описано выше, который включает получение, по меньшей мере, одного из вариантов, описанных выше, и смешивание его с вспомогательным веществом или их смесью.

Чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением приготавливают в любой приемлемой форме, такой как твердая, порошкообразная, жидкая, таблетированная или гелевая, и смешивание варианта и вспомогательного вещества могут осуществлять, используя любой приемлемый процесс, выбранный создателем состава, (см., например, патенты США №№5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, 5,486,303, 4,515,705, 4,537,706, 4,515,707, 4,550,862, 4,561,998, 4,597,898, 4,968,451, 5,565,145, 5,929,022, 6,294,514 и 6,376,445).

Чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть обеспечены в форме стандартной дозы, включая таблетки, капсулы, саше, мешочки и мешочки со множеством отделений. В некоторых вариантах осуществления фотмат стандартной дозы разрабатывают таким образом, чтобы обеспечить контролированное высвобождение ингредиентов в мешочке со множеством отделений (или другом формате стандартной дозы). Приемлемые форматы стандартных доз и форматы контролированного высвобождения известны из уровня техники (см., например, ЕР 2100949, WO 02/102955, патенты США №№4,765,916 и 4,972,017, и WO 04/111178 для веществ, приемлемых для использования в форматах стандартных доз и форматах контролированного высвобождения). В некоторых вариантах осуществления, форма стандартной дозы обеспечена путем таблеток, упакованных в водорастворимую пленку или водорастворимые мешочки. Различные форматы для стандартных доз представлены в ЕР 2100947, и известны из уровня техники. В предпочтительном мешочке со множеством отделений вариант протеазы находится в отдельном отделении от одного или больше из дополнительного фермента протеазы, фермента липазы первого цикла стирки, фермента целлюлазы, фермента амилазы, отбеливающего компонента, рН модификатора, оттеночного красителя для ткани, оптического осветлителя и неионного поверхностно-активного вещества или их смеси.

Способы использования

Настоящее изобретение также предусматривает способ обработки поверхности, в частности ткани, который включает контактирование поверхности с водной жидкостью, содержащей, по меньшей мере, один из вариантов, перечисленных выше, и вспомогательное вещество. Как правило, вариант протеазы, и вспомогательное вещество добавляют в воду с образованием моющего раствора путем добавления композиции в соответствии с изобретением в воду. Поверхность, которую чистят в способе в соответствии с изобретением, может быть любой поверхностью из ткани или требующей ухода в доме для очистки, такой как посуда, белье, твердые поверхности, контактные линзы и т.д. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, часть поверхности вводят в контакт, по меньшей мере, с одним вариантом осуществления чистящей композиции в соответствии с настоящим изобретением, в чистой форме или, предпочтительно, разбавленной в моющем растворе, и поверхность моют и необязательно споласкивают. Для целей в соответствии с настоящим изобретением, «мытье» включает, но не ограничивается приведенным, замачивание, чистку щеткой и механическое мытье. В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции в соответствии с настоящим изобретением используют при концентрациях от приблизительно 500 м.д. до приблизительно 15000 м.д. в растворе. В некоторых вариантах осуществления, в которых моющим растворителем является вода, температура воды, как правило, находится в диапазоне от приблизительно 5°С до 90°С.

Чистящая композиция может содержать композицию моющего средства для автоматического мытья посуды и/или композицию моющего средства для ручного мытья посуды, и отдельный предмет или объект, который очищают, является посудой или предметом столовой посуды. Чистящая композиция может содержать композицию моющего средства для стирки (например, порошкообразную композицию моющего средства для стирки или жидкую композицию моющего средства для стирки), и отдельный предмет, который очищают, является тканевым отдельным предметом. В некоторых других варианты осуществления, чистящая композиция представляет собой композицию для предварительной обработки белья. Чистящая композиция может содержать очиститель твердой поверхности.

В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции применяют в концентрациях от приблизительно 500 м.д. до приблизительно 15000 м.д. в растворе (например, водный моющий раствор). Когда поверхность, отдельный предмет или объект содержит ткань, массовое соотношение воды к ткани составляет, как правило, от приблизительно 1:1 до приблизительно 30:1.

Настоящее изобретение также обеспечивает способы очистки белья или тканевого отдельного предмета в стиральной машине, при этом способ включает обеспечение стиральной машины, размещение количества композиции моющего средства для стирки, содержащего, по меньшей мере, один вариантный субтилизин в соответствии с изобретением, достаточного для очистки белья или тканевого отдельного предмета, в машину (например, путем размещения композиции в соответствующей или отведенной камере для моющего средства или раздаточном устройстве в машине), размещение белья или тканевого отдельного предмета в машине, и функционирование машины таким образом, чтобы очистить белье или тканевой отдельный предмет (например, как изложено в руководстве от производителя). Способы в соответствии с настоящим изобретением включают любую композицию моющего средства для стирки белья, описанную в данной заявке, содержащую, но не ограничивающуюся приведенным, по меньшей мере, один любой вариантный субтилизин, предусмотренный в данной заявке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Настоящее изобретение описано более детально в следующих примерах, которые ни в коем случае не предназначены для ограничения границ изобретения, как заявлено.

