ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Данная заявка заявляет приоритет по предварительным заявкам на патент США № 61/332151, поданной 6 мая 2010 года; № 61/332006, поданной 6 мая 2010 года; № 61/392364, поданной 12 октября 2010 года, и № 61/392188, поданной 12 октября 2010 года, все из которых включены ссылкой в их полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предоставляет варианты серинпротеазы. В частности, настоящее изобретение предоставляет варианты серинпротеазы с одной или более заменами по сравнению с эталонной серинпротеазой. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет композиции, включающие эти варианты серинпротеазы. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет очищающие композиции, включающие по меньшей мере один из этих вариантов серинпротеазы.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Несмотря на то, что серинпротеазы давно известны в области техники промышленных ферментов, остается необходимость в сконструированных протеазах, которые подходят для определенных условий и применений.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предоставляет варианты серинпротеазы. В частности, настоящее изобретение предоставляет варианты серинпротеазы с одной или более заменами по сравнению с эталонной серинпротеазой. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет композиции, включающие эти варианты серинпротеазы. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет очищающие композиции, включающие по меньшей мере один из этих вариантов серинпротеазы.
Настоящее изобретение предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X1R, X2W, X2M, X2R, X2A, X2S, X3R, X4R, X4C, X4S, X8A, X9F, X9W, X9A, X10S, X10M, X10H, X10A, X12R, X12F, X14K, X14F, X14Q, X15R, X15F, X16S, X17R, X17M, X17F, X18R, X18K, X20F, X20R, X20K, X22Y, X22A, X22R, X22V, X22Q, X22W, X22L, X23F, X23S, X23A, X24W, X24R, X24H, X24F, X24Q, X24L, X25V, X25F, X25R, X26F, X27V, X27F, X27L, X27R, X28N, X28E, X28A, X29T, X30E, X31F, X33D, X33G, X33S, X34P, X35M, X36F, X36R, X36T, X38L, X38F, X38R, X40L, X40W, X40N, X40R, X40T, X40H, X42I, X43D, X43I, X43R, X43M, X43F, X43W, X43S, X43A, X45T, X46R, X48R, X50C, X51H, X51W, X51F, X52F, X52E, X52N, X55Y, X57R, X59R, X59A, X59F, X60A, X60Q, X60P, X62E, X62Q, X63I, X63V, X63T, X63P, X63D, X63M, X63H, X63Q, X63E, X63A, X63S, X64F, X64T, X68C, X68A, X69N, X69P, X69W, X69T, X71G, X72C, X74C, X75F, X75A, X75R, X75E, X76D, X78I, X78R, X78N, X79W, X79Q, X81R, X82V, X82T, X82F, X82M, X82R, X85M, X86L, X86I, X86W, X89P, X89T, X89V, X89G, X89W, X89H, X89F, X89L, X89I, X91N, X91F, X92F, X94N, X99G, X99F, X99M, X99T, X99P, X100I, X100S, X100N, X100Q, X101N, X101A, X101G, X101P, X101F, X101E, X101T, X101D, X102H, X102N, X102E, X102T, X102A, X103G, X103D, X103N, X104D, X104E, X104I, X104L, X105Q, X105E, X105T, X106F, X106V, X106G, X106E, X106T, X106D, X106A, X107F, X107M, X108G, X108I, X109M, X111V, X111I, X112V, X112L, X112Q, X114G, X115K, X115R, X116A, X116K, X116L, X117F, X118I, X118R, X119C, X120F, X120A, X120R, X121E, X121F, X123G, X123E, X124S, X128F, X128H, X128I, X128L, X128Q, X128N, X128M, X128D, X129E, X132E, X132A, X138G, X144R, X147L, X148I, X158E, X158E, X159E, X159C, X160D, X166D, X166E, X167W, X175V, X177C, X181A, X182R, X183F, X183I, X183D, X183R, X183M, X185E, X185I, X185V, X186H, X186K, X188R, X188E, X188D, X192H, X192W, X194V, X194F, X194E, X197F, X198L, X198F, X203E, X203C, X208S, X209N, X209F, X209E, X209S, X209H, X209G, X209T, X209L, X210R, X210V, X210L, X211R, X211Q, X212I, X212M, X212F, X213A, X214F, X215F, X215N, X215D, X215H, X215E, X216F, X216A, X217N, X217E, X217D, X218P, X218D, X218E, X224A, X224G, X227I, X230E, X231I, X231C, X233C, X234F, X235F, X236F, X236N, X238L, X238K, X238R, X239K, X239S, X239T, X239G, X239H, X239R, X239N, X239F, X240R, X241R, X242L, X242R, X243R, X243F, X244R, X246S, X248I, X248V, X248R, X249R, X249T, X250I, X251S, X251R, X252I, X252F, X252H, X252R, X253F, X253I, X253R, X254C, X256N, X258R, X260V, X260I, X262H, X262D, X263F, X265F, X267N, X267V, X267M, X269I, X269R, X270C, X271F, X271V, X271I, X271P, X271H, X271M, X271T, X271L, X271A, X272F, X272R, X272F, X273I, X273F и X274G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X16S, X18R, X20R, X22A, X24R, X43R/D, X45T, X76D, X101A, X103G, X104L, X111V, X128N, X148I, X230E, X242R и X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X1R, X230E, X271L, X115R, X20R, X249R, X235F, X27V/F/L, X75E, X82R, X18R, X269R, X43D, X43R, X76D, X45T, X212F, X242R, X24R, X78R, X9A, X22R, X121E, X244R, X28E, X30E, X4R и X241R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X062E-X158E, X103G-X158E, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X089P-X158E, X111V-X158E, X022A-X158E, X101A-X158E, X148I-X158E, X129E-X158E, X022A-X089P, X016S-X089P, X062E-X089P, X062E-X271F, X158E-X271F, X186H-X271F, X129E-X271F, X111V-X271F, X209E-X271F, X016S-X271F, X188D-X271F, X022A-X271F, X159E-X271F, X104L-X271F, X101A-X271F, X089P-X271F, X128N-X271F, X103G-X271F, X148I-X271F, X249R-X271F, X062E-X159E, X016S-X159E, X128N-X159E, X148I-X159E, X111V-X159E, X089P-X159E, X022A-X159E, X129E-X159E, X103G-X159E, X104L-X159E, X158E-X159E, X101A-X159E, X158E-X249R, X111V-X249R, X129E-X249R, X062E-X249R, X016S-X249R, X186H-X249R, X148I-X249R, X159E-X249R, X101A-X249R, X188D-X249R, X104L-X249R, X209E-X249R, X022A-X249R, X128N-X249R, X103G-X249R, X089P-X249R, X022A-X111V, X101A-X111V, X016S-X111V, X104L-X111V, X062E-X111V, X103G-X111V, X089P-X111V, X016S-X148I, X062E-X148I, X022A-X148I, X129E-X148I, X104L-X148I, X103G-X148I, X128N-X148I, X101A-X148I, X089P-X148I, X111V-X148I, X016S-X062E, X022A-X062E, X062E-X129E, X022A-X129E, X128N-X129E, X016S-X129E, X101A-X129E, X104L-X129E, X089P-X129E, X103G-X129E, X111V-X129E, X062E-X186H, X128N-X186H, X101A-X186H, X022A-X186H, X016S-X186H, X158E-X186H, X089P-X186H, X129E-X186H, X159E-X186H, X103G-X186H, X104L-X186H, X111V-X186H, X148I-X186H, X062E-X101A, X022A-X101A, X016S-X101A, X089P-X101A, X062E-X103G, X022A-X103G, X016S-X103G, X101A-X103G, X089P-X103G, X062E-X128N, X016S-X128N, X022A-X128N, X101A-X128N, X104L-X128N, X089P-X128N, X103G-X128N, X111V-X128N, X111V-X188D, X062E-X188D, X016S-X188D, X148I-X188D, X022A-X188D, X128N-X188D, X101A-X188D, X104L-X188D, X089P-X188D, X129E-X188D, X159E-X188D, X186H-X188D, X103G-X188D, X158E-X188D, X016S-X022A, X016S-X104L, X022A-X104L, X101A-X104L, X062E-X104L, X103G-X104L, X089P-X104L, X159E-X209E, X111V-X209E, X101A-X209E, X016S-X209E, X128N-X209E, X148I-X209E, X129E-X209E, X062E-X209E, X022A-X209E, X103G-X209E, X158E-X209E, X188D-X209E, X104L-X209E, X089P-X209E и X186H-X209E, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X241R, X020R-X241R, X024R-X241R, X009A-X241R, X020R-X241R, X004R-X241R, X043R-X241R, X078R-X241R, X022R-X241R, X115R-X241R, X001R-X241R, X212F-X241R, X082R-X241R, X018R-X244R, X024R-X244R, X078R-X244R, X020R-X244R, X212F-X244R, X009A-X244R, X082R-X244R, X001R-X244R, X043R-X244R, X022R-X244R, X004R-X244R, X115R-X244R, X241R-X244R, X242R-X244R, X001R-X004R, X009A-X022R, X018R-X022R, X020R-X022R, X004R-X022R, X001R-X022R, X024R-X242R, X018R-X242R, X004R-X242R, X020R-X242R, X212F-X242R, X082R-X242R, X078R-X242R, X001R-X242R, X009A-X242R, X022R-X242R, X115R-X242R, X043R-X242R, X241R-X242R, X018R-X212F, X022R-X212F, X004R-X212F, X024R-X212F, X001R-X212F, X115R-X212F, X020R-X212F, X009A-X212F, X043R-X212F, X078R-X212F, X082R-X212F, X009A-X078R, X020R-X078R, X024R-X078R, X022R-X078R, X018R-X078R, X004R-X078R, X001R-X078R, X043R-X078R, X022R-X024R, X020R-X024R, X018R-X024R, X001R-X024R, X004R-X024R, X009A-X024R, X004R-X009A, X001R-X009A, X242R-X269R, X024R-X269R, X020R-X269R, X022R-X269R, X249R-X269R, X212F-X269R, X043R-X269R, X244R-X269R, X001R-X269R, X018R-X269R, X078R-X269R, X009A-X269R, X115R-X269R, X241R-X269R, X004R-X269R, X082R-X269R, X018R-X043R, X020R-X043R, X004R-X043R, X022R-X043R, X009A-X043R, X001R-X043R, X024R-X043R, X009A-X018R, X004R-X018R, X001R-X018R, X024R-X082R, X009A-X082R, X018R-X082R, X001R-X082R, X078R-X082R, X020R-X082R, X022R-X082R, X004R-X082R, X043R-X082R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X018R-X249R, X009A-X249R, X212F-X249R, X022R-X249R, X024R-X249R, X115R-X249R, X001R-X249R, X082R-X249R, X242R-X249R, X241R-X249R, X244R-X249R, X078R-X249R, X018R-X115R, X020R-X115R, X022R-X115R, X078R-X115R, X009A-X115R, X004R-X115R, X001R-X115R, X082R-X115R, X043R-X115R, X024R-X115R, X009A-X020R, X018R-X020R, X004R-X020R, X001R-X020R, X009A-X271L, X020R-X271L, X024R-X271L, X244R-X271L, X241R-X271L, X043R-X271L, X022R-X271L, X249R-X271L, X212F-X271L, X115R-X271L, X242R-X271L, X078R-X271L, X004R-X271L, X269R-X271L, X001R-X271L, X018R-X271L и X082R-X271L, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X-43R, X020K-X062E, X024F-X116L, X020K-X024F, X024R-X174T, X024R-X118R, X024R-X235F, X024R-X086R, X024R-X086W, X078R-X118R, X033S-X118R, X033S-X235F, X209A-X241R, X020R-X076D, X018R-X245R, X024R-X045T, X232V-X245R, X118R-X172V, X118R-X194T, X008T-X024R, X235F-X243F, X018R-X103A, X018R-X104I, X086W-X118R, X086W-X243F, X086W-X209A, X024C-X033S, X024R-X232V, X024R-X243F, X024R-X239Q, X024R-X101G, X024R-X141G, X024R-X033S, X024R-X274I, X024R-X209A, X078R-X086W, X101G-X232V, X033S-X148F, X033S-X086W, X033S-X201S, X033S-X078R, X033S-X241R, X033S-X209A, X230E-X249R, X232V-X249R, X118R-X235F, X076D-X245R, X086W-X235F, X024R-X247H, X024R-X104A, X078R-X235F, X101G-X249R, X103A-X232V, X033S-X048T, X033S-X239T, X033S-X253A, X143A-X209A, X209A-X235F, X018R-X045T, X209A-X243F, X024R-X272P, X024R-X269C, X101G-X104I, X104I-X232V, X076D-X249R и X024R-X076D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X076D, X024R-X045T, X230E-X249R, X018R-X045T, X018R-X245R, X101G-X232V, X024R-X232V, X232V-X245R, X024R-X101G, X018R-X104I, X018R-X103A, X101G-X249R, X232V-X249R, X103A-X232V, X076D-X245R, X101G-X104I, X104I-X232V, X076D-X249R, X024R-X076D, X024F-X116L, X020K-X024F, X020K-X062E, X033S-X118R, X024R-X086W, X024R-X118R, X024R-X086R, X209A-X241R, X024R-X241R, X024R-X235F, X118R-X209A, X078R-X118R, X033S-X235F, X024R-X174T, X086W-X209A, X008T-X024R, X086W-X118R, X033S-X241R, X024R-X243F, X024R-X209A, X033S-X086W, X024R-X033S, X086W-X243F, X033S-X201S, X024R-X239Q, X078R-X086W, X235F-X243F, X118R-X172V, X033S-X148F, X033S-X078R, X033S-X243F, X024C-X033S, X118R-X194T, X033S-X209A, X024R-X141G, X024R-X274I, X086W-X235F, X015T-X033S, X209A-X235F, X024R-X247H, X078R-X235F, X024R-X104A, X033S-X048T, X118R-X235F, X033S-X253A, X143A-X209A, X033S-X239T, X209A-X243F, X024R-X272P и X024R-X269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X004R-X009A-X020R-X242R, X020R-X043R-X241R, X020R-X242R-X269R, X004R-X009A-X020R-X043R, X004R-X020R-X249R, X018R-X024R-X244R, X009A-X022R-X212F-X241R, X020R-X043R-X269R, X018R-X024R-X242R, X004R-X009A-X043R-X241R, X020R-X043R-X244R, X020R-X022R-X242R, X004R-X020R-X043R, X004R-X009A-X020R-X043R-X242R, X020R-X043R-X242R, X020R-X043R-X242R-X249R, X020R-X212F-X249R, X004R-X009A-X241R, X001R-X009A-X043R, X020R-X043R-X249R, X009A-X020R-X043R-X241R, X020R-X022R-X043R, X020R-X249R-X269R, X020R-X022R-X241R, X004R-X009A-X024R-X043R-X241R, X009A-X043R-X078R, X004R-X020R-X024R-X244R, X020R-X022R-X078R-X242R, X020R-X024R-X242R-X249R, X004R-X009A-X078R-X241R, X009A-X043R-X078R-X242R, X004R-X020R-X024R, X009A-X043R-X212F, X020R-X043R-X212F, X024R-X078R-X212F, X009A-X020R-X024R-X043R, X009A-X022R-X043R-X078R, X020R-X022R-X212F-X241R, X020R-X043R-X212F-X241R, X009A-X043R-X241R, X020R-X043R-X271L, X020R-X022R-X078R-X241R, X020R-X024R-X043R-X242R, X020R-X022R-X043R-X241R, X009A-X020R-X043R-X212F, X004R-X009A-X020R-X024R-X242R, X020R-X043R-X249R-X271L, X020R-X022R-X024R-X242R, X009A-X022R-X078R-X212F, X020R-X043R-X242R-X271L, X009A-X022R-X078R-X212F-X241R, X004R-X020R-X024R-X249R, X020R-X022R-X271L, X020R-X022R-X043R-X212F, X004R-X020R-X024R-X043R-X242R, X004R-X020R-X024R-X043R, X004R-X009A-X022R-X078R-X212F, X020R-X022R-X078R-X212F-X241R и X020R-X022R-X269R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X020R-X043D-X045T-X230E, X018R-X043R-X045T-X242R-X249R, X024R-X043D-X249R, X018R-X020R-X045T, X020R-X024R-X076D-X249R, X024R-X043R-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X230E, X020R-X076D, X018R-X024R-X043D-X076D-X249R, X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X024R-X045T-X242R, X020R-X043D-X076D-X230E-X249R, X020R-X043R-X045T-X242R, X018R-X024R-X076D-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X045T-X233I-X242R, X024R-X043R-X230E, X018R-X020R-X043D, X043R-X242R-X249R, X020R-X043R-X045T-X230E, X043R-X076D-X242R-X249R, X020R-X024R-X045T-X230E-X242R, X024R-X045T-X076D-X230E-X242R-X249R, X024R-X045T, X024R-X043R-X045T-X076D-X230E-X249R, X018R-X024R-X043D-X045T-X249R, X018R-X043R-X045T-X249R, X024R-X043R-X242R, X018R-X020R-X043R-X076D-X249R, X020R-X024R-X043D-X249R, X020R-X043R-X230E-X242R, X020R-X043R-X242R, X018R-X043R-X076D-X230E, X020R-X024R-X043D-X242R, X020R-X043R-X230E, X018R-X020R-X043R-X076D-X242R-X249R, X043D-X045T-X076D-X249R, X018R-X043R-X242R-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X242R, X018R-X020R-X043D-X230E-X242R, X020R-X024R-X043R-X045T-X249R, X024R-X043R-X249R, X020R-X024R-X27E-X043R-X076D-X230E, X024R-X043R-X045T-X242R, X018R-X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X230E, X020R-X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X043R-X045T-X242R, X020R-X242R-X249R, X018R-X043R-X076D-X230E-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D, X020R-X024R-X27R-X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X242R, X018R-X043R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X230E-X249R, X018R-X020R-X043D-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X242R, X024R-X043R-X076D-X230E-X242R, X020R-X024R-X38I-X043R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X020R-X043R, X018R-X024R-X045T-X230E-X242R, X018R-X020R-X249R, X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X249R, X018R-X043D-X045T-X076D-X242R-X249R, X024R-X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X045T-X242R, X020R-X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X043D-X045T-X230E-X242R, X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X043R-X045T-X076D-X242R, X018R-X020R-X043R-X076D-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X249R, X018R-X024R-X043R-X045T-X230E-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X249R, X018R-X024R-X242R, X018R-X043R-X045T-X076D-X230E-X242R, X045T-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X242R, X018R-X020R-X043D-X045T-X240P, X024R-X043R-X045T-X242R-X249R, X018R-X024R-X30S-X31S-X32I-X33Q-X34V-X35F, X018R-X020R-X043R-X076D, X020R-X043D-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X242R-X249R, X024R-X043D-X045T-X242R-X249R, X043R-X230E-X249R, X024R-X043R-X076D-X230E-X249R, X020R-X024R-X043D-X076D-X249R, X024R-X045T-X242R-X273V, X020R-X024R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X242R, X018R-X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X249R, X018R-X043R-X045T-X230E-X242R, X020R-X024R-X043D-X045T-X230E-X242R, X018R-X043D-X230E-X249R, X018R-X043R-X076D-X242R, X018R-X020R-X076D, X018R-X020R-X043D-X076D-X242R-X249R, X020R-X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X230E-X249R, X018R-X076D-X242R, X020R-X043R-X249R, X018R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X045T-X230E-X249R, X230E-X249R, X018R-X045T-X249R, X020R-X043R-X076D, X043R-X045T-X249R, X018R-X043D-X076D-X242R-X249R, X043R-X076D-X249R, X018R-X045T, X020R-X076D-X230E-X242R, X020R-X024R-X043D-X045T, X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X020R-X045T-X249R, X043R-X076D-X153A-X249R, X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X043D-X076D-X249R и X020R-X043R-X076D-X227I, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R и X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X016S-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024K-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X148I-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D и X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X016S-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X104L-X128N-X158E-X186H-X249R, X128N-X158E-X188D-X249R, X062E-X128N-X158E-X159E-X271F, X062E-X158E-X188D-X249R-X271F, X062E-X158E-X186H-X249R-X271F, X128N-X158E-X188D-X209E-X271F, X062E-X159E-X188D-X249R, X016S-X062E-X158E-X186H-X249R, X062E-X158E-X159E-X249R, X101A-X128N-X158E-X209E-X249R, X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X158E-X188D-X249R, X062E-X158E-X186H-X271F, X062E-X158E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X249R, X062E-X101A-X158E-X186H-X271F, X062E-X104L-X158E-X188D-X249R-X271F, X062E-X159E-X186H-X249R, X062E-X159E-X249R, X128N-X158E-X186H-X249R, X128N-X158E-X188D-X271F, X062E-X158E-X249R, X062E-X186H-X188D-X249R-X271F, X128N-X158E-X209E-, X062E-X101A-X158E-X249R, X104L-X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X101A-X158E-X186H-X249R-X271F, X016S-X062E-X158E-X249R, X062E-X101A-X159E-X249R, X128N-X158E-X186H-X188D-X271F, X101A-X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X101A-X188D-X249R, X101A-X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X159E-X249R-X271F, X128N-X158E-X159E-X271F, X016S-X062E-X104L-X158E-X186H-X271F, X022A-X128N-X158E-X249R, X128N-X158E-X249R, X062E-X101A-X104L-X158E-X186H-X271F, X016S-X062E-X158E-X186H-X271F, X104L-X128N-X158E-X249R, X104L-X128N-X158E-X188D-X249R, X022A-X062E-X158E, X062E-X101A-X188D-X249R-X271F, X062E-X158E-X249R-X271F, X104L-X128N-X158E-X186H-X188D-X271F, X062E-X101A-X186H-X271F, X062E-X104L-X159E-X249R, X062E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X249R-X271F, X101A-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X101A-X186H, X101A-X128N-X129E-X186H-X249R, X101A-X103G-X158E-X186H-X249R, X016S-X062E-X104L-X186H-X188D-X271F, X104L-X158E-X186H-X249R, X101A-X128N-X158E-X188D-X209E-X271F, X062E-X101A-X186H-X188D-X271F, X016S-X062E-X158E-X249R-X271F, X062E-X128N-X158E, X062E-X128N-X159E-X249R, X062E-X101A-X158E-X188D-X249R, X101A-X128N-X158E-X249R, X062E-X158E-X186H-X188D-X249R, X016S-X104L-X158E-X186H-X271F, X062E-X148I-X159E, X062E-X101A-X158E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X188D-X249R, X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X101A-X104L-X186H-X188D-X271F, X022A-X101A-X158E-X186H-X249R, X101A-X128N-X158E-X209E, X158E-X186H-X188D-X249R-X271F, X104L-X158E-X186H-X188D-X249R-X271F, X101A-X104L-X158E-X186H-X249R, X104L-X158E-X249R, X101A-X104L-X128N-X158E-X186H-X271F, X016S-X104L-X188D-X249R, X101A-X104L-X158E-X186H-X188D-X271F, X104L-X128N-X159E-X271F, X104L-X158E-X186H-X249R-X271F, X158E-X186H-X249R, X101A-X158E-X186H-X249R, X104L-X158E-X188D-X249R-X271F, X016S-X128N-X158E-X186H, X104L-X128N-X186H-X188D-X249R, X016S-X101A-X128N-X186H, X016S-X062E-X128N-X186H-X271F, X016S-X128N-X186H-X271F, X128N-X129E-X186H, X158E-X186H-X249R-X271F, X016S-X158E-X249R, X016S-X158E-X186H-X249R, X016S-X022A-X158E-X186H-X271F, X089P-X101A-X129E-X186H, X022A-X128N-X158E-X186H, X101A-X104L-X128N-X158E-X186H, X022A-X128N-X186H-X188D-, X062E-X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X022A-X158E-X186H-X249R-X271F, X022A-X104L-X158E-X249R, X101A-X111V-X129E, X016S-X158E-X249R-X271F, X016S-X111V-X188D-, X022A-X104L-X186H-X188D-X249R и X104L-X148I-X188D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X001R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X004R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X271L, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X004R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X271L, X020R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X025R-X116A-X167W, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X078R-X103N-X106G-X167W-X236N, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X101A-X120F-X194F-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X212F-X232V-X245R, X020R-X144R-X185I-X233C-X236N, X023A-X078R-X216F-X236N-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X115R-X232V-X245R, X052N-X078R-X103N-X148I-X213A, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X025R-X089I-X116A-X239S-X270C, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X148I-X213A-X252R, X024R-X025R-X183D-X192W-X239S, X046R-X194F-X212M, X104L-X217E-X224A-X249R-X252R, X023A-X091F-X121F-X192W-X236N, X101G-X103A-X104I-X232V-X244R-X245R, X099F-X144R-X167W-X252R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022W-X078R-X167W-X212M-X270C, X121F-X252R-X270C, X020R-X103N-X216F-X236N-X252R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X023A-X052N-X192W-X198L-X252R, X025R-X046R-X121F, X024R-X078R-X104L-X116A-X183D, X046R-X059A-X103N-X211Q-X212M, X020R-X052N-X062Q-X091F-X192W, X023A-X052N-X144R-X192W-X216F, X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X052N-X103N-X116A-X148I-X192W, X089I-X116A-X117F-X224A-X249R, X144R-X211Q-X238L-X239S-X249R, X043A-X062Q-X194F-X211Q, X020R-X024R-X052N-X059A-X216F, X024R-X167W-X224A-X249R, X057R-X167W-X249R, X025R-X103N-X186K-X194F-X224A, X105T-X128N-X144R-X148I-X212M, X020R-X059A-X144R-X192W-X224A, X024R-X043A-X117F-X194F-X211Q, X117F-X194F-X213A-X270C, X078R-X091F-X121F-X233C-X252R, X057R-X099F-X105T-X198L-X213A, X023A-X091F-X101A-X198L-X252R, X062Q-X103N-X121F-X144R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X023A-X024R-X117F-X212M-X216F, X104L-X213A-X216F, X194F-X211Q-X236N, X062Q-X103N-X117F-X194F, X024R-X062Q-X104L-X106G-X249R, X057R-X089I-X198L, X046R-X059A-X106G-X217E-X249R, X117F-X213A-X215F, X101A-X120F-X192W-X215F-X224A, X043A-X057R-X117F-X144R-X183D, X046R-X183D-X238L, X025R-X043A-X089I-X117F, X078R-X104L-X213A-X215F-X224A, X091F-X099F-X101A-X105T-X167W, X106G-X117F-X238L, X046R-X089I-X091F-X101A-X116A, X020R-X062Q-X089I-X186K-X212M, X057R-X099F-X121F-X185I-X192W, X046R-X089I-X192W-X233C-X270C, X089I-X117F-X185I-X215F-X233C, X052N-X104L-X183D-X216F-X249R, X078R-X099F-X116A-X186K-X224A, X025R-X105T-X128N-X144R-X270C, X105T-X211Q-X216F, X024R-X046R-X091F-X121F, X106G-X185I-X216F-X236N, X062Q-X101A-X236N-X252R-X270C, X025R-X043A-X091F-X198L-X270C, X020R-X023A-X104L-X192W-X233C, X024R-X043A-X105T-X106G-X198L, X020R-X089I-X217E, X024R-X091F-X198L-X215F-X239S, X046R-X089I-X099F-X186K-X212M, X104L-X120F-X186K-X216F-X252R, X022W-X194F-X213A-X233C-X238L, X099F-X105T-X106G-X194F-X212M, X089I-X105T-X116A-X215F-X216F, X025R-X116A-X120F-X224A-X270C, X043A-X059A-X101A-X216F-X224A, X057R-X183D-X236N, X025R-X062Q-X128N-X144R-X185I, X103N-X120F-X167W-X198L-X233C, X022W-X089I-X216F, X024R-X106G-X116A-X212M-X224A, X020R-X052N-X101A-X198L-X233C, X089I-X091F-X185I-X211Q-X270C, X111I-X215F-X239S, X024R-X116A-X186K-X233C-X236N и X023A-X103N-X106G-X212M-X215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116S-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X232V-X245R, X018R-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X103A-X232V-X249R, X018R-X101G-X104I-X232V-X245R, X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X249R, X018R-X22K-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V, X018R-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X018R-X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X215F-X232V-X245R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X245R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X101G-X103A-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I-X232V-X249R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X215F-X232V-X245R, X024R-X103A-X104I-X249R, X018R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X101G-X104I-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X103A-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X245R, X024R-X103A-X245R, X024R-X103A-X104I-X245R, X020R-X078R-X101G-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X104I-X249R, X018R-X024R-X104I-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X019H-X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X103A-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X101G-X104I-X232V, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X101G-X104I, X020R-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X245R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X22W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I-X249R, X020R-X22W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X198L-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X024R-X076D-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G-X104I-X232V-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X001T-X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X101G-X198L-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X024R-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215V-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X020R-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X215F-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X020R-X022W-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X180A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X103A-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X232V-X249R, X018R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X076D-X245R, X024R-X104I-X245R, X101G-X232V, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X198L-X232V-X245R, X024R-X245R-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X024R-X101G-X104I-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X104I, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X183D-X198L-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X22W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X012H-X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X198L-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X213A-X249R, X024R-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X249R, X018R-X076D-X103A-X104I-X249R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R-X271G, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X020R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X215F-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X103A-X175L-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X245R, X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X232V, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X249R, X018R-X024R-X076D-X198M-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X103A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R-X268G, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X249R, X101G-X103A-X104I-X245R, X018R-X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X103A-X232V, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X043R-X045T-X076D-X076T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X273T, X018R-X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G-X232V, X232V-X245R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X234I-X245R, X024R-X076D-X103A-X104I-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R-X272V, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X103A-X104I-X232V, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X117I-X183D-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X232V-X245R, X018R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X209H-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X175L-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X215F-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X215F-X249R, X024R-X076D-X104I-X245R, X027R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X076D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X114T-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022K-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V, X018R-X024R-X076D-X116A-X249R, X020R-X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X183D-X211Q-X232V-X245R-, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X018R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X131V-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X101G-X245R, X024R-X076D-X101G-X245R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X101G, X018R-X22W-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X198L-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X198L-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X104I, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X088I-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X076D-X101G-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R-X269R, X024R-X076D-X245R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X218S-X232V-X245R, X018R-X103A, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X024R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X027R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X104I, X101G-X103A-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X249R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R-X275S, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X004M-X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X104I-X232V-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R-X274I, X020R-X101A-X103A-X104I-X213A-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X024R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X103A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R-X270V, X018R-X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V, X101G-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X175L-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R-X269S, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R-X260K, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X245R, X024R-X076D-X103A-X249R, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X020R-X024R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X272D, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X232V, X024R-X103A-X104I, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X076D-X103A-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X103A-X104I-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X016T-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X043R-X076D-X101G-X103T-X104I-X232V-X245R-X249R-X269R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X115E-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G, X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X245R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X215F-X249R, X018R-X104I-X232V, X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X232V-X249R, X103A-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X024R-X076D-X103A-X104I-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X215F-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X131T-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X101G-X103A-X104I-X245R-X249R, X018R-X076D-X232V-X249R, X018K-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R-X267I, X232V-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X024R-X101G-X103A-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X249R, X103A-X232V-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R-X274I, X024R-X103A-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X103A-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X018R-X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R-X263S, X024R-X076D-X101G-X104I-X232V-X249R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X197A-X213A-X215F-X249R, X024R-X101G-X103A, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X104I-X232V, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X020R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X150T-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X024R-X076D-X232V-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116T-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X245R, X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X076D-X101G-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X209H-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X245R, X076D-X101G-X104I-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X020R-X024R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X204D-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X209V-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R-X269D, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X209H-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X076D-X232V-X245R, X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X213A-X249R, X020R-X024R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X020R-X090S-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X076D-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X076D-X103A-X104I-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101G-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X232V-X245R, X027R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X103A-X104I-X135I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X249R, X005S-X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X198L-X215F-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X243D-X249R, X018R-X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X076D-X101G, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X215F-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X245R, X020R-X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R-X269S, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X086V-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X076D-X101G-X198T-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X249R-X248T, X018R-X076D-X104I-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X076D-X101G-X104I, X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X076D-X104I, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X101G-X104I, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R-X263D, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R-X269H, X018R-X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X104I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X043R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X166F-X176P-X179V-X184T-X187P-X194P, X018R-X022W-X024R-X041E-X076D-X101A-X160T-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X076D-X104I, X018R-X076D-X101G-X232V, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X031F-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R-X269S, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X114T-X198L-X211Q-X215F-X249R, X024R-X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X076D-X103A-X104I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X101G-X104I-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R-X260A, X076D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X076D-X104I-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X076D-X101G-X103A, X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X101G-X103A-X232V, X024R-X076D-X101G-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X156V-X183D-X211Q-X215F-X249R-X269S, X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X076D-X101G, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X076D-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X237D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R-X275S, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X076D, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X232V-X249R, X018R-X076D-X103A-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X175E-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X273E, X020R-X024R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X005S-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X103A-X104I-X232V, X018R-X020R-X024R-X068A-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R-X275S, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R и X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X024R-X043R-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X024R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X076D-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X043D-X076D-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X078R-X249R, X020R-X101G-X103G-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104L-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101G-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103S-X104L-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104L-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104L-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104V-X232V-X245R, X020R-X101S-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101S-X103G-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103G-X104V-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101A-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101A-X103S-X104V-X232V-X245R, X018R-X024R-X043R-X076D-X078R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X217E-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X217E-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043R-X076D-X249R, X020R-X101A-X103G-X104V-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X217E-X249R-X269R и X018R-X024R-X076D-X217E-X242R-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X101A-X103A-X104I-X118R-X232V-X245R, X020R-X024R-X116A-X213A, X043R-X101A-X116A-X215F-X269R, X024R-X043R-X101A-X116A, X024R-X043R-X101A-X116A-X215F-X269R, X020R-X101G-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X043R-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X213A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X213A, X024R-X043R-X116A-X215F-X269R, X020R-X024R-X213A-X215F, X020R-X116A-X269R, X024R-X116A-X213A-X269R, X043R-X101A-X116A-X269R, X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X045T-X101A-X116A-X215F-X269R, X020R-X043R-X101A-X269R, X101A-X103A-X104I-X213A-X232V-X245R-X269R, X024R-X215F-X269R, X043R-X101A-X116A-X213A-X215F-X269R, X043R-X101A-X213A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X116A-X213A, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X045T-X101A-X116A-X213A-X269R, X024R-X043R-X045T-X269R, X020R-X043R-X045T-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T, X043R-X116A-X269R, X024R-X043R-X101A-X215F-X269R, X024R-X043R-X045T-X213A-X215F-X269R, X020R-X024R-X045T-X269R, X020R-X043R-X101A-X116A-X213A-X215F, X020R-X101G-X103A-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X024R-X045T-X116A-X269R, X020R-X101A-X116A-X269R, X024R-X043R-X215F, X020R-X024R-X213A, X024R-X043R-X101A-X215F, X020R-X024R-X043R-X045T-X116A, X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X269R, X020R-X024R-X101A-X215F, X020R-X024R-X116A-X213A-X215F, X020R-X024R-X116A, X020R-X024R-X101A-X116A, X043R-X213A-X215F-X269R, X024R-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X215F, X020R-X038A-X043R-X101A, X020R-X024R-X116A-X215F, X024R-X043R-X101A-X213A, X014L-X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X215F, X020R-X024R-X215F, X020R-X116A-X215F-X269R, X020R-X045T-X116A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X215F и X020R-X024R-X043R-X045T-X116A-X213A-X215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X076D-X101G-X103A-X104I-X114V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F и X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X217E-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R и X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X017R-X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X017R-X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X022A-X101G-X102A-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F и X022A-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101S-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103G-X104V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103G-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103G-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103S-X104V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103S-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103A-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103G-X104V-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R и X101S-X103A-X104V-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X026F-X051W-X104L-X106E, X026F-X031F-X078N-X102A-X160D, X020K-X100S-X116L-X158E-X166D-X243F, X033S-X043W-X218D-X239G-X243F, X022L-X038F-X048R-X062E-X100S-X186K, X101D-X103N-X116L-X144R-X215D, X104L-X105T-X213A-X217E-X256N, X043W-X101D-X212M-X243F, X026F-X048R-X105T-X213A-X218D-X224A, X024F-X101D-X118R-X215D-X250I-X272F, X121F-X185E-X224A-X239G, X022L-X031F-X102A-X128D-X224A-X243F, X062E-X078N-X102A-X116L-X144R-X250I, X022L-X038F-X121F-X160D-X272F, X026F-X078N-X159C-X186K-X243F, X024F-X048R-X118R-X166D-X217E, X023A-X038F-X078N-X100S-X212M-X215D, X100S-X116L-X158E-X213A, X078N-X104L-X118R-X128D, X102A-X103N-X105T-X194E, X022L-X078N-X128D-X213A, X027R-X100S-X118R-X160D-X188D-X243F, X024F-X102A-X186K-X213A-X217E-X243F, X033S-X105T-X188D-X216F, X023A-X100S-X194E-X212M, X048R-X128D-X185E-X239G, X020K-X024F-X033S-X129E-X194E, X020K-X027R-X129E-X166D-X239G, X022L-X023A-X027R-X101D-X104L-X216F, X033S-X118R-X129E-X194E-X239G, X022L-X078N-X116L-X129E-X256N, X027R-X101D-X103N-X105T-X272F, X048R-X078N-X116L-X185E-X217E-X239G, X023A-X024F-X027R-X062E, X024F-X103N-X104L-X118R-X188D, X026F-X104L-X256N-X272F, X024F-X043W-X104L-X121F-X129E, X062E-X078N-X116L-X224A, X023A-X024F-X051W-X158E, X027R-X038F-X102A-X116L, X062E-X078N-X144R-X212M, X031F-X116L-X256N-X272F, X022L-X033S-X104L-X116L-X160D-X186K, X024F-X118R-X129E-X186K-X213A, X043W-X105T-X213A-X215D-X216F, X031F-X105T-X186K-X188D, X026F-X194E-X213A-X256N и X103N-X160D-X250I-X256N, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D, X022A-X043R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X043R-X101D-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X248D, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X062E-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X128I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X128I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101D-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X062E-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X217D-X232V, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F и X022A-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020K-X024F-X062E-X188D-X239G, X024F-X062E-X116L-X239G, X020K-X023A-X062E-X188D, X020K-X023A-X024F-X062E-X118R-X188D-X213A, X020K-X043W-X062E-X116L-X188D-X213A-X239G, X023A-X062E-X116L-X118R, X023A-X024F-X062E-X116L-X118R, X024F-X116L, X024F-X062E-X188D-X213A, X023A-X062E-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X024F-X062E, X020K-X043W-X062E-X116L-X239G, X024F-X062E-X116L-X213A-X239G, X020K-X024F-X043W-X062E-X116L-X213A, X020K-X023A-X024F-X062E-X116L-X188D-X213A, X024F-X062E-X188D-X239G, X023A-X043W-X062E-X116L-X118R-X213A, X062E-X188D-X239G, X020K-X024F-X062E-X239G, X024F-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X023A-X062E-X116L-X118R-X213A, X020K-X023A-X024F-X062E-X188D-X213A-X239G, X024F-X043W-X118R-X188D, X023A-X024F-X116L-X118R-X188D-X213A, X020K-X023A-X043W-X116L-X188D-X213A-X239G, X023A-X024F-X116L-X188D-X239G, X023A-X043W-X116L-X118R-X188D, X023A-X024F-X118R-X188D-X239G, X023A-X024F-X043W-X062E-X116L-X118R, X020K-X043W-X188D-X213A, X024F-X062E-X118R-X239G, X023A-X043W-X188D-X213A, X020K-X024F-X043W-X062E-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X116L-X188D-X239G, X020K-X043W-X062E-X118R, X020K-X043W-X116L-X188D-X213A, X020K-X024F, X023A-X043W-X116L-X239G, X023A-X024F-X043W-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X023A-X043W-X213A и X023A-X024F-X062E-X118R-X213A-X239G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020K-X023A-X043W-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D, X024F-X118R-X128I-X129E-X159D, X020K-X024F-X062E-X116L-X118R-X188D, X020K-X062E-X116L-X188D, X062E-X116L-X118R-X213A, X020K-X023A-X062E-X116L-X188D, X062E-X116L-X118R-X188D, X020K-X062E-X116L-X213A, X020K-X023A-X062E-X116L, X020K-X062E-X188D-X213A, X020K-X062E, X020K-X024F-X062E-X116L-X188D, X020K-X043W-X062E-X116L-X188D, X020K-X024F-X062E-X188D-X213A, X062E-X116L-X188D-X213A, X020K-X062E-X116L, X020K-X023A-X062E-X116L-X188D-X213A, X023A-X024F-X062E-X116L-X213A, X022A-X043R-X103A-X104I-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X024F-X062E-X116L-X188D, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D, X023A-X062E-X116L-X188D, X043W-X062E-X116L, X020K-X023A-X116L-X188D, X043W-X062E-X116L-X188D, X024F-X062E-X116L, X062E-X116L-X188D и X022A-X024R-X103A-X104I-X128I-X159D-X188D-X232V-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X087R-X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R-X271V, X101G-X103A-X104I-X109R-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R-X271V, X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R, X076D-S87R-X103A-X104I-X212P-X271V, X076D-X103A-X104I-X109R, X076D-X103A-X104I-X212P-X271V, X076D-X103A-X104I-X109R-X245R и X076D-X103A-X104I-X212P-X245L-X271V, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X086W-X118R, X024R-X078R-X086W-X243F, X024R-X033S-X086S-X087N-X209A, X033S-X118R, X024R-X078R-X086W-X118R-X270T, X024R-X033S-X086W-X118R, X078R-X086W-X243F, X033S-X078R-X086W-X118R-X209A, X033S-X078R-X209A, X086W-X118R-X243F, X024R-X086W, X078R-X086W-X235F, X024R-X118R, X024R-X086R, X101G-X103A-X104I-X232V, X024R-X033S-X078R-X086W-X118R, X024R-X118R-X209A, X209A-X241R, X033S-X086W-X243F, X033S-X172V-X209A, X118R-X209A-X243F, X024R-X086S-X141G, X024R-X118R-X209A-X243F, X024R-X033S-X086S-X085N-X235F, X024R-X033S-X133V, X024R-X033S-X078R-X086W, X024R-X086W-X209A, X024R-X241R, X033S-X118R-X243F, X024R-X235F, X024R-X078R-X086W, X024R-X118R-X209A-X235F, X024R-X209A-X241R, X033S-X118R-X241R, X086W-X118R-X209A, X033S-X118R-X159D-X209A, X033S-X078R-X086W, X024R-X086W-X243F, X118R-X209A, X024R-X086W-X118R-X203I, X078R-X209A-X235F, X024R-X033S-X241R, X078R-X118R, X033S-X118R-X209A-X243F, X021M-X024R-X033S, X024R-X033S-X086W, X033S-X235F, X078R-X086W-X209A, X024R-X033S-X209A-X235F, X033S-X086W-X118R, X024R-X033S-X078R-X209A, X033S-X086W-X118R-X209A-X243F, X086W-X209A-X243F, X005S-X078R-X118R-X241R, X024R-X174T, X033S-X209A-X243F, X086W-X118R-X133V, X024R-X033S-X118R, X024R-X086W-X209A-X235F, X086W-X209A, X008T-X024R, X086W-X118R, X033S-X241R, X005S-X024R-X033S-X243F, X024R-X209A-X242P, X024R-X033S-X078R-X118R, X024R-X033S-X194T, X024R-X243F, X024R-X209A, X024R-X033S-X118R-X209A, X033S-X086W, X024R-X033S, X024R-X033S-X078R-X243F, X086W-X243F, X033S-X118D-X138V-X209A, X033S-X209A-X235F, X024R-X086R-X118R, X033S-X201S, X024R-X239Q, X033S-X118R-X209A-, X078R-X086W, X235F-X243F, X024R-X209A-X235F, X118R-X172V, X017Y-X024R-X033S-X086W, X033S-X148F, X024R-X118R-X235F, X033S-X078R, X033S-X243F, X024C-X033S, X118R-X194T, X033S-X209A, X118R-X209A-X235F, X024R-X033S-X209A-X243F, X024R-X033S-X235F, X024R-X033S-X118R-X235F, X024R-X141G, X024R-X274I, X024R-X033S-X209A, X086W-X235F, X024R-X209A-X243F, X004E-X033S-X078R, X086W-X209A-X235F, X015T-X033S, X033S-X086W-X156L-X209A, X024R-X118R-X243F-X269H, X209A-X235F, X024R-X247H, X024R-X033S-X228T, X078R-X235F, X024R-X033S-X174V-X235F, X024R-X235F-X243F, X024R-X033S-X235F-X241R, X024R-X033S-X151V, X024R-X104A, X033S-X048T, X012H-X104A-X118R, X118R-X235F, X033S-X253A, X143A-X209A, X024R-X033S-X243F, X033S-X239T, X209A-X243F, X024R-X033S-X129H-X184D-X253M, X024R-X085V-X086W-X118R-X235F, X024R-X272P и X024R-X269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X150L-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X249R-X269R, X018R-X024R-X076D-X087D-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X150L-X249R, X018R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X022R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X022R-X024R-X076D-X150L-X249R, X043R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X024R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X078R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X078R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X249R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X269R, X022R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X076D-X150L-X249R, X043R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X150L-X242R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X269R, X076D-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X076D-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R и X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X242R-X245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X027R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X222Q-X245R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222S-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222Q-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X222Q-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X222S-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X222S-X245R и X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222S-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X183D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X130A-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271G, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I, X22A-X101A-X209E, S103G-L111V-G159E, X22A-X103G-X159E, X22A-X111V-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X103G-X111V, X62E-X111V-X128N, X22A-X111V-X128N, X22A-X62E-X111V, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X101A-X103G-X104L-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L-X159E, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L-X209E, X22A-X209E-X271F, X22A-X101A-X271F и X101A-X209E-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K и X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X248R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R и X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X20R-X43R-X249R, X20R-X22R-X43R, X20R-X43R-X242R, X20R-X43R-X271L, X20R-X43R-X244R, X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X22R-X78R-X212F-X241R, X9A-X20R-X43R-X212F, X9A-X43R-X212F, X20R-X43R-X212F, X20R-X22R-X43R-X212F, X24R-X78R-X212F, X9A-X43R-X78R, X9A-X43R-X78R-X242R, X9A-X20R-X43R-X78R, X20R-X24R-X43R-X78R-X242R, X22R-X24R-X78R-X212F, X9A-X20R-X43R-X78R-X242R, X20R-X43R-X78R-X249R, X20R-X43R-X78R, X9A-X78R-X212F, X9A-X22R-X43R-X78R, X9A-X20R-X24R-X43R, X9A-X22R-X78R-X212F, X4R-X9A-X22R-X78R-X212F, X20R-X24R-X43R, X1R-X9A-X43R, X20R-X24R-X43R-X115R, X9A-X24R-X43R, X20R-X22R-X24R-X43R, X1R-X24R-X43R, X9A-X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X20R-X22R-X78R-X212F, X9A-X24R-X43R-X244R, X9A-X24R-X43R-X242R, X4R-X9A-X22R-X24R-X212F и X22R-X24R-X43R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248R и X101G, X103A, X104I, X232V, X236H, X245R и X252K, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X16S, X22A, X24R, X62E, X76D, X89P, X101A/G, X103G/A, X104L/I, X111V, X128N, X129E, X232V, X148I, X158E, X159D/E, X166D, X186H, X188D, X209E, X236H, X238R, X245R, X248D/R, X249R, X252K/R, X253R и X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N062E-A158E, S103G-A158E, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, E089P-A158E, L111V-A158E, T022A-A158E, S101A-A158E, L148I-A158E, P129E-A158E, T022A-E089P, A016S-E089P, N062E-E089P, N062E-E271F, A158E-E271F, R186H-E271F, P129E-E271F, L111V-E271F, Y209E-E271F, A016S-E271F, S188D-E271F, T022A-E271F, G159E-E271F, V104L-E271F, S101A-E271F, E089P-E271F, S128N-E271F, S103G-E271F, L148I-E271F, H249R-E271F, N062E-G159E, A016S-G159E, S128N-G159E, L148I-G159E, L111V-G159E, E089P-G159E, T022A-G159E, P129E-G159E, S103G-G159E, V104L-G159E, A158E-G159E, S101A-G159E, A158E-H249R, L111V-H249R, P129E-H249R, N062E-H249R, A016S-H249R, R186H-H249R, L148I-H249R, G159E-H249R, S101A-H249R, S188D-H249R, V104L-H249R, Y209E-H249R, T022A-H249R, S128N-H249R, S103G-H249R, E089P-H249R, T022A-L111V, S101A-L111V, A016S-L111V, V104L-L111V, N062E-L111V, S103G-L111V, E089P-L111V, A016S-L148I, N062E-L148I, T022A-L148I, P129E-L148I, V104L-L148I, S103G-L148I, S128N-L148I, S101A-L148I, E089P-L148I, L111V-L148I, A016S-N062E, T022A-N062E, N062E-P129E, T022A-P129E, S128N-P129E, A016S-P129E, S101A-P129E, V104L-P129E, E089P-P129E, S103G-P129E, L111V-P129E, N062E-R186H, S128N-R186H, S101A-R186H, T022A-R186H, A016S-R186H, A158E-R186H, E089P-R186H, P129E-R186H, G159E-R186H, S103G-R186H, V104L-R186H, L111V-R186H, L148I-R186H, N062E-S101A, T022A-S101A, A016S-S101A, E089P-S101A, N062E-S103G, T022A-S103G, A016S-S103G, S101A-S103G, E089P-S103G, N062E-S128N, A016S-S128N, T022A-S128N, S101A-S128N, V104L-S128N, E089P-S128N, S103G-S128N, L111V-S128N, L111V-S188D, N062E-S188D, A016S-S188D, L148I-S188D, T022A-S188D, S128N-S188D, S101A-S188D, V104L-S188D, E089P-S188D, P129E-S188D, G159E-S188D, R186H-S188D, S103G-S188D, A158E-S188D, A016S-T022A, A016S-V104L, T022A-V104L, S101A-V104L, N062E-V104L, S103G-V104L, E089P-V104L, G159E-Y209E, L111V-Y209E, S101A-Y209E, A016S-Y209E, S128N-Y209E, L148I-Y209E, P129E-Y209E, N062E-Y209E, T022A-Y209E, S103G-Y209E, A158E-Y209E, S188D-Y209E, V104L-Y209E, E089P-Y209E и R186H-Y209E, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-W241R, G020R-W241R, S024R-W241R, S009A-W241R, G020R-W241R, V004R-W241R, N043R-W241R, S078R-W241R, T022R-W241R, G115R-W241R, A001R-W241R, S212F-W241R, L082R-W241R, N018R-V244R, S024R-V244R, S078R-V244R, G020R-V244R, S212F-V244R, S009A-V244R, L082R-V244R, A001R-V244R, N043R-V244R, T022R-V244R, V004R-V244R, G115R-V244R, W241R-V244R, S242R-V244R, A001R-V004R, S009A-T022R, N018R-T022R, G020R-T022R, V004R-T022R, A001R-T022R, S024R-S242R, N018R-S242R, V004R-S242R, G020R-S242R, S212F-S242R, L082R-S242R, S078R-S242R, A001R-S242R, S009A-S242R, T022R-S242R, G115R-S242R, N043R-S242R, W241R-S242R, N018R-S212F, T022R-S212F, V004R-S212F, S024R-S212F, A001R-S212F, G115R-S212F, G020R-S212F, S009A-S212F, N043R-S212F, S078R-S212F, L082R-S212F, S009A-S078R, G020R-S078R, S024R-S078R, T022R-S078R, N018R-S078R, V004R-S078R, A001R-S078R, N043R-S078R, T022R-S024R, G020R-S024R, N018R-S024R, A001R-S024R, V004R-S024R, S009A-S024R, V004R-S009A, A001R-S009A, S242R-N269R, S024R-N269R, G020R-N269R, T022R-N269R, H249R-N269R, S212F-N269R, N043R-N269R, V244R-N269R, A001R-N269R, N018R-N269R, S078R-N269R, S009A-N269R, G115R-N269R, W241R-N269R, V004R-N269R, L082R-N269R, N018R-N043R, G020R-N043R, V004R-N043R, T022R-N043R, S009A-N043R, A001R-N043R, S024R-N043R, S009A-N018R, V004R-N018R, A001R-N018R, S024R-L082R, S009A-L082R, N018R-L082R, A001R-L082R, S078R-L082R, G020R-L082R, T022R-L082R, V004R-L082R, N043R-L082R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, N018R-H249R, S009A-H249R, S212F-H249R, T022R-H249R, S024R-H249R, G115R-H249R, A001R-H249R, L082R-H249R, S242R-H249R, W241R-H249R, V244R-H249R, S078R-H249R, N018R-G115R, G020R-G115R, T022R-G115R, S078R-G115R, S009A-G115R, V004R-G115R, A001R-G115R, L082R-G115R, N043R-G115R, S024R-G115R, S009A-G020R, N018R-G020R, V004R-G020R, A001R-G020R, S009A-E271L, G020R-E271L, S024R-E271L, V244R-E271L, W241R-E271L, N043R-E271L, T022R-E271L, H249R-E271L, S212F-E271L, G115R-E271L, S242R-E271L, S078R-E271L, V004R-E271L, N269R-E271L, A001R-E271L, N018R-E271L и L082R-E271L, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляют собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N043R, N062E-A158E, S103G-A158E, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, E089P-A158E, L111V-A158E, T022A-A158E, S101A-A158E, L148I-A158E, P129E-A158E, T022A-E089P, A016S-E089P, N062E-E089P, N062E-E271F, A158E-E271F, R186H-E271F, P129E-E271F, L111V-E271F, Y209E-E271F, A016S-E271F, S188D-E271F, T022A-E271F, G159E-E271F, V104L-E271F, S101A-E271F, E089P-E271F, S128N-E271F, S103G-E271F, L148I-E271F, H249R-E271F, N062E-G159E, A016S-G159E, S128N-G159E, L148I-G159E, L111V-G159E, E089P-G159E, T022A-G159E, P129E-G159E, S103G-G159E, V104L-G159E, A158E-G159E, S101A-G159E, A158E-H249R, L111V-H249R, P129E-H249R, N062E-H249R, A016S-H249R, R186H-H249R, L148I-H249R, G159E-H249R, S101A-H249R, S188D-H249R, V104L-H249R, Y209E-H249R, T022A-H249R, S128N-H249R, S103G-H249R, E089P-H249R, T022A-L111V, S101A-L111V, A016S-L111V, V104L-L111V, N062E-L111V, S103G-L111V, E089P-L111V, A016S-L148I, N062E-L148I, T022A-L148I, P129E-L148I, V104L-L148I, S103G-L148I, S128N-L148I, S101A-L148I, E089P-L148I, L111V-L148I, A016S-N062E, T022A-N062E, N062E-P129E, T022A-P129E, S128N-P129E, A016S-P129E, S101A-P129E, V104L-P129E, E089P-P129E, S103G-P129E, L111V-P129E, N062E-R186H, S128N-R186H, S101A-R186H, T022A-R186H, A016S-R186H, A158E-R186H, E089P-R186H, P129E-R186H, G159E-R186H, S103G-R186H, V104L-R186H, L111V-R186H, L148I-R186H, N062E-S101A, T022A-S101A, A016S-S101A, E089P-S101A, N062E-S103G, T022A-S103G, A016S-S103G, S101A-S103G, E089P-S103G, N062E-S128N, A016S-S128N, T022A-S128N, S101A-S128N, V104L-S128N, E089P-S128N, S103G-S128N, L111V-S128N, L111V-S188D, N062E-S188D, A016S-S188D, L148I-S188D, T022A-S188D, S128N-S188D, S101A-S188D, V104L-S188D, E089P-S188D, P129E-S188D, G159E-S188D, R186H-S188D, S103G-S188D, A158E-S188D, A016S-T022A, A016S-V104L, T022A-V104L, S101A-V104L, N062E-V104L, S103G-V104L, E089P-V104L, G159E-Y209E, L111V-Y209E, S101A-Y209E, A016S-Y209E, S128N-Y209E, L148I-Y209E, P129E-Y209E, N062E-Y209E, T022A-Y209E, S103G-Y209E, A158E-Y209E, S188D-Y209E, V104L-Y209E, E089P-Y209E, R186H-Y209E, N018R-W241R, G020R-W241R, S024R-W241R, S009A-W241R, G020R-W241R, V004R-W241R, N043R-W241R, S078R-W241R, T022R-W241R, G115R-W241R, A001R-W241R, S212F-W241R, L082R-W241R, N018R-V244R, S024R-V244R, S078R-V244R, G020R-V244R, S212F-V244R, S009A-V244R, L082R-V244R, A001R-V244R, N043R-V244R, T022R-V244R, V004R-V244R, G115R-V244R, W241R-V244R, S242R-V244R, A001R-V004R, S009A-T022R, N018R-T022R, G020R-T022R, V004R-T022R, A001R-T022R, S024R-S242R, N018R-S242R, V004R-S242R, G020R-S242R, S212F-S242R, L082R-S242R, S078R-S242R, A001R-S242R, S009A-S242R, T022R-S242R, G115R-S242R, N043R-S242R, W241R-S242R, N018R-S212F, T022R-S212F, V004R-S212F, S024R-S212F, A001R-S212F, G115R-S212F, G020R-S212F, S009A-S212F, N043R-S212F, S078R-S212F, L082R-S212F, S009A-S078R, G020R-S078R, S024R-S078R, T022R-S078R, N018R-S078R, V004R-S078R, A001R-S078R, N043R-S078R, T022R-S024R, G020R-S024R, N018R-S024R, A001R-S024R, V004R-S024R, S009A-S024R, V004R-S009A, A001R-S009A, S242R-N269R, S024R-N269R, G020R-N269R, T022R-N269R, H249R-N269R, S212F-N269R, N043R-N269R, V244R-N269R, A001R-N269R, N018R-N269R, S078R-N269R, S009A-N269R, G115R-N269R, W241R-N269R, V004R-N269R, L082R-N269R, N018R-N043R, G020R-N043R, V004R-N043R, T022R-N043R, S009A-N043R, A001R-N043R, S024R-N043R, S009A-N018R, V004R-N018R, A001R-N018R, S024R-L082R, S009A-L082R, N018R-L082R, A001R-L082R, S078R-L082R, G020R-L082R, T022R-L082R, V004R-L082R, N043R-L082R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, N018R-H249R, S009A-H249R, S212F-H249R, T022R-H249R, S024R-H249R, G115R-H249R, A001R-H249R, L082R-H249R, S242R-H249R, W241R-H249R, V244R-H249R, S078R-H249R, N018R-G115R, G020R-G115R, T022R-G115R, S078R-G115R, S009A-G115R, V004R-G115R, A001R-G115R, L082R-G115R, N043R-G115R, S024R-G115R, S009A-G020R, N018R-G020R, V004R-G020R, A001R-G020R, S009A-E271L, G020R-E271L, S024R-E271L, V244R-E271L, W241R-E271L, N043R-E271L, T022R-E271L, H249R-E271L, S212F-E271L, G115R-E271L, S242R-E271L, S078R-E271L, V004R-E271L, N269R-E271L, A001R-E271L, N018R-E271L и L082R-E271L, и где общий заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 относительно общего заряда протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен при помощи одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1.
В одном аспекте указанный вариант протеазы включает:
a) две и более из следующих мутаций: X1R, X2S, V4R, V4S, X9A, X10S, X14K, X16S, X22A, X22R, X24R, X25V, X26F, X42I, X52F, X52E, X52N, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X78R, X89P, X89T, X89G, X89H, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X108I, X111V, X112V, X115K, X117F, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X186H, X188E, X188D, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X248V, X249R, X250I, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H и X272F; и/или
b) один или более из следующих наборов мутаций: X062E-X129E, X062E-X159E, X016S-X148I, X158E-X249R, X016S-X062E, X111V-X188D, X022A-X062E, X062E-X148I, X022A-X129E, X062E-X271F, X062E-X158E, X016S-X159E, X062E-X186H, X128N-X159E, X062E-X188D, X062E-X128N, X148I-X159E, X103G-X158E, X111V-X159E, X158E-X271F, X016S-X188D, X022A-X111V, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X128N-X186H, X159E-X209E, X062E-X101A, X111V-X209E, X148I-X188D, X101A-X209E, X022A-X188D, X016S-X022A, X128N-X129E, X016S-X209E, X016S-X128N, X022A-X089P, X128N-X209E, X089P-X158E, X062E-X103G, X186H-X271F, X016S-X129E, X089P-X159E, X111V-X249R, X101A-X129E, X148I-X209E, X022A-X159E, X129E-X249R, X129E-X209E, X104L-X129E, X128N-X188D, X111V-X158E, X022A-X158E, X062E-X209E, X062E-X249R, X101A-X186H, X089P-X129E, X129E-X271F, X22A-X111V-X159E, X101A-X103G-X104L-X209E, X101A-X103G-X104L-X159E, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X22A-X103G-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X209E-X271F, X22A-X101A-X209E, X101A-X209E-X271F, X22A-X111V-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L, X101G-X103A-X104I, X101A-X103G-X104L-X128N, X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D и X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F; при этом указанный вариант имеет общий заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно 0, -1, -2 или -3 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Эти варианты протеазы могут быть особо предпочтительны в водной моющей жидкости с низкой ионной силой или низкими концентрациями моющего средства.
В одном аспекте указанный вариант протеазы включает:
a) две или более из следующих мутаций X4R, X17R, X18R, X20R, X22R, X24R, X24W, X25R, X43R, X43A, X46R, X52F, X52N, X57R, X59A, X62Q, X71G, X75R, X76D, X78R, X82R, X86W, X89P, X89W, X89T, X89I, X89H, X89V, X104L, X106V, X106G, X115R, X118I, X121F, X144R, X185I, X197F, X209N, X209S, X217E, X231I, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X249R, X252R, X253R, X271T, X271V, X271L, X271H, X271F, X271P, X1R, X9A, X212F и X269R; и/или
b) один или более из следующих наборов мутаций X022R-X024R, X009A-X271L, X018R-X241R, X018R-X115R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X020R-X024R, X018R-X249R, X009A-X020R, X020R-X241R, X009A-X078R, X020R-X115R, X018R-X024R, X024R-X242R, X022R-X115R, X018R-X043R, X020R-X043R, X018R-X242R, X242R-X269R, X018R-X244R, X024R-X269R, X020R-X271L, X024R-X271L, X004R-X009A, X020R-X269R, X001R-X024R, X244R-X271L, X009A-X018R, X241R-X271L, X004R-X024R, X009A-X249R, X009A-X022R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K; при этом указанный вариант протеазы имеет общий заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно имеет положительный общий заряд, наиболее предпочтительно +1, +2 или +3 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Эти варианты протеазы могут быть особо предпочтительны в водной моющей жидкости с высокой ионной силой или высокими концентрациями моющего средства.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N043R, G020K-N062E, S024F-N116L, G020K-S024F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086W, S078R-G118R, T033S-G118R, T033S-K235F, Y209A-W241R, G020R-N076D, N018R-Q245R, S024R-R045T, A232V-Q245R, G118R-A172V, G118R-A194T, I008T-S024R, K235F-N243F, N018R-S103A, N018R-V104I, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-N243F, S024R-P239Q, S024R-S101G, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T274I, S024R-Y209A, S078R-P086W, S101G-A232V, T033S-L148F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, A230E-H249R, A232V-H249R, G118R-K235F, N076D-Q245R, P086W-K235F, S024R-R247H, S024R-V104A, S078R-K235F, S101G-H249R, S103A-A232V, T033S-A048T, T033S-P239T, T033S-T253A, T143A-Y209A, Y209A-K235F, N018R-R045T, Y209A-N243F, S024R-A272P, S024R-R269C, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R и S024R-N076D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N076D, S024R-R045T, A230E-H249R, N018R-R045T, N018R-Q245R, S101G-A232V, S024R-A232V, A232V-Q245R, S024R-S101G, N018R-V104I, N018R-S103A, S101G-H249R, A232V-H249R, S103A-A232V, N076D-Q245R, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R, S024R-N076D, S024F-N116L, G020K-S024F, G020K-N062E, T033S-G118R, S024R-P086W, S024R-G118R, S024R-P086R, Y209A-W241R, S024R-W241R, S024R-K235F, G118R-Y209A, S078R-G118R, T033S-K235F, S024R-A174T, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, S024R-N243F, S024R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, P086W-N243F, T033S-P201S, S024R-P239Q, S078R-P086W, K235F-N243F, G118R-A172V, T033S-L148F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, S024R-S141G, S024R-T274I, P086W-K235F, A015T-T033S, Y209A-K235F, S024R-R247H, S078R-K235F, S024R-V104A, T033S-A048T, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-A272P и S024R-R269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V004R-S009A-G020R-S242R, G020R-N043R-W241R, G020R-S242R-N269R, V004R-S009A-G020R-N043R, V004R-G020R-H249R, N018R-S024R-V244R, S009A-T022R-S212F-W241R, G020R-N043R-N269R, N018R-S024R-S242R, V004R-S009A-N043R-W241R, G020R-N043R-V244R, G020R-T022R-S242R, V004R-G020R-N043R, V004R-S009A-G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R-H249R, G020R-S212F-H249R, V004R-S009A-W241R, A001R-S009A-N043R, G020R-N043R-H249R, S009A-G020R-N043R-W241R, G020R-T022R-N043R, G020R-H249R-N269R, G020R-T022R-W241R, V004R-S009A-S024R-N043R-W241R, S009A-N043R-S078R, V004R-G020R-S024R-V244R, G020R-T022R-S078R-S242R, G020R-S024R-S242R-H249R, V004R-S009A-S078R-W241R, S009A-N043R-S078R-S242R, V004R-G020R-S024R, S009A-N043R-S212F, G020R-N043R-S212F, S024R-S078R-S212F, S009A-G020R-S024R-N043R, S009A-T022R-N043R-S078R, G020R-T022R-S212F-W241R, G020R-N043R-S212F-W241R, S009A-N043R-W241R, G020R-N043R-E271L, G020R-T022R-S078R-W241R, G020R-S024R-N043R-S242R, G020R-T022R-N043R-W241R, S009A-G020R-N043R-S212F, V004R-S009A-G020R-S024R-S242R, G020R-N043R-H249R-E271L, G020R-T022R-S024R-S242R, S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-N043R-S242R-E271L, S009A-T022R-S078R-S212F-W241R, V004R-G020R-S024R-H249R, G020R-T022R-E271L, G020R-T022R-N043R-S212F, V004R-G020R-S024R-N043R-S242R, V004R-G020R-S024R-N043R, V004R-S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-T022R-S078R-S212F-W241R и G020R-T022R-N269R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-G020R-N043D-R045T-A230E, N018R-N043R-R045T-S242R-H249R, S024R-N043D-H249R, N018R-G020R-R045T, G020R-S024R-N076D-H249R, S024R-N043R-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-A230E, G020R-N076D, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R, S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-R045T-S242R, G020R-N043D-N076D-A230E-H249R, G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-S024R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-L233I-S242R, S024R-N043R-A230E, N018R-G020R-N043D, N043R-S242R-H249R, G020R-N043R-R045T-A230E, N043R-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-R045T-A230E-S242R, S024R-R045T-N076D-A230E-S242R-H249R, S024R-R045T, S024R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-S024R-N043D-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-H249R, S024R-N043R-S242R, N018R-G020R-N043R-N076D-H249R, G020R-S024R-N043D-H249R, G020R-N043R-A230E-S242R, G020R-N043R-S242R, N018R-N043R-N076D-A230E, G020R-S024R-N043D-S242R, G020R-N043R-A230E, N018R-G020R-N043R-N076D-S242R-H249R, N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-N043R-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-N043D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T-H249R, S024R-N043R-H249R, G020R-S024R-K27E-N043R-N076D-A230E, S024R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-A230E, G020R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043R-R045T-S242R, G020R-S242R-H249R, N018R-N043R-N076D-A230E-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D, G020R-S024R-K27R-N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-N043R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-H249R, N018R-G020R-N043D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S242R, S024R-N043R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-T38I-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R, N018R-S024R-R045T-A230E-S242R, N018R-G020R-H249R, S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, S024R-N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-S242R, G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-S242R, N018R-G020R-N043R-N076D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-H249R, N018R-S024R-N043R-R045T-A230E-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-S024R-S242R, N018R-N043R-R045T-N076D-A230E-S242R, R045T-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-S242R, N018R-G020R-N043D-R045T-S240P, S024R-N043R-R045T-S242R-H249R, N018R-S024R-V30S-L31S-D32I-T33Q-G34V-I35F, N018R-G020R-N043R-N076D, G020R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-S242R-H249R, S024R-N043D-R045T-S242R-H249R, N043R-A230E-H249R, S024R-N043R-N076D-A230E-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-H249R, S024R-R045T-S242R-A273V, G020R-S024R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T-A230E-S242R, N018R-N043D-A230E-H249R, N018R-N043R-N076D-S242R, N018R-G020R-N076D, N018R-G020R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-N076D-S242R, G020R-N043R-H249R, N018R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-R045T-A230E-H249R, A230E-H249R, N018R-R045T-H249R, G020R-N043R-N076D, N043R-R045T-H249R, N018R-N043D-N076D-S242R-H249R, N043R-N076D-H249R, N018R-R045T, G020R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T, S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-R045T-H249R, N043R-N076D-S153A-H249R, N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043D-N076D-H249R и G020R-N043R-N076D-V227I, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024K-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-L148I-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D и S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V104L-S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-S188D-H249R, N062E-S128N-A158E-G159E-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R-E271F, S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, N062E-G159E-S188D-H249R, A016S-N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-A158E-G159E-H249R, S101A-S128N-A158E-Y209E-H249R, S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R, N062E-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R, N062E-S101A-A158E-R186H-E271F, N062E-V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-G159E-R186H-H249R, N062E-G159E-H249R, S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-S188D-E271F, N062E-A158E-H249R, N062E-R186H-S188D-H249R-E271F, S128N-A158E-Y209E-, N062E-S101A-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R-E271F, A016S-N062E-A158E-H249R, N062E-S101A-G159E-H249R, S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, S101A-S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-S188D-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-G159E-H249R-E271F, S128N-A158E-G159E-E271F, A016S-N062E-V104L-A158E-R186H-E271F, T022A-S128N-A158E-H249R, S128N-A158E-H249R, N062E-S101A-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-N062E-A158E-R186H-E271F, V104L-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-S188D-H249R, T022A-N062E-A158E, N062E-S101A-S188D-H249R-E271F, N062E-A158E-H249R-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, N062E-S101A-R186H-E271F, N062E-V104L-G159E-H249R, N062E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R-E271F, S101A-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-R186H, S101A-S128N-P129E-R186H-H249R, S101A-S103G-A158E-R186H-H249R, A016S-N062E-V104L-R186H-S188D-E271F, V104L-A158E-R186H-H249R, S101A-S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-E271F, A016S-N062E-A158E-H249R-E271F, N062E-S128N-A158E, N062E-S128N-G159E-H249R, N062E-S101A-A158E-S188D-H249R, S101A-S128N-A158E-H249R, N062E-A158E-R186H-S188D-H249R, A016S-V104L-A158E-R186H-E271F, N062E-L148I-G159E, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-S188D-H249R, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-V104L-R186H-S188D-E271F, T022A-S101A-A158E-R186H-H249R, S101A-S128N-A158E-Y209E, A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, S101A-V104L-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-H249R, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, A016S-V104L-S188D-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-E271F, V104L-S128N-G159E-E271F, V104L-A158E-R186H-H249R-E271F, A158E-R186H-H249R, S101A-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, A016S-S128N-A158E-R186H, V104L-S128N-R186H-S188D-H249R, A016S-S101A-S128N-R186H, A016S-N062E-S128N-R186H-E271F, A016S-S128N-R186H-E271F, S128N-P129E-R186H, A158E-R186H-H249R-E271F, A016S-A158E-H249R, A016S-A158E-R186H-H249R, A016S-T022A-A158E-R186H-E271F, E089P-S101A-P129E-R186H, T022A-S128N-A158E-R186H, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H, T022A-S128N-R186H-S188D-, N062E-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, T022A-A158E-R186H-H249R-E271F, T022A-V104L-A158E-H249R, S101A-L111V-P129E, A016S-A158E-H249R-E271F, A016S-L111V-S188D-, T022A-V104L-R186H-S188D-H249R и V104L-L148I-S188D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A001R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-G025R-N116A-Y167W, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S103N-S106G-Y167W-Q236N, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101A-H120F-A194F-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-S212F-A232V-Q245R, G020R-S144R-N185I-L233C-Q236N, G023A-S078R-S216F-Q236N-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-G115R-A232V-Q245R, P052N-S078R-S103N-L148I-T213A, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G025R-E089I-N116A-P239S-A270C, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, L148I-T213A-N252R, S024R-G025R-N183D-Y192W-P239S, G046R-A194F-S212M, V104L-L217E-T224A-H249R-N252R, G023A-Y091F-V121F-Y192W-Q236N, S101G-S103A-V104I-A232V-V244R-Q245R, S099F-S144R-Y167W-N252R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S078R-Y167W-S212M-A270C, V121F-N252R-A270C, G020R-S103N-S216F-Q236N-N252R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G023A-P052N-Y192W-I198L-N252R, G025R-G046R-V121F, S024R-S078R-V104L-N116A-N183D, G046R-Q059A-S103N-G211Q-S212M, G020R-P052N-N062Q-Y091F-Y192W, G023A-P052N-S144R-Y192W-S216F, S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, P052N-S103N-N116A-L148I-Y192W, E089I-N116A-N117F-T224A-H249R, S144R-G211Q-N238L-P239S-H249R, N043A-N062Q-A194F-G211Q, G020R-S024R-P052N-Q059A-S216F, S024R-Y167W-T224A-H249R, T057R-Y167W-H249R, G025R-S103N-R186K-A194F-T224A, S105T-S128N-S144R-L148I-S212M, G020R-Q059A-S144R-Y192W-T224A, S024R-N043A-N117F-A194F-G211Q, N117F-A194F-T213A-A270C, S078R-Y091F-V121F-L233C-N252R, T057R-S099F-S105T-I198L-T213A, G023A-Y091F-S101A-I198L-N252R, N062Q-S103N-V121F-S144R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, G023A-S024R-N117F-S212M-S216F, V104L-T213A-S216F, A194F-G211Q-Q236N, N062Q-S103N-N117F-A194F, S024R-N062Q-V104L-S106G-H249R, T057R-E089I-I198L, G046R-Q059A-S106G-L217E-H249R, N117F-T213A-A215F, S101A-H120F-Y192W-A215F-T224A, N043A-T057R-N117F-S144R-N183D, G046R-N183D-N238L, G025R-N043A-E089I-N117F, S078R-V104L-T213A-A215F-T224A, Y091F-S099F-S101A-S105T-Y167W, S106G-N117F-N238L, G046R-E089I-Y091F-S101A-N116A, G020R-N062Q-E089I-R186K-S212M, T057R-S099F-V121F-N185I-Y192W, G046R-E089I-Y192W-L233C-A270C, E089I-N117F-N185I-A215F-L233C, P052N-V104L-N183D-S216F-H249R, S078R-S099F-N116A-R186K-T224A, G025R-S105T-S128N-S144R-A270C, S105T-G211Q-S216F, S024R-G046R-Y091F-V121F, S106G-N185I-S216F-Q236N, N062Q-S101A-Q236N-N252R-A270C, G025R-N043A-Y091F-I198L-A270C, G020R-G023A-V104L-Y192W-L233C, S024R-N043A-S105T-S106G-I198L, G020R-E089I-L217E, S024R-Y091F-I198L-A215F-P239S, G046R-E089I-S099F-R186K-S212M, V104L-H120F-R186K-S216F-N252R, T022W-A194F-T213A-L233C-N238L, S099F-S105T-S106G-A194F-S212M, E089I-S105T-N116A-A215F-S216F, G025R-N116A-H120F-T224A-A270C, N043A-Q059A-S101A-S216F-T224A, T057R-N183D-Q236N, G025R-N062Q-S128N-S144R-N185I, S103N-H120F-Y167W-I198L-L233C, T022W-E089I-S216F, S024R-S106G-N116A-S212M-T224A, G020R-P052N-S101A-I198L-L233C, E089I-Y091F-N185I-G211Q-A270C, L111I-A215F-P239S, S024R-N116A-R186K-L233C-Q236N и G023A-S103N-S106G-S212M-A215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116S-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S103A-A232V-H249R, N018R-S101G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-H249R, N018R-T22K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V, N018R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S101G-S103A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-A232V-H249R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A215F-A232V-Q245R, S024R-S103A-V104I-H249R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101G-V104I-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-S103A-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-Q245R, S024R-S103A-Q245R, S024R-S103A-V104I-Q245R, G020R-S078R-S101G-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-V104I-H249R, N018R-S024R-V104I-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, R019H-G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S103A-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-S101G-V104I-A232V, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-S101G-V104I, G020R-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-Q245R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-H249R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, S024R-N076D-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, A001T-N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-I198L-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, S024R-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, G020R-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, G020R-T022W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-T180A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S103A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N076D-Q245R, S024R-V104I-Q245R, S101G-A232V, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-I198L-A232V-Q245R, S024R-Q245R-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, S024R-S101G-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-V104I, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T22W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, Q012H-G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-H249R, S024R-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-N076D-S103A-V104I-H249R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R-E271G, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, G020R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-S103A-M175L-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-Q245R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-A232V, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-I198M-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S103A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-V268G, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S103A-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-S076T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A273T, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-A232V, A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-V234I-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-A272V, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S103A-V104I-A232V, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-M117I-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-Y209H-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-M175L-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I-Q245R, K027R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A114T-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V, N018R-S024R-N076D-N116A-H249R, G020R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-A232V-Q245R-, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A131V-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-S101G-Q245R, S024R-N076D-S101G-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-S101G, N018R-T22W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-I198L-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-V104I, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-L088I-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, S024R-N076D-Q245R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-N218S-A232V-Q245R, N018R-S103A, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, S024R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, K027R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-V104I, S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-R275S, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, V004M-N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, V104I-A232V-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-T274I, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R-A270V, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V, S101G-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-M175L-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-N269S, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R-T260K, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, G020R-S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272D, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-A232V, S024R-S103A-V104I, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N076D-S103A-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, S103A-V104I-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, A016T-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N043R-N076D-S101G-S103T-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G115E-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G, N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-V104I-A232V, N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-H249R, S103A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-S103A-V104I-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-A131T-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-Q245R-H249R, N018R-N076D-A232V-H249R, N018K-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R-L267I, A232V-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, S024R-S101G-S103A-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-H249R, S103A-A232V-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-T274I, S024R-S103A-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, S103A-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-N263S, S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-V197A-T213A-A215F-H249R, S024R-S101G-S103A, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-V104I-A232V, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, G020R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-A150T-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116T-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-Q245R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-Y209H-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-Q245R, N076D-S101G-V104I-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, G020R-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N204D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A209V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R-N269D, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-Y209H-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N076D-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-T213A-H249R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, G020R-A090S-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-Q245R, K027R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S103A-V104I-L135I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, P005S-N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-N243D-H249R, N018R-G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D-S101G, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-Q245R, G020R-S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R-N269S, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-A086V-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-S101G-I198T-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R-A248T, N018R-N076D-V104I-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-V104I, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-N076D-V104I, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R-N263D, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-R269H, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-Y166F-A176P-A179V-N184T-A187P-A194P, N018R-T022W-S024R-D041E-N076D-S101A-S160T-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I, N018R-N076D-S101G-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-L031F-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R-N269S, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N114T-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R-T260A, N076D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N076D-V104I-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, S101G-S103A-A232V, S024R-N076D-S101G-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A156V-N183D-G211Q-A215F-H249R-N269S, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-N076D-S101G, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-N237D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R-R275S, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-H249R, N018R-N076D-S103A-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-D175E-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-A273E, G020R-S024R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, P005S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-S024R-V068A-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R-R275S, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R и N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-S024R-N043R-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S078R-H249R, G020R-S101G-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104V-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043R-N076D-S078R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D-H249R, G020R-S101A-S103G-V104V-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-L217E-H249R-N269R и N018R-S024R-N076D-L217E-S242R-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-S101A-S103A-V104I-G118R-A232V-Q245R, G020R-S024R-N116A-T213A, N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101A-N116A, S024R-N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N043R-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-T213A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, S024R-N043R-N116A-A215F-N269R, G020R-S024R-T213A-A215F, G020R-N116A-N269R, S024R-N116A-T213A-N269R, N043R-S101A-N116A-N269R, S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-A215F-N269R, G020R-N043R-S101A-N269R, S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R-N269R, S024R-A215F-N269R, N043R-S101A-N116A-T213A-A215F-N269R, N043R-S101A-T213A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-T213A-N269R, S024R-N043R-R045T-N269R, G020R-N043R-R045T-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T, N043R-N116A-N269R, S024R-N043R-S101A-A215F-N269R, S024R-N043R-R045T-T213A-A215F-N269R, G020R-S024R-R045T-N269R, G020R-N043R-S101A-N116A-T213A-A215F, G020R-S101G-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N116A-N269R, G020R-S101A-N116A-N269R, S024R-N043R-A215F, G020R-S024R-T213A, S024R-N043R-S101A-A215F, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-S024R-S101A-A215F, G020R-S024R-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-N116A, G020R-S024R-S101A-N116A, N043R-T213A-A215F-N269R, S024R-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-A215F, G020R-T038A-N043R-S101A, G020R-S024R-N116A-A215F, S024R-N043R-S101A-T213A, P014L-G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-A215F, G020R-S024R-A215F, G020R-N116A-A215F-N269R, G020R-R045T-N116A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-A215F и G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A-A215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A114V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F и N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R и N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-G102A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F и T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101S-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103G-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S101S-S103A-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V026F-V051W-V104L-S106E, V026F-L031F-S078N-G102A-S160D, G020K-G100S-N116L-A158E-S166D-N243F, T033S-N043W-N218D-P239G-N243F, T022L-T038F-A048R-N062E-G100S-R186K, S101D-S103N-N116L-S144R-A215D, V104L-S105T-T213A-L217E-S256N, N043W-S101D-S212M-N243F, V026F-A048R-S105T-T213A-N218D-T224A, S024F-S101D-G118R-A215D-L250I-A272F, V121F-N185E-T224A-P239G, T022L-L031F-G102A-S128D-T224A-N243F, N062E-S078N-G102A-N116L-S144R-L250I, T022L-T038F-V121F-S160D-A272F, V026F-S078N-G159C-R186K-N243F, S024F-A048R-G118R-S166D-L217E, G023A-T038F-S078N-G100S-S212M-A215D, G100S-N116L-A158E-T213A, S078N-V104L-G118R-S128D, G102A-S103N-S105T-A194E, T022L-S078N-S128D-T213A, K027R-G100S-G118R-S160D-S188D-N243F, S024F-G102A-R186K-T213A-L217E-N243F, T033S-S105T-S188D-S216F, G023A-G100S-A194E-S212M, A048R-S128D-N185E-P239G, G020K-S024F-T033S-P129E-A194E, G020K-K027R-P129E-S166D-P239G, T022L-G023A-K027R-S101D-V104L-S216F, T033S-G118R-P129E-A194E-P239G, T022L-S078N-N116L-P129E-S256N, K027R-S101D-S103N-S105T-A272F, A048R-S078N-N116L-N185E-L217E-P239G, G023A-S024F-K027R-N062E, S024F-S103N-V104L-G118R-S188D, V026F-V104L-S256N-A272F, S024F-N043W-V104L-V121F-P129E, N062E-S078N-N116L-T224A, G023A-S024F-V051W-A158E, K027R-T038F-G102A-N116L, N062E-S078N-S144R-S212M, L031F-N116L-S256N-A272F, T022L-T033S-V104L-N116L-S160D-R186K, S024F-G118R-P129E-R186K-T213A, N043W-S105T-T213A-A215D-S216F, L031F-S105T-R186K-S188D, V026F-A194E-T213A-S256N и S103N-S160D-L250I-S256N, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N062E-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-N062E-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F и T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-S024F-N062E-S188D-P239G, S024F-N062E-N116L-P239G, G020K-G023A-N062E-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-G118R-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D-T213A-P239G, G023A-N062E-N116L-G118R, G023A-S024F-N062E-N116L-G118R, S024F-N116L, S024F-N062E-S188D-T213A, G023A-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-S024F-N062E, G020K-N043W-N062E-N116L-P239G, S024F-N062E-N116L-T213A-P239G, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-N116L-S188D-T213A, S024F-N062E-S188D-P239G, G023A-N043W-N062E-N116L-G118R-T213A, N062E-S188D-P239G, G020K-S024F-N062E-P239G, S024F-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-S188D-T213A-P239G, S024F-N043W-G118R-S188D, G023A-S024F-N116L-G118R-S188D-T213A, G020K-G023A-N043W-N116L-S188D-T213A-P239G, G023A-S024F-N116L-S188D-P239G, G023A-N043W-N116L-G118R-S188D, G023A-S024F-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R, G020K-N043W-S188D-T213A, S024F-N062E-G118R-P239G, G023A-N043W-S188D-T213A, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-N116L-S188D-P239G, G020K-N043W-N062E-G118R, G020K-N043W-N116L-S188D-T213A, G020K-S024F, G023A-N043W-N116L-P239G, G023A-S024F-N043W-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N043W-T213A и G023A-S024F-N062E-G118R-T213A-P239G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-G023A-N043W-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D, S024F-G118R-S128I-P129E-G159D, G020K-S024F-N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-N062E-N116L-S188D, N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D, N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-N062E-N116L-T213A, G020K-G023A-N062E-N116L, G020K-N062E-S188D-T213A, G020K-N062E, G020K-S024F-N062E-N116L-S188D, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D, G020K-S024F-N062E-S188D-T213A, N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-N062E-N116L, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D-T213A, G023A-S024F-N062E-N116L-T213A, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, S024F-N062E-N116L-S188D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, G023A-N062E-N116L-S188D, N043W-N062E-N116L, G020K-G023A-N116L-S188D, N043W-N062E-N116L-S188D, S024F-N062E-N116L, N062E-N116L-S188D и T022A-S024R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S087R-S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-Q109R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R, N076D-S87R-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-Q109R, N076D-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-Q109R-Q245R и N076D-S103A-V104I-S212P-Q245L-E271V, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-P086W-G118R, S024R-S078R-P086W-N243F, S024R-T033S-P086S-S087N-Y209A, T033S-G118R, S024R-S078R-P086W-G118R-A270T, S024R-T033S-P086W-G118R, S078R-P086W-N243F, T033S-S078R-P086W-G118R-Y209A, T033S-S078R-Y209A, P086W-G118R-N243F, S024R-P086W, S078R-P086W-K235F, S024R-G118R, S024R-P086R, S101G-S103A-V104I-A232V, S024R-T033S-S078R-P086W-G118R, S024R-G118R-Y209A, Y209A-W241R, T033S-P086W-N243F, T033S-A172V-Y209A, G118R-Y209A-N243F, S024R-P086S-S141G, S024R-G118R-Y209A-N243F, S024R-T033S-P086S-S085N-K235F, S024R-T033S-A133V, S024R-T033S-S078R-P086W, S024R-P086W-Y209A, S024R-W241R, T033S-G118R-N243F, S024R-K235F, S024R-S078R-P086W, S024R-G118R-Y209A-K235F, S024R-Y209A-W241R, T033S-G118R-W241R, P086W-G118R-Y209A, T033S-G118R-G159D-Y209A, T033S-S078R-P086W, S024R-P086W-N243F, G118R-Y209A, S024R-P086W-G118R-V203I, S078R-Y209A-K235F, S024R-T033S-W241R, S078R-G118R, T033S-G118R-Y209A-N243F, L021M-S024R-T033S, S024R-T033S-P086W, T033S-K235F, S078R-P086W-Y209A, S024R-T033S-Y209A-K235F, T033S-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-Y209A, T033S-P086W-G118R-Y209A-N243F, P086W-Y209A-N243F, P005S-S078R-G118R-W241R, S024R-A174T, T033S-Y209A-N243F, P086W-G118R-A133V, S024R-T033S-G118R, S024R-P086W-Y209A-K235F, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, P005S-S024R-T033S-N243F, S024R-Y209A-S242P, S024R-T033S-S078R-G118R, S024R-T033S-A194T, S024R-N243F, S024R-Y209A, S024R-T033S-G118R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, S024R-T033S-S078R-N243F, P086W-N243F, T033S-G118D-A138V-Y209A, T033S-Y209A-K235F, S024R-P086R-G118R, T033S-P201S, S024R-P239Q, T033S-G118R-Y209A-, S078R-P086W, K235F-N243F, S024R-Y209A-K235F, G118R-A172V, H017Y-S024R-T033S-P086W, T033S-L148F, S024R-G118R-K235F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, G118R-Y209A-K235F, S024R-T033S-Y209A-N243F, S024R-T033S-K235F, S024R-T033S-G118R-K235F, S024R-S141G, S024R-T274I, S024R-T033S-Y209A, P086W-K235F, S024R-Y209A-N243F, V004E-T033S-S078R, P086W-Y209A-K235F, A015T-T033S, T033S-P086W-S156L-Y209A, S024R-G118R-N243F-R269H, Y209A-K235F, S024R-R247H, S024R-T033S-A228T, S078R-K235F, S024R-T033S-A174V-K235F, S024R-K235F-N243F, S024R-T033S-K235F-W241R, S024R-T033S-A151V, S024R-V104A, T033S-A048T, Q012H-V104A-G118R, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, S024R-T033S-N243F, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-T033S-P129H-N184D-T253M, S024R-A085V-P086W-G118R-K235F, S024R-A272P и S024R-R269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-S087D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S024R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S078R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-V150L-H249R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-S242R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, N076D-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N076D-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-S242R-Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-K027R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222Q-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R и N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271G, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I, T22A-S101A-Y209E, S103G-L111V-G159E, T22A-S103G-G159E, T22A-L111V-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-S103G-L111V, N62E-L111V-S128N, T22A-L111V-S128N, T22A-N62E-L111V, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, S101A-S103G-V104L-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L-G159E, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-E271F и S101A-Y209E-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K и S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N248R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R и N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, W241R, G20R-N43R-H249R, G20R-T22R-N43R, G20R-N43R-S242R, G20R-N43R-E271L, G20R-N43R-V244R, G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-T22R-S78R-S212F-W241R, S9A-G20R-N43R-S212F, S9A-N43R-S212F, G20R-N43R-S212F, G20R-T22R-N43R-S212F, S24R-S78R-S212F, S9A-N43R-S78R, S9A-N43R-S78R-S242R, S9A-G20R-N43R-S78R, G20R-S24R-N43R-S78R-S242R, T22R-S24R-S78R-S212F, S9A-G20R-N43R-S78R-S242R, G20R-N43R-S78R-H249R, G20R-N43R-S78R, S9A-S78R-S212F, S9A-T22R-N43R-S78R, S9A-G20R-S24R-N43R, S9A-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R-S78R-S212F, G20R-S24R-N43R, A1R-S9A-N43R, G20R-S24R-N43R-G115R, S9A-S24R-N43R, G20R-T22R-S24R-N43R, A1R-S24R-N43R, S9A-G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-G20R-T22R-S78R-S212F, S9A-S24R-N43R-V244R, S9A-S24R-N43R-S242R, V4R-S9A-T22R-S24R-S212F и T22R-S24R-N43R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R, S101G, S103A, V104I, A232V, Q236H и Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A1R, Q2S, Q2M, Q2A, Q2R, Q2W, S3R, V4R, V4S, V4C, I8A, S9A, S9F, S9W, R10S, R10A, R10H, R10M, Q12F, Q12R, P14K, P14F, P14Q, A15R, A15F, A16S, H17R, H17M, H17F, N18R, N18K, G20F, G20K, G20R, T22A, T22R, T22Y, T22V, T22Q, T22L, T22W, G23A, G23S, G23F, S24R, S24F, S24W, S24Q, S24H, S24L, G25V, G25F, G25R, V26F, K27L, K27F, K27R, K27V, V28A, V28N, V28E, A29T, V30E, L31F, T33S, T33G, T33D, G34P, I35M, S36T, S36F, S36R, T38L, T38F, T38R, P40N, P40L, P40T, P40W, P40H, P40R, L42I, N43A, N43F, N43I, N43S, N43R, N43M, N43W, N43D, R45T, G46R, A48R, F50C, V51W, V51F, V51H, P52F, P52E, P52N, P55Y, T57R, Q59A, Q59F, Q59R, D60P, D60Q, D60A, N62E, N62Q, G63V, G63M, G63T, G63I, G63A, G63S, G63H, G63Q, G63D, G63E, G63P, H64F, H64T, V68A, V68C, A69N, A69T, A69P, A69W, T71G, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75E, L75R, N76D, S78R, S78N, S78I, S78R, I79W, I79Q, V81R, L82F, L82T, L82V, L82R, L82M, A85M, P86W, P86L, P86I, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, E89L, E89V, E89W, E89F, E89I, Y91N, Y91F, A92F, K94N, S99F, S99T, S99P, S99G, S99M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101D, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121F, V121F, V121E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, N183I, N183D, N183M, N183R, N183F, N183R, N185E, N185V, N185I, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Y192H, Y192W, A194E, A194V, A194F, D197F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, T213A, Y214F, A215N, A215D, A215E, A215H, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, N218P, N218E, T224A, T224G, V227I, A230E, A231I, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, N238K, N238L, P239K, P239G, P239R, P239R, P239H, P239T, P239N, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, N248I, N248R, H249R, H249T, L250I, K251R, K251S, N252I, N252F, N252R, N252K, N252H, T253I, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, T260I, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, N269I, N269R, A270C, E271I, E271H, E271V, E271H, E271M, E271L, E271P, E271A, E271F, E271T, A272F, A272F, A272R, A273F, A273I и T274G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям в аминокислотных положениях, выбранных из аминокислоты 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 50, 51, 52, 55, 57, 59, 60, 62, 63, 64, 68, 69, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 85, 86, 89, 91, 92, 94, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 128, 129, 132, 138, 44, 147, 148, 158, 159, 160, 166, 167, 175, 177, 181, 182, 183, 185, 186, 188, 192, 194, 197, 198, 203, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 224, 227, 230, 231, 233, 234, 235, 236, 236, 238, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 256, 258, 260, 262, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 272, 273 и 274, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы A1R, Q2S, Q2M, Q2A, Q2R, Q2W, S3R, V4R, V4S, V4C, I8A, S9A, S9F, S9W, R10S, R10A, R10H, R10M, Q12F, Q12R, P14K, P14F, P14Q, A15R, A15F, A16S, H17R, H17M, H17F, N18R, N18K, G20F, G20K, G20R, T22A, T22R, T22Y, T22V, T22Q, T22L, T22W, G23A, G23S, G23F, S24R, S24F, S24W, S24Q, S24H, S24L, G25V, G25F, G25R, V26F, K27L, K27F, K27R, K27V, V28A, V28N, V28E, A29T, V30E, L31F, T33S, T33G, T33D, G34P, I35M, S36T, S36F, S36R, T38L, T38F, T38R, P40N, P40L, P40T, P40W, P40H, P40R, L42I, N43A, N43F, N43I, N43S, N43R, N43M, N43W, N43D, R45T, G46R, A48R, F50C, V51W, V51F, V51H, P52F, P52E, P52N, P55Y, T57R, Q59A, Q59F, Q59R, D60P, D60Q, D60A, N62E, N62Q, G63V, G63M, G63T, G63I, G63A, G63S, G63H, G63Q, G63D, G63E, G63P, H64F, H64T, V68A, V68C, A69N, A69T, A69P, A69W, T71G, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75E, L75R, N76D, S78R, S78N, S78I, S78R, I79W, I79Q, V81R, L82F, L82T, L82V, L82R, L82M, A85M, P86W, P86L, P86I, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, E89L, E89V, E89W, E89F, E89I, Y91N, Y91F, A92F, K94N, S99F, S99T, S99P, S99G, S99M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101D, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121F, V121F, V121E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, N183I, N183D, N183M, N183R, N183F, N183R, N185E, N185V, N185I, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Y192H, Y192W, A194E, A194V, A194F, D197F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, T213A, Y214F, A215N, A215D, A215E, A215H, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, N218P, N218E, T224A, T224G, V227I, A230E, A231I, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, N238K, N238L, P239K, P239G, P239R, P239R, P239H, P239T, P239N, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, N248I, N248R, H249R, H249T, L250I, K251R, K251S, N252I, N252F, N252R, N252K, N252H, T253I, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, T260I, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, N269I, N269R, A270C, E271I, E271H, E271V, E271H, E271M, E271L, E271P, E271A, E271F, E271T, A272F, A272F, A272R, A273F, A273I и T274G, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы G20K, G20R, G23A, S24F, S24R, N43R, N43W, R45T, N62E, N76D, S101A, N116A, N116L, G118R, S128I, P129E, S166D, S188D, T213A, A215F, L217E, P239G и N269R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:2, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет 0 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет -4 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет -3 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет -2 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет -1 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет +1 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет +2 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет +3 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет +4 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы составляет +5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus. В некоторых случаях общий заряд варианта протеазы отличается от 0 (т.е., общий заряд протеазы не является нейтральным).