В экспериментальном раскрытии, которое следует ниже, применяют следующие сокращения: PI (Индекс эффективности), м.д. (миллионные доли); М (молярный); мМ (миллимолярный); мкМ (микромолярный); нМ (наномолярный); моль (моль); ммоль (миллимоль); мкмоль (микромоль); нмоль (наномоль); г (граммы); мг (миллиграммы); мкг (микрограммы); пг (пикограммы); л (литры); мл (миллилитры); мкл (микролитры); см (сантиметры); мм (миллиметры); мкм (микрометры); нм (нанометры); Ед. (единицы); В (вольты); MW (молекулярная масса); с (секунды); мин (минута/минуты); ч (час/часы); °С (градусы по Цельсию); QS (достаточное количество); н.д. (не делали); об./мин (оборотов в минуту); GH (степени немецкой твердости); Н₂О (вода); dН₂О (деионизированная вода); НСl (соляная кислота); аа (аминокислота); bp (основная пара); kb (килоосновная пара); кДа (килодальтоны); кДНК (копированная или комплементарная ДНК); ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота); ssДHK (однонитевая ДНК); dsДНК (двухнитевая ДНК); dNTP (дезоксирибонуклеотид трифосфат); РНК (рибонуклеиновая кислота); MgCl₂ (хлорид магния); NaCl (хлорид натрия); мас./об. (масса к объему); об./об. (объем к объему); мас./мас. (масса к массе); g (гравитация); OD (оптическая плотность); м.д. (миллионные доли); раствор фосфатного буфера Дульбекко (Dulbecco) (DPBS); SOC (2% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ КСl); Terrific Broth (ТВ; 12 г/л бакто-триптона, 24 г/л глицерина, 2,31 г/л КН₂РО₄ и 12,54 г/л К₂НРО₄); OD₂₈₀ (оптическая плотность при 280 нм); OD₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм); А₄₀₅ (поглощение при 405 нм); Vmax (максимальная начальная скорость реакции, катализируемой ферментом); PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле); PBS (фосфатный буферный солевой раствор [150 мМ NaCl, 10 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2]); PBST (PBS+0,25% TWEEN®-20); ПЭГ (полиэтиленгликоль); ПЦР (полимеразная цепная реакция); RT-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией); SDS (натрия до децил сульфат); Tris (три(гидроксиметил)аминометан); HEPES (N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N-[2-этансульфоновая кислота]); HBS (HEPES буферный солевой раствор); Tris-HCl (три [гидроксиметил]аминометан-гидрохлорид); трицин (N-[три(гидроксиметил)метил]-глицин); CHES (2-(N-циклогексиламино)этансульфоновая кислота); TAPS (3-{[три-(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота); CAPS (3-(циклогексиламино)пропансульфоновая кислота; ДМСО (диметилсульфоксид); ДТТ (1,4-дитио-DL-треитол); SA (синапиновая кислота (s,5-диметокси-4-гидроксикоричная кислота); ТСА (трихлоруксусная кислота); Glut и GSH (восстановленный глутатион); GSSG (окисленный глутатион); ТСЕР (три[2-карбоксиэтил]фосфин); Ки (Кюри); мКи (милликюри); мкКи (микрокюри); ВЭЖХ (высоко-эффективная жидкостная хроматография); ОФ-ВЭЖХ (высоко-эффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой); ТСХ (тонкослойная хроматография); MALDI-TOF (ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы-время пролета); Ts (тозил); Вn (бензил); Ph (фенил); Ms (мезил); Et (этил), Me (метил); Taq (Thermus aquaticus ДНК полимераза); Klenow (ДНК полимераза I большой (Klenow) фрагмент); EGTA (этиленгликоль-бис(В-аминоэтиловый эфир) N,N,N',N'-тетрауксусная кислота); ЭДТУ (этилендиаминтетрауксусная кислота); blа (β-лактамаза- или ампицилин-резистентный ген); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, the Netherlands); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San Jose, CA); Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Germany); Pall (Pall Corp., East Hills, NY and Bad Kreuznach, Germany); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, the Netherlands); P&G и Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); ДНК2.0 (ДНК2.0, Menlo Park, CA); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Ireland); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norway); Dynal (Dynal, Oslo, Norway); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); BD Biosciences и/или Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL или Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japan); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Sorvall (Sorvall brand, от Kendro Laboratory Products, Asheville, NC); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Siegfried Handel (Siegfried Handel AG, Zofingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); Bio-Tek (Bio-Тек Instruments, Winooski, VT); (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Germany); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Shell Chemicals (Shell Chemicals, Inc., London, UK); Stepan (Stepan, Northfield, IL); Clariant (Clariant, Sulzbach, Germany); Industrial Цеолит (Industrial Цеолит Ltd., Grays, Essex, UK); Jungbunzlauer (Jungbunzlauer, Basel, Switzerland); Solvay (Solvay, Brussels, Belgium); 3V Sigma (3V Sigma, Bergamo, Italy); Innospec (Innospec, Ellesmere Port, UK); Thermphos (Thermphos, Vlissiggen-Ost, the Netherlands); Ciba Specialty (Ciba Specialty Chemicals, Basel, Switzerland); Dow Corning (Dow Corning, Barry, UK); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, Spain); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, the Netherlands); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); Mettler-Toledo (Mettler-Toledo Inc, Columbus, OH); RB (Reckitt-Benckiser, Slough, UK); и Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA).

Как используется в данной заявке, в некоторых списках, приведение «0» показывают, с целью обеспечения трехчислового обозначения для каждого сайта (например, «001» представляет собой то же самое, что и «1», таким образом, «А001С» представляет собой то же самое, что и «А1С»). В некоторых списках, приведение «0» не включают. Кроме того, как используется в данной заявке, «X» относится к любой аминокислоте.

В иллюстративных композициях моющего средства, обеспеченных в данной заявке, уровни ферментов выражены на чистый фермент по массе общей композиции, и, если не указано иное, ингредиенты моющего средства выражены по массе всех композиций. Сокращенные идентификации компонентов в данной заявке имеют следующие значения:

В североамериканских (NA) и западноевропейских (WE) высокопроизводительных жидких моющих средств стирки (HDL) инактивация нагреванием ферментов, представленных в коммерчески доступных моющих средствах, осуществляется путем размещения предварительного взвешенного жидкого моющего средства (в стеклянной бутылке) на водяной бане при 95°С в течение 2 часов. Время выдерживания для инактивации нагреванием NA и WE моющих средств для автоматического мытья посуды (ADW) составляет 8 часов. Как ненагретые, так и нагретые моющие средства исследуют в пределах 5 минут растворения моющего средства, чтобы безошибочно определить процент дезактивации. Активность фермента исследуют с помощью AAPF анализа.

Для исследования активности фермента в инактивированных нагреванием моющих средствах, рабочие растворы моющих средств готовят из инактивированных нагреванием исходных растворов. Соответствующие количества жесткости воды (например, 6 гран в галлоне или 12 гран в галлоне) и буфер добавляют к растворам моющего средства для соответствия требуемым условиям. Растворы смешивают путем встряхивания или переворачивания бутылок. В следующей таблице А представлена информация, относящаяся к некоторым композициям моющего средства. В некоторых экспериментах, дополнительные и/или другие коммерчески доступные моющие средства находят применение в следующих примерах.

В Таблице А представлены гранулированные композиции моющего средства для стирки, полученные в соответствии с изобретением, приемлемые для стирки тканей.

В таблице А, все уровни ферментов представлены как % ферментного сырьевого вещества, за исключением протеазы холодной воды (в соответствии с настоящим изобретением), который выражают как % активного белка, добавленного к продукту.

В Таблице В представлены гранулированные композиции моющего средства для стирки, приемлемые для автоматических стиральных машин с вертикальной загрузкой (композиции моющего средства 7-9) и стиральных машин с фронтальной загрузкой (композиции моющего средства 10-11). Исследуемый вариант GG36 протеазы и/или протеаза холодной воды в соответствии с настоящим изобретением добавляют по отдельности в данные составы.

В таблице В ингредиенты поверхностно-активного вещества могут быть получены от любого приемлемого поставщина, включая, но не ограничиваясь приведенным, BASF (например, LUTENSOL®), Shell Chemicals, Stepan, Huntsman и Clariant (например, PRAEPAGEN®). Цеолит может быть получен из источников, таких как Industrial Zeolite. Лимонная кислота и цитрат натрия могут быть получены из источников, таких как Jungbunzlauer. Натрия перкарбонат, натрия карбонат, натрия бикарбонат и натрия сесквикарбонат могут быть получены из источников, таких как Solvay. Акрилатные/малеатные сополимеры могут быть получены из источников, таких как BASF. Карбоксиметилцеллюлоза и гидрофобно модифицированная карбоксиметилцеллюлоза могут быть получены из источников, таких как CPKelco. С.I. Флуоресцентный осветлитель 260 может быть получен от 3V Sigma (например, OPTIBLANC®, OPTIBLANC® 2M/G, OPTIBLANC® 2MG/LT Extra или OPTIBLANC® Ecobright. Тетранатрия S,S-этилендиаминдисункцинат может быть получен из источников, таких как Innospec. Терефталатный сополимер может быть получен от Clariant (например, REPELOTEX SF 2). Кроме того, 1-гидроксиэтан-1,1-дифосфоновая кислота может быть получена от Thermphos. Усилитель отбеливания на основе оксазиридиния имеет следующую структуру, где R1=2-бутилоктил, и был получен в соответствии с US 2006/0089284 A1.

Ферменты NATALASE®, TERMAMYL®, STAINZYME PLUS®, CELLUCLEAN® и MANNAWAY® могут быть получены от Novozymes. Тетрасульфонат фталоцианина цинка может быть получен от Ciba Specialty Chemicals (например, TINOLUX® ВМС). Гранулированный гаситель пены может быть получен от Dow Corning. В данных композициях моющего средства, стастический привитой сополимер представляет собой сополимер полиэтиленоксида, привитый поливинилацетатом, имеющий полиэтиленоксидный скелет и множество поливинилацетатных боковых цепей. Молекулярная масса полиэтиленоксидного скелета составляет приблизительно 6000 и массовое соотношение полиэтиленоксида к поливинилацетату составляет приблизительно от 40 до 60 и не больше, чем 1 точка привития на 50 этиленоксидных единиц.

В Таблицах С-Е представлены дополнительные гранулированные композиции моющего средства, приемлемые для стиральных машин (моющие средства 36а-п). Исследуемый вариант GG36 протеазы или протеазу холодной воды в соответствии с настоящим изобретением добавляли по отдельности в данные составы.