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, имеющие одну или более из следующих характеристик: a) эффективность по способу тестирования 2 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) эффективность по способу тестирования 3 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; c) эффективность по способу тестирования 4 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) эффективность по способу тестирования 6 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотидные последовательности, которые кодируют варианты субтилизина, представленные в настоящем изобретении. Настоящее изобретение дополнительно предоставляет векторы экспрессии, включающие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие варианты субтилизина, представленные в настоящем изобретении. В некоторых дополнительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота в векторе экспрессии функционально связана с промотором. Настоящее изобретение также предоставляет клетки-хозяева, включающие векторы экспрессии, представленные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева являются клетками-хозяевами Bacillus. В некоторых дополнительных вариантах осуществления клетки-хозяева являются клетками-хозяевами B. subtilis.
Настоящее изобретение также предоставляет способы получения по меньшей мере одного варианта субтилизина, включающие: трансформацию клетки-хозяина вектором экспрессии, включающим по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один вариант субтилизина, представленный в настоящем изобретении, с получением трансформированной клетки-хозяина; и культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для получения по меньшей мере одного варианта субтилизина, с получением по меньшей мере одного варианта субтилизина. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают сбор продуцированного варианта субтилизина. В некоторых дополнительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота в векторе экспрессии функционально связана с промотором. В некоторых дополнительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота в векторе экспрессии функционально связана с промотором. Настоящее изобретение также предоставляет клетки-хозяева, включающие векторы экспрессии, представленные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева являются клетками-хозяевами Bacillus. В некоторых дополнительных вариантах осуществления клетки-хозяева являются клетками-хозяевами B. subtilis.
Варианты протеазы настоящего изобретения можно также применять в продуктах по уходу за тканью и по уходу за домом, включающих по меньшей мере один вариант субтилизина, представленный в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления продукт по уходу за тканью и по уходу за домом представляют собой очищающую композицию. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой гранулированную, порошковую, твердую, брусковую, жидкую, таблетированную, гелевую или пастообразную композицию. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой моющую композицию. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой моющую композицию, функциональную в холодной воде, моющую композицию, функциональную при низком рН, или плотную моющую композицию. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой моющую композицию для белья, моющую композицию для посуды и/или очищающую композицию для твердых поверхностей. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция для посуды представляет собой моющую композицию для ручного мытья посуды или моющую композицию для автоматического мытья посуды. В некоторых дополнительных вариантах осуществления продукт по уходу за тканью и по уходу за домом дополнительно включает по меньшей мере одно отбеливающее средство. В некоторых последующих дополнительных вариантах осуществления очищающая композиция является бесфосфатной, в то время как в других вариантах осуществления очищающая композиция содержит фосфат. В некоторых дополнительных вариантах осуществления продукт по уходу за тканью и по уходу за домом дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный фермент. В еще некоторых дополнительных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный фермент выбран из гемицеллюлаз, целлюлаз, пероксидаз, протеаз, металлопротеаз, ксиланаз, липаз, фосфолипаз, эстераз, пергидролаз, кутиназ, пектиназ, пектатлиаз, маннаназ, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, липоксигеназ, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, маланаз, β-глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидаз, хондроитиназ, лакказ и амилаз или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления продукты по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант субтилизина, который не представляет собой протеазу, функциональную в холодной воде.
Настоящее изобретение также предоставляет очищающие композиции, включающие по меньшей мере один вариант субтилизина. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции представляют собой гранулированные, порошковые, твердые, брусковые, жидкие, таблетированные, гелевые или пастообразные композиции. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции представляют собой моющие композиции. В еще некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции представляют собой моющие композиции, функциональные в холодной воде, моющие композиции, функциональные при низком рН, или плотные моющие композиции. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции представляют собой моющие композиции для белья, моющие композиции для посуды и/или очищающие композиции для твердой поверхности. В некоторых дополнительных вариантах осуществления моющие средства для посуды представляют собой моющие композиции для ручного мытья посуды или моющие композиции для автоматического мытья посуды. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции представляют собой моющие композиции для белья. В еще одних дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции дополнительно включают по меньшей мере одно отбеливающее средство. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции являются бесфосфатными, в то время как в других вариантах осуществления очищающие композиции содержат фосфат. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции дополнительно включают по меньшей мере один дополнительный фермент. В еще некоторых дополнительных вариантах осуществления у очищающих композиций по меньшей мере один дополнительный фермент выбран из группы, состоящей из гемицеллюлаз, целлюлаз, пероксидаз, протеаз, металлопротеаз, ксиланаз, липаз, фосфолипаз, эстераз, пергидролаз, кутиназ, пектиназ, пектатлиаз, маннаназ, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, липоксигеназ, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, маланаз, β-глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидаз, хондроитиназ, лакказ и амилаз или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции включают по меньшей мере один вариант субтилизина, который не представляет собой протеазу, функциональную в холодной воде. Такая композиция может быть продуктом по уходу за тканью и по уходу за домом или такая композиция может не быть продуктом по уходу за тканью и по уходу за домом.
Настоящее изобретение также предоставляет способы очистки, включающие приведение поверхности или предмета в контакт с очищающей композицией, включающей по меньшей мере один вариант субтилизина, представленный в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления способы очистки включают приведение поверхности или предмета в контакт по меньшей мере с одной очищающей композицией, представленной в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают промывание поверхности или предмета после приведения поверхности или предмета, соответственно, в контакт с очищающей композицией. В некоторых вариантах осуществления предметом является столовая посуда, в то время как в других вариантах осуществления предметом является ткань. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают этап промывания поверхности или предмета после приведения поверхности или предмета в контакт с очищающей композицией. В некоторых дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают этап сушки поверхности или предмета после промывания поверхности или предмета. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции включают по меньшей мере один вариант субтилизина, который не представляет собой протеазу, функциональную в холодной воде.
Настоящее изобретение обеспечивает способы очистки поверхности или предмета, включающие: обеспечение очищающей композиции, представленной в настоящем изобретении, и поверхности или предмета, нуждающегося в очистке; и приведение очищающей композиции в контакт с поверхностью или предметом, нуждающемся в очистке, в условиях, подходящих для очистки поверхности или предмета, с получением очищенной поверхности или предмета. В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения дополнительно включают этап промывания очищенной поверхности или предмета с получением промытой поверхности или предмета. В некоторых дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают этап сушки промытой поверхности или предмета. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции включают по меньшей мере один вариант субтилизина, который не представляет собой протеазу, функциональную в холодной воде.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На ФИГ.1 приведено выравнивание зрелых эталонных протеаз, включая: BPN' (SEQ ID NO:1) и GG36 (SEQ ID NO:2). Каждое аминокислотное положение каждого варианта протеазы, описанного в настоящем изобретении, включая каждый вариант протеазы, функциональный в холодной воде, пронумеровано в соответствии с нумерацией соответствующего аминокислотного положения в аминокислотной последовательности протеазы субтилизин BPN' Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO:1), показанной на ФИГ.1, как установлено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью протеазы субтилизин BPN' Bacillus amyloliquefaciens. Таким образом, если не указано иное в настоящем изобретении, положения замен даны в связи с BPN'.
На ФИГ.2 представлена карта pHPLT-GG36.
На ФИГ.3 представлена карта pRA68.
На ФИГ.4 представлена карта pRA96.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предоставляет варианты серинпротеазы. В частности, настоящее изобретение предоставляет варианты серинпротеазы с одной или более заменами по сравнению с эталонной серинпротеазой. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет композиции, включающие данные варианты серинпротеазы. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет очищающие композиции, включающие по меньшей мере один из данных вариантов серинпротеазы.
Определения
Если не указано иное, практическое осуществление настоящего изобретения включает общепринятые методики, традиционно применяемые в молекулярной биологии, белковой инженерии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, которые находятся в компетенции специалиста в данной области. Такие методики известны специалистам в данной области и описаны в многочисленных текстах и справочниках, хорошо известных специалистам в данной области. Все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, упомянутые в настоящем изобретении, как выше, так и ниже, настоящим однозначно включены в данное изобретение ссылкой.
Если не определено иное в настоящем изобретении, все технические и научные термины, применяемые в настоящем изобретении, имеют то же значение, которое традиционно понимается рядовым специалистов в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Специалистам в данной области известно множество технических словарей. Хотя при практическом осуществлении настоящего изобретения находят применение любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем изобретении, в настоящем изобретении описываются некоторые подходящие способы и материалы. Соответственно, термины, определяемые непосредственно ниже, полнее описаны на основе Описания изобретения в целом. Также, применяемая в настоящем изобретении форма единственного числа включает указание на множественное число, если контекст явно не указывает на иное. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты пишутся слева направо в 5'-3' ориентации; аминокислотные последовательности пишутся слева направо в амино-карбокси ориентации, соответственно. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описываемыми методологией, протоколами и реагентами, поскольку они могут варьировать в зависимости от того, в каком контексте применяют их специалисты в данной области.
Практическое осуществление настоящего изобретения включает, если не указано иное, общепринятые методики очистки белка, молекулярной биологии, микробиологии, методики рекомбинантных ДНК и секвенирования белка, все из которых находятся в компетенции специалистов данной области.
Кроме того, заглавия, приведенные в настоящем изобретении, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения, которые можно получить на основании описания в целом. Соответственно, термины, определяемые непосредственно ниже, полнее определяются на основании описания в целом. Тем не менее, для того, чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, ряду терминов ниже приведены определения.
Применяемые в настоящем изобретении термины “протеаза” и “протеиназа” относятся к ферментному белку, который обладает способностью разрушать другие белки. Протеаза обладает способностью осуществлять “протеолиз”, который начинает катаболизм белка путем гидролиза пептидных связей, которые соединяют вместе аминокислоты в пептидной или полипептидной цепи, формирующей белок. Данную активность протеазы в качестве белок-расщепляющего фермента называют “протеолитической активностью”. Существует множество хорошо известных процедур для измерения протеолитической активности (см., например, Kalisz, "Microbial Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, (1988)). Например, протеолитическую активность можно измерить с помощью сравнительных анализов, которые анализируют соответствующую способность протеазы гидролизовать промышленный субстрат. Иллюстративные субстраты, пригодные в анализе протеазы или протеолитической активности, включают, но без ограничений, диметилказеин (Sigma C-9801), бычий коллаген (Sigma C-9879), бычий эластин (Sigma E-1625) и бычий кератин (ICN Biomedical 902111). Колориметрические анализы с использованием данных субстратов хорошо известны в данной области (см., например, WO 99/34011 и патент США № 6376450, оба из которых включены в настоящее изобретение ссылкой). pNA-анализ (см., например, Del Mar et al., Anal. Biochem. 99:316-320 [1979]) также находит применение в определении концентрации активного фермента для фракций, собранных в ходе градиентного элюирования. С помощью данного анализа измеряют скорость, при которой п-нитроанилин высвобождается по мере того, как фермент гидролизует растворимый синтетический субстрат, сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-п-нитроанилид (suc-AAPF-pNA). Скорость появления желтого цвета в результате реакции гидролиза измеряют при 410 нм на спектрофотометре, и она пропорциональна концентрации активного фермента. Кроме того, измерения абсорбции при 280 нанометрах (нм) можно применять для определения концентрации общего белка. Соотношение активный фермент/общий белок дает чистоту фермента.
Применяемый в настоящем изобретении термин “субтилизин” относится к любому члену семейства серинпротеаз S8, описываемому в MEROPS - базе данных пептидаз (см., Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucl Acids Res, 34 Database issue, D270-272 [2006]). Описываемое в данном документе семейство пептидаз S8 содержит сериновую эндопептидазу субтилизин и ее гомологи (Rawlings and Barrett, Biochem J., 290:205-218, [1993]). Семейство S8, также известное как семейство субтилаз, является вторым самым большим семейством сериновых пептидаз. К настоящему моменту были определены третичные структуры для нескольких членов семейства S8. Структура типичного белка S8 состоит из трех слоев при этом семицепочечный β-пласт находится между двумя слоями спиралей. Субтилизин (S08.001) представляет собой типовую структуру для рода SB (SB). Несмотря на различную структуру активные участки субтилизина и химотрипсина (S01.001) могут совмещаться, что позволяет сделать предположение, что схожесть является результатом скорее конвергентной, чем дивергентной эволюции.
Применяемые в настоящем изобретении термины “вариант протеазы”, “вариантная протеаза”, “вариантная серинпротеаза”, “вариант серинпротеазы”, “вариант субтилизина”, “мутантная протеаза” применяют в отношении протеаз, которые подобны эталонной протеазе (которой может быть протеаза субтилизин дикого типа), особенно по их функции, но имеют мутации в их аминокислотной последовательности, что делает их отличными в отношении последовательности от протеазы дикого типа или любой изначальной эталонной протеазы (т.е., “исходной” протеазы), от которой получена вариантная протеаза. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет “варианты GG36”, (или “варианты субтилизина GG36”), где присутствуют мутации в зрелой последовательности GG36, изложенной в SEQ ID NO:2. Однако не подразумевается, что эталонная протеаза ограничена какой-либо конкретной аминокислотной последовательностью. Кроме того, подразумевается, что данный термин охватывает варианты исходной протеазы, где последовательность исходной протеазы по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
Применяемый в настоящем изобретении термин “вариант протеазы, функциональный в холодной воде” означает вариант протеазы от исходной протеазы, где протеаза субтилизин GG36 B. lentus имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, где указанный вариант протеазы имеет одну или более из следующих характеристик: a) эффективность по способу тестирования 2 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) эффективность по способу тестирования 3 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; c) эффективность по способу тестирования 4 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) эффективность по способу тестирования 6 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5. Способ тестирования 2, способ тестирования 3, способ тестирования 4 и способ тестирования 6 подробно описаны далее в разделе "Пример 1" под заголовком “Способы тестирования”. Кроме того, подразумевается, что данный термин охватывает варианты исходной протеазы, где последовательность исходной протеазы по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения исходная протеаза (т.е., “эталонная” или “изначальная” протеаза) является коммерчески доступной протеазой, включая, но без ограничений, протеазы, продаваемые под торговыми названиями SAVINASE®, POLARZYME®, KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA®, OVOZYME®, (от Novozymes A/S); MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® и PURAFECT OXP®, PURAFAST™, PURAFECT® PRIME, PURAMAX® (от Danisco US, Genencor Division); и таковые, доступные от Henkel/Kemira, а именно BLAP (последовательность, показанная на Фиг.29 US 5352604 со следующими мутациями S99D+S101 R+S103A+V104I+G159S, в настоящем изобретении далее называемая BLAP) и BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I).
Применяемый в настоящем изобретении термин “вариантный полипептид” относится к полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая отличается по меньшей мере на один аминокислотный остаток от аминокислотной последовательности исходного или эталонного полипептида (включая, но без ограничений, полипептиды дикого типа).
Применяемое в настоящем изобретении “род Bacillus” включает все виды в пределах рода “Bacillus,” который известен специалистам в данной области, включая, но без ограничений, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus и B. thuringiensis. Понятно, что род Bacillus продолжает подвергаться таксономической реорганизации. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые были переклассифицированы, включая, но без ограничений, такие организмы, как B. stearothermophilus, который сейчас называется “Geobacillus stearothermophilus”. Производство устойчивых эндоспор в присутствии кислорода рассматривают как определяющий признак рода Bacillus, хотя данная характеристика также распространяется на недавно названные Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus и Virgibacillus.
Термины “полинуклеотид” и “нуклеиновая кислота”, которые применяют взаимозаменяемо в настоящем изобретении, относятся к полимеру с любой длиной из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепи. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), полинуклеотид, включающий дезоксирибонуклеотиды, и РНК (рибонуклеиновая кислота), полимер из рибонуклеотидов, являются примерами полинуклеотидов или нуклеиновых кислот с различной биологической функцией. Полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают, но без ограничений, одно-, двух- или трехцепочечную ДНК, геномную ДНК, кДНК, РНК, гибрид ДНК-РНК или полимер, включающий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически, биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. Следующие являются неограничивающими примерами полинуклеотидов: гены, фрагменты генов, хромосомные фрагменты, метка(и) экспрессируемых последовательностей (EST), экзоны, интроны, информационная РНК (иРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомная РНК (рРНК), рибозимы, комплементарная ДНК (кДНК), рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, зонды нуклеиновой кислоты и праймеры. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды включают модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, урацил, другие сахара и соединяющие группы, такие как фторрибоза и тиоат, и нуклеотидные ответвления. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеотидов прерывают ненуклеотидными компонентами.
Применяемый в настоящем изобретении термин "мутация" относится к изменениям, сделанным в изначальной аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты. Подразумевается, что данный термин охватывает замены, вставки и делеции.
Применяемый в настоящем изобретении термин “вектор” относится к конструкции нуклеиновой кислоты или полинуклеотидной конструкции, применяемой для введения или переноса нуклеиновой кислоты(нуклеиновых кислот) или полинуклеотида(ов) в целевую клетку или ткань. Вектор, как правило, применяют для введения чужеродной ДНК в другую клетку или ткань. Вектор, в целом, включает последовательность ДНК, которая представляет собой трансген, и большую полинуклеотидную последовательность, которая служит в качестве "остова" вектора. Вектор, как правило, служит для переноса генетической информация, такой как вставляемый трансген, в целевую клетку или ткань с тем, чтобы изолировать, размножить или экспрессировать вставку в целевой клетке или ткани. Векторы включают плазмиды, клонирующие векторы, бактериофаги, вирусы (например, вирусный вектор), космиды, векторы экспрессии, челночные векторы, кассеты и т.п. Вектор, как правило, включает точку начала репликации, сайт множественного клонирования и селектируемый маркер. Способ вставки вектора в целевую клетку, как правило, называют трансфекцией. Трансфекцию клетки при помощи вирусного вектора, как правило, называют трансдукцией. Настоящее изобретение включает в некоторых вариантах осуществления вектор, который включает последовательность ДНК, кодирующую вариантную протеазу (например, предшественник или зрелую вариантную протеазу), которая функционально связана с подходящей пропоследовательностью (например, секреторной, сигнальной пептидной последовательностью и т.д.), способной влиять на экспрессию последовательности ДНК у подходящего хозяина.
Применяемый в настоящем изобретении термин “кассета экспрессии”, “плазмида экспрессии” или “вектор экспрессии” относится к конструкции нуклеиновой кислоты или вектору, полученному рекомбинантно или синтетически для экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты (например, чужеродной нуклеиновой кислоты или трансгена) в целевой клетке. Представляющая интерес нуклеиновая кислота, как правило, экспрессирует представляющий интерес белок. Вектор экспрессии или кассета экспрессии, как правило, включает промоторную нуклеотидную последовательность, которая управляет или способствует экспрессии чужеродной нуклеиновой кислоты. Вектор или кассета экспрессии, как правило, также включает любые другие указанные элементы нуклеиновой кислоты, которые делают возможной транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в целевой клетке. Рекомбинантную кассету экспрессии можно встроить в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Некоторые векторы экспрессии обладают способностью к встраиванию и экспрессии гетерологичных ДНК-фрагментов в клетке-хозяине. Многие прокариотические и эукариотические векторы экспрессии коммерчески доступны. Выбор соответствующих векторов экспрессии известен специалистам в данной области. Выбор соответствующих векторов экспрессии для экспрессии белка с последовательности нуклеиновой кислоты, встроенной в вектор экспрессии, известен специалистам в данной области.
ДНК-конструкция является искусственно сконструированным сегментом нуклеиновой кислоты, который можно ввести в целевую клетку или ткань. ДНК-конструкция, как правило, включает ДНК-вставку, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, который был субклонирован в вектор. Вектор может содержать гены бактериальной устойчивости для роста в бактериях и промотор для экспрессии представляющего интерес белка в организме. ДНК можно создать in vitro с помощью ПЦР или любой другой подходящей методики(методик), известной специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления ДНК-конструкция включает представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления последовательность функционально связана с дополнительными элементами, такими как управляющие элементы (например, промоторы и т.д.). ДНК-конструкция может дополнительно включать селектируемый маркер и может дополнительно включать входную последовательность, фланкируемую гомологичными фрагментами. Конструкция может включать другие негомологичные последовательности, добавленные к концам (например, челночные последовательности или фланги). В некоторых вариантах осуществления концы последовательностей смыкаются так, чтобы ДНК-конструкция образовывала замкнутый круг. Представляющая интерес последовательность нуклеиновой кислоты, которая встроена в ДНК-конструкцию с помощью методик, хорошо известных в области техники, может представлять собой нуклеиновую кислоту дикого типа, мутантную или модифицированную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления ДНК-конструкция включает одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, гомологичных хромосоме клетки-хозяина. В других вариантах осуществления ДНК-конструкция включает одну или более негомологичных нуклеотидных последовательностей. После сборки ДНК-конструкции in vitro, ее можно применять, например, для: 1) вставки гетерологичных последовательностей в требуемую целевую последовательность клетки-хозяина; и/или 2) мутагенеза участка хромосомы клетки-хозяина (т.е., замены эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью); 3) удаления целевых генов; и/или 4) введения реплицирующейся плазмиды в хозяина. “ДНК-конструкцию” применяют взаимозаменяемо в настоящем изобретении с “кассетой экспрессии”.
Применяемый в настоящем изобретении термин “плазмида” относится к внехромосомной молекуле ДНК, которая способна реплицироваться независимо от хромосомной ДНК. Плазмида является двуцепочечной (ds) и может быть кольцевой, и ее, как правило, применяют в качестве клонирующего вектора.
Применяемый в настоящем изобретении в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку термин "введенная" относится к способу, подходящему для переноса последовательности нуклеиновой кислоты в клетку. Такие способы введения включают, но без ограничений, слияние протопластов, трансфекцию, трансформацию, электропорацию, конъюгацию и трансдукцию (см., например, Ferrari et al., “Genetics,” in Hardwood et al. (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pp. 57-72 [1989]).
Трансформация относится к генетической перемене клетки, которая происходит в результате поглощения, встраивания в геном и экспрессии генетического материала (например, ДНК).
Применяемое в настоящем изобретении выражение нуклеиновая кислота является “функционально связанной” с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, если она помещена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с нуклеотидной кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Сайт связывания рибосом может быть функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы способствовать трансляции кодирующей последовательности. Как правило, “функционально связанные” последовательности ДНК являются смежными. Однако, энхансеры не обязаны быть смежными. Связывание осуществляют путем сшивания в подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов нет, можно применять синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с традиционной практикой.
Применяемый в настоящем изобретении термин “ген” относится к полинуклеотиду (например, сегменту ДНК), который кодирует полипептид и включает участки, предшествующие и последующие кодирующим участкам, а также вставочные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).
Применяемый в настоящем изобретении термин “рекомбинантные” в случае применения по отношению к клетке, как правило, указывает на то, что клетка была модифицирована введением гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, или что клетка происходит от клетки, модифицированной подобным образом. Например, рекомбинантная клетка может включать ген, не обнаруживаемый в идентичной форме у нативной (нерекомбинантной) формы клетки, или рекомбинантная клетка может включать нативный ген (обнаруживаемый у нативной формы клетки), но который был модифицирован и повторно введен в клетку. Рекомбинантная клетка может включать нуклеиновую кислоту, эндогенную по отношению к клетке, которая была модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты из клетки; такие модификации включают модификации, получаемые путем замещения гена, сайт-специфической мутации и смежных методик, известных рядовым специалистам в данном области. Технология рекомбинантной ДНК включает методики получения рекомбинантной ДНК in vitro и перенос рекомбинантной ДНК в клетки, где она может экспрессироваться или размножаться с получением, таким образом, рекомбинантного полипептида. “Рекомбинация”, ”рекомбинирование” и “рекомбинированный” у полинуклеотидов или нуклеиновых кислот относится в целом к сборке или объединению двух более нуклеиновых кислот или полинуклеотидных цепей или фрагментов с образованием нового полинуклеотида или нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный полинуклеотид или нуклеиновую кислоту иногда называют химерой. Нуклеиновая кислота или полипептид является “рекомбинантным”, если он является искусственным или сконструированным, или происходит от искусственного или сконструированного белка или нуклеиновой кислоты.
Применяемый в настоящем изобретении термин “амплификация” нуклеиновой кислоты или гена относится к процессу, посредством которого конкретные последовательности ДНК диспропорционально реплицируются так, что амплифицированная нуклеиновая кислота или ген становятся присутствующими в более высоком количестве копий, чем изначально присутствуют в геноме. В некоторых вариантах осуществления отбор клеток по росту в присутствии лекарственного средства (например, ингибитора ингибируемого фермента) приводит к амплификации любого эндогенного гена, кодирующего требуемый генный продукт для роста в присутствии лекарственного средства, или к амплификации экзогенных (т.е., введенных) последовательностей, кодирующих данную нуклеиновую кислоту или генный продукт, или к тому и другому.
“Амплификация” является особым случаем репликации нуклеиновой кислоты, вовлекающим матричную специфичность. Ее следует противопоставить неспецифичной матричной репликации (т.е., репликации, которая является матрично-зависимой, но не зависит от конкретной матрицы). Матричная специфичность в данном случае отличается от точности репликации (т.е., синтеза точной полинуклеотидной последовательности) и нуклеотидной (рибо- или дезоксирибо-) специфичности. Матричную специфичность часто описывают на основании "целевой" специфичности. Целевые последовательности являются “целями” в смысле того, что их считают отсортировываемыми от другой нуклеиновой кислоты. Методики амплификации разработаны главным образом для такой отсортировки.
Применяемый в настоящем изобретении термин “праймер” относится к олигонуклеотиду (полимеру из нуклеотидных остатков), который либо естественно встречается как, например, очищенный фрагмент рестрикции, либо получен синтетически, и который способен выполнять роль точки инициации синтеза при размещении в условиях, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, который комплементарен цепи нуклеиновой кислоты (т.е., в присутствии нуклеотидов и индуцирующего средства, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и pH). Праймер предпочтительно является одноцепочечным для максимальной эффективности при амплификации, но альтернативно может быть двухцепочечным. Если двухцепочечный, то праймер сначала подвергают обработке для разделения его цепей перед применением для получения продуктов удлинения. В некоторых вариантах осуществления праймером является олигодезоксирибонуклеотид. Праймер должен быть достаточно длинным для того, чтобы инициировать синтез продуктов удлинения в присутствии индуцирующего средства. Точная длина праймера зависит от ряда факторов, включая температуру, источник праймера и применения способа.
Применяемый в настоящем изобретении термин “зонд” относится к олигонуклеотиду, который либо встречается в природе, как, например, очищенный фрагмент рестрикции, либо получен синтетически, рекомбинантно или с помощью ПЦР-амплификации, и который, как правило, способен гибридизироваться с другим представляющим интерес олигонуклеотидом. Зонд может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Зонды пригодны при детекции, идентификации и выделении конкретных генных последовательностей. Подразумевается, что любой зонд, применяемый в настоящем изобретении, будет помечен любой “репортерной группой” так, чтобы она была детектируема в любой системе детектирования, включая, но без ограничений, ферментную (например, ELISA, а также гистохимические анализы на основе ферментов), флуоресцентную, радиоактивную и люминесцентную системы. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо конкретной системой детектирования или меткой.
Применяемый в настоящем изобретении термин “цель” при применении в отношении полимеразной цепной реакции относится к участку нуклеиновой кислоты, связываемому праймерами, применяемыми для полимеразной цепной реакции. Таким образом, “цель” стремятся отсортировать от других последовательностей нуклеиновой кислоты. Нуклеотидный “сегмент” представляет собой участок нуклеиновой кислоты в пределах целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
Применяемый в настоящем изобретении термин "полимеразная цепная реакция" (ПЦР) относится к способам патентов США №№ 4683195, 4683202 и 4965188, настоящим включаемых ссылкой, которые включают способы повышения концентрации сегмента целевой последовательности в смеси геномной ДНК без клонирования или очистки. Данный способ амплификации целевой последовательности хорошо известен в данной области техники.
Применяемый в настоящем изобретении термин “реагенты для амплификации” относится к тем реагентам (например, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер и т.д.), которые необходимы для амплификации, за исключением праймеров, матрицы нуклеиновой кислоты и амплифицирующего фермента. Как правило, реагенты для амплификации наряду с другими компонентами реакции помещены и содержатся в реакционном сосуде (пробирка для теста, микролунка и т.д.).
Применяемый в настоящем изобретении термин “эндонуклеаза рестрикции” или “рестрикционный фермент” относится к ферменту (например, бактериальному ферменту), который способен разрезать двухцепочечную или одноцепочечную ДНК в или рядом со специфической последовательностью нуклеотидов, известной как сайт рестрикции. Нуклеотидная последовательность, включающая сайт рестрикции, распознается и расщепляется данной эндонуклеазой рестрикции или рестрикционным ферментом и зачастую является сайтом для вставки фрагментов ДНК. Сайт рестрикции можно встроить в вектор экспрессии или ДНК-конструкцию.
“Гомологичная рекомбинация” относится к обмену фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК или спаренными хромосомами в сайте с идентичными или почти идентичными нуклеотидными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления хромосомная интеграция является гомологичной рекомбинацией.
Говорят, что нуклеиновая кислота или полинуклеотид “кодирует” полипептид, если в своем нативном состоянии или при воздействии на него способами, известными специалистам в данной области, он может транскрибироваться и/или транслироваться с получением полипептида или его фрагмента. Также говорят, что антисмысловая цепь такой нуклеиновой кислоты кодирует последовательность.
Как известно из уровня техники, последовательность ДНК может транскрибироваться РНК-полимеразой с получением последовательности РНК, но последовательность РНК может обратно транскрибироваться обратной транскриптазой с получением последовательности ДНК.
“Штамм-хозяин” или “клетка-хозяин” относится к подходящему хозяину для вектора экспрессии, включающего представляющую интерес последовательность ДНК. Представляющая интерес последовательность ДНК может экспрессировать представляющий интерес белок в штамме-хозяине или клетке-хозяине.
“Белок” или “полипептид” включает полимерную последовательность аминокислотных остатков. Термины “белок” и “полипептид” в настоящем изобретении применяют взаимозаменяемо. В ходе настоящего раскрытия применяют одно- и 3-буквенный код для аминокислот, как определено в соответствии с IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (Объединенная комиссия IUPAC-IUB по биохимической номенклатуре) (JCBN). Отдельная буква X относится к любой из двадцати аминокислот. Также понятно, что полипептид может кодироваться несколькими нуклеотидными последовательностями вследствие вырожденности генетического кода. Мутации названы с помощью однобуквенного кода для исходной аминокислоты с последующими тремя или двумя числовыми номерами положения и затем однобуквенным кодом для вариантной аминокислоты. Например, мутация глицина (G) в положении 87 на серин (S) представлена в виде “G087S” или “G87S”. Множественные мутации указаны при помощи вставки “-” между мутациями. Мутации в положениях 87 и 90 представлены в виде либо “G087S-A090Y”, либо “G87S-A90Y”, либо “G87S+A90Y”, либо “G087S+A090Y”. Для делеций применяют однобуквенный код "Z". Для вставки относительно исходной последовательности однобуквенный код "Z" расположен на левой стороне номера положения. Для делеции однобуквенный код "Z" расположен на правой стороне номера положения. Для вставок номер положения представляет собой номер положения перед вставленной аминокислотой(ами), плюс 0,01 для каждой аминокислоты. Например, вставка трех аминокислот аланин (A), серин (S) и тирозин (Y) между положением 87 и 88 показано как “Z087,01A-Z087,02S-Z087,03Y”. Таким образом, объединение всех вышеупомянутых мутаций плюс делеция в положении 100 представляет собой: “G087S-Z087,01A-Z087,02S-Z087,03Y-A090Y-A100Z”.
“Пропоследовательность” или “пропептидная последовательность” относится к аминокислотной последовательности между сигнальной пептидной последовательностью и зрелой последовательностью протеазы, которая необходима для секреции протеазы. Отщепление пропоследовательности или пропептидной последовательности дает в результате зрелую активную протеазу.
Термин “сигнальная последовательность” или “сигнальный пептид” относится к последовательности аминокислотных остатков, которая может принимать участие в секреции или непосредственном транспорте зрелой формы или формы-предшественника белка. Сигнальная последовательность, как правило, расположена на N-конце по отношению к последовательности белка-предшественника или последовательности зрелого белка. Сигнальная последовательность может быть эндогенной или экзогенной. Одна иллюстративная экзогенная сигнальная последовательность включает первые семь аминокислотных остатков сигнальной последовательности из субтилизина Bacillus subtilis, слитые с остатком сигнальной последовательности субтилизина из Bacillus lentus (ATCC 21536). Сигнальная последовательность в норме отсутствует у зрелого белка. Сигнальная последовательность, как правило, отщепляется от белка сигнальной пептидазой после транспортировки белка.
Термин “гибридная сигнальная последовательность” относится к сигнальным последовательностям, у которых часть последовательности получена от хозяина экспрессии и слита с сигнальной последовательностью подлежащего экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления используют синтетические последовательности.
Термин “зрелая” форма белка, полипептида или пептид относится к функциональной форме белка, полипептида или пептида без сигнальной пептидной последовательности и пропептидной последовательности.
Термин форма “предшественник” белка или пептида относится к зрелой форме белка с пропоследовательностью, функционально связанной с N- или С-концом белка. Предшественник может также иметь “сигнальную” последовательность, функционально связанную с N-концом пропоследовательности. Предшественник также может иметь дополнительные полинуклеотиды, которые вовлечены в посттрансляционную активность (например, полинуклеотиды, отщепляемые от него с тем, чтобы оставить зрелую форму белка или пептида).
Термин “дикого типа” в отношении аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты указывает на то, что аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты является нативной или встречающейся в природе последовательностью. Применяемый в настоящем изобретении термин “встречающаяся в природе” относится к чему-либо (например, белкам, аминокислотам или последовательностям нуклеиновых кислот), которые обнаруживаются в природе (т.е., над ними не были произведены действия посредством рекомбинантных способов).
Применяемый в настоящем изобретении термин “не встречающаяся в природе” относится к чему-либо, что не обнаруживается в природе (например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, получаемые в лаборатории).
Применяемые в настоящем изобретении в отношении положений аминокислотных остатков “соответствующий (чему-либо)”, или “соответствует (чему-либо)” или “соответствует” относится к аминокислотному остатку в пронумерованном положении в белке или пептиде или аминокислотному остатку, который аналогичен, гомологичен или эквивалентен пронумерованному остатку в белке или пептиде. Применяемое в настоящем изобретении выражение “соответствующий участок” в целом относится к аналогичному положению среди родственных белков или эталонного белка.
Термины “происходящая от” и “полученная от” относятся не только к протеазе, продуцированной или продуцируемой штаммом обсуждаемого организма, но также к протеазе, кодируемой последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма и продуцируемой у организма-хозяина, содержащего такую последовательность ДНК. Кроме того, данный термин относится к протеазе, которая кодируется последовательностью ДНК синтетического и/или кДНК-происхождения и которая имеет отличительные характеристики обсуждаемой протеазы. Для примера, выражение “протеазы, происходящие от Bacillus” относится к таким ферментам, которые обладают протеолитической активностью и которые в природе продуцируются Bacillus, а также к серинпротеазам, наподобие тех, которые продуцируются источниками Bacillus, но которые благодаря применению методик генной инженерии продуцируются организмами, не относящимися к Bacillus, трансформированными нуклеиновой кислотой, кодирующей серинпротеазы.
Термин “идентичные” в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относится к остаткам у двух последовательностей, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие, которое измеряют с помощью одного из следующих алгоритмов анализа или сравнения последовательностей.
Применяемое в настоящем изобретении “гомологичные гены” относится к паре генов от различных, но обычно родственных видов, которые соответствуют друг другу и которые идентичны или очень подобны друг другу. Термин охватывает гены, которые обособились в результате видообразования (т.е., развитие новых видов) (например, ортологичные гены), а также гены, которые были обособлены в результате генетической дупликации (например, паралогичные гены).
Применяемое в настоящем изобретении “гомология” относится к подобию или идентичности последовательностей, при этом идентичность является предпочтительной. Гомологию можно определить с помощью стандартных методик, известных в области техники (см., например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; компьютерную программу, такую как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин); и Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387-395 [1984]). Одним примером пригодного алгоритма является PILEUP. PILEUP создает множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с помощью прогрессивных попарных выравниваний. Он также может построить древо, показывающее кластерные взаимосвязи, применяемые для создания выравнивания. В PILEUP применяют упрощение способа прогрессивного выравнивания Feng и Doolittle (см., Feng and Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 [1987]). Способ подобен таковому, описанному у Higgins и Sharp (см., Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). Пригодные параметры PILEUP, включающие стандартный штраф за открытие гэпа 3,00, стандартный штраф за продолжение гэпа 0,10 и взвешенные конечные гэпы. Другим примером пригодного алгоритма является алгоритм BLAST, описанный у Altschul et al., (см., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990]; и Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). Особенно пригодной программой BLAST является программа WU-BLAST-2 (см., Altschul et al., Meth. Enzymol. 266:460-480 [1996]). В WU-BLAST-2 применяют несколько параметров поиска, большинство из которых выставлены как значения по умолчанию. Корректируемые параметры выставляют со следующими значениями: длина перекрывания =1, доля перекрывания =0,125, пороговая длина «слова» (T)=11. Параметры HSP S и HSP S2 являются динамическими значениями и устанавливаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, против которой проводят поиск представляющей интерес последовательности. Однако, значения можно корректировать для увеличения чувствительности.
Процентная идентичность последовательностей между эталонной последовательностью и представляющей интерес тестовой последовательностью может быть легко определена специалистом в данной области. Процентную идентичность, общую для полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, определяют путем прямого сравнения информации последовательностей между молекулами с помощью выравнивания последовательностей и определения идентичность способами, известными в данной области техники. Примером алгоритма, который подходит для определения подобия последовательностей, является алгоритм BLAST (см., Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 [1990]). Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно благодаря Национальному центру биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information). Данный алгоритм включает сначала идентификацию пары последовательностей с наибольшим сходством (HSP) путем идентификации коротких "слов" с длиной W в последовательности запроса, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому баллу T при выравнивании со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Эти изначальные хиты соседних слов играют роль начальных точек для поиска более длинных HSP, которые их содержат. Хиты слов продлевают в обоих направлениях вдоль каждой из двух последовательностей, подвергаемых сравнению, до тех пор, пока можно повышать кумулятивный балл выравнивания. Продление хитов «слов» останавливают, если: кумулятивный балл выравнивания падает на количество X от максимального достигнутого значения; кумулятивный бал достигает нуля или ниже; или достигают конца любой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLAST использует по умолчанию длину "слова" (W) 11, матрицу замен BLOSUM62 (см., Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1992]) выравнивания (B) 50, параметр правдоподобия (E) 10, M'5, N'-4 и сравнение обеих цепей.
Затем алгоритм BLAST осуществляет статистический анализ подобия между двумя последовательностями (см., например, Karlin и Altschul, выше). Одной мерой подобия, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая обеспечивает указание на вероятность, с которой могут случайно встречаться совпадения между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновую кислоту считают подобной нуклеиновой кислоте серинпротеазы настоящего изобретения, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестовой нуклеиновой кислоты с нуклеиновой кислотой серинпротеазы составляет менее чем приблизительно 0,1, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 0,001. В случае, когда тестовая нуклеиновая кислота кодирует полипептид серинпротеазы, ее считают подобной указанной нуклеиновой кислоте серинпротеазы, если сравнение дает в результате наименьшую суммарную вероятность менее чем приблизительно 0,5 и более предпочтительно менее чем приблизительно 0,2.
“Идентичная” в процентах или процентная “идентичность” в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относится к двум или более последовательностям, которые являются одинаковыми или имеют указанный процент остатков нуклеиновой кислоты или аминокислотных остатков, соответственно, которые одинаковы при сравнении и выравнивании на максимальное подобие, которое определяют при помощи алгоритма сравнения последовательностей или визуального просмотра. “Процентная идентичность последовательностей”, или “% идентичность”, или “% идентичность последовательностей”, или “% идентичность аминокислотных последовательностей” рассматриваемой аминокислотной последовательности к эталонной (т.е., запроса) аминокислотной последовательности означает, что рассматриваемая аминокислотная последовательность является идентичной (т.е., на основании аминокислота-с-аминокислотой) на указанный процент с аминокислотной последовательностью запроса на длину сравнения при оптимальном выравнивании последовательностей. Таким образом, 80% идентичность аминокислотных последовательностей или 80% идентичность в отношении двух аминокислотных последовательностей означает, что 80% аминокислотных остатков в двух оптимально выровненных аминокислотных последовательностях являются идентичными.
“Процентная идентичность последовательностей”, или “% идентичность”, или “% идентичность последовательностей”, или “% идентичность нуклеотидных последовательностей” рассматриваемой последовательности нуклеиновой кислоты с эталонной (т.е. запроса) последовательностью нуклеиновой кислоты означает, что рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты идентична (т.е., на основании нуклеотид-с-нуклеотидом для полинуклеотидной последовательности) на указанный процент с последовательностью запроса на длину сравнения при оптимальном выравнивании последовательностей. Таким образом, 80% идентичность нуклеотидных последовательностей или 80% идентичность в отношении двух последовательностей нуклеиновых кислот означает, что 80% нуклеотидных остатков в двух оптимально выровненных последовательностях нуклеиновых кислот являются идентичными.
В некоторых вариантах осуществления “процентная идентичность последовательностей”, или “% идентичность последовательностей”, или “% идентичность” рассматриваемой последовательности с последовательностью запроса может быть рассчитана путем оптимального выравнивания двух последовательностей и сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на длину сравнения. Определяют количество положений в оптимальном выравнивании, в которых у обеих последовательностей встречаются идентичные остатки, таким образом получая количество совпавших положений, и затем количество совпавших положений делят на общее количество положений длины сравнения (которая, если не указано иное, представляет собой длину последовательности запроса). Полученное число умножают на 100 с получением процентной идентичности последовательности для рассматриваемой последовательности к последовательности запроса.
“Оптимальное выравнивание” или “оптимально выровненные” относится к выравниванию двух (или более) последовательностей, дающее самый высокий балл процентной идентичности. Например, оптимального выравнивания двух белковых последовательностей можно достичь с помощью выравнивания вручную последовательностей так, чтобы были выровнены друг с другом максимальное количество идентичных аминокислотных остатков в каждой последовательности, или с помощью компьютерных программ, или процедур, описываемых в настоящем изобретении или известных из уровня техники. Оптимального выравнивания двух последовательностей нуклеиновых кислот можно достичь с помощью выравнивания вручную последовательностей так, чтобы были выровнены друг с другом максимальное количество идентичных нуклеотидных остатков в каждой последовательности, или с помощью компьютерных программ, или процедур, описываемых в настоящем изобретении или известных из уровня техники.
В некоторых вариантах осуществления две полипептидные последовательности считают "оптимально выровненными", если они выровнены с применением заданных параметров, таких как заданная матрица аминокислотных замен, штраф за наличие гэпа (также называемый штраф за открытие гэпа) и штраф за продление гэпа, так, чтобы достигать наиболее высокого балла подобия, который возможен для данной пары последовательностей. Матрицу замен BLOSUM62 (см., Henikoff и Henikoff, выше) часто применяют в качестве матрицы оценки для замен по умолчанию в алгоритмах выравнивания полипептидных последовательностей (например, BLASTP). Штраф за наличие гэпа накладывают за введение гэпа из одной аминокислоты в одной из выравниваемых последовательностей, а штраф за продление гэпа накладывают за каждое положение остатка в гэпе. Задействуемые иллюстративные параметры выравнивания представляют собой: матрица замен BLOSUM62, штраф за наличие гэпа=11 и штраф за продление гэпа=1. Балл выравнивания определяют по аминокислотным положениям каждой последовательности, в которых начинается и заканчивается выравнивание (например, окно выравнивания) и необязательно по вставке гэпа или множественных гэпов в одну или обе последовательности так, чтобы достигался самый высокий возможный балл подобия.
Оптимальное выравнивание между двумя или более последовательностями можно определить вручную с помощью визуального просмотра или с помощью компьютера, такого как, но без ограничений, например, программы BLASTP для аминокислотных последовательностей и программы BLASTN для последовательностей нуклеиновых кислот (см., например, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997); см. также, сайт Национального центра биотехнологической информации (NCBI)).
Можно сказать, что представляющий интерес полипептид является “по сути идентичным” с эталонным полипептидом, если представляющий интерес полипептид включает аминокислотную последовательность по меньшей мере с приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно с 75%, по меньшей мере приблизительно с 80%, по меньшей мере приблизительно с 85%, по меньшей мере приблизительно с 90%, по меньшей мере приблизительно с 91%, по меньшей мере приблизительно с 92%, по меньшей мере приблизительно с 93%, по меньшей мере приблизительно с 94%, по меньшей мере приблизительно с 95%, по меньшей мере приблизительно с 96%, по меньшей мере приблизительно с 97%, по меньшей мере приблизительно с 98%, по меньшей мере приблизительно с 99% или по меньшей мере приблизительно с 99,5% идентичностью последовательности к аминокислотной последовательности эталонного полипептида. Процентную идентичность между двумя такими полипептидами можно определить вручную путем просмотра двух оптимально выровненных полипептидных последовательностей или с помощью компьютерных программ или алгоритмов (например, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) с применением стандартных параметров. Одним показателем того, что два полипептида являются по существу идентичными, является то, что первый полипептид является иммунологически перекрестно-реактивным со вторым полипептидом. Как правило, полипептиды, которые отличаются по консервативным аминокислотным заменам, являются иммунологически перекрестно-реактивными. Таким образом, полипептид по существу идентичен второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только по консервативной аминокислотной замене или одной или более консервативным аминокислотным заменам.
Можно сказать, что представляющая интерес нуклеиновая кислота является “по сути идентичной” с эталонной нуклеиновой кислотой, если представляющая интерес нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность по меньшей мере приблизительно с 70%, по меньшей мере с приблизительно 75%, по меньшей мере с приблизительно 80%, по меньшей мере с приблизительно 85%, по меньшей мере с приблизительно 90%, по меньшей мере с приблизительно 91%, по меньшей мере с приблизительно 92%, по меньшей мере с приблизительно 93%, по меньшей мере с приблизительно 94%, по меньшей мере с приблизительно 95%, по меньшей мере с приблизительно 96%, по меньшей мере с приблизительно 97%, по меньшей мере с приблизительно 98%, по меньшей мере с приблизительно 99% или по меньшей мере с приблизительно 99,5% идентичностью последовательности к нуклеотидной последовательности эталонной нуклеиновой кислоты. Процентную идентичность между двумя такими нуклеиновыми кислотами можно определить вручную путем просмотра двух оптимально выровненных последовательностей нуклеиновых кислот или с помощью компьютерных программ или алгоритмов (например, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) с применением стандартных параметров. Одним показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот являются по существу идентичными, является то, что две молекулы нуклеиновых кислот гибридизируются друг с другом в жестких условиях (например, в диапазоне от средней до высокой жесткости).
Нуклеиновая кислота или полинуклеотид является “выделенным”, если он частично или полностью отделен от других компонентов, включая, но без ограничений, например, другие белки, нуклеиновые кислоты, клетки и т.д. Аналогично, полипептид, белок или пептид является “выделенным”, если он частично или полностью отделен от других компонентов, включая, но без ограничений, например, другие белки, нуклеиновые кислоты, клетки и т.д. В молярном масштабе, выделенное частица является намного многочисленней других частиц в композиции. Например, выделенная частица может включать по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% (в молярном масштабе) всех присутствующих макромолекулярных частиц. Предпочтительно, представляющую интерес частицу очищают до необходимой гомогенности (т.е., посторонние частицы нельзя детектировать в композиции традиционными способами детектирования). Чистоту и гомогенность можно определить с помощью ряда методик, хорошо известных в области техники, таких как электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле образца белка или нуклеиновой кислоты, с последующей визуализацией после окрашивания. При необходимости, для очистки материала можно использовать методику с высокой разрешающей способностью, такую как высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) или подобные средства.
Термин “очищенный” при применении к нуклеиновым кислотам или полипептидам обычно означает нуклеиновую кислоту или полипептид, который в общем не содержит других компонентов при определении аналитическими методиками, хорошо известными в области техники (например, очищенный полипептид или полинуклеотид образует отдельный бэнд в электрофоретическом геле, хроматографическом элюате и/или средах, подвергаемых центрифугированию в градиенте плотности). Например, нуклеиновая кислота или полипептид, который дает фактически один бэнд в электрофоретическом геле, является “очищенным”. Очищенная нуклеиновая кислота или полипептид имеет по меньшей мере приблизительно 50% чистоты, обычно по меньшей мере приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,5%, приблизительно 99,6%, приблизительно 99,7%, приблизительно 99,8% или более чистоты (например, весовой процент в молярном масштабе). В некоторой степени родственном смысле, настоящее изобретение предоставляет способы обогащения композиций одной или более молекулами настоящего изобретения, такими как один или более полипептидов или полинуклеотидов настоящего изобретения. Композиция является обогащенной в отношении молекулы, если имеет место значительное увеличение концентрации молекулы после применения методики очистки или обогащения. По сути чистый полипептид или полинуклеотид настоящего изобретения (например, по существу чистая вариантная протеаза или полинуклеотид, кодирующий вариантную протеазу настоящего изобретения, соответственно), как правило, будут включать по меньшей мере приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98, приблизительно 99%, приблизительно 99,5% или более по массе (в молярном масштабе) всех макромолекулярных частиц в конкретной композиции.
В некоторой степени родственном смысле настоящее изобретение предлагает способы обогащения композиций в отношении одной или более молекул настоящего изобретения, как, например, один или более полипептидов настоящего изобретения (например, одна или более вариантных протеаз настоящего изобретения) или одна или более нуклеиновых кислот настоящего изобретения (например, одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более вариантных протеаз настоящего изобретения). Композиция является обогащенной в отношении молекулы, если имеет место значительное увеличение концентрации молекулы после применения методики очистки или обогащения. По сути чистый полипептид или полинуклеотид, как правило, будет включать по меньшей мере приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,5% или более по массе (в молярном масштабе) всех макромолекулярных частиц в конкретной композиции.
Применяемый в настоящем изобретении термин “комбинаторный мутагенез” или “комбинаторный” относится к способам, в которых создают библиотеки вариантов нуклеиновых кислот эталонной последовательности нуклеиновой кислоты. В данных библиотеках варианты содержат одну или более мутаций, выбранных из заранее заданного набора мутаций. Способы также обеспечивают средства введения случайных мутаций, которые не являлись членами заранее заданного набора мутаций. Некоторые такие способы включают способы, изложенные в патенте США № 6582914, который настоящим включен при помощи ссылки. Некоторые такие способы комбинаторного мутагенеза включают и/или охватывают способы, практически осуществленные в коммерчески доступных наборах (например, набор для осуществления направленного на множество сайтов мутагенеза QUIKCHANGE® (Stratagene), ПЦР-слияние/ПЦР с удлинением).
Применяемое в настоящем изобретении “обладающая улучшенными свойствами”, которое применяют по отношению к вариантной протеазе, относится к вариантной протеазе с улучшенным или усиленным моющим или очищающим действием, и/или улучшенной или усиленной стойкостью необязательно с сохраненным моющим или очищающим действием относительно соответствующей эталонной протеазы (например, дикого типа или встречающейся в природе протеазы). Улучшенные свойства вариантной протеазы могут включать улучшенное моющее или очищающее действие и/или улучшенную стойкость. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает вариантные протеазы настоящего изобретения, которые проявляют одно из нескольких из следующих свойств: улучшенное действие в отношении мытья рук, улучшенное действие в отношении мытья посуды вручную или руками, улучшенное действие в отношении автоматического мытья посуды, улучшенное действие в отношении стирки и/или улучшенная стойкость по сравнению с эталонной протеазой (например, протеаза дикого типа, такая как субтилизин дикого типа).
Применяемый в настоящем изобретении термин “функциональный анализ” относится к анализу, который приводит показатель активности белка. В некоторых вариантах осуществления данный термин относится к аналитическим системам, в которых белок анализируется на его способность функционировать в его обычной функциональной активности. Например, в случае ферментов, функциональный анализ включает определение эффективности фермента при катализе реакции.
Применяемый в настоящем изобретении термин “целевое свойство” относится к свойству изначального гена, которое подлежит перемене. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным целевым свойством. Однако, в некоторых вариантах осуществления целевым свойством является стойкость генного продукта (например, устойчивость к денатурации, протеолизу или другим разрушающим факторам), в то время как в других вариантах осуществления меняют уровень продуцирования у продуцирующего хозяина.
Применяемый в настоящем изобретении термин “свойство” или его грамматические эквиваленты в контексте нуклеиновой кислоты относится к любой характеристике или отличительной черте нуклеиновой кислоты, которую можно подвергнуть отбору или детектировать. Данные свойства включают, но без ограничений, свойство, влияющее на связывание полипептида, свойство, придаваемое клетке, включающей конкретную нуклеиновую кислоту, свойство, влияющее на транскрипцию гена (например, сила промотора, узнавание промотора, промоторная регуляция, энхансерная функция), свойство, влияющее на процессинг РНК (например, сплайсинг РНК, стойкость РНК, конформация РНК и посттранскрипционная модификация), свойство, влияющее на трансляцию (например, уровень, регуляция, связывание иРНК с рибосомальными белками, посттрансляционная модификация). Например, сайт связывания транскрипционного фактора, полимеразы, регуляторного фактора и т.д. у нуклеиновой кислоты можно подвергнуть переменам для получения необходимых характеристик или для идентификации нежелательных характеристик.
Применяемый в настоящем изобретении термин “свойство” или его грамматические эквиваленты в контексте полипептида (включая белки) относится к любой характеристике или отличительной черте полипептида, которую можно подвергнуть отбору или детектировать. Данные свойства включают, но без ограничений, стойкость к окислению, субстратную специфичность, каталитическую активность, ферментативную активность, термическую стойкость, стойкость к щелочной среде, профиль pH-активности, устойчивость к протеолитическому разрушению, KM, kкат, соотношение kкат/kM, фолдинг белка, индукцию иммунного ответа, способность связываться с лигандом, способность связываться с рецептором, способность секретироваться, способность выводиться на поверхности клетки, способность олигомеризироваться, способность к передаче сигнала, способность к стимуляции клеточной пролиферации, способность к ингибированию клеточной пролиферации, способность к индукции апоптоза, способность подвергаться модификации путем фосфорилирования или гликозилирования и/или способность лечить заболевание и т.д.
Применяемый в настоящем изобретении термин “скрининг” имеет свое обычное в области техники значение. В одном иллюстративном способе скрининга обеспечивают мутантную нуклеиновую кислоту или кодируемый ею вариантный полипептид и оценивают или определяют свойство мутантной нуклеиновой кислоты или вариантного полипептида, соответственно. Определенное свойство мутантной нуклеиновой кислоты или вариантного полипептида можно сравнить со свойством соответствующей нуклеиновой кислоты-предшественника (исходной) или со свойством соответствующего исходного полипептида, соответственно.
Специалисту в данной области будет понятно, что процедура скрининга для получения нуклеиновой кислоты или белка с подвергнутым переменам свойством зависит от свойства изначального материала, модификацией которого намереваются способствовать получению мутантной нуклеиновой кислоты. Таким образом, специалист в данной области признает, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным свойством, подлежащим скринингу, и что в последующем описании свойств приведены лишь иллюстративные примеры. Способы скрининга в отношении любого конкретного свойства в целом описаны в уровне техники. Например, можно измерять связывание, pH, специфичность и т.д., до и после мутации, где изменение указывает на перемену. Предпочтительно, скрининги проводят способом с высокой пропускной способностью, включая проведение одновременного скрининга множества образцов, включая, но без ограничений, анализы с использованием чипов, фагового дисплея и множественных субстратов и/или индикаторов.
Как применяется в настоящем изобретении, в некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает один или более этапов отбора, при которых представляющие интерес варианты обогащают из популяции вариантов. Примеры данных вариантов осуществления включают отбор вариантов, которые придают преимущество в отношении роста организму-хозяину, а также фаговый дисплей или любой другой способ индикации, где варианты можно собирать из популяции вариантов на основании их связывающих или каталитических свойств. В некоторых вариантах осуществления библиотеку вариантов подвергают воздействию стресса (например, тепло, денатурация и т.д.), и затем варианты, которые все еще остаются интактными, идентифицируют в скрининге или обогащают с помощью отбора. Подразумевается, что данный термин охватывает любые подходящие средства отбора. Действительно, не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено каким-либо конкретным способом скрининга.
Термины “модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты” и “модифицированный ген” применяют в настоящем изобретении взаимозаменяемо в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, которая включает делецию, вставку или обрыв встречающейся в природе (т.е., дикого типа) последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты является укороченным белком (например, если модификацией является делеция или обрыв последовательности). В некоторых вариантах осуществления укороченный белок сохраняет биологическую активность. В альтернативных вариантах осуществления продукт экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты является удлиненным белком (например, модификации, включающие вставку в последовательность нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная вставка в последовательность нуклеиновой кислоты дает в результате укороченный белок (например, если вставка приводит к образованию стоп-кодона). Таким образом, вставка может привести либо к укороченному белку, либо к удлиненному белку в качестве продукта экспрессии.
“Мутантная” последовательность нуклеиновой кислоты, как правило, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая имеет изменение по меньшей мере в одном кодоне, встречающемся в последовательности дикого типа клетки-хозяина, так, что продукт экспрессии мутантной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой белок с измененной аминокислотной последовательностью относительно белка дикого типа. Продукт экспрессии может обладать измененной функциональной способностью (например, усиленная ферментативная активность).
Применяемая в настоящем изобретении фраза “изменение в субстратной специфичности” относится к изменениям в субстратной специфичности фермента. В некоторых вариантах осуществления изменение в субстратной специфичности определяют как изменение в kкат и/или Km для конкретного субстрата, возникающая в результате мутаций фермента или изменения условий реакции. Субстратную специфичность фермента определяют путем сравнения каталитических эффективностей, которые он проявляет с различными субстратами. Данные определения находят практическое применение при оценке эффективности мутантных ферментов, поскольку в целом желательно получать вариантные ферменты, которые проявляют большие соотношения kкат/Km в отношении представляющих интерес субстратов. Однако, не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо конкретной субстратной композицией или субстратной специфичностью.
Применяемое в настоящем изобретении “поверхностное свойство” применяют в отношении электростатического заряда, а также таких свойств, как гидрофобность и гидрофильность, проявляемые поверхностью белка.
Применяемый в настоящем изобретении термин “суммарный заряд” определяют как сумму всех зарядов, присутствующих в молекуле. “Изменения суммарного заряда” осуществляют в отношении исходной белковой молекулы для получения варианта, который имеет суммарный заряд, отличающийся от исходной молекулы (т.е., вариант имеет суммарный заряд, который не является таким же, как заряд исходной молекулы). Например, замена нейтральной аминокислоты отрицательно заряженной аминокислотой или положительно заряженной аминокислоты нейтральной аминокислотой дает в результате суммарный заряд -1 относительно исходной молекулы. Замена положительно заряженной аминокислоты отрицательно заряженной аминокислотой дает в результате суммарный заряд -2 относительно исходного. Замена нейтральной аминокислоты положительно заряженной аминокислотой или отрицательно заряженной аминокислоты нейтральной аминокислотой дает в результате суммарный заряд +1 относительно исходного. Замена отрицательно заряженной аминокислоты положительно заряженной аминокислотой дает в результате суммарный заряд +2 относительно исходного. Суммарный заряд исходного белка также можно изменять путем делеции и/или вставки заряженных аминокислот.
Термины "термически стойкий", и “термостойкий”, и “термостойкость” относятся к протеазам, которые сохраняют указанное значение ферментативной активности после воздействия установленными температурами в течение заданного периода времени в условиях, преобладающих в ходе протеолитического, гидролитического, очищающего или другого процесса настоящего изобретения, при воздействии измененными температурами. “Измененные температуры” охватывают повышенные или пониженные температуры. В некоторых вариантах осуществления протеазы сохраняют по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% протеолитической активности после воздействия измененными температурами в течение заданного периода времени, например, по меньшей мере приблизительно 60 минут, приблизительно 120 минут, приблизительно 180 минут, приблизительно 240 минут, приблизительно 300 минут и т.д.
Термин “повышенная стойкость” в контексте стойкой к окислению, комплексону, термически стойкой и/или стойкой к pH протеазы относится к более высокой сохраняемой протеолитической активности с течением времени по сравнению с другими протеазами (например, субтилизиновыми протеазами) и/или ферментами дикого типа.
Термин “сниженная стойкость” в контексте стойкой к окислению, комплексону, термически стойкой и/или стойкой к pH протеазы относится к более низкой сохраняемой протеолитической активности с течением времени по сравнению с другими протеазы (например, субтилизиновые протеазы) и/или ферментами дикого типа.
Термин “очищающая активность” относится к очищающему действию, достигаемому с помощью вариантной протеазы или эталонной протеазы в условиях, преобладающих в ходе протеолитического, гидролитического, очищающего или другого процесса настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления очищающее действие вариантной протеазы или эталонной протеазы можно определить с помощью различных анализов в отношении очистки одного или более различных, чувствительных к ферментам загрязнений на предмете или поверхности (например, загрязнение, полученное от еды, травы, крови, чернила, молока, растительного масла и/или яичного белка). Очищающее действие вариантной или эталонной протеазы можно определить путем воздействия на загрязнение на предмете или поверхности стандартным моющим условием(ями) и оценки степени, до которой удаляется загрязнение, с помощью различных хроматографических, спектрофотометрических или других количественных методик. Иллюстративные анализы и способы по исследованию очищающего действия известны в области техники и включают, но без ограничений, описанные в WO 99/34011 и патенте США 6605458, обе из которых включены в настоящем изобретении ссылкой, а также анализы и способы по исследованию очищающего действия, включенные в примеры, приведенные ниже.
Термин “эффективное очищающее количество” вариантной протеазы или эталонной протеазы относится к количеству протеазы, при котором достигается требуемый уровень ферментативной активности в конкретной очищающей композиции. Такие эффективные количества легко установит рядовой специалист в данной области, и они основываются на многих факторах, таких как конкретная применяемая протеаза, практическое очищающее применение, конкретная композиция очищающей композиции и того, нужна ли жидкая или сухая (например, гранулированная, таблетка, брусок) композиция и т.д.
Термин “очищающий вспомогательный материал” относится к любому жидкому, твердому или газообразному материалу, включенному в очищающую композицию, отличному от вариантной протеазы настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения включают один или более очищающих вспомогательных материалов. Каждый очищающий вспомогательный материал, как правило, выбирают в зависимости от конкретного типа и формы очищающей композиции (например, жидкость, гранула, порошок, брусок, паста, спрэй, таблетка, гель, пена или другая композиция). Предпочтительно, каждый очищающий вспомогательный материал является совместимым с протеазным ферментом, применяемым в композиции.
Термин “усиленное действие” в контексте очищающей активности относится к увеличенной или большей очищающей активности с помощью фермента на определенных чувствительных к ферменту загрязнениях, таких как яйцо, молоко, трава, чернила, растительное масло и/или кровь, которая определяется путем обычного оценивания после стандартного цикла мытья и/или множественных циклов мытья.
Термин “сниженное действие” в контексте очищающей активности относится к пониженной или меньшей очищающей активности с помощью фермента на определенных чувствительных к ферменту загрязнениях, таких как яйцо, молоко, трава или кровь, которая определяется путем обычного оценивания после стандартного цикла мытья.
Термин “сравнительное действие” в контексте очищающей активности вариантной протеазы настоящего изобретения относится по меньшей мере к приблизительно 60%, по меньшей мере к приблизительно 70%, по меньшей мере к приблизительно 75%, по меньшей мере к приблизительно 80%, по меньшей мере к приблизительно 85%, по меньшей мере к приблизительно 90%, по меньшей мере к приблизительно 91%, по меньшей мере к приблизительно 92%, по меньшей мере к приблизительно 93%, по меньшей мере к приблизительно 94%, по меньшей мере к приблизительно 95%, по меньшей мере к приблизительно 96%, по меньшей мере к приблизительно 97%, по меньшей мере к приблизительно 98%, по меньшей мере к приблизительно 99%, по меньшей мере к приблизительно 99,5% очищающей активности сравнительной или эталонной протеазы (например, коммерчески доступных протеаз), включая, но без ограничений, например, протеазу OPTIMASE™ (Genencor), протеазные продукты PURAFECT™ (Genencor), протеазу SAVINASE™ (Novozymes), BPN'-варианты (см., например, патент США № Re 34606), протеазу RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ (Novozymes), протеазы MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™ (Genencor; см. также патент США № Re 34606 и патенты США №№ 5700676; 5955340; 6312936; и 6482628), и вариантные продукты протеазы B. lentus (например, описанные в WO 92/21760, WO 95/23221 и/или WO 97/07770). Очищающее действие можно определить путем сравнения вариантных протеаз настоящего изобретения с эталонными субтилизиновыми протеазами в различных анализах по исследованию очищающего действия в отношении чувствительных к ферменту загрязнений, таких как трава, кровь, чернило, растительное масло и/или молоко, которое определяют с помощью обычных спектрофотометрических или аналитических методик после условий стандартного цикла мытья.
Применяемый в настоящем изобретении термин “потребительский продукт” означает продукт по уходу за тканью и по уходу за домом. Применяемый в настоящем изобретении термин “продукт по уходу за тканью и по уходу за домом” или “продукт по уходу за тканью и по уходу за домашним хозяйством” включает продукты, которые обычно задуманы для применения или потребления в форме, в которой они продаются, и которые предназначены для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей, и очищающие системы только для ухода и очистки неживых поверхностей, а также продукты-кондиционеры для тканей и другие продукты, специально разработанные для ухода и сбережения тканей, и ароматизаторы, включая: ароматизаторы, включающие освежители воздуха и системы доставки запаха, средство по уходу за салоном автомобиля, средство по уходу за домашними животными, средство по уходу за домашним скотом, средство личной гигиены, средство по уходу за драгоценностями, средство для мытья посуды, средство для кондиционирования ткани (включая смягчение и/или авиваж), моющее средство для стирки, добавку и/или средство по уходу для стирки и ополаскивания, очищающие композиции для предварительной обработки, средство для очистки и/или обработки твердых поверхностей, включая средства для очистки пола и унитаза, средства для очистки и/или обработки стекла, средства для очистки и/или обработки плитки, средства для очистки и/или обработки керамики и другие очищающие средства для потребительского применения или применения в учреждениях. В некоторых вариантах осуществления продукты по уходу за тканью и по уходу за домом являются подходящими для применения на ранах и/или коже. “Продукт по уходу за тканью и по уходу за домом” включает потребительские продукты и продукты для учреждений.
Применяемый в настоящем изобретении термин “не имеющий отношение к продуктам по уходу за тканью и по уходу за домом” относится к композициям, которые добавляют к другим композициям для получения конечного продукта, которым может быть продукт по уходу за тканью и по уходу за домом.
Применяемый в настоящем изобретении термин “очищающая композиция для учреждений” относится к продуктам, подходящим для применения в учреждениях, включая, но без ограничений, школы, больницы, фабрики, магазины, корпорации, здания, рестораны, офисные комплексы и здания, перерабатывающие и/или производственные предприятия, ветеринарные клиники, аграрно-промышленные фермы, крупные аграрно-промышленные фермы и т.д.
Применяемый в настоящем изобретении термин “очищающая композиция и/или композиция для обработки” является подклассом продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, который включает, если не указано иное, композиции, подходящие для очистки и/или обработки предметов. Такие продукты включают, но без ограничений, продукты для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей в области ухода за домом и ухода за тканью, включая: ароматизаторы, включая освежители воздуха и системы доставки запаха, средство по уходу за салоном автомобиля, средство для мытья посуды, средство для кондиционирования ткани (включая смягчение и/или авиваж), моющее средство для стирки, добавку и/или средство по уходу для стирки и ополаскивания, средство для очистки и/или обработки твердых поверхностей, включая средства для очистки пола и унитаза, гранулированные или порошковые универсальные или "с высокой моющей способностью" средства для мытья, особенно очищающие моющие средства; жидкие, гелевые или в форме пасты универсальные средства для мытья, особенно так называемые жидкие формы с высокой моющей способностью; жидкие моющие средства для тонкой легкой ткани; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды с низкой моющей способностью, особенно таковые сильнопенящегося типа; средства для машинного мытья посуды, включая различные типы таблеток, гранулированные, жидкие и вспомогательные ополаскивающие для домашнего применения и применения в учреждениях: шампуни для автомобилей или ковров, средства для очистки ванн, включая средства для чистки унитазов; а также в качестве очищающих вспомогательных средств, таких как отбеливающие добавки и "карандаш-пятновыводитель" или средства типа предварительной обработки, продукты, загруженные в субстрат, такие как салфетки с добавленной пропиткой мягчителем-антистатиком.
Действительно, применяемое в настоящем изобретении выражение “очищающая композиция” или “очищающий состав” настоящего изобретения относится к любой композиции настоящего изобретения, пригодной для удаления или устранения соединения (например, нежелательного соединения) с объекта, предмета или поверхности, подлежащей очистке, включая, но без ограничений, например, ткань, предмет из ткани, предмет столовой посуды, предмет столовой утвари, предмет стеклянной посуды, контактные линзы, другой твердый субстрат, волосы (шампунь) (включая волосы человека или волосяной покров животных), кожу (мыло или и крем), зубы (ополаскиватели для рта, зубные пасты), поверхность предмета или объекта (например, твердые поверхности, такие как твердая поверхность стола, столешницы, стены, предмета мебели, пола, потолка, предмета, не имеющего отношение к столовой посуде, предмета, не имеющего отношение к столовой утвари, и т.д.), фильтры, мембраны (например, фильтрующие мембраны, включая, но без ограничений, ультрафильтрующие мембраны) и т.д. Данный термин охватывает любой материал и/или добавляемое соединение, выбранное по конкретном типу требуемой очищающей композиции и форме продукта (например, жидкая, гелевая, гранулированная, в виде спрэя или другая композиция), при условии, что композиция совместима с протеазой и другим ферментом(ами), применяемыми в данной композиции. Конкретный выбор материалов очищающей композиции легко осуществить, принимая во внимание поверхность, объект, предмет или ткань, подлежащие очистке, и требуемую форму композиции для условий очистки в ходе применения.
Очищающие композиции и очищающие составы включают любую композицию, которая подходит для очистки, отбеливания, дезинфекции и/или стерилизации любого объекта, предмета и/или поверхности. Такие композиции и составы включают, но без ограничений, например, жидкие и/или твердые композиции, включая очищающие или моющие композиции (например, очищающие или моющие композиции для белья и моющие композиции для тонкой легкой ткани в виде жидкости, таблетки, геля, бруска, гранулы и/или в твердом виде; очищающие композиции и составы для твердых поверхностей, как, например, для стеклянных, деревянных, керамических и металлических столешниц и окон; средства для чистки ковров; средства для чистки печей; освежители тканей; мягчители тканей; и очищающие или моющие композиции-усилители для белья и текстильного изделия, вспомогательные очищающие композиции для белья и пятновыводящие очищающие композиции для белья; композиции для мытья посуды, включая композиции для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную (например, моющие средства для “ручного” мытья посуды или мытья посуды “вручную”) и композиции для автоматического мытья посуды (например, “моющие средства для автоматического мытья посуды”).
Очищающая композиция или очищающие составы, применяемые в настоящем изобретении, включают, если не указано иное, гранулированные или порошковые универсальные или с высокой моющей способностью средства для мытья, особенно очищающие моющие средства; универсальные средства для мытья в форме жидкости, гранулы, геля, твердой форме, таблетки или пасты, особенно так называемые типы жидких моющих средств с высокой моющей способностью (HDL) или порошковых моющих средств с высокой моющей способностью (HDD); жидкие моющие средства для тонкой легкой ткани; средства для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную, включая средства сильнопенящегося типа; моющие средства для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную, автоматического мытья посуды или для столовой посуды или столовой утвари, включая различные типы таблеток, порошков, твердые, гранулированные, жидкие, гелевые и вспомогательные для ополаскивания для домашнего применения и применения в учреждениях; жидкие очищающие и дезинфицирующие средства, включая антибактериальные типы для мытья рук, очищающие бруски, ополаскиватели для рта, средства для чистки протезов, шампуни для автомобилей, шампуни для ковров, средства для чистки ванн; шампуни для волос и/или ополаскиватели для волос для людей и других животных; гели для душа, и пены для ванн, и средства для чистки металлов; а также вспомогательные очищающие средства, такие как отбеливающие добавки и “карандаш-пятновыводитель” или средства типа предварительной обработки. В некоторых вариантах осуществления гранулированные композиции находятся в “плотной” форме; в некоторых вариантах осуществления жидкие композиции находятся в “концентрированной” форме.
Применяемые в настоящем изобретении "очищающие композиции для тканей" включают моющие композиции для ручной и автоматической стирки, включая вспомогательные композиции для стирки и композиции, подходящие для применения при замачивании и/или при предварительной обработке загрязненных тканей (например, одежды, белья и других текстильных материалов).
Применяемые в настоящем изобретении “не относящиеся к очищающим композициям для тканей” включают очищающие композиции для нетекстильных (т.е. нетканевых) поверхностей, включая, но без ограничений, например, моющие композиции для ручного мытья, или для мытья вручную, или автоматического мытья посуды, очищающие композиции для рта, очищающие композиции для зубных протезов и композиции личной гигиены.
Применяемый в настоящем изобретении термин “композиция для очистки и/или обработки тканевой и/или твердой поверхности” является подклассом композиций для очистки и обработки, который включает, если не указано иное, гранулированные или порошковые универсальные или "с высокой моющей способностью" средства для мытья, особенно очищающие моющие средства; жидкие, гелевые или в форме пасты универсальные средства для мытья, особенно так называемые жидкие типы с высокой моющей способностью; жидкие моющие средства для тонкой легкой ткани; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды с низкой моющей способностью, особенно средства сильнопенящегося типа; средства для мытья посуды в посудомоечной машине, включая различные типы таблеток, гранул, жидкостей и вспомогательные для ополаскивания для домашнего применения и применения в учреждениях; жидкие очищающие и дезинфицирующие средства, шампуни для автомобилей или ковров, средства для чистки ванн, включая средства для чистки унитазов; продукты для кондиционирования тканей, включая смягчение и/или авиваж, которые могут быть в жидкой, твердой форме и/или форме салфетки с пропиткой мягчителем-антистатиком; а также очищающие вспомогательные средства, такие как отбеливающие добавки и "карандаш-пятновыводитель" или средства типа предварительной обработки, продукты, загруженные в субстрат, такие как салфетки с добавленной пропиткой мягчителем-антистатиком. Все такие продукты, которые являются применимыми, могут находиться в стандартной, концентрированной или даже высоко концентрированной форме, даже настолько, чтобы такие продукты могли, в некотором аспекте, быть безводными.