Примечания для композиций моющего средства 36а-n в таблицах С, D, Е:

Ингредиенты поверхностно-активного вещества могут быть получены от BASF, Ludwigshafen, Germany (Lutensol®); Shell Chemicals, London, UK; Stepan, Northfield, Illinois, USA; Huntsman, Huntsman, Salt Lake City, Utah, USA; Clariant, Sulzbach, Germany (Praepagen®).

Цеолит может быть получен от Industrial Zeolite (UK) Ltd, Grays, Essex, UK.

Лимонная кислота и цитрат натрий может быть получен от Jungbunzlauer, Basel, Switzerland.

Перкарбонат натрия, карбонат натрия, бикарбонат натрия и сесквикарбонат натрия могут быть получены от Solvay, Brussels, Belgium.

Акрилатные/малеатные сополимеры могут быть получены от BASF, Ludwigshafen, Germany.

Карбоксиметилцеллюлоза и гидрофобно модифицированная карбоксиметилцеллюлоза могут быть получены от CPKelco, Arnhem, The Netherlands.

C.I. Флуоресцентный осветлитель 260 может быть получен от 3V Sigma, Bergamo, Italy как Optiblanc® Optiblanc® 2M/G, Optiblanc® 2MG/LT Extra, или Optiblanc® Ecobright.

Тетранатрия 8,8-этилендиаминдисукцинат может быть получен от Innospec, Ellesmere Port, UK.

Терефталатный сополимер может быть получен от Clariant под торговым названием Repelotex SF 2.

1-Гидроксиэтан-1,1-дифосфоновая кислота может быть получена от Thermphos, Vlissingen-Oost, The Netherlands.

Усилитель отбеливания на основе оксазиридиния имеет следующую структуру, где R1=2-бутилоктил, и был получен в соответствии с US 2006/0089284 A1.

Ферменты Natalase®, Termamyl®, Stainzyme Plus®, Celluclean® и Mannaway® могут быть получены от Novozymes, Bagsvaerd, Denmark.

Тетрасульфонат фталоцианина цинка может быть получен от Ciba Specialty Chemicals, Basel, Switzerland, как Tinolux® BMC.

Гранулированный гаситель пены может быть получен от Dow Corning, Barry, UK.

Статистический привитой сополимер представляет собой сополимер полиэтиленоксида, привитый поливинилацетатом, имеющий полиэтиленоксидный скелет и множество поливинилацетатных боковых цепей. Молекулярная масса полиэтиленоксидного скелета составляет приблизительно 6000 и массовое соотношение полиэтиленоксида к поливинилацетату составляет приблизительно от 40 до 60 и не больше, чем 1 точка привития на 50 этиленоксидных единиц.

ПРИМЕР 1

Анализы и способы тестирования

Данный пример описывает различные способы тестирования и анализы, использованные в разработке в соответствии с настоящим изобретением. Любые отклонения от предусмотренных протоколов указаны в соответствующих примерах.

Анализы выполняли, используя Biomek FX Robot (Beckman Coulter) или многоканальную пипетку (например, Rainin PipetLite, Mettler-Toledo) и SpectraMAX MTP ридер (тип 340; Molecular Devices).

А. СПОСОБЫ ТЕСТИРОВАНИЯ

Способ тестирования 1

Протокол для определения или красителя, или пигментного вещества, которое является оттеночным агентом для ткани для цели изобретения, обеспечен ниже:

1) Наполняют две емкости терготометра 800 мл Newcastle upon Tyne, UK, City Water (общей жесткостью ~12 гран на галлон США, поставляемой Northumbrian Water, Pity Me, Durham, Co. Durham, UK).

2) Вставляют емкости в терготометр, с контролированной температурой воды на 30°С и перемешиванием на 40 об./мин на протяжении эксперимента.

3) Добавляют 4,8 г IEC-B моющего средства (IEC 60456 стандартное основное моющее средство типа В для стиральных машин), поставляемого wfk, Brüggen-Bracht, Germany, в каждую емкость.

4) Через две минуты, добавляют 2,0 мг активного красителя в первую емкость.

5) Через одну минуту, добавляют лоскут непрессованого хлопка массой 50 г (поставляемый Warwick Equest, Consett, County Durham, UK), разрезаный на образцы 5 см × 5 см, в каждую емкость.

6) Через 10 минут, сливают емкости и заново наполняют холодной водой (16°С), которая имеет жесткость воды 14,4 по английскому градусу жесткости воды Кларка с мольным соотношением кальция к магнию 3:1.

7) После 2 минуты полоскания, ткани удаляют.

8) Стадии повторяют 3-7 раз для следующих трех циклов, используя те же обработки.

9) Собирают и сушат на веревке ткани в помещении в течение 12 часов.

10) Анализируют образцы, используя спектрометр Hunter Miniscan, установленный с D65 источником света и UVA отсекающим фильтром, с получением значения Хантера (Hunter) а (красно-зеленые оси) и Хантера b (желто-синие оси).

11) Усредняют значения Хантера а и Хантера b для каждой серии тканей. Если ткани, обработанные красителем, при оценивании показывают среднее различие в оттенке больше, чем 0,2 единицы на или оси а, или оси b, то считают, что он является оттеночным агентом для ткани для цели изобретения.

Способ тестирования 2

Для способа тестирования 2, анализ BMI микрообразца, представленный ниже, проводят, используя гранулированную композицию моющего средства 10 (см., таблицу D, приведенную выше). Моющее средство для стирки растворяют в воде, которая имеет жесткость 12 гран на галлон и регулируют до температуры 16°С, и добавляют фермент варианта протеазы, представляющий интерес. Эффективность ферментов вариантов протеазы потом определяют в соответствии с описанным анализом BMI микрообразца. Индекс эффективности определяют путем сравнения эффективности фермента варианта протеазы с тем ферментом В. lentus GG36 субтилизина, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, во всех случаях с дозированием фермента в диапазоне, который составляет 0,1-5 м.д. Рассматривают, что ферменты вариантов протеазы, имеющие индекс эффективности 1,1 или больше, являются протеазами холодной воды.

Способ тестирования 3

Для способа тестирования 3, анализ BMI микрообразца, представленный ниже, проводят, используя гранулированную композицию моющего средства для стирки 7 (см. таблицу D, приведенную выше). Моющее средство для стирки растворяют в воде, которая имеет жесткость 6 гран на галлон и регулируют до температуры 16°С, и добавляют фермент варианта GG36 протеазы, представляющий интерес. Эффективность ферментов вариантов GG36 протеазы потом определяют в соответствии с описанным анализом BMI микрообразца. Индекс эффективности определяют путем сравнения эффективности фермента варианта GG36 протеазы с тем ферментом В. lentus GG36 субтилизина, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, во всех случаях с дозированием фермента в диапазоне, который составляет 0,1-5 м.д. Рассматривают, что ферменты вариантов GG36 протеазы, имеющие индекс эффективности 1,1 или больше, являются протеазами холодной воды.

Способ тестирования 4

Для способа тестирования 4, анализ BMI микрообразца, представленный ниже, проводят, используя гранулированную композицию моющего средства для стирки 7 (см. таблица D, приведенную выше). Моющее средство для стирки растворяют в воде, которая имеет жесткость 6 гран на галлон и регулируют до температуры 16°С, и добавляют фермент варианта GG36 протеазы, представляющий интерес. Эффективность ферментов вариантов GG36 протеазы потом определяют в соответствии с описанным анализом BMI микрообразца. Индекс эффективности определяют путем сравнения эффективности фермента варианта GG36 протеазы со стандартным ферментом GG36-A158E, при этом указанный GG36-A158E стандартный фермент состоит из аминокислотной последовательности В. lentus субтилизин GG36 протеазы SEQ ID NO: 2, с единичной заменой глутаминовой кислоты на аланин в положении 158 (то есть, А158Е мутацией), во всех случаях с дозированием фермента в диапазоне, который составляет 0,1 5 м.д. Рассматривают, что ферменты вариантов GG36 протеазы, имеющие индекс эффективности 1,0 или больше, являются протеазами холодной воды.

Способ тестирования 6

Для способа тестирования 6, анализ BMI микрообразца проводят, используя одно из моющих средств 36а-36n в Таблице 1-2. Моющее средство растворяют в воде, которая имеет жесткость, как определено в Таблице 1-2, и регулируют до температуры 16°С. Эффективность вариантных ферментов потом определяют в соответствии с описанным анализом BMI микрообразца. Индекс эффективности определяют путем сравнения эффективности варианта с ферментом SEQ ID NO: 2, с дозированием фермента в диапазоне, который составляет 0,1-5 м.д. во всех случаях. Рассматривают, что ферменты, имеющие индекс эффективности 1,1 или больше, являются протеазами холодной воды.

Способ тестирования 7

Для способа тестирования 7, анализ BMI микрообразца проводят, используя одно из моющих средств в Таблице 1. Моющее средство растворяют в воде, которая имеет жесткость и буфер, как описано в Таблице 1, и регулируют до температуры 16°С или 25°С. Эффективность вариантных ферментов затем определяют в соответствии с описанным анализом BMI микрообразца. Индекс эффективности определяют путем сравнения эффективности варианта с ферментом SEQ ID NO: 2, с дозированием фермента в диапазоне, который составляет 0,1-5 м.д. во всех случаях. Рассматривают, что ферменты, имеющие индекс эффективности 1,1 или больше, являются протеазами холодной воды.