Применяемый в настоящем изобретении термин “моющая композиция” или “моющий состав” применяют в отношении композиции, предназначенной для применения в моющей среде для очистки загрязненных или грязных объектов, включая конкретные тканевые и/или нетканевые объекты или предметы. Такие композиции настоящего изобретения не ограничены конкретной моющей композицией или составом. Действительно, в некоторых вариантах осуществления моющие средства настоящего изобретения включают по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения и, кроме того, одно или более поверхностно-активных средств, трансферазу(ы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, модифицирующие добавки (например, соль-модифицирующая добавка), отбеливающие средства, активаторы отбеливателя, разновидности синьки, флуоресцентные красители, средства, препятствующие слеживанию, дезодораторы, активаторы ферментов, антиоксиданты и/или солюбилизаторы. В некоторых случаях соль-модифицирующая добавка является смесью силикатной соли и фосфатной соли, предпочтительно с большим количеством силиката (например, метасиликат натрия), чем фосфата (например, триполифосфат натрия). Некоторые композиции настоящего изобретения, такие как, но без ограничения, очищающие композиции или моющие композиции, не содержат какого-либо фосфата (например, фосфатной соли или фосфатной модифицирующей добавки).
Применяемый в настоящем изобретении термин “отбеливание” относится к обработке материала (например, ткани, белья, технической целлюлозы и т.д.) или поверхности в течение достаточно длительного времени и/или при соответствующем pH и/или температурных условиях до достижения эффекта осветления (т.е., беления) и/или очистки материала. Примеры химических веществ, подходящих для отбеливания, включают, но без ограничений, например, ClO2, H2O2, перкислоты, NO2 и т.д.
Применяемое в настоящем изобретении “моющее действие” протеазы (например, вариантной протеазы настоящего изобретения) относится к вкладу вариантной протеазы в мытье, который обеспечивает дополнительное очищающее действие моющему средству по сравнению с моющим средством без добавления вариантной протеазы к композиции. Моющее действие сравнивают при соответствующих условиях мытья. В некоторых тестовых системах другие соответствующие факторы, такие как моющая композиция, концентрация пены, жесткость воды, механика мытья, время, pH и/или температура, можно контролировать таким образом, чтобы подражать условию(ям), типичному для домашнего применения в определенном рыночном сегменте (например, ручное мытье посуды, автоматическое мытье посуды, очистка столовой посуды, очистка столовой утвари, очистка ткани и т.д.).
Термин "соответствующие условия мытья" применяют в настоящем изобретении для обозначения условий, в частности, температуры мытья, времени, механики мытья, концентрации пены, типа моющего средства и жесткости воды, в действительности применяемых в быту, в сегменте рынка, ориентированного на ручное мытье посуды, автоматическое мытье посуды или моющие средства для стирки.
Термин "улучшенное моющее действие" применяют для указание на то, что достигается лучший конечный результат при удалении загрязнений в соответствующих условиях мытья, или что необходимо меньше вариантной протеазы, по массе, для получения такого же конечного результата по отношению к соответствующей дикого типа или изначальной исходной протеазе.
Применяемый в настоящем изобретении термин “дезинфицирование” относится к удаление загрязняющих веществ с поверхностей, а также ингибированию или уничтожению микробов на поверхностях предметов. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо конкретной поверхностью, предметом или подлежащим удалению загрязняющим веществом(ами) или микробами.
"Плотная" форма очищающих композиций в настоящем изобретении лучше всего отражается по плотности и, в пересчете на композицию, по количеству неорганической соли-наполнителя. Неорганические соли-наполнители являются традиционными ингредиентами моющих композиций в порошковой форме. В традиционных моющих композициях соли-наполнители присутствуют в значительных количествах, как правило, от приблизительно 17 до приблизительно 35% по массе общей композиции. Наоборот, в плотных композициях соль-наполнитель присутствует в количествах, не превышающих приблизительно 15% от общей композиции. В некоторых вариантах осуществления соль-наполнитель присутствует в количествах, не превышающих приблизительно 10% или более предпочтительно приблизительно 5% по массе композиции. В некоторых вариантах осуществления неорганические соли-наполнители выбирают из сульфатных и хлоридных солей щелочных и щелочноземельных металлов. В некоторых вариантах осуществления солью-наполнителем является сульфат натрия.
Положение аминокислотного остатка в данной аминокислотной последовательности как правило пронумеровано в настоящем изобретении с помощью нумерации положения соответствующего аминокислотного остатка аминокислотной последовательности субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens из SEQ ID NO:1, таким образом, служит в качестве эталонной последовательности. Данную аминокислотную последовательность, такую как аминокислотная последовательность вариантной протеазы, описываемая в настоящем изобретении, можно выровнять с последовательностью BPN' (SEQ ID NO:1) с помощью алгоритма выравнивания, который описан в настоящем изобретении, и аминокислотный остаток в данной аминокислотной последовательности, который выравнивается (предпочтительно оптимально выравнивается) с аминокислотным остатком в последовательности BPN', можно условно пронумеровать исходя из соответствующего аминокислотного остатка в последовательности субтилизина BPN'. Альтернативно, если положения аминокислотных остатков последовательностей субтилизиновой вариантной протеазы пронумерованы с помощью действительной нумерации положений аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности GG36 (SEQ ID NO:2), и не исходя из соответствующих аминокислотных положений в последовательности BPN' после выравнивания, то субтилизиновую вариантную протеазу можно описывать как вариантную протеазу от протеазы GG36, приведенной в SEQ ID NO:2.
В целом, номенклатура, применяемая в настоящем изобретении, и многие из лабораторных процедур клеточного культивирования, молекулярной генетики, молекулярной биологии, химии нуклеиновых кислот и химии белка, описываемые ниже, хорошо известны и обычно используются рядовыми специалистами в данной области. Способы получения и обращения со способами, в которых задействуют рекомбинантные нуклеиновые кислоты, синтез нуклеиновых кислот, способы клеточного культивирования и встраивание трансгена (например, трансфекция, электропорация) известны специалистам в данной области и описаны во многочисленных типовых текстах. Этапы синтеза и очистки олигонуклеотидов, как правило, осуществляют в соответствии с инструкциями. Методики и процедуры обычно осуществляют в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в области техники и различных общих источниках, которые приведены по всему данному документу. Полагают, что процедуры, приведенные в них, хорошо известны рядовым специалистам в данной области, и они приведены для удобства читателя.
Полипептиды настоящего изобретения
Настоящее изобретение предоставляет новые полипептиды, которые могут в целом называться “полипептиды настоящего изобретения”. Полипептиды настоящего изобретения включают выделенные, рекомбинантные, по существу чистые или не встречающиеся в природе полипептиды вариантных протеаз, включая, например, полипептиды вариантного субтилизина, обладающие ферментативной активностью (например, протеолитической активностью). В некоторых вариантах осуществления полипептиды настоящего изобретения пригодны в применениях для очистки и могут быть включены в очищающие композиции, которые пригодны в способах очистки предмета или поверхности (например, поверхности предмета), нуждающихся в очистке.
В некоторых вариантах осуществления вариантная протеаза настоящего изобретения включает “вариантный субтилизин”. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет “вариантную протеазу Bacillus sp.”. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет “вариантный субтилизин Bacillus sp.”.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает выделенную, рекомбинантную, по существу чистую или не встречающуюся в природе вариантную протеазу, обладающую протеолитической активностью, полипептид которой включает полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно 99,5% или 100% идентичность последовательности с аминокислотными последовательностями, кодирующими вариантные протеазы, представленные в настоящем изобретении.
Как отмечалось выше, полипептиды вариантной протеазы настоящего изобретения обладают ферментативными активностями (например, протеолитическими активностями) и, таким образом, пригодны в применениях для очистки, включая, но без ограничений, способы очистки предметов столовой посуды, предметов столовой утвари, тканей и предметов, имеющих твердые поверхности (например, твердая поверхность стола, столешницы, стены, предмета мебели, пола, потолка и т.д.). Иллюстративные очищающие композиции, включающие один или более полипептидов вариантных протеаз настоящего изобретения, описаны ниже. Ферментативную активность (например, протеазную активность) полипептида вариантной протеазы настоящего изобретения можно легко определить с помощью процедур, хорошо известных рядовому специалисту в данной области. Примеры, представленные ниже, описывают способы оценки ферментативной активности, очищающего действия и/или моющего действия. Действие вариантных протеаз настоящего изобретения при удалении загрязнений (например, белковое загрязнение), очистке твердых поверхностей или очистке белья, предмета(ов) столовой посуды или предмета(ов) столовой утвари можно легко определить с помощью процедур, хорошо известных в данной области, и/или с помощью процедур, изложенных в примерах.
Полипептид настоящего изобретения может быть подвергнут различным изменениям, таким как одна или более аминокислотных вставок, делеций и/или замен, либо консервативных, либо неконсервативных, включая случаи, где такие изменения по существу не изменяют ферментативную активность полипептида. Аналогично, нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть подвергнута различным изменениям, таким как одна или более замен у одной или более нуклеиновых кислот в одном или более кодонах, так, чтобы конкретный кодон кодировал такую же или иную аминокислоту, приводя либо к молчащей вариации (например, мутация в нуклеотидной последовательности приводит к молчащей мутации в аминокислотной последовательности, например, когда кодируемая аминокислота не изменяется мутацией нуклеиновой кислоты), либо немолчащей вариации, одна или более делеций у одной или более нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности, одно или более присоединений или вставок у одной или более нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности, и/или расщепление или одно или более укорачиваний одной или более нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности. Многие такие изменения в последовательности нуклеиновой кислоты могут по существу не изменять ферментативную активность получаемой в результате кодируемой вариантной протеазы по сравнению с вариантной протеазой, кодируемой первоначальной последовательностью нуклеиновой кислоты. Нуклеиновую кислоту настоящего изобретения также можно модифицировать для включения одного или более кодонов, которые обеспечивают оптимальную экспрессию в системе экспрессии (например, бактериальная система экспрессии), при этом, при необходимости, указанный один или более кодонов продолжают кодировать одинаковую аминокислоту (аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет класс полипептидов, включающий полипептиды вариантных протеаз, обладающие требуемой ферментативной активностью (например, протеазной активностью или активностью очищающего действия), которые включают последовательности с аминокислотными заменами, описанными в настоящем изобретении, а также которые включают одну или более дополнительных аминокислотных замен, таких как консервативные или неконсервативные замены, где полипептид проявляет, поддерживает или примерно поддерживает требуемую ферментативную активность (например, протеазную активность или субтилизиновую активность, отражаемую в очищающей активности или очищающем действии вариантной протеазы). Аминокислотные замены в соответствии с настоящим изобретением могут включать, но без ограничений, одну или более неконсервативных замен и/или одну или более консервативных аминокислотных замен. Консервативная замена аминокислотных остатков, как правило, включает обмен члена в одном функциональном классе аминокислотных остатков на остаток, который принадлежит к тому же функциональному классу (идентичные аминокислотные остатки считаются функционально гомологичными или консервативными при вычислении процентной функциональной гомологи). Консервативная аминокислотная замена, как правило, включает замену аминокислоты в аминокислотной последовательности функционально сходной аминокислотой. Например, функционально сходны аланин, глицин, серин и треонин, и поэтому могут служить в качестве консервативных аминокислотных замен друг для друга. Аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота способны служить в качестве консервативных замен друг для друга. Аспарагин и глутамин способны служить в качестве консервативных замен друг для друга. Аргинин, лизин и гистидин способны служить в качестве консервативных замен друг для друга. Изолейцин, лейцин, метионин и валин способны служить в качестве консервативных замен друг для друга. Фенилаланин, тирозин и триптофан способны служить в качестве консервативных замен друг для друга.
Можно предположить другие группы консервативных аминокислотных замен. Например, аминокислоты могут быть сгруппированы по сходной функции или химической структуре или составу (например, кислотные, основные, алифатические, ароматические, серосодержащие). Например, алифатическая группировка может включать: глицин (G), аланин (A), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I). Другие группы, включающие аминокислоты, которые рассматривают в качестве консервативных замен друг для друга, включают: ароматические: фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); серосодержащие: метионин (M), цистеин (C); основные: аргинин (R), лизин (K), гистидин (H); кислотные: аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E); неполярные незаряженные остатки, цистеин (C), метионин (M) и пролин (P); гидрофильные незаряженные остатки: серин (S), треонин (T), аспарагин (N) и глутамин (Q). Дополнительные группировки аминокислот хорошо известны специалистам в данной области и описаны в различных стандартных учебниках. Перечень полипептидных последовательностей в настоящем изобретении вместе с вышеуказанными группами замен предоставляет недвусмысленный перечень всех полипептидных последовательностей с консервативными заменами.
В пределах описанных выше классов аминокислотных остатков существуют более консервативные замены, которые так или иначе могут быть пригодны. Консервативные группы для замен, которые представляют собой более консервативные, включают: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенный или рекомбинантный полипептид вариантной протеазы (например, вариантный субтилизин), обладающий протеолитической активностью, причем указанный полипептид вариантной протеазы включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 99,5% идентичностью последовательности к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. Консервативная замена одной аминокислоты на другую в вариантной протеазе настоящего изобретения, как ожидается, значительно не изменит ферментативную активность или активность очищающего действия вариантной протеазы. Ферментативная активность или активность очищающего действия полученной протеазы может быть легко определена с помощью стандартных проб и проб, описанных в настоящем изобретении.
Вариации с консервативными заменами полипептидной последовательности настоящего изобретения (например, вариантные протеазы настоящего изобретения) включают замены небольшого процента, иногда менее чем приблизительно 25%, приблизительно 20%, приблизительно 15%, приблизительно 14%, приблизительно 13%, приблизительно 12%, приблизительно 11%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7% или приблизительно 6% аминокислот полипептидной последовательности или менее чем приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1% аминокислот полипептидной последовательности, выбранной по консервативности аминокислотой из той же группы консервативных замен.
Как более подробно описано в других разделах настоящего изобретения и в примерах, представленных в настоящем изобретении, полипептиды настоящего изобретения могут иметь очищающие способности, которые можно сравнить с известными протеазами, включая известные субтилизины. Иллюстративные известные субтилизиновые протеазы включают, но без ограничений, например, субтилизин GG36 B. lentus, субтилизин BPN' B. amyloliquefaciens, субтилизин BPN'-Y217L B. amyloliquefaciens и PB92 B. clausii. Аминокислотная последовательность зрелого белка субтилизина GG36 B. lentus представляет собой:
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:2)
Аминокислотная последовательность зрелого белка BPN' субтилизина B. amyloliquefaciens представляет собой:
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ (SEQ ID NO:1)
Настоящее изобретение предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X1R, X2W, X2M, X2R, X2A, X2S, X3R, X4R, X4C, X4S, X8A, X9F, X9W, X9A, X10S, X10M, X10H, X10A, X12R, X12F, X14K, X14F, X14Q, X15R, X15F, X16S, X17R, X17M, X17F, X18R, X18K, X20F, X20R, X20K, X22Y, X22A, X22R, X22V, X22Q, X22W, X22L, X23F, X23S, X23A, X24W, X24R, X24H, X24F, X24Q, X24L, X25V, X25F, X25R, X26F, X27V, X27F, X27L, X27R, X28N, X28E, X28A, X29T, X30E, X31F, X33D, X33G, X33S, X34P, X35M, X36F, X36R, X36T, X38L, X38F, X38R, X40L, X40W, X40N, X40R, X40T, X40H, X42I, X43D, X43I, X43R, X43M, X43F, X43W, X43S, X43A, X45T, X46R, X48R, X50C, X51H, X51W, X51F, X52F, X52E, X52N, X55Y, X57R, X59R, X59A, X59F, X60A, X60Q, X60P, X62E, X62Q, X63I, X63V, X63T, X63P, X63D, X63M, X63H, X63Q, X63E, X63A, X63S, X64F, X64T, X68C, X68A, X69N, X69P, X69W, X69T, X71G, X72C, X74C, X75F, X75A, X75R, X75E, X76D, X78I, X78R, X78N, X79W, X79Q, X81R, X82V, X82T, X82F, X82M, X82R, X85M, X86L, X86I, X86W, X89P, X89T, X89V, X89G, X89W, X89H, X89F, X89L, X89I, X91N, X91F, X92F, X94N, X99G, X99F, X99M, X99T, X99P, X100I, X100S, X100N, X100Q, X101N, X101A, X101G, X101P, X101F, X101E, X101T, X101D, X102H, X102N, X102E, X102T, X102A, X103G, X103D, X103N, X104D, X104E, X104I, X104L, X105Q, X105E, X105T, X106F, X106V, X106G, X106E, X106T, X106D, X106A, X107F, X107M, X108G, X108I, X109M, X111V, X111I, X112V, X112L, X112Q, X114G, X115K, X115R, X116A, X116K, X116L, X117F, X118I, X118R, X119C, X120F, X120A, X120R, X121E, X121F, X123G, X123E, X124S, X128F, X128H, X128I, X128L, X128Q, X128N, X128M, X128D, X129E, X132E, X132A, X138G, X144R, X147L, X148I, X158E, X158E, X159E, X159C, X160D, X166D, X166E, X167W, X175V, X177C, X181A, X182R, X183F, X183I, X183D, X183R, X183M, X185E, X185I, X185V, X186H, X186K, X188R, X188E, X188D, X192H, X192W, X194V, X194F, X194E, X197F, X198L, X198F, X203E, X203C, X208S, X209N, X209F, X209E, X209S, X209H, X209G, X209T, X209L, X210R, X210V, X210L, X211R, X211Q, X212I, X212M, X212F, X213A, X214F, X215F, X215N, X215D, X215H, X215E, X216F, X216A, X217N, X217E, X217D, X218P, X218D, X218E, X224A, X224G, X227I, X230E, X231I, X231C, X233C, X234F, X235F, X236F, X236N, X238L, X238K, X238R, X239K, X239S, X239T, X239G, X239H, X239R, X239N, X239F, X240R, X241R, X242L, X242R, X243R, X243F, X244R, X246S, X248I, X248V, X248R, X249R, X249T, X250I, X251S, X251R, X252I, X252F, X252H, X252R, X253F, X253I, X253R, X254C, X256N, X258R, X260V, X260I, X262H, X262D, X263F, X265F, X267N, X267V, X267M, X269I, X269R, X270C, X271F, X271V, X271I, X271P, X271H, X271M, X271T, X271L, X271A, X272F, X272R, X272F, X273I, X273F и X274G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X16S, X18R, X20R, X22A, X24R, X43R/D, X45T, X76D, X101A, X103G, X104L, X111V, X128N, X148I, X230E, X242R и X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X1R, X230E, X271L, X115R, X20R, X249R, X235F, X27V/F/L, X75E, X82R, X18R, X269R, X43D, X43R, X76D, X45T, X212F, X242R, X24R, X78R, X9A, X22R, X121E, X244R, X28E, X30E, X4R и X241R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X062E-X158E, X103G-X158E, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X089P-X158E, X111V-X158E, X022A-X158E, X101A-X158E, X148I-X158E, X129E-X158E, X022A-X089P, X016S-X089P, X062E-X089P, X062E-X271F, X158E-X271F, X186H-X271F, X129E-X271F, X111V-X271F, X209E-X271F, X016S-X271F, X188D-X271F, X022A-X271F, X159E-X271F, X104L-X271F, X101A-X271F, X089P-X271F, X128N-X271F, X103G-X271F, X148I-X271F, X249R-X271F, X062E-X159E, X016S-X159E, X128N-X159E, X148I-X159E, X111V-X159E, X089P-X159E, X022A-X159E, X129E-X159E, X103G-X159E, X104L-X159E, X158E-X159E, X101A-X159E, X158E-X249R, X111V-X249R, X129E-X249R, X062E-X249R, X016S-X249R, X186H-X249R, X148I-X249R, X159E-X249R, X101A-X249R, X188D-X249R, X104L-X249R, X209E-X249R, X022A-X249R, X128N-X249R, X103G-X249R, X089P-X249R, X022A-X111V, X101A-X111V, X016S-X111V, X104L-X111V, X062E-X111V, X103G-X111V, X089P-X111V, X016S-X148I, X062E-X148I, X022A-X148I, X129E-X148I, X104L-X148I, X103G-X148I, X128N-X148I, X101A-X148I, X089P-X148I, X111V-X148I, X016S-X062E, X022A-X062E, X062E-X129E, X022A-X129E, X128N-X129E, X016S-X129E, X101A-X129E, X104L-X129E, X089P-X129E, X103G-X129E, X111V-X129E, X062E-X186H, X128N-X186H, X101A-X186H, X022A-X186H, X016S-X186H, X158E-X186H, X089P-X186H, X129E-X186H, X159E-X186H, X103G-X186H, X104L-X186H, X111V-X186H, X148I-X186H, X062E-X101A, X022A-X101A, X016S-X101A, X089P-X101A, X062E-X103G, X022A-X103G, X016S-X103G, X101A-X103G, X089P-X103G, X062E-X128N, X016S-X128N, X022A-X128N, X101A-X128N, X104L-X128N, X089P-X128N, X103G-X128N, X111V-X128N, X111V-X188D, X062E-X188D, X016S-X188D, X148I-X188D, X022A-X188D, X128N-X188D, X101A-X188D, X104L-X188D, X089P-X188D, X129E-X188D, X159E-X188D, X186H-X188D, X103G-X188D, X158E-X188D, X016S-X022A, X016S-X104L, X022A-X104L, X101A-X104L, X062E-X104L, X103G-X104L, X089P-X104L, X159E-X209E, X111V-X209E, X101A-X209E, X016S-X209E, X128N-X209E, X148I-X209E, X129E-X209E, X062E-X209E, X022A-X209E, X103G-X209E, X158E-X209E, X188D-X209E, X104L-X209E, X089P-X209E и X186H-X209E, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X241R, X020R-X241R, X024R-X241R, X009A-X241R, X020R-X241R, X004R-X241R, X043R-X241R, X078R-X241R, X022R-X241R, X115R-X241R, X001R-X241R, X212F-X241R, X082R-X241R, X018R-X244R, X024R-X244R, X078R-X244R, X020R-X244R, X212F-X244R, X009A-X244R, X082R-X244R, X001R-X244R, X043R-X244R, X022R-X244R, X004R-X244R, X115R-X244R, X241R-X244R, X242R-X244R, X001R-X004R, X009A-X022R, X018R-X022R, X020R-X022R, X004R-X022R, X001R-X022R, X024R-X242R, X018R-X242R, X004R-X242R, X020R-X242R, X212F-X242R, X082R-X242R, X078R-X242R, X001R-X242R, X009A-X242R, X022R-X242R, X115R-X242R, X043R-X242R, X241R-X242R, X018R-X212F, X022R-X212F, X004R-X212F, X024R-X212F, X001R-X212F, X115R-X212F, X020R-X212F, X009A-X212F, X043R-X212F, X078R-X212F, X082R-X212F, X009A-X078R, X020R-X078R, X024R-X078R, X022R-X078R, X018R-X078R, X004R-X078R, X001R-X078R, X043R-X078R, X022R-X024R, X020R-X024R, X018R-X024R, X001R-X024R, X004R-X024R, X009A-X024R, X004R-X009A, X001R-X009A, X242R-X269R, X024R-X269R, X020R-X269R, X022R-X269R, X249R-X269R, X212F-X269R, X043R-X269R, X244R-X269R, X001R-X269R, X018R-X269R, X078R-X269R, X009A-X269R, X115R-X269R, X241R-X269R, X004R-X269R, X082R-X269R, X018R-X043R, X020R-X043R, X004R-X043R, X022R-X043R, X009A-X043R, X001R-X043R, X024R-X043R, X009A-X018R, X004R-X018R, X001R-X018R, X024R-X082R, X009A-X082R, X018R-X082R, X001R-X082R, X078R-X082R, X020R-X082R, X022R-X082R, X004R-X082R, X043R-X082R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X018R-X249R, X009A-X249R, X212F-X249R, X022R-X249R, X024R-X249R, X115R-X249R, X001R-X249R, X082R-X249R, X242R-X249R, X241R-X249R, X244R-X249R, X078R-X249R, X018R-X115R, X020R-X115R, X022R-X115R, X078R-X115R, X009A-X115R, X004R-X115R, X001R-X115R, X082R-X115R, X043R-X115R, X024R-X115R, X009A-X020R, X018R-X020R, X004R-X020R, X001R-X020R, X009A-X271L, X020R-X271L, X024R-X271L, X244R-X271L, X241R-X271L, X043R-X271L, X022R-X271L, X249R-X271L, X212F-X271L, X115R-X271L, X242R-X271L, X078R-X271L, X004R-X271L, X269R-X271L, X001R-X271L, X018R-X271L и X082R-X271L, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X-43R, X020K-X062E, X024F-X116L, X020K-X024F, X024R-X174T, X024R-X118R, X024R-X235F, X024R-X086R, X024R-X086W, X078R-X118R, X033S-X118R, X033S-X235F, X209A-X241R, X020R-X076D, X018R-X245R, X024R-X045T, X232V-X245R, X118R-X172V, X118R-X194T, X008T-X024R, X235F-X243F, X018R-X103A, X018R-X104I, X086W-X118R, X086W-X243F, X086W-X209A, X024C-X033S, X024R-X232V, X024R-X243F, X024R-X239Q, X024R-X101G, X024R-X141G, X024R-X033S, X024R-X274I, X024R-X209A, X078R-X086W, X101G-X232V, X033S-X148F, X033S-X086W, X033S-X201S, X033S-X078R, X033S-X241R, X033S-X209A, X230E-X249R, X232V-X249R, X118R-X235F, X076D-X245R, X086W-X235F, X024R-X247H, X024R-X104A, X078R-X235F, X101G-X249R, X103A-X232V, X033S-X048T, X033S-X239T, X033S-X253A, X143A-X209A, X209A-X235F, X018R-X045T, X209A-X243F, X024R-X272P, X024R-X269C, X101G-X104I, X104I-X232V, X076D-X249R и X024R-X076D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X076D, X024R-X045T, X230E-X249R, X018R-X045T, X018R-X245R, X101G-X232V, X024R-X232V, X232V-X245R, X024R-X101G, X018R-X104I, X018R-X103A, X101G-X249R, X232V-X249R, X103A-X232V, X076D-X245R, X101G-X104I, X104I-X232V, X076D-X249R, X024R-X076D, X024F-X116L, X020K-X024F, X020K-X062E, X033S-X118R, X024R-X086W, X024R-X118R, X024R-X086R, X209A-X241R, X024R-X241R, X024R-X235F, X118R-X209A, X078R-X118R, X033S-X235F, X024R-X174T, X086W-X209A, X008T-X024R, X086W-X118R, X033S-X241R, X024R-X243F, X024R-X209A, X033S-X086W, X024R-X033S, X086W-X243F, X033S-X201S, X024R-X239Q, X078R-X086W, X235F-X243F, X118R-X172V, X033S-X148F, X033S-X078R, X033S-X243F, X024C-X033S, X118R-X194T, X033S-X209A, X024R-X141G, X024R-X274I, X086W-X235F, X015T-X033S, X209A-X235F, X024R-X247H, X078R-X235F, X024R-X104A, X033S-X048T, X118R-X235F, X033S-X253A, X143A-X209A, X033S-X239T, X209A-X243F, X024R-X272P и X024R-X269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO: 1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X004R-X009A-X020R-X242R, X020R-X043R-X241R, X020R-X242R-X269R, X004R-X009A-X020R-X043R, X004R-X020R-X249R, X018R-X024R-X244R, X009A-X022R-X212F-X241R, X020R-X043R-X269R, X018R-X024R-X242R, X004R-X009A-X043R-X241R, X020R-X043R-X244R, X020R-X022R-X242R, X004R-X020R-X043R, X004R-X009A-X020R-X043R-X242R, X020R-X043R-X242R, X020R-X043R-X242R-X249R, X020R-X212F-X249R, X004R-X009A-X241R, X001R-X009A-X043R, X020R-X043R-X249R, X009A-X020R-X043R-X241R, X020R-X022R-X043R, X020R-X249R-X269R, X020R-X022R-X241R, X004R-X009A-X024R-X043R-X241R, X009A-X043R-X078R, X004R-X020R-X024R-X244R, X020R-X022R-X078R-X242R, X020R-X024R-X242R-X249R, X004R-X009A-X078R-X241R, X009A-X043R-X078R-X242R, X004R-X020R-X024R, X009A-X043R-X212F, X020R-X043R-X212F, X024R-X078R-X212F, X009A-X020R-X024R-X043R, X009A-X022R-X043R-X078R, X020R-X022R-X212F-X241R, X020R-X043R-X212F-X241R, X009A-X043R-X241R, X020R-X043R-X271L, X020R-X022R-X078R-X241R, X020R-X024R-X043R-X242R, X020R-X022R-X043R-X241R, X009A-X020R-X043R-X212F, X004R-X009A-X020R-X024R-X242R, X020R-X043R-X249R-X271L, X020R-X022R-X024R-X242R, X009A-X022R-X078R-X212F, X020R-X043R-X242R-X271L, X009A-X022R-X078R-X212F-X241R, X004R-X020R-X024R-X249R, X020R-X022R-X271L, X020R-X022R-X043R-X212F, X004R-X020R-X024R-X043R-X242R, X004R-X020R-X024R-X043R, X004R-X009A-X022R-X078R-X212F, X020R-X022R-X078R-X212F-X241R и X020R-X022R-X269R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X020R-X043D-X045T-X230E, X018R-X043R-X045T-X242R-X249R, X024R-X043D-X249R, X018R-X020R-X045T, X020R-X024R-X076D-X249R, X024R-X043R-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X230E, X020R-X076D, X018R-X024R-X043D-X076D-X249R, X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X024R-X045T-X242R, X020R-X043D-X076D-X230E-X249R, X020R-X043R-X045T-X242R, X018R-X024R-X076D-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X045T-X233I-X242R, X024R-X043R-X230E, X018R-X020R-X043D, X043R-X242R-X249R, X020R-X043R-X045T-X230E, X043R-X076D-X242R-X249R, X020R-X024R-X045T-X230E-X242R, X024R-X045T-X076D-X230E-X242R-X249R, X024R-X045T, X024R-X043R-X045T-X076D-X230E-X249R, X018R-X024R-X043D-X045T-X249R, X018R-X043R-X045T-X249R, X024R-X043R-X242R, X018R-X020R-X043R-X076D-X249R, X020R-X024R-X043D-X249R, X020R-X043R-X230E-X242R, X020R-X043R-X242R, X018R-X043R-X076D-X230E, X020R-X024R-X043D-X242R, X020R-X043R-X230E, X018R-X020R-X043R-X076D-X242R-X249R, X043D-X045T-X076D-X249R, X018R-X043R-X242R-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X242R, X018R-X020R-X043D-X230E-X242R, X020R-X024R-X043R-X045T-X249R, X024R-X043R-X249R, X020R-X024R-X27E-X043R-X076D-X230E, X024R-X043R-X045T-X242R, X018R-X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X230E, X020R-X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X043R-X045T-X242R, X020R-X242R-X249R, X018R-X043R-X076D-X230E-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D, X020R-X024R-X27R-X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X242R, X018R-X043R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X230E-X249R, X018R-X020R-X043D-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X242R, X024R-X043R-X076D-X230E-X242R, X020R-X024R-X38I-X043R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X020R-X043R, X018R-X024R-X045T-X230E-X242R, X018R-X020R-X249R, X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X249R, X018R-X043D-X045T-X076D-X242R-X249R, X024R-X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X045T-X242R, X020R-X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X043D-X045T-X230E-X242R, X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X043R-X045T-X076D-X242R, X018R-X020R-X043R-X076D-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X249R, X018R-X024R-X043R-X045T-X230E-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X249R, X018R-X024R-X242R, X018R-X043R-X045T-X076D-X230E-X242R, X045T-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X242R, X018R-X020R-X043D-X045T-X240P, X024R-X043R-X045T-X242R-X249R, X018R-X024R-X30S-X31S-X32I-X33Q-X34V-X35F, X018R-X020R-X043R-X076D, X020R-X043D-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X242R-X249R, X024R-X043D-X045T-X242R-X249R, X043R-X230E-X249R, X024R-X043R-X076D-X230E-X249R, X020R-X024R-X043D-X076D-X249R, X024R-X045T-X242R-X273V, X020R-X024R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X242R, X018R-X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X249R, X018R-X043R-X045T-X230E-X242R, X020R-X024R-X043D-X045T-X230E-X242R, X018R-X043D-X230E-X249R, X018R-X043R-X076D-X242R, X018R-X020R-X076D, X018R-X020R-X043D-X076D-X242R-X249R, X020R-X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X230E-X249R, X018R-X076D-X242R, X020R-X043R-X249R, X018R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X045T-X230E-X249R, X230E-X249R, X018R-X045T-X249R, X020R-X043R-X076D, X043R-X045T-X249R, X018R-X043D-X076D-X242R-X249R, X043R-X076D-X249R, X018R-X045T, X020R-X076D-X230E-X242R, X020R-X024R-X043D-X045T, X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X020R-X045T-X249R, X043R-X076D-X153A-X249R, X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X043D-X076D-X249R и X020R-X043R-X076D-X227I, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R и X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X016S-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024K-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X148I-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D и X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X016S-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X104L-X128N-X158E-X186H-X249R, X128N-X158E-X188D-X249R, X062E-X128N-X158E-X159E-X271F, X062E-X158E-X188D-X249R-X271F, X062E-X158E-X186H-X249R-X271F, X128N-X158E-X188D-X209E-X271F, X062E-X159E-X188D-X249R, X016S-X062E-X158E-X186H-X249R, X062E-X158E-X159E-X249R, X101A-X128N-X158E-X209E-X249R, X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X158E-X188D-X249R, X062E-X158E-X186H-X271F, X062E-X158E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X249R, X062E-X101A-X158E-X186H-X271F, X062E-X104L-X158E-X188D-X249R-X271F, X062E-X159E-X186H-X249R, X062E-X159E-X249R, X128N-X158E-X186H-X249R, X128N-X158E-X188D-X271F, X062E-X158E-X249R, X062E-X186H-X188D-X249R-X271F, X128N-X158E-X209E-, X062E-X101A-X158E-X249R, X104L-X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X101A-X158E-X186H-X249R-X271F, X016S-X062E-X158E-X249R, X062E-X101A-X159E-X249R, X128N-X158E-X186H-X188D-X271F, X101A-X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X101A-X188D-X249R, X101A-X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X159E-X249R-X271F, X128N-X158E-X159E-X271F, X016S-X062E-X104L-X158E-X186H-X271F, X022A-X128N-X158E-X249R, X128N-X158E-X249R, X062E-X101A-X104L-X158E-X186H-X271F, X016S-X062E-X158E-X186H-X271F, X104L-X128N-X158E-X249R, X104L-X128N-X158E-X188D-X249R, X022A-X062E-X158E, X062E-X101A-X188D-X249R-X271F, X062E-X158E-X249R-X271F, X104L-X128N-X158E-X186H-X188D-X271F, X062E-X101A-X186H-X271F, X062E-X104L-X159E-X249R, X062E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X249R-X271F, X101A-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X101A-X186H, X101A-X128N-X129E-X186H-X249R, X101A-X103G-X158E-X186H-X249R, X016S-X062E-X104L-X186H-X188D-X271F, X104L-X158E-X186H-X249R, X101A-X128N-X158E-X188D-X209E-X271F, X062E-X101A-X186H-X188D-X271F, X016S-X062E-X158E-X249R-X271F, X062E-X128N-X158E, X062E-X128N-X159E-X249R, X062E-X101A-X158E-X188D-X249R, X101A-X128N-X158E-X249R, X062E-X158E-X186H-X188D-X249R, X016S-X104L-X158E-X186H-X271F, X062E-X148I-X159E, X062E-X101A-X158E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X188D-X249R, X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X101A-X104L-X186H-X188D-X271F, X022A-X101A-X158E-X186H-X249R, X101A-X128N-X158E-X209E, X158E-X186H-X188D-X249R-X271F, X104L-X158E-X186H-X188D-X249R-X271F, X101A-X104L-X158E-X186H-X249R, X104L-X158E-X249R, X101A-X104L-X128N-X158E-X186H-X271F, X016S-X104L-X188D-X249R, X101A-X104L-X158E-X186H-X188D-X271F, X104L-X128N-X159E-X271F, X104L-X158E-X186H-X249R-X271F, X158E-X186H-X249R, X101A-X158E-X186H-X249R, X104L-X158E-X188D-X249R-X271F, X016S-X128N-X158E-X186H, X104L-X128N-X186H-X188D-X249R, X016S-X101A-X128N-X186H, X016S-X062E-X128N-X186H-X271F, X016S-X128N-X186H-X271F, X128N-X129E-X186H, X158E-X186H-X249R-X271F, X016S-X158E-X249R, X016S-X158E-X186H-X249R, X016S-X022A-X158E-X186H-X271F, X089P-X101A-X129E-X186H, X022A-X128N-X158E-X186H, X101A-X104L-X128N-X158E-X186H, X022A-X128N-X186H-X188D-, X062E-X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X022A-X158E-X186H-X249R-X271F, X022A-X104L-X158E-X249R, X101A-X111V-X129E, X016S-X158E-X249R-X271F, X016S-X111V-X188D-, X022A-X104L-X186H-X188D-X249R и X104L-X148I-X188D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X001R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X004R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X271L, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X004R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X271L, X020R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X025R-X116A-X167W, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X078R-X103N-X106G-X167W-X236N, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X101A-X120F-X194F-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X212F-X232V-X245R, X020R-X144R-X185I-X233C-X236N, X023A-X078R-X216F-X236N-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X115R-X232V-X245R, X052N-X078R-X103N-X148I-X213A, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X025R-X089I-X116A-X239S-X270C, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X148I-X213A-X252R, X024R-X025R-X183D-X192W-X239S, X046R-X194F-X212M, X104L-X217E-X224A-X249R-X252R, X023A-X091F-X121F-X192W-X236N, X101G-X103A-X104I-X232V-X244R-X245R, X099F-X144R-X167W-X252R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022W-X078R-X167W-X212M-X270C, X121F-X252R-X270C, X020R-X103N-X216F-X236N-X252R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X023A-X052N-X192W-X198L-X252R, X025R-X046R-X121F, X024R-X078R-X104L-X116A-X183D, X046R-X059A-X103N-X211Q-X212M, X020R-X052N-X062Q-X091F-X192W, X023A-X052N-X144R-X192W-X216F, X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X052N-X103N-X116A-X148I-X192W, X089I-X116A-X117F-X224A-X249R, X144R-X211Q-X238L-X239S-X249R, X043A-X062Q-X194F-X211Q, X020R-X024R-X052N-X059A-X216F, X024R-X167W-X224A-X249R, X057R-X167W-X249R, X025R-X103N-X186K-X194F-X224A, X105T-X128N-X144R-X148I-X212M, X020R-X059A-X144R-X192W-X224A, X024R-X043A-X117F-X194F-X211Q, X117F-X194F-X213A-X270C, X078R-X091F-X121F-X233C-X252R, X057R-X099F-X105T-X198L-X213A, X023A-X091F-X101A-X198L-X252R, X062Q-X103N-X121F-X144R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X023A-X024R-X117F-X212M-X216F, X104L-X213A-X216F, X194F-X211Q-X236N, X062Q-X103N-X117F-X194F, X024R-X062Q-X104L-X106G-X249R, X057R-X089I-X198L, X046R-X059A-X106G-X217E-X249R, X117F-X213A-X215F, X101A-X120F-X192W-X215F-X224A, X043A-X057R-X117F-X144R-X183D, X046R-X183D-X238L, X025R-X043A-X089I-X117F, X078R-X104L-X213A-X215F-X224A, X091F-X099F-X101A-X105T-X167W, X106G-X117F-X238L, X046R-X089I-X091F-X101A-X116A, X020R-X062Q-X089I-X186K-X212M, X057R-X099F-X121F-X185I-X192W, X046R-X089I-X192W-X233C-X270C, X089I-X117F-X185I-X215F-X233C, X052N-X104L-X183D-X216F-X249R, X078R-X099F-X116A-X186K-X224A, X025R-X105T-X128N-X144R-X270C, X105T-X211Q-X216F, X024R-X046R-X091F-X121F, X106G-X185I-X216F-X236N, X062Q-X101A-X236N-X252R-X270C, X025R-X043A-X091F-X198L-X270C, X020R-X023A-X104L-X192W-X233C, X024R-X043A-X105T-X106G-X198L, X020R-X089I-X217E, X024R-X091F-X198L-X215F-X239S, X046R-X089I-X099F-X186K-X212M, X104L-X120F-X186K-X216F-X252R, X022W-X194F-X213A-X233C-X238L, X099F-X105T-X106G-X194F-X212M, X089I-X105T-X116A-X215F-X216F, X025R-X116A-X120F-X224A-X270C, X043A-X059A-X101A-X216F-X224A, X057R-X183D-X236N, X025R-X062Q-X128N-X144R-X185I, X103N-X120F-X167W-X198L-X233C, X022W-X089I-X216F, X024R-X106G-X116A-X212M-X224A, X020R-X052N-X101A-X198L-X233C, X089I-X091F-X185I-X211Q-X270C, X111I-X215F-X239S, X024R-X116A-X186K-X233C-X236N и X023A-X103N-X106G-X212M-X215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116S-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X232V-X245R, X018R-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X103A-X232V-X249R, X018R-X101G-X104I-X232V-X245R, X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X249R, X018R-X22K-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V, X018R-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X018R-X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X215F-X232V-X245R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X245R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X101G-X103A-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I-X232V-X249R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X215F-X232V-X245R, X024R-X103A-X104I-X249R, X018R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X101G-X104I-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X103A-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X245R, X024R-X103A-X245R, X024R-X103A-X104I-X245R, X020R-X078R-X101G-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X104I-X249R, X018R-X024R-X104I-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X019H-X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X103A-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X101G-X104I-X232V, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X101G-X104I, X020R-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X245R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X22W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I-X249R, X020R-X22W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X198L-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X024R-X076D-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G-X104I-X232V-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X001T-X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X101G-X198L-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X024R-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215V-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X020R-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X215F-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X020R-X022W-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X180A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X103A-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X232V-X249R, X018R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X076D-X245R, X024R-X104I-X245R, X101G-X232V, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X198L-X232V-X245R, X024R-X245R-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X024R-X101G-X104I-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X104I, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X183D-X198L-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X22W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X012H-X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X198L-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X213A-X249R, X024R-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X249R, X018R-X076D-X103A-X104I-X249R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R-X271G, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X020R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X215F-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X103A-X175L-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X245R, X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X232V, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X249R, X018R-X024R-X076D-X198M-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X103A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R-X268G, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X249R, X101G-X103A-X104I-X245R, X018R-X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X103A-X232V, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X043R-X045T-X076D-X076T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X273T, X018R-X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G-X232V, X232V-X245R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X234I-X245R, X024R-X076D-X103A-X104I-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R-X272V, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X103A-X104I-X232V, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X117I-X183D-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X232V-X245R, X018R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X209H-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X175L-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X215F-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X215F-X249R, X024R-X076D-X104I-X245R, X027R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X076D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X114T-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022K-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V, X018R-X024R-X076D-X116A-X249R, X020R-X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X183D-X211Q-X232V-X245R-, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X018R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X131V-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X101G-X245R, X024R-X076D-X101G-X245R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X101G, X018R-X22W-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X198L-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X198L-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X104I, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X088I-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X076D-X101G-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R-X269R, X024R-X076D-X245R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X218S-X232V-X245R, X018R-X103A, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X024R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X027R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X104I, X101G-X103A-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X249R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R-X275S, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X004M-X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X104I-X232V-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R-X274I, X020R-X101A-X103A-X104I-X213A-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X024R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X103A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R-X270V, X018R-X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V, X101G-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X175L-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R-X269S, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R-X260K, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X245R, X024R-X076D-X103A-X249R, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X020R-X024R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X272D, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X232V, X024R-X103A-X104I, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X076D-X103A-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X103A-X104I-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X016T-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X043R-X076D-X101G-X103T-X104I-X232V-X245R-X249R-X269R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X115E-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G, X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X245R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X215F-X249R, X018R-X104I-X232V, X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X232V-X249R, X103A-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X024R-X076D-X103A-X104I-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X215F-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X131T-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X101G-X103A-X104I-X245R-X249R, X018R-X076D-X232V-X249R, X018K-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R-X267I, X232V-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X024R-X101G-X103A-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X249R, X103A-X232V-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R-X274I, X024R-X103A-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X103A-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X018R-X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R-X263S, X024R-X076D-X101G-X104I-X232V-X249R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X197A-X213A-X215F-X249R, X024R-X101G-X103A, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X104I-X232V, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X020R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X150T-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X024R-X076D-X232V-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116T-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X245R, X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X076D-X101G-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X209H-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X245R, X076D-X101G-X104I-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X020R-X024R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X204D-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X209V-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R-X269D, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X209H-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X076D-X232V-X245R, X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X213A-X249R, X020R-X024R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X020R-X090S-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X076D-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X076D-X103A-X104I-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101G-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X232V-X245R, X027R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X103A-X104I-X135I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X249R, X005S-X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X198L-X215F-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X243D-X249R, X018R-X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X076D-X101G, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X215F-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X245R, X020R-X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R-X269S, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X086V-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X076D-X101G-X198T-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X249R-X248T, X018R-X076D-X104I-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X076D-X101G-X104I, X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X076D-X104I, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X101G-X104I, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R-X263D, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R-X269H, X018R-X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X104I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X043R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X166F-X176P-X179V-X184T-X187P-X194P, X018R-X022W-X024R-X041E-X076D-X101A-X160T-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X076D-X104I, X018R-X076D-X101G-X232V, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X031F-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R-X269S, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X114T-X198L-X211Q-X215F-X249R, X024R-X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X076D-X103A-X104I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X101G-X104I-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R-X260A, X076D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X076D-X104I-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X076D-X101G-X103A, X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X101G-X103A-X232V, X024R-X076D-X101G-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X156V-X183D-X211Q-X215F-X249R-X269S, X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X076D-X101G, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X076D-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X237D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R-X275S, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X076D, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X232V-X249R, X018R-X076D-X103A-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X175E-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X273E, X020R-X024R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X005S-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X103A-X104I-X232V, X018R-X020R-X024R-X068A-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R-X275S, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R и X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X024R-X043R-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X024R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X076D-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X043D-X076D-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X078R-X249R, X020R-X101G-X103G-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104L-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101G-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103S-X104L-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104L-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104L-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104V-X232V-X245R, X020R-X101S-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101S-X103G-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103G-X104V-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101A-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101A-X103S-X104V-X232V-X245R, X018R-X024R-X043R-X076D-X078R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X217E-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X217E-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043R-X076D-X249R, X020R-X101A-X103G-X104V-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X217E-X249R-X269R и X018R-X024R-X076D-X217E-X242R-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X101A-X103A-X104I-X118R-X232V-X245R, X020R-X024R-X116A-X213A, X043R-X101A-X116A-X215F-X269R, X024R-X043R-X101A-X116A, X024R-X043R-X101A-X116A-X215F-X269R, X020R-X101G-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X043R-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X213A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X213A, X024R-X043R-X116A-X215F-X269R, X020R-X024R-X213A-X215F, X020R-X116A-X269R, X024R-X116A-X213A-X269R, X043R-X101A-X116A-X269R, X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X045T-X101A-X116A-X215F-X269R, X020R-X043R-X101A-X269R, X101A-X103A-X104I-X213A-X232V-X245R-X269R, X024R-X215F-X269R, X043R-X101A-X116A-X213A-X215F-X269R, X043R-X101A-X213A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X116A-X213A, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X045T-X101A-X116A-X213A-X269R, X024R-X043R-X045T-X269R, X020R-X043R-X045T-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T, X043R-X116A-X269R, X024R-X043R-X101A-X215F-X269R, X024R-X043R-X045T-X213A-X215F-X269R, X020R-X024R-X045T-X269R, X020R-X043R-X101A-X116A-X213A-X215F, X020R-X101G-X103A-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X024R-X045T-X116A-X269R, X020R-X101A-X116A-X269R, X024R-X043R-X215F, X020R-X024R-X213A, X024R-X043R-X101A-X215F, X020R-X024R-X043R-X045T-X116A, X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X269R, X020R-X024R-X101A-X215F, X020R-X024R-X116A-X213A-X215F, X020R-X024R-X116A, X020R-X024R-X101A-X116A, X043R-X213A-X215F-X269R, X024R-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X215F, X020R-X038A-X043R-X101A, X020R-X024R-X116A-X215F, X024R-X043R-X101A-X213A, X014L-X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X215F, X020R-X024R-X215F, X020R-X116A-X215F-X269R, X020R-X045T-X116A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X215F и X020R-X024R-X043R-X045T-X116A-X213A-X215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X076D-X101G-X103A-X104I-X114V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F и X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X217E-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R и X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X017R-X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X017R-X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X022A-X101G-X102A-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F и X022A-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101S-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103G-X104V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103G-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103G-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103S-X104V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103S-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103A-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103G-X104V-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R и X101S-X103A-X104V-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X026F-X051W-X104L-X106E, X026F-X031F-X078N-X102A-X160D, X020K-X100S-X116L-X158E-X166D-X243F, X033S-X043W-X218D-X239G-X243F, X022L-X038F-X048R-X062E-X100S-X186K, X101D-X103N-X116L-X144R-X215D, X104L-X105T-X213A-X217E-X256N, X043W-X101D-X212M-X243F, X026F-X048R-X105T-X213A-X218D-X224A, X024F-X101D-X118R-X215D-X250I-X272F, X121F-X185E-X224A-X239G, X022L-X031F-X102A-X128D-X224A-X243F, X062E-X078N-X102A-X116L-X144R-X250I, X022L-X038F-X121F-X160D-X272F, X026F-X078N-X159C-X186K-X243F, X024F-X048R-X118R-X166D-X217E, X023A-X038F-X078N-X100S-X212M-X215D, X100S-X116L-X158E-X213A, X078N-X104L-X118R-X128D, X102A-X103N-X105T-X194E, X022L-X078N-X128D-X213A, X027R-X100S-X118R-X160D-X188D-X243F, X024F-X102A-X186K-X213A-X217E-X243F, X033S-X105T-X188D-X216F, X023A-X100S-X194E-X212M, X048R-X128D-X185E-X239G, X020K-X024F-X033S-X129E-X194E, X020K-X027R-X129E-X166D-X239G, X022L-X023A-X027R-X101D-X104L-X216F, X033S-X118R-X129E-X194E-X239G, X022L-X078N-X116L-X129E-X256N, X027R-X101D-X103N-X105T-X272F, X048R-X078N-X116L-X185E-X217E-X239G, X023A-X024F-X027R-X062E, X024F-X103N-X104L-X118R-X188D, X026F-X104L-X256N-X272F, X024F-X043W-X104L-X121F-X129E, X062E-X078N-X116L-X224A, X023A-X024F-X051W-X158E, X027R-X038F-X102A-X116L, X062E-X078N-X144R-X212M, X031F-X116L-X256N-X272F, X022L-X033S-X104L-X116L-X160D-X186K, X024F-X118R-X129E-X186K-X213A, X043W-X105T-X213A-X215D-X216F, X031F-X105T-X186K-X188D, X026F-X194E-X213A-X256N и X103N-X160D-X250I-X256N, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D, X022A-X043R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X043R-X101D-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X248D, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X062E-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X128I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X128I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101D-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X062E-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X217D-X232V, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, и X022A-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020K-X024F-X062E-X188D-X239G, X024F-X062E-X116L-X239G, X020K-X023A-X062E-X188D, X020K-X023A-X024F-X062E-X118R-X188D-X213A, X020K-X043W-X062E-X116L-X188D-X213A-X239G, X023A-X062E-X116L-X118R, X023A-X024F-X062E-X116L-X118R, X024F-X116L, X024F-X062E-X188D-X213A, X023A-X062E-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X024F-X062E, X020K-X043W-X062E-X116L-X239G, X024F-X062E-X116L-X213A-X239G, X020K-X024F-X043W-X062E-X116L-X213A, X020K-X023A-X024F-X062E-X116L-X188D-X213A, X024F-X062E-X188D-X239G, X023A-X043W-X062E-X116L-X118R-X213A, X062E-X188D-X239G, X020K-X024F-X062E-X239G, X024F-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X023A-X062E-X116L-X118R-X213A, X020K-X023A-X024F-X062E-X188D-X213A-X239G, X024F-X043W-X118R-X188D, X023A-X024F-X116L-X118R-X188D-X213A, X020K-X023A-X043W-X116L-X188D-X213A-X239G, X023A-X024F-X116L-X188D-X239G, X023A-X043W-X116L-X118R-X188D, X023A-X024F-X118R-X188D-X239G, X023A-X024F-X043W-X062E-X116L-X118R, X020K-X043W-X188D-X213A, X024F-X062E-X118R-X239G, X023A-X043W-X188D-X213A, X020K-X024F-X043W-X062E-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X116L-X188D-X239G, X020K-X043W-X062E-X118R, X020K-X043W-X116L-X188D-X213A, X020K-X024F, X023A-X043W-X116L-X239G, X023A-X024F-X043W-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X023A-X043W-X213A и X023A-X024F-X062E-X118R-X213A-X239G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020K-X023A-X043W-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D, X024F-X118R-X128I-X129E-X159D, X020K-X024F-X062E-X116L-X118R-X188D, X020K-X062E-X116L-X188D, X062E-X116L-X118R-X213A, X020K-X023A-X062E-X116L-X188D, X062E-X116L-X118R-X188D, X020K-X062E-X116L-X213A, X020K-X023A-X062E-X116L, X020K-X062E-X188D-X213A, X020K-X062E, X020K-X024F-X062E-X116L-X188D, X020K-X043W-X062E-X116L-X188D, X020K-X024F-X062E-X188D-X213A, X062E-X116L-X188D-X213A, X020K-X062E-X116L, X020K-X023A-X062E-X116L-X188D-X213A, X023A-X024F-X062E-X116L-X213A, X022A-X043R-X103A-X104I-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X024F-X062E-X116L-X188D, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D, X023A-X062E-X116L-X188D, X043W-X062E-X116L, X020K-X023A-X116L-X188D, X043W-X062E-X116L-X188D, X024F-X062E-X116L, X062E-X116L-X188D и X022A-X024R-X103A-X104I-X128I-X159D-X188D-X232V-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X087R-X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R-X271V, X101G-X103A-X104I-X109R-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R-X271V, X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R, X076D-S87R-X103A-X104I-X212P-X271V, X076D-X103A-X104I-X109R, X076D-X103A-X104I-X212P-X271V, X076D-X103A-X104I-X109R-X245R и X076D-X103A-X104I-X212P-X245L-X271V, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X086W-X118R, X024R-X078R-X086W-X243F, X024R-X033S-X086S-X087N-X209A, X033S-X118R, X024R-X078R-X086W-X118R-X270T, X024R-X033S-X086W-X118R, X078R-X086W-X243F, X033S-X078R-X086W-X118R-X209A, X033S-X078R-X209A, X086W-X118R-X243F, X024R-X086W, X078R-X086W-X235F, X024R-X118R, X024R-X086R, X101G-X103A-X104I-X232V, X024R-X033S-X078R-X086W-X118R, X024R-X118R-X209A, X209A-X241R, X033S-X086W-X243F, X033S-X172V-X209A, X118R-X209A-X243F, X024R-X086S-X141G, X024R-X118R-X209A-X243F, X024R-X033S-X086S-X085N-X235F, X024R-X033S-X133V, X024R-X033S-X078R-X086W, X024R-X086W-X209A, X024R-X241R, X033S-X118R-X243F, X024R-X235F, X024R-X078R-X086W, X024R-X118R-X209A-X235F, X024R-X209A-X241R, X033S-X118R-X241R, X086W-X118R-X209A, X033S-X118R-X159D-X209A, X033S-X078R-X086W, X024R-X086W-X243F, X118R-X209A, X024R-X086W-X118R-X203I, X078R-X209A-X235F, X024R-X033S-X241R, X078R-X118R, X033S-X118R-X209A-X243F, X021M-X024R-X033S, X024R-X033S-X086W, X033S-X235F, X078R-X086W-X209A, X024R-X033S-X209A-X235F, X033S-X086W-X118R, X024R-X033S-X078R-X209A, X033S-X086W-X118R-X209A-X243F, X086W-X209A-X243F, X005S-X078R-X118R-X241R, X024R-X174T, X033S-X209A-X243F, X086W-X118R-X133V, X024R-X033S-X118R, X024R-X086W-X209A-X235F, X086W-X209A, X008T-X024R, X086W-X118R, X033S-X241R, X005S-X024R-X033S-X243F, X024R-X209A-X242P, X024R-X033S-X078R-X118R, X024R-X033S-X194T, X024R-X243F, X024R-X209A, X024R-X033S-X118R-X209A, X033S-X086W, X024R-X033S, X024R-X033S-X078R-X243F, X086W-X243F, X033S-X118D-X138V-X209A, X033S-X209A-X235F, X024R-X086R-X118R, X033S-X201S, X024R-X239Q, X033S-X118R-X209A-, X078R-X086W, X235F-X243F, X024R-X209A-X235F, X118R-X172V, X017Y-X024R-X033S-X086W, X033S-X148F, X024R-X118R-X235F, X033S-X078R, X033S-X243F, X024C-X033S, X118R-X194T, X033S-X209A, X118R-X209A-X235F, X024R-X033S-X209A-X243F, X024R-X033S-X235F, X024R-X033S-X118R-X235F, X024R-X141G, X024R-X274I, X024R-X033S-X209A, X086W-X235F, X024R-X209A-X243F, X004E-X033S-X078R, X086W-X209A-X235F, X015T-X033S, X033S-X086W-X156L-X209A, X024R-X118R-X243F-X269H, X209A-X235F, X024R-X247H, X024R-X033S-X228T, X078R-X235F, X024R-X033S-X174V-X235F, X024R-X235F-X243F, X024R-X033S-X235F-X241R, X024R-X033S-X151V, X024R-X104A, X033S-X048T, X012H-X104A-X118R, X118R-X235F, X033S-X253A, X143A-X209A, X024R-X033S-X243F, X033S-X239T, X209A-X243F, X024R-X033S-X129H-X184D-X253M, X024R-X085V-X086W-X118R-X235F, X024R-X272P и X024R-X269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X150L-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X249R-X269R, X018R-X024R-X076D-X087D-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X150L-X249R, X018R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X022R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X022R-X024R-X076D-X150L-X249R, X043R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X024R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X078R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X078R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X249R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X269R, X022R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X076D-X150L-X249R, X043R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X150L-X242R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X269R, X076D-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X076D-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R и X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X242R-X245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X027R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X222Q-X245R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222S-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222Q-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X222Q-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X222S-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X222S-X245R и X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222S-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X183D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X130A-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271G, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I, X22A-X101A-X209E, S103G-L111V-G159E, X22A-X103G-X159E, X22A-X111V-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X103G-X111V, X62E-X111V-X128N, X22A-X111V-X128N, X22A-X62E-X111V, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X101A-X103G-X104L-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L-X159E, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L-X209E, X22A-X209E-X271F, X22A-X101A-X271F и X101A-X209E-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K и X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X248R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R и X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X20R-X43R-X249R, X20R-X22R-X43R, X20R-X43R-X242R, X20R-X43R-X271L, X20R-X43R-X244R, X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X22R-X78R-X212F-X241R, X9A-X20R-X43R-X212F, X9A-X43R-X212F, X20R-X43R-X212F, X20R-X22R-X43R-X212F, X24R-X78R-X212F, X9A-X43R-X78R, X9A-X43R-X78R-X242R, X9A-X20R-X43R-X78R, X20R-X24R-X43R-X78R-X242R, X22R-X24R-X78R-X212F, X9A-X20R-X43R-X78R-X242R, X20R-X43R-X78R-X249R, X20R-X43R-X78R, X9A-X78R-X212F, X9A-X22R-X43R-X78R, X9A-X20R-X24R-X43R, X9A-X22R-X78R-X212F, X4R-X9A-X22R-X78R-X212F, X20R-X24R-X43R, X1R-X9A-X43R, X20R-X24R-X43R-X115R, X9A-X24R-X43R, X20R-X22R-X24R-X43R, X1R-X24R-X43R, X9A-X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X20R-X22R-X78R-X212F, X9A-X24R-X43R-X244R, X9A-X24R-X43R-X242R, X4R-X9A-X22R-X24R-X212F и X22R-X24R-X43R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248R, и X101G, X103A, X104I, X232V, X236H, X245R, и X252K, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X16S, X22A, X24R, X62E, X76D, X89P, X101A/G, X103G/A, X104L/I, X111V, X128N, X129E, X232V, X148I, X158E, X159D/E, X166D, X186H, X188D, X209E, X236H, X238R, X245R, X248D/R, X249R, X252K/R, X253R и X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N062E-A158E, S103G-A158E, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, E089P-A158E, L111V-A158E, T022A-A158E, S101A-A158E, L148I-A158E, P129E-A158E, T022A-E089P, A016S-E089P, N062E-E089P, N062E-E271F, A158E-E271F, R186H-E271F, P129E-E271F, L111V-E271F, Y209E-E271F, A016S-E271F, S188D-E271F, T022A-E271F, G159E-E271F, V104L-E271F, S101A-E271F, E089P-E271F, S128N-E271F, S103G-E271F, L148I-E271F, H249R-E271F, N062E-G159E, A016S-G159E, S128N-G159E, L148I-G159E, L111V-G159E, E089P-G159E, T022A-G159E, P129E-G159E, S103G-G159E, V104L-G159E, A158E-G159E, S101A-G159E, A158E-H249R, L111V-H249R, P129E-H249R, N062E-H249R, A016S-H249R, R186H-H249R, L148I-H249R, G159E-H249R, S101A-H249R, S188D-H249R, V104L-H249R, Y209E-H249R, T022A-H249R, S128N-H249R, S103G-H249R, E089P-H249R, T022A-L111V, S101A-L111V, A016S-L111V, V104L-L111V, N062E-L111V, S103G-L111V, E089P-L111V, A016S-L148I, N062E-L148I, T022A-L148I, P129E-L148I, V104L-L148I, S103G-L148I, S128N-L148I, S101A-L148I, E089P-L148I, L111V-L148I, A016S-N062E, T022A-N062E, N062E-P129E, T022A-P129E, S128N-P129E, A016S-P129E, S101A-P129E, V104L-P129E, E089P-P129E, S103G-P129E, L111V-P129E, N062E-R186H, S128N-R186H, S101A-R186H, T022A-R186H, A016S-R186H, A158E-R186H, E089P-R186H, P129E-R186H, G159E-R186H, S103G-R186H, V104L-R186H, L111V-R186H, L148I-R186H, N062E-S101A, T022A-S101A, A016S-S101A, E089P-S101A, N062E-S103G, T022A-S103G, A016S-S103G, S101A-S103G, E089P-S103G, N062E-S128N, A016S-S128N, T022A-S128N, S101A-S128N, V104L-S128N, E089P-S128N, S103G-S128N, L111V-S128N, L111V-S188D, N062E-S188D, A016S-S188D, L148I-S188D, T022A-S188D, S128N-S188D, S101A-S188D, V104L-S188D, E089P-S188D, P129E-S188D, G159E-S188D, R186H-S188D, S103G-S188D, A158E-S188D, A016S-T022A, A016S-V104L, T022A-V104L, S101A-V104L, N062E-V104L, S103G-V104L, E089P-V104L, G159E-Y209E, L111V-Y209E, S101A-Y209E, A016S-Y209E, S128N-Y209E, L148I-Y209E, P129E-Y209E, N062E-Y209E, T022A-Y209E, S103G-Y209E, A158E-Y209E, S188D-Y209E, V104L-Y209E, E089P-Y209E и R186H-Y209E, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина, обладающие протеолитической активностью и включающие аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-W241R, G020R-W241R, S024R-W241R, S009A-W241R, G020R-W241R, V004R-W241R, N043R-W241R, S078R-W241R, T022R-W241R, G115R-W241R, A001R-W241R, S212F-W241R, L082R-W241R, N018R-V244R, S024R-V244R, S078R-V244R, G020R-V244R, S212F-V244R, S009A-V244R, L082R-V244R, A001R-V244R, N043R-V244R, T022R-V244R, V004R-V244R, G115R-V244R, W241R-V244R, S242R-V244R, A001R-V004R, S009A-T022R, N018R-T022R, G020R-T022R, V004R-T022R, A001R-T022R, S024R-S242R, N018R-S242R, V004R-S242R, G020R-S242R, S212F-S242R, L082R-S242R, S078R-S242R, A001R-S242R, S009A-S242R, T022R-S242R, G115R-S242R, N043R-S242R, W241R-S242R, N018R-S212F, T022R-S212F, V004R-S212F, S024R-S212F, A001R-S212F, G115R-S212F, G020R-S212F, S009A-S212F, N043R-S212F, S078R-S212F, L082R-S212F, S009A-S078R, G020R-S078R, S024R-S078R, T022R-S078R, N018R-S078R, V004R-S078R, A001R-S078R, N043R-S078R, T022R-S024R, G020R-S024R, N018R-S024R, A001R-S024R, V004R-S024R, S009A-S024R, V004R-S009A, A001R-S009A, S242R-N269R, S024R-N269R, G020R-N269R, T022R-N269R, H249R-N269R, S212F-N269R, N043R-N269R, V244R-N269R, A001R-N269R, N018R-N269R, S078R-N269R, S009A-N269R, G115R-N269R, W241R-N269R, V004R-N269R, L082R-N269R, N018R-N043R, G020R-N043R, V004R-N043R, T022R-N043R, S009A-N043R, A001R-N043R, S024R-N043R, S009A-N018R, V004R-N018R, A001R-N018R, S024R-L082R, S009A-L082R, N018R-L082R, A001R-L082R, S078R-L082R, G020R-L082R, T022R-L082R, V004R-L082R, N043R-L082R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, N018R-H249R, S009A-H249R, S212F-H249R, T022R-H249R, S024R-H249R, G115R-H249R, A001R-H249R, L082R-H249R, S242R-H249R, W241R-H249R, V244R-H249R, S078R-H249R, N018R-G115R, G020R-G115R, T022R-G115R, S078R-G115R, S009A-G115R, V004R-G115R, A001R-G115R, L082R-G115R, N043R-G115R, S024R-G115R, S009A-G020R, N018R-G020R, V004R-G020R, A001R-G020R, S009A-E271L, G020R-E271L, S024R-E271L, V244R-E271L, W241R-E271L, N043R-E271L, T022R-E271L, H249R-E271L, S212F-E271L, G115R-E271L, S242R-E271L, S078R-E271L, V004R-E271L, N269R-E271L, A001R-E271L, N018R-E271L и L082R-E271L, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N043R, N062E-A158E, S103G-A158E, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, E089P-A158E, L111V-A158E, T022A-A158E, S101A-A158E, L148I-A158E, P129E-A158E, T022A-E089P, A016S-E089P, N062E-E089P, N062E-E271F, A158E-E271F, R186H-E271F, P129E-E271F, L111V-E271F, Y209E-E271F, A016S-E271F, S188D-E271F, T022A-E271F, G159E-E271F, V104L-E271F, S101A-E271F, E089P-E271F, S128N-E271F, S103G-E271F, L148I-E271F, H249R-E271F, N062E-G159E, A016S-G159E, S128N-G159E, L148I-G159E, L111V-G159E, E089P-G159E, T022A-G159E, P129E-G159E, S103G-G159E, V104L-G159E, A158E-G159E, S101A-G159E, A158E-H249R, L111V-H249R, P129E-H249R, N062E-H249R, A016S-H249R, R186H-H249R, L148I-H249R, G159E-H249R, S101A-H249R, S188D-H249R, V104L-H249R, Y209E-H249R, T022A-H249R, S128N-H249R, S103G-H249R, E089P-H249R, T022A-L111V, S101A-L111V, A016S-L111V, V104L-L111V, N062E-L111V, S103G-L111V, E089P-L111V, A016S-L148I, N062E-L148I, T022A-L148I, P129E-L148I, V104L-L148I, S103G-L148I, S128N-L148I, S101A-L148I, E089P-L148I, L111V-L148I, A016S-N062E, T022A-N062E, N062E-P129E, T022A-P129E, S128N-P129E, A016S-P129E, S101A-P129E, V104L-P129E, E089P-P129E, S103G-P129E, L111V-P129E, N062E-R186H, S128N-R186H, S101A-R186H, T022A-R186H, A016S-R186H, A158E-R186H, E089P-R186H, P129E-R186H, G159E-R186H, S103G-R186H, V104L-R186H, L111V-R186H, L148I-R186H, N062E-S101A, T022A-S101A, A016S-S101A, E089P-S101A, N062E-S103G, T022A-S103G, A016S-S103G, S101A-S103G, E089P-S103G, N062E-S128N, A016S-S128N, T022A-S128N, S101A-S128N, V104L-S128N, E089P-S128N, S103G-S128N, L111V-S128N, L111V-S188D, N062E-S188D, A016S-S188D, L148I-S188D, T022A-S188D, S128N-S188D, S101A-S188D, V104L-S188D, E089P-S188D, P129E-S188D, G159E-S188D, R186H-S188D, S103G-S188D, A158E-S188D, A016S-T022A, A016S-V104L, T022A-V104L, S101A-V104L, N062E-V104L, S103G-V104L, E089P-V104L, G159E-Y209E, L111V-Y209E, S101A-Y209E, A016S-Y209E, S128N-Y209E, L148I-Y209E, P129E-Y209E, N062E-Y209E, T022A-Y209E, S103G-Y209E, A158E-Y209E, S188D-Y209E, V104L-Y209E, E089P-Y209E, R186H-Y209E, N018R-W241R, G020R-W241R, S024R-W241R, S009A-W241R, G020R-W241R, V004R-W241R, N043R-W241R, S078R-W241R, T022R-W241R, G115R-W241R, A001R-W241R, S212F-W241R, L082R-W241R, N018R-V244R, S024R-V244R, S078R-V244R, G020R-V244R, S212F-V244R, S009A-V244R, L082R-V244R, A001R-V244R, N043R-V244R, T022R-V244R, V004R-V244R, G115R-V244R, W241R-V244R, S242R-V244R, A001R-V004R, S009A-T022R, N018R-T022R, G020R-T022R, V004R-T022R, A001R-T022R, S024R-S242R, N018R-S242R, V004R-S242R, G020R-S242R, S212F-S242R, L082R-S242R, S078R-S242R, A001R-S242R, S009A-S242R, T022R-S242R, G115R-S242R, N043R-S242R, W241R-S242R, N018R-S212F, T022R-S212F, V004R-S212F, S024R-S212F, A001R-S212F, G115R-S212F, G020R-S212F, S009A-S212F, N043R-S212F, S078R-S212F, L082R-S212F, S009A-S078R, G020R-S078R, S024R-S078R, T022R-S078R, N018R-S078R, V004R-S078R, A001R-S078R, N043R-S078R, T022R-S024R, G020R-S024R, N018R-S024R, A001R-S024R, V004R-S024R, S009A-S024R, V004R-S009A, A001R-S009A, S242R-N269R, S024R-N269R, G020R-N269R, T022R-N269R, H249R-N269R, S212F-N269R, N043R-N269R, V244R-N269R, A001R-N269R, N018R-N269R, S078R-N269R, S009A-N269R, G115R-N269R, W241R-N269R, V004R-N269R, L082R-N269R, N018R-N043R, G020R-N043R, V004R-N043R, T022R-N043R, S009A-N043R, A001R-N043R, S024R-N043R, S009A-N018R, V004R-N018R, A001R-N018R, S024R-L082R, S009A-L082R, N018R-L082R, A001R-L082R, S078R-L082R, G020R-L082R, T022R-L082R, V004R-L082R, N043R-L082R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, N018R-H249R, S009A-H249R, S212F-H249R, T022R-H249R, S024R-H249R, G115R-H249R, A001R-H249R, L082R-H249R, S242R-H249R, W241R-H249R, V244R-H249R, S078R-H249R, N018R-G115R, G020R-G115R, T022R-G115R, S078R-G115R, S009A-G115R, V004R-G115R, A001R-G115R, L082R-G115R, N043R-G115R, S024R-G115R, S009A-G020R, N018R-G020R, V004R-G020R, A001R-G020R, S009A-E271L, G020R-E271L, S024R-E271L, V244R-E271L, W241R-E271L, N043R-E271L, T022R-E271L, H249R-E271L, S212F-E271L, G115R-E271L, S242R-E271L, S078R-E271L, V004R-E271L, N269R-E271L, A001R-E271L, N018R-E271L и L082R-E271L, и где общий заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен одной или более заменами, выбранными из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N043R, G020K-N062E, S024F-N116L, G020K-S024F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086W, S078R-G118R, T033S-G118R, T033S-K235F, Y209A-W241R, G020R-N076D, N018R-Q245R, S024R-R045T, A232V-Q245R, G118R-A172V, G118R-A194T, I008T-S024R, K235F-N243F, N018R-S103A, N018R-V104I, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-N243F, S024R-P239Q, S024R-S101G, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T274I, S024R-Y209A, S078R-P086W, S101G-A232V, T033S-L148F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, A230E-H249R, A232V-H249R, G118R-K235F, N076D-Q245R, P086W-K235F, S024R-R247H, S024R-V104A, S078R-K235F, S101G-H249R, S103A-A232V, T033S-A048T, T033S-P239T, T033S-T253A, T143A-Y209A, Y209A-K235F, N018R-R045T, Y209A-N243F, S024R-A272P, S024R-R269C, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R и S024R-N076D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N076D, S024R-R045T, A230E-H249R, N018R-R045T, N018R-Q245R, S101G-A232V, S024R-A232V, A232V-Q245R, S024R-S101G, N018R-V104I, N018R-S103A, S101G-H249R, A232V-H249R, S103A-A232V, N076D-Q245R, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R, S024R-N076D, S024F-N116L, G020K-S024F, G020K-N062E, T033S-G118R, S024R-P086W, S024R-G118R, S024R-P086R, Y209A-W241R, S024R-W241R, S024R-K235F, G118R-Y209A, S078R-G118R, T033S-K235F, S024R-A174T, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, S024R-N243F, S024R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, P086W-N243F, T033S-P201S, S024R-P239Q, S078R-P086W, K235F-N243F, G118R-A172V, T033S-L148F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, S024R-S141G, S024R-T274I, P086W-K235F, A015T-T033S, Y209A-K235F, S024R-R247H, S078R-K235F, S024R-V104A, T033S-A048T, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-A272P и S024R-R269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V004R-S009A-G020R-S242R, G020R-N043R-W241R, G020R-S242R-N269R, V004R-S009A-G020R-N043R, V004R-G020R-H249R, N018R-S024R-V244R, S009A-T022R-S212F-W241R, G020R-N043R-N269R, N018R-S024R-S242R, V004R-S009A-N043R-W241R, G020R-N043R-V244R, G020R-T022R-S242R, V004R-G020R-N043R, V004R-S009A-G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R-H249R, G020R-S212F-H249R, V004R-S009A-W241R, A001R-S009A-N043R, G020R-N043R-H249R, S009A-G020R-N043R-W241R, G020R-T022R-N043R, G020R-H249R-N269R, G020R-T022R-W241R, V004R-S009A-S024R-N043R-W241R, S009A-N043R-S078R, V004R-G020R-S024R-V244R, G020R-T022R-S078R-S242R, G020R-S024R-S242R-H249R, V004R-S009A-S078R-W241R, S009A-N043R-S078R-S242R, V004R-G020R-S024R, S009A-N043R-S212F, G020R-N043R-S212F, S024R-S078R-S212F, S009A-G020R-S024R-N043R, S009A-T022R-N043R-S078R, G020R-T022R-S212F-W241R, G020R-N043R-S212F-W241R, S009A-N043R-W241R, G020R-N043R-E271L, G020R-T022R-S078R-W241R, G020R-S024R-N043R-S242R, G020R-T022R-N043R-W241R, S009A-G020R-N043R-S212F, V004R-S009A-G020R-S024R-S242R, G020R-N043R-H249R-E271L, G020R-T022R-S024R-S242R, S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-N043R-S242R-E271L, S009A-T022R-S078R-S212F-W241R, V004R-G020R-S024R-H249R, G020R-T022R-E271L, G020R-T022R-N043R-S212F, V004R-G020R-S024R-N043R-S242R, V004R-G020R-S024R-N043R, V004R-S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-T022R-S078R-S212F-W241R и G020R-T022R-N269R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-G020R-N043D-R045T-A230E, N018R-N043R-R045T-S242R-H249R, S024R-N043D-H249R, N018R-G020R-R045T, G020R-S024R-N076D-H249R, S024R-N043R-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-A230E, G020R-N076D, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R, S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-R045T-S242R, G020R-N043D-N076D-A230E-H249R, G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-S024R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-L233I-S242R, S024R-N043R-A230E, N018R-G020R-N043D, N043R-S242R-H249R, G020R-N043R-R045T-A230E, N043R-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-R045T-A230E-S242R, S024R-R045T-N076D-A230E-S242R-H249R, S024R-R045T, S024R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-S024R-N043D-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-H249R, S024R-N043R-S242R, N018R-G020R-N043R-N076D-H249R, G020R-S024R-N043D-H249R, G020R-N043R-A230E-S242R, G020R-N043R-S242R, N018R-N043R-N076D-A230E, G020R-S024R-N043D-S242R, G020R-N043R-A230E, N018R-G020R-N043R-N076D-S242R-H249R, N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-N043R-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-N043D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T-H249R, S024R-N043R-H249R, G020R-S024R-K27E-N043R-N076D-A230E, S024R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-A230E, G020R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043R-R045T-S242R, G020R-S242R-H249R, N018R-N043R-N076D-A230E-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D, G020R-S024R-K27R-N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-N043R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-H249R, N018R-G020R-N043D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S242R, S024R-N043R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-T38I-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R, N018R-S024R-R045T-A230E-S242R, N018R-G020R-H249R, S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, S024R-N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-S242R, G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-S242R, N018R-G020R-N043R-N076D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-H249R, N018R-S024R-N043R-R045T-A230E-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-S024R-S242R, N018R-N043R-R045T-N076D-A230E-S242R, R045T-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-S242R, N018R-G020R-N043D-R045T-S240P, S024R-N043R-R045T-S242R-H249R, N018R-S024R-V30S-L31S-D32I-T33Q-G34V-I35F, N018R-G020R-N043R-N076D, G020R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-S242R-H249R, S024R-N043D-R045T-S242R-H249R, N043R-A230E-H249R, S024R-N043R-N076D-A230E-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-H249R, S024R-R045T-S242R-A273V, G020R-S024R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T-A230E-S242R, N018R-N043D-A230E-H249R, N018R-N043R-N076D-S242R, N018R-G020R-N076D, N018R-G020R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-N076D-S242R, G020R-N043R-H249R, N018R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-R045T-A230E-H249R, A230E-H249R, N018R-R045T-H249R, G020R-N043R-N076D, N043R-R045T-H249R, N018R-N043D-N076D-S242R-H249R, N043R-N076D-H249R, N018R-R045T, G020R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T, S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-R045T-H249R, N043R-N076D-S153A-H249R, N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043D-N076D-H249R и G020R-N043R-N076D-V227I, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024K-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-L148I-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D и S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V104L-S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-S188D-H249R, N062E-S128N-A158E-G159E-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R-E271F, S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, N062E-G159E-S188D-H249R, A016S-N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-A158E-G159E-H249R, S101A-S128N-A158E-Y209E-H249R, S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R, N062E-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R, N062E-S101A-A158E-R186H-E271F, N062E-V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-G159E-R186H-H249R, N062E-G159E-H249R, S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-S188D-E271F, N062E-A158E-H249R, N062E-R186H-S188D-H249R-E271F, S128N-A158E-Y209E-, N062E-S101A-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R-E271F, A016S-N062E-A158E-H249R, N062E-S101A-G159E-H249R, S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, S101A-S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-S188D-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-G159E-H249R-E271F, S128N-A158E-G159E-E271F, A016S-N062E-V104L-A158E-R186H-E271F, T022A-S128N-A158E-H249R, S128N-A158E-H249R, N062E-S101A-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-N062E-A158E-R186H-E271F, V104L-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-S188D-H249R, T022A-N062E-A158E, N062E-S101A-S188D-H249R-E271F, N062E-A158E-H249R-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, N062E-S101A-R186H-E271F, N062E-V104L-G159E-H249R, N062E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R-E271F, S101A-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-R186H, S101A-S128N-P129E-R186H-H249R, S101A-S103G-A158E-R186H-H249R, A016S-N062E-V104L-R186H-S188D-E271F, V104L-A158E-R186H-H249R, S101A-S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-E271F, A016S-N062E-A158E-H249R-E271F, N062E-S128N-A158E, N062E-S128N-G159E-H249R, N062E-S101A-A158E-S188D-H249R, S101A-S128N-A158E-H249R, N062E-A158E-R186H-S188D-H249R, A016S-V104L-A158E-R186H-E271F, N062E-L148I-G159E, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-S188D-H249R, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-V104L-R186H-S188D-E271F, T022A-S101A-A158E-R186H-H249R, S101A-S128N-A158E-Y209E, A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, S101A-V104L-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-H249R, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, A016S-V104L-S188D-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-E271F, V104L-S128N-G159E-E271F, V104L-A158E-R186H-H249R-E271F, A158E-R186H-H249R, S101A-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, A016S-S128N-A158E-R186H, V104L-S128N-R186H-S188D-H249R, A016S-S101A-S128N-R186H, A016S-N062E-S128N-R186H-E271F, A016S-S128N-R186H-E271F, S128N-P129E-R186H, A158E-R186H-H249R-E271F, A016S-A158E-H249R, A016S-A158E-R186H-H249R, A016S-T022A-A158E-R186H-E271F, E089P-S101A-P129E-R186H, T022A-S128N-A158E-R186H, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H, T022A-S128N-R186H-S188D-, N062E-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, T022A-A158E-R186H-H249R-E271F, T022A-V104L-A158E-H249R, S101A-L111V-P129E, A016S-A158E-H249R-E271F, A016S-L111V-S188D-, T022A-V104L-R186H-S188D-H249R и V104L-L148I-S188D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A001R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-G025R-N116A-Y167W, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S103N-S106G-Y167W-Q236N, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101A-H120F-A194F-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-S212F-A232V-Q245R, G020R-S144R-N185I-L233C-Q236N, G023A-S078R-S216F-Q236N-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-G115R-A232V-Q245R, P052N-S078R-S103N-L148I-T213A, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G025R-E089I-N116A-P239S-A270C, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, L148I-T213A-N252R, S024R-G025R-N183D-Y192W-P239S, G046R-A194F-S212M, V104L-L217E-T224A-H249R-N252R, G023A-Y091F-V121F-Y192W-Q236N, S101G-S103A-V104I-A232V-V244R-Q245R, S099F-S144R-Y167W-N252R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S078R-Y167W-S212M-A270C, V121F-N252R-A270C, G020R-S103N-S216F-Q236N-N252R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G023A-P052N-Y192W-I198L-N252R, G025R-G046R-V121F, S024R-S078R-V104L-N116A-N183D, G046R-Q059A-S103N-G211Q-S212M, G020R-P052N-N062Q-Y091F-Y192W, G023A-P052N-S144R-Y192W-S216F, S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, P052N-S103N-N116A-L148I-Y192W, E089I-N116A-N117F-T224A-H249R, S144R-G211Q-N238L-P239S-H249R, N043A-N062Q-A194F-G211Q, G020R-S024R-P052N-Q059A-S216F, S024R-Y167W-T224A-H249R, T057R-Y167W-H249R, G025R-S103N-R186K-A194F-T224A, S105T-S128N-S144R-L148I-S212M, G020R-Q059A-S144R-Y192W-T224A, S024R-N043A-N117F-A194F-G211Q, N117F-A194F-T213A-A270C, S078R-Y091F-V121F-L233C-N252R, T057R-S099F-S105T-I198L-T213A, G023A-Y091F-S101A-I198L-N252R, N062Q-S103N-V121F-S144R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, G023A-S024R-N117F-S212M-S216F, V104L-T213A-S216F, A194F-G211Q-Q236N, N062Q-S103N-N117F-A194F, S024R-N062Q-V104L-S106G-H249R, T057R-E089I-I198L, G046R-Q059A-S106G-L217E-H249R, N117F-T213A-A215F, S101A-H120F-Y192W-A215F-T224A, N043A-T057R-N117F-S144R-N183D, G046R-N183D-N238L, G025R-N043A-E089I-N117F, S078R-V104L-T213A-A215F-T224A, Y091F-S099F-S101A-S105T-Y167W, S106G-N117F-N238L, G046R-E089I-Y091F-S101A-N116A, G020R-N062Q-E089I-R186K-S212M, T057R-S099F-V121F-N185I-Y192W, G046R-E089I-Y192W-L233C-A270C, E089I-N117F-N185I-A215F-L233C, P052N-V104L-N183D-S216F-H249R, S078R-S099F-N116A-R186K-T224A, G025R-S105T-S128N-S144R-A270C, S105T-G211Q-S216F, S024R-G046R-Y091F-V121F, S106G-N185I-S216F-Q236N, N062Q-S101A-Q236N-N252R-A270C, G025R-N043A-Y091F-I198L-A270C, G020R-G023A-V104L-Y192W-L233C, S024R-N043A-S105T-S106G-I198L, G020R-E089I-L217E, S024R-Y091F-I198L-A215F-P239S, G046R-E089I-S099F-R186K-S212M, V104L-H120F-R186K-S216F-N252R, T022W-A194F-T213A-L233C-N238L, S099F-S105T-S106G-A194F-S212M, E089I-S105T-N116A-A215F-S216F, G025R-N116A-H120F-T224A-A270C, N043A-Q059A-S101A-S216F-T224A, T057R-N183D-Q236N, G025R-N062Q-S128N-S144R-N185I, S103N-H120F-Y167W-I198L-L233C, T022W-E089I-S216F, S024R-S106G-N116A-S212M-T224A, G020R-P052N-S101A-I198L-L233C, E089I-Y091F-N185I-G211Q-A270C, L111I-A215F-P239S, S024R-N116A-R186K-L233C-Q236N и G023A-S103N-S106G-S212M-A215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116S-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S103A-A232V-H249R, N018R-S101G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-H249R, N018R-T22K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V, N018R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S101G-S103A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-A232V-H249R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A215F-A232V-Q245R, S024R-S103A-V104I-H249R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101G-V104I-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-S103A-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-Q245R, S024R-S103A-Q245R, S024R-S103A-V104I-Q245R, G020R-S078R-S101G-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-V104I-H249R, N018R-S024R-V104I-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, R019H-G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S103A-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-S101G-V104I-A232V, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-S101G-V104I, G020R-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-Q245R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-H249R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, S024R-N076D-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, A001T-N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-I198L-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, S024R-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, G020R-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, G020R-T022W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-T180A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S103A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N076D-Q245R, S024R-V104I-Q245R, S101G-A232V, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-I198L-A232V-Q245R, S024R-Q245R-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, S024R-S101G-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-V104I, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T22W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, Q012H-G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-H249R, S024R-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-N076D-S103A-V104I-H249R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R-E271G, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, G020R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-S103A-M175L-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-Q245R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-A232V, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-I198M-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S103A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-V268G, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S103A-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-S076T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A273T, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-A232V, A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-V234I-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-A272V, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S103A-V104I-A232V, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-M117I-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-Y209H-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-M175L-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I-Q245R, K027R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A114T-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V, N018R-S024R-N076D-N116A-H249R, G020R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-A232V-Q245R-, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A131V-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-S101G-Q245R, S024R-N076D-S101G-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-S101G, N018R-T22W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-I198L-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-V104I, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-L088I-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, S024R-N076D-Q245R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-N218S-A232V-Q245R, N018R-S103A, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, S024R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, K027R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-V104I, S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-R275S, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, V004M-N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, V104I-A232V-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-T274I, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R-A270V, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V, S101G-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-M175L-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-N269S, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R-T260K, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, G020R-S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272D, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-A232V, S024R-S103A-V104I, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N076D-S103A-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, S103A-V104I-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, A016T-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N043R-N076D-S101G-S103T-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G115E-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G, N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-V104I-A232V, N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-H249R, S103A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-S103A-V104I-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-A131T-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-Q245R-H249R, N018R-N076D-A232V-H249R, N018K-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R-L267I, A232V-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, S024R-S101G-S103A-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-H249R, S103A-A232V-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-T274I, S024R-S103A-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, S103A-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-N263S, S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-V197A-T213A-A215F-H249R, S024R-S101G-S103A, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-V104I-A232V, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, G020R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-A150T-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116T-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-Q245R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-Y209H-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-Q245R, N076D-S101G-V104I-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, G020R-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N204D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A209V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R-N269D, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-Y209H-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N076D-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-T213A-H249R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, G020R-A090S-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-Q245R, K027R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S103A-V104I-L135I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, P005S-N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-N243D-H249R, N018R-G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D-S101G, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-Q245R, G020R-S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R-N269S, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-A086V-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-S101G-I198T-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R-A248T, N018R-N076D-V104I-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-V104I, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-N076D-V104I, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R-N263D, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-R269H, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-Y166F-A176P-A179V-N184T-A187P-A194P, N018R-T022W-S024R-D041E-N076D-S101A-S160T-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I, N018R-N076D-S101G-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-L031F-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R-N269S, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N114T-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R-T260A, N076D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N076D-V104I-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, S101G-S103A-A232V, S024R-N076D-S101G-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A156V-N183D-G211Q-A215F-H249R-N269S, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-N076D-S101G, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-N237D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R-R275S, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-H249R, N018R-N076D-S103A-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-D175E-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-A273E, G020R-S024R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, P005S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-S024R-V068A-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R-R275S, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R и N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-S024R-N043R-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S078R-H249R, G020R-S101G-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104V-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043R-N076D-S078R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D-H249R, G020R-S101A-S103G-V104V-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-L217E-H249R-N269R и N018R-S024R-N076D-L217E-S242R-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-S101A-S103A-V104I-G118R-A232V-Q245R, G020R-S024R-N116A-T213A, N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101A-N116A, S024R-N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N043R-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-T213A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, S024R-N043R-N116A-A215F-N269R, G020R-S024R-T213A-A215F, G020R-N116A-N269R, S024R-N116A-T213A-N269R, N043R-S101A-N116A-N269R, S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-A215F-N269R, G020R-N043R-S101A-N269R, S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R-N269R, S024R-A215F-N269R, N043R-S101A-N116A-T213A-A215F-N269R, N043R-S101A-T213A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-T213A-N269R, S024R-N043R-R045T-N269R, G020R-N043R-R045T-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T, N043R-N116A-N269R, S024R-N043R-S101A-A215F-N269R, S024R-N043R-R045T-T213A-A215F-N269R, G020R-S024R-R045T-N269R, G020R-N043R-S101A-N116A-T213A-A215F, G020R-S101G-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N116A-N269R, G020R-S101A-N116A-N269R, S024R-N043R-A215F, G020R-S024R-T213A, S024R-N043R-S101A-A215F, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-S024R-S101A-A215F, G020R-S024R-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-N116A, G020R-S024R-S101A-N116A, N043R-T213A-A215F-N269R, S024R-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-A215F, G020R-T038A-N043R-S101A, G020R-S024R-N116A-A215F, S024R-N043R-S101A-T213A, P014L-G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-A215F, G020R-S024R-A215F, G020R-N116A-A215F-N269R, G020R-R045T-N116A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-A215F и G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A-A215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A114V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F и N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R и N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-G102A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F и T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101S-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103G-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S101S-S103A-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V026F-V051W-V104L-S106E, V026F-L031F-S078N-G102A-S160D, G020K-G100S-N116L-A158E-S166D-N243F, T033S-N043W-N218D-P239G-N243F, T022L-T038F-A048R-N062E-G100S-R186K, S101D-S103N-N116L-S144R-A215D, V104L-S105T-T213A-L217E-S256N, N043W-S101D-S212M-N243F, V026F-A048R-S105T-T213A-N218D-T224A, S024F-S101D-G118R-A215D-L250I-A272F, V121F-N185E-T224A-P239G, T022L-L031F-G102A-S128D-T224A-N243F, N062E-S078N-G102A-N116L-S144R-L250I, T022L-T038F-V121F-S160D-A272F, V026F-S078N-G159C-R186K-N243F, S024F-A048R-G118R-S166D-L217E, G023A-T038F-S078N-G100S-S212M-A215D, G100S-N116L-A158E-T213A, S078N-V104L-G118R-S128D, G102A-S103N-S105T-A194E, T022L-S078N-S128D-T213A, K027R-G100S-G118R-S160D-S188D-N243F, S024F-G102A-R186K-T213A-L217E-N243F, T033S-S105T-S188D-S216F, G023A-G100S-A194E-S212M, A048R-S128D-N185E-P239G, G020K-S024F-T033S-P129E-A194E, G020K-K027R-P129E-S166D-P239G, T022L-G023A-K027R-S101D-V104L-S216F, T033S-G118R-P129E-A194E-P239G, T022L-S078N-N116L-P129E-S256N, K027R-S101D-S103N-S105T-A272F, A048R-S078N-N116L-N185E-L217E-P239G, G023A-S024F-K027R-N062E, S024F-S103N-V104L-G118R-S188D, V026F-V104L-S256N-A272F, S024F-N043W-V104L-V121F-P129E, N062E-S078N-N116L-T224A, G023A-S024F-V051W-A158E, K027R-T038F-G102A-N116L, N062E-S078N-S144R-S212M, L031F-N116L-S256N-A272F, T022L-T033S-V104L-N116L-S160D-R186K, S024F-G118R-P129E-R186K-T213A, N043W-S105T-T213A-A215D-S216F, L031F-S105T-R186K-S188D, V026F-A194E-T213A-S256N и S103N-S160D-L250I-S256N, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N062E-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-N062E-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F и T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-S024F-N062E-S188D-P239G, S024F-N062E-N116L-P239G, G020K-G023A-N062E-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-G118R-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D-T213A-P239G, G023A-N062E-N116L-G118R, G023A-S024F-N062E-N116L-G118R, S024F-N116L, S024F-N062E-S188D-T213A, G023A-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-S024F-N062E, G020K-N043W-N062E-N116L-P239G, S024F-N062E-N116L-T213A-P239G, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-N116L-S188D-T213A, S024F-N062E-S188D-P239G, G023A-N043W-N062E-N116L-G118R-T213A, N062E-S188D-P239G, G020K-S024F-N062E-P239G, S024F-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-S188D-T213A-P239G, S024F-N043W-G118R-S188D, G023A-S024F-N116L-G118R-S188D-T213A, G020K-G023A-N043W-N116L-S188D-T213A-P239G, G023A-S024F-N116L-S188D-P239G, G023A-N043W-N116L-G118R-S188D, G023A-S024F-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R, G020K-N043W-S188D-T213A, S024F-N062E-G118R-P239G, G023A-N043W-S188D-T213A, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-N116L-S188D-P239G, G020K-N043W-N062E-G118R, G020K-N043W-N116L-S188D-T213A, G020K-S024F, G023A-N043W-N116L-P239G, G023A-S024F-N043W-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N043W-T213A и G023A-S024F-N062E-G118R-T213A-P239G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-G023A-N043W-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D, S024F-G118R-S128I-P129E-G159D, G020K-S024F-N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-N062E-N116L-S188D, N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D, N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-N062E-N116L-T213A, G020K-G023A-N062E-N116L, G020K-N062E-S188D-T213A, G020K-N062E, G020K-S024F-N062E-N116L-S188D, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D, G020K-S024F-N062E-S188D-T213A, N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-N062E-N116L, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D-T213A, G023A-S024F-N062E-N116L-T213A, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, S024F-N062E-N116L-S188D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, G023A-N062E-N116L-S188D, N043W-N062E-N116L, G020K-G023A-N116L-S188D, N043W-N062E-N116L-S188D, S024F-N062E-N116L, N062E-N116L-S188D и T022A-S024R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S087R-S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-Q109R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R, N076D-S87R-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-Q109R, N076D-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-Q109R-Q245R и N076D-S103A-V104I-S212P-Q245L-E271V, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-P086W-G118R, S024R-S078R-P086W-N243F, S024R-T033S-P086S-S087N-Y209A, T033S-G118R, S024R-S078R-P086W-G118R-A270T, S024R-T033S-P086W-G118R, S078R-P086W-N243F, T033S-S078R-P086W-G118R-Y209A, T033S-S078R-Y209A, P086W-G118R-N243F, S024R-P086W, S078R-P086W-K235F, S024R-G118R, S024R-P086R, S101G-S103A-V104I-A232V, S024R-T033S-S078R-P086W-G118R, S024R-G118R-Y209A, Y209A-W241R, T033S-P086W-N243F, T033S-A172V-Y209A, G118R-Y209A-N243F, S024R-P086S-S141G, S024R-G118R-Y209A-N243F, S024R-T033S-P086S-S085N-K235F, S024R-T033S-A133V, S024R-T033S-S078R-P086W, S024R-P086W-Y209A, S024R-W241R, T033S-G118R-N243F, S024R-K235F, S024R-S078R-P086W, S024R-G118R-Y209A-K235F, S024R-Y209A-W241R, T033S-G118R-W241R, P086W-G118R-Y209A, T033S-G118R-G159D-Y209A, T033S-S078R-P086W, S024R-P086W-N243F, G118R-Y209A, S024R-P086W-G118R-V203I, S078R-Y209A-K235F, S024R-T033S-W241R, S078R-G118R, T033S-G118R-Y209A-N243F, L021M-S024R-T033S, S024R-T033S-P086W, T033S-K235F, S078R-P086W-Y209A, S024R-T033S-Y209A-K235F, T033S-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-Y209A, T033S-P086W-G118R-Y209A-N243F, P086W-Y209A-N243F, P005S-S078R-G118R-W241R, S024R-A174T, T033S-Y209A-N243F, P086W-G118R-A133V, S024R-T033S-G118R, S024R-P086W-Y209A-K235F, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, P005S-S024R-T033S-N243F, S024R-Y209A-S242P, S024R-T033S-S078R-G118R, S024R-T033S-A194T, S024R-N243F, S024R-Y209A, S024R-T033S-G118R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, S024R-T033S-S078R-N243F, P086W-N243F, T033S-G118D-A138V-Y209A, T033S-Y209A-K235F, S024R-P086R-G118R, T033S-P201S, S024R-P239Q, T033S-G118R-Y209A-, S078R-P086W, K235F-N243F, S024R-Y209A-K235F, G118R-A172V, H017Y-S024R-T033S-P086W, T033S-L148F, S024R-G118R-K235F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, G118R-Y209A-K235F, S024R-T033S-Y209A-N243F, S024R-T033S-K235F, S024R-T033S-G118R-K235F, S024R-S141G, S024R-T274I, S024R-T033S-Y209A, P086W-K235F, S024R-Y209A-N243F, V004E-T033S-S078R, P086W-Y209A-K235F, A015T-T033S, T033S-P086W-S156L-Y209A, S024R-G118R-N243F-R269H, Y209A-K235F, S024R-R247H, S024R-T033S-A228T, S078R-K235F, S024R-T033S-A174V-K235F, S024R-K235F-N243F, S024R-T033S-K235F-W241R, S024R-T033S-A151V, S024R-V104A, T033S-A048T, Q012H-V104A-G118R, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, S024R-T033S-N243F, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-T033S-P129H-N184D-T253M, S024R-A085V-P086W-G118R-K235F, S024R-A272P и S024R-R269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты протеазы, где указанный вариант протеазы включает одну или более, предпочтительно две или более или предпочтительно три или более из следующих мутаций: X1R, X2S, X4R, X4S, X9A, X10S, X14K, X16S, X17R, X18R, X20R, X22A, X22R, X24R, X24W, X25R, X25V, X26F, X42I, X43R, X43A, X46R, X52F, X52E, X52N, X57R, X59A, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C. X75A, X75F, X75R, X76D, X78R, X82R, X86W, X89P, X89T, X89G, X89H, X89I, X89V, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X106V, X106G, X108I, X111V, X112V, X115K, X115R, X117F, X118I, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X144R, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X185I, X186H, X188E, X188D, X197F, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X248V, X249R, X250I, X252R, X253R, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H, X271P, X271T, X271V, X271L и X272F, и необязательно одну или более из следующих мутаций: X103A, X159D, X236H, X245R, X248D и X252K.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты протеазы, где указанный вариант протеазы включает один или более из следующих наборов мутаций:
a) G020K-G023A-N043W-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D, G020K-G023A-N062E-N116L, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-G100S-N116L-A158E-S166D-N243F, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D, G020K-N062E, G020K-N062E-N116L, G020K-N062E-N116L-S188D, G020K-N062E-N116L-T213A, G020K-N062E-S188D-T213A, G020K-S024F-N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-S024F-N062E-N116L-S188D, G020K-S024F-N062E-S188D-T213A, G023A-N062E-N116L-S188D, G023A-S024F-N062E-N116L-T213A, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043W-N062E-N116L, N043W-S101D-S212M-N243F, N062E-N116L-G118R-S188D, N062E-N116L-G118R-T213A, N062E-N116L-S188D-T213A, S024F-G118R-S128I-P129E-G159D, S024F-N062E-N116L-S188D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101D-S103N-N116L-S144R-A215D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-T038F-A048R-N062E-G100S-R186K, T033S-N043W-N218D-P239G-N243F, V026F-A048R-S105T-T213A-N218D-T224A, V026F-L031F-S078N-G102A-S160D, V026F-V051W-V104L-S106E, V104L-S105T-T213A-L217E-S256N, A016S-N062E-A158E-H249R, A016S-N062E-A158E-R186H-E271F, A016S-N062E-A158E-R186H-H249R, A016S-N062E-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, G020K-G023A-N062E-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-G118R-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D-T213A-P239G, G020K-S024F-N062E-S188D-P239G, G023A-N062E-N116L-G118R, G023A-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-N062E-N116L-G118R, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N062E-A158E-G159E-H249R, N062E-A158E-H249R, N062E-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-A158E-R186H-H249R-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R, N062E-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-G159E-H249R, N062E-G159E-H249R-E271F, N062E-G159E-R186H-H249R, N062E-G159E-S188D-H249R, N062E-R186H-S188D-H249R-E271F, N062E-S101A-A158E-H249R, N062E-S101A-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R-E271F, N062E-S101A-G159E-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R, N062E-S101A-S188D-H249R, N062E-S101A-S188D-H249R-E271F, N062E-S101A-V104L-A158E-R186H-E271F, N062E-S128N-A158E-G159E-E271F, N062E-V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S024F-N062E-N116L-P239G, S024F-N062E-S188D-T213A, S024F-N116L, S024R-N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F-E271F, S101A-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S128N-A158E-R186H-E271F, S101A-S128N-A158E-Y209E-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222Q-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S128N-A158E-G159E-E271F, S128N-A158E-H249R, S128N-A158E-R186H-E271F, S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, S128N-A158E-S188D-E271F, S128N-A158E-S188D-H249R, S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, S128N-A158E-Y209E-, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N062E-A158E, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-H249R и/или V104L-S128N-A158E-S188D-H249R;
b) A016S-N062E-A158E-H249R-E271F, A016S-N062E-S128N-R186H-E271F, A016S-N062E-V104L-R186H-S188D-E271F, A016S-S101A-S128N-R186H, A016S-S128N-A158E-R186H, A016S-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-V104L-S188D-H249R, A158E-R186H-H249R, A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, G020K-G023A-N116L-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-P239G, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-T213A, G020K-S024F-N062E, G023A-N043W-N062E-N116L-G118R-T213A, G023A-T038F-S078N-G100S-S212M-A215D, G100S-N116L-A158E-T213A, G102A-S103N-S105T-A194E, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043W-N062E-N116L-S188D, N062E-A158E-H249R-E271F, N062E-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-L148I-G159E, N062E-N116L-S188D, N062E-R186H-H249R, N062E-S078N-G102A-N116L-S144R-L250I, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-A158E-S188D-H249R, N062E-S101A-R186H, N062E-S101A-R186H-E271F, N062E-S101A-R186H-H249R-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-V104L-R186H-S188D-E271F, N062E-S128N-A158E, N062E-S128N-G159E-H249R, N062E-S188D-P239G, N062E-V104L-G159E-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A114V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, S024F-A048R-G118R-S166D-L217E, S024F-N062E-N116L, S024F-N062E-N116L-T213A-P239G, S024F-N062E-S188D-P239G, S024F-S101D-G118R-A215D-L250I-A272F, S024R-K027R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S078N-V104L-G118R-S128D, S101A-A158E-R186H-H249R, S101A-A158E-R186H-S188D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103G-A158E-R186H-H249R, S101A-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S128N-A158E-H249R, S101A-S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, S101A-S128N-A158E-Y209E, S101A-S128N-P129E-R186H-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-E271F, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N043R-N062E-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101A-A158E-R186H-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022L-L031F-G102A-S128D-T224A-N243F, T022L-T038F-V121F-S160D-A272F, V026F-S078N-G159C-R186K-N243F, V104L-A158E-H249R, V104L-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-R186H-H249R-E271F, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, V104L-S128N-G159E-E271F, V104L-S128N-R186H-S188D-H249R и/или V121F-N185E-T224A-P239G;
c) A016S-S128N-R186H-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271G, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-G102A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-A158E-H249R, A016S-A158E-H249R-E271F, A016S-A158E-R186H-H249R, A016S-L111V-S188D-, A016S-T022A-A158E-R186H-E271F, A048R-S078N-N116L-N185E-L217E-P239G, A048R-S128D-N185E-P239G, A158E-R186H-H249R-E271F, E089P-S101A-P129E-R186H, G020K-G023A-N043W-N116L-S188D-T213A-P239G, G020K-G023A-N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-S188D-T213A-P239G, G020K-K027R-P129E-S166D-P239G, G020K-S024F-N062E-P239G, G020K-S024F-T033S-P129E-A194E, G023A-G100S-A194E-S212M, G023A-N043W-N116L-G118R-S188D, G023A-S024F-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-K027R-N062E, G023A-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R, G023A-S024F-N116L-G118R-S188D-T213A, G023A-S024F-N116L-S188D-P239G, K027R-G100S-G118R-S160D-S188D-N243F, K027R-S101D-S103N-S105T-A272F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N062E-S078N-N116L-T224A, N062E-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024F-G102A-R186K-T213A-L217E-N243F, S024F-N043W-G118R-S188D, S024F-N043W-V104L-V121F-P129E, S024F-N116L-G118R-S188D-P239G, S024F-S103N-V104L-G118R-S188D, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101A-L111V-P129E, S101A-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H, S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S128N-P129E-R186H, T022A-A158E-R186H-H249R-E271F, T022A-S024K-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S128N-A158E-R186H, T022A-S128N-R186H-S188D-, T022A-V104L-A158E-H249R, T022A-V104L-R186H-S188D-H249R, T022L-G023A-K027R-S101D-V104L-S216F, T022L-S078N-N116L-P129E-S256N, T022L-S078N-S128D-T213A, T033S-G118R-P129E-A194E-P239G, T033S-S105T-S188D-S216F, V026F-V104L-S256N-A272F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F и/или T022A-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F;
d) G118R-Y209A, G118R-Y209A-N243F, L021M-S024R-T033S, P005S-S078R-G118R-W241R, P086W-G118R-A133V, P086W-G118R-N243F, P086W-G118R-Y209A, P086W-Y209A-N243F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-G118R-Y209A, S024R-G118R-Y209A-K235F, S024R-G118R-Y209A-N243F, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086S-S141G, S024R-P086W, S024R-P086W-G118R, S024R-P086W-G118R-V203I, S024R-P086W-N243F, S024R-P086W-Y209A, S024R-S078R-P086W, S024R-S078R-P086W-G118R-A270T, S024R-S078R-P086W-N243F, S024R-T033S-A133V, S024R-T033S-G118R, S024R-T033S-P086S-S085N-K235F, S024R-T033S-P086S-S087N-Y209A, S024R-T033S-P086W, S024R-T033S-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-P086W, S024R-T033S-S078R-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-Y209A, S024R-T033S-W241R, S024R-T033S-Y209A-K235F, S024R-Y209A-W241R, S078R-G118R, S078R-P086W-K235F, S078R-P086W-N243F, S078R-P086W-Y209A, S078R-Y209A-K235F, T033S-A172V-Y209A, T033S-G118R, T033S-G118R-G159D-Y209A, T033S-G118R-N243F, T033S-G118R-W241R, T033S-G118R-Y209A-N243F, T033S-K235F, T033S-P086W-G118R, T033S-P086W-G118R-Y209A-N243F, T033S-P086W-N243F, T033S-S078R-P086W, T033S-S078R-P086W-G118R-Y209A, T033S-S078R-Y209A, T033S-Y209A-N243F, Y209A-W241R, A001R-S009A-N043R, A001R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, A001T-N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, A194F-G211Q-Q236N, E089I-N116A-N117F-T224A-H249R, G020R-G025R-N116A-Y167W, G020R-H249R-N269R, G020R-N043D-N076D-A230E-H249R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043R-A230E, G020R-N043R-A230E-S242R, G020R-N043R-E271L, G020R-N043R-H249R, G020R-N043R-H249R-E271L, G020R-N043R-N269R, G020R-N043R-R045T-A230E, G020R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-N043R-R045T-S242R, G020R-N043R-S101A-N116A-T213A-A215F, G020R-N043R-S101A-N269R, G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043R-S212F, G020R-N043R-S212F-W241R, G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R-E271L, G020R-N043R-S242R-H249R, G020R-N043R-V244R, G020R-N043R-W241R, G020R-N062Q-E089I-R186K-S212M, G020R-N076D, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N116A-N269R, G020R-P052N-N062Q-Y091F-Y192W, G020R-Q059A-S144R-Y192W-T224A, G020R-S024R-K27E-N043R-N076D-A230E, G020R-S024R-N043D-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T, G020R-S024R-N043R-R045T-H249R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, G020R-S024R-N043R-S242R, G020R-S024R-N076D-H249R, G020R-S024R-N116A, G020R-S024R-N116A-A215F, G020R-S024R-N116A-T213A, G020R-S024R-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-P052N-Q059A-S216F, G020R-S024R-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-R045T-N116A-N269R, G020R-S024R-R045T-N269R, G020R-S024R-S101A-A215F, G020R-S024R-S101A-N116A, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-S242R-H249R, G020R-S024R-T213A, G020R-S024R-T213A-A215F, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-N116A-N269R, G020R-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-G118R-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-I198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101G-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S103N-S216F-Q236N-N252R, G020R-S144R-N185I-L233C-Q236N, G020R-S212F-H249R, G020R-S242R-N269R, G020R-T022R-E271L, G020R-T022R-N043R, G020R-T022R-N043R-S212F, G020R-T022R-N043R-W241R, G020R-T022R-S024R-S242R, G020R-T022R-S078R-S242R, G020R-T022R-S078R-W241R, G020R-T022R-S212F-W241R, G020R-T022R-S242R, G020R-T022R-W241R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116S-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T038A-N043R-S101A, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T22W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G023A-P052N-S144R-Y192W-S216F, G023A-P052N-Y192W-I198L-N252R, G023A-S024R-N117F-S212M-S216F, G023A-S078R-S216F-Q236N-H249R, G023A-Y091F-S101A-I198L-N252R, G023A-Y091F-V121F-Y192W-Q236N, G025R-E089I-N116A-P239S-A270C, G025R-G046R-V121F, G025R-N043A-E089I-N117F, G025R-S103N-R186K-A194F-T224A, G046R-A194F-S212M, G046R-E089I-Y091F-S101A-N116A, G046R-E089I-Y192W-L233C-A270C, G046R-N183D-N238L, G046R-Q059A-S103N-G211Q-S212M, G046R-Q059A-S106G-L217E-H249R, L148I-T213A-N252R, N018R-G020R-N043D, N018R-G020R-N043D-A230E-S242R, N018R-G020R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E, N018R-G020R-N043R-N076D-H249R, N018R-G020R-N043R-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-L233I-S242R, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-A230E, N018R-G020R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043R-N076D-A230E, N018R-N043R-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-S242R-H249R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043R-S242R-H249R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-V104I-A232V-Q245R, N018R-Q245R, N018R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-A230E, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R-N269R, N018R-S024R-N043D-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N043D-R045T-H249R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-H249R-N269R, N018R-S024R-N043R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-S087D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215V-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-R045T-S242R, N018R-S024R-S101G-V104I, N018R-S024R-S101G-V104I-A232V, N018R-S024R-S242R, N018R-S024R-V104I-H249R, N018R-S024R-V244R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-Q245R, N018R-S101G-S103A-H249R, N018R-S101G-S103A-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-A232V-H249R, N018R-S101G-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-H249R, N018R-S103A-A232V-H249R, N018R-S103A-V104I-H249R, N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R, N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-T22K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-V104I-A232V-H249R, N043A-N062Q-A194F-G211Q, N043A-T057R-N117F-S144R-N183D, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-R045T-N076D-H249R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-N076D-S242R-H249R, N043R-N116A-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, N043R-S101A-N116A-N269R, N043R-S101A-N116A-T213A-A215F-N269R, N043R-S101A-N269R, N043R-S101A-T213A-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N043R-S242R-H249R, N043R-T213A-A215F-N269R, N062Q-S103N-N117F-A194F, N062Q-S103N-V121F-S144R-H249R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N076D-S103A-V104I-Q109R, N076D-S103A-V104I-Q109R-Q245R, N076D-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-S212P-Q245L-E271V, N076D-S87R-S103A-V104I-S212P-E271V, N117F-A194F-T213A-A270C, N117F-T213A-A215F, P052N-S078R-S103N-L148I-T213A, P052N-S103N-N116A-L148I-Y192W, R019H-G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S009A-G020R-N043R-S212F, S009A-G020R-N043R-W241R, S009A-G020R-S024R-N043R, S009A-N043R-S078R, S009A-N043R-S078R-S242R, S009A-N043R-S212F, S009A-N043R-W241R, S009A-T022R-N043R-S078R, S009A-T022R-S078R-S212F, S009A-T022R-S078R-S212F-W241R, S009A-T022R-S212F-W241R, S024R-A215F-N269R, S024R-A232V-Q245R, S024R-G025R-N183D-Y192W-P239S, S024R-N043A-N117F-A194F-G211Q, S024R-N043D-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-A215F, S024R-N043R-A230E, S024R-N043R-A230E-S242R, S024R-N043R-H249R, S024R-N043R-N076D-H249R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-N116A-A215F, S024R-N043R-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-N116A-N269R, S024R-N043R-N116A-T213A-N269R, S024R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, S024R-N043R-R045T-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-T213A-N269R, S024R-N043R-R045T-S242R, S024R-N043R-R045T-T213A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101A-A215F, S024R-N043R-S101A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101A-N116A, S024R-N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-S242R, S024R-N062Q-V104L-S106G-H249R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N076D-V104I-A232V-Q245R, S024R-N116A-T213A-N269R, S024R-R045T, S024R-R045T-N076D-A230E-S242R-H249R, S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S078R-S212F, S024R-S078R-V104L-N116A-N183D, S024R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101A-H120F-A194F-H249R, S024R-S101A-N269R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S024R-S101G-V104I-Q245R, S024R-S103A-Q245R, S024R-S103A-V104I-A232V-H249R, S024R-S103A-V104I-H249R, S024R-S103A-V104I-Q245R, S024R-Y167W-T224A-H249R, S078R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S078R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S078R-S103N-S106G-Y167W-Q236N, S078R-V104L-T213A-A215F-T224A, S078R-Y091F-V121F-L233C-N252R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S087R-S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S099F-S144R-Y167W-N252R, S101A-H120F-Y192W-A215F-T224A, S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-V244R-Q245R, S101G-S103A-V104I-G115R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-Q109R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-S212F-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, S105T-S128N-S144R-L148I-S212M, S106G-N117F-N238L, S144R-G211Q-N238L-P239S-H249R, T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S078R-Y167W-S212M-A270C, T057R-E089I-I198L, T057R-S099F-S105T-I198L-T213A, T057R-S099F-V121F-N185I-Y192W, T057R-Y167W-H249R, V004R-G020R-H249R, V004R-G020R-N043R, V004R-G020R-S024R, V004R-G020R-S024R-H249R, V004R-G020R-S024R-N043R, V004R-G020R-S024R-N043R-S242R, V004R-G020R-S024R-V244R, V004R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-S009A-G020R-N043R, V004R-S009A-G020R-N043R-S242R, V004R-S009A-G020R-S024R-S242R, V004R-S009A-G020R-S242R, V004R-S009A-N043R-W241R, V004R-S009A-S024R-N043R-W241R, V004R-S009A-S078R-W241R, V004R-S009A-W241R, V004R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V104L-L217E-T224A-H249R-N252R, V104L-T213A-S216F, V121F-N252R-A270C и/или Y091F-S099F-S101A-S105T-Y167W;
e) S101G-S103A-V104I-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, A232V-Q245R, E089I-N117F-N185I-A215F-L233C, G020R-E089I-L217E, G020R-G023A-V104L-Y192W-L233C, G020R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-N043R-N076D-A230E-H249R, G020R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N116A-A215F-N269R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-R045T-N116A-N269R, G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-A215F, G020R-S024R-K27R-N043D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S024R-N043R-N076D, G020R-S024R-N043R-R045T-A215F, G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-T38I-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A131V-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R-E271G, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-T180A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-A232V-Q245R-, G020R-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S242R-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-I198L-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-I198L-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A114T-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S103A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G025R-N043A-Y091F-I198L-A270C, G025R-S105T-S128N-S144R-A270C, G046R-E089I-S099F-R186K-S212M, G118R-A172V, G118R-A194T, G118R-Y209A-K235F, H017Y-S024R-T033S-P086W, I008T-S024R, K027R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, K027R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, K235F-N243F, N018R-G020R-H249R, N018R-G020R-N043D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E-S242R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S242R, N018R-G020R-N043D-R045T-S240P, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043R, N018R-G020R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043R-N076D-A230E-S242R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-S242R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-L217E-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-G020R-T22W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043R-N076D-A230E-S242R-H249R, N018R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043R-N076D-S242R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-A230E-S242R, N018R-N043R-R045T-N076D-S076T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A273T, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043R-R045T-N076D-S242R, N018R-N043R-R045T-S242R, N018R-N076D-H249R, N018R-N076D-Q245R, N018R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-N076D-S103A-V104I-H249R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-A230E-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N043D-S242R, N018R-S024R-N043D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N043R-R045T-A230E-H249R, N018R-S024R-N076D, N018R-S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198M-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-L088I-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-V268G, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-Y209H-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-M117I-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G-A232V, N018R-S024R-N076D-S103A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-V104I, N018R-S024R-Q245R, N018R-S024R-R045T-A230E-S242R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-S242R, N018R-S024R-V104I, N018R-S024R-V30S-L31S-D32I-T33Q-G34V-I35F, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S101G-V104I, N018R-S103A, N018R-S103A-V104I-A232V, N018R-T022K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-V104I, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-A272V, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-R275S, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-V234I-Q245R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-N218S-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N062Q-S101A-Q236N-N252R-A270C, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, P005S-S024R-T033S-N243F, P014L-G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-A215F, P052N-V104L-N183D-S216F-H249R, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, Q012H-G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, R045T-S242R-H249R, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-G046R-Y091F-V121F, S024R-G118R-K235F, S024R-N043A-S105T-S106G-I198L, S024R-N043D-R045T-S242R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043D-S242R-H249R, S024R-N043R-N076D, S024R-N043R-N076D-A230E-S242R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S242R-H249R, S024R-N043R-S101A-T213A, S024R-N076D-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-M175L-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-Q245R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-V104I-Q245R, S024R-N243F, S024R-P086R-G118R, S024R-P086W-Y209A-K235F, S024R-P239Q, S024R-Q245R-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101G, S024R-S101G-Q245R, S024R-S101G-V104I-H249R, S024R-S103A-A232V, S024R-S103A-M175L-A232V-H249R, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T033S-A194T, S024R-T033S-G118R-K235F, S024R-T033S-G118R-Y209A, S024R-T033S-K235F, S024R-T033S-S078R-G118R, S024R-T033S-S078R-N243F, S024R-T033S-Y209A, S024R-T033S-Y209A-N243F, S024R-T274I, S024R-V104I-H249R, S024R-V104I-Q245R, S024R-Y091F-I198L-A215F-P239S, S024R-Y209A, S024R-Y209A-K235F, S024R-Y209A-S242P, S078R-P086W, S078R-S099F-N116A-R186K-T224A, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-A232V, S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, S101G-S103A-V104I-Q245R, S105T-G211Q-S216F, S106G-N185I-S216F-Q236N, T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, T033S-G118D-A138V-Y209A, T033S-G118R-Y209A-, T033S-L148F, T033S-N243F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, T033S-Y209A-K235F, V004M-N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, V104I-A232V-H249R и/или V104L-H120F-R186K-S216F-N252R;
f) A015T-T033S, A016T-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, A230E-H249R, A232V-H249R, E089I-S105T-N116A-A215F-S216F, E089I-Y091F-N185I-G211Q-A270C, G020R-A090S-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-N043R-N076D, G020R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-P052N-S101A-I198L-L233C, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S024R-N043D-N076D-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G115E-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-T274I, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022R-N269R, G020R-T022R-S078R-S212F-W241R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-N269S, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-T274I, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-N263S, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A232V-Q245R, G025R-N062Q-S128N-S144R-N185I, G025R-N116A-H120F-T224A-A270C, G118R-K235F, K027R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018K-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043R-R045T-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-G020R-N076D, N018R-G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-S024R-N076D-A131T-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-N243D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R-N269S, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N204D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R-N269D, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-N043D-A230E-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272D, N018R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043R-N076D-S242R, N018R-N043R-R045T-A230E-S242R, N018R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-A232V-H249R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-I198T-A232V, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-N076D-S101G-V104I, N018R-N076D-S242R, N018R-N076D-S242R-H249R, N018R-N076D-V104I-Q245R-H249R, N018R-R045T-H249R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N043D-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-S024R-N076D-A086V-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-A232V, N018R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-L217E-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-A150T-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R-A248T, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R-A270V, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-V197A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G, N018R-S024R-N076D-S101G-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V, N018R-S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-S024R-N076D-S103A-V104I-L135I-A232V, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R-T260K, N018R-S024R-N076D-V150L-S242R-H249R, N018R-S024R-R045T-A230E-H249R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A209V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-Y209H-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R-L267I, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116T-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-Y209H-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-V104I-A232V, N043A-Q059A-S101A-S216F-T224A, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S242R-H249R, N043R-A230E-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103T-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, N043R-R045T-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, N076D-A232V-Q245R, N076D-Q245R, N076D-S101G-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N076D-S101G-V104I-H249R, N076D-S101G-V104I-Q245R, N076D-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-Q245R, N076D-V104I-A232V-Q245R, N076D-V104I-Q245R, P005S-N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, P086W-K235F, P086W-Y209A-K235F, Q012H-V104A-G118R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-G118R-N243F-R269H, S024R-K235F-N243F, S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-N076D-A230E-H249R, S024R-N076D-A232V-H249R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N076D-S101G, S024R-N076D-S101G-A232V-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-A232V, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-M175L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, S024R-N076D-S103A-H249R, S024R-N076D-S103A-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-R045T-S242R-A273V, S024R-R247H, S024R-S101G-S103A, S024R-S101G-S103A-A232V, S024R-S101G-S103A-V104I, S024R-S103A-Q245R-H249R, S024R-S103A-V104I, S024R-S106G-N116A-S212M-T224A, S024R-T033S-A151V, S024R-T033S-A174V-K235F, S024R-T033S-A228T, S024R-T033S-K235F-W241R, S024R-T033S-N243F, S024R-V104A, S024R-V104I-A232V, S024R-Y209A-N243F, S078R-K235F, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S099F-S105T-S106G-A194F-S212M, S101G-H249R, S101G-S103A-V104I, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S103A-A232V, S103A-A232V-H249R, S103A-A232V-Q245R, S103A-V104I-Q245R, S103N-H120F-Y167W-I198L-L233C, T022W-A194F-T213A-L233C-N238L, T022W-E089I-S216F, T033S-A048T, T033S-P086W-S156L-Y209A, T033S-P239T, T033S-T253A, T057R-N183D-Q236N, T143A-Y209A, V004E-T033S-S078R, V004R-S009A-T022R-S078R-S212F и/или Y209A-K235F и необязательно одну или более из следующих муцаций: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты протеазы, где указанный вариант протеазы имеет по меньшей мере одну, или даже две, или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из N062E, S101D, P129E, A158E, G159D/E, S166D и/или S188D, предпочтительно имеющие заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно 0, -1, -2 или -3, наиболее предпочтительно -1 или -2 по отношению к ферменту с SEQ ID NO:1. Указанные варианты протеазы могут также включать любой из вариантов, перечисленных в настоящей заявке.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты протеазы, где указанный вариант протеазы имеет одну, две или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из N018R, G020K/R, T022R, S024R, N043R, Q245R, H249R и/или N269R, предпочтительно имеющие заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно +1, +2 или +3, наиболее предпочтительно +2 по отношению к ферменту с SEQ ID NO:1. Указанные варианты протеазы могут также включать любой из вариантов, перечисленных в настоящей заявке.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-S087D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S024R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S078R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-V150L-H249R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-S242R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, N076D-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N076D-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-S242R-Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-K027R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222Q-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R и N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271G, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина, обладающие протеолитической активностью, включающие аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I, T22A-S101A-Y209E, S103G-L111V-G159E, T22A-S103G-G159E, T22A-L111V-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-S103G-L111V, N62E-L111V-S128N, T22A-L111V-S128N, T22A-N62E-L111V, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, S101A-S103G-V104L-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L-G159E, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-E271F и S101A-Y209E-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина, обладающие протеолитической активностью, включающие аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K и S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина, обладающие протеолитической активностью, включающие аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N248R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R и N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина, обладающие протеолитической активностью, включающие аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, W241R, G20R-N43R-H249R, G20R-T22R-N43R, G20R-N43R-S242R, G20R-N43R-E271L, G20R-N43R-V244R, G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-T22R-S78R-S212F-W241R, S9A-G20R-N43R-S212F, S9A-N43R-S212F, G20R-N43R-S212F, G20R-T22R-N43R-S212F, S24R-S78R-S212F, S9A-N43R-S78R, S9A-N43R-S78R-S242R, S9A-G20R-N43R-S78R, G20R-S24R-N43R-S78R-S242R, T22R-S24R-S78R-S212F, S9A-G20R-N43R-S78R-S242R, G20R-N43R-S78R-H249R, G20R-N43R-S78R, S9A-S78R-S212F, S9A-T22R-N43R-S78R, S9A-G20R-S24R-N43R, S9A-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R-S78R-S212F, G20R-S24R-N43R, A1R-S9A-N43R, G20R-S24R-N43R-G115R, S9A-S24R-N43R, G20R-T22R-S24R-N43R, A1R-S24R-N43R, S9A-G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-G20R-T22R-S78R-S212F, S9A-S24R-N43R-V244R, S9A-S24R-N43R-S242R, V4R-S9A-T22R-S24R-S212F и T22R-S24R-N43R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина, обладающие протеолитической активностью и включающие аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R, S101G, S103A, V104I, A232V, Q236H и Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина, обладающие протеолитической активностью и включающие аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы G20K, G20R, G23A, S24F, S24R, N43R, N43W, R45T, N62E, N76D, S101A, N116A, N116L, G118R, S128I, P129E, S188D, T213A, A215F, L217E, P239G и N269R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты субтилизина, обладающие протеолитической активностью и включающие аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A1R, Q2S, Q2M, Q2A, Q2R, Q2W, S3R, V4R, V4S, V4C, I8A, S9A, S9F, S9W, R10S, R10A, R10H, R10M, Q12F, Q12R, P14K, P14F, P14Q, A15R, A15F, A16S, H17R, H17M, H17F, N18R, N18K, G20F, G20K, G20R, T22A, T22R, T22Y, T22V, T22Q, T22L, T22W, G23A, G23S, G23F, S24R, S24F, S24W, S24Q, S24H, S24L, G25V, G25F, G25R, V26F, K27L, K27F, K27R, K27V, V28A, V28N, V28E, A29T, V30E, L31F, T33S, T33G, T33D, G34P, I35M, S36T, S36F, S36R, T38L, T38F, T38R, P40N, P40L, P40T, P40W, P40H, P40R, L42I, N43A, N43F, N43I, N43S, N43R, N43M, N43W, N43D, R45T, G46R, A48R, F50C, V51W, V51F, V51H, P52F, P52E, P52N, P55Y, T57R, Q59A, Q59F, Q59R, D60P, D60Q, D60A, N62E, N62Q, G63V, G63M, G63T, G63I, G63A, G63S, G63H, G63Q, G63D, G63E, G63P, H64F, H64T, V68A, V68C, A69N, A69T, A69P, A69W, T71G, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75E, L75R, N76D, S78R, S78N, S78I, S78R, I79W, I79Q, V81R, L82F, L82T, L82V, L82R, L82M, A85M, P86W, P86L, P86I, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, E89L, E89V, E89W, E89F, E89I, Y91N, Y91F, A92F, K94N, S99F, S99T, S99P, S99G, S99M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101D, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121F, V121F, V121E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, N183I, N183D, N183M, N183R, N183F, N183R, N185E, N185V, N185I, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Y192H, Y192W, A194E, A194V, A194F, D197F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, T213A, Y214F, A215N, A215D, A215E, A215H, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, N218P, N218E, T224A, T224G, V227I, A230E, A231I, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, N238K, N238L, P239K, P239G, P239R, P239R, P239H, P239T, P239N, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, N248I, N248R, H249R, H249T, L250I, K251R, K251S, N252I, N252F, N252R, N252K, N252H, T253I, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, T260I, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, N269I, N269R, A270C, E271I, E271H, E271V, E271H, E271M, E271L, E271P, E271A, E271F, E271T, A272F, A272F, A272R, A273F, A273I и T274G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие вариант протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям в аминокислотных положениях, выбранных из аминокислоты 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 50, 51, 52, 55, 57, 59, 60, 62, 63, 64, 68, 69, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 85, 86, 89, 91, 92, 94, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 128, 129, 132, 138, 44, 147, 148, 158, 159, 160, 166, 167, 175, 177, 181, 182, 183, 185, 186, 188, 192, 194, 197, 198, 203, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 224, 227, 230, 231, 233, 234, 235, 236, 236, 238, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 256, 258, 260, 262, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 272, 273 и 274, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет полипептиды, включающие варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы A1R, Q2S, Q2M, Q2A, Q2R, Q2W, S3R, V4R, V4S, V4C, I8A, S9A, S9F, S9W, R10S, R10A, R10H, R10M, Q12F, Q12R, P14K, P14F, P14Q, A15R, A15F, A16S, H17R, H17M, H17F, N18R, N18K, G20F, G20K, G20R, T22A, T22R, T22Y, T22V, T22Q, T22L, T22W, G23A, G23S, G23F, S24R, S24F, S24W, S24Q, S24H, S24L, G25V, G25F, G25R, V26F, K27L, K27F, K27R, K27V, V28A, V28N, V28E, A29T, V30E, L31F, T33S, T33G, T33D, G34P, I35M, S36T, S36F, S36R, T38L, T38F, T38R, P40N, P40L, P40T, P40W, P40H, P40R, L42I, N43A, N43F, N43I, N43S, N43R, N43M, N43W, N43D, R45T, G46R, A48R, F50C, V51W, V51F, V51H, P52F, P52E, P52N, P55Y, T57R, Q59A, Q59F, Q59R, D60P, D60Q, D60A, N62E, N62Q, G63V, G63M, G63T, G63I, G63A, G63S, G63H, G63Q, G63D, G63E, G63P, H64F, H64T, V68A, V68C, A69N, A69T, A69P, A69W, T71G, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75E, L75R, N76D, S78R, S78N, S78I, S78R, I79W, I79Q, V81R, L82F, L82T, L82V, L82R, L82M, A85M, P86W, P86L, P86I, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, E89L, E89V, E89W, E89F, E89I, Y91N, Y91F, A92F, K94N, S99F, S99T, S99P, S99G, S99M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101D, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121F, V121F, V121E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, N183I, N183D, N183M, N183R, N183F, N183R, N185E, N185V, N185I, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Y192H, Y192W, A194E, A194V, A194F, D197F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, T213A, Y214F, A215N, A215D, A215E, A215H, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, N218P, N218E, T224A, T224G, V227I, A230E, A231I, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, N238K, N238L, P239K, P239G, P239R, P239R, P239H, P239T, P239N, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, N248I, N248R, H249R, H249T, L250I, K251R, K251S, N252I, N252F, N252R, N252K, N252H, T253I, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, T260I, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, N269I, N269R, A270C, E271I, E271H, E271V, E271H, E271M, E271L, E271P, E271A, E271F, E271T, A272F, A272F, A272R, A273F, A273I и T274G, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет полипептиды, включающие варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, E271F, A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: G20K, G20R, G23A, S24F, S24R, N43R, N43W, R45T, N62E, N76D, S101A, N116A, N116L, G118R, S128I, P129E, S188D, T213A, A215F, L217E, P239G и N269R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет полипептиды, включающие варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, E271F, A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где варианты протеазы представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N043R, G020K-N062E, S024F-N116L, G020K-S024F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086W, S078R-G118R, T033S-G118R, T033S-K235F, Y209A-W241R, G020R-N076D, N018R-Q245R, S024R-R045T, A232V-Q245R, G118R-A172V, G118R-A194T, I008T-S024R, K235F-N243F, N018R-S103A, N018R-V104I, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-N243F, S024R-P239Q, S024R-S101G, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T274I, S024R-Y209A, S078R-P086W, S101G-A232V, T033S-L148F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, A230E-H249R, A232V-H249R, G118R-K235F, N076D-Q245R, P086W-K235F, S024R-R247H, S024R-V104A, S078R-K235F, S101G-H249R, S103A-A232V, T033S-A048T, T033S-P239T, T033S-T253A, T143A-Y209A, Y209A-K235F, N018R-R045T, Y209A-N243F, S024R-A272P, S024R-R269C, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R и S024R-N076D, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен с помощью одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где варианты протеазы представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N076D, S024R-R045T, A230E-H249R, N018R-R045T, N018R-Q245R, S101G-A232V, S024R-A232V, A232V-Q245R, S024R-S101G, N018R-V104I, N018R-S103A, S101G-H249R, A232V-H249R, S103A-A232V, N076D-Q245R, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R, S024R-N076D, S024F-N116L, G020K-S024F, G020K-N062E, T033S-G118R, S024R-P086W, S024R-G118R, S024R-P086R, Y209A-W241R, S024R-W241R, S024R-K235F, G118R-Y209A, S078R-G118R, T033S-K235F, S024R-A174T, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, S024R-N243F, S024R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, P086W-N243F, T033S-P201S, S024R-P239Q, S078R-P086W, K235F-N243F, G118R-A172V, T033S-L148F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, S024R-S141G, S024R-T274I, P086W-K235F, A015T-T033S, Y209A-K235F, S024R-R247H, S078R-K235F, S024R-V104A, T033S-A048T, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-A272P и S024R-R269C, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен с помощью одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где варианты протеазы представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-G023A-N043W-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D, G020K-G023A-N062E-N116L, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-G100S-N116L-A158E-S166D-N243F, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D, G020K-N062E, G020K-N062E-N116L, G020K-N062E-N116L-S188D, G020K-N062E-N116L-T213A, G020K-N062E-S188D-T213A, G020K-S024F-N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-S024F-N062E-N116L-S188D, G020K-S024F-N062E-S188D-T213A, G023A-N062E-N116L-S188D, G023A-S024F-N062E-N116L-T213A, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043W-N062E-N116L, N043W-S101D-S212M-N243F, N062E-N116L-G118R-S188D, N062E-N116L-G118R-T213A, N062E-N116L-S188D-T213A, S024F-G118R-S128I-P129E-G159D, S024F-N062E-N116L-S188D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101D-S103N-N116L-S144R-A215D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-T038F-A048R-N062E-G100S-R186K, T033S-N043W-N218D-P239G-N243F, V026F-A048R-S105T-T213A-N218D-T224A, V026F-L031F-S078N-G102A-S160D, V026F-V051W-V104L-S106E, V104L-S105T-T213A-L217E-S256N, A016S-N062E-A158E-H249R, A016S-N062E-A158E-R186H-E271F, A016S-N062E-A158E-R186H-H249R, A016S-N062E-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, G020K-G023A-N062E-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-G118R-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D-T213A-P239G, G020K-S024F-N062E-S188D-P239G, G023A-N062E-N116L-G118R, G023A-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-N062E-N116L-G118R, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N062E-A158E-G159E-H249R, N062E-A158E-H249R, N062E-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-A158E-R186H-H249R-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R, N062E-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-G159E-H249R, N062E-G159E-H249R-E271F, N062E-G159E-R186H-H249R, N062E-G159E-S188D-H249R, N062E-R186H-S188D-H249R-E271F, N062E-S101A-A158E-H249R, N062E-S101A-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R-E271F, N062E-S101A-G159E-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R, N062E-S101A-S188D-H249R, N062E-S101A-S188D-H249R-E271F, N062E-S101A-V104L-A158E-R186H-E271F, N062E-S128N-A158E-G159E-E271F, N062E-V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S024F-N062E-N116L-P239G, S024F-N062E-S188D-T213A, S024F-N116L, S024R-N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F-E271F, S101A-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S128N-A158E-R186H-E271F, S101A-S128N-A158E-Y209E-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222Q-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S128N-A158E-G159E-E271F, S128N-A158E-H249R, S128N-A158E-R186H-E271F, S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, S128N-A158E-S188D-E271F, S128N-A158E-S188D-H249R, S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, S128N-A158E-Y209E-, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N062E-A158E, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-H249R и V104L-S128N-A158E-S188D-H249R, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен с помощью одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где варианты протеазы представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A016S-N062E-A158E-H249R-E271F, A016S-N062E-S128N-R186H-E271F, A016S-N062E-V104L-R186H-S188D-E271F, A016S-S101A-S128N-R186H, A016S-S128N-A158E-R186H, A016S-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-V104L-S188D-H249R, A158E-R186H-H249R, A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, G020K-G023A-N116L-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-P239G, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-T213A, G020K-S024F-N062E, G023A-N043W-N062E-N116L-G118R-T213A, G023A-T038F-S078N-G100S-S212M-A215D, G100S-N116L-A158E-T213A, G102A-S103N-S105T-A194E, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043W-N062E-N116L-S188D, N062E-A158E-H249R-E271F, N062E-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-L148I-G159E, N062E-N116L-S188D, N062E-R186H-H249R, N062E-S078N-G102A-N116L-S144R-L250I, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-A158E-S188D-H249R, N062E-S101A-R186H, N062E-S101A-R186H-E271F, N062E-S101A-R186H-H249R-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-V104L-R186H-S188D-E271F, N062E-S128N-A158E, N062E-S128N-G159E-H249R, N062E-S188D-P239G, N062E-V104L-G159E-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A114V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, S024F-A048R-G118R-S166D-L217E, S024F-N062E-N116L, S024F-N062E-N116L-T213A-P239G, S024F-N062E-S188D-P239G, S024F-S101D-G118R-A215D-L250I-A272F, S024R-K027R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S078N-V104L-G118R-S128D, S101A-A158E-R186H-H249R, S101A-A158E-R186H-S188D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103G-A158E-R186H-H249R, S101A-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S128N-A158E-H249R, S101A-S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, S101A-S128N-A158E-Y209E, S101A-S128N-P129E-R186H-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-E271F, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N043R-N062E-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101A-A158E-R186H-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022L-L031F-G102A-S128D-T224A-N243F, T022L-T038F-V121F-S160D-A272F, V026F-S078N-G159C-R186K-N243F, V104L-A158E-H249R, V104L-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-R186H-H249R-E271F, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, V104L-S128N-G159E-E271F, V104L-S128N-R186H-S188D-H249R и V121F-N185E-T224A-P239G, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен с помощью одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где варианты протеазы представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A016S-S128N-R186H-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271G, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-G102A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-A158E-H249R, A016S-A158E-H249R-E271F, A016S-A158E-R186H-H249R, A016S-L111V-S188D-, A016S-T022A-A158E-R186H-E271F, A048R-S078N-N116L-N185E-L217E-P239G, A048R-S128D-N185E-P239G, A158E-R186H-H249R-E271F, E089P-S101A-P129E-R186H, G020K-G023A-N043W-N116L-S188D-T213A-P239G, G020K-G023A-N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-S188D-T213A-P239G, G020K-K027R-P129E-S166D-P239G, G020K-S024F-N062E-P239G, G020K-S024F-T033S-P129E-A194E, G023A-G100S-A194E-S212M, G023A-N043W-N116L-G118R-S188D, G023A-S024F-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-K027R-N062E, G023A-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R, G023A-S024F-N116L-G118R-S188D-T213A, G023A-S024F-N116L-S188D-P239G, K027R-G100S-G118R-S160D-S188D-N243F, K027R-S101D-S103N-S105T-A272F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N062E-S078N-N116L-T224A, N062E-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024F-G102A-R186K-T213A-L217E-N243F, S024F-N043W-G118R-S188D, S024F-N043W-V104L-V121F-P129E, S024F-N116L-G118R-S188D-P239G, S024F-S103N-V104L-G118R-S188D, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101A-L111V-P129E, S101A-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H, S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S128N-P129E-R186H, T022A-A158E-R186H-H249R-E271F, T022A-S024K-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S128N-A158E-R186H, T022A-S128N-R186H-S188D-, T022A-V104L-A158E-H249R, T022A-V104L-R186H-S188D-H249R, T022L-G023A-K027R-S101D-V104L-S216F, T022L-S078N-N116L-P129E-S256N, T022L-S078N-S128D-T213A, T033S-G118R-P129E-A194E-P239G, T033S-S105T-S188D-S216F, V026F-V104L-S256N-A272F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-L148I-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, V104L-L148I-S188D-H249R, S024R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103G-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, G023A-S024F-V051W-A158E, K027R-T038F-G102A-N116L, N062E-S078N-S144R-S212M, L031F-N116L-S256N-A272F, T022L-T033S-V104L-N116L-S160D-R186K, S024F-G118R-P129E-R186K-T213A, N043W-S105T-T213A-A215D-S216F, L031F-S105T-R186K-S188D, V026F-A194E-T213A-S256N, S103N-S160D-L250I-S256N, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N062E-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, G020K-N043W-S188D-T213A, S024F-N062E-G118R-P239G, G023A-N043W-S188D-T213A, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-N116L-S188D-P239G, G020K-N043W-N062E-G118R, G020K-N043W-N116L-S188D-T213A, G020K-S024F, G023A-N043W-N116L-P239G, G023A-S024F-N043W-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N043W-T213A и G023A-S024F-N062E-G118R-T213A-P239G, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен с помощью одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где варианты протеазы представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G118R-Y209A, G118R-Y209A-N243F, L021M-S024R-T033S, P005S-S078R-G118R-W241R, P086W-G118R-A133V, P086W-G118R-N243F, P086W-G118R-Y209A, P086W-Y209A-N243F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-G118R-Y209A, S024R-G118R-Y209A-K235F, S024R-G118R-Y209A-N243F, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086S-S141G, S024R-P086W, S024R-P086W-G118R, S024R-P086W-G118R-V203I, S024R-P086W-N243F, S024R-P086W-Y209A, S024R-S078R-P086W, S024R-S078R-P086W-G118R-A270T, S024R-S078R-P086W-N243F, S024R-T033S-A133V, S024R-T033S-G118R, S024R-T033S-P086S-S085N-K235F, S024R-T033S-P086S-S087N-Y209A, S024R-T033S-P086W, S024R-T033S-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-P086W, S024R-T033S-S078R-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-Y209A, S024R-T033S-W241R, S024R-T033S-Y209A-K235F, S024R-Y209A-W241R, S078R-G118R, S078R-P086W-K235F, S078R-P086W-N243F, S078R-P086W-Y209A, S078R-Y209A-K235F, T033S-A172V-Y209A, T033S-G118R, T033S-G118R-G159D-Y209A, T033S-G118R-N243F, T033S-G118R-W241R, T033S-G118R-Y209A-N243F, T033S-K235F, T033S-P086W-G118R, T033S-P086W-G118R-Y209A-N243F, T033S-P086W-N243F, T033S-S078R-P086W, T033S-S078R-P086W-G118R-Y209A, T033S-S078R-Y209A, T033S-Y209A-N243F, Y209A-W241R, A001R-S009A-N043R, A001R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, A001T-N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, A194F-G211Q-Q236N, E089I-N116A-N117F-T224A-H249R, G020R-G025R-N116A-Y167W, G020R-H249R-N269R, G020R-N043D-N076D-A230E-H249R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043R-A230E, G020R-N043R-A230E-S242R, G020R-N043R-E271L, G020R-N043R-H249R, G020R-N043R-H249R-E271L, G020R-N043R-N269R, G020R-N043R-R045T-A230E, G020R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-N043R-R045T-S242R, G020R-N043R-S101A-N116A-T213A-A215F, G020R-N043R-S101A-N269R, G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043R-S212F, G020R-N043R-S212F-W241R, G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R-E271L, G020R-N043R-S242R-H249R, G020R-N043R-V244R, G020R-N043R-W241R, G020R-N062Q-E089I-R186K-S212M, G020R-N076D, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N116A-N269R, G020R-P052N-N062Q-Y091F-Y192W, G020R-Q059A-S144R-Y192W-T224A, G020R-S024R-K27E-N043R-N076D-A230E, G020R-S024R-N043D-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T, G020R-S024R-N043R-R045T-H249R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, G020R-S024R-N043R-S242R, G020R-S024R-N076D-H249R, G020R-S024R-N116A, G020R-S024R-N116A-A215F, G020R-S024R-N116A-T213A, G020R-S024R-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-P052N-Q059A-S216F, G020R-S024R-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-R045T-N116A-N269R, G020R-S024R-R045T-N269R, G020R-S024R-S101A-A215F, G020R-S024R-S101A-N116A, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-S242R-H249R, G020R-S024R-T213A, G020R-S024R-T213A-A215F, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-N116A-N269R, G020R-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-G118R-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-I198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101G-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S103N-S216F-Q236N-N252R, G020R-S144R-N185I-L233C-Q236N, G020R-S212F-H249R, G020R-S242R-N269R, G020R-T022R-E271L, G020R-T022R-N043R, G020R-T022R-N043R-S212F, G020R-T022R-N043R-W241R, G020R-T022R-S024R-S242R, G020R-T022R-S078R-S242R, G020R-T022R-S078R-W241R, G020R-T022R-S212F-W241R, G020R-T022R-S242R, G020R-T022R-W241R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116S-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T038A-N043R-S101A, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T22W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G023A-P052N-S144R-Y192W-S216F, G023A-P052N-Y192W-I198L-N252R, G023A-S024R-N117F-S212M-S216F, G023A-S078R-S216F-Q236N-H249R, G023A-Y091F-S101A-I198L-N252R, G023A-Y091F-V121F-Y192W-Q236N, G025R-E089I-N116A-P239S-A270C, G025R-G046R-V121F, G025R-N043A-E089I-N117F, G025R-S103N-R186K-A194F-T224A, G046R-A194F-S212M, G046R-E089I-Y091F-S101A-N116A, G046R-E089I-Y192W-L233C-A270C, G046R-N183D-N238L, G046R-Q059A-S103N-G211Q-S212M, G046R-Q059A-S106G-L217E-H249R, L148I-T213A-N252R, N018R-G020R-N043D, N018R-G020R-N043D-A230E-S242R, N018R-G020R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E, N018R-G020R-N043R-N076D-H249R, N018R-G020R-N043R-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-L233I-S242R, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-A230E, N018R-G020R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043R-N076D-A230E, N018R-N043R-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-S242R-H249R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043R-S242R-H249R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-V104I-A232V-Q245R, N018R-Q245R, N018R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-A230E, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R-N269R, N018R-S024R-N043D-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N043D-R045T-H249R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-H249R-N269R, N018R-S024R-N043R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-S087D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215V-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-R045T-S242R, N018R-S024R-S101G-V104I, N018R-S024R-S101G-V104I-A232V, N018R-S024R-S242R, N018R-S024R-V104I-H249R, N018R-S024R-V244R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-Q245R, N018R-S101G-S103A-H249R, N018R-S101G-S103A-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-A232V-H249R, N018R-S101G-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-H249R, N018R-S103A-A232V-H249R, N018R-S103A-V104I-H249R, N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R, N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-T22K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-V104I-A232V-H249R, N043A-N062Q-A194F-G211Q, N043A-T057R-N117F-S144R-N183D, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-R045T-N076D-H249R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-N076D-S242R-H249R, N043R-N116A-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, N043R-S101A-N116A-N269R, N043R-S101A-N116A-T213A-A215F-N269R, N043R-S101A-N269R, N043R-S101A-T213A-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N043R-S242R-H249R, N043R-T213A-A215F-N269R, N062Q-S103N-N117F-A194F, N062Q-S103N-V121F-S144R-H249R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N076D-S103A-V104I-Q109R, N076D-S103A-V104I-Q109R-Q245R, N076D-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-S212P-Q245L-E271V, N076D-S87R-S103A-V104I-S212P-E271V, N117F-A194F-T213A-A270C, N117F-T213A-A215F, P052N-S078R-S103N-L148I-T213A, P052N-S103N-N116A-L148I-Y192W, R019H-G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S009A-G020R-N043R-S212F, S009A-G020R-N043R-W241R, S009A-G020R-S024R-N043R, S009A-N043R-S078R, S009A-N043R-S078R-S242R, S009A-N043R-S212F, S009A-N043R-W241R, S009A-T022R-N043R-S078R, S009A-T022R-S078R-S212F, S009A-T022R-S078R-S212F-W241R, S009A-T022R-S212F-W241R, S024R-A215F-N269R, S024R-A232V-Q245R, S024R-G025R-N183D-Y192W-P239S, S024R-N043A-N117F-A194F-G211Q, S024R-N043D-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-A215F, S024R-N043R-A230E, S024R-N043R-A230E-S242R, S024R-N043R-H249R, S024R-N043R-N076D-H249R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-N116A-A215F, S024R-N043R-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-N116A-N269R, S024R-N043R-N116A-T213A-N269R, S024R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, S024R-N043R-R045T-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-T213A-N269R, S024R-N043R-R045T-S242R, S024R-N043R-R045T-T213A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101A-A215F, S024R-N043R-S101A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101A-N116A, S024R-N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-S242R, S024R-N062Q-V104L-S106G-H249R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N076D-V104I-A232V-Q245R, S024R-N116A-T213A-N269R, S024R-R045T, S024R-R045T-N076D-A230E-S242R-H249R, S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S078R-S212F, S024R-S078R-V104L-N116A-N183D, S024R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101A-H120F-A194F-H249R, S024R-S101A-N269R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S024R-S101G-V104I-Q245R, S024R-S103A-Q245R, S024R-S103A-V104I-A232V-H249R, S024R-S103A-V104I-H249R, S024R-S103A-V104I-Q245R, S024R-Y167W-T224A-H249R, S078R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S078R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S078R-S103N-S106G-Y167W-Q236N, S078R-V104L-T213A-A215F-T224A, S078R-Y091F-V121F-L233C-N252R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S087R-S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S099F-S144R-Y167W-N252R, S101A-H120F-Y192W-A215F-T224A, S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-V244R-Q245R, S101G-S103A-V104I-G115R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-Q109R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-S212F-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, S105T-S128N-S144R-L148I-S212M, S106G-N117F-N238L, S144R-G211Q-N238L-P239S-H249R, T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S078R-Y167W-S212M-A270C, T057R-E089I-I198L, T057R-S099F-S105T-I198L-T213A, T057R-S099F-V121F-N185I-Y192W, T057R-Y167W-H249R, V004R-G020R-H249R, V004R-G020R-N043R, V004R-G020R-S024R, V004R-G020R-S024R-H249R, V004R-G020R-S024R-N043R, V004R-G020R-S024R-N043R-S242R, V004R-G020R-S024R-V244R, V004R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-S009A-G020R-N043R, V004R-S009A-G020R-N043R-S242R, V004R-S009A-G020R-S024R-S242R, V004R-S009A-G020R-S242R, V004R-S009A-N043R-W241R, V004R-S009A-S024R-N043R-W241R, V004R-S009A-S078R-W241R, V004R-S009A-W241R, V004R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V104L-L217E-T224A-H249R-N252R, V104L-T213A-S216F, V121F-N252R-A270C и Y091F-S099F-S101A-S105T-Y167W, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен с помощью одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где варианты протеазы представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, A232V-Q245R, E089I-N117F-N185I-A215F-L233C, G020R-E089I-L217E, G020R-G023A-V104L-Y192W-L233C, G020R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-N043R-N076D-A230E-H249R, G020R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N116A-A215F-N269R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-R045T-N116A-N269R, G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-A215F, G020R-S024R-K27R-N043D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S024R-N043R-N076D, G020R-S024R-N043R-R045T-A215F, G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-T38I-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A131V-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R-E271G, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-T180A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-A232V-Q245R-, G020R-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S242R-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-I198L-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-I198L-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A114T-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S103A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G025R-N043A-Y091F-I198L-A270C, G025R-S105T-S128N-S144R-A270C, G046R-E089I-S099F-R186K-S212M, G118R-A172V, G118R-A194T, G118R-Y209A-K235F, H017Y-S024R-T033S-P086W, I008T-S024R, K027R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, K027R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, K235F-N243F, N018R-G020R-H249R, N018R-G020R-N043D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E-S242R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S242R, N018R-G020R-N043D-R045T-S240P, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043R, N018R-G020R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043R-N076D-A230E-S242R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-S242R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-L217E-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-G020R-T22W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043R-N076D-A230E-S242R-H249R, N018R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043R-N076D-S242R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-A230E-S242R, N018R-N043R-R045T-N076D-S076T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A273T, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043R-R045T-N076D-S242R, N018R-N043R-R045T-S242R, N018R-N076D-H249R, N018R-N076D-Q245R, N018R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-N076D-S103A-V104I-H249R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-A230E-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N043D-S242R, N018R-S024R-N043D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N043R-R045T-A230E-H249R, N018R-S024R-N076D, N018R-S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198M-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-L088I-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-V268G, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-Y209H-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-M117I-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G-A232V, N018R-S024R-N076D-S103A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-V104I, N018R-S024R-Q245R, N018R-S024R-R045T-A230E-S242R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-S242R, N018R-S024R-V104I, N018R-S024R-V30S-L31S-D32I-T33Q-G34V-I35F, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S101G-V104I, N018R-S103A, N018R-S103A-V104I-A232V, N018R-T022K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-V104I, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-A272V, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-R275S, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-V234I-Q245R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-N218S-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N062Q-S101A-Q236N-N252R-A270C, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, P005S-S024R-T033S-N243F, P014L-G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-A215F, P052N-V104L-N183D-S216F-H249R, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, Q012H-G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, R045T-S242R-H249R, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-G046R-Y091F-V121F, S024R-G118R-K235F, S024R-N043A-S105T-S106G-I198L, S024R-N043D-R045T-S242R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043D-S242R-H249R, S024R-N043R-N076D, S024R-N043R-N076D-A230E-S242R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S242R-H249R, S024R-N043R-S101A-T213A, S024R-N076D-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-M175L-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-Q245R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-V104I-Q245R, S024R-N243F, S024R-P086R-G118R, S024R-P086W-Y209A-K235F, S024R-P239Q, S024R-Q245R-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101G, S024R-S101G-Q245R, S024R-S101G-V104I-H249R, S024R-S103A-A232V, S024R-S103A-M175L-A232V-H249R, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T033S-A194T, S024R-T033S-G118R-K235F, S024R-T033S-G118R-Y209A, S024R-T033S-K235F, S024R-T033S-S078R-G118R, S024R-T033S-S078R-N243F, S024R-T033S-Y209A, S024R-T033S-Y209A-N243F, S024R-T274I, S024R-V104I-H249R, S024R-V104I-Q245R, S024R-Y091F-I198L-A215F-P239S, S024R-Y209A, S024R-Y209A-K235F, S024R-Y209A-S242P, S078R-P086W, S078R-S099F-N116A-R186K-T224A, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-A232V, S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, S101G-S103A-V104I-Q245R, S105T-G211Q-S216F, S106G-N185I-S216F-Q236N, T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, T033S-G118D-A138V-Y209A, T033S-G118R-Y209A-, T033S-L148F, T033S-N243F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, T033S-Y209A-K235F, V004M-N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, V104I-A232V-H249R и V104L-H120F-R186K-S216F-N252R, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен с помощью одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где варианты протеазы представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A015T-T033S, A016T-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, A230E-H249R, A232V-H249R, E089I-S105T-N116A-A215F-S216F, E089I-Y091F-N185I-G211Q-A270C, G020R-A090S-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-N043R-N076D, G020R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-P052N-S101A-I198L-L233C, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S024R-N043D-N076D-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G115E-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-T274I, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022R-N269R, G020R-T022R-S078R-S212F-W241R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-N269S, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-T274I, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-N263S, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A232V-Q245R, G025R-N062Q-S128N-S144R-N185I, G025R-N116A-H120F-T224A-A270C, G118R-K235F, K027R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018K-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043R-R045T-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-G020R-N076D, N018R-G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-S024R-N076D-A131T-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-N243D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R-N269S, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N204D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R-N269D, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-N043D-A230E-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272D, N018R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043R-N076D-S242R, N018R-N043R-R045T-A230E-S242R, N018R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-A232V-H249R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-I198T-A232V, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-N076D-S101G-V104I, N018R-N076D-S242R, N018R-N076D-S242R-H249R, N018R-N076D-V104I-Q245R-H249R, N018R-R045T-H249R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N043D-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-S024R-N076D-A086V-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-A232V, N018R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-L217E-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-A150T-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R-A248T, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R-A270V, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-V197A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G, N018R-S024R-N076D-S101G-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V, N018R-S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-S024R-N076D-S103A-V104I-L135I-A232V, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R-T260K, N018R-S024R-N076D-V150L-S242R-H249R, N018R-S024R-R045T-A230E-H249R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A209V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-Y209H-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R-L267I, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116T-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-Y209H-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-V104I-A232V, N043A-Q059A-S101A-S216F-T224A, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S242R-H249R, N043R-A230E-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103T-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, N043R-R045T-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, N076D-A232V-Q245R, N076D-Q245R, N076D-S101G-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N076D-S101G-V104I-H249R, N076D-S101G-V104I-Q245R, N076D-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-Q245R, N076D-V104I-A232V-Q245R, N076D-V104I-Q245R, P005S-N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, P086W-K235F, P086W-Y209A-K235F, Q012H-V104A-G118R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-G118R-N243F-R269H, S024R-K235F-N243F, S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-N076D-A230E-H249R, S024R-N076D-A232V-H249R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N076D-S101G, S024R-N076D-S101G-A232V-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-A232V, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-M175L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, S024R-N076D-S103A-H249R, S024R-N076D-S103A-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-R045T-S242R-A273V, S024R-R247H, S024R-S101G-S103A, S024R-S101G-S103A-A232V, S024R-S101G-S103A-V104I, S024R-S103A-Q245R-H249R, S024R-S103A-V104I, S024R-S106G-N116A-S212M-T224A, S024R-T033S-A151V, S024R-T033S-A174V-K235F, S024R-T033S-A228T, S024R-T033S-K235F-W241R, S024R-T033S-N243F, S024R-V104A, S024R-V104I-A232V, S024R-Y209A-N243F, S078R-K235F, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S099F-S105T-S106G-A194F-S212M, S101G-H249R, S101G-S103A-V104I, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S103A-A232V, S103A-A232V-H249R, S103A-A232V-Q245R, S103A-V104I-Q245R, S103N-H120F-Y167W-I198L-L233C, T022W-A194F-T213A-L233C-N238L, T022W-E089I-S216F, T033S-A048T, T033S-P086W-S156L-Y209A, T033S-P239T, T033S-T253A, T057R-N183D-Q236N, T143A-Y209A, V004E-T033S-S078R, V004R-S009A-T022R-S078R-S212F, Y209A-K235F, N043R-N076D-H249R, N018R-R045T, G020R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T, S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-R045T-H249R, N043R-N076D-S153A-H249R, N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043D-N076D-H249R, G020R-N043R-N076D-V227I, L111I-A215F-P239S, S024R-N116A-R186K-L233C-Q236N, G023A-S103N-S106G-S212M-A215F, Y209A-N243F, S024R-T033S-P129H-N184D-T253M, S024R-A085V-P086W-G118R-K235F, S024R-A272P, S024R-R269C, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-N076D-V104I, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R-N263D, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-R269H, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-Y166F-A176P-A179V-N184T-A187P-A194P, N018R-T022W-S024R-D041E-N076D-S101A-S160T-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I, N018R-N076D-S101G-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-L031F-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R-N269S, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N114T-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R-T260A, N076D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N076D-V104I-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, S101G-S103A-A232V, S024R-N076D-S101G-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A156V-N183D-G211Q-A215F-H249R-N269S, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-N076D-S101G, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-N237D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R-R275S, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-H249R, N018R-N076D-S103A-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-D175E-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-A273E, G020R-S024R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, P005S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-S024R-V068A-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R-R275S, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-L217E-S242R-H249R, N076D-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-S242R-Q245R, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где общий заряд получен с помощью одной или более замен, выбранных из: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F и E271L, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В другом аспекте авторы изобретения обнаружили, что предпочтительные протеазы включают по меньшей мере одну, или даже две, или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из: N062E, S101D, P129E, A158E, G159D/E, S166D и/или S188D. Такие протеазы особенно предпочтительны для включения в моющие композиции, подходящие для добавления в воду для получения моющей жидкости, предпочтительно обладающей низкой ионной силой или низкой концентрацией моющего средства. Таким образом, в предпочтительном аспекте настоящего изобретения данные протеазы будут формировать часть моющей композиции, которую добавляют в воду, либо для мытья рук, либо процесса мытья в моющей машине, как правило в моющей машине, для образования моющей жидкости, чья проводимость составляет от приблизительно 0,1 мСм/см до приблизительно 3 мСм/см, от приблизительно 0,3 мСм/см до приблизительно 2,5 мСм/см или даже от приблизительно 0,5 мСм/см до приблизительно 2 мСм/см.
В дополнительном аспекте такие протеазы, которые включают по меньшей мере одну, или даже две, или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из: N062E, S101D, P129E, A158E, G159D/E, S166D и/или S188D, имеют заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно 0, -1, -2 или -3, наиболее предпочтительно -1 или -2 по отношению к ферменту с SEQ ID NO:1.
В соответствии с настоящим изобретением особенно предпочтительные протеазы для применения в настоящем изобретении:
(a) включают одну или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из: N062E, S101D, P129E, A158E, G159D/E, S166D и/или S188D;
(b) имеют заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно 0, -1, -2 или -3, наиболее предпочтительно -1 или -2 по отношению к ферменту с SEQ ID NO:1; и
(c) включают одну, две, три или более мутаций для достижения требуемого суммарного заряда, выбранные из группы, включающей: G20K, S024R, G118R, Q245R, H249R и/или E271F/L.
Под “мутации для достижения требуемого суммарного заряда” следует понимать, что если вариант фермента сравнивают с протеазой субтилизин GG36 Bacillus lentus, то общий заряд варианта по отношению к субтилизину GG36 Bacillus lentus может быть скорректирован для нахождения в пределах предпочтительного диапазона при помощи выбора одной или более дополнительных мутаций, предпочтительно выбранных из указанных мутаций, например, перечисленных выше в подпункте (с).
Предпочтительно эти предпочтительные протеазы формируют часть моющей композиции, которую добавляют в воду в способе либо ручного мытья, либо для мытья в машине, как правило в моющей машине, с формированием моющей жидкости, чья проводимость составляет от приблизительно 0,1 мСм/см до приблизительно 3 мСм/см, от приблизительно 0,3 мСм/см до приблизительно 2,5 мСм/см или даже от приблизительно 0,5 мСм/см до приблизительно 2 мСм/см.
Не желая быть связанным теорией, считается, что эти мутации для достижения требуемого суммарного заряда обеспечивают повышенное общее протеазное действие путем обеспечения оптимального заряда молекулы для условий с низкой ионной силой или моющих жидкостей, включающих низкую концентрацию моющего средства - лишь за счет точного сочетания определенных мутаций, из которых данные являются предпочтительными, с тем, чтобы можно было получить предпочтительные протеазы.
В другом аспекте авторы изобретения обнаружили, что предпочтительные протеазы включают по меньшей мере одну, или две, или более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из: N018R, G020K/R, T022R, S024R, N043R, Q245R, H249R и/или N269R. Такие протеазы особенно предпочтительны для включения в моющие композиции, которые будут добавляться в воду для получения моющей жидкости, предпочтительно имеющей высокую ионную силу или высокую концентрацию моющего средства. Например, эти предпочтительные протеазы могут формировать часть моющей композиции, которую добавляют в воду либо для ручного мытья, либо для мытья в машине, как правило, в моющей машине, для формирования моющей жидкости, чья проводимость составляет от приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см.
В дополнительном аспекте такие протеазы включают по меньшей мере одну, или две, или даже более заряженных мутаций, выбранных из группы, состоящей из: N018R, G020K/R, T022R, S024R, N043R, Q245R, H249R и/или N269R, имеют заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно +1, +2 или +3, наиболее предпочтительно +2 по отношению к ферменту с SEQ ID NO:1.
Особенно предпочтительные протеазы:
(a) включают одну, или две, или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: N018R, G020K/R, T022R, S024R, N043R, Q245R, H249R и/или N269R;
(b) имеют заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно +1, +2 или +3, наиболее предпочтительно +2 по отношению к ферменту с SEQ ID NO:1; и
(c) включают мутации для достижения требуемого суммарного заряда, выбранные из группы, состоящей из: N043D, R045T, N076D и/или A230E.
Предпочтительно эти протеазы формируют часть моющей композиции, которую добавляют в воду либо для ручного мытья, либо мытья в моющей машине, как правило, в моющей машине, для формирования моющей жидкости, чья проводимость составляет от приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см.
Не желая быть связанным теорией считается, что эти мутации для достижения требуемого суммарного заряда обеспечивают повышенное общее протеазное действие в условиях высокой ионной силы или высокой концентрации моющего средства - лишь за счет точного сочетания определенных мутаций, из которых данные являются предпочтительными, с тем, чтобы можно было получить предпочтительные протеазы.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет полипептиды, включающие варианты протеазы, имеющие одну или более из следующих характеристик: a) эффективность по способу тестирования 2 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) эффективность по способу тестирования 3 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; c) эффективность по способу тестирования 4 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) эффективность по способу тестирования 6 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5. Способ тестирования 2, способ тестирования 3, способ тестирования 4 и способ тестирования 6 подробно описываются выше в разделе "Пример 1" под заголовком “Способы тестирования”.
Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения
Настоящее изобретение предоставляет выделенные, не встречающиеся в природе или рекомбинантные нуклеиновые кислоты (также называемые в настоящем изобретении как “полинуклеотиды”), которые собирательно могут называться “нуклеиновые кислоты настоящего изобретения” или “полинуклеотиды настоящего изобретения”, которые кодируют полипептиды настоящего изобретения. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, включая все описанные ниже, пригодны при рекомбинантном получении (например, экспрессии) полипептидов настоящего изобретения, как правило посредством экспрессии плазмидных векторов экспрессии, включающих последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид или его фрагмент. Как обсуждалось выше, полипептиды включают полипептиды вариантной протеазы, включая полипептиды вариантного субтилизина, обладающие ферментативной активностью (например, протеолитической активностью), которые пригодны в применениях, связанных к очисткой, и очищающих композициях для очистки предмета или поверхности (например, поверхности предмета), нуждающегося в очистке.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенную, рекомбинантную, по существу чистую или не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую любой полипептид (включая любой гибридный белок и т.д.) настоящего изобретения, описанный выше в разделе под заголовком "Полипептиды настоящего изобретения" и в других разделах в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также предоставляет выделенную, рекомбинантную, по существу чистую или не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую комбинацию из двух или более любых полипептидов настоящего изобретения, описанных выше и в других разделах в настоящем изобретении.