В. АНАЛИЗЫ

ТСА анализ для определения содержания белка

В. subtilis культуры выращивали в течение 2-3 дней при 37°С, перемешивая при 250-300 об./мин с увлажнением аэрацией. Клетки извлекали из культурального супернатанта, содержащего фермент, центрифугированием и/или фильтрацией. Концентрацию протеазы/белка/фермента определяли, используя анализ ТСА осаждения. Аликвоту (20-25 мкл) культурального супернатанта переносили в 96 луночный титрационный микропланшет с плоским дном (MTP; Costar 9017 прозрачный полистирольный планшет для связывания среды), содержащий 100 мкл/лунку 0,25 N НСl. «Базовую линию» чтения определяли путем считывания рассеивания/поглощения света на 405 нм с последующими 5 секундами смешивания. Добавляли 100 мкл/лунку 30% (мас./об.) трихлоруксусной кислоты (ТСА) в планшет, содержащий НСl, и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы способствовать осаждению белка. Рассеивание/поглощение света при 405 нм данного «тест»-планшета определяли через 5 секунд смешивания. Возрастание мутности/рассеивания света в образцах коррелирует с общим количеством осажденного белка в культуральном супернатанте. Расчеты выполняли путем вычитания считанной «базовой линии» (полученной после добавления НСl) из считанного «теста» (полученного после добавления ТСА), получая относительное измерение общего присутствующего белка. Коэффициент преобразования отношения осаждения белка к концентрации белка определяли для стандарта GG36 известной концентрацией. Данный коэффициент преобразования может быть использован для всех вариантов, поскольку осаждение меняется линейно с концентрацией. Если требуется, стандартная кривая может быть создана путем калибровки ТСА данных с анализов AAPF протеазы (см. ниже) клонов с известной определенной активностью. Однако, ТСА результаты меняются линейно по отношению к концентрации белка от 50 до 500 миллионных долей (м.д.) белка (где 1 м.д. соответствует 1 мг/л) и, таким образом, могут быть графически изображены прямо против эффективности белка для цели выбора вариантов с требуемой эффективностью.

Анализ AAPF протеазы

Для того, чтобы определить активность протеазы вариантов сериновой протеазы, более конкретно вариантов субтилизина, измеряли гидролиз N-сукцинил-L-аланил-L-аланил-L-пропил-L-фенил-п-нитроанилида (suc-AAPF-pNA). Растворами реагентов, которые использовали, были: 100 мМ Tris/HCl, рН 8,6, содержащий 0,005% TWEEN®-80 (Tris разбавленный буфер); 100 мМ Tris буфер, рН 8,6, содержащий 1 мМ СаСl₂ и 0,005% TWEEN®-80 (Tris/Ca буфер); и 160 мМ suc-AAPF-pNA в ДМСО (suc-AAPF-pNA исходный раствор) (Sigma: S-7388). Для получения рабочего раствора suc-AAPF-pNA, 1 мл sue-AAPF-pNA исходного раствора добавляли к 100 мл Tris/Ca буфера и хорошо перемешивали в течение, по меньшей мере, 10 секунд. Анализ выполняли путем добавления 10 мкл разбавленного раствора протеазы в каждую лунку 96-лункового МТР, непосредственно с последующим добавлением 190 мкл 1 мг/мл suc-AAPF-pNA рабочего раствора. Растворы смешивали в течение 5 секунд, и изменение поглощения в кинетическом режиме (25 считываний через 5 минут) считывали при 405 нм в МТР ридере, при 25°С. Активность протеазы выражали как AU (активность=ΔОD⋅мин^-1 мл^-1).

Анализ BMI микрообразца (анализ BMI)

Предварительно промытые и выделенные окрашенные микрообразцы крови, молока и чернил (BMI) (ЕМРА116) с 5,5 миллиметровым круглым диаметром в 96-лунковых титрационных микропланшетах (МТР; Corning 3641) были получены из центра тестматериалов (Center for Testmaterials) BV (Vlaardingen, The Netherlands).

Моющие средства в Таблице 1 получали путем смешивания, по меньшей мере, в течение 30 минут с водой соответствующего уровня жесткости (3:1 Ca:Mg. - СаСl₂: MgCl₂⋅6H₂O) в воде Milli-Q для композиций моющих средств 104 и 105; и в 2 мМ буфере карбоната натрия рН 10,3 для композиции моющего средства 101, 102, 103, 106 и 107, как описано в Таблице 1. Моющие средства центрифугировали и фильтровали, чтобы выделить осадок, и охлаждали льдом в течение 30 минут перед тем, как использовать для анализов, которые выполняли при 16°С.

Концентрации ферментов выравнивали до требуемой фиксированной концентрации, которая находится в диапазоне 20-50 м.д. по отношению к стандарту очищенной GG36. Была использована определенная активность GG36, используя AAPF в качестве субстрата, чтобы преобразовать вычтенные фоновые значения ТСА в концентрацию фермента в м.д. Поскольку концентрацию фермента определяли в м.д., то использовали простую формулу, чтобы рассчитать объем каждого варианта, требуемый, чтобы добавить к фиксированному объему буфера (300-600 мкл) для того, чтобы достичь требуемую концентрацию исходного фермента:

х=(мишень м.д.)(v_b)/(у-мишень м.д.)

Где х = объем фермента, у = концентрация фермента, v_b = объем буфера

Использовали робот Perkin-Elmer Janus с Versispan 8 канальным манипулятором для дозирования различных объемов фермента с исходного планшета (Axygen планшет с полуглубокими лунками с объединенными собранными вариантами, используемыми в анализе ТСА концентрации фермента) в наполненный буфером целевой планшет, используя проводящие наконечники. Образцы смешивали трижды путем набора и выпуска из пипетки. Точность разбавлений фермента подтверждали путем измерения AAPF активности компенсированного планшета и сравнения его с исходным планшетом, чтобы подтвердить, что были сделаны корректные разбавления.

После наступления равновесия, добавляли 5-15 мкл раствора фермента в планшет с BMI микрообразцом, наполненным моющим средством, чтобы достичь конечного объема ~200 мкл. В некоторых примерах, образцы фермента не уравновешивали, а вместо этого все одинаково разбавляли из исходного планшета, чтобы дать рабочий диапазон от 0,1 до 5 м.д. Оптимальные целевые концентрации для каждого анализа определяли по кривой ответа на дозу, измеряя чистящую активность выше данного диапазона для предоставленного моющего средства.

МТР герметично закрывали фольгой (Bio-Rad) и инкубировали в iEMS инкубаторе/шейкере (Thermo/Labsystems) при предварительно установленных 16°С в холодной комнате при установленных 4°С или при 25°С на рабочей поверхности в течение 15-30 минут при 1400 об./мин. После инкубации 120 мкл супернатанта переносили в свежий МТР (Corning 9017) и считывали при 600 нм, используя ридер SpectraMax. Считывания фактического поглощения получали путем вычитания контрольной пробы (без фермента) из каждого значения.

Индекс эффективности (PI) рассчитывали для каждого варианта. Индекс эффективности представляет собой соотношение поглощения супернатанта, полученного путем очистки вариантным ферментом, к поглощению, полученному путем очистки GG36 при фиксированной концентрации фермента. PI значения рассчитывали путем деления поглощения варианта на поглощение контроля на данном планшете. Если получили множество версий того же самого варианта в скрининговой библиотеке, то их PI значения усредняли, чтобы получить одно характерное значение. Индекс эффективности (PI), который является больше, чем 1 (Р1>1), показывает превосходную очистку по сравнению со стандартом (например, GG36), в то время как PI 1 (PI=1) идентифицирует вариант, который имеет эффективность такую же, как и стандарт, PI, который является меньше, чем 1 (Р1<1), идентифицирует вариант, который имеет эффективность хуже, чем стандарт.

Индекс эффективности сравнивает эффективность варианта (измеренное значение) и стандартного фермента (теоретическое значение) при одинаковой концентрации белка. Кроме того, теоретические значения могут быть рассчитаны, используя параметры кривой ответа эффективность-доза стандартной протеазы.

ПРИМЕР 2

Конструкция вариантов и комбинаторных библиотек GG36

Данный пример описывает чистящие свойства в холодной воде GG36 вариантов и сконструированных библиотек в В. Subtilis, используя pHPLT-GG36 В. subtilis экспрессионную плазмиду. Данная В. subtilis экспрессионная плазмида содержит GG36 экспрессионную кассету, показанную ниже, В. licheniformis LAT промотор (Plat) и дополнительные элементы pUBHO (McKenzie et al., Plasmid, 15:93-103, 1986), включая ген репликазы (reppUB), неомицин/канамицин резистентный ген (нео) и блеомицин резистентный маркер (блео) (Фигура 4 в патенте США №6,566,112). Карта плазмиды pHPLT-GG36 предсталена в WO 2011140364. Последовательность GG36 экспрессионной кассеты представлена ниже.

ДНК последовательность GG36 (сигнальная последовательность представлена строчными буквами, пропептид - строчными буквами, подчеркнутым текстом, и GG36 зрелая последовательность - прописными буквами) представлена ниже:

Последовательность белка GG36 (сигнальная последовательность представлена строчными буквами, пропептид - строчными буквами, подчеркнутым текстом, и GG36 зрелая последовательность - прописными буквами) представлена ниже:

ДНК библиотеки и варианты создавали, используя ПЦР удлинение (WO 2011140364), быстро меняющий мутагенез (Stratagene) или их синтезировали на ДНК2.0, Inc. или GeneArt. pHPLT -GG36 плазмиду использовали для клонирования GG36 вариантных генов или для реакций мутагенеза. Для эффективной трансформации библиотек и вариантов в В. subtilis, 1 микролитр пришитых библиотечных продуктов или реакций мутагенеза амплифицировали, используя амплификацию по типу катящегося кольца набором Illustra Templiphi в соответствии с инструкциями производителя (GE Healthcare), чтобы сгенерировать мультимерную ДНК для трансформации в Bacillus subtilis. Продукты амплификации по типу катящегося кольца разбавляли в 100 раз и использовали, чтобы трансформировать В. subtilis клетки (генотип: ΔарrЕ, ΔnрrЕ, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Аликвоту трансформационной смеси помещали на LB планшеты, содержащие 1,6% снятого молока и 10 мкг/мл неомицина, и инкубировали на протяжении ночи при 37°С. Затем, колонии с зонами инокулировали в 120 мкл бульонной питательной среды Лурии (Luria), содержащей 10 мкг/мл неомицина, для экстракции плазмидной ДНК (QIAprep Spin Miniprep kit, Qiagen). Экстрагированные плазмиды секвенировали, чтобы подтвердить присутствие требуемых мутаций. Варианты экспрессировали в В. subtilis клетках (генотип: ΔарrЕ, ΔnрrЕ, amyE::xylRPxylAcomK-phleo), как описано в Примере 1 (ТСА анализ), и далее охарактеризовывали, используя анализ очистки BMI микрообразца, как описано в Примере 1. В следующих таблицах композиции моющего средства («Моющие средства») соответствуют тем, что представлены в Таблице 1 выше. Кроме того, как показано, аминокислотное положение приведено в соответствии с BPN' нумерацией.