Также представлена выделенная, рекомбинантная, по существу чистая или не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота, включающая полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариантную протеазу, обладающую протеолитической активностью, причем указанная вариантная протеаза (например, вариантный субтилизин) включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по 50, не более чем по 40, не более чем по 30, не более чем по 35, не более чем по 25, не более чем по 20, не более чем по 19, не более чем по 18, не более чем по 17, не более чем по 16, не более чем по 15, не более чем по 14, не более чем по 13, не более чем по 12, не более чем по 11, не более чем по 10, не более чем по 9, не более чем по 8, не более чем по 7, не более чем по 6, не более чем по 5, не более чем по 4, не более чем по 3, не более чем по 2 аминокислотным остаткам или не более чем по 1 аминокислотному остатку, где аминокислотные положения вариантного субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено путем выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X1R, X2W, X2M, X2R, X2A, X2S, X3R, X4R, X4C, X4S, X8A, X9F, X9W, X9A, X10S, X10M, X10H, X10A, X12R, X12F, X14K, X14F, X14Q, X15R, X15F, X16S, X17R, X17M, X17F, X18R, X18K, X20F, X20R, X20K, X22Y, X22A, X22R, X22V, X22Q, X22W, X22L, X23F, X23S, X23A, X24W, X24R, X24H, X24F, X24Q, X24L, X25V, X25F, X25R, X26F, X27V, X27F, X27L, X27R, X28N, X28E, X28A, X29T, X30E, X31F, X33D, X33G, X33S, X34P, X35M, X36F, X36R, X36T, X38L, X38F, X38R, X40L, X40W, X40N, X40R, X40T, X40H, X42I, X43D, X43I, X43R, X43M, X43F, X43W, X43S, X43A, X45T, X46R, X48R, X50C, X51H, X51W, X51F, X52F, X52E, X52N, X55Y, X57R, X59R, X59A, X59F, X60A, X60Q, X60P, X62E, X62Q, X63I, X63V, X63T, X63P, X63D, X63M, X63H, X63Q, X63E, X63A, X63S, X64F, X64T, X68C, X68A, X69N, X69P, X69W, X69T, X71G, X72C, X74C, X75F, X75A, X75R, X75E, X76D, X78I, X78R, X78N, X79W, X79Q, X81R, X82V, X82T, X82F, X82M, X82R, X85M, X86L, X86I, X86W, X89P, X89T, X89V, X89G, X89W, X89H, X89F, X89L, X89I, X91N, X91F, X92F, X94N, X99G, X99F, X99M, X99T, X99P, X100I, X100S, X100N, X100Q, X101N, X101A, X101G, X101P, X101F, X101E, X101T, X101D, X102H, X102N, X102E, X102T, X102A, X103G, X103D, X103N, X104D, X104E, X104I, X104L, X105Q, X105E, X105T, X106F, X106V, X106G, X106E, X106T, X106D, X106A, X107F, X107M, X108G, X108I, X109M, X111V, X111I, X112V, X112L, X112Q, X114G, X115K, X115R, X116A, X116K, X116L, X117F, X118I, X118R, X119C, X120F, X120A, X120R, X121E, X121F, X123G, X123E, X124S, X128F, X128H, X128I, X128L, X128Q, X128N, X128M, X128D, X129E, X132E, X132A, X138G, X144R, X147L, X148I, X158E, X158E, X159E, X159C, X160D, X166D, X166E, X167W, X175V, X177C, X181A, X182R, X183F, X183I, X183D, X183R, X183M, X185E, X185I, X185V, X186H, X186K, X188R, X188E, X188D, X192H, X192W, X194V, X194F, X194E, X197F, X198L, X198F, X203E, X203C, X208S, X209N, X209F, X209E, X209S, X209H, X209G, X209T, X209L, X210R, X210V, X210L, X211R, X211Q, X212I, X212M, X212F, X213A, X214F, X215F, X215N, X215D, X215H, X215E, X216F, X216A, X217N, X217E, X217D, X218P, X218D, X218E, X224A, X224G, X227I, X230E, X231I, X231C, X233C, X234F, X235F, X236F, X236N, X238L, X238K, X238R, X239K, X239S, X239T, X239G, X239H, X239R, X239N, X239F, X240R, X241R, X242L, X242R, X243R, X243F, X244R, X246S, X248I, X248V, X248R, X249R, X249T, X250I, X251S, X251R, X252I, X252F, X252H, X252R, X253F, X253I, X253R, X254C, X256N, X258R, X260V, X260I, X262H, X262D, X263F, X265F, X267N, X267V, X267M, X269I, X269R, X270C, X271F, X271V, X271I, X271P, X271H, X271M, X271T, X271L, X271A, X272F, X272R, X272F, X273I, X273F и X274G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие субтилизин Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X16S, X18R,X20R, X22A, X24R, X43R/D, X45T, X76D,X101A, X103G, X104L, X111V, X128N, X148I, X230E, X242R и X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие субтилизин Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X1R, X230E, X271L, X115R, X20R, X249R, X235F, X27V/F/L, X75E, X82R, X18R, X269R, X43D, X43R, X76D, X45T, X212F, X242R, X24R, X78R, X9A, X22R, X121E, X244R, X28E, X30E, X4R и X241R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие субтилизин Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X062E-X158E, X103G-X158E, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X089P-X158E, X111V-X158E, X022A-X158E, X101A-X158E, X148I-X158E, X129E-X158E, X022A-X089P, X016S-X089P, X062E-X089P, X062E-X271F, X158E-X271F, X186H-X271F, X129E-X271F, X111V-X271F, X209E-X271F, X016S-X271F, X188D-X271F, X022A-X271F, X159E-X271F, X104L-X271F, X101A-X271F, X089P-X271F, X128N-X271F, X103G-X271F, X148I-X271F, X249R-X271F, X062E-X159E, X016S-X159E, X128N-X159E, X148I-X159E, X111V-X159E, X089P-X159E, X022A-X159E, X129E-X159E, X103G-X159E, X104L-X159E, X158E-X159E, X101A-X159E, X158E-X249R, X111V-X249R, X129E-X249R, X062E-X249R, X016S-X249R, X186H-X249R, X148I-X249R, X159E-X249R, X101A-X249R, X188D-X249R, X104L-X249R, X209E-X249R, X022A-X249R, X128N-X249R, X103G-X249R, X089P-X249R, X022A-X111V, X101A-X111V, X016S-X111V, X104L-X111V, X062E-X111V, X103G-X111V, X089P-X111V, X016S-X148I, X062E-X148I, X022A-X148I, X129E-X148I, X104L-X148I, X103G-X148I, X128N-X148I, X101A-X148I, X089P-X148I, X111V-X148I, X016S-X062E, X022A-X062E, X062E-X129E, X022A-X129E, X128N-X129E, X016S-X129E, X101A-X129E, X104L-X129E, X089P-X129E, X103G-X129E, X111V-X129E, X062E-X186H, X128N-X186H, X101A-X186H, X022A-X186H, X016S-X186H, X158E-X186H, X089P-X186H, X129E-X186H, X159E-X186H, X103G-X186H, X104L-X186H, X111V-X186H, X148I-X186H, X062E-X101A, X022A-X101A, X016S-X101A, X089P-X101A, X062E-X103G, X022A-X103G, X016S-X103G, X101A-X103G, X089P-X103G, X062E-X128N, X016S-X128N, X022A-X128N, X101A-X128N, X104L-X128N, X089P-X128N, X103G-X128N, X111V-X128N, X111V-X188D, X062E-X188D, X016S-X188D, X148I-X188D, X022A-X188D, X128N-X188D, X101A-X188D, X104L-X188D, X089P-X188D, X129E-X188D, X159E-X188D, X186H-X188D, X103G-X188D, X158E-X188D, X016S-X022A, X016S-X104L, X022A-X104L, X101A-X104L, X062E-X104L, X103G-X104L, X089P-X104L, X159E-X209E, X111V-X209E, X101A-X209E, X016S-X209E, X128N-X209E, X148I-X209E, X129E-X209E, X062E-X209E, X022A-X209E, X103G-X209E, X158E-X209E, X188D-X209E, X104L-X209E, X089P-X209E и X186H-X209E, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X241R, X020R-X241R, X024R-X241R, X009A-X241R, X020R-X241R, X004R-X241R, X043R-X241R, X078R-X241R, X022R-X241R, X115R-X241R, X001R-X241R, X212F-X241R, X082R-X241R, X018R-X244R, X024R-X244R, X078R-X244R, X020R-X244R, X212F-X244R, X009A-X244R, X082R-X244R, X001R-X244R, X043R-X244R, X022R-X244R, X004R-X244R, X115R-X244R, X241R-X244R, X242R-X244R, X001R-X004R, X009A-X022R, X018R-X022R, X020R-X022R, X004R-X022R, X001R-X022R, X024R-X242R, X018R-X242R, X004R-X242R, X020R-X242R, X212F-X242R, X082R-X242R, X078R-X242R, X001R-X242R, X009A-X242R, X022R-X242R, X115R-X242R, X043R-X242R, X241R-X242R, X018R-X212F, X022R-X212F, X004R-X212F, X024R-X212F, X001R-X212F, X115R-X212F, X020R-X212F, X009A-X212F, X043R-X212F, X078R-X212F, X082R-X212F, X009A-X078R, X020R-X078R, X024R-X078R, X022R-X078R, X018R-X078R, X004R-X078R, X001R-X078R, X043R-X078R, X022R-X024R, X020R-X024R, X018R-X024R, X001R-X024R, X004R-X024R, X009A-X024R, X004R-X009A, X001R-X009A, X242R-X269R, X024R-X269R, X020R-X269R, X022R-X269R, X249R-X269R, X212F-X269R, X043R-X269R, X244R-X269R, X001R-X269R, X018R-X269R, X078R-X269R, X009A-X269R, X115R-X269R, X241R-X269R, X004R-X269R, X082R-X269R, X018R-X043R, X020R-X043R, X004R-X043R, X022R-X043R, X009A-X043R, X001R-X043R, X024R-X043R, X009A-X018R, X004R-X018R, X001R-X018R, X024R-X082R, X009A-X082R, X018R-X082R, X001R-X082R, X078R-X082R, X020R-X082R, X022R-X082R, X004R-X082R, X043R-X082R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X018R-X249R, X009A-X249R, X212F-X249R, X022R-X249R, X024R-X249R, X115R-X249R, X001R-X249R, X082R-X249R, X242R-X249R, X241R-X249R, X244R-X249R, X078R-X249R, X018R-X115R, X020R-X115R, X022R-X115R, X078R-X115R, X009A-X115R, X004R-X115R, X001R-X115R, X082R-X115R, X043R-X115R, X024R-X115R, X009A-X020R, X018R-X020R, X004R-X020R, X001R-X020R, X009A-X271L, X020R-X271L, X024R-X271L, X244R-X271L, X241R-X271L, X043R-X271L, X022R-X271L, X249R-X271L, X212F-X271L, X115R-X271L, X242R-X271L, X078R-X271L, X004R-X271L, X269R-X271L, X001R-X271L, X018R-X271L и X082R-X271L, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X-43R, X020K-X062E, X024F-X116L, X020K-X024F, X024R-X174T, X024R-X118R, X024R-X235F, X024R-X086R, X024R-X086W, X078R-X118R, X033S-X118R, X033S-X235F, X209A-X241R, X020R-X076D, X018R-X245R, X024R-X045T, X232V-X245R, X118R-X172V, X118R-X194T, X008T-X024R, X235F-X243F, X018R-X103A, X018R-X104I, X086W-X118R, X086W-X243F, X086W-X209A, X024C-X033S, X024R-X232V, X024R-X243F, X024R-X239Q, X024R-X101G, X024R-X141G, X024R-X033S, X024R-X274I, X024R-X209A, X078R-X086W, X101G-X232V, X033S-X148F, X033S-X086W, X033S-X201S, X033S-X078R, X033S-X241R, X033S-X209A, X230E-X249R, X232V-X249R, X118R-X235F, X076D-X245R, X086W-X235F, X024R-X247H, X024R-X104A, X078R-X235F, X101G-X249R, X103A-X232V, X033S-X048T, X033S-X239T, X033S-X253A, X143A-X209A, X209A-X235F, X018R-X045T, X209A-X243F, X024R-X272P, X024R-X269C, X101G-X104I, X104I-X232V, X076D-X249R и X024R-X076D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X076D, X024R-X045T, X230E-X249R, X018R-X045T, X018R-X245R, X101G-X232V, X024R-X232V, X232V-X245R, X024R-X101G, X018R-X104I, X018R-X103A, X101G-X249R, X232V-X249R, X103A-X232V, X076D-X245R, X101G-X104I, X104I-X232V, X076D-X249R, X024R-X076D, X024F-X116L, X020K-X024F, X020K-X062E, X033S-X118R, X024R-X086W, X024R-X118R, X024R-X086R, X209A-X241R, X024R-X241R, X024R-X235F, X118R-X209A, X078R-X118R, X033S-X235F, X024R-X174T, X086W-X209A, X008T-X024R, X086W-X118R, X033S-X241R, X024R-X243F, X024R-X209A, X033S-X086W, X024R-X033S, X086W-X243F, X033S-X201S, X024R-X239Q, X078R-X086W, X235F-X243F, X118R-X172V, X033S-X148F, X033S-X078R, X033S-X243F, X024C-X033S, X118R-X194T, X033S-X209A, X024R-X141G, X024R-X274I, X086W-X235F, X015T-X033S, X209A-X235F, X024R-X247H, X078R-X235F, X024R-X104A, X033S-X048T, X118R-X235F, X033S-X253A, X143A-X209A, X033S-X239T, X209A-X243F, X024R-X272P и X024R-X269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X004R-X009A-X020R-X242R, X020R-X043R-X241R, X020R-X242R-X269R, X004R-X009A-X020R-X043R, X004R-X020R-X249R, X018R-X024R-X244R, X009A-X022R-X212F-X241R, X020R-X043R-X269R, X018R-X024R-X242R, X004R-X009A-X043R-X241R, X020R-X043R-X244R, X020R-X022R-X242R, X004R-X020R-X043R, X004R-X009A-X020R-X043R-X242R, X020R-X043R-X242R, X020R-X043R-X242R-X249R, X020R-X212F-X249R, X004R-X009A-X241R, X001R-X009A-X043R, X020R-X043R-X249R, X009A-X020R-X043R-X241R, X020R-X022R-X043R, X020R-X249R-X269R, X020R-X022R-X241R, X004R-X009A-X024R-X043R-X241R, X009A-X043R-X078R, X004R-X020R-X024R-X244R, X020R-X022R-X078R-X242R, X020R-X024R-X242R-X249R, X004R-X009A-X078R-X241R, X009A-X043R-X078R-X242R, X004R-X020R-X024R, X009A-X043R-X212F, X020R-X043R-X212F, X024R-X078R-X212F, X009A-X020R-X024R-X043R, X009A-X022R-X043R-X078R, X020R-X022R-X212F-X241R, X020R-X043R-X212F-X241R, X009A-X043R-X241R, X020R-X043R-X271L, X020R-X022R-X078R-X241R, X020R-X024R-X043R-X242R, X020R-X022R-X043R-X241R, X009A-X020R-X043R-X212F, X004R-X009A-X020R-X024R-X242R, X020R-X043R-X249R-X271L, X020R-X022R-X024R-X242R, X009A-X022R-X078R-X212F, X020R-X043R-X242R-X271L, X009A-X022R-X078R-X212F-X241R, X004R-X020R-X024R-X249R, X020R-X022R-X271L, X020R-X022R-X043R-X212F, X004R-X020R-X024R-X043R-X242R, X004R-X020R-X024R-X043R, X004R-X009A-X022R-X078R-X212F, X020R-X022R-X078R-X212F-X241R и X020R-X022R-X269R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X020R-X043D-X045T-X230E, X018R-X043R-X045T-X242R-X249R, X024R-X043D-X249R, X018R-X020R-X045T, X020R-X024R-X076D-X249R, X024R-X043R-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X230E, X020R-X076D, X018R-X024R-X043D-X076D-X249R, X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X024R-X045T-X242R, X020R-X043D-X076D-X230E-X249R, X020R-X043R-X045T-X242R, X018R-X024R-X076D-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X045T-X233I-X242R, X024R-X043R-X230E, X018R-X020R-X043D, X043R-X242R-X249R, X020R-X043R-X045T-X230E, X043R-X076D-X242R-X249R, X020R-X024R-X045T-X230E-X242R, X024R-X045T-X076D-X230E-X242R-X249R, X024R-X045T, X024R-X043R-X045T-X076D-X230E-X249R, X018R-X024R-X043D-X045T-X249R, X018R-X043R-X045T-X249R, X024R-X043R-X242R, X018R-X020R-X043R-X076D-X249R, X020R-X024R-X043D-X249R, X020R-X043R-X230E-X242R, X020R-X043R-X242R, X018R-X043R-X076D-X230E, X020R-X024R-X043D-X242R, X020R-X043R-X230E, X018R-X020R-X043R-X076D-X242R-X249R, X043D-X045T-X076D-X249R, X018R-X043R-X242R-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X242R, X018R-X020R-X043D-X230E-X242R, X020R-X024R-X043R-X045T-X249R, X024R-X043R-X249R, X020R-X024R-X27E-X043R-X076D-X230E, X024R-X043R-X045T-X242R, X018R-X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X230E, X020R-X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X043R-X045T-X242R, X020R-X242R-X249R, X018R-X043R-X076D-X230E-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D, X020R-X024R-X27R-X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X242R, X018R-X043R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X230E-X249R, X018R-X020R-X043D-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X242R, X024R-X043R-X076D-X230E-X242R, X020R-X024R-X38I-X043R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X020R-X043R, X018R-X024R-X045T-X230E-X242R, X018R-X020R-X249R, X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X249R, X018R-X043D-X045T-X076D-X242R-X249R, X024R-X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043D-X045T-X242R, X020R-X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X043D-X045T-X230E-X242R, X020R-X024R-X043R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X043R-X045T-X076D-X242R, X018R-X020R-X043R-X076D-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X249R, X018R-X024R-X043R-X045T-X230E-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X249R, X018R-X024R-X242R, X018R-X043R-X045T-X076D-X230E-X242R, X045T-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X242R, X018R-X020R-X043D-X045T-X240P, X024R-X043R-X045T-X242R-X249R, X018R-X024R-X30S-X31S-X32I-X33Q-X34V-X35F, X018R-X020R-X043R-X076D, X020R-X043D-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X230E-X242R, X018R-X024R-X043D-X242R-X249R, X024R-X043D-X045T-X242R-X249R, X043R-X230E-X249R, X024R-X043R-X076D-X230E-X249R, X020R-X024R-X043D-X076D-X249R, X024R-X045T-X242R-X273V, X020R-X024R-X045T-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X242R, X018R-X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X249R, X018R-X043R-X045T-X230E-X242R, X020R-X024R-X043D-X045T-X230E-X242R, X018R-X043D-X230E-X249R, X018R-X043R-X076D-X242R, X018R-X020R-X076D, X018R-X020R-X043D-X076D-X242R-X249R, X020R-X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X043D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043R-X076D, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X249R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X230E-X249R, X018R-X076D-X242R, X020R-X043R-X249R, X018R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X045T-X230E-X249R, X230E-X249R, X018R-X045T-X249R, X020R-X043R-X076D, X043R-X045T-X249R, X018R-X043D-X076D-X242R-X249R, X043R-X076D-X249R, X018R-X045T, X020R-X076D-X230E-X242R, X020R-X024R-X043D-X045T, X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X020R-X045T-X249R, X043R-X076D-X153A-X249R, X043R-X076D-X230E-X249R, X018R-X043D-X076D-X249R и X020R-X043R-X076D-X227I, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R и X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X016S-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024K-X101G-X103A-X104I-X128N-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X232V-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X148I-X188D-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X148I-X159E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D и X101G-X103A-X104I-X128N-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X016S-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X129E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X148I-X158E-X232V-X245R-X248D, X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X188D-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X238R-X245R-X248D, X022A-X024R-X101G-X103A-X104I-X129E-X158E-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X159E-X232V-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X104L-X128N-X158E-X186H-X249R, X128N-X158E-X188D-X249R, X062E-X128N-X158E-X159E-X271F, X062E-X158E-X188D-X249R-X271F, X062E-X158E-X186H-X249R-X271F, X128N-X158E-X188D-X209E-X271F, X062E-X159E-X188D-X249R, X016S-X062E-X158E-X186H-X249R, X062E-X158E-X159E-X249R, X101A-X128N-X158E-X209E-X249R, X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X158E-X188D-X249R, X062E-X158E-X186H-X271F, X062E-X158E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X249R, X062E-X101A-X158E-X186H-X271F, X062E-X104L-X158E-X188D-X249R-X271F, X062E-X159E-X186H-X249R, X062E-X159E-X249R, X128N-X158E-X186H-X249R, X128N-X158E-X188D-X271F, X062E-X158E-X249R, X062E-X186H-X188D-X249R-X271F, X128N-X158E-X209E-, X062E-X101A-X158E-X249R, X104L-X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X101A-X158E-X186H-X249R-X271F, X016S-X062E-X158E-X249R, X062E-X101A-X159E-X249R, X128N-X158E-X186H-X188D-X271F, X101A-X128N-X158E-X186H-X271F, X062E-X101A-X188D-X249R, X101A-X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X159E-X249R-X271F, X128N-X158E-X159E-X271F, X016S-X062E-X104L-X158E-X186H-X271F, X022A-X128N-X158E-X249R, X128N-X158E-X249R, X062E-X101A-X104L-X158E-X186H-X271F, X016S-X062E-X158E-X186H-X271F, X104L-X128N-X158E-X249R, X104L-X128N-X158E-X188D-X249R, X022A-X062E-X158E, X062E-X101A-X188D-X249R-X271F, X062E-X158E-X249R-X271F, X104L-X128N-X158E-X186H-X188D-X271F, X062E-X101A-X186H-X271F, X062E-X104L-X159E-X249R, X062E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X249R-X271F, X101A-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X101A-X186H, X101A-X128N-X129E-X186H-X249R, X101A-X103G-X158E-X186H-X249R, X016S-X062E-X104L-X186H-X188D-X271F, X104L-X158E-X186H-X249R, X101A-X128N-X158E-X188D-X209E-X271F, X062E-X101A-X186H-X188D-X271F, X016S-X062E-X158E-X249R-X271F, X062E-X128N-X158E, X062E-X128N-X159E-X249R, X062E-X101A-X158E-X188D-X249R, X101A-X128N-X158E-X249R, X062E-X158E-X186H-X188D-X249R, X016S-X104L-X158E-X186H-X271F, X062E-X148I-X159E, X062E-X101A-X158E-X186H-X249R, X062E-X101A-X186H-X188D-X249R, X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X062E-X101A-X104L-X186H-X188D-X271F, X022A-X101A-X158E-X186H-X249R, X101A-X128N-X158E-X209E, X158E-X186H-X188D-X249R-X271F, X104L-X158E-X186H-X188D-X249R-X271F, X101A-X104L-X158E-X186H-X249R, X104L-X158E-X249R, X101A-X104L-X128N-X158E-X186H-X271F, X016S-X104L-X188D-X249R, X101A-X104L-X158E-X186H-X188D-X271F, X104L-X128N-X159E-X271F, X104L-X158E-X186H-X249R-X271F, X158E-X186H-X249R, X101A-X158E-X186H-X249R, X104L-X158E-X188D-X249R-X271F, X016S-X128N-X158E-X186H, X104L-X128N-X186H-X188D-X249R, X016S-X101A-X128N-X186H, X016S-X062E-X128N-X186H-X271F, X016S-X128N-X186H-X271F, X128N-X129E-X186H, X158E-X186H-X249R-X271F, X016S-X158E-X249R, X016S-X158E-X186H-X249R, X016S-X022A-X158E-X186H-X271F, X089P-X101A-X129E-X186H, X022A-X128N-X158E-X186H, X101A-X104L-X128N-X158E-X186H, X022A-X128N-X186H-X188D-, X062E-X104L-X158E-X186H-X188D-X249R, X022A-X158E-X186H-X249R-X271F, X022A-X104L-X158E-X249R, X101A-X111V-X129E, X016S-X158E-X249R-X271F, X016S-X111V-X188D-, X022A-X104L-X186H-X188D-X249R и X104L-X148I-X188D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X001R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X004R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X271L, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X004R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X271L, X020R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X025R-X116A-X167W, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X078R-X103N-X106G-X167W-X236N, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X101A-X120F-X194F-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X212F-X232V-X245R, X020R-X144R-X185I-X233C-X236N, X023A-X078R-X216F-X236N-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X115R-X232V-X245R, X052N-X078R-X103N-X148I-X213A, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X025R-X089I-X116A-X239S-X270C, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X148I-X213A-X252R, X024R-X025R-X183D-X192W-X239S, X046R-X194F-X212M, X104L-X217E-X224A-X249R-X252R, X023A-X091F-X121F-X192W-X236N, X101G-X103A-X104I-X232V-X244R-X245R, X099F-X144R-X167W-X252R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022W-X078R-X167W-X212M-X270C, X121F-X252R-X270C, X020R-X103N-X216F-X236N-X252R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X023A-X052N-X192W-X198L-X252R, X025R-X046R-X121F, X024R-X078R-X104L-X116A-X183D, X046R-X059A-X103N-X211Q-X212M, X020R-X052N-X062Q-X091F-X192W, X023A-X052N-X144R-X192W-X216F, X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X052N-X103N-X116A-X148I-X192W, X089I-X116A-X117F-X224A-X249R, X144R-X211Q-X238L-X239S-X249R, X043A-X062Q-X194F-X211Q, X020R-X024R-X052N-X059A-X216F, X024R-X167W-X224A-X249R, X057R-X167W-X249R, X025R-X103N-X186K-X194F-X224A, X105T-X128N-X144R-X148I-X212M, X020R-X059A-X144R-X192W-X224A, X024R-X043A-X117F-X194F-X211Q, X117F-X194F-X213A-X270C, X078R-X091F-X121F-X233C-X252R, X057R-X099F-X105T-X198L-X213A, X023A-X091F-X101A-X198L-X252R, X062Q-X103N-X121F-X144R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X023A-X024R-X117F-X212M-X216F, X104L-X213A-X216F, X194F-X211Q-X236N, X062Q-X103N-X117F-X194F, X024R-X062Q-X104L-X106G-X249R, X057R-X089I-X198L, X046R-X059A-X106G-X217E-X249R, X117F-X213A-X215F, X101A-X120F-X192W-X215F-X224A, X043A-X057R-X117F-X144R-X183D, X046R-X183D-X238L, X025R-X043A-X089I-X117F, X078R-X104L-X213A-X215F-X224A, X091F-X099F-X101A-X105T-X167W, X106G-X117F-X238L, X046R-X089I-X091F-X101A-X116A, X020R-X062Q-X089I-X186K-X212M, X057R-X099F-X121F-X185I-X192W, X046R-X089I-X192W-X233C-X270C, X089I-X117F-X185I-X215F-X233C, X052N-X104L-X183D-X216F-X249R, X078R-X099F-X116A-X186K-X224A, X025R-X105T-X128N-X144R-X270C, X105T-X211Q-X216F, X024R-X046R-X091F-X121F, X106G-X185I-X216F-X236N, X062Q-X101A-X236N-X252R-X270C, X025R-X043A-X091F-X198L-X270C, X020R-X023A-X104L-X192W-X233C, X024R-X043A-X105T-X106G-X198L, X020R-X089I-X217E, X024R-X091F-X198L-X215F-X239S, X046R-X089I-X099F-X186K-X212M, X104L-X120F-X186K-X216F-X252R, X022W-X194F-X213A-X233C-X238L, X099F-X105T-X106G-X194F-X212M, X089I-X105T-X116A-X215F-X216F, X025R-X116A-X120F-X224A-X270C, X043A-X059A-X101A-X216F-X224A, X057R-X183D-X236N, X025R-X062Q-X128N-X144R-X185I, X103N-X120F-X167W-X198L-X233C, X022W-X089I-X216F, X024R-X106G-X116A-X212M-X224A, X020R-X052N-X101A-X198L-X233C, X089I-X091F-X185I-X211Q-X270C, X111I-X215F-X239S, X024R-X116A-X186K-X233C-X236N и X023A-X103N-X106G-X212M-X215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116S-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X232V-X245R, X018R-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X103A-X232V-X249R, X018R-X101G-X104I-X232V-X245R, X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X249R, X018R-X22K-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V, X018R-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X018R-X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X215F-X232V-X245R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X245R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X101G-X103A-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I-X232V-X249R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X215F-X232V-X245R, X024R-X103A-X104I-X249R, X018R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X101G-X104I-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X103A-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X245R, X024R-X103A-X245R, X024R-X103A-X104I-X245R, X020R-X078R-X101G-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X104I-X249R, X018R-X024R-X104I-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X019H-X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X103A-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X101G-X104I-X232V, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X101G-X104I, X020R-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X245R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X22W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I-X249R, X020R-X22W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X198L-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X024R-X076D-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G-X104I-X232V-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X001T-X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X101G-X198L-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X024R-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215V-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X020R-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X215F-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X020R-X022W-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X180A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X103A-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X211Q-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X211Q-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X232V-X249R, X018R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X076D-X245R, X024R-X104I-X245R, X101G-X232V, X020R-X22W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X198L-X232V-X245R, X024R-X245R-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X211Q-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X249R, X024R-X101G-X104I-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X104I, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X183D-X198L-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X22W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X012H-X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X198L-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X213A-X249R, X024R-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X249R, X018R-X076D-X103A-X104I-X249R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R-X271G, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X020R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X215F-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X103A-X175L-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X213A-X249R, X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X245R, X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X232V, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X249R, X018R-X024R-X076D-X198M-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X018R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X103A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R-X268G, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X249R, X101G-X103A-X104I-X245R, X018R-X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X103A-X232V, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X043R-X045T-X076D-X076T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X273T, X018R-X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G-X232V, X232V-X245R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X234I-X245R, X024R-X076D-X103A-X104I-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R-X272V, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X103A-X104I-X232V, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X078R-X101G-X103A-X104I-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X117I-X183D-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X232V-X245R, X018R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X209H-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X175L-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X215F-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X215F-X249R, X024R-X076D-X104I-X245R, X027R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X104I, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X076D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X020R-X022W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X114T-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022K-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V, X018R-X024R-X076D-X116A-X249R, X020R-X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X183D-X211Q-X232V-X245R-, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X018R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X078R-X101G-X103A-X104I-X116A-X131V-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X101G-X245R, X024R-X076D-X101G-X245R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X101G, X018R-X22W-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X198L-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X198L-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X104I, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X088I-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X076D-X101G-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R-X269R, X024R-X076D-X245R, X018R-X020R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X22W-X078R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X218S-X232V-X245R, X018R-X103A, X020R-X22W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X024R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X027R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X104I, X101G-X103A-X104I-X232V-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X249R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R-X275S, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X004M-X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X104I-X232V-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R-X274I, X020R-X101A-X103A-X104I-X213A-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X020R-X024R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X103A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R-X270V, X018R-X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X22W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V, X101G-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X175L-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R-X269S, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X213A-X215F-X249R-X260K, X018R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X245R, X024R-X076D-X103A-X249R, X018R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X020R-X024R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X272D, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X101A-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X232V, X024R-X103A-X104I, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X076D-X103A-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X103A-X104I-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X016T-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X215F-X249R, X043R-X076D-X101G-X103T-X104I-X232V-X245R-X249R-X269R, X020R-X078R-X101A-X103A-X104I-X115E-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101G, X076D-X101G-X232V-X245R, X018R-X076D-X101G-X103A-X104I-X245R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X215F-X249R, X018R-X104I-X232V, X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X076D-X101G-X232V-X249R, X103A-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X024R-X076D-X103A-X104I-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X215F-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X131T-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X101G-X103A-X104I-X245R-X249R, X018R-X076D-X232V-X249R, X018K-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R-X267I, X232V-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X024R-X101G-X103A-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X249R, X103A-X232V-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R-X274I, X024R-X103A-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X249R, X103A-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X018R-X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R-X263S, X024R-X076D-X101G-X104I-X232V-X249R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X197A-X213A-X215F-X249R, X024R-X101G-X103A, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X215F-X249R, X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X104I-X232V, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X020R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X150T-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X024R-X076D-X232V-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116T-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X249R, X020R-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X245R, X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X249R, X018R-X22W-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X076D-X101G-X104I-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X209H-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X245R, X076D-X101G-X104I-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X213A-X249R, X020R-X024R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X020R-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X204D-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X209V-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X211Q-X215F-X249R-X269D, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X183D-X215F-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X209H-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X076D-X232V-X245R, X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X213A-X249R, X020R-X024R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R, X020R-X090S-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X043D-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X076D-X103A-X104I-X232V-X245R, X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X076D-X103A-X104I-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101G-X245R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X232V-X245R, X027R-X043R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X103A-X104I-X135I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X249R, X005S-X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X198L-X215F-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X211Q-X243D-X249R, X018R-X020R-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X076D-X101G, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X215F-X249R, X018R-X043D-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X245R, X020R-X024R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R-X269S, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X183D-X213A-X215F-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X086V-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X076D-X101G-X198T-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X183D-X249R-X248T, X018R-X076D-X104I-X245R-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X043R-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X076D-X101G-X104I, X020R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X043D-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X076D-X104I, X018R-X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X101G-X104I, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R-X263D, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X215F-X249R-X269H, X018R-X043D-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X211Q-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X249R, X020R-X022W-X101G-X103A-X104I-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X104I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X043R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X045T-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X166F-X176P-X179V-X184T-X187P-X194P, X018R-X022W-X024R-X041E-X076D-X101A-X160T-X183D-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X198L-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X024R-X076D-X104I, X018R-X076D-X101G-X232V, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X215F-X249R, X018R-X024R-X031F-X076D-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X213A-X249R-X269S, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X215F-X249R, X018R-X043R-X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X114T-X198L-X211Q-X215F-X249R, X024R-X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X024R-X076D-X103A-X104I-X232V, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X101G-X104I-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X213A-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X211Q-X213A-X249R, X018R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X215F-X249R-X260A, X076D-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X213A-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X249R, X076D-X104I-X249R, X020R-X022W-X101A-X103A-X104I-X116A-X183D-X211Q-X213A-X215F-X232V-X245R, X024R-X043R-X045T-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X183D-X198L-X215F-X249R, X018R-X076D-X101G-X103A, X020R-X024R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R, X101G-X103A-X232V, X024R-X076D-X101G-X232V, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X183D-X198L-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X116A-X156V-X183D-X211Q-X215F-X249R-X269S, X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X198L-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X116A-X249R, X018R-X076D-X101G, X018R-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X020R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X198L-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X249R, X018R-X076D-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X232V-X245R, X018R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X022W-X024R-X076D-X183D-X213A-X215F-X249R, X018R-X024R-X076D-X101A-X116A-X211Q-X213A-X237D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X211Q-X249R-X275S, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X215F-X249R, X024R-X076D, X018R-X024R-X076D-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X116A-X183D-X198L-X213A-X215F-X249R, X076D-X104I-X232V-X249R, X018R-X076D-X103A-X232V, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X116A-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X183D-X213A-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X101A-X175E-X183D-X211Q-X215F-X249R, X018R-X020R-X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X217E-X232V-X245R-X273E, X020R-X024R-X043D-X045T-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X005S-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X103A-X104I-X232V, X018R-X020R-X024R-X068A-X076D-X101A-X116A-X213A-X215F-X249R, X018R-X022W-X024R-X076D-X101A-X198L-X215F-X249R-X275S, X018R-X024R-X076D-X183D-X198L-X211Q-X213A-X249R и X043D-X045T-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X018R-X024R-X043R-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X043R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X078R-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X043R-X076D-X249R, X018R-X024R-X076D-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X076D-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X249R-X269R, X018R-X022R-X024R-X043D-X076D-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X078R-X249R, X020R-X101G-X103G-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104L-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101G-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103S-X104L-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104L-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104L-X232V-X245R, X020R-X101S-X103S-X104V-X232V-X245R, X020R-X101S-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101S-X103G-X104I-X232V-X245R, X020R-X101S-X103G-X104V-X232V-X245R, X020R-X101A-X103A-X104V-X232V-X245R, X020R-X101A-X103S-X104I-X232V-X245R, X020R-X101A-X103S-X104V-X232V-X245R, X018R-X024R-X043R-X076D-X078R-X249R, X024R-X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X249R, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X217E-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X217E-X249R, X018R-X024R-X043D-X076D-X242R-X249R, X018R-X020R-X024R-X043R-X076D-X249R, X020R-X101A-X103G-X104V-X232V-X245R, X043D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X076D-X217E-X249R-X269R и X018R-X024R-X076D-X217E-X242R-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X101A-X103A-X104I-X118R-X232V-X245R, X020R-X024R-X116A-X213A, X043R-X101A-X116A-X215F-X269R, X024R-X043R-X101A-X116A, X024R-X043R-X101A-X116A-X215F-X269R, X020R-X101G-X103A-X104I-X215F-X232V-X245R, X043R-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X213A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X213A, X024R-X043R-X116A-X215F-X269R, X020R-X024R-X213A-X215F, X020R-X116A-X269R, X024R-X116A-X213A-X269R, X043R-X101A-X116A-X269R, X101G-X103A-X104I-X116A-X213A-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X045T-X101A-X116A-X215F-X269R, X020R-X043R-X101A-X269R, X101A-X103A-X104I-X213A-X232V-X245R-X269R, X024R-X215F-X269R, X043R-X101A-X116A-X213A-X215F-X269R, X043R-X101A-X213A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X116A-X213A, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X024R-X043R-X045T-X101A-X116A-X213A-X269R, X024R-X043R-X045T-X269R, X020R-X043R-X045T-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T, X043R-X116A-X269R, X024R-X043R-X101A-X215F-X269R, X024R-X043R-X045T-X213A-X215F-X269R, X020R-X024R-X045T-X269R, X020R-X043R-X101A-X116A-X213A-X215F, X020R-X101G-X103A-X104I-X213A-X215F-X232V-X245R, X020R-X024R-X045T-X116A-X269R, X020R-X101A-X116A-X269R, X024R-X043R-X215F, X020R-X024R-X213A, X024R-X043R-X101A-X215F, X020R-X024R-X043R-X045T-X116A, X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X269R, X020R-X024R-X101A-X215F, X020R-X024R-X116A-X213A-X215F, X020R-X024R-X116A, X020R-X024R-X101A-X116A, X043R-X213A-X215F-X269R, X024R-X101A-X269R, X024R-X043R-X116A-X215F, X020R-X038A-X043R-X101A, X020R-X024R-X116A-X215F, X024R-X043R-X101A-X213A, X014L-X020R-X024R-X043R-X045T-X101A-X215F, X020R-X024R-X215F, X020R-X116A-X215F-X269R, X020R-X045T-X116A-X269R, X020R-X024R-X043R-X045T-X215F и X020R-X024R-X043R-X045T-X116A-X213A-X215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X076D-X101G-X103A-X104I-X114V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F и X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X217E-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X043R-X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X166D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R и X076D-X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X017R-X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X101G-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X017R-X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, X022A-X101G-X102A-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F и X022A-X043R-X076D-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101S-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103G-X104V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103G-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103G-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103S-X104V-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104L-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103A-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103S-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103S-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101S-X103A-X104L-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101A-X103G-X104V-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R и X101S-X103A-X104V-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X026F-X051W-X104L-X106E, X026F-X031F-X078N-X102A-X160D, X020K-X100S-X116L-X158E-X166D-X243F, X033S-X043W-X218D-X239G-X243F, X022L-X038F-X048R-X062E-X100S-X186K, X101D-X103N-X116L-X144R-X215D, X104L-X105T-X213A-X217E-X256N, X043W-X101D-X212M-X243F, X026F-X048R-X105T-X213A-X218D-X224A, X024F-X101D-X118R-X215D-X250I-X272F, X121F-X185E-X224A-X239G, X022L-X031F-X102A-X128D-X224A-X243F, X062E-X078N-X102A-X116L-X144R-X250I, X022L-X038F-X121F-X160D-X272F, X026F-X078N-X159C-X186K-X243F, X024F-X048R-X118R-X166D-X217E, X023A-X038F-X078N-X100S-X212M-X215D, X100S-X116L-X158E-X213A, X078N-X104L-X118R-X128D, X102A-X103N-X105T-X194E, X022L-X078N-X128D-X213A, X027R-X100S-X118R-X160D-X188D-X243F, X024F-X102A-X186K-X213A-X217E-X243F, X033S-X105T-X188D-X216F, X023A-X100S-X194E-X212M, X048R-X128D-X185E-X239G, X020K-X024F-X033S-X129E-X194E, X020K-X027R-X129E-X166D-X239G, X022L-X023A-X027R-X101D-X104L-X216F, X033S-X118R-X129E-X194E-X239G, X022L-X078N-X116L-X129E-X256N, X027R-X101D-X103N-X105T-X272F, X048R-X078N-X116L-X185E-X217E-X239G, X023A-X024F-X027R-X062E, X024F-X103N-X104L-X118R-X188D, X026F-X104L-X256N-X272F, X024F-X043W-X104L-X121F-X129E, X062E-X078N-X116L-X224A, X023A-X024F-X051W-X158E, X027R-X038F-X102A-X116L, X062E-X078N-X144R-X212M, X031F-X116L-X256N-X272F, X022L-X033S-X104L-X116L-X160D-X186K, X024F-X118R-X129E-X186K-X213A, X043W-X105T-X213A-X215D-X216F, X031F-X105T-X186K-X188D, X026F-X194E-X213A-X256N и X103N-X160D-X250I-X256N, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D, X022A-X043R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X043R-X101D-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X248D, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X062E-X103A-X104I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X101D-X103A-X104I-X118R-X128I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X043R-X103A-X104I-X128I-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X101D-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D-X271F, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X062E-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X101D-X103A-X104I-X118R-X129E-X159D-X188D-X217D-X232V, X022A-X024R-X103A-X104I-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D, X022A-X024R-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X217D-X232V-X248D-X271F и X022A-X103A-X104I-X118R-X159D-X188D-X217D-X232V-X245R-X248D-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020K-X024F-X062E-X188D-X239G, X024F-X062E-X116L-X239G, X020K-X023A-X062E-X188D, X020K-X023A-X024F-X062E-X118R-X188D-X213A, X020K-X043W-X062E-X116L-X188D-X213A-X239G, X023A-X062E-X116L-X118R, X023A-X024F-X062E-X116L-X118R, X024F-X116L, X024F-X062E-X188D-X213A, X023A-X062E-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X024F-X062E, X020K-X043W-X062E-X116L-X239G, X024F-X062E-X116L-X213A-X239G, X020K-X024F-X043W-X062E-X116L-X213A, X020K-X023A-X024F-X062E-X116L-X188D-X213A, X024F-X062E-X188D-X239G, X023A-X043W-X062E-X116L-X118R-X213A, X062E-X188D-X239G, X020K-X024F-X062E-X239G, X024F-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X023A-X062E-X116L-X118R-X213A, X020K-X023A-X024F-X062E-X188D-X213A-X239G, X024F-X043W-X118R-X188D, X023A-X024F-X116L-X118R-X188D-X213A, X020K-X023A-X043W-X116L-X188D-X213A-X239G, X023A-X024F-X116L-X188D-X239G, X023A-X043W-X116L-X118R-X188D, X023A-X024F-X118R-X188D-X239G, X023A-X024F-X043W-X062E-X116L-X118R, X020K-X043W-X188D-X213A, X024F-X062E-X118R-X239G, X023A-X043W-X188D-X213A, X020K-X024F-X043W-X062E-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X116L-X188D-X239G, X020K-X043W-X062E-X118R, X020K-X043W-X116L-X188D-X213A, X020K-X024F, X023A-X043W-X116L-X239G, X023A-X024F-X043W-X116L-X118R-X188D-X239G, X020K-X023A-X043W-X213A и X023A-X024F-X062E-X118R-X213A-X239G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020K-X023A-X043W-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D, X024F-X118R-X128I-X129E-X159D, X020K-X024F-X062E-X116L-X118R-X188D, X020K-X062E-X116L-X188D, X062E-X116L-X118R-X213A, X020K-X023A-X062E-X116L-X188D, X062E-X116L-X118R-X188D, X020K-X062E-X116L-X213A, X020K-X023A-X062E-X116L, X020K-X062E-X188D-X213A, X020K-X062E, X020K-X024F-X062E-X116L-X188D, X020K-X043W-X062E-X116L-X188D, X020K-X024F-X062E-X188D-X213A, X062E-X116L-X188D-X213A, X020K-X062E-X116L, X020K-X023A-X062E-X116L-X188D-X213A, X023A-X024F-X062E-X116L-X213A, X022A-X043R-X103A-X104I-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X245R-X248D, X022A-X043R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D-X271F, X024F-X062E-X116L-X188D, X022A-X024R-X103A-X104I-X118R-X128I-X129E-X159D-X188D-X232V-X248D, X023A-X062E-X116L-X188D, X043W-X062E-X116L, X020K-X023A-X116L-X188D, X043W-X062E-X116L-X188D, X024F-X062E-X116L, X062E-X116L-X188D и X022A-X024R-X103A-X104I-X128I-X159D-X188D-X232V-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X087R-X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R-X271V, X101G-X103A-X104I-X109R-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R-X271V, X101G-X103A-X104I-X109R-X212P-X232V-X245R, X076D-S87R-X103A-X104I-X212P-X271V, X076D-X103A-X104I-X109R, X076D-X103A-X104I-X212P-X271V, X076D-X103A-X104I-X109R-X245R и X076D-X103A-X104I-X212P-X245L-X271V, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X086W-X118R, X024R-X078R-X086W-X243F, X024R-X033S-X086S-X087N-X209A, X033S-X118R, X024R-X078R-X086W-X118R-X270T, X024R-X033S-X086W-X118R, X078R-X086W-X243F, X033S-X078R-X086W-X118R-X209A, X033S-X078R-X209A, X086W-X118R-X243F, X024R-X086W, X078R-X086W-X235F, X024R-X118R, X024R-X086R, X101G-X103A-X104I-X232V, X024R-X033S-X078R-X086W-X118R, X024R-X118R-X209A, X209A-X241R, X033S-X086W-X243F, X033S-X172V-X209A, X118R-X209A-X243F, X024R-X086S-X141G, X024R-X118R-X209A-X243F, X024R-X033S-X086S-X085N-X235F, X024R-X033S-X133V, X024R-X033S-X078R-X086W, X024R-X086W-X209A, X024R-X241R, X033S-X118R-X243F, X024R-X235F, X024R-X078R-X086W, X024R-X118R-X209A-X235F, X024R-X209A-X241R, X033S-X118R-X241R, X086W-X118R-X209A, X033S-X118R-X159D-X209A, X033S-X078R-X086W, X024R-X086W-X243F, X118R-X209A, X024R-X086W-X118R-X203I, X078R-X209A-X235F, X024R-X033S-X241R, X078R-X118R, X033S-X118R-X209A-X243F, X021M-X024R-X033S, X024R-X033S-X086W, X033S-X235F, X078R-X086W-X209A, X024R-X033S-X209A-X235F, X033S-X086W-X118R, X024R-X033S-X078R-X209A, X033S-X086W-X118R-X209A-X243F, X086W-X209A-X243F, X005S-X078R-X118R-X241R, X024R-X174T, X033S-X209A-X243F, X086W-X118R-X133V, X024R-X033S-X118R, X024R-X086W-X209A-X235F, X086W-X209A, X008T-X024R, X086W-X118R, X033S-X241R, X005S-X024R-X033S-X243F, X024R-X209A-X242P, X024R-X033S-X078R-X118R, X024R-X033S-X194T, X024R-X243F, X024R-X209A, X024R-X033S-X118R-X209A, X033S-X086W, X024R-X033S, X024R-X033S-X078R-X243F, X086W-X243F, X033S-X118D-X138V-X209A, X033S-X209A-X235F, X024R-X086R-X118R, X033S-X201S, X024R-X239Q, X033S-X118R-X209A-, X078R-X086W, X235F-X243F, X024R-X209A-X235F, X118R-X172V, X017Y-X024R-X033S-X086W, X033S-X148F, X024R-X118R-X235F, X033S-X078R, X033S-X243F, X024C-X033S, X118R-X194T, X033S-X209A, X118R-X209A-X235F, X024R-X033S-X209A-X243F, X024R-X033S-X235F, X024R-X033S-X118R-X235F, X024R-X141G, X024R-X274I, X024R-X033S-X209A, X086W-X235F, X024R-X209A-X243F, X004E-X033S-X078R, X086W-X209A-X235F, X015T-X033S, X033S-X086W-X156L-X209A, X024R-X118R-X243F-X269H, X209A-X235F, X024R-X247H, X024R-X033S-X228T, X078R-X235F, X024R-X033S-X174V-X235F, X024R-X235F-X243F, X024R-X033S-X235F-X241R, X024R-X033S-X151V, X024R-X104A, X033S-X048T, X012H-X104A-X118R, X118R-X235F, X033S-X253A, X143A-X209A, X024R-X033S-X243F, X033S-X239T, X209A-X243F, X024R-X033S-X129H-X184D-X253M, X024R-X085V-X086W-X118R-X235F, X024R-X272P и X024R-X269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X020R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X020R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X020R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X020R-X024R-X076D-X150L-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X043R-X076D-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X078R-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X249R-X269R, X018R-X024R-X076D-X087D-X242R-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X150L-X249R, X018R-X024R-X076D-X150L-X249R, X018R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X022R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X022R-X024R-X076D-X150L-X249R, X043R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X043R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X024R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X024R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X078R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X078R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X269R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X249R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X269R, X022R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X076D-X150L-X249R, X043R-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X022R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X018R-X024R-X043D-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X087D-X249R, X018R-X024R-X076D-X150L-X242R-X249R, X043R-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R-X269R, X076D-X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X242R-X245R, X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X245R, X076D-X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X087D-X101G-X103A-X104I-X232V-X245R и X101G-X103A-X104I-X150L-X232V-X242R-X245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X027R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X222Q-X245R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222S-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222Q-X232V-X245R-X248D-X249R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X222Q-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X222S-X245R, X076D-X101G-X103A-X104I-X232V-X222S-X245R, и X076D-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X222S-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X183D-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X128L-X130A-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X130A-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X129Q-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R-X271G, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X130A-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R, X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X158E-X183D-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X129Q-X158E-X188D-X217E-X232V-X245R-X248D-X249R и X024R-X101G-X103A-X104I-X128L-X130A-X158E-X188D-X232V-X245R-X248D-X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I, X22A-X101A-X209E, S103G-L111V-G159E, X22A-X103G-X159E, X22A-X111V-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X103G-X111V, X62E-X111V-X128N, X22A-X111V-X128N, X22A-X62E-X111V, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X101A-X103G-X104L-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L-X159E, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L-X209E, X22A-X209E-X271F, X22A-X101A-X271F и X101A-X209E-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты субтилизина Bacillus от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K и X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X248R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R и X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие субтилизин Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X20R-X43R-X249R, X20R-X22R-X43R, X20R-X43R-X242R, X20R-X43R-X271L, X20R-X43R-X244R, X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X22R-X78R-X212F-X241R, X9A-X20R-X43R-X212F, X9A-X43R-X212F, X20R-X43R-X212F, X20R-X22R-X43R-X212F, X24R-X78R-X212F, X9A-X43R-X78R, X9A-X43R-X78R-X242R, X9A-X20R-X43R-X78R, X20R-X24R-X43R-X78R-X242R, X22R-X24R-X78R-X212F, X9A-X20R-X43R-X78R-X242R, X20R-X43R-X78R-X249R, X20R-X43R-X78R, X9A-X78R-X212F, X9A-X22R-X43R-X78R, X9A-X20R-X24R-X43R, X9A-X22R-X78R-X212F, X4R-X9A-X22R-X78R-X212F, X20R-X24R-X43R, X1R-X9A-X43R, X20R-X24R-X43R-X115R, X9A-X24R-X43R, X20R-X22R-X24R-X43R, X1R-X24R-X43R, X9A-X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X20R-X22R-X78R-X212F, X9A-X24R-X43R-X244R, X9A-X24R-X43R-X242R, X4R-X9A-X22R-X24R-X212F и X22R-X24R-X43R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus от субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248R, и X101G, X103A, X104I, X232V, X236H, X245R и X252K, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие субтилизин Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X16S, X22A, X24R, X62E, X76D, X89P, X101A/G, X103G/A, X104L/I, X111V, X128N, X129E, X232V, X148I, X158E, X159D/E, X166D, X186H, X188D, X209E, X236H, X238R, X245R, X248D/R, X249R, X252K/R, X253R и X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие субтилизин Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N062E-A158E, S103G-A158E, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, E089P-A158E, L111V-A158E, T022A-A158E, S101A-A158E, L148I-A158E, P129E-A158E, T022A-E089P, A016S-E089P, N062E-E089P, N062E-E271F, A158E-E271F, R186H-E271F, P129E-E271F, L111V-E271F, Y209E-E271F, A016S-E271F, S188D-E271F, T022A-E271F, G159E-E271F, V104L-E271F, S101A-E271F, E089P-E271F, S128N-E271F, S103G-E271F, L148I-E271F, H249R-E271F, N062E-G159E, A016S-G159E, S128N-G159E, L148I-G159E, L111V-G159E, E089P-G159E, T022A-G159E, P129E-G159E, S103G-G159E, V104L-G159E, A158E-G159E, S101A-G159E, A158E-H249R, L111V-H249R, P129E-H249R, N062E-H249R, A016S-H249R, R186H-H249R, L148I-H249R, G159E-H249R, S101A-H249R, S188D-H249R, V104L-H249R, Y209E-H249R, T022A-H249R, S128N-H249R, S103G-H249R, E089P-H249R, T022A-L111V, S101A-L111V, A016S-L111V, V104L-L111V, N062E-L111V, S103G-L111V, E089P-L111V, A016S-L148I, N062E-L148I, T022A-L148I, P129E-L148I, V104L-L148I, S103G-L148I, S128N-L148I, S101A-L148I, E089P-L148I, L111V-L148I, A016S-N062E, T022A-N062E, N062E-P129E, T022A-P129E, S128N-P129E, A016S-P129E, S101A-P129E, V104L-P129E, E089P-P129E, S103G-P129E, L111V-P129E, N062E-R186H, S128N-R186H, S101A-R186H, T022A-R186H, A016S-R186H, A158E-R186H, E089P-R186H, P129E-R186H, G159E-R186H, S103G-R186H, V104L-R186H, L111V-R186H, L148I-R186H, N062E-S101A, T022A-S101A, A016S-S101A, E089P-S101A, N062E-S103G, T022A-S103G, A016S-S103G, S101A-S103G, E089P-S103G, N062E-S128N, A016S-S128N, T022A-S128N, S101A-S128N, V104L-S128N, E089P-S128N, S103G-S128N, L111V-S128N, L111V-S188D, N062E-S188D, A016S-S188D, L148I-S188D, T022A-S188D, S128N-S188D, S101A-S188D, V104L-S188D, E089P-S188D, P129E-S188D, G159E-S188D, R186H-S188D, S103G-S188D, A158E-S188D, A016S-T022A, A016S-V104L, T022A-V104L, S101A-V104L, N062E-V104L, S103G-V104L, E089P-V104L, G159E-Y209E, L111V-Y209E, S101A-Y209E, A016S-Y209E, S128N-Y209E, L148I-Y209E, P129E-Y209E, N062E-Y209E, T022A-Y209E, S103G-Y209E, A158E-Y209E, S188D-Y209E, V104L-Y209E, E089P-Y209E и R186H-Y209E, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-W241R, G020R-W241R, S024R-W241R, S009A-W241R, G020R-W241R, V004R-W241R, N043R-W241R, S078R-W241R, T022R-W241R, G115R-W241R, A001R-W241R, S212F-W241R, L082R-W241R, N018R-V244R, S024R-V244R, S078R-V244R, G020R-V244R, S212F-V244R, S009A-V244R, L082R-V244R, A001R-V244R, N043R-V244R, T022R-V244R, V004R-V244R, G115R-V244R, W241R-V244R, S242R-V244R, A001R-V004R, S009A-T022R, N018R-T022R, G020R-T022R, V004R-T022R, A001R-T022R, S024R-S242R, N018R-S242R, V004R-S242R, G020R-S242R, S212F-S242R, L082R-S242R, S078R-S242R, A001R-S242R, S009A-S242R, T022R-S242R, G115R-S242R, N043R-S242R, W241R-S242R, N018R-S212F, T022R-S212F, V004R-S212F, S024R-S212F, A001R-S212F, G115R-S212F, G020R-S212F, S009A-S212F, N043R-S212F, S078R-S212F, L082R-S212F, S009A-S078R, G020R-S078R, S024R-S078R, T022R-S078R, N018R-S078R, V004R-S078R, A001R-S078R, N043R-S078R, T022R-S024R, G020R-S024R, N018R-S024R, A001R-S024R, V004R-S024R, S009A-S024R, V004R-S009A, A001R-S009A, S242R-N269R, S024R-N269R, G020R-N269R, T022R-N269R, H249R-N269R, S212F-N269R, N043R-N269R, V244R-N269R, A001R-N269R, N018R-N269R, S078R-N269R, S009A-N269R, G115R-N269R, W241R-N269R, V004R-N269R, L082R-N269R, N018R-N043R, G020R-N043R, V004R-N043R, T022R-N043R, S009A-N043R, A001R-N043R, S024R-N043R, S009A-N018R, V004R-N018R, A001R-N018R, S024R-L082R, S009A-L082R, N018R-L082R, A001R-L082R, S078R-L082R, G020R-L082R, T022R-L082R, V004R-L082R, N043R-L082R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, N018R-H249R, S009A-H249R, S212F-H249R, T022R-H249R, S024R-H249R, G115R-H249R, A001R-H249R, L082R-H249R, S242R-H249R, W241R-H249R, V244R-H249R, S078R-H249R, N018R-G115R, G020R-G115R, T022R-G115R, S078R-G115R, S009A-G115R, V004R-G115R, A001R-G115R, L082R-G115R, N043R-G115R, S024R-G115R, S009A-G020R, N018R-G020R, V004R-G020R, A001R-G020R, S009A-E271L, G020R-E271L, S024R-E271L, V244R-E271L, W241R-E271L, N043R-E271L, T022R-E271L, H249R-E271L, S212F-E271L, G115R-E271L, S242R-E271L, S078R-E271L, V004R-E271L, N269R-E271L, A001R-E271L, N018R-E271L и L082R-E271L, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N043R, G020K-N062E, S024F-N116L, G020K-S024F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086W, S078R-G118R, T033S-G118R, T033S-K235F, Y209A-W241R, G020R-N076D, N018R-Q245R, S024R-R045T, A232V-Q245R, G118R-A172V, G118R-A194T, I008T-S024R, K235F-N243F, N018R-S103A, N018R-V104I, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-N243F, S024R-P239Q, S024R-S101G, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T274I, S024R-Y209A, S078R-P086W, S101G-A232V, T033S-L148F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, A230E-H249R, A232V-H249R, G118R-K235F, N076D-Q245R, P086W-K235F, S024R-R247H, S024R-V104A, S078R-K235F, S101G-H249R, S103A-A232V, T033S-A048T, T033S-P239T, T033S-T253A, T143A-Y209A, Y209A-K235F, N018R-R045T, Y209A-N243F, S024R-A272P, S024R-R269C, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R и S024R-N076D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N076D, S024R-R045T, A230E-H249R, N018R-R045T, N018R-Q245R, S101G-A232V, S024R-A232V, A232V-Q245R, S024R-S101G, N018R-V104I, N018R-S103A, S101G-H249R, A232V-H249R, S103A-A232V, N076D-Q245R, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R, S024R-N076D, S024F-N116L, G020K-S024F, G020K-N062E, T033S-G118R, S024R-P086W, S024R-G118R, S024R-P086R, Y209A-W241R, S024R-W241R, S024R-K235F, G118R-Y209A, S078R-G118R, T033S-K235F, S024R-A174T, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, S024R-N243F, S024R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, P086W-N243F, T033S-P201S, S024R-P239Q, S078R-P086W, K235F-N243F, G118R-A172V, T033S-L148F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, S024R-S141G, S024R-T274I, P086W-K235F, A015T-T033S, Y209A-K235F, S024R-R247H, S078R-K235F, S024R-V104A, T033S-A048T, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-A272P и S024R-R269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V004R-S009A-G020R-S242R, G020R-N043R-W241R, G020R-S242R-N269R, V004R-S009A-G020R-N043R, V004R-G020R-H249R, N018R-S024R-V244R, S009A-T022R-S212F-W241R, G020R-N043R-N269R, N018R-S024R-S242R, V004R-S009A-N043R-W241R, G020R-N043R-V244R, G020R-T022R-S242R, V004R-G020R-N043R, V004R-S009A-G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R-H249R, G020R-S212F-H249R, V004R-S009A-W241R, A001R-S009A-N043R, G020R-N043R-H249R, S009A-G020R-N043R-W241R, G020R-T022R-N043R, G020R-H249R-N269R, G020R-T022R-W241R, V004R-S009A-S024R-N043R-W241R, S009A-N043R-S078R, V004R-G020R-S024R-V244R, G020R-T022R-S078R-S242R, G020R-S024R-S242R-H249R, V004R-S009A-S078R-W241R, S009A-N043R-S078R-S242R, V004R-G020R-S024R, S009A-N043R-S212F, G020R-N043R-S212F, S024R-S078R-S212F, S009A-G020R-S024R-N043R, S009A-T022R-N043R-S078R, G020R-T022R-S212F-W241R, G020R-N043R-S212F-W241R, S009A-N043R-W241R, G020R-N043R-E271L, G020R-T022R-S078R-W241R, G020R-S024R-N043R-S242R, G020R-T022R-N043R-W241R, S009A-G020R-N043R-S212F, V004R-S009A-G020R-S024R-S242R, G020R-N043R-H249R-E271L, G020R-T022R-S024R-S242R, S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-N043R-S242R-E271L, S009A-T022R-S078R-S212F-W241R, V004R-G020R-S024R-H249R, G020R-T022R-E271L, G020R-T022R-N043R-S212F, V004R-G020R-S024R-N043R-S242R, V004R-G020R-S024R-N043R, V004R-S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-T022R-S078R-S212F-W241R и G020R-T022R-N269R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-G020R-N043D-R045T-A230E, N018R-N043R-R045T-S242R-H249R, S024R-N043D-H249R, N018R-G020R-R045T, G020R-S024R-N076D-H249R, S024R-N043R-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-A230E, G020R-N076D, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R, S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-R045T-S242R, G020R-N043D-N076D-A230E-H249R, G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-S024R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-L233I-S242R, S024R-N043R-A230E, N018R-G020R-N043D, N043R-S242R-H249R, G020R-N043R-R045T-A230E, N043R-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-R045T-A230E-S242R, S024R-R045T-N076D-A230E-S242R-H249R, S024R-R045T, S024R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-S024R-N043D-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-H249R, S024R-N043R-S242R, N018R-G020R-N043R-N076D-H249R, G020R-S024R-N043D-H249R, G020R-N043R-A230E-S242R, G020R-N043R-S242R, N018R-N043R-N076D-A230E, G020R-S024R-N043D-S242R, G020R-N043R-A230E, N018R-G020R-N043R-N076D-S242R-H249R, N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-N043R-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-N043D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T-H249R, S024R-N043R-H249R, G020R-S024R-K27E-N043R-N076D-A230E, S024R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-A230E, G020R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043R-R045T-S242R, G020R-S242R-H249R, N018R-N043R-N076D-A230E-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D, G020R-S024R-K27R-N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-N043R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-H249R, N018R-G020R-N043D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S242R, S024R-N043R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-T38I-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R, N018R-S024R-R045T-A230E-S242R, N018R-G020R-H249R, S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, S024R-N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-S242R, G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-S242R, N018R-G020R-N043R-N076D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-H249R, N018R-S024R-N043R-R045T-A230E-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-S024R-S242R, N018R-N043R-R045T-N076D-A230E-S242R, R045T-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-S242R, N018R-G020R-N043D-R045T-S240P, S024R-N043R-R045T-S242R-H249R, N018R-S024R-V30S-L31S-D32I-T33Q-G34V-I35F, N018R-G020R-N043R-N076D, G020R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-S242R-H249R, S024R-N043D-R045T-S242R-H249R, N043R-A230E-H249R, S024R-N043R-N076D-A230E-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-H249R, S024R-R045T-S242R-A273V, G020R-S024R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T-A230E-S242R, N018R-N043D-A230E-H249R, N018R-N043R-N076D-S242R, N018R-G020R-N076D, N018R-G020R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-N076D-S242R, G020R-N043R-H249R, N018R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-R045T-A230E-H249R, A230E-H249R, N018R-R045T-H249R, G020R-N043R-N076D, N043R-R045T-H249R, N018R-N043D-N076D-S242R-H249R, N043R-N076D-H249R, N018R-R045T, G020R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T, S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-R045T-H249R, N043R-N076D-S153A-H249R, N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043D-N076D-H249R и G020R-N043R-N076D-V227I, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024K-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-L148I-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D и S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V104L-S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-S188D-H249R, N062E-S128N-A158E-G159E-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R-E271F, S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, N062E-G159E-S188D-H249R, A016S-N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-A158E-G159E-H249R, S101A-S128N-A158E-Y209E-H249R, S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R, N062E-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R, N062E-S101A-A158E-R186H-E271F, N062E-V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-G159E-R186H-H249R, N062E-G159E-H249R, S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-S188D-E271F, N062E-A158E-H249R, N062E-R186H-S188D-H249R-E271F, S128N-A158E-Y209E-, N062E-S101A-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R-E271F, A016S-N062E-A158E-H249R, N062E-S101A-G159E-H249R, S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, S101A-S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-S188D-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-G159E-H249R-E271F, S128N-A158E-G159E-E271F, A016S-N062E-V104L-A158E-R186H-E271F, T022A-S128N-A158E-H249R, S128N-A158E-H249R, N062E-S101A-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-N062E-A158E-R186H-E271F, V104L-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-S188D-H249R, T022A-N062E-A158E, N062E-S101A-S188D-H249R-E271F, N062E-A158E-H249R-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, N062E-S101A-R186H-E271F, N062E-V104L-G159E-H249R, N062E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R-E271F, S101A-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-R186H, S101A-S128N-P129E-R186H-H249R, S101A-S103G-A158E-R186H-H249R, A016S-N062E-V104L-R186H-S188D-E271F, V104L-A158E-R186H-H249R, S101A-S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-E271F, A016S-N062E-A158E-H249R-E271F, N062E-S128N-A158E, N062E-S128N-G159E-H249R, N062E-S101A-A158E-S188D-H249R, S101A-S128N-A158E-H249R, N062E-A158E-R186H-S188D-H249R, A016S-V104L-A158E-R186H-E271F, N062E-L148I-G159E, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-S188D-H249R, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-V104L-R186H-S188D-E271F, T022A-S101A-A158E-R186H-H249R, S101A-S128N-A158E-Y209E, A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, S101A-V104L-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-H249R, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, A016S-V104L-S188D-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-E271F, V104L-S128N-G159E-E271F, V104L-A158E-R186H-H249R-E271F, A158E-R186H-H249R, S101A-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, A016S-S128N-A158E-R186H, V104L-S128N-R186H-S188D-H249R, A016S-S101A-S128N-R186H, A016S-N062E-S128N-R186H-E271F, A016S-S128N-R186H-E271F, S128N-P129E-R186H, A158E-R186H-H249R-E271F, A016S-A158E-H249R, A016S-A158E-R186H-H249R, A016S-T022A-A158E-R186H-E271F, E089P-S101A-P129E-R186H, T022A-S128N-A158E-R186H, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H, T022A-S128N-R186H-S188D-, N062E-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, T022A-A158E-R186H-H249R-E271F, T022A-V104L-A158E-H249R, S101A-L111V-P129E, A016S-A158E-H249R-E271F, A016S-L111V-S188D-, T022A-V104L-R186H-S188D-H249R и V104L-L148I-S188D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A001R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-G025R-N116A-Y167W, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S103N-S106G-Y167W-Q236N, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101A-H120F-A194F-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-S212F-A232V-Q245R, G020R-S144R-N185I-L233C-Q236N, G023A-S078R-S216F-Q236N-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-G115R-A232V-Q245R, P052N-S078R-S103N-L148I-T213A, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G025R-E089I-N116A-P239S-A270C, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, L148I-T213A-N252R, S024R-G025R-N183D-Y192W-P239S, G046R-A194F-S212M, V104L-L217E-T224A-H249R-N252R, G023A-Y091F-V121F-Y192W-Q236N, S101G-S103A-V104I-A232V-V244R-Q245R, S099F-S144R-Y167W-N252R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S078R-Y167W-S212M-A270C, V121F-N252R-A270C, G020R-S103N-S216F-Q236N-N252R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G023A-P052N-Y192W-I198L-N252R, G025R-G046R-V121F, S024R-S078R-V104L-N116A-N183D, G046R-Q059A-S103N-G211Q-S212M, G020R-P052N-N062Q-Y091F-Y192W, G023A-P052N-S144R-Y192W-S216F, S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, P052N-S103N-N116A-L148I-Y192W, E089I-N116A-N117F-T224A-H249R, S144R-G211Q-N238L-P239S-H249R, N043A-N062Q-A194F-G211Q, G020R-S024R-P052N-Q059A-S216F, S024R-Y167W-T224A-H249R, T057R-Y167W-H249R, G025R-S103N-R186K-A194F-T224A, S105T-S128N-S144R-L148I-S212M, G020R-Q059A-S144R-Y192W-T224A, S024R-N043A-N117F-A194F-G211Q, N117F-A194F-T213A-A270C, S078R-Y091F-V121F-L233C-N252R, T057R-S099F-S105T-I198L-T213A, G023A-Y091F-S101A-I198L-N252R, N062Q-S103N-V121F-S144R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, G023A-S024R-N117F-S212M-S216F, V104L-T213A-S216F, A194F-G211Q-Q236N, N062Q-S103N-N117F-A194F, S024R-N062Q-V104L-S106G-H249R, T057R-E089I-I198L, G046R-Q059A-S106G-L217E-H249R, N117F-T213A-A215F, S101A-H120F-Y192W-A215F-T224A, N043A-T057R-N117F-S144R-N183D, G046R-N183D-N238L, G025R-N043A-E089I-N117F, S078R-V104L-T213A-A215F-T224A, Y091F-S099F-S101A-S105T-Y167W, S106G-N117F-N238L, G046R-E089I-Y091F-S101A-N116A, G020R-N062Q-E089I-R186K-S212M, T057R-S099F-V121F-N185I-Y192W, G046R-E089I-Y192W-L233C-A270C, E089I-N117F-N185I-A215F-L233C, P052N-V104L-N183D-S216F-H249R, S078R-S099F-N116A-R186K-T224A, G025R-S105T-S128N-S144R-A270C, S105T-G211Q-S216F, S024R-G046R-Y091F-V121F, S106G-N185I-S216F-Q236N, N062Q-S101A-Q236N-N252R-A270C, G025R-N043A-Y091F-I198L-A270C, G020R-G023A-V104L-Y192W-L233C, S024R-N043A-S105T-S106G-I198L, G020R-E089I-L217E, S024R-Y091F-I198L-A215F-P239S, G046R-E089I-S099F-R186K-S212M, V104L-H120F-R186K-S216F-N252R, T022W-A194F-T213A-L233C-N238L, S099F-S105T-S106G-A194F-S212M, E089I-S105T-N116A-A215F-S216F, G025R-N116A-H120F-T224A-A270C, N043A-Q059A-S101A-S216F-T224A, T057R-N183D-Q236N, G025R-N062Q-S128N-S144R-N185I, S103N-H120F-Y167W-I198L-L233C, T022W-E089I-S216F, S024R-S106G-N116A-S212M-T224A, G020R-P052N-S101A-I198L-L233C, E089I-Y091F-N185I-G211Q-A270C, L111I-A215F-P239S, S024R-N116A-R186K-L233C-Q236N и G023A-S103N-S106G-S212M-A215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116S-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S103A-A232V-H249R, N018R-S101G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-H249R, N018R-T22K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V, N018R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S101G-S103A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-A232V-H249R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A215F-A232V-Q245R, S024R-S103A-V104I-H249R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101G-V104I-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-S103A-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-Q245R, S024R-S103A-Q245R, S024R-S103A-V104I-Q245R, G020R-S078R-S101G-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-V104I-H249R, N018R-S024R-V104I-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, R019H-G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S103A-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-S101G-V104I-A232V, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-S101G-V104I, G020R-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-Q245R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-H249R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, S024R-N076D-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, A001T-N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-I198L-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, S024R-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, G020R-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, G020R-T022W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-T180A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S103A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N076D-Q245R, S024R-V104I-Q245R, S101G-A232V, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-I198L-A232V-Q245R, S024R-Q245R-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, S024R-S101G-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-V104I, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T22W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, Q012H-G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-H249R, S024R-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-N076D-S103A-V104I-H249R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R-E271G, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, G020R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-S103A-M175L-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-Q245R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-A232V, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-I198M-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S103A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-V268G, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S103A-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-S076T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A273T, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-A232V, A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-V234I-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-A272V, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S103A-V104I-A232V, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-M117I-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-Y209H-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-M175L-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I-Q245R, K027R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A114T-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V, N018R-S024R-N076D-N116A-H249R, G020R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-A232V-Q245R-, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A131V-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-S101G-Q245R, S024R-N076D-S101G-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-S101G, N018R-T22W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-I198L-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-V104I, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-L088I-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, S024R-N076D-Q245R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-N218S-A232V-Q245R, N018R-S103A, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, S024R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, K027R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-V104I, S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-R275S, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, V004M-N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, V104I-A232V-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-T274I, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R-A270V, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V, S101G-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-M175L-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-N269S, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R-T260K, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, G020R-S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272D, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-A232V, S024R-S103A-V104I, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N076D-S103A-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, S103A-V104I-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, A016T-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N043R-N076D-S101G-S103T-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G115E-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G, N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-V104I-A232V, N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-H249R, S103A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-S103A-V104I-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-A131T-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-Q245R-H249R, N018R-N076D-A232V-H249R, N018K-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R-L267I, A232V-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, S024R-S101G-S103A-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-H249R, S103A-A232V-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-T274I, S024R-S103A-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, S103A-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-N263S, S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-V197A-T213A-A215F-H249R, S024R-S101G-S103A, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-V104I-A232V, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, G020R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-A150T-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116T-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-Q245R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-Y209H-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-Q245R, N076D-S101G-V104I-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, G020R-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N204D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A209V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R-N269D, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-Y209H-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N076D-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-T213A-H249R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, G020R-A090S-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-Q245R, K027R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S103A-V104I-L135I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, P005S-N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-N243D-H249R, N018R-G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D-S101G, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-Q245R, G020R-S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R-N269S, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-A086V-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-S101G-I198T-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R-A248T, N018R-N076D-V104I-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-V104I, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-N076D-V104I, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R-N263D, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-R269H, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-Y166F-A176P-A179V-N184T-A187P-A194P, N018R-T022W-S024R-D041E-N076D-S101A-S160T-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I, N018R-N076D-S101G-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-L031F-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R-N269S, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N114T-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R-T260A, N076D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N076D-V104I-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, S101G-S103A-A232V, S024R-N076D-S101G-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A156V-N183D-G211Q-A215F-H249R-N269S, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-N076D-S101G, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-N237D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R-R275S, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-H249R, N018R-N076D-S103A-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-D175E-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-A273E, G020R-S024R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, P005S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-S024R-V068A-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R-R275S, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R и N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-S024R-N043R-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S078R-H249R, G020R-S101G-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104V-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043R-N076D-S078R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D-H249R, G020R-S101A-S103G-V104V-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-L217E-H249R-N269R и N018R-S024R-N076D-L217E-S242R-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-S101A-S103A-V104I-G118R-A232V-Q245R, G020R-S024R-N116A-T213A, N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101A-N116A, S024R-N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N043R-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-T213A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, S024R-N043R-N116A-A215F-N269R, G020R-S024R-T213A-A215F, G020R-N116A-N269R, S024R-N116A-T213A-N269R, N043R-S101A-N116A-N269R, S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-A215F-N269R, G020R-N043R-S101A-N269R, S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R-N269R, S024R-A215F-N269R, N043R-S101A-N116A-T213A-A215F-N269R, N043R-S101A-T213A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-T213A-N269R, S024R-N043R-R045T-N269R, G020R-N043R-R045T-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T, N043R-N116A-N269R, S024R-N043R-S101A-A215F-N269R, S024R-N043R-R045T-T213A-A215F-N269R, G020R-S024R-R045T-N269R, G020R-N043R-S101A-N116A-T213A-A215F, G020R-S101G-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N116A-N269R, G020R-S101A-N116A-N269R, S024R-N043R-A215F, G020R-S024R-T213A, S024R-N043R-S101A-A215F, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-S024R-S101A-A215F, G020R-S024R-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-N116A, G020R-S024R-S101A-N116A, N043R-T213A-A215F-N269R, S024R-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-A215F, G020R-T038A-N043R-S101A, G020R-S024R-N116A-A215F, S024R-N043R-S101A-T213A, P014L-G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-A215F, G020R-S024R-A215F, G020R-N116A-A215F-N269R, G020R-R045T-N116A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-A215F и G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A-A215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A114V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F и N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R и N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-G102A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F и T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101S-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103G-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S101S-S103A-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V026F-V051W-V104L-S106E, V026F-L031F-S078N-G102A-S160D, G020K-G100S-N116L-A158E-S166D-N243F, T033S-N043W-N218D-P239G-N243F, T022L-T038F-A048R-N062E-G100S-R186K, S101D-S103N-N116L-S144R-A215D, V104L-S105T-T213A-L217E-S256N, N043W-S101D-S212M-N243F, V026F-A048R-S105T-T213A-N218D-T224A, S024F-S101D-G118R-A215D-L250I-A272F, V121F-N185E-T224A-P239G, T022L-L031F-G102A-S128D-T224A-N243F, N062E-S078N-G102A-N116L-S144R-L250I, T022L-T038F-V121F-S160D-A272F, V026F-S078N-G159C-R186K-N243F, S024F-A048R-G118R-S166D-L217E, G023A-T038F-S078N-G100S-S212M-A215D, G100S-N116L-A158E-T213A, S078N-V104L-G118R-S128D, G102A-S103N-S105T-A194E, T022L-S078N-S128D-T213A, K027R-G100S-G118R-S160D-S188D-N243F, S024F-G102A-R186K-T213A-L217E-N243F, T033S-S105T-S188D-S216F, G023A-G100S-A194E-S212M, A048R-S128D-N185E-P239G, G020K-S024F-T033S-P129E-A194E, G020K-K027R-P129E-S166D-P239G, T022L-G023A-K027R-S101D-V104L-S216F, T033S-G118R-P129E-A194E-P239G, T022L-S078N-N116L-P129E-S256N, K027R-S101D-S103N-S105T-A272F, A048R-S078N-N116L-N185E-L217E-P239G, G023A-S024F-K027R-N062E, S024F-S103N-V104L-G118R-S188D, V026F-V104L-S256N-A272F, S024F-N043W-V104L-V121F-P129E, N062E-S078N-N116L-T224A, G023A-S024F-V051W-A158E, K027R-T038F-G102A-N116L, N062E-S078N-S144R-S212M, L031F-N116L-S256N-A272F, T022L-T033S-V104L-N116L-S160D-R186K, S024F-G118R-P129E-R186K-T213A, N043W-S105T-T213A-A215D-S216F, L031F-S105T-R186K-S188D, V026F-A194E-T213A-S256N и S103N-S160D-L250I-S256N, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N062E-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-N062E-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F и T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-S024F-N062E-S188D-P239G, S024F-N062E-N116L-P239G, G020K-G023A-N062E-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-G118R-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D-T213A-P239G, G023A-N062E-N116L-G118R, G023A-S024F-N062E-N116L-G118R, S024F-N116L, S024F-N062E-S188D-T213A, G023A-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-S024F-N062E, G020K-N043W-N062E-N116L-P239G, S024F-N062E-N116L-T213A-P239G, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-N116L-S188D-T213A, S024F-N062E-S188D-P239G, G023A-N043W-N062E-N116L-G118R-T213A, N062E-S188D-P239G, G020K-S024F-N062E-P239G, S024F-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-S188D-T213A-P239G, S024F-N043W-G118R-S188D, G023A-S024F-N116L-G118R-S188D-T213A, G020K-G023A-N043W-N116L-S188D-T213A-P239G, G023A-S024F-N116L-S188D-P239G, G023A-N043W-N116L-G118R-S188D, G023A-S024F-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R, G020K-N043W-S188D-T213A, S024F-N062E-G118R-P239G, G023A-N043W-S188D-T213A, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-N116L-S188D-P239G, G020K-N043W-N062E-G118R, G020K-N043W-N116L-S188D-T213A, G020K-S024F, G023A-N043W-N116L-P239G, G023A-S024F-N043W-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N043W-T213A и G023A-S024F-N062E-G118R-T213A-P239G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-G023A-N043W-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D, S024F-G118R-S128I-P129E-G159D, G020K-S024F-N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-N062E-N116L-S188D, N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D, N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-N062E-N116L-T213A, G020K-G023A-N062E-N116L, G020K-N062E-S188D-T213A, G020K-N062E, G020K-S024F-N062E-N116L-S188D, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D, G020K-S024F-N062E-S188D-T213A, N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-N062E-N116L, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D-T213A, G023A-S024F-N062E-N116L-T213A, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, S024F-N062E-N116L-S188D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, G023A-N062E-N116L-S188D, N043W-N062E-N116L, G020K-G023A-N116L-S188D, N043W-N062E-N116L-S188D, S024F-N062E-N116L, N062E-N116L-S188D и T022A-S024R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S087R-S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-Q109R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R, N076D-S87R-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-Q109R, N076D-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-Q109R-Q245R и N076D-S103A-V104I-S212P-Q245L-E271V, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-P086W-G118R, S024R-S078R-P086W-N243F, S024R-T033S-P086S-S087N-Y209A, T033S-G118R, S024R-S078R-P086W-G118R-A270T, S024R-T033S-P086W-G118R, S078R-P086W-N243F, T033S-S078R-P086W-G118R-Y209A, T033S-S078R-Y209A, P086W-G118R-N243F, S024R-P086W, S078R-P086W-K235F, S024R-G118R, S024R-P086R, S101G-S103A-V104I-A232V, S024R-T033S-S078R-P086W-G118R, S024R-G118R-Y209A, Y209A-W241R, T033S-P086W-N243F, T033S-A172V-Y209A, G118R-Y209A-N243F, S024R-P086S-S141G, S024R-G118R-Y209A-N243F, S024R-T033S-P086S-S085N-K235F, S024R-T033S-A133V, S024R-T033S-S078R-P086W, S024R-P086W-Y209A, S024R-W241R, T033S-G118R-N243F, S024R-K235F, S024R-S078R-P086W, S024R-G118R-Y209A-K235F, S024R-Y209A-W241R, T033S-G118R-W241R, P086W-G118R-Y209A, T033S-G118R-G159D-Y209A, T033S-S078R-P086W, S024R-P086W-N243F, G118R-Y209A, S024R-P086W-G118R-V203I, S078R-Y209A-K235F, S024R-T033S-W241R, S078R-G118R, T033S-G118R-Y209A-N243F, L021M-S024R-T033S, S024R-T033S-P086W, T033S-K235F, S078R-P086W-Y209A, S024R-T033S-Y209A-K235F, T033S-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-Y209A, T033S-P086W-G118R-Y209A-N243F, P086W-Y209A-N243F, P005S-S078R-G118R-W241R, S024R-A174T, T033S-Y209A-N243F, P086W-G118R-A133V, S024R-T033S-G118R, S024R-P086W-Y209A-K235F, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, P005S-S024R-T033S-N243F, S024R-Y209A-S242P, S024R-T033S-S078R-G118R, S024R-T033S-A194T, S024R-N243F, S024R-Y209A, S024R-T033S-G118R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, S024R-T033S-S078R-N243F, P086W-N243F, T033S-G118D-A138V-Y209A, T033S-Y209A-K235F, S024R-P086R-G118R, T033S-P201S, S024R-P239Q, T033S-G118R-Y209A-, S078R-P086W, K235F-N243F, S024R-Y209A-K235F, G118R-A172V, H017Y-S024R-T033S-P086W, T033S-L148F, S024R-G118R-K235F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, G118R-Y209A-K235F, S024R-T033S-Y209A-N243F, S024R-T033S-K235F, S024R-T033S-G118R-K235F, S024R-S141G, S024R-T274I, S024R-T033S-Y209A, P086W-K235F, S024R-Y209A-N243F, V004E-T033S-S078R, P086W-Y209A-K235F, A015T-T033S, T033S-P086W-S156L-Y209A, S024R-G118R-N243F-R269H, Y209A-K235F, S024R-R247H, S024R-T033S-A228T, S078R-K235F, S024R-T033S-A174V-K235F, S024R-K235F-N243F, S024R-T033S-K235F-W241R, S024R-T033S-A151V, S024R-V104A, T033S-A048T, Q012H-V104A-G118R, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, S024R-T033S-N243F, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-T033S-P129H-N184D-T253M, S024R-A085V-P086W-G118R-K235F, S024R-A272P и S024R-R269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-S087D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S024R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S078R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-V150L-H249R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-S242R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, N076D-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N076D-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-S242R-Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-K027R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222Q-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R и N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271G, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I, T22A-S101A-Y209E, S103G-L111V-G159E, T22A-S103G-G159E, T22A-L111V-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-S103G-L111V, N62E-L111V-S128N, T22A-L111V-S128N, T22A-N62E-L111V, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, S101A-S103G-V104L-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L-G159E, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-E271F и S101A-Y209E-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K и S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N248R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R и N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью, включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, W241R, G20R-N43R-H249R, G20R-T22R-N43R, G20R-N43R-S242R, G20R-N43R-E271L, G20R-N43R-V244R, G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-T22R-S78R-S212F-W241R, S9A-G20R-N43R-S212F, S9A-N43R-S212F, G20R-N43R-S212F, G20R-T22R-N43R-S212F, S24R-S78R-S212F, S9A-N43R-S78R, S9A-N43R-S78R-S242R, S9A-G20R-N43R-S78R, G20R-S24R-N43R-S78R-S242R, T22R-S24R-S78R-S212F, S9A-G20R-N43R-S78R-S242R, G20R-N43R-S78R-H249R, G20R-N43R-S78R, S9A-S78R-S212F, S9A-T22R-N43R-S78R, S9A-G20R-S24R-N43R, S9A-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R-S78R-S212F, G20R-S24R-N43R, A1R-S9A-N43R, G20R-S24R-N43R-G115R, S9A-S24R-N43R, G20R-T22R-S24R-N43R, A1R-S24R-N43R, S9A-G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-G20R-T22R-S78R-S212F, S9A-S24R-N43R-V244R, S9A-S24R-N43R-S242R, V4R-S9A-T22R-S24R-S212F и T22R-S24R-N43R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью и включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R, S101G, S103A, V104I, A232V, Q236H и Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью и включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: G20K, G20R, G23A, S24F, S24R, N43R, N43W, R45T, N62E, N76D, S101A, N116A, N116L, G118R, S128I, P129E, S188D, T213A, A215F, L217E, P239G и N269R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий протеолитической активностью и включающий аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A1R, Q2S, Q2M, Q2A, Q2R, Q2W, S3R, V4R, V4S, V4C, I8A, S9A, S9F, S9W, R10S, R10A, R10H, R10M, Q12F, Q12R, P14K, P14F, P14Q, A15R, A15F, A16S, H17R, H17M, H17F, N18R, N18K, G20F, G20K, G20R, T22A, T22R, T22Y, T22V, T22Q, T22L, T22W, G23A, G23S, G23F, S24R, S24F, S24W, S24Q, S24H, S24L, G25V, G25F, G25R, V26F, K27L, K27F, K27R, K27V, V28A, V28N, V28E, A29T, V30E, L31F, T33S, T33G, T33D, G34P, I35M, S36T, S36F, S36R, T38L, T38F, T38R, P40N, P40L, P40T, P40W, P40H, P40R, L42I, N43A, N43F, N43I, N43S, N43R, N43M, N43W, N43D, R45T, G46R, A48R, F50C, V51W, V51F, V51H, P52F, P52E, P52N, P55Y, T57R, Q59A, Q59F, Q59R, D60P, D60Q, D60A, N62E, N62Q, G63V, G63M, G63T, G63I, G63A, G63S, G63H, G63Q, G63D, G63E, G63P, H64F, H64T, V68A, V68C, A69N, A69T, A69P, A69W, T71G, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75E, L75R, N76D, S78R, S78N, S78I, S78R, I79W, I79Q, V81R, L82F, L82T, L82V, L82R, L82M, A85M, P86W, P86L, P86I, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, E89L, E89V, E89W, E89F, E89I, Y91N, Y91F, A92F, K94N, S99F, S99T, S99P, S99G, S99M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101D, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121F, V121F, V121E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, N183I, N183D, N183M, N183R, N183F, N183R, N185E, N185V, N185I, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Y192H, Y192W, A194E, A194V, A194F, D197F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, T213A, Y214F, A215N, A215D, A215E, A215H, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, N218P, N218E, T224A, T224G, V227I, A230E, A231I, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, N238K, N238L, P239K, P239G, P239R, P239R, P239H, P239T, P239N, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, N248I, N248R, H249R, H249T, L250I, K251R, K251S, N252I, N252F, N252R, N252K, N252H, T253I, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, T260I, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, N269I, N269R, A270C, E271I, E271H, E271V, E271H, E271M, E271L, E271P, E271A, E271F, E271T, A272F, A272F, A272R, A273F, A273I и T274G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям в аминокислотных положениях, выбранных из аминокислоты 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 50, 51, 52, 55, 57, 59, 60, 62, 63, 64, 68, 69, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 85, 86, 89, 91, 92, 94, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 128, 129, 132, 138, 44, 147, 148, 158, 159, 160, 166, 167, 175, 177, 181, 182, 183, 185, 186, 188, 192, 194, 197, 198, 203, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 224, 227, 230, 231, 233, 234, 235, 236, 236, 238, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 256, 258, 260, 262, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 272, 273 и 274, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено путем выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы: A1R, Q2S, Q2M, Q2A, Q2R, Q2W, S3R, V4R, V4S, V4C, I8A, S9A, S9F, S9W, R10S, R10A, R10H, R10M, Q12F, Q12R, P14K, P14F, P14Q, A15R, A15F, A16S, H17R, H17M, H17F, N18R, N18K, G20F, G20K, G20R, T22A, T22R, T22Y, T22V, T22Q, T22L, T22W, G23A, G23S, G23F, S24R, S24F, S24W, S24Q, S24H, S24L, G25V, G25F, G25R, V26F, K27L, K27F, K27R, K27V, V28A, V28N, V28E, A29T, V30E, L31F, T33S, T33G, T33D, G34P, I35M, S36T, S36F, S36R, T38L, T38F, T38R, P40N, P40L, P40T, P40W, P40H, P40R, L42I, N43A, N43F, N43I, N43S, N43R, N43M, N43W, N43D, R45T, G46R, A48R, F50C, V51W, V51F, V51H, P52F, P52E, P52N, P55Y, T57R, Q59A, Q59F, Q59R, D60P, D60Q, D60A, N62E, N62Q, G63V, G63M, G63T, G63I, G63A, G63S, G63H, G63Q, G63D, G63E, G63P, H64F, H64T, V68A, V68C, A69N, A69T, A69P, A69W, T71G, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75E, L75R, N76D, S78R, S78N, S78I, S78R, I79W, I79Q, V81R, L82F, L82T, L82V, L82R, L82M, A85M, P86W, P86L, P86I, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, E89L, E89V, E89W, E89F, E89I, Y91N, Y91F, A92F, K94N, S99F, S99T, S99P, S99G, S99M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101D, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121F, V121F, V121E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, N183I, N183D, N183M, N183R, N183F, N183R, N185E, N185V, N185I, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Y192H, Y192W, A194E, A194V, A194F, D197F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, T213A, Y214F, A215N, A215D, A215E, A215H, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, N218P, N218E, T224A, T224G, V227I, A230E, A231I, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, N238K, N238L, P239K, P239G, P239R, P239R, P239H, P239T, P239N, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, N248I, N248R, H249R, H249T, L250I, K251R, K251S, N252I, N252F, N252R, N252K, N252H, T253I, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, T260I, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, N269I, N269R, A270C, E271I, E271H, E271V, E271H, E271M, E271L, E271P, E271A, E271F, E271T, A272F, A272F, A272R, A273F, A273I и T274G, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, E271F, A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, и где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, E271F, A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы от протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: G20K, G20R, G23A, S24F, S24R, N43R, N43W, R45T, N62E, N76D, S101A, N116A, N116L, G118R, S128I, P129E, S188D, T213A, A215F, L217E, P239G и N269R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, включающий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и где общий заряд варианта протеазы составляет +1, +2, +3, +4, +5, 0, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы, включающие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и где суммарный заряд варианта протеазы составляет 0 по отношению к суммарному заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина Bacillus, обладающий одной или более из следующих характеристик: a) эффективность по способу тестирования 2 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) эффективность по способу тестирования 3 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; c) эффективность по способу тестирования 4 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) эффективность по способу тестирования 6 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5. Способ тестирования 2, способ тестирования 3, способ тестирования 4 и способ тестирования 6 подробно описаны ниже в разделе "Пример 1" под заголовком “Способы тестирования”.
Как указанно в настоящем изобретении, подходящие варианты протеазы, функциональные в холодной воде, представляют собой варианты исходной протеазы, причем указанная последовательность исходной протеазы по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, причем указанный вариант протеазы обладает одной или более из следующих характеристик:
a) эффективность по способу тестирования 2 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) эффективность по способу тестирования 3 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; c) эффективность по способу тестирования 4 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) эффективность по способу тестирования 6 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5. Способ тестирования 2, способ тестирования 3, способ тестирования 4 и способ тестирования 6 подробно описаны ниже в разделе "Пример 1" под заголовком “Способы тестирования”. Все мутации, относящиеся к настоящему изобретению, используют схему нумерации BPN', показанную на Фигуре 1. В некоторых вариантах осуществления варианты, относящиеся к настоящему изобретению, относятся к вариантам с аминокислотными последовательностями, сравниваемыми с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, с применением схемы нумерации BPN'.
В некоторых вариантах осуществления варианты, представленные в настоящем изобретении, относятся к вариантам исходной протеазы, где последовательность исходной протеазы по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.
Подходящие протеазы, функциональные в холодной воде, могут быть получены из субтилизинов, в частности, протеазы, полученные из субтилизина GG36 Bacillus lentus с SEQ ID NO:2, и в некоторых вариантах осуществления включают одну или более из следующих мутаций: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и/или A272F.
В некоторых вариантах осуществления подходящие варианты протеазы, функциональной в холодной воде, включают субтилизины, в частности, полученные из GG36 Bacillus lentus с SEQ ID NO:2, включающие один или более из следующих наборов мутаций: T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D и/или S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N043R, G020K-N062E, S024F-N116L, G020K-S024F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086W, S078R-G118R, T033S-G118R, T033S-K235F, Y209A-W241R, G020R-N076D, N018R-Q245R, S024R-R045T, A232V-Q245R, G118R-A172V, G118R-A194T, I008T-S024R, K235F-N243F, N018R-S103A, N018R-V104I, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-N243F, S024R-P239Q, S024R-S101G, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T274I, S024R-Y209A, S078R-P086W, S101G-A232V, T033S-L148F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, A230E-H249R, A232V-H249R, G118R-K235F, N076D-Q245R, P086W-K235F, S024R-R247H, S024R-V104A, S078R-K235F, S101G-H249R, S103A-A232V, T033S-A048T, T033S-P239T, T033S-T253A, T143A-Y209A, Y209A-K235F, N018R-R045T, Y209A-N243F, S024R-A272P, S024R-R269C, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R и S024R-N076D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-N076D, S024R-R045T, A230E-H249R, N018R-R045T, N018R-Q245R, S101G-A232V, S024R-A232V, A232V-Q245R, S024R-S101G, N018R-V104I, N018R-S103A, S101G-H249R, A232V-H249R, S103A-A232V, N076D-Q245R, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R, S024R-N076D, S024F-N116L, G020K-S024F, G020K-N062E, T033S-G118R, S024R-P086W, S024R-G118R, S024R-P086R, Y209A-W241R, S024R-W241R, S024R-K235F, G118R-Y209A, S078R-G118R, T033S-K235F, S024R-A174T, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, S024R-N243F, S024R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, P086W-N243F, T033S-P201S, S024R-P239Q, S078R-P086W, K235F-N243F, G118R-A172V, T033S-L148F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, S024R-S141G, S024R-T274I, P086W-K235F, A015T-T033S, Y209A-K235F, S024R-R247H, S078R-K235F, S024R-V104A, T033S-A048T, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-A272P и S024R-R269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V004R-S009A-G020R-S242R, G020R-N043R-W241R, G020R-S242R-N269R, V004R-S009A-G020R-N043R, V004R-G020R-H249R, N018R-S024R-V244R, S009A-T022R-S212F-W241R, G020R-N043R-N269R, N018R-S024R-S242R, V004R-S009A-N043R-W241R, G020R-N043R-V244R, G020R-T022R-S242R, V004R-G020R-N043R, V004R-S009A-G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R-H249R, G020R-S212F-H249R, V004R-S009A-W241R, A001R-S009A-N043R, G020R-N043R-H249R, S009A-G020R-N043R-W241R, G020R-T022R-N043R, G020R-H249R-N269R, G020R-T022R-W241R, V004R-S009A-S024R-N043R-W241R, S009A-N043R-S078R, V004R-G020R-S024R-V244R, G020R-T022R-S078R-S242R, G020R-S024R-S242R-H249R, V004R-S009A-S078R-W241R, S009A-N043R-S078R-S242R, V004R-G020R-S024R, S009A-N043R-S212F, G020R-N043R-S212F, S024R-S078R-S212F, S009A-G020R-S024R-N043R, S009A-T022R-N043R-S078R, G020R-T022R-S212F-W241R, G020R-N043R-S212F-W241R, S009A-N043R-W241R, G020R-N043R-E271L, G020R-T022R-S078R-W241R, G020R-S024R-N043R-S242R, G020R-T022R-N043R-W241R, S009A-G020R-N043R-S212F, V004R-S009A-G020R-S024R-S242R, G020R-N043R-H249R-E271L, G020R-T022R-S024R-S242R, S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-N043R-S242R-E271L, S009A-T022R-S078R-S212F-W241R, V004R-G020R-S024R-H249R, G020R-T022R-E271L, G020R-T022R-N043R-S212F, V004R-G020R-S024R-N043R-S242R, V004R-G020R-S024R-N043R, V004R-S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-T022R-S078R-S212F-W241R и G020R-T022R-N269R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-G020R-N043D-R045T-A230E, N018R-N043R-R045T-S242R-H249R, S024R-N043D-H249R, N018R-G020R-R045T, G020R-S024R-N076D-H249R, S024R-N043R-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-A230E, G020R-N076D, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R, S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-R045T-S242R, G020R-N043D-N076D-A230E-H249R, G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-S024R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-L233I-S242R, S024R-N043R-A230E, N018R-G020R-N043D, N043R-S242R-H249R, G020R-N043R-R045T-A230E, N043R-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-R045T-A230E-S242R, S024R-R045T-N076D-A230E-S242R-H249R, S024R-R045T, S024R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-S024R-N043D-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-H249R, S024R-N043R-S242R, N018R-G020R-N043R-N076D-H249R, G020R-S024R-N043D-H249R, G020R-N043R-A230E-S242R, G020R-N043R-S242R, N018R-N043R-N076D-A230E, G020R-S024R-N043D-S242R, G020R-N043R-A230E, N018R-G020R-N043R-N076D-S242R-H249R, N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-N043R-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-N043D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T-H249R, S024R-N043R-H249R, G020R-S024R-K27E-N043R-N076D-A230E, S024R-N043R-R045T-S242R, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-A230E, G020R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043R-R045T-S242R, G020R-S242R-H249R, N018R-N043R-N076D-A230E-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D, G020R-S024R-K27R-N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-N043R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-H249R, N018R-G020R-N043D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S242R, S024R-N043R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-T38I-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-N043R, N018R-S024R-R045T-A230E-S242R, N018R-G020R-H249R, S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, S024R-N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-R045T-S242R, G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-S242R, N018R-G020R-N043R-N076D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-H249R, N018R-S024R-N043R-R045T-A230E-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-H249R, N018R-S024R-S242R, N018R-N043R-R045T-N076D-A230E-S242R, R045T-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-S242R, N018R-G020R-N043D-R045T-S240P, S024R-N043R-R045T-S242R-H249R, N018R-S024R-V30S-L31S-D32I-T33Q-G34V-I35F, N018R-G020R-N043R-N076D, G020R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-A230E-S242R, N018R-S024R-N043D-S242R-H249R, S024R-N043D-R045T-S242R-H249R, N043R-A230E-H249R, S024R-N043R-N076D-A230E-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-H249R, S024R-R045T-S242R-A273V, G020R-S024R-R045T-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R, N018R-N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-H249R, N018R-N043R-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T-A230E-S242R, N018R-N043D-A230E-H249R, N018R-N043R-N076D-S242R, N018R-G020R-N076D, N018R-G020R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N043D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-N076D-S242R, G020R-N043R-H249R, N018R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-R045T-A230E-H249R, A230E-H249R, N018R-R045T-H249R, G020R-N043R-N076D, N043R-R045T-H249R, N018R-N043D-N076D-S242R-H249R, N043R-N076D-H249R, N018R-R045T, G020R-N076D-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-R045T, S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-R045T-H249R, N043R-N076D-S153A-H249R, N043R-N076D-A230E-H249R, N018R-N043D-N076D-H249R и G020R-N043R-N076D-V227I, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024K-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-L148I-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D и S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V104L-S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-S188D-H249R, N062E-S128N-A158E-G159E-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R-E271F, S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, N062E-G159E-S188D-H249R, A016S-N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-A158E-G159E-H249R, S101A-S128N-A158E-Y209E-H249R, S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R, N062E-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R, N062E-S101A-A158E-R186H-E271F, N062E-V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-G159E-R186H-H249R, N062E-G159E-H249R, S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-S188D-E271F, N062E-A158E-H249R, N062E-R186H-S188D-H249R-E271F, S128N-A158E-Y209E-, N062E-S101A-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R-E271F, A016S-N062E-A158E-H249R, N062E-S101A-G159E-H249R, S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, S101A-S128N-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-S188D-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-G159E-H249R-E271F, S128N-A158E-G159E-E271F, A016S-N062E-V104L-A158E-R186H-E271F, T022A-S128N-A158E-H249R, S128N-A158E-H249R, N062E-S101A-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-N062E-A158E-R186H-E271F, V104L-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-S188D-H249R, T022A-N062E-A158E, N062E-S101A-S188D-H249R-E271F, N062E-A158E-H249R-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, N062E-S101A-R186H-E271F, N062E-V104L-G159E-H249R, N062E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R-E271F, S101A-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-R186H, S101A-S128N-P129E-R186H-H249R, S101A-S103G-A158E-R186H-H249R, A016S-N062E-V104L-R186H-S188D-E271F, V104L-A158E-R186H-H249R, S101A-S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-E271F, A016S-N062E-A158E-H249R-E271F, N062E-S128N-A158E, N062E-S128N-G159E-H249R, N062E-S101A-A158E-S188D-H249R, S101A-S128N-A158E-H249R, N062E-A158E-R186H-S188D-H249R, A016S-V104L-A158E-R186H-E271F, N062E-L148I-G159E, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-R186H-S188D-H249R, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-V104L-R186H-S188D-E271F, T022A-S101A-A158E-R186H-H249R, S101A-S128N-A158E-Y209E, A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, S101A-V104L-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-H249R, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, A016S-V104L-S188D-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-E271F, V104L-S128N-G159E-E271F, V104L-A158E-R186H-H249R-E271F, A158E-R186H-H249R, S101A-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, A016S-S128N-A158E-R186H, V104L-S128N-R186H-S188D-H249R, A016S-S101A-S128N-R186H, A016S-N062E-S128N-R186H-E271F, A016S-S128N-R186H-E271F, S128N-P129E-R186H, A158E-R186H-H249R-E271F, A016S-A158E-H249R, A016S-A158E-R186H-H249R, A016S-T022A-A158E-R186H-E271F, E089P-S101A-P129E-R186H, T022A-S128N-A158E-R186H, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H, T022A-S128N-R186H-S188D-, N062E-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, T022A-A158E-R186H-H249R-E271F, T022A-V104L-A158E-H249R, S101A-L111V-P129E, A016S-A158E-H249R-E271F, A016S-L111V-S188D-, T022A-V104L-R186H-S188D-H249R и V104L-L148I-S188D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A001R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-G025R-N116A-Y167W, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S103N-S106G-Y167W-Q236N, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101A-H120F-A194F-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-S212F-A232V-Q245R, G020R-S144R-N185I-L233C-Q236N, G023A-S078R-S216F-Q236N-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-G115R-A232V-Q245R, P052N-S078R-S103N-L148I-T213A, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G025R-E089I-N116A-P239S-A270C, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, L148I-T213A-N252R, S024R-G025R-N183D-Y192W-P239S, G046R-A194F-S212M, V104L-L217E-T224A-H249R-N252R, G023A-Y091F-V121F-Y192W-Q236N, S101G-S103A-V104I-A232V-V244R-Q245R, S099F-S144R-Y167W-N252R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S078R-Y167W-S212M-A270C, V121F-N252R-A270C, G020R-S103N-S216F-Q236N-N252R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G023A-P052N-Y192W-I198L-N252R, G025R-G046R-V121F, S024R-S078R-V104L-N116A-N183D, G046R-Q059A-S103N-G211Q-S212M, G020R-P052N-N062Q-Y091F-Y192W, G023A-P052N-S144R-Y192W-S216F, S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, P052N-S103N-N116A-L148I-Y192W, E089I-N116A-N117F-T224A-H249R, S144R-G211Q-N238L-P239S-H249R, N043A-N062Q-A194F-G211Q, G020R-S024R-P052N-Q059A-S216F, S024R-Y167W-T224A-H249R, T057R-Y167W-H249R, G025R-S103N-R186K-A194F-T224A, S105T-S128N-S144R-L148I-S212M, G020R-Q059A-S144R-Y192W-T224A, S024R-N043A-N117F-A194F-G211Q, N117F-A194F-T213A-A270C, S078R-Y091F-V121F-L233C-N252R, T057R-S099F-S105T-I198L-T213A, G023A-Y091F-S101A-I198L-N252R, N062Q-S103N-V121F-S144R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, G023A-S024R-N117F-S212M-S216F, V104L-T213A-S216F, A194F-G211Q-Q236N, N062Q-S103N-N117F-A194F, S024R-N062Q-V104L-S106G-H249R, T057R-E089I-I198L, G046R-Q059A-S106G-L217E-H249R, N117F-T213A-A215F, S101A-H120F-Y192W-A215F-T224A, N043A-T057R-N117F-S144R-N183D, G046R-N183D-N238L, G025R-N043A-E089I-N117F, S078R-V104L-T213A-A215F-T224A, Y091F-S099F-S101A-S105T-Y167W, S106G-N117F-N238L, G046R-E089I-Y091F-S101A-N116A, G020R-N062Q-E089I-R186K-S212M, T057R-S099F-V121F-N185I-Y192W, G046R-E089I-Y192W-L233C-A270C, E089I-N117F-N185I-A215F-L233C, P052N-V104L-N183D-S216F-H249R, S078R-S099F-N116A-R186K-T224A, G025R-S105T-S128N-S144R-A270C, S105T-G211Q-S216F, S024R-G046R-Y091F-V121F, S106G-N185I-S216F-Q236N, N062Q-S101A-Q236N-N252R-A270C, G025R-N043A-Y091F-I198L-A270C, G020R-G023A-V104L-Y192W-L233C, S024R-N043A-S105T-S106G-I198L, G020R-E089I-L217E, S024R-Y091F-I198L-A215F-P239S, G046R-E089I-S099F-R186K-S212M, V104L-H120F-R186K-S216F-N252R, T022W-A194F-T213A-L233C-N238L, S099F-S105T-S106G-A194F-S212M, E089I-S105T-N116A-A215F-S216F, G025R-N116A-H120F-T224A-A270C, N043A-Q059A-S101A-S216F-T224A, T057R-N183D-Q236N, G025R-N062Q-S128N-S144R-N185I, S103N-H120F-Y167W-I198L-L233C, T022W-E089I-S216F, S024R-S106G-N116A-S212M-T224A, G020R-P052N-S101A-I198L-L233C, E089I-Y091F-N185I-G211Q-A270C, L111I-A215F-P239S, S024R-N116A-R186K-L233C-Q236N и G023A-S103N-S106G-S212M-A215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116S-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S103A-A232V-H249R, N018R-S101G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-H249R, N018R-T22K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V, N018R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S101G-S103A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-A232V-H249R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A215F-A232V-Q245R, S024R-S103A-V104I-H249R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101G-V104I-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-S103A-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-Q245R, S024R-S103A-Q245R, S024R-S103A-V104I-Q245R, G020R-S078R-S101G-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-V104I-H249R, N018R-S024R-V104I-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, R019H-G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S103A-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-S101G-V104I-A232V, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-S101G-V104I, G020R-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-Q245R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I-H249R, G020R-T22W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, S024R-N076D-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, A001T-N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-I198L-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, S024R-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, G020R-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, G020R-T022W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-T180A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S103A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-G211Q-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N076D-Q245R, S024R-V104I-Q245R, S101G-A232V, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-I198L-A232V-Q245R, S024R-Q245R-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, S024R-S101G-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-V104I, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T22W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, Q012H-G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-I198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-H249R, S024R-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-N076D-S103A-V104I-H249R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R-E271G, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, G020R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-S103A-M175L-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-Q245R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-A232V, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-S024R-N076D-I198M-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S103A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-V268G, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S103A-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N043R-R045T-N076D-S076T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A273T, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G-A232V, A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-V234I-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-A272V, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S103A-V104I-A232V, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-M117I-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A232V-Q245R, N018R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-Y209H-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-M175L-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I-Q245R, K027R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-V104I, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-N076D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-A114T-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022K-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V, N018R-S024R-N076D-N116A-H249R, G020R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-A232V-Q245R-, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A131V-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-S101G-Q245R, S024R-N076D-S101G-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-S101G, N018R-T22W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-I198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-I198L-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-V104I, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-L088I-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, S024R-N076D-Q245R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-N218S-A232V-Q245R, N018R-S103A, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, S024R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, K027R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-V104I, S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-R275S, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, V004M-N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, V104I-A232V-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-T274I, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R-A270V, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V, S101G-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-M175L-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-N269S, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R-T260K, N018R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-S103A-H249R, N018R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, G020R-S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272D, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-A232V, S024R-S103A-V104I, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N076D-S103A-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, S103A-V104I-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-A215F-H249R, A016T-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-A215F-H249R, N043R-N076D-S101G-S103T-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G115E-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101G, N076D-S101G-A232V-Q245R, N018R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-A215F-H249R, N018R-V104I-A232V, N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-H249R, S103A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-S103A-V104I-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-A131T-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-Q245R-H249R, N018R-N076D-A232V-H249R, N018K-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R-L267I, A232V-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, S024R-S101G-S103A-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-H249R, S103A-A232V-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-T274I, S024R-S103A-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, S103A-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-N263S, S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-V197A-T213A-A215F-H249R, S024R-S101G-S103A, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-A215F-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-V104I-A232V, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, G020R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-A150T-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, S024R-N076D-A232V-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116T-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-Q245R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N076D-S101G-V104I-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-Y209H-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-Q245R, N076D-S101G-V104I-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, G020R-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N204D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A209V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R-N269D, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-Y209H-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N076D-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-T213A-H249R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, G020R-A090S-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101G-Q245R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-Q245R, K027R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S103A-V104I-L135I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, P005S-N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-I198L-A215F-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-N243D-H249R, N018R-G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D-S101G, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, N018R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-Q245R, G020R-S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R-N269S, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-A086V-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-S101G-I198T-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-N183D-H249R-A248T, N018R-N076D-V104I-Q245R-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-N076D-S101G-V104I, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-N076D-V104I, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R-N263D, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-A215F-H249R-R269H, N018R-N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-H249R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-Y166F-A176P-A179V-N184T-A187P-A194P, N018R-T022W-S024R-D041E-N076D-S101A-S160T-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, S024R-N076D-V104I, N018R-N076D-S101G-A232V, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-S024R-L031F-N076D-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R-N269S, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N114T-I198L-G211Q-A215F-H249R, S024R-N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-A215F-H249R, S101G-V104I-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R-T260A, N076D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-T213A-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-H249R, N076D-V104I-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-N076D-S101G-S103A, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, S101G-S103A-A232V, S024R-N076D-S101G-A232V, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-A156V-N183D-G211Q-A215F-H249R-N269S, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-N076D-S101G, N018R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-H249R, N018R-N076D-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-A232V-Q245R, N018R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-N237D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R-R275S, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, S024R-N076D, N018R-S024R-N076D-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-T213A-A215F-H249R, N076D-V104I-A232V-H249R, N018R-N076D-S103A-A232V, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-D175E-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-A273E, G020R-S024R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, P005S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S103A-V104I-A232V, N018R-G020R-S024R-V068A-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R-R275S, N018R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R и N043D-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N018R-S024R-N043R-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N076D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-H249R-N269R, N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S078R-H249R, G020R-S101G-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101S-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104V-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043R-N076D-S078R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-L217E-H249R, N018R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D-H249R, G020R-S101A-S103G-V104V-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N076D-L217E-H249R-N269R и N018R-S024R-N076D-L217E-S242R-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-S101A-S103A-V104I-G118R-A232V-Q245R, G020R-S024R-N116A-T213A, N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, S024R-N043R-S101A-N116A, S024R-N043R-S101A-N116A-A215F-N269R, G020R-S101G-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, N043R-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-T213A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, S024R-N043R-N116A-A215F-N269R, G020R-S024R-T213A-A215F, G020R-N116A-N269R, S024R-N116A-T213A-N269R, N043R-S101A-N116A-N269R, S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-A215F-N269R, G020R-N043R-S101A-N269R, S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R-N269R, S024R-A215F-N269R, N043R-S101A-N116A-T213A-A215F-N269R, N043R-S101A-T213A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-S101A-N116A-T213A-N269R, S024R-N043R-R045T-N269R, G020R-N043R-R045T-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T, N043R-N116A-N269R, S024R-N043R-S101A-A215F-N269R, S024R-N043R-R045T-T213A-A215F-N269R, G020R-S024R-R045T-N269R, G020R-N043R-S101A-N116A-T213A-A215F, G020R-S101G-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N116A-N269R, G020R-S101A-N116A-N269R, S024R-N043R-A215F, G020R-S024R-T213A, S024R-N043R-S101A-A215F, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-S024R-S101A-A215F, G020R-S024R-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-N116A, G020R-S024R-S101A-N116A, N043R-T213A-A215F-N269R, S024R-S101A-N269R, S024R-N043R-N116A-A215F, G020R-T038A-N043R-S101A, G020R-S024R-N116A-A215F, S024R-N043R-S101A-T213A, P014L-G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-A215F, G020R-S024R-A215F, G020R-N116A-A215F-N269R, G020R-R045T-N116A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-A215F и G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A-A215F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A114V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F и N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R и N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-G102A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F и T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101S-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103G-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S101S-S103A-V104V-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: V026F-V051W-V104L-S106E, V026F-L031F-S078N-G102A-S160D, G020K-G100S-N116L-A158E-S166D-N243F, T033S-N043W-N218D-P239G-N243F, T022L-T038F-A048R-N062E-G100S-R186K, S101D-S103N-N116L-S144R-A215D, V104L-S105T-T213A-L217E-S256N, N043W-S101D-S212M-N243F, V026F-A048R-S105T-T213A-N218D-T224A, S024F-S101D-G118R-A215D-L250I-A272F, V121F-N185E-T224A-P239G, T022L-L031F-G102A-S128D-T224A-N243F, N062E-S078N-G102A-N116L-S144R-L250I, T022L-T038F-V121F-S160D-A272F, V026F-S078N-G159C-R186K-N243F, S024F-A048R-G118R-S166D-L217E, G023A-T038F-S078N-G100S-S212M-A215D, G100S-N116L-A158E-T213A, S078N-V104L-G118R-S128D, G102A-S103N-S105T-A194E, T022L-S078N-S128D-T213A, K027R-G100S-G118R-S160D-S188D-N243F, S024F-G102A-R186K-T213A-L217E-N243F, T033S-S105T-S188D-S216F, G023A-G100S-A194E-S212M, A048R-S128D-N185E-P239G, G020K-S024F-T033S-P129E-A194E, G020K-K027R-P129E-S166D-P239G, T022L-G023A-K027R-S101D-V104L-S216F, T033S-G118R-P129E-A194E-P239G, T022L-S078N-N116L-P129E-S256N, K027R-S101D-S103N-S105T-A272F, A048R-S078N-N116L-N185E-L217E-P239G, G023A-S024F-K027R-N062E, S024F-S103N-V104L-G118R-S188D, V026F-V104L-S256N-A272F, S024F-N043W-V104L-V121F-P129E, N062E-S078N-N116L-T224A, G023A-S024F-V051W-A158E, K027R-T038F-G102A-N116L, N062E-S078N-S144R-S212M, L031F-N116L-S256N-A272F, T022L-T033S-V104L-N116L-S160D-R186K, S024F-G118R-P129E-R186K-T213A, N043W-S105T-T213A-A215D-S216F, L031F-S105T-R186K-S188D, V026F-A194E-T213A-S256N и S103N-S160D-L250I-S256N, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N062E-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-N062E-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F и T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-S024F-N062E-S188D-P239G, S024F-N062E-N116L-P239G, G020K-G023A-N062E-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-G118R-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D-T213A-P239G, G023A-N062E-N116L-G118R, G023A-S024F-N062E-N116L-G118R, S024F-N116L, S024F-N062E-S188D-T213A, G023A-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-S024F-N062E, G020K-N043W-N062E-N116L-P239G, S024F-N062E-N116L-T213A-P239G, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-N116L-S188D-T213A, S024F-N062E-S188D-P239G, G023A-N043W-N062E-N116L-G118R-T213A, N062E-S188D-P239G, G020K-S024F-N062E-P239G, S024F-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-S188D-T213A-P239G, S024F-N043W-G118R-S188D, G023A-S024F-N116L-G118R-S188D-T213A, G020K-G023A-N043W-N116L-S188D-T213A-P239G, G023A-S024F-N116L-S188D-P239G, G023A-N043W-N116L-G118R-S188D, G023A-S024F-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R, G020K-N043W-S188D-T213A, S024F-N062E-G118R-P239G, G023A-N043W-S188D-T213A, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-N116L-S188D-P239G, G020K-N043W-N062E-G118R, G020K-N043W-N116L-S188D-T213A, G020K-S024F, G023A-N043W-N116L-P239G, G023A-S024F-N043W-N116L-G118R-S188D-P239G, G020K-G023A-N043W-T213A и G023A-S024F-N062E-G118R-T213A-P239G, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020K-G023A-N043W-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D, S024F-G118R-S128I-P129E-G159D, G020K-S024F-N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-N062E-N116L-S188D, N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D, N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-N062E-N116L-T213A, G020K-G023A-N062E-N116L, G020K-N062E-S188D-T213A, G020K-N062E, G020K-S024F-N062E-N116L-S188D, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D, G020K-S024F-N062E-S188D-T213A, N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-N062E-N116L, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D-T213A, G023A-S024F-N062E-N116L-T213A, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, S024F-N062E-N116L-S188D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, G023A-N062E-N116L-S188D, N043W-N062E-N116L, G020K-G023A-N116L-S188D, N043W-N062E-N116L-S188D, S024F-N062E-N116L, N062E-N116L-S188D и T022A-S024R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-N248D, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S087R-S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-Q109R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R, N076D-S87R-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-Q109R, N076D-S103A-V104I-S212P-E271V, N076D-S103A-V104I-Q109R-Q245R и N076D-S103A-V104I-S212P-Q245L-E271V, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-P086W-G118R, S024R-S078R-P086W-N243F, S024R-T033S-P086S-S087N-Y209A, T033S-G118R, S024R-S078R-P086W-G118R-A270T, S024R-T033S-P086W-G118R, S078R-P086W-N243F, T033S-S078R-P086W-G118R-Y209A, T033S-S078R-Y209A, P086W-G118R-N243F, S024R-P086W, S078R-P086W-K235F, S024R-G118R, S024R-P086R, S101G-S103A-V104I-A232V, S024R-T033S-S078R-P086W-G118R, S024R-G118R-Y209A, Y209A-W241R, T033S-P086W-N243F, T033S-A172V-Y209A, G118R-Y209A-N243F, S024R-P086S-S141G, S024R-G118R-Y209A-N243F, S024R-T033S-P086S-S085N-K235F, S024R-T033S-A133V, S024R-T033S-S078R-P086W, S024R-P086W-Y209A, S024R-W241R, T033S-G118R-N243F, S024R-K235F, S024R-S078R-P086W, S024R-G118R-Y209A-K235F, S024R-Y209A-W241R, T033S-G118R-W241R, P086W-G118R-Y209A, T033S-G118R-G159D-Y209A, T033S-S078R-P086W, S024R-P086W-N243F, G118R-Y209A, S024R-P086W-G118R-V203I, S078R-Y209A-K235F, S024R-T033S-W241R, S078R-G118R, T033S-G118R-Y209A-N243F, L021M-S024R-T033S, S024R-T033S-P086W, T033S-K235F, S078R-P086W-Y209A, S024R-T033S-Y209A-K235F, T033S-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-Y209A, T033S-P086W-G118R-Y209A-N243F, P086W-Y209A-N243F, P005S-S078R-G118R-W241R, S024R-A174T, T033S-Y209A-N243F, P086W-G118R-A133V, S024R-T033S-G118R, S024R-P086W-Y209A-K235F, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, P005S-S024R-T033S-N243F, S024R-Y209A-S242P, S024R-T033S-S078R-G118R, S024R-T033S-A194T, S024R-N243F, S024R-Y209A, S024R-T033S-G118R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, S024R-T033S-S078R-N243F, P086W-N243F, T033S-G118D-A138V-Y209A, T033S-Y209A-K235F, S024R-P086R-G118R, T033S-P201S, S024R-P239Q, T033S-G118R-Y209A-, S078R-P086W, K235F-N243F, S024R-Y209A-K235F, G118R-A172V, H017Y-S024R-T033S-P086W, T033S-L148F, S024R-G118R-K235F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, G118R-Y209A-K235F, S024R-T033S-Y209A-N243F, S024R-T033S-K235F, S024R-T033S-G118R-K235F, S024R-S141G, S024R-T274I, S024R-T033S-Y209A, P086W-K235F, S024R-Y209A-N243F, V004E-T033S-S078R, P086W-Y209A-K235F, A015T-T033S, T033S-P086W-S156L-Y209A, S024R-G118R-N243F-R269H, Y209A-K235F, S024R-R247H, S024R-T033S-A228T, S078R-K235F, S024R-T033S-A174V-K235F, S024R-K235F-N243F, S024R-T033S-K235F-W241R, S024R-T033S-A151V, S024R-V104A, T033S-A048T, Q012H-V104A-G118R, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, S024R-T033S-N243F, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-T033S-P129H-N184D-T253M, S024R-A085V-P086W-G118R-K235F, S024R-A272P и S024R-R269C, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: G020R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-G020R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N043R-N076D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S078R-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R-N269R, N018R-S024R-N076D-S087D-S242R-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-V150L-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-H249R, N018R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S024R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S078R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-V150L-H249R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N018R-S024R-N043D-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-S087D-H249R, N018R-S024R-N076D-V150L-S242R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, N076D-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N076D-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R и S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-S242R-Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-K027R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222Q-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R и N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенные варианты субтилизина, где варианты субтилизина представляют собой зрелые формы, обладающие протеолитической активностью, и включают аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271G, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R и S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления подходящие варианты протеазы, функциональные в холодной воде, включают варианты субтилизинов, в частности, полученные из GG36 Bacillus lentus с SEQ ID NO:2, где варианты включают три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или даже 25 мутаций в группе положений, включающей положения 1, 2, 4, 9, 10, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 42, 43, 46, 52, 57, 59, 62, 68, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 82, 86, 89, 91, 94, 100, 101, 103, 104, 106, 108, 111, 112, 115, 117, 118, 121, 128, 129, 144, 148, 158, 159, 160, 166, 185, 186, 188, 197, 203, 209, 210, 212, 214, 215, 217, 224, 230, 231, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 248, 249, 250, 252, 253, 262, 263, 265, 267, 269, 271 и 272.
В некоторых вариантах осуществления подходящие варианты протеазы, функциональные в холодной воде, включают варианты субтилизинов, в частности, полученные из GG36 Bacillus lentus с SEQ ID NO:2, где варианты включают суммарно три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или даже 25 мутаций, выбранных из: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N, N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F; и необязательно одну или более из следующих мутаций: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K.
В некоторых вариантах осуществления вариант протеазы, функциональный в холодной воде, включает одну или более мутаций, и при этом обладает общим зарядом -5, -4, -3, -2, -1 или 0 по отношению к субтилизину GG36 дикого типа B. lentus (SEQ ID NO:2).
В некоторых вариантах осуществления варианты протеазы, функциональные в холодной воде, представляют собой варианты протеазы, функциональные при низкой ионной силе и в холодной воде. Такие варианты протеазы, функциональные при низкой ионной силе и в холодной воде, включают одну или более мутаций и при этом обладают общим зарядом -5, -4, -3, -2, -1 или 0 по отношению к протеазе субтилизин GG36 дикого типа B. lentus (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления эти мутации выбраны из двух или более из следующих мутаций: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, T22A, T22R, S24R, G25V, V26F, L42I, P52F, P52E, P52N, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, S78R, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, A108I, L111V, E112V, G115K, N117F, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, R186H, S188E, S188D, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, N248V, H249R, L250I, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H и A272F; и/или одного или более из следующих наборов мутаций: N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271F, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D и S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутые варианты протеазы, функциональные при высокой ионной силе и в холодной воде, формируют часть моющей композиции, которую разводят в воде, как правило, в стиральной машине, с образованием моющей жидкости с моющим средством для белья, чья электропроводность составляет от приблизительно 0,1 мСм/см до приблизительно 3 мСм/см, от приблизительно 0,3 мСм/см до приблизительно 2,5 мСм/см или даже от приблизительно 0,5 мСм/см до приблизительно2 мСм/см.
В некоторых вариантах осуществления варианты протеазы, функциональные в холодной воде, представляют собой варианты протеазы, функциональные при высокой ионной силе и в холодной воде. Такие варианты протеазы, функциональные при высокой ионной силе и в холодной воде, включают две или более мутации и обладают общим зарядом +5, +4, +3, +2, +1 или 0 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus дикого типа (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления эти мутации выбраны из двух или более из следующих мутаций: V4R, H17R, N18R, G20R, T22R, S24R, S24W, G25R, N43R, N43A, G46R, P52F, P52N, T57R, Q59A, N62Q, T71G, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89W, E89T, E89I, E89H, E89V, V104L, S106V, S106G, G115R, G118I, V121F, S144R, N185I, D197F, Y209N, Y209S, L217E, A231I, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, H249R, N252R, T253R, E271T, E271V, E271L, E271H, E271F, E271P, A1R, S9A, S212F и N269R; и/или одного или более из следующих наборов мутаций T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутые варианты протеазы, функциональные при высокой ионной силе и в холодной воде, формируют часть моющей композиции, которую разводят в воде, как правило, в стиральной машине, для формирования моющей жидкости с моющим средством для белья, электропроводность которой составляет от приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно10 мСм/см.
Заряд вариантов протеазы, функциональных в холодной воде, выражают относительно протеазы субтилизин GG36 дикого типа B. lentus с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Аминокислотами, которые придают единичный отрицательный заряд, являются D и E, а аминокислотами, которые придают единичный положительный заряд, являются R, H и K. Для расчета заряда варианта протеазы, функционального в холодной воде, используют любое изменение аминокислоты по сравнению SEQ ID NO:2, которое изменяет заряд. Например, введение мутации с отрицательным зарядом за счет нейтрального положения дикого типа будет добавлять суммарный заряд -1 к варианту протеазы, функциональному в холодной воде, в то время как введение мутации с отрицательным зарядом (D или E) за счет положительного аминокислотного остатка дикого типа (R, H или K) будет добавлять суммарный заряд -2. Суммирование изменений зарядов от всех аминокислотных остатков, которые являются отличными для варианта протеазы, функционального в холодной воде, по сравнению с протеазой субтилизин GG36 дикого типа B. lentus с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, дает изменение заряда варианта протеазы, функционального в холодной воде. Не желая быть связанным теорией, полагают, что предпочтительный диапазон заряда для протеаз, функциональных в холодной воде, для применения в растворах моющих средств для белья с низкой проводимостью составляет -5, -4, -3, -2, -1, 0, в частности, -2, -1; предпочтительный диапазон заряда для протеаз, функциональных в холодной воде, для применения в растворах моющих средств для белья с высокой проводимостью составляет +5, +4, +3, +2, +1, 0, в частности, +2, +1. Путем соответствующего подбора заряда можно получить неожиданно повышенные уровни очищающего действия в холодной воде. “Растворы моющих средств для белья с низкой проводимостью” определяют как обладающие проводимостью от приблизительно 0,1 мСм/см до приблизительно 3 мСм/см, от приблизительно 0,3 мСм/см до приблизительно 2,5 мСм/см или даже от приблизительно 0,5 мСм/см до приблизительно 2 мСм/см. “Растворы моющих средств для белья с высокой проводимостью” определяют как обладающие проводимостью от приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см. Подразумевают, что вышеприведенные примеры являются неограничивающими. После комбинирования мутаций для оптимизации действия в холодной воде заряд фермента также можно уравновесить с помощью мутаций в дополнительных положениях.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенную, рекомбинантную, по существу чистую или не встречающуюся в природе вариантную протеазу (например, вариантный субтилизин), обладающую протеолитической активностью, причем указанная вариантная протеаза включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, не более чем по 50, не более чем по 45, не более чем по 40, не более чем по 35, не более чем по 30, не более чем по 25, не более чем по 20, не более чем по 19, не более чем по 18, не более чем по 17, не более чем по 16, не более чем по 15, не более чем по 14, не более чем по 13, не более чем по 12, не более чем по 11, не более чем по 10, не более чем по 9 или не более чем по 8 аминокислотным остаткам, где аминокислотные положения пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено с помощью выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, где вариантный субтилизин включает замены 101G/103A/104I/159D/232V/236H/245R/248D/252K.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенную, рекомбинантную, по существу чистую или не встречающуюся в природе вариантную протеазу (например, вариантный субтилизин), обладающую протеолитической активностью, причем указанная вариантная протеаза включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, не более чем по 50, не более чем по 45, не более чем по 40, не более чем по 35, не более чем по 30, не более чем по 25, не более чем по 20, не более чем по 19, не более чем по 18, не более чем по 17, не более чем по 16, не более чем по 15, не более чем по 14, не более чем по 13, не более чем по 12, не более чем по 11, не более чем по 10, не более чем по 9, не более чем по 6, не более чем по 5, не более чем по 4, не более чем по 3, не более чем по 2 аминокислотным остаткам, где аминокислотные положения пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как определено с помощью выравнивания аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, где вариантный субтилизин включает замену 87N.
Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно получить с помощью любых подходящих методик синтеза, обращения и/или выделения или их комбинаций. Например, полинуклеотид настоящего изобретения можно получить с помощью стандартных методик синтеза нуклеиновых кислот, таких как методики твердофазного синтеза, которые хорошо известны специалистам в данной области. В таких методиках, как правило, синтезируют фрагменты длиной до 50 или более нуклеотидных оснований, затем соединяют (например, с помощью способов ферментного или химического сшивания или способов с применением рекомбинации, опосредованной полимеразой) с образованием фактически любой требуемой непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты. Синтез нуклеиновых кислот настоящего изобретения также можно облегчить (или, альтернативно, совершить) с помощью любого подходящего способа, известного из уровня техники, включая, но без ограничений, химический синтез с применением классического фосфорамидитного способа (см., например, Beaucage et al. Tetrahedron Letters 22:1859-69 [1981]); или способ, описанный у Matthes et al. (см., Matthes et al., EMBO J. 3:801-805 [1984], который, как правило, применяют на практике в автоматических способах синтеза. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения также можно получить с применением автоматического ДНК-синтезатора. Нуклеиновые кислоты с учетом конкретных особенностей можно заказать у ряда коммерческих источников (например, The Midland Certified Reagent Company, the Great American Gene Company, Operon Technologies Inc. и DNA2.0). Другие методики синтеза нуклеиновых кислот и связанные с ними подходы известны из уровня техники (см., например, Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323 [1984]; и Itakura et al., Science 198:1056 [1984]).
Как указано выше, методики с применением рекомбинантных ДНК, пригодные в модификации нуклеиновых кислот, хорошо известны из уровня техники. Например, такие методики, как расщепление эндонуклеазами рестрикции, сшивание, обратная транскрипция и получение кДНК, и полимеразная цепная реакция (например, ПЦР) известны и легко используются специалистами в данной области. Нуклеотиды настоящего изобретения также можно получить путем скрининга библиотек кДНК (например, библиотек кДНК, созданных с помощью методик мутагенеза, традиционно применяемых в данной области, включая описанные в настоящем изобретении) с применением одного или более олигонуклеотидных зондов, которые могут гибридизироваться с полинуклеотидами, которые кодируют полипептид(ы) вариантной протеазы настоящего изобретения, или ПЦР-амплифицировать их. Процедуры скрининга и выделения кДНК-клонов и процедуры ПЦР-амплификации хорошо известны специалистам в данной области и описаны в стандартных справочниках, известных специалистам в данной области. Некоторые нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно получить путем изменения встречающегося в природе полинуклеотидного остова (например, который кодирует фермент или исходную протеазу), например, с помощью известной процедуры мутагенеза (например, сайт-направленный мутагенез, сайт-насыщающий мутагенез и рекомбинация in vitro).
Способы получения модифицированных вариантных протеаз настоящего изобретения
В области техники известен ряд способов, которые подходят для получения модифицированных полинуклеотидов настоящего изобретения, кодирующих вариантные протеазы настоящего изобретения, включая, но без ограничений, например, сайт-насыщающий мутагенез, сканирующий мутагенез, мутагенез методом микроинъекций, делеционный мутагенез, неспецифический мутагенез, сайт-направленный мутагенез и направленная эволюция, а также различные другие рекомбинаторные подходы. Способы получения модифицированных полинуклеотидов и белков (например, вариантных протеаз) включают методики перестановки в ДНК, способы на основе негомологичной рекомбинации генов, такие как ITCHY (см., Ostermeier et al., Bioorg. Med. Chem.7:2139-44 [1999]), SCRACHY (см., Lutz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA98:11248-53 [2001]), SHIPREC (см., Sieber et al., Nat. Biotechnol.19:456-60 [2001]) и NRR (см., Bittker et al., Nat. Biotechnol.20:1024-9 [2001]; Bittker et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA101:7011-6 [2004]), и способы, которые основаны на применении олигонуклеотидов для вставки неспецифичных и нацеленных мутаций, делеций и/или вставок (см., Ness et al., Nat. Biotechnol.20:1251-5 [2002]; Coco et al., Nat. Biotechnol. 20:1246-50 [2002]; Zha et al., Chembiochem.4:34-9 [2003]; Glaser et al., J. Immunol.149:3903-13 [1992]).
Векторы, клетки и способы получения вариантных протеаз настоящего изобретения
Настоящее изобретение предоставляет выделенные или рекомбинантные векторы, включающие по меньшей мере один полинуклеотид настоящего изобретения, описываемый в настоящем изобретении (например, полинуклеотид, кодирующий вариантную протеазу настоящего изобретения, описываемую в настоящем изобретении), выделенные или рекомбинантные векторы экспрессии или кассеты экспрессии, включающие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид настоящего изобретения, выделенные, по существу чистые или рекомбинантные ДНК-конструкции, включающие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид настоящего изобретения, выделенные или рекомбинантные клетки, включающие по меньшей мере один полинуклеотид настоящего изобретения, культуры клеток, включающие клетки, которые включают по меньшей мере один полинуклеотид настоящего изобретения, культуры клеток, включающие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид настоящего изобретения, и композиции, включающие один или более таких векторов, нуклеиновых кислот, векторов экспрессии, кассет экспрессии, ДНК-конструкций, клеток, культур клеток или любую их комбинацию или смеси.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет рекомбинантные клетки, включающие по меньшей мере один вектор (например, вектор экспрессии или ДНК-конструкцию) настоящего изобретения, который включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или полинуклеотид настоящего изобретения. Некоторые такие рекомбинантные клетки трансформированы или трансфицированы по меньшей мере одним таким вектором. Такие клетки, как правило, называют клетками-хозяевами. Некоторые такие клетки включают бактериальные клетки, включая, но без ограничений, клетки Bacillus sp., такие как, клетки B. subtilis. Настоящее изобретение также предоставляет рекомбинантные клетки (например, рекомбинантные клетки-хозяева), включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет вектор, включающий нуклеиновую кислоту или полинуклеотид настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления данным вектором является вектор экспрессии или кассета экспрессии, у которых полинуклеотидная последовательность настоящего изобретения, которая кодирует вариантную протеазу настоящего изобретения, функционально связана с одним сегментом или дополнительными сегментами нуклеиновой кислоты, необходимыми для эффективной экспрессии гена (например, промотором, функционально связанным с полинуклеотидом настоящего изобретения, который кодирует вариантную протеазу настоящего изобретения). Вектор может включать терминатор транскрипции и/или ген для отбора, такой как ген устойчивости к антибиотику, который делает возможным непрерывное поддержание культуры инфицированных плазмидой клеток-хозяев путем выращивания в средах, содержащих противомикробное средство.
Вектор экспрессии может происходить от плазмидной или вирусной ДНК или, в альтернативных вариантах осуществления, содержит элементы их обеих. Иллюстративные векторы включают, но без ограничений, pXX, pC194, pJH101, pE194, pHP13 (см., Harwood and Cutting [eds.], Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]; подходящие реплицирующиеся плазмиды для B. subtilis включают таковые, перечисленные на странице 92; см. также, Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, in Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C. [1993], pp. 615-624).
Для экспрессии и продуцирования представляющего интерес белка (например, вариантной протеазы) в клетке по меньшей мере один вектор экспрессии, включающий по меньшей мере одну копию полинуклеотида, кодирующего модифицированную протеазу, и предпочтительно включающий множество копий, трансфицируют в клетку в условиях, подходящих для экспрессии протеазы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полинуклеотидную последовательность, кодирующая вариантную протеазу (а также другие последовательности, включенные в вектор), встраивают в геном клетки-хозяина, в то время как в других вариантах осуществления плазмидный вектор, включающий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариантную протеазу, остается в качестве автономного внехромосомного элемента в клетке. Настоящее изобретение предоставляет как внехромосомные элементы нуклеиновой кислоты, так и входящие нуклеотидные последовательности, которые встроены в геном клетки-хозяина. Векторы, описанные в настоящем изобретении, пригодны для продуцирования вариантных протеаз настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция, кодирующая вариантную протеазу, присутствует на встраивающемся векторе, что делает возможным встраивание и, необязательно, амплификацию полинуклеотида, кодирующего вариантную протеазу, в бактериальную хромосому. Примеры сайтов для встраивания хорошо известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления транскрипция полинуклеотида, кодирующего вариантную протеазу настоящего изобретения, запускается промотором, который является промотором дикого типа для выбранной протеазы-предшественника. В некоторых других вариантах осуществления промотор является гетерологичным по отношению к протеазе-предшественнику, но функционален в клетке-хозяине. В частности, примеры подходящих промоторов для применения в бактериальных клетках-хозяевах включают, но без ограничений, например, промоторы amyE, amyQ, amyL, pstS, sacB, pSPAC, pAprE, pVeg, pHpaII, промотор гена мальтогенной амилазы B. stearothermophilus, гена амилазы B. amyloliquefaciens (BAN), гена щелочной протеазы B. subtilis, гена щелочной протеазы B. clausii, гена ксилозидазы B. pumilis, cryIIIA B. thuringiensis и гена альфа-амилазы B. licheniformis. Дополнительные промоторы включают, но без ограничений, промотор A4, а также промоторы фага лямбда PR или PL и промоторы lac, trp или tac E. coli.
Вариантные протеазы настоящего изобретения можно получать в клетках-хозяевах любого подходящего грамположительного микроорганизма, включая бактерии и грибы. Например, в некоторых вариантах осуществления вариантную протеазу получают в клетках-хозяевах грибного и/или бактериального происхождения. В некоторых вариантах осуществления клетками-хозяевами являются Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp. или Aspergillus sp. В некоторых вариантах осуществления вариантные протеазы продуцируются клетками-хозяевами Bacillus sp. Примерами клеток-хозяев Bacillus sp., которые находят применение в получении вариантных протеаз настоящего изобретения, включают, но без ограничений B. licheniformis, B. lentus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. coagulans, B. circulans, B. pumilis, B. thuringiensis, B. clausii и B. megaterium, а также другие организмы рода Bacillus. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева B. subtilis применяют для получения вариантных протеаз. Патенты США 5264366 и 4760025 (RE 34606) описывают различные штаммы-хозяева Bacillus, которые можно применять для получения вариантных протеаз настоящего изобретения, хотя можно применять другие подходящие штаммы.
Несколько промышленных бактериальных штаммов, которые можно применять для получения вариантных протеаз настоящего изобретения, включают нерекомбинантные (т.е., дикого типа) штаммы Bacillus sp., а также варианты встречающихся в природе штаммов и/или рекомбинантных штаммов. В некоторых вариантах осуществления штамм-хозяин представляет собой рекомбинантный штамм, где в хозяина был введен полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид. В некоторых вариантах осуществления штамм-хозяин представляет собой штамм-хозяин B. subtilis, и в частности, рекомбинантный штамм-хозяин Bacillus subtilis. Известны многочисленные штаммы B. subtilis, включая, но без ограничений, например, штамм 1A6 (ATCC 39085), 168 (1A01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753-PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39,087), ATCC 21332, ATCC 6051, MI113, DE100 (ATCC 39,094), GX4931, PBT 110 и PEP 211 (см., например, Hoch et al., Genetics 73:215-228 [1973]; см. также, патенты США №№ 4450235, и 4302544, и EP 0134048, каждый из которых включен при помощи ссылки в своем полном объеме). Применение B. subtilis в качестве клеток-хозяев для экспрессии хорошо известно в области техники (см., например, Palva et al., Gene 19:81-87 [1982]; Fahnestock and Fischer, J. Bacteriol., 165:796-804 [1986]; и Wang et al., Gene 69:39-47 [1988]).
В некоторых вариантах осуществления клеткой-хозяином Bacillus является Bacillus sp., которая включает мутацию или делецию по меньшей мере в одном из следующих генов: degU, degS, degR и degQ. Предпочтительно мутация находится в гене degU и более предпочтительно мутацией является degU(Hy)32 (см., например, Msadek et al., J. Bacteriol. 172:824-834 [1990]; и Olmos et al., Mol. Gen. Genet. 253:562-567 [1997]). Одним подходящим штаммом-хозяином является Bacillus subtilis, несущий мутацию degU32(Hy). В некоторых вариантах осуществления хозяин Bacillus включает мутацию или делецию в scoC4 (см., например, Caldwell et al., J. Bacteriol. 183:7329-7340 [2001]); spoIIE (см., например, Arigoni et al., Mol. Microbiol. 31:1407-1415 [1999]); и/или oppA или других генах оперона opp (см., например, Perego et al., Mol. Microbiol. 5:173-185 [1991]). Действительно, предполагается, что любая мутация в опероне opp, которая обуславливает такой же фенотип, что и мутация в гене oppA, будет находить применение в некоторых вариантах осуществления измененного штамма Bacillus настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления эти мутации встречаются поодиночке, в то время как в других вариантах осуществления присутствуют комбинации мутаций. В некоторых вариантах осуществления измененным штаммом клеток-хозяев Bacillus, который можно применять для получения вариантной протеазы настоящего изобретения, является штамм-хозяин Bacillus, который уже включает мутацию в одном или более вышеупомянутых генах. Кроме того, находят применение клетки-хозяева Bacillus sp., которые включают мутацию(и) и/или делеции эндогенных генов протеазы. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин Bacillus включает делецию генов aprE и nprE. В других вариантах осуществления клетка-хозяин Bacillus sp. включает делецию 5 генов протеазы, в то время как в других вариантах осуществления клетка-хозяин Bacillus sp. включает делецию 9 генов протеаз (см., например, заявку на патент США с номером публикации 2005/0202535, включенную в настоящее изобретении при помощи ссылки).
Клетки-хозяева трансформируют по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения, с помощью любого подходящего способа, известного из уровня техники. Независимо от того, встроена ли нуклеиновая кислота в вектор или применяется без наличия плазмидной ДНК, ее, как правило, вводят в микроорганизм, в некоторых вариантах осуществления, предпочтительно в клетку E. coli или компетентную клетку Bacillus. Способы введения нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетки Bacillus или клетки E. coli с использованием плазмидных ДНК-конструкций или векторов и трансформации таких плазмидных ДНК-конструкций или векторов в такие клетки являются хорошо известными. В некоторых вариантах осуществления плазмиды затем выделяют из клеток E. coli и трансформируют в клетки Bacillus. Однако, применение промежуточных микроорганизмов, таких как E. coli, не является обязательным, и в некоторых вариантах осуществления ДНК-конструкцию или вектор непосредственно вводят в хозяина Bacillus.
Специалисты в данной области хорошо осведомлены о подходящих способах введения последовательностей нуклеиновых кислот или полинуклеотидных последовательностей настоящего изобретения в клетки Bacillus (см., например, Ferrari et al., “Genetics,” in Harwood et al. [eds.], Bacillus, Plenum Publishing Corp. [1989], pp. 57-72; Saunders et al., J. Bacteriol. 157:718-726 [1984]; Hoch et al., J. Bacteriol. 93:1925 -1937 [1967]; Mann et al., Current Microbiol. 13:131-135 [1986]; Holubova, Folia Microbiol. 30:97 [1985]; Chang et al., Mol. Gen. Genet. 168:11-115 [1979]; Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett. 7:261-263 [1980]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol. 51:634 [1986]; Fisher et al., Arch. Microbiol. 139:213-217 [1981]; и McDonald, J. Gen. Microbiol. 130:203 [1984]). Действительно, такие способы, как трансформация, включая протопластную трансформацию и конгрессию, трансдукция и слияние протопластов хорошо известны и подходят для применения в настоящем изобретении. Способы трансформации применяют для введения ДНК-конструкции или вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу настоящего изобретения, в клетку-хозяина. Известные в данной области способы трансформации клеток Bacillus включают такие способы, как плазмидная трансформация со спасением маркера, которая включает поглощение донорной плазмиды компетентными клетками, несущими частично гомологичную резидентную плазмиду (см., Contente et al., Plasmid 2:555-571 [1979]; Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223:185-191 [1990]; Weinrauch et al., J. Bacteriol. 154:1077-1087 [1983]; и Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169:1205-1211 [1987]). В данном способе входящая донорная плазмида рекомбинируется с гомологичным участком резидентной “хелперной” плазмиды в процессе, который имитирует хромосомную трансформацию.
В дополнение к традиционно применяемым способам в некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева непосредственно трансформируют ДНК-конструкцией или вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу настоящего изобретения (т.е., не используют промежуточную клетку для амплификации, или иного процесса, ДНК-конструкции или вектора перед введением в клетку-хозяина). Введение ДНК-конструкции или вектора настоящего изобретения в клетку-хозяина включает такие физические и химические способы, которые известны из уровня техники для введения последовательности нуклеиновой кислоты (например, последовательности ДНК) в клетку-хозяина без вставки в плазмиду или вектор. Такие способы включают, но без ограничений, осаждение при добавлении хлорида кальция, электропорацию, "голую" ДНК, липосомы и т.п. В дополнительных вариантах осуществления ДНК-конструкции или вектор совместно трансформируют с плазмидой, без вставки в плазмиду. В дополнительных вариантах осуществления селектируемый маркер удаляют из измененного штамма Bacillus при помощи способов, известных в области техники (см., Stahl et al., J. Bacteriol. 158:411-418 [1984]; и Palmeros et al., Gene 247:255 -264 [2000]).
В некоторых вариантах осуществления трансформированные клетки настоящего изобретения культивируют в традиционных питательных средах. Подходящие конкретные условия культивирования, такие как температура, pH и т.п., известны специалистам в данной области и хорошо раскрыты в научной литературе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет культуру (например, культуру клеток), включающую по меньшей мере одну вариантную протеазу или по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Также представлены композиции, включающие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, вектор или ДНК-конструкцию настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева, трансформированные по меньшей мере одной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения, культивируют в подходящей питательной среде в условиях, допускающих экспрессию настоящей протеазы, после чего полученную протеазу выделяют из культуры. Среда, применяемая для культивирования клеток, включает любую традиционную среду, подходящую для выращивания клеток-хозяев, такую как минимальная или комплексная среды, содержащие соответствующие дополнения. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или их можно приготовить в соответствии с опубликованными прописями (см., например, каталоги Американской коллекции типовых культур). В некоторых вариантах осуществления протеазу, продуцируемую данными клетками, выделяют из культуральной среды при помощи традиционных процедур, включая, но без ограничений, например, отделение клеток-хозяев от среды центрифугированием или фильтрацией, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата посредством соли (например, сульфата аммония), хроматографической очистки (например, ионообмен, гель-фильтрация, аффинность и т.д.). В настоящем изобретении находит применение любой способ, подходящий для выделения или очистки вариантной протеазы.
В некоторых вариантах осуществления вариантная протеаза, продуцируемая рекомбинантной клеткой-хозяином, секретируется в культуральную среду. Для облегчения очистки растворимых белков можно применять последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует домен, облегчающий очистку. Вектор или ДНК-конструкция, включающая полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариантную протеазу, могут дополнительно включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую домен, облегчающий очистку, для облегчения очистки вариантной протеазы (см., например, Kroll et al., DNA Cell Biol. 12:441-53 [1993]). Такие домены, облегчающие очистку, включают, но без ограничений, например, металлхелатирующие пептиды, такие как модули гистидин-триптофан, которые делают возможной очистку на иммобилизированных металлах (смотри, Porath, Protein Expr. Purif. 3:263-281 [1992]), домены белка A, которые делают возможной очистку на иммобилизированном иммуноглобулине, и домен, используемый в системах очистки с FLAGS-достройкой/аффинностью (например, домены белка A, доступные от Immunex Corp., Сиэтл, Вашингтон). Для облегчения очистки также находит применение включение расщепляемой линкерной последовательности, такой как для фактора XA или энтерокиназы (например, последовательности, доступные от Invitrogen, Сан Диего, Калифорния), между доменом для очистки и гетерологичным белком.
Хорошо известны анализы для определения и измерения ферментативной активности фермента, такого как вариантная протеаза настоящего изобретения. Рядовым специалистам в данной области также известны различные анализы для определения и измерения активности протеаз (например, вариантных протеаз настоящего изобретения). В частности, доступны анализы для измерения активности протеазы, которые основаны на высвобождении растворимых в кислоте пептидов из казеина или гемоглобина, измеряемом в виде поглощения при 280 нм или колорометрически с помощью способа Фолина, хорошо известного специалистам в данной области. Одни иллюстративные анализы включают солюбилизацию хромогенных субстратов (см., например, Ward, “Proteinases,” in Fogarty (ed.)., Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, London, [1983], pp. 251-317). Другие иллюстративные анализы включают, но без ограничений, анализ с применением сукцинил-Ala-Ala-Pro-Phe-паранитроанилида (suc-AAPF-pNA) и анализ с применением натриевой соли 2,4,6-тринитробензолсульфата (анализ TNBS). Многочисленные дополнительные источники, известные специалистам в данной области, приводят подходящие способы (см., например, Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7911-7925 [1983]; Christianson et al., Anal. Biochem. 223:119 -129 [1994]; и Hsia et al., Anal Biochem. 242:221-227 [1999]).
Для определения уровня продуцирования зрелой протеазы (например, зрелых вариантных протеаз настоящего изобретения) в клетке-хозяине можно применять ряд способов. Такие способы включают, но без ограничений, например, способы, в которых используют либо поликлональные, либо моноклональные антитела, специфичные к протеазе. Иллюстративные способы включают, но без ограничений, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммуноанализы (RIA), флуоресцентные иммуноанализы (FIA) и сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Эти и другие анализы хорошо известны в данной области техники (см., например, Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211 [1983]).
В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы получения или продуцирования зрелой вариантной протеазы настоящего изобретения. Зрелая вариантная протеаза не включает сигнальный пептид или пропептидную последовательность. Некоторые способы включают получение или продуцирование вариантной протеазы настоящего изобретения в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине, такой как например, клетка Bacillus sp. (например, клетка B. subtilis). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способ получения вариантной протеазы настоящего изобретения, при этом способ включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, включающей рекомбинантный вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу настоящего изобретения, в условиях, благоприятствующих продуцированию вариантной протеазы. Некоторые такие способы дополнительно включают выделение вариантной протеазы из культуры.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы получения вариантной протеазы настоящего изобретения, при этом способы включают: (a) введение рекомбинантного вектора экспрессии, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантную протеазу настоящего изобретения, в популяцию клеток (например, бактериальных клеток, таких как клетки B. subtilis); и (b) культивирование клеток в культуральной среде в условиях, благоприятствующих продуцированию вариантной протеазы, кодируемой вектором экспрессии. Некоторые такие способы дополнительно включают: (c) выделение вариантной протеазы из клеток или из культуральной среды.
Продукты по уходу за тканью и по уходу за домом
В некоторых вариантах осуществления варианты протеазы настоящего изобретения могут быть применены в композициях, включающих вспомогательный материал и вариант протеазы, где композиция представляет собой продукт по уходу за тканью и по уходу за домом.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий одну или более, предпочтительно две или более из следующих мутаций: X1R, X2S, X4R, X4S, X9A, X10S, X14K, X16S, X17R, X18R, X20R, X22A, X22R, X24R, X24W, X25R, X25V, X26F, X42I, X43R, X43A, X46R, X52F, X52E, X52N, X57R, X59A, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C. X75A, X75F, X75R, X76D, X78R, X82R, X86W, X89P, X89T, X89G, X89H, X89I, X89V, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X106V, X106G, X108I, X111V, X112V, X115K, X115R, X117F, X118I, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X144R, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X185I, X186H, X188E, X188D, X197F, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X248V, X249R, X250I, X252R, X253R, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H, X271P, X271T, X271V, X271L и X272F.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий один или более из следующих наборов мутаций: X022R-X024R, X009A-X271L, X018R-X241R, X018R-X115R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X020R-X024R, X018R-X249R, X009A-X020R, X020R-X241R, X009A-X078R, X020R-X115R, X018R-X024R, X024R-X242R, X022R-X115R, X018R-X043R, X020R-X043R, X018R-X242R, X242R-X269R, X018R-X244R, X024R-X269R, X020R-X271L, X024R-X271L, X004R-X009A, X020R-X269R, X001R-X024R, X244R-X271L, X009A-X018R, X241R-X271L, X004R-X024R, X009A-X249R, X009A-X022R, X062E-X129E, X062E-X159E, X016S-X148I, X158E-X249R, X016S-X062E, X111V-X188D, X022A-X062E, X062E-X148I, X022A-X129E, X062E-X271F, X062E-X158E, X016S-X159E, X062E-X186H, X128N-X159E, X062E-X188D, X062E-X128N, X148I-X159E, X103G-X158E, X111V-X159E, X158E-X271F, X016S-X188D, X022A-X111V, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X128N-X186H, X159E-X209E, X062E-X101A, X111V-X209E, X148I-X188D, X101A-X209E, X022A-X188D, X016S-X022A, X128N-X129E, X016S-X209E, X016S-X128N, X022A-X089P, X128N-X209E, X089P-X158E, X062E-X103G, X186H-X271F, X016S-X129E, X089P-X159E, X111V-X249R, X101A-X129E, X148I-X209E, X022A-X159E, X129E-X249R, X129E-X209E, X104L-X129E, X128N-X188D, X111V-X158E, X022A-X158E, X062E-X209E, X062E-X249R, X101A-X186H, X089P-X129E, X129E-X271, X22A-X111V-X159E, X101A-X103G-X104L-X209E, X101A-X103G-X104L-X159E, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X22A-X103G-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X209E-X271F, X22A-X101A-X209E, X101A-X209E-X271F, X22A-X111V-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L, X101G-X103A-X104I, X101A-X103G-X104L-X128N, X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D и X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий один или более из следующих наборов мутаций: X022R-X024R, X009A-X271L, X018R-X241R, X018R-X115R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X020R-X024R, X018R-X249R, X009A-X020R, X020R-X241R, X009A-X078R, X020R-X115R, X018R-X024R, X024R-X242R, X022R-X115R, X018R-X043R, X020R-X043R, X018R-X242R, X242R-X269R, X018R-X244R, X024R-X269R, X020R-X271L, X024R-X271L, X004R-X009A, X020R-X269R, X001R-X024R, X244R-X271L, X009A-X018R, X241R-X271L, X004R-X024R, X009A-X249R, X009A-X022R, X062E-X129E, X062E-X159E, X016S-X148I, X158E-X249R, X016S-X062E, X111V-X188D, X022A-X062E, X062E-X148I, X022A-X129E, X062E-X271F, X062E-X158E, X016S-X159E, X062E-X186H, X128N-X159E, X062E-X188D, X062E-X128N, X148I-X159E, X103G-X158E, X111V-X159E, X158E-X271F, X016S-X188D, X022A-X111V, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X128N-X186H, X159E-X209E, X062E-X101A, X111V-X209E, X148I-X188D, X101A-X209E, X022A-X188D, X016S-X022A, X128N-X129E, X016S-X209E, X016S-X128N, X022A-X089P, X128N-X209E, X089P-X158E, X062E-X103G, X186H-X271F, X016S-X129E, X089P-X159E, X111V-X249R, X101A-X129E, X148I-X209E, X022A-X159E, X129E-X249R, X129E-X209E, X104L-X129E, X128N-X188D, X111V-X158E, X022A-X158E, X062E-X209E, X062E-X249R, X101A-X186H, X089P-X129E, X129E-X271, X22A-X111V-X159E, X101A-X103G-X104L-X209E, X101A-X103G-X104L-X159E, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X22A-X103G-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X209E-X271F, X22A-X101A-X209E, X101A-X209E-X271F, X22A-X111V-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L, X101G-X103A-X104I, X101A-X103G-X104L-X128N, X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D и X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий в совокупности три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или даже 25 мутаций, выбранных из: X1R, X2S, V4R, V4S, X9A, X10S, X14K, X16S, H17R, X18R, X20R, X22A, X22R, X24R, X24W, X25R, X25V, X26F, X42I, X43R, X43A, G46R, X52F, X52E, X52N, T57R, Q59A, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X75R, X76D, X78R, L82R, P86W, X89P, X89T, X89G, X89H, X89I, X89V, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X106V, X106G, X108I, X111V, X112V, X115K, X115R, X117F, X118I, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X144R, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X185I, X186H, X188E, X188D, D197F, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X248V, X249R, X250I, X252R, X253R, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H, X271P, X271T, X271V, X271L и X272F; и необязательно одну или более из следующих мутаций: X103A, X159D, X236H, X245R, X248D и X252K.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий: две или более из следующих мутаций: X1R, X2S, V4R, V4S, X9A, X10S, X14K, X16S, X22A, X22R, X24R, X25V, X26F, X42I, X52F, X52E, X52N, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X78R, X89P, X89T, X89G, X89H, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X108I, X111V, X112V, X115K, X117F, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X186H, X188E, X188D, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X248V, X249R, X250I, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H и X272F; и/или один или более из следующих наборов мутаций: X062E-X129E, X062E-X159E, X016S-X148I, X158E-X249R, X016S-X062E, X111V-X188D, X022A-X062E, X062E-X148I, X022A-X129E, X062E-X271F, X062E-X158E, X016S-X159E, X062E-X186H, X128N-X159E, X062E-X188D, X062E-X128N, X148I-X159E, X103G-X158E, X111V-X159E, X158E-X271F, X016S-X188D, X022A-X111V, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X128N-X186H, X159E-X209E, X062E-X101A, X111V-X209E, X148I-X188D, X101A-X209E, X022A-X188D, X016S-X022A, X128N-X129E, X016S-X209E, X016S-X128N, X022A-X089P, X128N-X209E, X089P-X158E, X062E-X103G, X186H-X271F, X016S-X129E, X089P-X159E, X111V-X249R, X101A-X129E, X148I-X209E, X022A-X159E, X129E-X249R, X129E-X209E, X104L-X129E, X128N-X188D, X111V-X158E, X022A-X158E, X062E-X209E, X062E-X249R, X101A-X186H, X089P-X129E, X129E-X271F, X22A-X111V-X159E, X101A-X103G-X104L-X209E, X101A-X103G-X104L-X159E, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X22A-X103G-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X209E-X271F, X22A-X101A-X209E, X101A-X209E-X271F, X22A-X111V-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L, X101G-X103A-X104I, X101A-X103G-X104L-X128N, X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D и X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F; где по меньшей мере один вариант протеазы имеет общий заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий: две или более из следующих мутаций: X4R, X17R, X18R, X20R, X22R, X24R, X24W, X25R, X43R, X43A, X46R, X52F, X52N, X57R, X59A, X62Q, X71G, X75R, X76D, X78R, X82R, X86W, X89P, X89W, X89T, X89I, X89H, X89V, X104L, X106V, X106G, X115R, X118I, X121F, X144R, X185I, X197F, X209N, X209S, X217E, X231I, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X249R, X252R, X253R, X271T, X271V, X271L, X271H, X271F, X271P, X1R, X9A, X212F и X269R; и/или один или более из следующих наборов мутаций X022R-X024R, X009A-X271L, X018R-X241R, X018R-X115R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X020R-X024R, X018R-X249R, X009A-X020R, X020R-X241R, X009A-X078R, X020R-X115R, X018R-X024R, X024R-X242R, X022R-X115R, X018R-X043R, X020R-X043R, X018R-X242R, X242R-X269R, X018R-X244R, X024R-X269R, X020R-X271L, X024R-X271L, X004R-X009A, X020R-X269R, X001R-X024R, X244R-X271L, X009A-X018R, X241R-X271L, X004R-X024R, X009A-X249R, X009A-X022R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K; где по меньшей мере один вариант протеазы имеет общий заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
В некоторых вариантах осуществления вариант(ы) протеазы композиций продукта для ухода за тканью и домом получены из исходной протеазы, которая является коммерчески доступной (например, SAVINASE®, POLARZYME®, KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA® или OVOZYME® от Novozymes A/S); MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® и PURAFECT OXP®, PURAFAST™, PURAFECT® PRIME или PURAMAX® от Genencor International) и из протеаз, которые доступны от Henkel/Kemira, а именно BLAP (последовательность, показанная на Фигуре 29 US 5352604 со следующими мутациями: S99D+S101 R+S103A+V104I+G159S, далее в настоящем изобретении именуемая как BLAP) и BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I).
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, исходник которого обладает протеолитической активностью, где вариантная протеаза включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, не более чем по 50, не более чем по 40, не более чем по 35, не более чем по 30, не более чем по 25, не более чем по 20, не более чем по 19, не более чем по 18, не более чем по 17, не более чем по 16, не более чем по 15, не более чем по 14, не более чем по 13, не более чем по 12, не более чем по 11, не более чем по 10, не более чем по 9 или не более чем по 8 аминокислотным остаткам, где аминокислотные положения пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности вариантной протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, где вариантный субтилизин включает один из следующих наборов замен: X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K; или X87N; или X87N-S101G-V104N; или X76D, X103A-X104I; или Y167A-R170S-A194P; или X87N-G118V-X129Q-X130A.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, который включает одну или более, или даже две или более из следующих мутаций A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N, N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий один или более из следующих наборов мутаций: T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D и S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий один или более из следующих наборов мутаций: T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D и S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или даже 25 мутаций в рамках группы положений, включающей положения: 1, 2, 4, 9, 10, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 42, 43, 46, 52, 57, 59, 62, 68, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 82, 86, 89, 91, 94, 100, 101, 103, 104, 106, 108, 111, 112, 115, 117, 118, 121, 128, 129, 144, 148, 158, 159, 160, 166, 185, 186, 188, 197, 203, 209, 210, 212, 214, 215, 217, 224, 230, 231, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 248, 249, 250, 252, 253, 262, 263, 265, 267, 269, 271 и 272.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий в совокупности три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или даже 25 мутаций, выбранных из: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F; и необязательно одну или более из следующих мутаций: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий две или более из следующих мутаций: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, T22A, T22R, S24R, G25V, V26F, L42I, P52F, P52E, P52N, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, S78R, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, A108I, L111V, E112V, G115K, N117F, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, R186H, S188E, S188D, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, N248V, H249R, L250I, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N, N269I, N269R, E271F, E271I, E271H и A272F; и/или один или более из следующих наборов мутаций: N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271F, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D и S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F; где по меньшей мере один вариант протеазы имеет общий заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и которая включает аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X1R, X230E, X271L, X115R, X20R, X249R, X235F, X27V/F/L, X75E, X82R, X18R, X269R, X43D, X43R, X76D, X45T, X212F, X242R, X24R, X78R, X9A, X22R, X121E, X244R, X28E, X30E, X4R и X241R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и которая включает аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X16S, X18R, X20R, X22A, X24R, X43R/D, X45T, X76D, X101A, X103G, X104L, X111V, X128N, X148I, X230E, X242R и X249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и которая включает аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A16S, N18R, G20R, T22A, S24R, N43R, N43D, R45T, N76D, S101A, S103G, V104L, L111V, S128N, L148I, A230E, S242R и H249R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X20R-X43R-X249R, X20R-X22R-X43R, X20R-X43R-X242R, X20R-X43R-X271L, X20R-X43R-X244R, X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X22R-X78R-X212F-X241R, X9A-X20R-X43R-X212F, X9A-X43R-X212F, X20R-X43R-X212F, X20R-X22R-X43R-X212F, X24R-X78R-X212F, X9A-X43R-X78R, X9A-X43R-X78R-X242R, X9A-X20R-X43R-X78R, X20R-X24R-X43R-X78R-X242R, X22R-X24R-X78R-X212F, X9A-X20R-X43R-X78R-X242R, X20R-X43R-X78R-X249R, X20R-X43R-X78R, X9A-X78R-X212F, X9A-X22R-X43R-X78R, X9A-X20R-X24R-X43R, X9A-X22R-X78R-X212F, X4R-X9A-X22R-X78R-X212F, X20R-X24R-X43R, X1R-X9A-X43R, X20R-X24R-X43R-X115R, X9A-X24R-X43R, X20R-X22R-X24R-X43R, X1R-X24R-X43R, X9A-X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X20R-X22R-X78R-X212F, X9A-X24R-X43R-X244R, X9A-X24R-X43R-X242R, X4R-X9A-X22R-X24R-X212F и X22R-X24R-X43R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, W241R, G20R-N43R-H249R, G20R-T22R-N43R, G20R-N43R-S242R, G20R-N43R-E271L, G20R-N43R-V244R, G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-T22R-S78R-S212F-W241R, S9A-G20R-N43R-S212F, S9A-N43R-S212F, G20R-N43R-S212F, G20R-T22R-N43R-S212F, S24R-S78R-S212F, S9A-N43R-S78R, S9A-N43R-S78R-S242R, S9A-G20R-N43R-S78R, G20R-S24R-N43R-S78R-S242R, T22R-S24R-S78R-S212F, S9A-G20R-N43R-S78R-S242R, G20R-N43R-S78R-H249R, G20R-N43R-S78R, S9A-S78R-S212F, S9A-T22R-N43R-S78R, S9A-G20R-S24R-N43R, S9A-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R-S78R-S212F, G20R-S24R-N43R, A1R-S9A-N43R, G20R-S24R-N43R-G115R, S9A-S24R-N43R, G20R-T22R-S24R-N43R, A1R-S24R-N43R, S9A-G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-G20R-T22R-S78R-S212F, S9A-S24R-N43R-V244R, S9A-S24R-N43R-S242R, V4R-S9A-T22R-S24R-S212F и T22R-S24R-N43R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248R, и X101G, X103A, X104I, X232V, X236H, X245R и X252K, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и которая включает аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R, S101G, S103A, V104I, A232V, Q236H и Q245R, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В одном аспекте указанной композиции указанная композиция включает вариант протеазы, функциональный в холодной воде, где вариант протеазы, функциональный в холодной воде, представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотные последовательности, включающие комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: X16S, X22A, X24R, X62E, X76D, X89P, X101A/G, X103G/A, X104L/I, X111V, X128N, X129E, X232V, X148I, X158E, X159D/E, X166D, X186H, X188D, X209E, X236H, X238R, X245R, X248D/R, X249R, X252K/R, X253R и X271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, где по меньшей мере один вариант протеазы представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' B. amyloliquefaciens, изложенной как SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, который включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
Настоящее изобретение также предоставляет варианты протеазы из протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, где протеаза субтилизин GG36 Bacillus lentus включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, где вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и где общий заряд варианта протеазы составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к общему заряду протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, и где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L и A272F, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R и E271F, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, где указанный вариант протеазы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 не более чем по двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мутациям, выбранным из группы: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R и W241R, и необязательно включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D и N252K, где аминокислотные положения варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO:1, как установлено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающий две или более из следующих мутаций: V4R, H17R, N18R, G20R, T22R, S24R, S24W, G25R, N43R, N43A, G46R, P52F, P52N, T57R, Q59A, N62Q, T71G, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89W, E89T, E89I, E89H, E89V, V104L, S106V, S106G, G115R, G118I, V121F, S144R, N185I, D197F, Y209N, Y209S, L217E, A231I, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, H249R, N252R, T253R, E271T, E271V, E271L, E271H, E271F, E271P, A1R, S9A, S212F и N269R; и/или один или более из следующих наборов мутаций: T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K и S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K; где по меньшей мере один вариант протеазы имеет общий заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вариант протеазы, включающей по меньшей мере один вспомогательный материал, выбранный из инкапсулирующего материала, включающего отдушку, окрашивающего средства, поверхностно-активных веществ, модифицирующих добавок, хелатообразующих средств, средств, ингибирующих перенос красителя, диспергирующих средств, дополнительных ферментов, стабилизаторов ферментов, каталитических материалов, активаторов отбеливателя, перекиси водорода, источников перекиси водорода, предварительно полученных перкислот, полимерных диспергирующих средств, средств для удаления/средств препятствующие вторичному осаждению глинистой грязи, оптических отбеливателей, подавителей пенообразования, красителей, отдушек, средств, придающих пластичность структуре, мягчителей ткани, носителей, гидротропов, вспомогательных веществ, растворителей, пигментов и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом включают по меньшей мере один вспомогательный материал, выбранный из инкапсулирующих материалов с отдушками, окрашивающих ткани средств, растворимых в холодной воде оптических отбеливателей, катализатора отбеливателей, который может включать материал, выбранный из иминиевых катионов, иминиевых полиинов; иминиевых цвиттерионов; модифицированных аминов; модифицированных аминоксидов; N-сульфонилиминов; N-фосфонилиминов; N-ацилиминов; тиадизолдиоксидов; перфториминов; кетонов циклического сахара и их смесей; липаз для первичного мытья; бактериальных очищающих целлюлаз; неионогенных поверхностно-активных веществ Гюрберта; и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, дополнительно включают по меньшей мере одну дополнительную неиммуноэквивалентную протеазу, выбранную из субтилизинов (EC 3.4.21.62); трипсиноподобных или химотрипсиноподобных протеаз; металлопротеаз; и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, дополнительно включают по меньшей мере одну дополнительную неиммуноэквивалентную протеазу, выбранную из: субтилизинов (EC 3.4.21.62), полученных из B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus и B. gibsonii; трипсиновых протеаз и/или химотрипсиновых протеаз, полученных из Cellulomonas; металлопротеаз, полученных из Bacillus amyloliquefaciens; и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, дополнительно включают по меньшей мере один дополнительный фермент, выбранный из гемицеллюлаз, пероксидаз, протеаз, целлюлаз, целлобиозных дегидрогеназ, ксилоглюканаз, ксиланаз, липаз, фосфолипаз, эстераз, кутиназ, пектиназ, маннаназ, пектатлиаз, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, липоксигеназ, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, лихеназ, глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидаз, хондроитиназ, лакказ, амилаз и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, дополнительно включают по меньшей мере один дополнительный фермент, выбранный из липаз для первого мытья; алфа-амилаз; бактериальных очищающих целлюлаз; и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, дополнительно включают по меньшей мере одно из следующих: инкапсулирующий материал, включающий отдушку, включает микрокапсулу с отдушкой; окрашивающее средство, включающее материал, выбранный из основных, кислотных, гидрофобных, прямых и полимерных красителей и конъюгатов с красителями с длиной волны при пиковом поглощении от 550 нм до 650 нм и их смеси; моющее поверхностно-активное вещество, включающее материал, выбранный из анионных моющих поверхностно-активных веществ, неионного моющего поверхностно-активного вещества, катионных моющих поверхностно-активных веществ, цвиттерионных моющих поверхностно-активных веществ и амфотерных моющих поверхностно-активных веществ и их смесей; модифицирующую добавку, включающую материал, выбранный из цеолитов, фосфатов и их смесей; силикатную соль, включающую материал, выбранный из силиката натрия, силиката калия и их смесей; оптический отбеливатель, включающий материал, выбранный из растворимых в холодной воде оптических отбеливателей и их смесей; карбоксилатный полимер, включающий материал, выбранный из статистического сополимера малеата/акрилата или полиакрилатного гомополимера и их смесей; грязеудаляющий полимер, включающий материал, выбранный из терефталатных сополимеров и их смесей; целлюлозный полимер, включающий материал, выбранный из алкилцеллюлозы, алкилалкоксилалкилцеллюлозы, карбоксиалкилцеллюлозы, алкилкарбоксиалкилцеллюлозы и их смесей; катализатор отбеливателя, включающий материал, выбранный из иминиевых катионов, иминиевых полиинов; иминиевых цвиттерионов; модифицированных аминов; модифицированных аминоксидов; N-сульфонилиминов; N-фосфонилиминов; N-ацилиминов; тиадизолдиоксидов; перфториминов; кетонов циклического сахара и их смесей; активатор отбеливателя, включающий материал, выбранный из додеканоилоксибензолсульфоната, деканоилоксибензолсульфоната, деканоилоксибензойной кислоты или ее солей, 3,5,5-триметилгексаноилоксибензолсульфоната, тетраацетилэтилендиамина (TAED), нонаноилоксибензолсульфоната (NOBS) и их смесей; источник перекиси водорода, включающий материал, выбранный из неорганических пергидратных солей, включая соли щелочных металлов, такие как натриевые соли пербората (обычно моно- или тетра-гидратат), перкарбоната, персульфата, перфосфата, персиликатные соли и их смеси; хелатирующее средство, включающее материал, выбранный из DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота), HEDP (гидроксиэтандифосфоновая кислота), DTPMP (диэтилентриаминпента(мителенфосфоновая кислота)), этилендиаминдиянтарной кислоты (EDDS), 1,2-дигидроксибензол-3,5-дисульфокислоты, гидрата динатриевой соли, производных указанных хелатирующих средств; и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, включают окрашивающее ткани средство, выбранное из группы, состоящей из красителей, конъюгатов краситель-глина, включающих по меньшей мере один катионно-основный краситель и отбеливающую глину; и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, включают по меньшей мере одно окрашивающее ткань средство, выбранное из низкомолекулярных красителей, полимерных красителей и их смесей, конъюгатов краситель-глина, включающих по меньшей мере один катионно-основный краситель и отбеливающую глину; и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, представлены в единичных стандартных дозах или стандартных дозах с множеством камер. В некоторых вариантах осуществления композиция представляют собой стандартную дозу с множеством камер, где вариант протеазы находится в камере, отдельной от любого источника перекиси водорода, и/или хелатирующего средства, и/или дополнительного фермента.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, включают моющую жидкость, где по меньшей мере один вариант протеазы включает две или более из следующих мутаций: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, T22A, T22R, S24R, G25V, V26F, L42I, P52F, P52E, P52N, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, S78R, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, A108I, L111V, E112V, G115K, N117F, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, R186H, S188E, S188D, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, N248V, H249R, L250I, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N, N269I, N269R, E271F, E271I, E271H и A272F; и/или один или более из следующих наборов мутаций: N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271F, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D и S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F; при этом указанный вариант протеазы, функциональный в холодной воде, обладает общим зарядом +1, 0, -1, -2, -3, -4 или -5 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и где моющая жидкость имеет электропроводность от приблизительно 0,1 мСм/см до приблизительно 3 мСм/см, от приблизительно 0,3 мСм/см до приблизительно 2,5 мСм/см или даже от приблизительно 0,5 мСм/см до приблизительно 2 мСм/см.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, включают моющую жидкость, включающую вспомогательный материал, где по меньшей мере один вариант протеазы включает две или более из следующих мутаций: V4R, H17R, N18R, G20R, T22R, S24R, S24W, G25R, N43R, N43A, G46R, P52F, P52N, T57R, Q59A, N62Q, T71G, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89W, E89T, E89I, E89H, E89V, V104L, S106V, S106G, G115R, G118I, V121F, S144R, N185I, D197F, Y209N, Y209S, L217E, A231I, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, H249R, N252R, T253R, E271T, E271V, E271L, E271H, E271F, E271P, A1R, S9A, S212F и N269R; и/или один или более из следующих наборов мутаций T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K и S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, причем указанный вариант протеазы, функциональный в холодной воде, обладает общим зарядом 0, +1, +2, +3, +4 или +5 по отношению к протеазе субтилизин GG36 B. lentus, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; и при этом указанная моющая жидкость с моющим средством для белья имеет электропроводность от приблизительно 3 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, от приблизительно 3,5 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см или даже от приблизительно 4 мСм/см до приблизительно10 мСм/см.