Размеры и значения, раскрытые в данной заявке, не следует понимать, как такие, которые строго ограничиваются изложенными точными числовыми значениями. Вместо этого, если не указано другое, подразумевается, что каждое такое измерение означает как указанное значение, так и функционально эквивалентный диапазон, окружающий такое значение. Например, подразумевается, что измерение, раскрытое как «40 мм», означает «приблизительно 40 мм».

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена композиция для очистки и/или обработки ткани, содержащая выделенный вариант субтилизина GG36 Bacillus lentus (SEQ ID NO:2), и вспомогательное вещество, где указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей субтилизиновую активность. Предложен способ получения указанной композиции, включающий стадию, на которой смешивают вспомогательное вещество с вышеуказанным вариантом субтилизина. Предложен способ обработки ткани, включающий стадию, на которой вводят в контакт ткань с водным моющим раствором, содержащим указанную композицию. Группа изобретений обладает высокой эффективностью очистки при мытье в холодной воде. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 14 табл., 2 пр.

1. Композиция для очистки и/или обработки ткани, содержащая вспомогательное вещество, предназначенное для того, чтобы способствовать или увеличивать эффективность очистки, для обработки субстрата, который нужно почистить, или чтобы модифицировать органолептические свойства чистящей композиции, и выделенный вариант субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей субтилизиновую активность, и содержит аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью субтилизиновой протеазы GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, причем указанный вариант субтилизина содержит комбинацию аминокислотных замен, выбранную из T022A-S103 А-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-VI04I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V 104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-E271F, и T022A-S101G-S103A-V1041-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, представленной в SEQ ID NO:l.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что общий суммарный заряд выделенного варианта субтилизина составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 относительно общего суммарного заряда субтилизиновой протеазы GG36 Bacillus lentus, предпочтительно 0, +1, +2, +3, +4 или +5 относительно общего суммарного заряда субтилизиновой протеазы GG36 Bacillus lentus.

3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что общий суммарный заряд выделенного варианта субтилизина составляет +1, 0, -1, -2, -3 или -4 относительно общего суммарного заряда субтилизиновой протеазы GG36 Bacillus lentus, предпочтительно 0, -1, -2, -3 или -4 относительно общего суммарного заряда субтилизиновой протеазы GG36 Bacillus lentus.

4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что общий суммарный заряд выделенного варианта субтилизина получен путем одной или более замен, выбранных из: А001Е, V004E, R010H/A, Q012E, A015D, N018D, R019H/S, V026D, K027E, N043D, R045C/T/S/P, S049D, V051E, G061E, N062D/E, N076D, N077D, S078D, S087D, А098Е, S101D, S106E, G115E, G118D, N123D, S128D, Р129Е, S130D/E, S132D, А158Е, G159D/E, S160D, S166D, R170T, N183D, N184D, N185E, R186H, S188D, А194Е, A200D, Y209E, A215D, N204D, S212D, L217D/E, N218D, А230Е, K235F, N237D, K237E, N238D, S240D, N243D, Q245D, R247L, N248D/E, K251C, N263D, N269D/E, A272D, А273Е или R275H/S, и при этом аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, представленной в SEQ ID NO:1.

5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что общий суммарный заряд выделенного варианта субтилизина получен путем одной или более замен, выбранных из: A001R, V004R, Q012R, P014R, H017R, N018R/K, G020K/R, S024R/K, G025R, D032I, D041K/L/N, N043R/K, G046R, A048R, F050R/K, P055R, S056R/K, T057R, Q059K, G061R, N076K, S078R, P086R, S087R, E089G/P/I, G097R, S099R, Q109R, G115R, G118R, S132K, S144R, G159R/K, D181C/S/T, L196K, N204K, Q206R, K235R, Q236R/K, K237R, N238R, S240R, W241R, S242R/K, V244R, Q245R/K, N248R, H249R, N252R/K, S256R, G258R, Т260К, N269R/K или E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V, и при этом аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, представленной в SEQ ID NO:1.

6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит, по меньшей мере, один дополнительный фермент, выбранный из гемицеллюлаз, целлюлаз, пероксидаз, протеаз, металлопротеаз, ксиланаз, липаз, фосфолипаз, эстераз, пергидролаз, кутиназ, пектиназ, пектат-лиаз, маннаназ, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, липоксигеназ, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, маланаз, В-глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидаз, хондроитиназ, лакказ, и амилаз, или любой их комбинации.

7. Способ получения композиции по любому из предыдущих пунктов, включающий стадию, на которой смешивают вспомогательное вещество с вариантом субтилизина, при этом указанный вариант субтилизина является зрелой формой, имеющей субтилизиновую активность, и содержит аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью субтилизиновой протеазы GG36 Bacillus lentus, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, причем указанный вариант субтилизина содержит комбинацию аминокислотных замен, выбранную из T022A-S103 А-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-VI04I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V 104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-E271F, и T022A-S101G-S103A-V1041-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, представленной в SEQ ID NO:l.

8. Способ обработки ткани, включающий стадию, на которой вводят в контакт ткань с водным моющим раствором, содержащим композицию по любому из пп. 1-6.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что водный моющий раствор имеет проводимость от 0,1 до 3 мСм/см, предпочтительно от 0,3 до 2,5 мСм/см.

10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что водный моющий раствор имеет проводимость от более 3 до 30 мСм/см, предпочтительно от 3,5 до 20 мСм/см.