В некоторых вариантах осуществления композиции продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающие по меньшей мере один вариант протеазы, включают один или более из следующих ингредиентов (на основе массы совокупной композиции): от приблизительно 0,0005 масс.% до приблизительно 0,1 масс.%, от приблизительно 0,001 масс.% до приблизительно 0,05 масс.% или даже от приблизительно 0,002 масс.% до приблизительно 0,03 масс.% указанного варианта протеазы, функционального в холодной воде; и одно или более из следующего: от приблизительно 0,00003 масс.% до приблизительно 0,1 масс.% окрашивающего ткань средства; от приблизительно 0,001 масс.% до приблизительно 5 масс.% капсул с отдушкой; от приблизительно 0,001 масс.% до приблизительно 1 масс.% растворимых в холодной воде оптических отбеливателей; от приблизительно 0,00003 масс.% до приблизительно 0,1 масс.% катализаторов отбеливателя; от приблизительно 0,00003 масс.% до приблизительно 0,1 масс.% липаз первичного мытья; от приблизительно 0,00003 масс.% до приблизительно 0,1 масс.% бактериальных очищающих целлюлаз; и/или от приблизительно 0,05 масс.% до приблизительно 20 масс.% неионогенных поверхностно-активных веществ Герберта.
В некоторых вариантах осуществления композиция продукта по уходу за тканью и по уходу за домом представляет собой гранулированное или порошковое моющее средство для белья, которое не включает протеазу, функциональную в холодной воде.
В некоторых вариантах осуществления композиция продукта по уходу за тканью и по уходу за домом представляет собой жидкое моющее средство для белья, моющее средство для мытья посуды.
Предполагается, что продукт по уходу за тканью и по уходу за домом представлен в любой подходящей форме, включая жидкую или твердую. Продукт по уходу за тканью и по уходу за домом может быть в форме пакета со стандартной дозой, особенно когда находится в форме жидкости, и как правило, продукт по уходу за тканью и по уходу за домом по меньшей мере частично, или даже полностью, заключен в водорастворимый пакет. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления продуктов по уходу за тканью и по уходу за домом, включающих по меньшей мере один вариант протеазы, продукт по уходу за тканью и по уходу за домом может иметь любую комбинацию параметров и/или характеристик, подробно описанных выше.
Очищающие композиции
Если не указано иное, все уровни компонентов или композиций, представленные в настоящем изобретении, даны по отношению к эффективному уровню такого компонента или композиции и не включают примеси, например, остаточные растворители или побочные продукты, которые могут присутствовать в коммерчески доступных источниках. Массы ферментных компонентов основываются на совокупном активном белке. Все проценты и соотношения рассчитаны по массе, если не указано иное. Все проценты и соотношения рассчитаны на основе совокупной композиции, если не указано иное. В иллюстративных моющих композициях уровни ферментов выражены посредством чистого фермента по массе совокупной композиции, и, если не указано иное, моющие ингредиенты выражены по массе совокупных композиций.
Как указано в настоящем изобретении, в некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения дополнительно включают вспомогательные материалы, включая, но без ограничений, поверхностно-активные вещества, модифицирующие добавки, отбеливатели, активаторы отбеливателей, катализаторы отбеливателей, другие ферменты, системы стабилизации ферментов, хелатирующие средства, оптические отбеливатели, полимеры для высвобождения загрязняющий средств, средства переноса красителей, диспергирующие средства, подавители пенообразования, красители, отдушки, красящие вещества, соли-наполнители, гидротропы, фотоактиваторы, флуоресцирующие вещества, кондиционеры для тканей, гидролизируемые поверхностно-активные вещества, консерванты, антиоксиданты, противоусадочные средства, средства, препятствующие образованию складок, гермициды, фунгициды, цветные вкрапления, средства для ухода за металлом, средства, препятствующее образованию оксидов, и/или антикоррозийные средства, источники щелочности, солюбилизирующие средства, носители, технологические добавки, пигменты, и средства для контроля рН (см., например, патенты США №№ 6610642, 6605458, 5705464, 5710115, 5698504, 5695679, 5686014 и 5646101, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки). Варианты осуществления конкретных материалов очищающих композиций проиллюстрированы детально ниже. В вариантах осуществления, в которых очищающие вспомогательные материалы не совместимы с вариантными протеазами настоящего изобретения в очищающих композициях, в таком случае применяют подходящие способы хранения вспомогательных очищающих материалов и протеазы(протеаз) раздельно (т.е., не в контакте друг с другом) до момента, когда уместно объединение данных двух компонентов. Такие способы разделения включают любой подходящий способ, известный из уровня техники (например, желатиновые капсулы, инкапсуляция, таблетки, физическое разделение и т.д.).
Очищающие композиции настоящего изобретения преимущественно задействуют, например, в областях применения, связанных с бельем, областях применения, связанных с очисткой твердых поверхностей, мытье посуды, а также косметических применениях, таких как протезы, зубы, волосы и кожа. Дополнительно, в связи с уникальными преимуществами повышенной эффективности в низкотемпературных растворах, ферменты настоящего изобретения идеально подходят для областей применения, связанных с бельем. Кроме того, ферменты настоящего изобретения находят применение в гранулированных и жидких композициях.
Вариантные протеазы настоящего изобретения также находят применение в очищающих продуктах-добавках. В некоторых вариантах осуществления находят применение в областях применения, связанных с чисткой в низкотемпературном растворе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет очищающие продукты-добавки, включающие по меньшей мере один фермент настоящего изобретения, который идеально подходит для включения в моющий процесс при необходимости дополнительной отбеливающей эффективности. Такие примеры включают, но без ограничений, области применения, связанные с чисткой в низкотемпературном растворе. В некоторых вариантах осуществления продукт-добавка в своей простейшей форме представляет собой одну или более протеаз. В некоторых вариантах осуществления добавку упаковывают в дозированную форму для добавления в процесс очистки. В некоторых вариантах осуществления добавку упаковывают в дозированную форму для добавления в процесс очистки, где используется источник пероксигена и требуется повышенная отбеливающая эффективность. Любая подходящая форма с однократной единицей дозирования находит применение с настоящим изобретением, включая, но без ограничений, пилюли, таблетки, желатиновые капсулы или другие однократные единицы дозирования, такие как предварительно отмеренные порошки или жидкости. В некоторых вариантах осуществления включены наполнитель(и) или материал-носитель(и) для увеличения объема таких композиций. Подходящие наполнитель или материалы-носители включают, но без ограничений, различные соли из сульфата, карбоната и силиката, а также тальк, глину и т.п. Подходящие наполнитель или материалы-носители для жидких композиций включают, но без ограничений, воду или низкомолекулярные первичные и вторичные спирты, включая полиолы и диолы. Примеры таких спиртов включают, но без ограничений, метанол, этанол, пропанол и изопропанол. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат от приблизительно 5% до приблизительно 90% таких материалов. Для снижения рН находят применение кислотные наполнители. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления очищающая добавка включает вспомогательные ингредиенты, которые детальнее описаны ниже.
Настоящие очищающие композиции и очищающие добавки нуждаются в эффективном количестве по меньшей мере одного из вариантов протеазы, представленных в настоящем изобретении, отдельно или в комбинации с другими протеазами и/или дополнительными ферментами. Требуемый уровень фермента достигают путем добавления одного или более вариантов протеазы настоящего изобретения. Как правило, настоящие очищающие композиции включают по меньшей мере приблизительно 0,0001 массовый процент, от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10, от приблизительно 0,001 до приблизительно 1 или даже от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 массового процента по меньшей мере одной из вариантных протеаз настоящего изобретения.
Очищающие композиции в настоящем изобретении, как правило, составляют так, чтобы в ходе применения в водных очищающих действиях вода для мытья имела pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 11,5 или даже от приблизительно 7,5 до приблизительно 10,5. Жидкие составы продукта, как правило, составляют так, чтобы они имели в чистом виде pH от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0 или даже от приблизительно 3 до приблизительно 5. Гранулированные продукты для белья, как правило, составляют так, чтобы они имели pH от приблизительно 9 до приблизительно 11. Методики контроля pH на рекомендуемых для применения уровнях включают применение буферов, щелочных металлов, кислот и т.д. и хорошо известны специалистам в данной области.
Подходящие “очищающие композиции с низким рН”, как правило, имеют в чистом виде pH от приблизительно 3 до приблизительно 5 и, как правило, не содержат поверхностно-активные вещества, которые гидролизуются в такой pH-среде. Такие поверхностно-активные вещества включают поверхностно-активные вещества на основе алкилсульфата натрия, которые включают по меньшей мере один этиленоксидный фрагмент или даже от приблизительно 1 до приблизительно 16 молей этиленоксида. Такие очищающие композиции, как правило, включают достаточное количество pH-модификатора, такого как гидроксид натрия, моноэтаноламин или соляная кислота, с получением такой очищающей композиции с pH в чистом виде от приблизительно 3 до приблизительно 5. Такие композиции, как правило, включают по меньшей мере один устойчивый к кислоте фермент. В некоторых вариантах осуществления композициями являются жидкости, в то время как в других вариантах осуществления они являются твердыми веществами. pH таких жидких композиций, как правило, измеряют как pH в чистом виде. pH таких твердых композиций измеряют как 10% раствор твердых веществ указанной композиции, где растворителем является дистиллированная вода. В данных вариантах осуществления все измерения pH проводят при 20°C, если не указано иное.
В некоторых вариантах осуществления при использовании вариантной протеазы(протеаз) в гранулированной композиции или жидкости желательно, чтобы вариантная протеаза была в форме инкапсулированной частицы с тем, чтобы защитить вариантную протеазу от других компонентов гранулированной композиции при хранении. Кроме того, инкапсуляция также является средством контроля доступности вариантной протеазы в ходе процесса чистки. В некоторых вариантах осуществления инкапсуляция усиливает действие вариантной протеазы(протеаз) и/или дополнительных ферментов. В связи с этим вариантные протеазы настоящего изобретения инкапсулируют любым подходящим инкапсулирующим материалом, известным из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал, как правило, инкапсулирует по меньшей мере часть катализатора для вариантной протеазы(протеаз) настоящего изобретения. Как правило, инкапсулирующий материал является водорастворимым и/или вододиспергируемым. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал имеет температуру стеклования (Tg) 0oC или выше. Температура стеклования подробнее описана в WO 97/11151. Инкапсулирующий материал, как правило, выбирают из группы, состоящей из углеводов, природных или синтетических камедей, хитина, хитозана, целлюлозы и производных целлюлозы, силикатов, фосфатов, боратов, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, разновидностей парафинового воска и их комбинаций. Если инкапсулирующим материалом является углевод, то его, как правило, выбирают из моносахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинаций. В некоторых типичных вариантах осуществления инкапсулирующим материалом является крахмал (см., например, EP 0922499; US 4977252; US 5354559 и US 5935826). В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующим материалом является микросфера, выполненная из пластика, как например, термопластика, акрилонитрила, метакрилонитрила, полиакрилонитрила, полиметакрилонитрила и их смесей; коммерчески доступные микросферы, которые находят применение, включают, но без ограничений, поставляемые EXPANCEL® (Стоквиксверкен, Швеция) и PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® и SPHERICEL® (PQ Corp., Вэлли Фордж, Пенсильвания).
Как описано в настоящем изобретении, вариантные протеазы настоящего изобретения находят конкретное применение в индустрии чистоты, включая, но без ограничений, моющие средства для посуды и белья. Данные применения помещают ферменты в различные условия внешней нагрузки. Вариантные протеазы настоящего изобретения обеспечивают преимущества над многими применяемыми в настоящее время ферментами благодаря своей стойкости в различных условиях.
Действительно, существует ряд условий мытья, включая различные моющие составы, объемы воды для мытья, температуры воды для мытья и длительности времени мытья, которым подвергаются протеазы, вовлеченные в мытье. Кроме того, моющие составы, применяемые в различных географических областях, имеют различные концентрации их соответствующих компонентов, присутствующих в воде для мытья. Например, европейские моющие средства, как правило, имеют приблизительно 4500-5000 ppm моющих компонентов в воде для мытья, в то время как японские моющие средства, как правило, имеют примерно 667 ppm моющих компонентов в воде для мытья. В Серверной Америке, в частности в Соединенных Штатах, моющие средства, как правило, имеют приблизительно 975 ppm моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья.
Система с низкой концентрацией моющих средств включает моющие средства, где в воде для мытья присутствует менее чем приблизительно 800 ppm моющих компонентов. Японские моющие средства, как правило, считаются системой с низкой концентрацией моющих средств, поскольку они имеют примерно 667 ppm моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья.
Средняя концентрация моющих средств включает моющие средства, где в воде для мытья присутствуют от приблизительно 800 ppm до приблизительно 2000 ppm моющих компонентов. Североамериканские моющие средства обычно рассматривают как системы со средней концентрацией моющих средств, поскольку они имеют примерно 975 ppm моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья. Бразильские, как правило, имеют примерно 1500 ppm моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья.
Система с высокой концентрацией моющих средств включает моющие средства, где в воде для мытья присутствуют более чем приблизительно 2000 ppm моющих компонентов. Европейские моющие средства обычно рассматривают как системы с высокой концентрацией моющих средств, поскольку они имеют примерно 4500-5000 ppm моющих компонентов в воде для мытья.
Латиноамериканские моющие средства в целом представляют собой моющие средства с высоким содержанием фосфатных модифицирующих добавок для пенообразования, и диапазон моющих средств, применяемых в Латинской Америке, может охватывать как средние, так и высокие концентрации моющих средств, поскольку они варьируют от 1500 ppm до 6000 ppm моющих компонентов в воде для мытья. Как упомянуто выше, бразильское средство, как правило имеет примерно 1500 ppm моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья. Однако, в других регионах моющих средств с высоким содержанием фосфатных модифицирующих добавок для пенообразования, не ограничиваясь другими странами Латинской Америки, могут быть системы с высокой концентрацией моющих средств с до приблизительно 6000 ppm моющих компонентов, присутствующих в воде для мытья.
В свете вышесказанного, очевидно, что концентрации моющих композиций в типичных растворах для мытья по всему миру варьирует от менее чем приблизительно 800 ppm моющей композиции ("регионы с низкой концентрацией моющих средств"), например, приблизительно 667 ppm в Японии, до приблизительно 800 ppm - приблизительно 2000 ppm ("регионы со средней концентрацией моющих средств"), например, приблизительно 975 ppm в США и приблизительно 1500 ppm в Бразилии, до более чем приблизительно 2000 ppm ("регионы с высокой концентрацией моющих средств"), например, приблизительно 4500 ppm - приблизительно 5000 ppm в Европе и приблизительно 6000 ppm в регионах с высоким содержанием фосфатных модифицирующих добавок для пенообразования.
Концентрации типичных растворов для мытья определяют эмпирически. Например, в США, типичные моющие машины удерживают объем приблизительно 64,4 л раствора для мытья. Соответственно, для того, чтобы получить концентрацию приблизительно 975 ppm моющего средства в растворе для мытья, нужно добавить приблизительно 62,79 г моющей композиции к 64,4 л раствора для мытья. Данное количество является типичным количеством, отмеряемым в воду для мытья потребителем при помощи мерного стаканчика, поставляемого с моющим средством.
В качестве дополнительного примера можно привести то, что в различных регионах используют различные температуры для мытья. Температура воды для мытья в Японии, как правило, ниже температуры, используемой в Европе. Например, температура воды для мытья в Северной Америке и Японии составляет, как правило, от приблизительно 10 до приблизительно 30°C (например, приблизительно 20°C), в то время как температура воды для мытья в Европе составляет, как правило, от приблизительно 30 до приблизительно 60°C (например, приблизительно 40°C). Однако, в интересах сбережения энергии, многие потребители переключаются на использование мытья в холодной воде. Кроме того, в некоторых более отдаленных странах холодную воду, как правило, применяют для белья, а также применений, связанных с мытьем посуды. В некоторых вариантах осуществления при “мытье в холодной воде” настоящего изобретения используют “моющее средство для мытья в холодной воде”, подходящее для мытья при температурах от приблизительно 10°C до приблизительно 40°C, или от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C, или от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C, а также всех других комбинациях в пределах диапазона от приблизительно 15°C до приблизительно 35°C и всех диапазонах в пределах 10°C-40°C.
В качестве дополнительного примера можно привести то, что в различных регионах, как правило, разная жесткость воды. Жесткость воды, как правило, описывают на основании гран на галлон смешанных Ca2+/Mg2+. Жесткость представляет собой меру количества кальция (Ca2+) и магния (Mg2+) в воде. Большая часть воды в Соединенный Штатах является жесткой, но степень жесткости воды варьирует. Умеренно жесткая (60-120 ppm) - жесткая (121-181 ppm) вода имеет от 60 до 181 частей на миллион (частей на миллион, преобразованные в гран на галлон США представляют собой количество ppm, деленное на 17,1 равно гран на галлон) минералов жесткости.
Жесткость европейской воды, как правило, составляет более чем приблизительно 10,5 (например, от приблизительно 10,5 до приблизительно 20,0) гран на галлон смешанных Ca2+/Mg2+ (например, приблизительно 15 гран на галлон смешанных Ca2+/Mg2+). Жесткость североамериканской воды, как правило, больше жесткости японской воды, но меньше жесткости европейской воды. Например, жесткость североамериканской воды может составлять от приблизительно 3 до приблизительно 10 гран, от приблизительно 3 до приблизительно 8 гран или приблизительно 6 гран. Жесткость японской воды, как правило, ниже жесткости североамериканской воды, обычно менее чем приблизительно 4, например, приблизительно 3 грана на галлон смешанных Ca2+/Mg2+.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет вариантные протеазы, которые демонстрируют неожиданное моющее действие по меньшей мере в одной группе условий мытья (например, температура воды, жесткость воды и/или концентрация моющего средства). В некоторых вариантах осуществления вариантные протеазы настоящего изобретения сравнимы в моющем действии с другими субтилизиновыми протеазами. В некоторых вариантах осуществления вариантные протеазы настоящего изобретения проявляют усиленное моющее действие по сравнению с субтилизиновыми протеазами, коммерчески доступными в настоящий момент. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариантные протеазы, представленные в настоящем изобретении, проявляют усиленную стойкость к окислению, усиленную термическую стойкость, усиленные очищающие свойства в различных условиях и/или усиленную стойкость комплексонов. Кроме того, вариантные протеазы настоящего изобретения находят применение в очищающих композициях, которые не включают моющие средства, опять-таки либо отдельно, либо в комбинации с модифицирующими добавками и стабилизаторами.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции включают по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% по массе композиции, и при этом остальная часть (например, от приблизительно 99,999% до приблизительно 90,0%) включает вспомогательные очищающие материалы по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции настоящего изобретения включают по меньшей мере одну вариантную протеазу на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% по массе композиции, и при этом остальная часть очищающей композиции (например, от приблизительно 99,9999% до приблизительно 90,0%, от приблизительно 99,999% до приблизительно 98%, от приблизительно 99,995% до приблизительно 99,5% по массе) включает вспомогательные очищающие материалы.
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения включают один или более дополнительных моющих ферментов, которые обеспечивают преимущества очищающего действия, и/или ухода за тканью, и/или мытья посуды. Примеры подходящих ферментов включают, но без ограничений, гемицеллюлазы, целлюлазы, пероксидазы, протеазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, пектатлиазы, маннаназы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, маланазы, β-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазы, хондроитиназы, лакказы и амилазы, или любые их комбинации или смеси. В некоторых вариантах осуществления применяют комбинацию ферментов (т.е., “коктейль”), включающий традиционные применяемые ферменты, например, протеазу, липазу, кутиназу и/или целлюлазу применяют совместно с амилазой.
В дополнение к вариантам протеазы, представленным в настоящем изобретении, в композициях настоящего изобретения находит применение любая другая подходящая протеаза. Подходящие протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения. В некоторых вариантах осуществления применяют микробные протеазы. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. В некоторых вариантах осуществления протеазой является серинпротеаза, предпочтительно микробная щелочная протеаза или трипсин-подобная протеаза. Примеры щелочных протеаз включают субтилизины, особенно субтилизины, происходящие от Bacillus (например, субтилизин, lentus, amyloliquefaciens, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168). Дополнительные примеры включают те мутантные протеазы, которые описаны в патентах США №№ RE 34606, 5955340, 5700676, 6312936 и 6482628, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки. Дополнительные примеры протеаз включают, но без ограничений, трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеазу Fusarium, описанную в WO 89/06270. В некоторых вариантах осуществления коммерчески доступные ферменты протеаз, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но без ограничений, MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX™, EXCELLASE™ и PURAFAST™ (Genencor); ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, NEUTRASE®, RELASE® и ESPERASE® (Novozymes); BLAP™ и варианты BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Дюссельдорф, Германия), и KAP (субтилизин B. alkalophilus; Kao Corp., Токио, Япония). Различные протеазы описаны в WO95/23221, WO 92/21760, публикации патента США № 2008/0090747, и патентах США №№ 5801039, 5340735, 5500364, 5855625, US RE 34606, 5955340, 5700676, 6312936 и 6482628, и различных других патентах. В некоторых дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении находят применение металлопротеазы, включая, но без ограничений, нейтральную металлопротеазу, описанную в WO 07/044993.
Кроме того, в настоящем изобретении находит применение любая подходящая липаза. Подходящие липазы включают, но без ограничений, липазы бактериального или грибного происхождения. Настоящим изобретением охватываются химически или генетически модифицированные мутанты. Примеры пригодных липаз включают липазу Humicola lanuginosa (см., например, EP 258068 и EP 305216), липазу Rhizomucor miehei (см., например, EP 238023), липазу Candida, такую как липазу C. antarctica (например, липазу A или B C. antarctica; см., например, EP 214761), липазы Pseudomonas, такие как липаза P. alcaligenes и липаза P. pseudoalcaligenes (см., например, EP 218272), липаза P. cepacia (см., например, EP 331376), липаза P. stutzeri (см., например, GB 1372034), липаза P. fluorescens, липазу Bacillus (например, липаза B. subtilis [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); липазу B. stearothermophilus [см., например, JP 64/744992]; и липазу B. pumilus [см., например, WO 91/16422]).
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения находят применение ряд клонированных липаз, включая, но без ограничений, липазу Penicillium camembertii (см., Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991]), липазу Geotricum candidum (см., Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989]) и различные липазы Rhizopus, такие как липаза R. delemar (см., Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]), липаза R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) и липаза R. oryzae.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также находят применение другие типы липолитических ферментов, такие как кутиназы, включая, но без ограничений, кутиназу, происходящую от Pseudomonas mendocina (см., WO 88/09367), и кутиназу, происходящую от Fusarium solani pisi (см., WO 90/09446).
Дополнительные подходящие липазы включают коммерчески доступные липазы, такие как M1 LIPASE™, LUMA FAST™ и LIPOMAX™ (Genencor); LIPEX®, LIPOLASE® и LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); и LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Япония).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции настоящего изобретения дополнительно включают липазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной липазы по массе композиции и остальную часть вспомогательных очищающих материалов по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции настоящего изобретения также включают липазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% липазы по массе композиции.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения любая подходящая амилаза находит применение в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления также находит применение любая амилаза (например, альфа и/или бета), подходящая для применения в щелочных растворах. Подходящие амилазы включают, но без ограничений, амилазы бактериального или грибного происхождения. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Амилазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но без ограничений, α-амилазы, полученные от B. licheniformis (см., например, GB 1296839). Коммерчески доступные амилазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но без ограничений, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA® и BAN™ (Novozymes), а также POWERASE™, RAPIDASE® и MAXAMYL® P (Genencor).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции настоящего изобретения дополнительно включают амилазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной амилазы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных очищающих материалов по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции настоящего изобретения также включают амилазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% амилазы по массе композиции.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления в очищающих композициях настоящего изобретения находит применение любая подходящая целлюлаза. Подходящие целлюлазы включают, но без ограничений, целлюлазы бактериального или грибного происхождения. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Подходящие целлюлазы включают, но без ограничений, целлюлазы Humicola insolens (см., например, патент США № 4435307). Особенно подходящими целлюлазами являются целлюлазы с преимуществом ухода за цветом (см., например, EP 0495257). Коммерчески доступные целлюлазы, которые находят применение в настоящем, включают, но без ограничений, CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes) и KAC-500(B)™ (Kao Corporation). В некоторых вариантах осуществления целлюлазы включены в качестве сегментов или фрагментов зрелой целлюлазы дикого типа или вариантных целлюлаз, у которых удален сегмент N-конца (см., например, патент США № 5874276). В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения дополнительно включают целлюлазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной целлюлазы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных очищающих материалов по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции настоящего изобретения также включают целлюлазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% целлюлазы по массе композиции.
В настоящем изобретении также находит применение любая маннаназа, подходящая для применения в моющих композициях. Подходящие маннаназы включают, но без ограничений, маннаназы бактериального или грибного происхождения. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Известны различные маннаназы, которые находят применение в настоящем изобретении (см., например, патент США № 6566114, патент США № 6602842 и патент США № 6440991, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки). В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения дополнительно включают маннаназы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной маннаназы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных очищающих материалов по массе композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции настоящего изобретения также включают маннаназы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% маннаназы по массе композиции.
В некоторых вариантах осуществления пероксидазы применяют в комбинации с перекисью водорода или ее источником (например, перкарбонатом, перборатом или персульфатом) в композициях настоящего изобретения. В некоторых альтернативных вариантах осуществления оксидазы применяют в комбинации с кислородом. Оба типа ферментов применяют для "отбеливания в растворе" (т.е., для предупреждения переноса тканевого красителя с окрашенной ткани на другую ткань при мытье тканей вместе в жидкости для мытья), предпочтительно вместе с усиливающим средством (см., например, WO 94/12621 и WO 95/01426). Подходящие пероксидазы/оксидазы включают, но без ограничений, таковые растительного, бактериального или грибного происхождения. В некоторых вариантах осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения дополнительно включают пероксидазные и/или оксидазные ферменты на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной пероксидазы и/или оксидазы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных очищающих материалов по массе композиции. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения очищающие композиции настоящего изобретения также включают пероксидазные и/или оксидазные ферменты на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% пероксидазных и/или оксидазных ферментов по массе композиции.
В некоторых вариантах осуществления находят применение дополнительные ферменты, включая, но без ограничений, пергидролазы (см., например, WO 05/056782). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления в данном изобретении охвачены смеси вышеупомянутых ферментов, в частности, одна или более дополнительных протеаз, амилаз, липаз, маннаназ и/или по меньшей мере одна целлюлаза. Действительно, подразумевается, что в настоящем изобретении найдут применение различные смеси. Также подразумевается, что варьирующие уровни как вариантной протеазы(протеаз) и так одного или более дополнительных ферментов могут независимо изменяться в диапазоне до приблизительно 10%, при этом остальной частью очищающей композиции являются вспомогательные материалы. Конкретный выбор вспомогательных очищающих материалов легко осуществить, принимая во внимание поверхность, предмет или ткань, подлежащие чистке, и требуемую при применении форму композиции для условий чистки (например, путем применения моющего средства для мытья).
Примеры подходящих вспомогательных очищающих материалов включают, но без ограничений, поверхностно-активные вещества, модифицирующие добавки, отбеливатели, активаторы отбеливателя, катализаторы отбеливателя, другие ферменты, системы стабилизации ферментов, хелатирующие средства, оптические отбеливатели, полимеры для высвобождения загрязняющий средств, средства переноса красителей, средства, ингибирующие перенос красителей, каталитические материалы, перекись водорода, источники перекиси водорода, предварительно полученные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для удаления глинистой грязи, средства, придающие пластичность структуре, диспергирующие средства, подавители пенообразования, красители, отдушки, красящие вещества, соли-наполнители, гидротропы, фотоактиваторы, флуоресцирующие вещества, кондиционеры для тканей, мягчители ткани, носители, гидротропы, технологические добавки, растворители, пигменты, гидролизируемые поверхностно-активные вещества, консерванты, антиоксиданты, противоусадочные средства, средства, препятствующие образованию складок, гермициды, фунгициды, цветные вкрапления, средства для ухода за металлом, средство, препятствующее образованию оксидов, и/или антикоррозийные средства, источники щелочности, солюбилизирующие средства, носители, технологические добавки, пигменты и средства для контроля рН (см., например, патенты США №№ 6610642, 6605458, 5705464, 5710115, 5698504, 5695679, 5686014 и 5646101, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки). Варианты осуществления конкретных материалов очищающих композиций проиллюстрированы подробно ниже. В вариантах осуществления, в которых вспомогательные очищающие материалы не совместимы с вариантными протеазами настоящего изобретения в очищающих композициях, в таком случае применяют подходящие способы хранения вспомогательных очищающих материалов и протеазы(протеаз) раздельно (т.е., не в контакте друг с другом) до момента, когда уместно объединение двух компонентов. Такие способы разделения включают любой подходящий способ, известный в области техники (например, желатиновые капсулы, инкапсулирование, таблетки, физическое разделение и т. д.).
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество одной вариантной протеазы или более вариантных протеаз, представленных в настоящем изобретении, включено в композиции, пригодные для очистки ряда поверхностей, нуждающихся в удалении белкового загрязнения. Такие очищающие композиции включают очищающие композиции для таких применений, как очистка твердых поверхностей, тканей и посуды. Действительно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет очищающие композиции для тканей, в то время как в других вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет очищающие композиции для материалов, отличных от тканей. В особенности, настоящее изобретение также предоставляет очищающие композиции, подходящие для личной гигиены, включая гигиену полости рта (включая средства для чистки зубов, зубные пасты, ополаскиватели для рта и т.д., а также очищающие композиции для зубов и полости рта), очищающие композиции для кожи и волос. Подразумевается, что настоящее изобретение охватывает моющие композиции в любой форме (т.е., жидкая, гранулированная, брусковая, полутвердая, гели, эмульсии, таблетки, капсулы и т.д.).
Как пример, несколько очищающих композиций, где находят применение вариантные протеазы настоящего изобретения, описаны более детально ниже. В некоторых вариантах осуществления, в которых очищающие композиции настоящего изобретения составлены в виде композиций, пригодных для применения в способе(ах) мытья в стиральной машине, композиции настоящего изобретения предпочтительно содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно соединение-модифицирующую добавку, а также один или более вспомогательных очищающих материалов, предпочтительно выбранных из органических полимерных соединений, отбеливающих средств, дополнительных ферментов, подавителей пенообразования, диспергирующих средств, кальциевых мыльных диспергирующих средств, средств, суспендирующих грязь и препятствующих ее повторному осаждению, и ингибиторов коррозии. В некоторых вариантах осуществления композиции для белья также содержат мягчители (т.е., в качестве дополнительных вспомогательных очищающих материалов). В композициях настоящего изобретения также находят применение моющие продукты-добавки в твердой или жидкой форме. Такие продукты-добавки предназначены для дополнения и/или усиления действия традиционных моющих композиций и их можно добавлять на любой стадии процесса очистки. В некоторых вариантах осуществления плотность моющих композиций для белья в настоящем изобретении варьирует от приблизительно 400 до приблизительно 1200 г/литр, в то время как в других вариантах осуществления она варьирует в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 950 г/литр композиции, измеряемой при 20°C.
В вариантах осуществления, составленных в виде композиций для применения в способах мытья посуды вручную, композиции настоящего изобретения предпочтительно содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество и предпочтительно по меньшей мере один дополнительный вспомогательный очищающий материал, выбранный из органических полимерных соединений, средств, усиливающих пенообразование, ионов металлов II группы, растворителей, гидротропов и дополнительных ферментов.
В некоторых вариантах осуществления различные очищающие композиции, такие как представленные в патенте США № 6605458, находят применение с вариантными протеазами настоящего изобретения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения, представляют собой плотную гранулированную очищающую композицию для ткани, в то время как в других вариантах осуществления композиция представляет собой гранулированную очищающую композицию для ткани, пригодную при стирке окрашенных тканей, в дополнительных вариантах осуществления композиция представляет собой гранулированную очищающую композицию для тканей, которая обеспечивает мягкость благодаря моющей способности, в дополнительных вариантах осуществления данная композиция является жидкой очищающей композицией с высокой моющей способностью для ткани. В некоторых вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения, представляют собой очищающие композиции для тканей, такие как те, что описаны в патентах США №№ 6610642 и 6376450. Кроме того, вариантные протеазы настоящего изобретения находят применение в гранулированных моющих композициях для белья с особой полезностью в европейских или японских условиях мытья (см., например, патент США № 6610642).
В некоторых альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет очищающие композиции для твердых поверхностей, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу, представленную в настоящем изобретении. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения, представляют собой очищающую композицию для твердых поверхностей, такие как те, что описаны в патентах США №№ 6610642, 6376450 и 6376450.
В еще дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет композиции для мытья посуды, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу, представленную в настоящем изобретении. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения, представляют собой очищающую композицию для твердых поверхностей, такую, как в патентах США №№ 6610642 и 6376450. В еще одних некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет композиции для мытья посуды, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу, представленную в настоящем изобретении. В некоторых дополнительных вариантах осуществления композиции, включающие по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения, включают композиции для гигиены полости рта, такие, как в патентах США № 6376450 и 6376450. Составы и описания содержащихся соединений и вспомогательных очищающих материалов в вышеупомянутых патентах США №№ 6376450, 6605458, 6605458 и 6610642 находят применение с вариантными протеазами, представленными в настоящем изобретении.
Очищающие композиции настоящего изобретения составляют в любую подходящую форму и готовят с помощью любого способа, выбираемого специалистом, занимающимся составлением, неограничивающие примеры чего описаны в патентах США №№ 5879584, 5691297, 5574005, 5569645, 5565422, 5516448, 5489392 и 5486303, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки. Если необходима очищающая композиция с низким рН, то pH такой композиции доводят путем добавления такого материала, как моноэтаноламин, или кислотного материала, такого как HCl.
Несмотря на то, что не обязательно для целей настоящего изобретения, неограничивающий перечень вспомогательных средств, проиллюстрированных далее в настоящем изобретении, пригоден для применения в обсуждаемых очищающих композициях. В некоторых вариантах осуществления эти вспомогательные средства включены, например, для содействия или усиления очищающего действия, для обработки субстрата, подлежащего очистке, или для модификации эстетики очищающей композиции, как это есть в случае с отдушками, красящими веществами, красителями или подобным. Понятно, что такие вспомогательные средства являются дополнением к вариантным протеазам настоящего изобретения. Точная природа этих дополнительных компонентов и уровни их включения будут зависеть от физической формы композиции и природы процесса чистки, для которого ее применяют. Подходящие вспомогательные материалы включают, но без ограничений, поверхностно-активные вещества, модифицирующие добавки, хелатирующие средства, средства, ингибирующие перенос красителей, вспомогательные вещества, способствующие осаждению, диспергирующие средства, дополнительные ферменты и стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливателя, усилители отбеливателя, перекись водорода, источники перекиси водорода, предварительно полученные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для удаления глинистой грязи/средства, препятствующие ее повторному осаждению, оптические отбеливатели, подавители пенообразования, красители, отдушки, средства, придающие пластичность структуре, мягчители ткани, носители, гидротропы, технологические добавки и/или пигменты. В дополнение к приведенному ниже раскрытию, подходящие примеры таких других вспомогательных средств и уровней применения находятся в патентах США №№ 5576282, 6306812 и 6326348, включенных с помощью ссылки. Вышеупомянутые вспомогательные ингредиенты могут составлять остальную часть очищающих композиций настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции согласно настоящему изобретению включают по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество и/или систему поверхностно-активных веществ, где поверхностно-активное вещество выбирают из неионных поверхностно-активных веществ, анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, амфолитических поверхностно-активных веществ, цвиттерионных поверхностно-активных веществ, полуполярных неионных поверхностно-активных веществ и их смесей. В некоторых вариантах осуществления очищающих композиций с низким рН (например, композиции с рН в чистом виде от приблизительно 3 до приблизительно 5) композиция, как правило, не содержит алкилэтоксилированный сульфат, поскольку полагают, что такое поверхностно-активное вещество может гидролизоваться такими композициями с кислотным содержимым. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество присутствует на уровне от приблизительно 0,1% до приблизительно 60%, в то время как в альтернативных вариантах осуществления уровень составляет от приблизительно 1% до приблизительно 50%, в то время как в еще дополнительных вариантах осуществления уровень составляет от приблизительно 5% до приблизительно 40% по массе очищающей композиции.
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения включают одну или более модифицирующих моющее средство добавок или систем модифицирующих моющее средство добавок. В некоторых вариантах осуществления, включающих по меньшей мере одну модифицирующую добавку, очищающие композиции включают по меньшей мере приблизительно 1%, от приблизительно 3% до приблизительно 60% или даже от приблизительно 5% до приблизительно 40% модифицирующей добавки по массе очищающей композиции. Модифицирующие добавки включают, но без ограничений, соли щелочного металла, аммониевые и алканоламмониевые соли полифосфатов, силикаты щелочных металлов, карбонаты щелочноземельных и щелочных металлов, алюмосиликаты, поликарбоксилатные соединения, простые эфиры гидроксиполикарбоксилатов, сополимеры малеинового ангидрида с простым этиленовым или винилметиловым эфиром, 1,3,5-тригидроксибензол-2,4,6-трисульфокислоту и карбоксиметилоксиянтарную кислоту, различные соли щелочных металлов, аммониевые и замещенные аммониевые соли полиуксусных кислот, таких как этилендиаминтетрауксусная кислота и нитрилотриуксусная кислота, а также поликарбоксилаты, такие как меллитовая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, оксидиянтарная кислота, полималеиновая кислота, бензол-1,3,5-трикарбоновая кислота, карбоксиметилоксиянтарная кислота и их растворимые соли. Действительно, подразумевается, что любая подходящая модифицирующая добавка будет находить применение в различных вариантах осуществления настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления модифицирующие добавки формируют водорастворимые комплексы с ионами жесткости (например, комплексообразующие модифицирующие добавки), такие как цитраты и полифосфаты (например, триполифосфат натрия и триполифосфатгексагидрат натрия, триполифосфат калия и смешанные триполифосфат натрия и калия и т.д.). Подразумевается, что любая подходящая модифицирующая добавка будет находить применение в настоящем изобретении, включая те, которые известны из уровня техники (см., например, EP 2100949).
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения содержат по меньшей мере одно хелатирующее средство. Подходящие хелатирующие средства включают, но без ограничений, медные, железные и/или марганцевые хелатирующие средства и их смеси. В вариантах осуществления, в которых применяют по меньшей мере одно хелатирующее средство, очищающие композиции настоящего изобретения включают от приблизительно 0,1% до приблизительно 15% или даже от приблизительно 3,0% до приблизительно 10% хелатирующего средства по массе обсуждаемой очищающей композиции.
В некоторых других дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции, представленные в настоящем изобретении, содержат по меньшей мере одно вспомогательное вещество, способствующее осаждению. Подходящие вспомогательные вещества, способствующие осаждению, включают, но без ограничений, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поликарбоксилат, полимеры для высвобождения загрязняющий средств, такие как полителефталевая кислота, глины, такие как каолинит, монтмориллонит, атапульгит, иллит, бентонит, галлуазит и их смеси.
Как указано в настоящем изобретении, в некоторых вариантах осуществления средства, препятствующие повторному осаждению, находят применение в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления находят применение неионные поверхностно-активные вещества. Например, в вариантах осуществления автоматического мытья посуды неионные поверхностно-активные вещества находят применение для целей модификации поверхности, в частности, для образования защитного покрытия, для того, чтобы избежать образование пленки и загрязнения и улучшить блеск. Эти неионные поверхностно-активные вещества также находят применение в предупреждении повторного осаждения грязи. В некоторых вариантах осуществления средство, препятствующее повторному осаждению, представляет собой неионное поверхностно-активное вещество, которое известно из уровня техники (см., например, EP 2100949).
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения включают одно или более средств, ингибирующих перенос красителей. Подходящие полимерные средства, ингибирующие перенос красителей, включают, но без ограничений, поливинилпирролидоновые полимеры, полиамин-N-оксидные полимеры, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. В вариантах осуществления, в которых применяют по меньшей мере одно средство, ингибирующее перенос красителей, очищающие композиции настоящего изобретения включают от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% или даже от приблизительно 0,1% до приблизительно 3% по массе очищающей композиции.
В некоторых вариантах осуществления в композиции настоящего изобретения включены силикаты. В некоторых таких вариантах осуществления находят применение силикаты натрия (например, дисиликат натрия, метасиликат натрия и кристаллические биотиты). В некоторых вариантах осуществления силикаты присутствуют на уровне от приблизительно 1% до приблизительно 20%. В некоторых вариантах осуществления силикаты присутствуют на уровне от приблизительно 5% до приблизительно 15% по массе композиции.
В еще некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения также содержат диспергирующие средства. Подходящие водорастворимые органические материалы включают, но без ограничений, гомо- или со-полимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота включает по меньшей мере два карбоксильных радикала, разделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления ферменты, применяемые в очищающих композициях, стабилизируют при помощи любой подходящей методики. В некоторых вариантах осуществления ферменты, используемые в настоящем изобретении, стабилизируют при помощи присутствия водорастворимых источников ионов кальция и/или магния в окончательных композициях, которые поставляют такие ионы ферментам. В некоторых вариантах осуществления стабилизаторы ферментов включают олигосахариды, полисахариды и неорганические соли двухвалентных металлов, включая щелочноземельные металлы, как, например, кальциевые соли. Предполагается, что в настоящем изобретении найдут применение различные методики стабилизации ферментов. Например, в некоторых вариантах осуществления ферменты, используемые в настоящем изобретении, стабилизируют при помощи присутствия водорастворимых источников ионов цинка (II), кальция (II) и/или магния (II) в окончательных композициях, которые поставляют такие ионы ферментам, а также ионы других металлов (например, бария (II), скандия (II), железа (II), марганца (II), алюминия (III), олова (II), кобальта (II), меди (II), никеля (II) и оксованадия (IV). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также находят применение хлориды и сульфаты. Примеры подходящих олигосахаридов и полисахаридов (например, декстринов) известны из уровня техники (см., например, WO 07/145964). В некоторых вариантах осуществления также находят применение обратимо действующие ингибиторы протеаз, как, например, борсодержащие соединения (например, борат, 4-формилфенилбороновая кислота) и/или трипептидальдегид, находят применение для дополнительного улучшения стойкости, при необходимости.
В некоторых вариантах осуществления в композициях настоящего изобретения присутствуют отбеливатели, активаторы отбеливателя и/или катализаторы отбеливателя. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения включают неорганическое и/или органическое отбеливающее соединение(я). Неорганические отбеливатели включают, но без ограничений, пергидратные соли (например, перборатные, перкарбонатные, перфосфатные, персульфатные и персиликатные соли). В некоторых вариантах осуществления неорганические пергидратные соли представляют собой соли щелочных металлов. В некоторых вариантах осуществления неорганические пергидратные соли включены в виде кристаллического твердого вещества без дополнительной защиты, хотя в некоторых других вариантах осуществления соли имеют покрытие. В настоящем изобретении находит применение любая подходящая соль, известная из уровня техники (см., например, EP 2100949).
В некоторых вариантах осуществления в композициях настоящего изобретения применяют активаторы отбеливателя. Активаторы отбеливателя, как правило, представляют собой предшественники органических перкислот, которые усиливают отбеливающее действие в ходе очистки при температурах 60°C и ниже. Активаторы отбеливателя, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают соединения, которые в условиях пергидролиза дают алифатические пероксикарбоновые кислоты, имеющие предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 10 атомов углерода, в частности, от приблизительно 2 до приблизительно 4 атомов углерода, и/или необязательно замещенную пербензойную кислоту. Дополнительные активаторы отбеливателя известны из уровня техники и находят применение в настоящем изобретении (см., например, EP 2100949).
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления и как дополнительно описано в настоящем изобретении, очищающие композиции настоящего изобретения дополнительно включают по меньшей мере один катализатор отбеливателя. В некоторых вариантах осуществления находят применение триазациклононан марганца и родственные комплексы, а также комплексы кобальта, меди, марганца и железа. В настоящем изобретении находят применение дополнительные катализаторы отбеливателя (см., например, US 4246612, 5227084, 4810410, WO 99/06521 и EP 2100949).
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения содержат один или более каталитических комплексов с металлом. В некоторых вариантах осуществления находит применение металл-содержащий катализатор отбеливателя. В некоторых вариантах осуществления металлический катализатор отбеливателя включает каталитическую систему, включающую катион переходного металла с определенной каталитической активностью в отношении отбеливателя, (например, катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца), вспомогательный катион металла, имеющий небольшую каталитическую активность или вообще без активности (например, катионы цинка или алюминия), и комплексообразователь, имеющий определенные константы устойчивости в отношении каталитического и вспомогательного катионов металла, в частности, применяют этилендиаминтетрауксусную кислоту, этилендиаминтетра(метиленфосфоновую кислоту) и их водорастворимые соли (см., например, патент США № 4430243). В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения катализируются посредством соединения марганца. Такие соединения и уровни применения хорошо известны из уровня техники (см., например, патент США № 5576282). В дополнительных вариантах осуществления в очищающих композициях настоящего изобретения находят применение кобальтовые катализаторы отбеливателя. Различные кобальтовые катализаторы отбеливателя известны из уровня техники (см., например, патенты США №№ 5597936 и 5595967), и их легко получают с помощью известных процедур.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения включают комплекс переходного металла и макрополициклического жесткого лиганда (MRL). На практике, и не в качестве ограничения, в некоторых вариантах осуществления композиции и способы чистки, представленные настоящим изобретением, корректируют для получения порядка по меньшей мере одной части на сто миллионов активных частиц MRL в водной моющей среде и в некоторых вариантах осуществления для получения от приблизительно 0,005 ppm до приблизительно 25 ppm, более предпочтительно от приблизительно 0,05 ppm до приблизительно 10 ppm и наиболее предпочтительно от приблизительно 0,1 ppm до приблизительно 5 ppm MRL в жидкости для мытья.
В некоторых вариантах осуществления переходные металлы в обсуждаемом катализаторе отбеливателя на основе переходного металла включают, но без ограничений, марганец, железо и хром. MRL также включают, но без ограничений, специальные ультражесткие лиганды, которые сшиты мостиковой связью (например, 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6,6,2]гексадекан). Подходящие MRL с переходными металлами легко получить с помощью известных процедур (см., например, WO 2000/32601 и патент США № 6225464).
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения включают средства по уходу за металлом. Средства по уходу за металлом находят применение в предупреждении и/или уменьшении потускнения металла, коррозии и/или окисления металлов, включая алюминий, нержавеющую сталь и цветные металлы (например, серебро и медь). Подходящие средства по уходу за металлом включают таковые, описанные в EP 2100949, WO 9426860 и WO 94/26859). В некоторых вариантах осуществления средством по уходу за металлом является соль цинка. В некоторых дополнительных вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения включают от приблизительно 0,1% до приблизительно 5% по массе одного или более средств по уходу за металлом.
Как указано выше, очищающие композиции настоящего изобретения составляют в любую подходящую форму и готовят с помощью любого способа, выбираемого специалистом, который занимается составлением, неограничивающие примеры чего описаны в патентах США №№ 5879584, 5691297, 5574005, 5569645, 5516448, 5489392 и 5486303, все из которых включены в настоящее изобретение с помощью ссылки. В некоторых вариантах осуществления, в которых необходима очищающая композиция с низким рН, pH такой композиции доводят путем добавления кислотного материала, такого как HCl.
Очищающие композиции, раскрытые в настоящем изобретении, находят применение при очистке места действия (например, поверхности, предмета, столовой посуды или ткани). Как правило, по меньшей мере сегмент места действия приводят в контакт с вариантом осуществления настоящей очищающей композиции, в чистой форме или разведенной в жидкости для мытья, и затем место действия необязательно моют и/или ополаскивают. Для целей настоящего изобретения, “мытье” включает, но без ограничений, промывание и механическое перемешивание. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции, как правило, используют в концентрациях от приблизительно 500 ppm до приблизительно 15000 ppm в растворе. Если растворителем для мытья является вода, то температура воды, как правило, варьирует в диапазоне от приблизительно 5°C до приблизительно 90°C, и если место действия включает ткань, то массовое соотношение воды к ткани, как правило, составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 30:1.
Способы получения и применения очищающих композиций
Очищающие композиции настоящего изобретения составляют в любую подходящую форму и готовят с помощью любого способа, выбираемого специалистом, который занимается составлением, (см., например, патенты США №№ 5879584, 5691297, 5574005, 5569645, 5565422, 5516448, 5489392, 5486303, 4515705, 4537706, 4515707, 4550862, 4561998, 4597898, 4968451, 5565145, 5929022, 6294514 и 6376445).
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения представлены в форме стандартной дозы, включая таблетки, капсулы, саше, пакеты и пакеты со множеством камер. В некоторых вариантах осуществления формат стандартной дозы разработан для обеспечения контролируемого высвобождения ингредиентов в пакете со множеством камер (или другом формате стандартной дозы). Подходящие форматы со стандартной дозой и контролируемым высвобождением известны из уровня техники (см., например, EP 2100949, WO 02/102955, патенты США №№ 4765916 и 4972017 и WO 04/111178 для материалов, подходящих для применения в форматах стандартной дозы и с контролируемым высвобождением). В некоторых вариантах осуществления форма стандартной дозы представлена таблетками, упакованными водорастворимой пленкой или водорастворимыми пакетами. Различные форматы для стандартных доз представлены в EP 2100947 и известны из уровня техники.
Способы применения
В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения находят применение при очистке поверхностей (например, столовой посуды), белья, твердых поверхностей, контактных линз и т.д. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере сегмент поверхности приводят в контакт по меньшей мере с одним вариантом осуществления очищающих композиций настоящего изобретения, в чистой форме или разведенной в жидкости для мытья, и затем поверхность необязательно моют и/или ополаскивают. Для целей настоящего изобретения “мытье” включает, но без ограничений, промывание и механическое мытье. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции настоящего изобретения применяют в концентрациях от приблизительно 500 ppm до приблизительно 15000 ppm в растворе. В некоторых вариантах осуществления, в которых растворителем для мытья является вода, температура воды, как правило, варьирует в диапазоне от приблизительно 5°C до приблизительно 90°C.
Настоящее изобретение предоставляет способы очистки или мытья предмета или поверхности (например, твердой поверхности), нуждающейся в очистке, включая, но без ограничений, способы очистки или мытья предмета столовой посуды, предмета столовой утвари, тканевого предмета, предмета белья, предмета личной гигиены и т.д. или подобного, и способы очистки или мытья твердой или мягкой поверхности (например, твердой поверхности предмета).
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способ очистки предмета, объекта или поверхности, нуждающихся в очистке, при этом способ включает приведение в контакт предмета или поверхности (или сегмента предмета или поверхности, которые необходимо очистить) по меньшей мере с одной вариантной субтилизиновой протеазой настоящего изобретения или композицией настоящего изобретения в течение достаточного времени и/или в условиях, подходящих и/или эффективных для очистки предмета, объекта или поверхности до требуемой степени. Некоторые такие способы дополнительно включают ополаскивание предмета, объекта или поверхности водой. Для других таких способов очищающая композиция представляет собой моющую композицию для мытья посуды, а предмет или объект, подлежащий очистке, представляет собой предмет столовой посуды или предмет столовой утвари. Применяемый в настоящем изобретении “предмет столовой посуды” представляет собой предмет, обычно применяемый для сервировки или приема пищи. Предметом столовой посуды может быть, но без ограничений, например, блюдо, тарелка, чашка, миска и т.д. и т.п. Применяемая в настоящем изобретении “столовая утварь” является более широким термином, который включает, но без ограничений, например, блюда, кухонные ножи, ножи, вилки, ложки, палочки для еды, стеклянную посуду, кувшины, соусницы, емкости для напитков, сервировочные предметы и т.д. Подразумевается, что “предмет столовой утвари” включает любой из этих или подобных предметов для сервировки или приема пищи. Для некоторых таких способов очищающая композиция представляет собой моющую композицию для автоматического мытья посуды или моющую композицию для ручного мытья посуды, а подлежащий очистке предмет или объект представляет собой предмет столовой посуды или столовой утвари. Для некоторых таких способов очищающей композицией является моющая композиция для белья (например, порошковая моющая композиция для белья или жидкая моющая композиция для белья), а подлежащий очистке предмет представляет собой тканевой предмет. В некоторых других вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой композицию для предварительной обработки белья.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы очистки или мытья тканевого предмета, необязательно нуждающегося в очистке или мытье, соответственно. В некоторых вариантах осуществления способы включают обеспечение композиции, включающей вариантную протеазу, включая, но без ограничений, очищающую композицию для белья или ткани, и тканевого предмета или предмета белья, нуждающегося в очистке, и приведение в контакт тканевого предмета или предмета белья (или сегмента предмета, требующего чистки) с композицией в условиях, достаточных или эффективных для очистки или мытья тканевого предмета или предмета белья до требуемой степени.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способ очистки или мытья предмета или поверхности (например, твердой поверхности), необязательно нуждающейся в очистке, при этом способ включает обеспечение предмета или поверхности, подлежащих очистке или мытью, и приведение в контакт предмета или поверхности (или сегмента предмета или поверхности, подлежащих очистке или мытью) по меньшей мере с одним вариантом субтилизина настоящего изобретения или композицией настоящего изобретения, включающей по меньшей мере один такой вариант субтилизина, в течение достаточного времени и/или в условиях, достаточных или эффективных для очистки или мытья предмета или поверхности до требуемой степени. Такие композиции включают, но без ограничений, например, очищающую композицию или моющую композицию настоящего изобретения (например, моющую композицию для ручного мытья посуды, очищающую композицию для ручного мытья посуды, моющее средство для белья или моющее средство для ткани или очищающую композицию для белья или ткани, жидкое моющее средство для белья, жидкую очищающую композицию для белья, порошковую моющую композицию для белья, порошковую очищающую композицию для белья, моющую композицию для автоматического мытья посуды, очищающую или моющую композицию-усилитель для белья, очищающую добавку для белья и композицию для предварительного замачивания белья и т.д.). В некоторых вариантах осуществления данный способ повторяют один или более раз, особенно если необходима дополнительная очистка или дополнительное мытье. Например, в некотором случае, данный способ необязательно дополнительно включает предоставление возможности предмету или поверхности оставаться в контакте по меньшей мере с одной вариантной протеазой или композицией в течение периода времени, достаточного или эффективного для очистки или мытья предмета или поверхности до требуемой степени. В некоторых вариантах осуществления данные способы дополнительно включают ополаскивание предмета или поверхности водой и/или другой жидкостью. В некоторых вариантах осуществления данные способы дополнительно включают приведение в контакт предмета или поверхности по меньшей мере с одной вариантной протеазой настоящего изобретения или композицией настоящего изобретения еще раз и предоставление возможности предмету или поверхности оставаться в контакте по меньшей мере с одной вариантной протеазой или композицией в течение периода времени, достаточного для очистки или мытья предмета или поверхности до требуемой степени. В некоторых вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой моющую композицию для мытья посуды, а предмет, подлежащий чистке, представляет собой предмет столовой посуды или столовой утвари. В некоторых вариантах осуществления настоящих способов очищающая композиция представляет собой моющую композицию для автоматического мытья посуды или моющую композицию для ручного мытья посуды, а предмет, подлежащий очистке, представляет собой предмет столовой посуды или столовой утвари. В некоторых вариантах осуществления данных способов очищающая композиция представляет собой моющую композицию для белья, а предмет, подлежащий очистке, представляет собой тканевой предмет.
Настоящее изобретение также предоставляет способы очистки предмета столовой утвари или предмета столовой посуды в машине для автоматического мытья посуды, при этом способ включает обеспечение машины для автоматического мытья посуды, размещение некоторого количества композиции для автоматического мытья посуды, включающей по меньшей мере один вариант субтилизина настоящего изобретения, или композиции настоящего изобретения, достаточного для очистки предмета столовой утвари или предмета столовой посуды в машине (например, путем размещения композиции в соответствующей или предоставленной камере или диспенсере для моющего средства в машине), расстановку предмета столовой посуды или столовой утвари в машине и эксплуатирование машины так, чтобы чистить предмет столовой утвари или предмет столовой посуды (например, согласно инструкциям производителя). В некоторых вариантах осуществления способы включают любую композицию для автоматического мытья посуды, описанную в настоящем изобретении, которая включает, но без ограничений, по меньшей мере один вариант субтилизина, представленный в настоящем изобретении. Количество композиции для автоматического мытья посуды, которое нужно применять, можно легко определить в соответствии с инструкциями или рекомендациями производителя и можно использовать любую форму композиции для автоматического мытья посуды, включающей по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения (например, жидкую, порошковую, твердую, гелевую, таблетированную и т.д.), включая любую описанную в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение также предоставляет способы очистки поверхности, предмета или объекта, необязательно нуждающегося в очистке, при этом способ включает приведение в контакт предмета или поверхности (или сегмента предмета или поверхности, требующего очистки) по меньшей мере с одним вариантным субтилизином настоящего изобретения или очищающей композицией настоящего изобретения в чистой форме, или разведенной в жидкости для мытья, в течение достаточного времени и/или в условиях, достаточных или эффективных для очистки или мытья предмета или поверхности до требуемой степени. Поверхность, предмет или объект затем, при необходимости, можно (необязательно) мыть и/или полоскать. Для целей настоящего изобретения “мытье” включает, но без ограничения, например, промывание и механическое перемешивание. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции используют в концентрациях от приблизительно 500 ppm до приблизительно 15000 ppm в растворе (например, водном растворе). Если растворителем для мытья является вода, то температура воды, как правило, варьирует в диапазоне от приблизительно 5°C до приблизительно 90°C, и если поверхность, предмет или объект включает ткань, то массовое соотношение воды к ткани, как правило, составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 30:1.
Настоящее изобретение также предоставляет способы очистки предмета белья или тканевого предмета в моющей машине, при этом способ включает обеспечение моющей машины, размещение некоторого количества моющей композиции для белья, включающей по меньшей мере один вариантный субтилизин настоящего изобретения, достаточного для очистки предмета белья или тканевого предмета в машине (например, путем размещения композиции в соответствующей или предоставленной камере или диспенсере для моющего средства в машине), помещение предмета белья или тканевого предмета в машине и эксплуатирование машины так, чтобы очистить предмет белья или тканевой предмет (например, согласно инструкциям производителя). Способы настоящего изобретения включают любую моющую композицию для мытья белья, описанную в настоящем изобретении, включающую, но без ограничений, по меньшей мере один любой вариантный субтилизин, представленный в настоящем изобретении. Количество моющей композиции для белья, которое нужно применять, можно легко определить в соответствии с инструкциями или рекомендациями производителя и можно использовать любую форму моющей композиции для белья, включающей по меньшей мере одну вариантную протеазу настоящего изобретения (например, твердую, порошковую, жидкую, таблетированную, гелевую и т.д.), включая любую описанную в настоящем изобретении.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Настоящее изобретение дополнительно подробно описано в следующих примерах, которые не предназначены каким-либо образом для ограничения заявляемого объема настоящего изобретения.
В экспериментальном раскрытии, следующем далее, употребляются следующие сокращения: PI (эффективность), ppm (частей на миллион); M (молярный); мМ (миллимолярный); мкМ (микромолярный); нМ (наномолярный); моль (моли); ммоль (миллимоли); мкмоль (микромоли); нмоль (наномоли); г (граммы); мг (миллиграммы); мкг (микрограммы); пг (пикограммы); л (литры); мл и млитр (миллилитры); мкл и мклитр (микролитр); см (сантиметры); мм (миллиметры); мкм (микрометры); нм (нанометры); Е (единицы); В (Вольты); МВ (молекулярный вес); с (секунды); мин(ы) (минута/минуты); ч(ы) и час(ы) (час/часы); °C (градусы Цельсия); QS (количество достаточное); ND (не выполнено); об./мин. (оборотов в минуту); GH (германские градусы жесткости); H2O (вода); dH2O (деионизированная вода); HCl (соляная кислота); АК (аминокислота); п.о. (пара оснований); т.п.о. (тысяча пар оснований); кДа (килоДальтоны); кДНК (копийная или комплементарная ДНК); ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота); оцДНК (одноцепочечная ДНК); дцДНК (двухцепочечная ДНК); dNTP (дезоксирибонуклеотидфосфат); РНК (рибонуклеиновая кислота); MgCl2 (хлорид магния); NaCl (хлорид натрия); w/v (вес к объему); v/v (объем к объему); w/w (вес к весу); g (ускорение свободного падения); OD (оптическая плотность); ppm (частей на миллион); фосфатный буферный раствор Дульбекко (DPBS); SOC (2% Bacto-триптон, 0,5% Bacto-дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl); Terrific Broth (TB; 12 г/л Bacto-триптон, 24 г/л глицерин, 2,31 г/л KH2PO4, и 12,54 г/л K2HPO4); OD280 (оптическая плотность при 280 нм); OD600 (оптическая плотность при 600 нм); A405 (поглощение при 405 нм); Vmax (максимальная начальная скорость реакции, катализируемой ферментом); PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле); PBS (фосфатно-солевой буферный раствор [150 мМ NaCl, 10 мМ буфер из фосфата натрия, pH 7,2]); PBST (PBS+0,25% TWEEN®-20); PEG (полиэтиленгликоль); PCR (полимеразная цепная реакция); RT-PCR (ПЦР с обратной транскрипцией); SDS (додецилсульфат натрия); Tris (трис(гидроксиметил)аминометан); HEPES (N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N-[2-этансульфоновая кислота]); HBS (HEPES-буферный солевой раствор); Tris-HCl (трис[гидроксиметил]аминометан-гидрохлорид); трицин (N-[трис-(гидроксиметил)метил]глицин); CHES (2-(N-циклогексиламино)этансульфоновая кислота); TAPS (3-{[трис-(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота); CAPS (3-(циклогексиламино)пропансульфоновая кислота; DMSO (диметилсульфоксид); DTT (1,4-дитио-DL-треитол); SA (синапиновая кислота (s,5-диметокси-4-гидроксифенилакриловая кислота); TCA (трихлоруксусная кислота); Glut и GSH (восстановленный глутатион); GSSG (окисленный глутатион); TCEP (трис[2-карбоксиэтил]фосфин); Ки (Кюри); мКи (миллиКюри); мкКи (микроКюри); HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография); RP-HPLC (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография); TLC (тонкослойная хроматография); MALDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы); Ts (тозил); Bn (бензил); Ph (фенил); Ms (мезил); Et (этил), Me (метил); Taq (ДНК-полимераза Thermus aquaticus); Кленова (большой (Кленова) фрагмент ДНК-полимеразы I); EGTA (этиленгликоль-бис(β-аминоэтилэфир) N,N,N',N'-тетрауксусная кислота); EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); bla (β-лактамазный ген или ген устойчивости к ампициллину); HDL (жидкость высокой плотности); HDD (порошковое моющее средство с высокой моющей способностью); HSG (гранулированное моющее средство с высоким пенообразованием); CEE (Центральная и Восточная Европа); WE (Западная Европа); NA при применении в отношении моющих средств (Северная Америка); Япония и JPN при применении в отношении моющих средств (Япония); MJ Research (MJ Research, Рино, Невада); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Лейден, Нидерланды); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Фрамингэм, Массачусетс); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, Сан-Хосе, Калифорния); Argo (Argo BioAnalytica, Морис Плэйнс, Нью-Джерси); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Бад-Кройцнах, Германия); Pall (Pall Corp., Ист-Хиллс, Нью-Йорк и Бад-Кройцнах, Германия); Spectrum (Spectrum Laboratories, Домингез Ранчо, Калифорния); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Вудлендс, Техас); Accelrys (Accelrys, Inc., Сан Диего, Калифорния); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Монреаль, Канада); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Эдисон, Нью-Джерси); CFT (Центр тестовых материалов, Влаардинген, Нидерланды); P&G и Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Цинциннати, Огайо); GE Healthcare (GE Healthcare, Чалфонт Сант-Джайлс, Соединенное Королевство); DNA2.0 (DNA2.0, Менло-Парк, Калифорния); OXOID (Oxoid, Бейзингсток, Гэмпшир, Великобритания); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Уиклоу, Ирландия); Finnzymes (Finnzymes Oy, Эспо, Финляндия); Kelco (CP Kelco, Уилмингтон, Делавер); Corning (Corning Life Sciences, Корнинг, Нью-Йорк); (NEN (NEN Life Science Products, Бостон, Массачусетс); Pharma AS (Pharma AS, Осло, Норвегия); Dynal (Dynal, Осло, Норвегия); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Левисвилл, Техас); ATCC (Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк); Sigma (Sigma Chemical Co., Сант-Луис, Миссури); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Пискатавэй, Нью-Джерси); NCBI (Национальный центр биотехнологической информации); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния); BD Biosciences и/или Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Пало Альто, Калифорния); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Аламеда, Калифорния); MWG Biotech (MWG Biotech, Хай-Пойнт, Северная Каролина); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Вилсонвилл, Орегон); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., Кинг-оф-Пруссия, Пенсильвания); Difco (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган); Mediatech (Mediatech, Херндон, Виржиния; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Круз, Калифорния); Oxoid (Oxoid Inc., Огденбург, Нью-Йорк); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Фрихолд, Нью-Джерси); GIBCO BRL или Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд); Millipore (Millipore, Биллерика, Массачусетс); Bio-Rad (Bio-Rad, Херкулес, Калифорния); Invitrogen (Invitrogen Corp., Сан-Диего, Калифорния); NEB (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс); Sigma (Sigma Chemical Co., Сант-Луис, Миссури); Pierce (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс); Takara (Takara Bio Inc. Отсу, Япония); Roche (Hoffmann-La Roche, Базель, Швейцария); EM Science (EM Science, Гиббстаун, Нью-Джерси); Qiagen (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния); Biodesign (Biodesign Intl., Сако, Мэйн); Aptagen (Aptagen, Inc., Херндон, Виржиния); Sorvall (Sorvall brand, из Kendro Laboratory Products, Ашвилл, Северная Каролина); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Саннивейл, Калифорния); R&D Systems (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота); Siegfried Handel (Siegfried Handel AG, Зофинген, Швейцария); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, Ла-Хойя, Калифорния); Marsh (Marsh Biosciences, Рочестер, Нью-Йорк); Geneart (Geneart GmbH, Регенсбург, Германия); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Винуски, Вермонт); (Biacore (Biacore, Inc., Пискатавэй, Нью-Джерси); PeproTech (PeproTech, Роки-Хилл, Нью-Джерси); SynPep (SynPep, Дублин, Калифорния); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Рингоуз, Нью-Джерси); Waters (Waters, Inc., Милфорд, Массачусетс); Matrix Science (Matrix Science, Бостон, Массачусетс); Dionex (Dionex, Corp., Саннивейл, Калифорния); Monsanto (Monsanto Co., Сант-Луис, Миссури); Wintershall (Wintershall AG, Кассель, Германия); BASF (BASF Co., Флорхэм-Парк, Нью-Джерси); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Солт-Лейк-Сити, Юта); Shell Chemicals (Shell Chemicals, Inc., Лондон, Великобритания); Stepan (Stepan, Норфилд, Иллинойс); Clariant (Clariant, Шульцбах, Германия); Industrial Zeolite (Industrial Zeolite Ltd., Грэйз, Эссекс, Великобритания); Jungbunzlauer (Jungbunzlauer, Базель, Швейцария); Solvay (Solvay, Брюссель, Бельгия); 3V Sigma (3V Sigma, Бергамо, Италия); Innospec (Innospec, Эллесмер-Порт, Великобритания); Thermphos (Thermphos, Влиссигген-Ост, Нидерланды); Ciba Specialty (Ciba Specialty Chemicals, Базель, Швейцария); Dow Corning (Dow Corning, Барри, Великобритания); Enichem (Enichem Iberica, Барселона, Испания); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Букс, Швейцария); Gist-Brocades (Gist-Brocades, Невада, Делфт, Нидерланды); Dow Corning (Dow Corning Corp., Мидленд, Мичиган); Mettler-Toledo (Mettler-Toledo Inc, Колумбус, Огайо); RB (Reckitt-Benckiser, Слау, Великобритания); и Microsoft (Microsoft, Inc., Редмонд, Вашингтон).
Применяемый в настоящем изобретении в некоторых перечнях предшествующий “0” указан для того, чтобы привести трехциферное обозначение для каждого сайта (например, “001” является тем же “1,” таким образом “A001C” является тем же “A1C”). В некоторых перечнях предшествующий “0” не включен. Кроме того, применяемый в настоящем изобретении “X” означает любую аминокислоту.
В иллюстративных моющих композициях, представленных в настоящем изобретении, уровни ферментов выражены посредством чистого фермента от массы совокупной композиции, и, если не указано иное, моющие ингредиенты выражены по массе от совокупных композиций. Сокращенные обозначения компонентов в настоящем изобретении имеют следующие значения:
Для североамериканских (NA) и западноевропейских (WE) жидких моющих средств с высокой моющей способностью (HDL) для белья тепловую инактивацию ферментов, присутствующих в коммерчески доступных моющих средствах, выполняют путем помещения предварительно взвешенного жидкого моющего средства (в стеклянной бутылке) в воду при 95°C на 2 часа. Время инкубации для тепловой инкубации NA и WE моющих средств для автоматического мытья посуды (ADW) составляет 8 часов. Как обработанные, так и необработанные теплом моющие средства оценивают в течение 5 минут после растворения моющего средства для точного определения процента дезактивации. Ферментную активность тестируют с помощью AAPF-анализа.
Для тестирования ферментной активности в инактивированных теплом моющих средствах рабочие растворы моющих средств делают из инактивированных теплом исходных растворов. Соответствующие количества ионов жесткости воды (например, 6 гран/галлон или 12 гран/галлон) и буфера добавляют к моющим растворам для приведения в соответствие с требуемыми условиями. Растворы смешивают путем интенсивного перемешивания или переворачивания бутылок. Следующая таблица предоставляет информацию касательно некоторых из коммерчески доступных моющих средств и условий тестирования, применяемых в настоящем изобретении. В некоторых экспериментах дополнительные и/или другие коммерчески доступные моющие средства находят применение в следующих примерах.
Условия для мытья посуды и белья
В некоторых дополнительных примерах находят применение следующие растворы:
Рабочие моющие растворы
HEPES
HEPES
MOPS
Таблица C приводит гранулированные моющие композиции для белья, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, пригодные для стирки тканей.
Гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
(Finnfix BDA бывшая CPKelco)
(14 мгран/галлон)
2 Полиэтиленимин (MW=600) с 20 этоксилатными группами на -NH.
3 Амфифильный, алкоксилированный, очищающий от жира полимер представляет собой полиэтиленимин (MW=600) с 24 этоксилатными группами на -NH и 16 пропоксилатных групп на -NH.
4 Обратимо действующий ингибитор протеазы со структурой:
5Этоксилированный тиофен окрашивающий краситель является таким, как описано в US 7208459 B2.
В таблице C все уровни ферментов выражены как % ферментного сырья, за исключением протеазы, функциональной в холодной воде (настоящего изобретения), которая выражена как % активного белка, добавляемого к продукту.
Таблица D приводит гранулированные моющие композиции для белья, подходящие для автоматических моющих машин с верхней загрузкой (моющие композиции 7-9) и моющих машин с фронтальной загрузкой (моющие композиции 10-11). Тестируемый вариант протеазы GG36 и/или протеазу, функциональную в холодной воде, настоящего изобретения в данные составы добавляют отдельно.
Гранулированная моющие композиции для белья и их компоненты
В таблице D ингредиенты-поверхностно-активные вещества можно получить от различных поставщиков, включая, но не ограничиваясь этим, BASF (например, LUTENSOL®), Shell Chemicals, Stepan, Huntsman и Clariant (например, PRAEPAGEN®). Цеолит можно получить от таких источников, как Industrial Zeolite. Лимонную кислоту и цитрат натрия можно получить от таких источников, как Jungbunzlauer. Перкарбонат натрия, карбонат натрия, бикарбонат натрия и сесквикарбонат натрия можно получить от таких источников, как Solvay. Сополимеры акрилата и малеата можно получить от таких источников, как BASF. Карбоксиметилцеллюлозу и гидрофобно модифицированную карбоксиметилцеллюлозу можно получить от таких источников, как CPKelco. C.I. флуоресцентный оптический отбеливатель 260 можно получить от 3V Sigma (например, OPTIBLANC®, OPTIBLANC® 2M/G, OPTIBLANC® 2MG/LT Extra или OPTIBLANC® Ecobright. S,S-Этилендиаминдисукцинат тетранатрия можно получить от таких источников, как Innospec. Терефталатный сополимер можно получить от Clariant (например, REPELOTEX SF 2). Кроме того, 1-гидроксиэтан-1,1-дифосфоновую кислоту можно получить от Thermphos. Усилитель отбеливателя на основе оксазиридиния имеет следующую структуру, где R1=2-бутилоктил, и был получен в соответствии с US 2006/0089284A1.
Ферменты NATALASE®, TERMAMYL®, STAINZYME PLUS®, CELLUCLEAN® и MANNAWAY®, можно получить от Novozymes. Тетрасульфонат фталоцианина цинка можно получить от Ciba Specialty Chemicals (например, TINOLUX® BMC). Подавитель пенообразования в гранулах можно получить от Dow Corning. В этих моющих композициях статистический привитой сополимер представляет собой сополимер поливинилацетата, привитого на полиэтиленоксид, имеющий полиэтиленоксидный остов и множество поливинилацетатных боковых цепей. Молекулярная масса полиэтиленоксидного остова составляет приблизительно 6000, и массовое соотношение полиэтиленоксида к поливинилацетат составляет приблизительно 40 к 60 и не более чем по 1 точке прививки на 50 этиленоксидных элементарных звеньев.
Таблицы E-G приводят дополнительные гранулированные моющие композиции, подходящие для моющих машин (моющие средства 36a-n). Тестируемый вариант протеазы GG36 или протеазу, функциональную в холодной воде, настоящего изобретения в данные составы добавляют отдельно.
Дополнительные гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
Дополнительные гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
Дополнительные гранулированные моющие композиции для белья и их компоненты
Примечания для моющих композиций 36a-n в таблицах E, F, G:
Ингредиенты-поверхностно-активные вещества можно получить от BASF, Людвигсхафен, Германия (Lutensol®); Shell Chemicals, Лондон, Великобритания; Stepan, Норфилд, Иллинойс, США; Huntsman, Huntsman, Солт-Лейк-Сити, Юта, США; Clariant, Шульцбах, Германия (Praepagen®).
Цеолит можно получить от Industrial Zeolite (Великобритания) Ltd, Грэйз, Эссекс, Великобритания.
Лимонную кислоту и цитрат натрия можно получить от Jungbunzlauer, Базель, Швейцария.
Перкарбонат натрия, карбонат натрия, бикарбонат натрия и сесквикарбонат натрия можно получить от Solvay, Брюссель, Бельгия.
Сополимеры акрилата и малеата можно получить от BASF, Людвигсхафен, Германия.
Карбоксиметилцеллюлозу и гидрофобно модифицированную карбоксиметилцеллюлозу можно получить от CPKelco, Арнем, Нидерланды.
C.I. Флуоресцентный оптический отбеливатель 260 можно получить от 3V Sigma, Бергамо, Италия в виде Optiblanc® Optiblanc® 2M/G, Optiblanc® 2MG/LT Extra или Optiblanc® Ecobright.
S,S-Этилендиаминдисукцинат тетранатрия можно получить от Innospec, Эллесмер-Порт, Великобритания.
Терефталатный сополимер можно получить от Clariant под торговым названием Repelotex SF 2.
1-Гидроксиэтан -1,1-дифосфоновую кислоту можно получить от Thermphos, Флиссинген-Оост, Нидерланды.
Усилитель отбеливателя на основе оксазиридиния имеет следующую структуру, где R1=2-бутилоктил, и был получен в соответствии с US 2006/0089284A1.
Ферменты Natalase®, Termamyl®, Stainzyme Plus®, Celluclean® и Mannaway® можно получить от Novozymes, Багсверд, Дания.
Тетрасульфонат фталоцианина цинка можно получить от Ciba Specialty Chemicals, Базель, Швейцария, в виде Tinolux® BMC.
Подавитель пенообразования в гранулах можно получить от Dow Corning, Барри, Великобритания.
Статистический привитой сополимер представляет собой сополимер поливинилацетата, привитого на полиэтиленоксид, имеющий полиэтиленоксидный остов и множество поливинилацетатных боковых цепей. Молекулярная масса полиэтиленоксидного остова составляет приблизительно 6000, и массовое соотношение полиэтиленоксида к поливинилацетату составляет приблизительно 40 к 60 и не более чем по 1 точке прививки на 50 этиленоксидных элементарных звеньев.
ПРИМЕР 1
Пробы и способы тестирования
Данный пример описывает различные способы тестирования и пробы, применявшиеся при разработке настоящего изобретения. Любые отклонения от приведенных протоколов указаны в соответствующих примерах.
Пробы выполняли с помощью Biomek FX Robot (Beckman Coulter) или многоканального пипеточного дозатора (например, Rainin PipetLite, Mettler-Toledo) и ридера SpectraMAX MTP (тип 340; Molecular Devices).
A. СПОСОБЫ ТЕСТИРОВАНИЯ
Способ тестирования 1
Протокол для определения того, представляет ли собой краситель или пигментный материал окрашивающее ткань средство для цели настоящего изобретения, представлен ниже:
1) Наполнить две емкости терготометра 800 мл водопроводной воды, Ньюкасл-апон-Тайн, Великобритания (общая жесткость ~12 гран на галлон США, поставляемая Northumbrian Water, Pity Me, Дарем, графство Дарем, Великобритания).
2) Вставить емкости в терготометр с температурой воды, контролируемой на уровне 30°C, и перемешиванием, выставленным на 40 об./мин. на время длительности эксперимента.
3) Добавить 4,8 г моющего средства IEC-B (IEC 60456, основное эталонное моющее средство для моющей машины типа B), поставляемая wfk, Бруген-Брахт, Германия, в каждую емкость.
4) Через две минуты добавить 2,0 мг активного красящего вещества в первую емкость.
5) Через одну минуту добавить 50 г нательной одежды из непрессованного хлопка (поставляемой Warwick Equest, Консетт, графство Дарем, Великобритания), порезанной на 5 см × 5 см лоскутки, в каждую емкость.
6) Через 10 минут, слить емкость и повторно наполнить холодной водой (16°C) с жесткостью воды 14,4 английских градусов жесткости Кларка с молярным соотношением кальция к магнию 3:1.
7) Через 2 минуты пополоскать, удалить ткань.
8) Повторить этапы 3-7 дополнительные три цикла с применением таких же обработок.
9) Собрать и высушить на веревке ткани в помещении в течение 12 часов.
10) Проанализировать лоскутки с помощью спектрометра Hunter Miniscan, оснащенным источником света D65 и УФА-ограничивающим фильтром, для получения значений Hunter a (ось красный-зеленый) и Hunter b (ось желтый-синий).
11) Вычислить средние значения Hunter a и Hunter b для каждого набора тканей. Если ткани, обработанные красящим веществом, при оценивании демонстрируют среднюю разницу в оттенке более чем на 0,2 единицы либо на оси a, либо оси b, считают, что это окрашивающее ткань средство для цели настоящего изобретения.
Способ тестирования 2
Для способа тестирования 2 проводят пробу микрообразца ткани BMI, приведенную ниже, с применением гранулированной моющей композиции 10 (см. Таблицу D, выше). Моющее средство для белья растворяют в воде, которая имеет жесткость 12 гран/галлон, и доводят до температуры 16°C, и добавляют интересующий протеазный вариантный фермент. Действие протеазных вариантных ферментов затем определяют в соответствии с описанной пробой микрообразца ткани BMI. Эффективность определяют путем сравнения действия протеазного вариантного фермента с показателем фермента субтилизина GG36 B. lentus с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, при этом во всех случаях диапазон дозировки фермента представляет собой 0,1-5 ppm. Протеазные вариантные ферменты, имеющие эффективность 1,1 или больше, рассматривают как протеазы, функциональные в холодной воде.
Способ тестирования 3
Для способа тестирования 3 пробу микрообразца ткани BMI, приведенную ниже, проводят с применением гранулированной моющей композиции 7 для белья (см. Таблицу D, выше). Моющее средство для белья растворяют в воде, которая имеет жесткость 6 гран/галлон, и доводят до температуры 16°C, добавляют интересующий протеазный вариантный фермент GG36. Затем действие протеазных вариантных ферментов GG36 определяют в соответствии с описанной пробой микрообразцов ткани BMI. Эффективность определяют путем сравнения действия протеазного вариантного фермента GG36 с показателем фермента субтилизина GG36 B. lentus с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, при этом во всех случаях диапазон дозировки фермента представляет собой 0,1-5 ppm. Протеазные вариантные ферменты, имеющие эффективность 1,1 или больше, рассматривают как протеазы, функциональные в холодной воде.
Способ тестирования 4
Для способа тестирования 4 пробу микрообразца ткани BMI проводят с применением гранулированной моющей композиции 7 для белья (см. Таблицу D, выше). Моющее средство для белья растворяют в воде, которая имеет жесткость 6 гран/галлон, и доводят до температуры 16°C, и добавляют интересующий протеазный вариантный фермент GG36. Затем действие протеазных вариантных ферментов GG36 определяют в соответствии с описанной пробой микрообразца ткани BMI. Эффективность определяют путем сравнения действия протеазного вариантного фермента GG36 с показателем эталонного фермента GG36-A158E, причем указанный эталонный фермент GG36-A158E состоит из протеазы субтилизина GG36 B. lentus аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 с одной заменой аланина на глутаминовую кислоту в положении 158 (т.е., мутация A158E), при этом во всех случаях диапазон дозировки фермента представляет собой 0,1-5 ppm. Протеазные вариантные ферменты, имеющие эффективность 1,0 или больше, рассматривают как протеазы, функциональные в холодной воде.
Способ тестирования 6
Для способа тестирования 6 пробу микрообразца ткани BMI проводят с применением одного из моющих средств 36a-6n в Таблице 1-2. Моющее средство растворяют в воде, которая имеет жесткость, указанную в Таблице 1-2, и доводят до температуры 16°C. Затем действие вариантных ферментов определяют в соответствии с описанной пробой микрообразца ткани BMI. Эффективность определяют путем сравнения действия варианта с действием фермента с SEQ ID NO:2, при этом диапазон дозировок фермента представляет собой 0,1-5 ppm во всех случаях. Ферменты, имеющие эффективность 1,1 или больше, рассматривают как протеазы, функциональные в холодной воде.
B. ПРОБЫ
TCA-анализ для определения содержания белка в 96-луночных микротитровальных планшетах
Культуры B. subtilis выращивали 2-3 дня при 37°C, перемешивали на скорости 250-300 об./мин. с увлажняющим аэрированием. Клетки удаляли из фермент-содержащего культурального супернатанта с помощью центрифугирования и/или фильтрации. Концентрацию протеазы/белка/фермента определяли с помощью преципитации пробы в TCA. Аликвоту (20-25 мкл) супернатанта культуры переносили в 96-луночный плоскодонный микротитровальный планшет (MTP; Costar 9017 прозрачный полистироловый планшет, связывающий среду), содержащий 100 мл/лунку 0,25 N HCl. Показания “начального уровня” определяли с помощью считывания рассеивания/поглощения света при 405 нм после 5 секунд перемешивания. 100 мл/лунку 30% (w/v) трихлоруксусной кислоты (TCA) добавляли в HCl-содержащий планшет и инкубировали 10 минут при комнатной температуре для того, чтобы способствовать осаждению белка. Рассеивание/поглощение света при 405 нм данного “тестового” планшета определяли после 5 секундного перемешивания. Возрастание мутности/рассеивания света в образцах коррелирует с общим количеством осаждаемого белка в культуральном супернатанте. Расчеты осуществляли путем вычитания показаний “начального уровня” (полученных после добавления HCl) от "тестовых" показаний (полученных после добавления TCA) с получением относительной меры присутствующего общего белка. При необходимости, можно построить калибровочную кривую путем калибровки TCA-показаний с AAPF-протеазными пробами (смотри ниже) клонов с известной удельной активностью. Однако, результаты TCA являются линейными по отношению к концентрации белка от 50 до 500 частей на миллион (ppm) белка (где 1 ppm соответствует 1 мг/л), и, таким образом, их можно отобразить на графике непосредственно в зависимости от действия фермента с целью отбора вариантов с требуемым действием.
AAPF-протеазная проба в 96-луночных микротитровальных планшетах
Для того чтобы определить протеазную активность вариантов серинпротеазы, измеряли гидролиз N-сукцинил-L-аланил-L-аланил-L-пролил-L-фенил-p-нитроанилида (suc-AAPF-pNA). Применяемыми растворами реагентов были: 100 мМ Tris/HCl, pH 8,6, содержащий 0,005% TWEEN®-80 (буфер для разбавления Tris); 100 мМ Tris-буфер, pH 8,6, содержащий 1 мМ CaCl2 и 0,005% TWEEN®-80 (Tris/Ca-буфер); и 160 мМ suc-AAPF-pNA в DMSO (исходный раствор suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). Для приготовления рабочего раствора suc-AAPF-pNA, 1 мл исходного раствора suc-AAPF-pNA добавляли к 100 мл Tris/Ca-буфер и хорошо перемешали в течение по меньшей мере 10 секунд. Пробу проводили путем добавления 10 мкл разбавленного раствора протеазы в каждую лунку 96-луночного MTP непосредственно после этого добавляли 190 мкл рабочего раствора 1 мг/мл suc-AAPF-pNA. Растворы измеряли в течение 5 сек и считывали изменение поглощения в кинетическом режиме (25 считываний за 5 минут) при 405 нм в MTP-ридере при 25°C. Протеазную активность выражали как AU (активность = ∆OD·мин-1 мл-1).
Проба для ингибирования эглином C
Как описано в настоящем изобретении, концентрацию и специфическую активность серинпротеазы определяли путем титрования с ингибитором, называемым эглин c. Эглин c из пиявки Hirudo medicinalis является прочно связывающимся белковым ингибитором субтилизинов и ASP-протеазы (Heinz et al., Biochemistry, 31: 8755-66 [1992]), и, таким образом, его можно применять для измерения концентрации протеазного фермента, которая, в свою очередь, позволит рассчитать специфическую активность. Ген эглина c синтезировали и экспрессировали в E. coli с помощью стандартных способов. Его свойства и ингибиторная сила была такая же, как у эглина c, приобретенного у Sigma.
(i) Определение концентрации исходного раствора эглина C
Образец субтилизина Bacillus lentus с известной удельной активностью разводили в 100 мМ Tris-буфер, pH 8,6, содержащих 1 мМ CaCl2 и 0,005% TWEEN®-80 (Tris/Ca-буфер), до концентрации, пригодной для AAPF-протеазной пробы, описанной выше. Также делали несколько разведений исходного раствора эглина c в Tris/Ca-буфере. Аликвоту каждого разведенного раствора эглина с смешивали с равным объемом разведенного раствора субтилизина Bacillus lentus. Аликвоту только Tris/Ca-буфера, без эглина c, также смешивали с равным объемом разведенного раствора субтилизина Bacillus lentus для того, чтобы измерить активность неингибированного субтилизина в отсутствии эглина c. Смешанные растворы инкубировали при комнатной температуре 15-30 минут и затем измеряли протеазную активность каждого образца с помощью AAPF-пробы, описанной выше. С помощью известной удельной активности субтилизина Bacillus lentus определяли концентрацию активной протеазы в каждом образце. Затем рассчитывали концентрацию эглина c в каждом образце на основании снижения наблюдаемой протеазной активности по сравнению с образцом неингибированного субтилизина, который был смешан только с Tris/Ca-буфером (без эглина c). Таким образом, с помощью известных разведений и объемов растворов эглина с определяли концентрацию эглина c в исходном растворе.
(ii) Определение концентрации и удельной активности вариантов субтилизина
Образцы вариантов субтилизина разводили в 100 мМ Tris-буфере, pH 8,6, содержащим 1 мМ CaCl2 и 0,005% TWEEN®-80 (Tris/Ca-буфер). Также делали несколько разведений исходного раствора эглина c известной концентрации в Tris/Ca-буфере. Аликвоту каждого разведенного раствора эглина с смешивали с равным объемом раствора варианта субтилизина. Смешанные растворы инкубировали при комнатной температуре 15-30 минут и затем определяли протеазную активность каждого образца с помощью AAPF-пробы. С помощью наблюдаемого снижения протеазной активности после добавления каждого образца эглина c и известной концентрации эглина c рассчитывали концентрацию эглина c, необходимую для полного ингибирования каждого варианта субтилизинового фермента. Данная концентрация эквивалентна концентрации фермента в образце. Аликвоту только Tris/Ca-буфера, без эглина c, также смешивали с каждым образцом варианта субтилизина, и протеазную активность в отсутствии эглина c измеряли с помощью AAPF-пробы. Затем рассчитывали удельную активность вариантов субтилизина с помощью концентраций ферментов, как определено выше.
Проба микрообразца ткани BMI (проба BMI)
Предварительно ополоснутые и перфорированные, окрашенные в крови, молоке и чернилах (BMI) микрообразцы ткани (EMPA116) с кольцевым диаметром 5,5 миллиметров в 96-луночных микротитровальных планшетах (MTP; Corning 3641) получали из Центра материалов для тестирования BV (Center for Testmaterials BV) (Влаардинген, Нидерланды).
Моющие средства 7-11 и 36a-n (Таблицы D-G) готовили путем смешивания в течение по меньшей мере 30 минут в 2 мМ карбонате натрия, забуференном до pH 10,3 с соответствующим уровнем жесткости воды (3:1 Ca:Mg.-CaCl2:MgCl2·6H2O) в воде Milli-Q, как описано в Таблице 1-1 и Таблице 1-2. Аликвоты моющих средств взяли в 50 мл конические пробирки (Falcon), центрифугировали для удаления осадка и охлаждали на льду в течение 30 минут перед использованием.
Концентрации ферментов уравновешивали до требуемой фиксированной концентрации в диапазоне 20-50 ppm относительно стандарта очищенного GG36. Удельную активность GG36 с применением AAPF в качестве субстрата использовали для преобразования TCA-значений с вычтенным начальным уровнем в концентрацию фермента в ppm. После определения концентрации фермента в ppm применяли простую формулу расчета объема каждого варианта, необходимого для добавления к фиксированному объему буфера (300-600 мкл), с тем, чтобы достигнуть требуемой исходной концентрации фермента:
x=(целевое ppm)(vb)/(y-целевое ppm)
где x = фермент в объеме, y = концентрация фермента, vb = объем буфера.
Автоматическое устройство Janus Perkin-Elmer с 8-канальной рукой Versispan применяли для дозирования различных объемов фермента из планшета-источника (планшет с полуглубокими лунками Axygen с объединенными собранными вариантами, применяемыми в пробе концентрации фермента с использованием TCA) в наполненный буфером планшет-приемник с помощью электропроводных наконечников. Образцы перемешивали три раза путем пипетирования вверх и вниз. Точность разведения ферментов оценивали путем измерения AAPF-активности уравновешенного планшета и сравнения ее с активностью планшета-источника для проверки того, чтобы были сделаны корректные разведения.
После уравновешивания добавляли 5-15 мкл раствора фермента в планшет с BMI-микрообразцами ткани, наполненный моющим средством, для достижения конечного объема ~200 мкл. В некоторых случая образцы ферментов не уравновешивали, и вместо этого их все одинаково разводили из исходного планшета с получением рабочего диапазона 0,1-5 ppm. Оптимальные целевые концентрации для каждой пробы определяли в результате измерения по кривой зависимости "доза-эффект" очищающей активности по данному диапазону для данного моющего средства.
MTP запечатывали фольгой (Bio-Rad) и инкубировали в инкубаторе/шейкере iEMS (Thermo/Labsystems), предустановленном на 16°C, в холодной комнате, установленной на 4°C или на 32°C, на столе в течение 30 минут при 1400 об./мин. После инкубации 120 мкл супернатанта переносили в свежий MTP (Corning 9017) и считывали при 600 нм с помощью ридера SpectraMax. Показания поглощения получали путем вычитания холостого контроля (без фермента) от каждого значения.
Эффективность (PI) рассчитывали для каждого варианта. Эффективность представляет собой соотношение поглощения супернатанта, получаемого в результате очищения вариантным ферментом к поглощению, получаемому в результате очищения GG36, при фиксированной концентрации фермента. Для уравновешенных планшетов величины PI рассчитывали путем деления поглощения варианта на поглощение контроля на заданном планшете. Для неуравновешенных планшетов строили калибровочную кривую (например, выравнивание по логистической модели нелинейной регрессии с четырьмя параметрами или Ленгмюра) исходя из активности и концентрации фермента у контролей. С помощью данной калибровочной кривой действие вариантов можно непосредственно сравнить с контролем при любой концентрации фермента. PI определяют путем деления поглощения у вариантов на рассчитанное поглощение для контроля при одинаковой концентрации фермента.
Эффективность (PI), которая больше 1 (PI>1), указывает на лучшее очищение вариантом по сравнению со стандартом (например, GG36), в то время как PI 1 (PI=1) указывает на вариант, который действует так же, как и стандарт, и PI, которая меньше 1 (PI<1), указывает на вариант, который действует хуже стандарта.
Конечные концентрации моющего средства, конечная жесткость воды, конечные концентрации буфера, применяемые для проб
микрообразцов ткани BMI
Конечные концентрации моющего средства, конечная жесткость воды, конечные концентрации буфера, применяемые для проб микрообразцов ткани BMI
Анализ стойкости LAS/EDTA
Стойкость вариантов протеаз в присутствии типичного анионного поверхностно-активного вещества (LAS=линейный алкилбенсульфонат, натрия додецилбензолсульфонат-DOBS) и динатриевой соли EDTA измеряют после инкубации в заданных условиях, а остаточную активность измеряют с помощью AAPF-пробы, описанной выше. Используемыми реагентами были додецилбензолсульфонат, натриевая соль (DOBS; Sigma № D-2525), TWEEN®-80 (Sigma № P-8074), динатриевая соль EDTA (Siegfried Handel № 164599-02), HEPES (Sigma № H-7523), нестрессовый буфер: 50 мМ HEPES (11,9 г/л) + 0,005% TWEEN®-80, pH 8,0, стрессовый буфер: 50 мМ HEPES (11,9 г/л), 0,1% (w/v) DOBS (1 г/л), 10 мМ EDTA (3,36 г/л), pH 8,0, культуральные супернатанты эталонной протеазы и варианта протеазы, содержащие 200-400 мкг/мл белка. Применяемым оборудованием является V- или U-донный MTP в качестве планшетов для разведения (Greiner 651101 и 650161, соответственно), F-донный MTP (Corning 9017) для нестрессового и LAS/EDTA буфера, а также для планшетов с suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter), МТР-ридер Spectramax Plus 384 (Molecular Devices) и инкубатор/шейкер iEMS (Thermo/Labsystems).
Инкубатор/шейкер iEMS (Thermo/Labsystems) выставляли на 29°C. Культуральные супернатанты разводили в планшетах, содержащих нестрессовый буфер, до концентрации ~25 ppm (основной планшет для разведений). Для пробы 20 мкл образца из основного планшета для разведений добавляли в планшеты, содержащие 180 мкл нестрессового буфера, с получением конечной концентрации инкубирования 2,5 ppm. Содержимое перемешивали и держали при комнатной температуре, и на данном планшете проводили AAPF-пробу. Кроме того, 20 мкл образца из основного планшета для разведений также добавляли в планшеты, содержащие 180 мкл стрессового буфера (50 мМ HEPES (11,9 г/л), 0,1% (w/v) DOBS (1 г/л), 10 мМ EDTA (3,36 г/л), pH 8,0). Растворы перемешивали и сразу помещали в 29°C шейкер iEMS на 30 минут при 400 об./мин. Через 30 минут инкубации проводили AAPF-пробу на стрессовом планшете. Стойкость образцов определяли путем расчета соотношения остаточной и изначальной активности AAPF следующим образом: остаточная активность (%) = [mOD.мин-1 стрессовый]*100/[mOD. мин-1 нестрессовый].
Конечные концентрации моющего средства, конечную жесткость воды и конечные концентрации буфера определяют на основе аналитической системы, которую нужно применять (например, североамериканские, японские, западноевропейские или центральноевропейские условия). В некоторых вариантах осуществления действие по удалению грязи вариантов протеазы определяют у коммерчески доступных моющих средств. Тепловая инактивация коммерческих моющих составов предназначена для устранения ферментативной активности у любого белкового компонента, в то же время сохраняя свойства неферментных компонентов. Таким образом, данный способ подходит для подготовки коммерчески приобретаемых моющих средств для применения в тестировании ферментных вариантов настоящего изобретения.
Микротитровальная проба с печеным яйцом
Для данной пробы 96-луночные планшеты с субстратом из желтка печеного яйца готовят из желтков куриных яиц. Желтки куриных яиц отделяют от белков, высвобождают из мембранной сумки и разводят до 20% (об./масса) водой Milli-Q. Разведенный желток перемешивают 15 минут при комнатной температуре с помощью магнитной мешалки. Пять мкл аккуратно пипетируют в центр каждой лунки 96-луночного V-донного планшета (Costar №3894) с помощью 8-канальной пипетки. Планшеты пекут при 90°C 1 час и охлаждают при комнатной температуре. Планшеты с субстратом из печенной яичного желтка хранят при комнатной температуре и используют в течение одной недели от приготовления. Моющие средства для автоматического мытья посуды готовят, как описано в настоящем изобретении, и предварительно нагревают до 50°C. 190 мкл аликвоту моющего средства добавляют в каждую лунку 96-луночного планшета с помощью 8-канальной пипетки. Десять мкл разведенного фермента добавляют в каждую лунку с помощью 96-канального пипетирующего устройства. Планшет тщательно запечатывают липкой фольгой-герметиком и инкубируют при 50°C с помешиванием в течение 30 минут. 120 мкл реакционной смеси переносят в новый 96-луночный плоскодонный планшет и определяют поглощение/рассеивание света при 405 нм. Поглощение/рассеивание света при 405 нм пропорционально удалению яичного желтка.
Проба микрообразцов ткани с яичным желтком (“Проба микрообразцов ткани CS-38”; или “ЯЙЦО” или “Посуда”)
Моющие средства для автоматического мытья посуды готовят, как описано в настоящем изобретении. Применявшееся оборудование включало шейкер/инкубатор Innova 4230 New Brunswick и МТР-ридер SpectraMAX (тип 340). MTP получены от Costar (тип 9017). Старый яичный желток с пигментными микрообразцами (CS-38) получен из Центра материалов для тестирования (Влаардинген, Нидерланды). Перед нарезанием на 0,25-дюймовые круглые микрообразцы ткани промывают водой. Один микрообразец ткани помещают в каждую лунку 96-луночного микротитровального планшета. Тестируемое моющее средство уравновешивают при 50°C. 190 мкл моющего раствора добавляют в каждую лунку MTP, содержащий микрообразцы ткани. К данной смеси добавляют 10 мкл разведенного раствора фермента. MTP запечатывают липкой фольгой и помещают в инкубатор на 30 минут с встряхиванием. После инкубации 100 мкл раствора из каждой лунки переносят в свежий MTP. Этот MTP считывают при 405 нм с помощью MTP-ридера SpectraMax. Также включают холостые контроли, а также контроли, содержащие микрообразцы ткани и моющее средство, но без фермента.
В некоторых вариантах осуществления находят применение предварительно промытые микрообразцы ткани. Данный тип микрообразца ткани является предварительно промытым в деионизированной воде в течение 20 минут при окружающей температуре. После этапа предварительной промывки микрообразцы выкладывают на бумажные полотенца для сушки. Высушенные на воздухе микрообразцы затем перфорируют с помощью ¼” кольцевого штампа на перфораторе. Наконец, два микрообразца ткани кладут в каждую лунку 96-луночного MTP вертикально с тем, чтобы выставить всю площадь поверхности (т.е. не плашмя на дне лунки).
Образцы вариантов протеазы, подлежащие тестированию, получают из фильтрованного культурального бульона культур, выращенных в MTP-планшетах. Применяемым оборудованием является автоматическое устройство Biomek FX (Beckman Coulter), МТР-ридер SpectraMAX (тип 340; Molecular Devices), инкубатор/шейкер iEMS (Thermo/Labsystems); F-донные MTP (Costar тип 9017, применяемый для считывания реакционных планшетов после инкубации); и V-донные MTP (Greiner 651101, применяемые для предварительного разведения супернатанта). В данной пробе протеазы гидролизуют субстрат и высвобождают пигмент и нерастворимые частицы из субстрата. Таким образом, степень мутности является мерой ферментной активности.
Действие по удалению грязи эталонных серинпротеаз и вариантов от них на микрообразцах ткани определяют в масштабе MTP в коммерчески доступном моющем средстве (Calgonit 5 в 1). Микрообразцы ткани CS-38 (яичный желток с пигментом, состаренный нагреванием), полученные от CFT Влаардинген, применяют в качестве субстрата. На лунку используют два микрообразца ткани. Таблетки ADW из Calgonit 5 в 1 применяют для приготовления моющего раствора. Для инактивации протеазной активности, присутствующей у таблеток, 21 г таблетку растворяют в воде Milli-Q, нагретой на водяной бане до температуры 60°C. Раствор охлаждают до комнатной температуры и объем воды доводят до 700 мл. Раствор дополнительно разводят водой до достижения конечной концентрации 3 г/л. Жесткость воды доводят до 21°GH путем добавления 1,46 мл Ca/Mg-смеси (смесь Ca/Mg [(3:1), 1,92 M CaCl2 = 282,3 г/л CaCl2.2H20; 0,64 M MgCl2 = 130,1 г/л MgCl2.6H2O), 15000 гран/галлон]. Образцы ферментов разводят в 10 мМ NaCl, 0,1 мМ CaCl2, 0,005% растворе TWEEN®-80 и тестируют на соответствующие концентрации.
Инкубатор выставляют на требуемую температуру 50°C. 72 мкл буфера для разведения добавляют в пустой V-донный планшет (т.е., “планшет для разведений”) с последующим добавлением 8 мкл супернатанта. 9 мкл из планшета для разведений добавляют в планшеты, содержащие микрообразцы ткани, инкубированные в 171 мкл моющего раствора. 9 мкл из планшета для разведений добавляют в планшеты, содержащие микрообразцы ткани для получения общего разведения супернатанта 200×. Планшет с микрообразцами ткани (с моющим средством и ферментом) накрывают пленкой и помещают в инкубатор/шейкер на 30 минут при 1400 об./мин. После инкубации 75 мкл реакционной смеси переносят в пустой F-донный планшет и считывают поглощение в MTP-ридере при 405 нм после удаления пузырьков феном. В тест также включают холостые контроли, содержащие один или два микрообразца ткани и моющее средство без добавления образцов, содержащих эталонную протеазу.
Полученное значение поглощения корректируют на холостое значение (субстрат без фермента), получая меру гидролитической активности. Для каждого образца (варианта) рассчитывают эффективность. Эффективность сравнивает действие варианта (фактическое значение) и стандартного фермента (теоретическое значение) при одинаковой концентрации белка. Кроме того, теоретические значения можно рассчитать, используя параметры уравнения Ленгмюра стандартного фермента.
Грязь яичного желтка на нержавеющей стали
Листы нержавеющей стали (10×15 см; матовые на одной стороне), используемые в данных экспериментах, тщательно моют при 95°C в лабораторной посудомоечной машине высокощелочным коммерческим моющим средством (например, моющее средство ECOLAB®; Henkel) с получением листов, которые являются чистыми и не содержат жира. С данных листов снимают заусенцы перед их первым использованием. Листы сушат 30 минут при 80°C в тепловом шкафу перед тем, как нанести загрязнение яичным желтком. Поверхностей, подлежащих шлифовке, не касаются до нанесения загрязнений. Также не допускаются пятна от воды или пыль на поверхностях. Охлажденные листы взвешивают перед нанесением загрязнений.
Яичные желтки готовят путем разделения желтков примерно 10-11 яиц (200 г яичного желтка) от белков. Желтки перемешивают вилкой в аналитическом стакане для гомогенизации суспензии желтка. Желтки затем процеживают (примерно 0,5 мм ячейка) для удаления грубых частиц и любых фрагментов яичной скорлупы.
Плоскую щетку (2,5”) применяют для нанесения 1,0±0,1 г суспензии яичных желтков так однородно, как только можно по площади 140 см2 на матовых сторонах каждой из плит из нержавеющей стали, оставляя незагрязненным ободок примерно 1 см шириной (при необходимости применяют липкую ленту). Запачканные листы сушат горизонтально (для предупреждения образования капель на краях листов) при комнатной температуре 4 часа (максимально 24 часа).
Для денатурации листы погружают на 30 секунд в кипящую деминерализированную воду (при необходимости, с помощью захвата). Затем листы снова сушат 30 минут при 80°C. После сушки и охлаждения листы взвешивают. После взвешивания листы оставляют по меньшей мере на 24 часа (20°C, 40-60% относительной влажности) перед направлением их на моющий тест. Для того, чтобы соответствовать требованиям тестирования, в тестировании используют только листы с 500±100 мг/140 см2 (яичного желтка после денатурации). После проведения моющих тестов листы сушат 30 минут при 80°C в тепловом шкафу и еще раз взвешивают после охлаждения. Относительное очищающее действие определяют путем деления (мг яичного желтка, высвобожденного мытьем ×100) на (мг нанесенного денатурированного яичного желтка).
Рубленное мясо на фарфоровых тарелках
Для данных экспериментов применяют десертные тарелки (Arzberg, белые, глазированные, фарфоровые) соответствующие EN 50242, форма 1495, № 0219, диаметр 19 см. Всего 225 г постной свинины и говядины (половина и половина) мелко режут и охлаждают после удаления видимого жира. Смесь дважды пропускают через мясорубку. Избегают температур свыше 35°C. Затем, 225 г рубленного мяса смешивают с 75 г яиц (белок и желток смешивают вместе). Затем препарат держат замороженным до трех месяцев при -18°C перед применением. Если свинина не доступна, используют говядину.
Смесь рубленного мяса и яиц (300 г) доводят до комнатной температуры и смешивают с 80 мл синтетической воды. Затем смесь гомогенизируют с помощью кухонного ручного блендера в течение 2 минут. Затем применяют вилку для распределения 3 г смеси рубленное мясо/яйцо/вода на каждой белой фарфоровой тарелке, оставляя незагрязненным край шириной примерно 2 см вокруг ободка. Нанесенное количество составляют 11,8±0,5 мг/см². Тарелки сушат в течение 2 часов при 120°C в предварительно нагретом тепловом шкафу. Как только тарелки остыли, они готовы к использованию. Тарелки укладывают в стопку с бумажными полотенцами между каждой из тарелок.
После мытья тарелки опрыскивают раствором нингидрина (1% этанол) для лучшей идентификации остатков рубленного мяса. Для запуска цветной реакции тарелки нагревают в течение 10 минут при 80°C в тепловом шкафу. Оценку моющего действия проводят визуальным просмотром цветных реакций остатков рубленного мяса по отношению к фотографическому каталогу IKW (IKW).
Яичная/молочная грязь на нержавеющей стали
Листы из нержавеющей стали (10×15 см; матовые на одной стороне), применяемые в данных экспериментах, тщательно моют при 95°C в лабораторной посудомоечной машине высокощелочным коммерческим моющим средством для удаления жира и очищения листов. Листы вытирают насухо целлюлозной салфеткой. Поверхностей, подлежащих шлифовке, не касаются до нанесения загрязнений. Также не допускаются пятна от воды или пыль на поверхностях. Перед нанесением загрязнений листы помещают в тепловой шкаф с 80°C на 30 минут. Охлажденные листы взвешивают перед нанесением загрязнений.
Яичные желтки и белки цельных сырых яиц (3-4 яйца; 160 г/яйцо) помещают в миску и взбивают венчиком. Затем в смесь добавляют 50 мл обезжиренное UHT (1,5% жира, стерилизованное при сверхвысокой температуре, гомогенизированное) молоко. Молоко и яйца смешивают без образования пены. Применяют плоскую щетку для однородного распределения 1,0±0,1 г смеси яйцо/молоко на матовой стороне листов из нержавеющей стали, используя остальную часть для проверки распределения. Вокруг коротких сторон листов оставляют полосу примерно 1,0 см. Запачканные листы сушат горизонтально (для предупреждения образования капель на краях листов) при комнатной температуре 4 часа (максимально 24 часа).
Листы затем погружают на 30 секунд в кипящую деминерализированную воду (при необходимости, с помощью захвата). Затем листы еще раз сушат в течение 30 минут при 80°C. После сушки и охлаждения листы взвешивают. После взвешивания листы оставляют по меньшей мере на 24 часа (20°C, 40-60% относительная влажность), перед направлением их на моющий тест. Для того, чтобы соответствовать требованиям тестирования, используют только листы с 190±10 мг яичного желтка.
После проведения моющих тестов листы сушат 30 минут при 80°C в тепловом шкафу и еще раз взвешивают после охлаждения. Относительное очищающее действие определяют путем деления (мг яйца/молока, высвобожденного мытьем ×100) на (мг нанесенного яйца/молока).
Получение грязи смеси спагетти на фарфоровых тарелках
Соус для макарон (390 г) смешивают с 150 г вареных макарон спагетти, 25 г рубленного мяса (улучшенная композиция IKW - комбинация 225 грамм обезжиренного рубленного мяса и 75 грамм яичного желтка) и 50 г сыра Grozette Formaggio. Используют ложку для распределения 3 г этой смеси на каждой белой фарфоровой тарелке (Arzberg, 19 см диаметр, бела, глазированная, фарфоровая, соответствующая EN 50242, форма 1495, № 0219), оставляя незагрязненной полосу примерно 2 см шириной вокруг ободка. Тарелки сушат путем пропекания их в течение 2 часов при 120°C в печи. Как только тарелки остыли, они готовы к использованию. Тарелки укладывают в стопку с бумажными полотенцами между каждой из тарелок для хранения. После мытья тарелки опрыскивают раствором йода (0,05 N) для лучшей идентификации углеводных остатков. Оценку моющего действия проводят визуальным просмотром цветных реакций углеводных остатков по отношению к фотографическому каталогу IKW (IKW) и выставляют балл по шкале 0-10 (при этом 10 означает "чистое").
Эффективность
Эффективность сравнивает действие варианта (измеренного значения) и стандартного фермента (теоретическое значение) при одинаковой концентрации белка. Кроме того, теоретические значения можно рассчитать, используя параметры кривой зависимости "доза-эффект" действия у стандартного фермента.
ПРИМЕР 2
Создание одиночных мутантов GG36 с применением библиотек для оценки сайтов мутации (SEL)
Построение SEL GG36, описываемое в данном примере, проводили с помощью GENEART с применением их запатентованных способов и технологических платформ для генной оптимизации, генного синтеза, создания и анализа библиотек (WO 2004/059556A3, Европейские патенты №№ 0200362 и 0201184; и патенты США №№ 4683195, 4683202 и 6472184). SEL GG36 получали в положениях, предварительно выбранных авторами изобретения, с помощью плазмиды экспрессии pHPLT-GG36 B. subtilis (см., ФИГ.2). Данная плазмида экспрессии B. subtilis содержит кассету экспрессии GG36, показанную ниже, промотор LAT B. licheniformis (Plat) и дополнительные элементы из pUB110 (McKenzie et al., Plasmid, 15:93-103, 1986), включая ген репликазы (reppUB), ген устойчивости к неомицину/канамицину (neo) и маркер устойчивости к блеомицину (bleo) (Фиг.4 в патенте США № 6566112). Карта плазмиды pHPLT-GG36 представлена на Фиг.2. Последовательность кассеты экспрессии GG36 представлена ниже.
ДНК-последовательность GG36 (сигнальная последовательность показана строчными буквами, пропептид - строчным подчеркнутым текстом, и зрелая последовательность GG36 - заглавными буквами) представлена ниже:
GtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgagctcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAA (SEQ ID NO:3)
Белковая последовательность GG36 (сигнальная последовательность показана строчными буквами, пропептид - строчным подчеркнутым текстом, и зрелая последовательность GG36 - заглавными буквами) представлена ниже:
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveuevailseeeeveiellhefetipvlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:4).
Способ мутагенеза основан на кодон-специфичном мутационном подходе, в котором все возможные аминокислотные замены создаются одновременно в конкретном представляющем интерес кодоне с помощью прямых и обратных мутагенных праймеров, которые содержат вырожденный кодон, NNS ((A,C,T или G), (A,C,T или G), (C или G)) в представляющем интерес сайте. Для построения каждой из SEL GG36 проводили три ПЦР-реакции: две реакции мутагенеза (первичные ПЦР 1 и ПЦР 2) для введения представляющего интерес мутантного кодона в зрелую ДНК-последовательность GG36 с применением прямых и обратных мутагенных праймеров NNS (25-45 нуклеотидов длиной), и третья реакция для слияния двух мутагенных ПЦР-продуктов вместе с построением вектора экспрессии pHPLT-GG36, имеющего требуемые мутантные кодоны в зрелой последовательности GG36.
Последовательности праймеров, применяемые в данном примере, представлены ниже:
Праймеры
Высокоточную ДНК-полимеразу Phusion (Finnzymes, каталожный № F-530L) применяли для всех ПЦР и реакции проводили в соответствии с протоколами производителя, которые поставлялись с полимеразой. В частности, для первичной ПЦР 1 применяли 1 мкл (10 мкМ) каждого из праймера pHPLT-BglII-Fw и обратного мутагенного праймера NN, а для первичной ПЦР 2 применяли 1 мкл (10 мкМ) праймера pHPLT-BglII-Rv и прямого мутагенного праймера NNS. Каждая реакция также включала 1 мкл матричной ДНК плазмиды pHPLT-GG36 (0,1-1 нг/мкл). Для ПЦР применяли термоциклер с элементом Пельтье PTC-200 MJ Research. Реакции давали два фрагмента примерно 2-3 т.п.о., имеющие примерно 30-нуклеотидное перекрытие, окружающее представляющий интерес кодон GG36. Полученные фрагменты сливали в третьей ПЦР, подобной тем, что описаны выше, с применением 1 мкл реакционной смеси из первичной ПЦР 1, 1 мкл реакционной смеси из первичной ПЦР 2 и 1 мкл (10 мкМ) каждого из прямого и обратного праймеров SacI-Fw и HindIII-Rv. Амплифицированный линейный фрагмент 859 п.о., кодирующий вариантный ген GG36, очищали (с помощью набора для очищения ПЦР-продуктов Qiaquick QIAGEN®) и расщепляли рестриктазами SacI и HindIIII для создания липких концов на обоих сторонах фрагмента слияния. Также очищали приблизительно 50 нг плазмиды pHPLT-GG36 после расщепления с помощью SacI и HindIIII, получая в результате фрагмент векторного остова длиной 3,9 т.п.о. Расщепленный векторный фрагмент сшивали с 50 нг расщепленного фрагмента длиной 859 п.о, кодирующего вариантный фермент с помощью ДНК-лигазы T4 (Invitrogen), следуя протоколу производителя для клонирования липких концов. После этого применяли смесь сшивания для того, чтобы трансформировать клетки B. subtilis (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::[xylR,pxylA-comK]), как описано (WO 2002/014490).
Для экспрессии вариантных белков для дальнейших биохимических анализов штаммы B. subtilis, несущие плазмиды с вариантом GG36, инокулировали в микротитровальные планшеты, содержащие 150 мкл бульонной среды Лурия, дополненной 10 мкг/мл неомицина. Планшеты культивировали в течение ночи при 37°C с 300 об./мин. помешиванием и 80% влажностью с применением крышек Enzyscreen для микротитровальных планшетов (Enzyscreen). Десять микролитров из ночного культурального планшета использовали для инокуляции нового микротитровального планшета, содержащего 190 мкл среды MBD (определенная среда на основе MOPS) с 10 мкг/мл неомицина. Среду MBD готовили, по существу как известно из уровня техники (см., Neidhardt et al., J. Bacteriol., 119: 736-747 [1974]), за исключением того, что опускали NH4Cl2, FeSO4 и CaCl2 из основной среды, использовали 3 мМ K2HPO4, и основную среду дополняли 60 мМ мочевиной и 100 мл раствора, получаемого из 210 г/л глюкозы и 350 г/л мальтодекстрина. Микроэлементы добавляли в виде 100× исходного раствора, содержащего в одном литре 400 мг FeSO4 7H2O, 100 мг MnSO4.H2O, 100 мг ZnSO4 7H2O, 50 мг CuCl2 2H2O, 100 мг CoCl2 6H2O, 100 мг NaMoO4 2H2O, 100 мг Na2B4O7 10H2O, 10 мл 1M CaCl2 и 10 мл 0,5 M цитрата натрия. Микротитровальные планшеты, содержащие среду MBD, культивировали в течение 68 часов при 37°C, 300 об./мин. и 80% влажности с применением крышек Enzyscreen (Enzyscreen) для определения экспрессии белка. На следующий день культуры профильтровали через микрофильтровальный планшет (0,22 мкм; Millipore), и полученный фильтрат применяли для биохимического анализа. Пробы микрообразцов ткани TCA и BMI для моющих композиций 7-11 проводили, как описано в Примере 1. Показатели действия также рассчитывали, как описано в описании пробы BMI в Примере 1, и они показаны в Таблице 2-2 относительно GG36. В следующих таблицах моющие композиции (“Det.”) соответствуют таковым, показанным в Таблице D, выше. Также, как указано, аминокислотное положение приведено в соответствии с нумерацией BPN'.
Одиночные варианты GG36 с эффективностью по меньшей мере 0,2 по отношению к GG36 при очистке микрообразцов ткани либо TCA, либо BMI при 16°C в моющих средствах 7-11
Одиночные варианты GG36 с эффективностью по меньшей мере 1,5 по отношению к GG36 при очистке микрообразцов ткани BMI при 32°C в моющем средстве 7
Одиночные варианты GG36 с эффективностью по меньшей мере 1,2 по отношению к GG36 при очистке микрообразцов ткани BMI при 32°C в моющем средстве 10
ПРИМЕР 3
Построение и очищающее действие наборов NHJ1 и WCE1 вариантов GG36
Набор NHJ1 и WCE1 вариантов GG36, описанных в настоящем изобретении, строили в DNA 2.0, Inc., с применением описанной выше (ФИГ.2) плазмиды экспрессии pHPLT-GG36 B. subtilis. Варианты экспрессировали в клетках B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo), как описано в Примере 2, и дополнительно охарактеризовывали с помощью пробы TCA для определения белкового содержания, пробы стойкости LAS/EDTA и пробы микрообразцов ткани BMI для исследования очищающего действия, как описано в Примере 1. Эти результаты показаны в Таблицах 3-1 и 3-2. В следующих таблицах моющие композиции (“Det.”) соответствуют вышепоказанным в Таблице D. Также, как указывалось, аминокислотное положение перечислено в соответствии с нумерацией BPN'.
Варианты NHJ1 с эффективностью по меньшей мере 0,25 по отношению к GG36 в любой из TCA, стойкости LAS/EDTA или очистки микрообразцов ткани BMI при 16°C в моющих средствах 7, 8 или 9
Варианты WCE1 с эффективностью по меньшей мере 0,2 по отношению к GG36 в любой из TCA, стойкости LAS/EDTA или очищение микрообразцов ткани BMI при 16°C в моющих средствах 10 или 11
ПРИМЕР 4
Построение и очищающее действие набора NHJ4 вариантов GG36
Варианты GG36 набора NHJ4, описанные ниже в Таблице 4-4, строили при помощи плазмиды экспрессии pHPLT-GG36 B. subtilis (Фигура 2) с применением ПЦР-слияния или набора для множественного сайт-направленного мутагенеза QUIKCHANGE® (“набор QCMS”; Stratagene), как описано ниже.
a) Построение вариантов NHJ4 при помощи множественного сайт-направленного мутагенеза QUIKCHANGE®
Варианты, созданные с помощью множественного сайт-направленного мутагенеза QUIKCHANGE®, показаны в Таблице 4-4. Исходную плазмиду pHPLT-GG36 (ДНК-матрица) метилировали с помощью двух микрограмм ДНК- и Dam-метилазы (NEB) в соответствии с инструкциями производителя. Сайт-направленные мутанты были получены при помощи набора множественного сайт-направленного мутагенеза QuikChange® (“набор QCMS”; Stratagene), следуя протоколу производителя (см., Таблицу 4-1 для праймерных последовательностей). Для эффективной трансформации B. subtilis ДНК из реакционных смесей QCMS амплифицировали с помощью амплификации по типу катящегося кольца (RCA) с применением набора Illustra Templiphi (GE Healthcare), и реакцию ставили согласно протоколу производителя. Один микролитр десятикратно разведенной амплифицированной ДНК использовали для трансформации 50 мкл компетентных клеток B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Смесь для трансформации встряхивали при 37°C в течение 1 часа. Десятимикролитровые аликвоты смеси для трансформации высевали на агаровые пластинки Лурия с обезжиренным молоком (1,6%) с добавлением 10 мкг/мл неомицина (Teknova). После этого, колонии, образующие чистый участок (окаймленного) на пластинках с обезжиренным молоком, инокулировали в 120 мкл среды LB, содержащей 10 мкг/мл неомицина, для экстракции плазмидной ДНК (набор QIAprep Spin Miniprep, Qiagen). Экстрагированные плазмиды секвенировали для подтверждения наличия требуемых мутаций.
Праймерные последовательности, применяемые при построении вариантов NHJ4
b) Построение вариантов NHJ4 с помощью ПЦР с удлинением
Десять комбинаторных мутантов GG36 были созданы с помощью ПЦР с удлинением. Перечень мутаций, введенных в плазмиду pHPLT-GG36, и праймеры, применяемые для данной цели, показаны в Таблице 4-2. Для создания каждого мутанта несколько фрагментов (Таблица 4-3) амплифицировали с помощью праймеров, показанных в Таблице 4-2. Каждая реакция амплификации ПЦР содержала 30 пмоль каждого праймера и 100 нг матрицы ДНК, плазмиды pHPLT-GG36. Амплификации выполняли с применением ДНК-полимеразы Vent (NEB). Реакцию ПЦР (20 мкл) изначально нагревали до 95°C в течение 2,5 мин, с последующими 30 циклами денатурации при 94°C в течение 15 с, ренатурации при 55°C в течение 15 с и удлинением при 72°C в течение 1 минуты. После амплификации 2-4 ПЦР-фрагменты (Таблица 4-3) для каждого варианта очищали в геле с применением набора для очистки QIAGEN® gel-bend purification kit и перемешивали (50 нг каждого фрагмента). Эти смеси служили в качестве матриц ДНК для ПЦР с удлинением с помощью праймеров P5954 и P5955 для создания генного фрагмента полной длины. Условия ПЦР были такими же, как описано выше, за исключением фазы удлинения, которую проводили при 72°C в течение 2 мин. ДНК-фрагмент полной длины очищали в геле применением набора для очистки QIAGEN® gel-bend purification kit, расщепляли с помощью рестрикционных ферментов BamHI и HindIII и сшивали с pHPLT-GG36, которую расщепляли теми же рестрикционными ферментами. Один микролитр смесей для сшивания амплифицировали с помощью амплификации по типу катящегося кольца при помощи набора Illustra Templiphi в соответствии с инструкциями производителя (GE Healthcare) с получением мультимерной ДНК для трансформации в Bacillus subtilis. Продукты амплификации по типу катящегося кольца разводили в 100 раз и применяли для трансформации клеток B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Часть смеси для трансформации высевали на пластины LB, содержащие 1,6% обезжиренное молоко и 10 мкг/мл неомицина, и инкубировали в течение ночи при 37°C. После этого, колонии с окаймлением инокулировали в 120 мкл бульонной среды Лурия, содержащей 10 мкг/мл неомицина для экстракции плазмидной ДНК (набор QIAprep Spin Miniprep, Qiagen). Экстрагированные плазмиды секвенировали для подтверждения присутствия требуемых мутаций. Варианты, созданные с помощью ПЦР с удлинением, показаны в Таблице 4-4.
Перечень праймеров, применяемых для построения вариантов NHJ4 при помощи ПЦР с удлинением
Комбинаторные варианты, созданные при помощи ПЦР с удлинением
Для экспрессии набора NHJ4 вариантных белков для дальнейших биохимических анализов штаммы B. subtilis, несущие вариантные плазмиды, инокулировали в микротитровальные планшеты, содержащие 150 мкл бульонной среды Лурия с добавлением 10 мкг/мл неомицина. Культуры выращивали для экспрессии белка, как описано в Примере 2, и их фильтровали через микрофильтровальный планшет (0,22 мкм; Millipore), также как описано в Примере 2. Полученный фильтрат использовали для биохимического анализа. Пробы ингибирования с эглином с для определения содержания белка и микрообразцы ткани пробы BMI, тестируемые в различных моющих средствах, выполняли, как описано в Примере 1. Эффективность также рассчитывали, как описано в описании пробы BMI в Примере 1. Таблица 4-4 предоставляет информацию касательно вариантов множественных мутаций и результатов, полученных для них. PI значения приведены относительно GG36. В следующих таблицах моющие композиции (“Det.”) соответствуют вышепоказанным в Таблице D. Также, как указано, аминокислотное положение перечислено в соответствии с нумерацией BPN'.
Варианты множественных мутаций NHJ4 с показателем очищающего действия BMI по меньшей мере 0,2 по отношению к GG36 в моющих средствах 7, 8 или 9, при 16°C
ПРИМЕР 5
Построение и очищающее действие набора NHJ3 вариантов GG36
Набор NHJ3 вариантов, описанных в настоящем изобретении, основан на варианте GG36 (называемым GG36-9), содержащем следующие мутации: S101G, S103A, V104I, G159D, A232V, Q236H, Q245R, N248D и N252K (нумерация BPN'). Эти варианты были созданы с применением экспресс-набора для сайт-направленного мутагенеза QUIKCHANGE® (набор QCLDS; Stratagene), с плазмидой pRA68 (см., ФИГ.3) в качестве матрицы ДНК. Плазмиду pRA68 получали из вектора pBN3 (см., Babé et al., Biotech. Appl. Biochem. 27:117-124 [1998]).
ДНК-последовательность варианта GG36-9 (сигнальная последовательность показана строчными буквами, пропептид - строчным подчеркнутым текстом, и зрелая последовательность GG36-9 - заглавными буквами) приведена ниже:
GtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGGGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACATAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAAAACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCGAAGCTGCAACTCGTTAA (SEQ ID NO:5)
Белковая последовательность варианта GG36-9 (сигнальная последовательность показана строчными буквами, пропептид - строчным подчеркнутым текстом, и зрелая последовательность GG36-9 - заглавными буквами) приведена ниже:
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveuevailseeeeveiellhefetipvlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAVLVKHKNPSWSNVRIRDHLKKTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:6)
Для создания вариантов NHJ3 с помощью набора QCLSD, мутагенные праймеры расщепляли, как показано в Таблице 5-1 для каждого из вариантов. Реакция мутагенеза для каждого варианта состоит из 0,5 мкл 10× буфера, 0,5 мкл ДНК плазмиды pRA68 (168 нг/мкл), 0,5 мкл прямого “f” мутагенного праймера (25 мкМ), 0,5 мкл обратного “r” мутагенного праймера (25 мкМ), 1 мкл dNTP (поставляется в наборе QCLSD), 1,5 мкл раствора Quik (поставляется в наборе QCLMS), 1 мкл ферментной смеси (поставляется в наборе QCLSD) и 40 мкл дистиллированной, деионизированной воды для получения 50 мкл реакционного объема в соответствии с инструкциями производителя. Программа циклирования представляла собой 1 цикл при 95°C в течении 2 минут, 18 циклов 95°C в течении 20 секунд, 60°C в течении 10 секунд и 68°C в течении 3 минут, 22 секунд и финальный цикл при 68°C в течении 5 минут. Затем 1 мкл рестрикционного фермента DpnI, поставляемого в наборе, использовали для расщепления плазмидной ДНК в реакции, и затем 2 мкл использовали для трансформации 10 лучших компетентных клеток E.coli (Invitrogen). Трансформанты E.coli отбирали на чашках с бульонной средой Луриа, содержащей 50 мкг/мл (ppm) карбенициллина, после выращивания в течение ночи при 37°C. Плазмидную ДНК экстрагировали из 4-8 колоний E. coli, выращенных в среде LA, содержащей 50 мкг/мл (ppm) карбенициллина, при помощи набора spin miniprep QIAprep (Qiagen). Плазмиды секвенировали для подтверждения присутствия требуемых мутаций. Вариантные плазмиды затем трансформировали в клетки B. subtilis, как описано в Примере 2. Вариантные штаммы B. subtilis выращивали, как описано в Примере 2, для дальнейших биохимических анализов, таких как определение содержания белка с применением пробы ингибирования с эглином с (Пример 1) и пробы микрообразцов ткани BMI для исследования очищающего действия (Пример 1). Результаты представлены ниже в Таблицах 5-2 и 5-3. PI приведены по отношению к GG36. В следующих таблицах моющие композиции (“Det.”) соответствуют вышепоказанным в Таблице D. Также, как указывалось, аминокислотное положение перечислено в соответствии с нумерацией BPN'.
Перечень мутагенных праймеров, применяемых для создания набора NHJ3 вариантов (“f” относится к прямым праймерам и “r” относится к обратным праймерам)
Варианты множественных мутаций NHJ3 с показателями очищающего действия BMI по меньшей мере 1,1 по отношению к GG36 в моющих средствах 7, 8 или 9, при 16°C
Варианты множественных мутаций NHJ3 с показателями очищающего действия BMI по меньшей мере 0,3 по отношению к GG36 в моющих средствах 10 или 11, при 16°C
ПРИМЕР 6
Получение и очищающее действие набора NHJ5 вариантов GG36
Набор NHJ5 вариантов, описанных в настоящем изобретении, основан на варианте GG36 (называемый GG36-7), содержащем следующие мутации: S101G, S103A, V104I, G159D, A232V, Q245R, N248D и (нумерация BPN'). Эти варианты были созданы с применением экспресс-набора для множественного сайт-направленного мутагенеза QUIKCHANGE® (“набор QCLMS”) с плазмидой pRA96 в качестве матрицы ДНК (см., ФИГ.4). Встраиваемые мутации и последовательности праймеров, применяемых для введения мутаций в GG36-7, показаны в Таблице 6-1. Варианты создавали с помощью способов, описанных в Примере 4. Вариантные штаммы B. subtilis выращивали, как описано в Примере 2, для дальнейшего биохимического анализа, такого как определение содержания белка с применением пробы ингибирования с эглином с (Пример 1) и пробы микрообразцов ткани BMI для исследования очищающего действия (Пример 1). Результаты представлены ниже в Таблице 6-2. Значения PI приведены по отношению к GG36. В следующих таблицах моющие композиции (“Det.”) соответствуют вышеуказанным в Таблице D. Также, как указано, аминокислотное положение перечислено в соответствии с нумерацией BPN'.
ДНК-последовательность варианта GG36-7 (сигнальная последовательность показана строчными буквами, пропептид - строчным подчеркнутым текстом, и зрелая последовательность GG36-7 - заглавными буквами) представлена ниже:
GtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGGGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCGAAGCTGCAACTCGT (SEQ ID NO:7)
Белковая последовательность варианта GG36-7 (сигнальная последовательность показана строчными буквами, пропептид - строчным подчеркнутым текстом, и зрелая последовательность GG36-7 - заглавными буквами) представлена ниже:
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveuevailseeeeveiellhefetipvlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAVLVKQKNPSWSNVRIRDHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:8)
Перечень праймеров применяемых для создания наборов NHJ5 вариантов
(нумерация BPN' показана в скобках)
Варианты множественных мутаций NHJ5 с показателями очищающего действия BMI по меньшей мере 0,6 по отношению к GG36 в моющих средствах 7-11, при 16°C
ПРИМЕР 7
Построение комбинаторной NHJ2 библиотеки
Этот пример описывает построение комбинаторной библиотеки GG36, включающей одну или более из следующих мутаций: A16S, T22A, S101A, S103G, V104L, L111V, S128N и L148I (нумерация BPN'). Плазмида экспрессии pHPLT-GG36 B. subtilis была введена в DNA 2.0 Inc., для создания комбинаторной библиотеки NHJ2. Реакция лигирования построенной библиотеки NHJ2 была введена в DNA 2.0, Inc. для трансформации в штамм B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Созданные варианты, содержащие одну или более из мутаций, описанных в настоящем изобретении, можно протестировать на очищение в холодной воде с помощью способов и моющих композиций, описанных в настоящем изобретении.
ПРИМЕР 8
Построение дополнительных библиотек и вариантов GG36
Дополнительные библиотеки и варианты строили при помощи следующего набора мутаций: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, W241R (нумерация BPN'). Плазмиду экспрессии pHPLT-GG36 B. subtilis применяли для построения библиотек и вариантов в DNA2.0, Inc. Продукт реакции лигирования библиотеки или варианта трансформировали в штамм B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Созданные варианты, содержащие одну или более данных мутаций, тестировали на очищение в холодной воде в пробе микрообразцов ткани BMI для исследования очищающего действия (Пример 1) с применением способов и моющих композиций, описанных в настоящем изобретении. Результаты представлены ниже в Таблице 8-1. В следующих таблицах моющие композиции (“Det.”) соответствуют вышеуказанным в Таблице 1-2. Также, как указывалось, аминокислотное положение перечислено в соответствии с нумерацией BPN'.
Дополнительные наборы вариантов GG36 построены и протестированы на очищение в холодной воде с помощью способов и моющих композиций, описанных в настоящем изобретении, и включают: G20R-N43R-H249R, G20R-T22R-N43R, G20R-N43R-S242R, G20R-N43R-E271L, G20R-N43R-V244R, G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-T22R-S78R-S212F-W241R, S9A-G20R-N43R-S212F, S9A-N43R-S212F, G20R-N43R-S212F, G20R-T22R-N43R-S212F, S24R-S78R-S212F, S9A-N43R-S78R, S9A-N43R-S78R-S242R, S9A-G20R-N43R-S78R, G20R-S24R-N43R-S78R-S242R, T22R-S24R-S78R-S212F, S9A-G20R-N43R-S78R-S242R, G20R-N43R-S78R-H249R, G20R-N43R-S78R, S9A-S78R-S212F, S9A-T22R-N43R-S78R, S9A-G20R-S24R-N43R, S9A-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R-S78R-S212F, G20R-S24R-N43R, A1R-S9A-N43R, G20R-S24R-N43R-G115R, S9A-S24R-N43R, G20R-T22R-S24R-N43R, A1R-S24R-N43R, S9A-G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-G20R-T22R-S78R-S212F, S9A-S24R-N43R-V244R, S9A-S24R-N43R-S242R, V4R-S9A-T22R-S24R-S212F и T22R-S24R-N43R (нумерация BPN').
Очищающее действие BMI вариантов WCE4
PI = Эффективность по отношению к GG36
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36k или l
ПРИМЕР 9
Построение и очищающее действие WCE2 библиотеки GG36
Комбинаторная библиотека WCE2 была создана при помощи DNA 2.0, Inc., с применением плазмиды экспрессии pHPLT-GG36 B. subtilis. Продукт реакция лигирования построенной библиотеки WCE2 трансформировали в штамм B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Набор мутаций, применяемый для создания библиотеки WCE2, представляет собой: A230E, G20R, H249R, N18R, N43R/D, N76D, R45T, S242R и S24R (нумерация BPN'). Созданные варианты, содержащие одну или более данных мутаций, тестировали на очищение в холодной воде в пробе микрообразца ткани BMI для исследования очищающего действия (Пример 1) с применением способов и моющих композиций, описанных в настоящем изобретении. Результаты представлены ниже в Таблице 9-1. В следующей таблице моющие композиции (“Det.”) соответствуют вышеуказанным в Таблице 1-2. Также, как указывалось, аминокислотное положение перечислено в соответствии с нумерацией BPN'.
Очищающее действие BMI библиотеки WCE2 GG36
PI = Эффективность по отношению к GG36
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36h или 36i
ПРИМЕР 10
Построение и очищающее действие набора WCE3 вариантов GG36
Этот пример описывает набор мутаций WCE3, основанный на вариантах GG36, GG36-7 (Пример 5) и GG36-9 (Пример 4). Эти варианты представляют собой: S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R и S101G, S103A, V104I, A232V, Q236H, Q245R и N252K. Они были созданы с помощью экспресс-набора для множественного сайт-направленного мутагенеза QuikChange® (QCLMS наборе; Stratagene) с плазмидой pRA96 в качестве матрицы ДНК, описанной в Примере 5. Созданные варианты протестировали на очищение в холодной воде в пробе микрообразцов ткани BMI (Пример 1) с применением моющих средств, описанных в Таблице 1-2.
Очищающее действие BMI вариантов WCE3
PI = Эффективность по отношению к GG36
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36h или 36i
ПРИМЕР 11
Построение дополнительных библиотек и вариантов GG36
Этот пример описывает построение вариантов и библиотек GG36 с помощью одной или более из следующих мутаций: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, S166D, R186H, S188D, Y209E, Q236H, N238R, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, E271F (пронумерованных BPN') с применением плазмиды экспрессии B. subtilis (например, pHPLT-GG36; Фиг.2). Комбинаторные варианты строили при помощи DNA2.0, Inc., с применением плазмиды экспрессии B. subtilis (например, pHPLT-GG36; Фиг.2) и штамма B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). В случае библиотек ДНК продукт реакции лигирования каждой из построенных библиотек с помощью плазмиды экспрессии B. subtilis (например, pHPLT-GG36; Фиг.2) трансформировали в штамм B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Созданные варианты, содержащие одну или более мутаций, перечисленные выше, тестировали на очищение в холодной воде в пробе микрообразцов ткани BMI (Пример 1) с применением моющих композиций, описанных в Таблице 1-2.
Очищающее действие BMI библиотек вариантов NHJ6
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36b, 36d или 36e
Очищающее действие BMI библиотек вариантов NHJ6
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = +
Очищающее действие BMI комбинаторных вариантов NHJ7
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36b, 36d или 36e
ПРИМЕР 12
Построение дополнительных библиотек и вариантов GG36
Этот пример описывает построение вариантов и библиотек GG36 в B. subtilis с помощью одной или более из следующих мутаций (пронумерованных BPN'): A1R, Q2S, Q2M, Q2A, Q2R, Q2W, S3R, V4R, V4S, V4C, I8A, S9A, S9F, S9W, R10S, R10A, R10H, R10M, Q12F, Q12R, P14K, P14F, P14Q, A15R, A15F, A16S, H17R, H17M, H17F, N18R, N18K, G20F, G20K, G20R, T22A, T22R, T22Y, T22V, T22Q, T22L, T22W, G23A, G23S, G23F, S24R, S24F, S24W, S24Q, S24H, S24L, G25V, G25F, G25R, V26F, K27L, K27F, K27R, K27V, V28A, V28N, V28E, A29T, V30E, L31F, T33S, T33G, T33D, G34P, I35M, S36T, S36F, S36R, T38L, T38F, T38R, P40N, P40L, P40T, P40W, P40H, P40R, L42I, N43A, N43F, N43I, N43S, N43R, N43M, N43W, N43D, R45T, G46R, A48R, F50C, V51W, V51F, V51H, P52F, P52E, P52N, P55Y, T57R, Q59A, Q59F, Q59R, D60P, D60Q, D60A, N62E, N62Q, G63V, G63M, G63T, G63I, G63A, G63S, G63H, G63Q, G63D, G63E, G63P, H64F, H64T, V68A, V68C, A69N, A69T, A69P, A69W, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75E, L75R, N76D, S78R, S78N, S78I, I79W, I79Q, V81R, L82F, L82T, L82V, L82R, L82M, A85M, P86W, P86L, P86I, E89P, E89T, E89G, E89H, E89L, E89V, E89W, E89F, E89I, Y91N, Y91F, A92F, K94N, S99F, S99T, S99P, S99G, S99M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121F, V121E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, N183I, N183D, N183M, N183F, N183R, N185E, N185V, N185I, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Y192H, Y192W, A194E, A194V, A194F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, T213A, Y214F, A215N, A215D, A215E, A215H, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, N218P, N218E, T224A, T224G, V227I, A230E, A231I, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, N238K, N238L, P239K, P239G, P239R, P239H, P239T, P239N, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, N248I, N248R, H249R, H249T, L250I, K251R, K251S, N252I, N252F, N252R, N252K, N252H, T253I, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, T260I, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, N269I, N269R, A270C, E271I, E271V, E271H, E271M, E271L, E271P, E271A, E271F, E271T, A272F, A272F, A272R, A273F, A273I и T274G. Варианты и библиотеки были построены с помощью DNA2.0, Inc., как описано в Примере 11. Созданные варианты, содержащие одну или более данных мутаций, тестировали на очищение в холодной воде в пробе микрообразцов ткани BMI (Пример 1) и моющих композициях, описанных в Таблице 1-2.
Очищающее действие BMI вариантов WCE6 и WCE8.
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36k или 36l
Очищающее действие BMI вариантов библиотек WCE10-WCE14
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36k или 36l
Очищающее действие BMI вариантов WCE15 и WCE16
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36m
Очищающее действие BMI вариантов библиотек WCE20 и WCE21
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36m или 36n
Очищающее действие BMI вариантов библиотек NHJ8
PI = Эффективность
PI > или = 1,3 равно +++; PI от 1,29 до 1,2 = ++; PI от 1,19 до 1,0 = + в моющем средстве 36f
Очищающее действие BMI вариантов библиотек NHJ8, NHJ9, NHJ14
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36c
Очищающее действие BMI вариантов библиотеки NHJ9
PI = Эффективность
PI > или = 1,3 равно +++; PI от 1,29 до 1,2 = ++; PI от 1,19 до 1,0 = + для моющего средства 36f
Очищающее действие BMI вариантов NHJ11
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36a или 36c
Очищающее действие BMI вариантов NHJ12
PI = Эффективность
PI > или = 1,3 равно +++; PI от 1,29 до 1,2 = ++; PI от 1,19 до 1,0 = + в моющем средстве 36a
Очищающее действие BMI вариантов библиотек NHJ15
PI = Эффективность
PI > или = 1,3 равно +++; PI от 1,29 до 1,2 = ++; PI от 1,19 до 1,0 = + в моющем средстве 36a
Очищающее действие BMI вариантов библиотек NHJ16
PI = Эффективность
PI > или = 1,3 равно +++; PI от 1,29 до 1,2 = ++; PI от 1,19 до 1,0 = + в моющем средстве 36a
Очищающее действие BMI вариантов библиотек NHJ15 и NHJ16
PI = Эффективность
PI > или = 1,3 равно +++; PI от 1,29 до 1,2 = ++; PI от 1,19 до 1,0 = + в моющем средстве 36a, 36d или 36f
ПРИМЕР 13
Построение дополнительных библиотек и вариантов GG36
Данный пример описывает очищение в холодной воде у дополнительных вариантов и библиотек GG36, построенных в B. subtilis. Большинство ДНК-библиотек были синтезированы в DNA2.0, Inc., с применением плазмиды экспрессии pHPLT-GG36 B. subtilis. Продукты реакции сшивания построенных библиотек трансформировали в штамм B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) после амплификации ДНК с помощью амплификации по типу катящегося кольца, как описано в Примере 4. Библиотека и варианты WCE9 и NHJ10 были созданы с помощью ПЦР с удлинением или мутагенезом QuickChange (см. Пример 4 для описания способов). Библиотека и варианты WCE9 и NHJ10 были также созданы с применением плазмиды экспрессии pHPLT-GG36 B. subtilis. Варианты были экспрессированы в клетках B. subtilis (генотип: ∆aprE, ∆nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo), как описано в Примере 1, и дополнительно охарактеризованы с помощью пробы микрообразцов ткани BMI для исследования очищающего действия, как описано в Примере 1. В следующих таблицах моющие композиции (“Det.”) соответствуют вышеуказанным Таблице 1-2. Также, как указывалось, аминокислотное положение перечислено в соответствии с нумерацией BPN'.
Очищающее действие BMI вариантов WCE5
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36k или 36l
Очищающее действие BMI вариантов WCE9
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36j, 36d или 36e
Очищающее действие BMI вариантов WCE15
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве 36m
Очищающее действие BMI вариантов библиотек NHJ14
PI = Эффективность
PI > или = 1,5 равно +++; PI от 1,49 до 1,3 = ++; PI от 1,29 до 1,0 = + в моющем средстве Примера 36c
Очищающее действие BMI вариантов NHJ10
PI = Эффективность
PI > или = 1,3 равно +++; PI от 1,29 до 1,2 = ++; PI от 1,19 до 1,0 = + в моющем средстве 36a
Очищающее действие BMI вариантов библиотеки NHJ14
PI = Эффективность
PI > или = 1,3 равно +++; PI от 1,29 до 1,2 = ++; PI от 1,19 до 1,0 = + в моющем средстве 36f
ПРИМЕР 14
Гранулированные и/или таблетированные композиции для белья
Данный пример предоставляет различные составы для гранулированных и таблетированных моющих средств для белья. Следующие композиции для белья настоящего изобретения, которые могут быть в виде гранул или таблеток, представлены ниже. В каждом из этих составов по меньшей мере один вариант протеазы, представленный в настоящем изобретении, включен в концентрации от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 массовых процентов. В некоторых других вариантах осуществления находят применение другие концентрации, что определяется специалистом, занимающимся составлением, исходя из их потребностей.
Гранулированные и/или таблетированные композиции для белья
ПРИМЕР 15
Таблетированные моющие композиции
Данный пример предоставляет различные таблетированные моющие составы. Следующие таблетированные моющие композиции настоящего изобретения готовят прессованием гранулированной моющей композиции для мытья посуды под давлением 13 кН/см2 с помощью стандартного 12 головочного ротационного пресса. В каждом из этих составов по меньшей мере один вариант протеазы, представленный в настоящем изобретении, включен в концентрации от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 массовых процентов. В некоторых других вариантах осуществления находят применение другие концентрации, что определяется специалистом, занимающимся составлением, исходя из их потребностей.
Таблетированные моющие композиции
(по выбору)
(по выбору)
pH Примеров 15(I)-15(VII) составляет от приблизительно 10 до приблизительно 11,5; pH 15(VIII) составляет от 8-10. Масса таблетки Примеров 15(I)-15(VIII) составляет от приблизительно 20 грамм до приблизительно 30 грамм.
ПРИМЕР 16
Жидкие моющие композиции для белья
В данном примере представлены различные составы для жидких моющих композиций для белья. Следующие жидкие моющие композиции для белья настоящего изобретения готовят, как показано ниже. В каждом из этих составов по меньшей мере один вариант протеазы, представленный в настоящем изобретении, включен в концентрации от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 массовых процентов. В некоторых других вариантах осуществления находят применение другие концентрации, что определяется специалистом, занимающимся составлением, исходя из их потребностей.
Жидкие моющие композиции для белья
#1: Добавить 1N водный раствор HCl для доведения рН в чистом виде формулы в диапазоне от приблизительно 3 до приблизительно 5.
pH вышеприведенных Примеров 16(I)-(II) составляет от приблизительно 5 до приблизительно 7, и у 16(III)-(V) составляет от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,5.
Жидкие моющие средства для белья
ПРИМЕР 17
Жидкие моющие композиции для ручного мытья посуды
В данном примере представлены различные жидкие моющие составы для ручного мытья посуды. Следующие жидкие моющие композиции для ручного мытья посуды настоящего изобретения представлены ниже. В каждом из этих составов по меньшей мере один вариант протеазы, представленный в настоящем изобретении, включен в концентрации от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 массовых процентов. В некоторых других вариантах осуществления находят применение другие концентрации, что определяется специалистом, занимающимся составлением, исходя из их потребностей.
Жидкие моющие композиции для ручного мытья посуды
pH Примера 17(I)-(VI) составляет от приблизительно 8 до приблизительно 11.
ПРИМЕР 18
Жидкие моющие композиции для автоматического мытья посуды
В данном примере представлены разнообразные жидкие моющие составы для автоматического мытья посуды. Следующие жидкие моющие композиции для ручного мытья посуды настоящего изобретения представлены ниже. В каждом из этих составов по меньшей мере один вариант протеазы, представленный в настоящем изобретении, включен в концентрации от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 массовых процентов. В некоторых других вариантах осуществления находят применение другие концентрации, что определяется специалистом, занимающимся составлением, исходя из их потребностей.
Жидкие моющие композиции для автоматического мытья посуды
ПРИМЕР 19
Моющие средства высокой плотности для мытья посуды
Данный пример предоставляет различные составы для моющих средств высокой плотности для мытья посуды. Следующие плотные моющие средства высокой плотности для мытья посуды настоящего изобретения приведены ниже. В каждом из этих составов по меньшей мере один вариант протеазы, представленный в настоящем изобретении, включен в концентрации от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 массовых процентов. В некоторых других вариантах осуществления находят применение другие концентрации, что определяется специалистом, занимающимся составлением, исходя из их потребностей.
Моющие средства высокой плотности для мытья посуды
pH Примера 19(I)-(VI) составляет от приблизительно 9,6 до приблизительно 11,3.
ПРИМЕР 20
Жидкие моющие средства для очищения твердых поверхностей
Данный пример предоставляет различные составы для жидких моющих средств для очищения твердых поверхностей. Следующие композиции жидких моющих средств для очищения твердых поверхностей настоящего изобретения представлены ниже. В каждом из этих составов по меньшей мере один вариант протеазы, представленный в настоящем изобретении, включен в концентрации от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 массовых процентов. В некоторых других вариантах осуществления находят применение другие концентрации, что определяется специалистом, занимающимся составлением, исходя из их потребностей.
Жидкие моющие средства для очищения твердых поверхностей
pH из Примера 20(I)-(VII) составляет от приблизительно 7,4 до приблизительно 9,5.
ПРИМЕР 21
Функциональные тесты для автоматического мытья посуды
В данном примере описаны способы, применяемые для определения моющего действия вариантов протеазы с помощью некоторых коммерчески доступных моющих средств для мытья посуды. Данные варианты протеазы тестируют в различных условиях. Данные моющие средства коммерчески доступны от WFK и называются по обозначениям, представленным ниже. Протоколы для каждого из типов грязи (рубленое мясо, яичный желток и яичный желток с молоком) представлены ниже. Перед тем, как нанести отдельные типы грязи для тестирования посуды, посуду необходимо тщательно озолить. Это крайне необходимо, поскольку остатки некоторых стойких загрязнений могут все еще остаться на посуде от предыдущих тестов. Новую посуду также подвергали тщательному трехкратному мытью перед применением первый раз в тесте.
Моющие тесты, как правило, выполняют в автоматической посудомоечной машине (например, Miele: G690SC), укомплектованной грязной посудой и листами нержавеющей стали, как описано выше. Применяют заданное количество моющего средства, как указано ниже в таблицах результатов. В некоторых экспериментах тестируемые температуры составляют 45°C, 55°C и 65°C. В некоторых экспериментах жесткость воды составляет 9° или 21° GH (Немецкая жесткость) (374 ppm Ca).
Как указано выше, после мытья, тарелки, загрязненные мясным фаршем или макаронами/соусом/мясом/сыром, визуально оценивают с помощью фотошкалы для оценки от 0 до 10, где “0” обозначает абсолютно грязную и “10” обозначает чистую тарелку. Эти значения соответствуют способности удалять загрязнение или грязь (SR) у ферментсодержащего моющего средства.
Промытые тарелки из нержавеющей стали, загрязненные яичным желтком и/или яичным желтком с молоком (анализируют гравиметрически для определения количества остаточной грязи после мытья.
Некоторые иллюстративные моющие средства представлены ниже.
Бесфосфатное моющее средство IEC-60436 WFK тип B
(pH=10,4 в 3 г/л)
Фосфатсодержащее моющее средство:IEC-60436 WFK тип C
(pH=10,5 в 3 г/л))
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Даниско ЮЭс Инк.
Компания Проктэр энд Гэмбл
Алексеев, Виктор Юриевич
Амин, Нилам С.
Августин, Кэтрин
Каскао-Перейра, Луис Густаво
Колье, Кэтрин Д.
Эстелль, Давид А.
Келлис, Джеймс Т. мл.
Поулосе, Айроокаран Дж.
Саутер, Филипп Франк
Уорд, Глен Стивен
Яо Цзянь
<120> Композиции и способы включающие варианты сериновых протеаз
<130> 31528WO-2
<140> PCT/US2011/035389
<141> 2011-05-05
<150> US 61/332,151
<151> 2010-05-06
<150> US 61/332,006
<151> 2010-05-06
<150> US 61/392,364
<151> 2010-10-12
<150> US 61/392,188
<151> 2010-10-12
<160> 82
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 275
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 1
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210> 2
<211> 269
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus lentus
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 3
<211> 1143
<212> ДНК
<213> Bacillus lentus
<400> 3
gtgagaagca aaaaattgtg gatcgtcgcg tcgaccgcac tactcatttc tgttgctttc 60
agttcatcga tcgcatcggc tgctgaagaa gcaaaagaaa aatatttaat tggctttaat 120
gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa caagtagagg caaatgacga ggtcgccatt 180
ctctctgagg aagaggaagt cgaaattgaa ttgcttcatg aatttgaaac gattcctgtt 240
ttatccgttg agttaagccc agaagatgtg gacgcgcttg agctcgatcc agcgatttct 300
tatattgaag aggatgcaga agtaacgaca atggcgcaat cagtgccatg gggaattagc 360
cgtgtgcaag ccccagctgc ccataaccgt ggattgacag gttctggtgt aaaagttgct 420
gtcctcgata caggtatttc cactcatcca gacttaaata ttcgtggtgg cgctagcttt 480
gtaccagggg aaccatccac tcaagatggg aatgggcatg gcacgcatgt ggccgggacg 540
attgctgctt taaacaattc gattggcgtt cttggcgtag cgccgagcgc ggaactatac 600
gctgttaaag tattaggggc gagcggttca ggttcggtca gctcgattgc ccaaggattg 660
gaatgggcag ggaacaatgg catgcacgtt gctaatttga gtttaggaag cccttcgcca 720
agtgccacac ttgagcaagc tgttaatagc gcgacttcta gaggcgttct tgttgtagcg 780
gcatctggaa attcaggtgc aggctcaatc agctatccgg cccgttatgc gaacgcaatg 840
gcagtcggag ctactgacca aaacaacaac cgcgccagct tttcacagta tggcgcaggg 900
cttgacattg tcgcaccagg tgtaaacgtg cagagcacat acccaggttc aacgtatgcc 960
agcttaaacg gtacatcgat ggctactcct catgttgcag gtgcagcagc ccttgttaaa 1020
caaaagaacc catcttggtc caatgtacaa atccgcaatc atctaaagaa tacggcaacg 1080
agcttaggaa gcacgaactt gtatggaagc ggacttgtca atgcagaagc tgcaactcgt 1140
taa 1143
<210> 4
<211> 380
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus lentus
<400> 4
Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys
20 25 30
Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe
35 40 45
Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu
50 55 60
Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val
65 70 75 80
Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp
85 90 95
Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala
100 105 110
Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His
115 120 125
Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr
130 135 140
Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe
145 150 155 160
Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His
165 170 175
Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly
180 185 190
Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly
210 215 220
Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro
225 230 235 240
Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val
245 250 255
Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr
260 265 270
Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn
275 280 285
Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val
290 295 300
Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala
305 310 315 320
Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala
325 330 335
Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg
340 345 350
Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr
355 360 365
Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
370 375 380
<210> 5
<211> 1143
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический вариант GG36-9
<400> 5
gtgagaagca aaaaattgtg gatcgtcgcg tcgaccgcac tactcatttc tgttgctttt 60
agttcatcga tcgcatcggc tgctgaagaa gcaaaagaaa aatatttaat tggctttaat 120
gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa caagtagagg caaatgacga ggtcgccatt 180
ctctctgagg aagaggaagt cgaaattgaa ttgcttcatg aatttgaaac gattcctgtt 240
ttatccgttg agttaagccc agaagatgtg gacgcgcttg aactcgatcc agcgatttct 300
tatattgaag aggatgcaga agtaacgaca atggcgcaat cagtgccatg gggaattagc 360
cgtgtgcaag ccccggctgc ccataaccgt ggattgacag gttctggtgt aaaagttgct 420
gtcctcgata caggtatttc cactcatcca gacttaaata ttcgtggtgg cgctagcttt 480
gtaccagggg aaccatccac tcaagatggg aatgggcatg gcacgcatgt ggccgggacg 540
attgctgctc taaacaattc gattggcgta cttggcgtag cgccgagcgc ggaactatac 600
gctgttaaag tattaggggc gagcggtggg ggcgccatca gctcgattgc ccaaggattg 660
gaatgggcag ggaacaatgg catgcacgtt gctaatttga gtttaggaag cccttcgcca 720
agtgccacac ttgagcaagc tgttaatagc gcgacttcta ggggcgttct tgttgtagcg 780
gcatctggaa attcgggtgc agactcaatc agctatccgg cccgttatgc gaacgcaatg 840
gcagtcggag ctactgacca aaacaacaac cgcgccagct tttcacagta tggcgcaggg 900
cttgacatcg tcgcaccagg tgtaaacgtg cagagcacat acccaggttc aacgtatgcc 960
agcttaaacg gtacatcgat ggctactcct catgttgcag gtgcagcagt ccttgttaaa 1020
cataagaacc catcttggtc caatgtacga atccgcgatc atctaaagaa aacggcaacg 1080
agcttaggaa gcacgaactt gtatggaagc ggacttgtca atgccgaagc tgcaactcgt 1140
taa 1143
<210> 6
<211> 380
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический вариант GG36-9
<400> 6
Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys
20 25 30
Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe
35 40 45
Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu
50 55 60
Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val
65 70 75 80
Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp
85 90 95
Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala
100 105 110
Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His
115 120 125
Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr
130 135 140
Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe
145 150 155 160
Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His
165 170 175
Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly
180 185 190
Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly
210 215 220
Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro
225 230 235 240
Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val
245 250 255
Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Asp Ser Ile Ser Tyr
260 265 270
Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn
275 280 285
Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val
290 295 300
Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala
305 310 315 320
Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala
325 330 335
Val Leu Val Lys His Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Arg Ile Arg
340 345 350
Asp His Leu Lys Lys Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr
355 360 365
Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
370 375 380
<210> 7
<211> 1140
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический вариант GG36-7
<400> 7
gtgagaagca aaaaattgtg gatcgtcgcg tcgaccgcac tactcatttc tgttgctttt 60
agttcatcga tcgcatcggc tgctgaagaa gcaaaagaaa aatatttaat tggctttaat 120
gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa caagtagagg caaatgacga ggtcgccatt 180
ctctctgagg aagaggaagt cgaaattgaa ttgcttcatg aatttgaaac gattcctgtt 240
ttatccgttg agttaagccc agaagatgtg gacgcgcttg aactcgatcc agcgatttct 300
tatattgaag aggatgcaga agtaacgaca atggcgcaat cagtgccatg gggaattagc 360
cgtgtgcaag ccccggctgc ccataaccgt ggattgacag gttctggtgt aaaagttgct 420
gtcctcgata caggtatttc cactcatcca gacttaaata ttcgtggtgg cgctagcttt 480
gtaccagggg aaccatccac tcaagatggg aatgggcatg gcacgcatgt ggccgggacg 540
attgctgctc taaacaattc gattggcgta cttggcgtag cgccgagcgc ggaactatac 600
gctgttaaag tattaggggc gagcggtggg ggcgccatca gctcgattgc ccaaggattg 660
gaatgggcag ggaacaatgg catgcacgtt gctaatttga gtttaggaag cccttcgcca 720
agtgccacac ttgagcaagc tgttaatagc gcgacttcta ggggcgttct tgttgtagcg 780
gcatctggaa attcgggtgc agactcaatc agctatccgg cccgttatgc gaacgcaatg 840
gcagtcggag ctactgacca aaacaacaac cgcgccagct tttcacagta tggcgcaggg 900
cttgacatcg tcgcaccagg tgtaaacgtg cagagcacat acccaggttc aacgtatgcc 960
agcttaaacg gtacatcgat ggctactcct catgttgcag gtgcagcagt ccttgttaaa 1020
caaaagaacc catcttggtc caatgtacga atccgcgatc atctaaagaa tacggcaacg 1080
agcttaggaa gcacgaactt gtatggaagc ggacttgtca atgccgaagc tgcaactcgt 1140
<210> 8
<211> 380
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический вариант GG36-7
<400> 8
Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys
20 25 30
Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe
35 40 45
Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu
50 55 60
Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val
65 70 75 80
Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp
85 90 95
Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala
100 105 110
Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His
115 120 125
Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr
130 135 140
Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe
145 150 155 160
Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His
165 170 175
Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly
180 185 190
Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly
210 215 220
Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro
225 230 235 240
Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val
245 250 255
Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Asp Ser Ile Ser Tyr
260 265 270
Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn
275 280 285
Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val
290 295 300
Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala
305 310 315 320
Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala
325 330 335
Val Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Arg Ile Arg
340 345 350
Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr
355 360 365
Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
370 375 380
<210> 9
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 9
cgcgcttgag ctcgatccag cgatttc 27
<210> 10
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 10
gtctccaagc tttaacgagt tgcag 25
<210> 11
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 11
gcaattcaga tcttccttca ggttatgacc 30
<210> 12
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 12
gcatcgaaga tctgattgct taactgcttc 30
<210> 13
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 13
aaagtattag gggcgagcgg tgcaggtgga cttagctcga ttgcccaagg attg 54
<210> 14
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 14
catctggaaa ttcaggtgca gaatcaatca gctatccggc ccgtta 46
<210> 15
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 15
ctgcccataa ccgtggattg gcaggttctg gtgtaaaagt tgctg 45
<210> 16
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 16
aggtgtaaac gtgcagagca cagaaccagg ttcaacgtat gccag 45
<210> 17
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 17
gaagcggact tgtcaatgca ttcgctgcaa ctcgttaaag cttg 44
<210> 18
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 18
aaagtattag gggcgagcgg tgcaggttcg gtcagctcga ttgcccaa 48
<210> 19
<211> 47
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 19
tattaggggc gagcggttca ggtggagtca gctcgattgc ccaagga 47
<210> 20
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 20
gtcagctcga ttgcccaagg agtagaatgg gcagggaaca atggca 46
<210> 21
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 21
cgttgctaat ttgagtttag gaaacccttc gccaagtgcc acacttga 48
<210> 22
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 22
gaaccatcca ctcaagatgg ggaagggcat ggcacgcatg tg 42
<210> 23
<211> 47
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 23
accaaaacaa caaccgcgcc gacttttcac agtatggcgc agggctt 47
<210> 24
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 24
catatgagtt atgcagtttg tag 23
<210> 25
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 25
tgtttttctt ggaattgtgc tgt 23
<210> 26
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 26
cagtttgtag aatgcaaaaa gtg 23
<210> 27
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 27
gacaaggtaa aggataaaac agc 23
<210> 28
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 28
cataaccgtg gattggcagg ttctggtgta aaagttgctg 40
<210> 29
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 29
acttttacac cagaacctgc caatccacgg ttatgggcag 40
<210> 30
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 30
cactcaagat ggggaagggc atggcacgca tgtgg 35
<210> 31
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 31
atgcgtgcca tgcccttccc catcttgagt ggatggttc 39
<210> 32
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 32
gcgagcggtt caggtggagt cagctcgatt gcccaagga 39
<210> 33
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 33
tgggcaatcg agctgactcc acctgaaccg ctcgccccta 40
<210> 34
<211> 52
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 34
gtggagtcag ctcgattgcc caaggagtag aatgggcagg gaacaatggc at 52
<210> 35
<211> 52
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 35
cattctactc cttgggcaat cgagctgact ccacctgaac cgctcgcccc ta 52
<210> 36
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 36
gcgagcggtg gaggtgcgat cagctcgatt gcccaaggat tg 42
<210> 37
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 37
cttgggcaat cgagctgatc gcacctccac cgctcgcccc taatacttta 50
<210> 38
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 38
gcgagcggtg caggtggact tagctcgatt gcccaaggat tg 42
<210> 39
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 39
cttgggcaat cgagctaagt ccacctgcac cgctcgcccc taatacttta 50
<210> 40
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 40
tattaggggc gagcggtgca ggttcggtca gctcgattgc 40
<210> 41
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 41
atcgagctga ccgaacctgc accgctcgcc cctaatactt ta 42
<210> 42
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 42
ctaatttgag tttaggaaac ccttcgccaa gtgccacact t 41
<210> 43
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 43
gcacttggcg aagggtttcc taaactcaaa ttagcaacgt g 41
<210> 44
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 44
gaaattcagg tgcagactca atcagctatc cggcccgtt 39
<210> 45
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 45
ggatagctga ttgagtctgc acctgaattt ccagatgc 38
<210> 46
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 46
gaaattcagg tgcagaatca atcagctatc cggcccgtt 39
<210> 47
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 47
ggatagctga ttgattctgc acctgaattt ccagatgc 38
<210> 48
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 48
aacgtgcaga gcacagaacc aggttcaacg tatgccagct t 41
<210> 49
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 49
catacgttga acctggttct gtgctctgca cgtttacacc 40
<210> 50
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 50
tcgattgccc aaggagtaga atgggcaggg aacaatggca t 41
<210> 51
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 51
cattgttccc tgcccattct actccttggg caatcgagct gac 43
<210> 52
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> искусственный субстрат
<400> 52
Ala Ala Pro Phe
1
<210> 53
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 53
gttaaagtat taggggcgag cggtagcggc gccatcagct cgattgcc 48
<210> 54
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 54
ggcaatcgag ctgatggcgc cgctaccgct cgcccctaat actttaac 48
<210> 55
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 55
gtattagggg cgagcggtgg gggcagcatc agctcgattg cccaaggatt g 51
<210> 56
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 56
caatccttgg gcaatcgagc tgatgctgcc cccaccgctc gcccctaata c 51
<210> 57
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 57
gggcgagcgg tgggggcgcc gttagctcga ttgcccaagg attg 44
<210> 58
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 58
caatccttgg gcaatcgagc taacggcgcc cccaccgctc gccc 44
<210> 59
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 59
gcatctggaa attcgggtgc aggctcaatc agctatccgg cccgt 45
<210> 60
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 60
acgggccgga tagctgattg agcctgcacc cgaatttcca gatgc 45
<210> 61
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 61
ctcatgttgc aggtgcagca gcacttgtta aacataagaa ccc 43
<210> 62
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 62
gggttcttat gtttaacaag tgctgctgca cctgcaacat gag 43
<210> 63
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 63
gtgcagcagt ccttgttaaa caaaagaacc catcttggtc caat 44
<210> 64
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 64
attggaccaa gatgggttct tttgtttaac aaggactgct gcac 44
<210> 65
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 65
ccatcttggt ccaatgtaca aatccgcgat catctaaaga aaac 44
<210> 66
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 66
gttttcttta gatgatcgcg gatttgtaca ttggaccaag atgg 44
<210> 67
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 67
ggtccaatgt acgaatccgc aatcatctaa agaaaacggc aac 43
<210> 68
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 68
gttgccgttt tctttagatg attgcggatt cgtacattgg acc 43
<210> 69
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 69
gaatccgcga tcatctaaag aatacggcaa cgagcttagg aag 43
<210> 70
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 70
cttcctaagc tcgttgccgt attctttaga tgatcgcgga ttc 43
<210> 71
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 71
gtacgaatcc gcgatagact aaagaatacg gcaacgag 38
<210> 72
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 72
gcggacttgt caatgccttt gctgcaactc gttaaagctt acat 44
<210> 73
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 73
ggaaattcgg gtgcagaatc aatcagctat ccggcccgtt a 41
<210> 74
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 74
ctggaaattc gggtgaagac tcaatcagct atccggcc 38
<210> 75
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 75
cggcatctgg aaattcgggt gaaggctcaa tcagctatcc ggcccgttat g 51
<210> 76
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 76
cataaccgtg gattggcagg ttctggtgta aaagttgctg tc 42
<210> 77
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 77
tccactcaag atggggaagg gcatggcacg catgtggc 38
<210> 78
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 78
cttgttaaac aaaagagacc atcttggtcc aatgtacgaa tc 42
<210> 79
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 79
aatgtacgaa tccgcagaca tctaaagaat acggcaacga gc 42
<210> 80
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 80
cgatcatcta aagaatagag caacgagctt aggaagcacg aac 43
<210> 81
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 81
gtggattgac aggtagaggt gtaaaagttg ctgtcctcga ta 42
<210> 82
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический праймер
<400> 82
acgattgctg ctctagataa ttcgattggc gtacttggcg tag 43
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ТОВАРЫ С ВАРИАНТАМИ ПРОТЕАЗЫ | 2011 |
|
RU2598717C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ВАРИАНТЫ СЕРИНОВОЙ ПРОТЕАЗЫ | 2012 |
|
RU2718648C2 |
| Способы и композиции, содержащие варианты сериновой протеазы | 2012 |
|
RU2663114C2 |
| ВАРИАНТЫ ПРОТЕАЗ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2017 |
|
RU2790443C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ ВАРИАНТОВ ПРОТЕАЗЫ | 2010 |
|
RU2639534C2 |
| ВАРИАНТЫ СУБТИЛАЗ | 2010 |
|
RU2651525C2 |
| ВАРИАНТЫ СУБТИЛАЗЫ И КОДИРУЮЩИЕ ИХ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ | 2015 |
|
RU2710720C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ В СЕБЯ ПРИМЕНЕНИЕ ВАРИАНТНЫХ МИКРОБНЫХ ПРОТЕАЗ | 2009 |
|
RU2575073C2 |
| ПРОТЕАЗЫ ДЛЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2006 |
|
RU2420578C2 |
| ВАРИАНТЫ ПРОТЕАЗЫ И КОДИРУЮЩИЕ ИХ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ | 2014 |
|
RU2670946C9 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен вариант сериновой протеазы субтилизина, аминокислотная последовательность которого включает комбинацию аминокислотных замен по сравнению с родительской протеазой субтилизином GG36 Bacillus lentus. Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный вариант субтилизина, и к способу получения варианта субтилизина. Изобретение обеспечивает улучшенное очищающее действие предложенного варианта субтилизина по сравнению с исходной протеазой. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 51 табл., 21 пр.
1. Выделенный вариант субтилизина, где указанный вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую активностью субтилизина, и включает аминокислотную последовательность, включающую комбинацию аминокислотных замен, выбранную из: H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N062E-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S101G-G102A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F и T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, где указанный вариант представляет собой вариант родительской протеазы – протеазы субтилизин GG36 Bacillus lentus, включающей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, и где аминокислотные положения указанного варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN’ Bacillus amyloliquefaciens, показанной в SEQ ID NO:1.
2. Вариант субтилизина по п.1, где указанный вариант субтилизина обладает одной или более из следующих характеристик: a) эффективность по способу тестирования 2 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) эффективность по способу тестирования 3 по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5; c) эффективность по способу тестирования 4 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) эффективность по способу тестирования 6 по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8 или даже от 1,0 до приблизительно 5.
3. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует вариант субтилизина по п.1 или 2.
4. Способ получения по меньшей мере одного варианта субтилизина от субтилизина Bacillus, включающий:
a) трансформацию клетки-хозяина вектором экспрессии, включающим по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один вариант субтилизина по п.1 или 2, с получением трансформированной клетки-хозяина; и
b) культивирование указанной трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для получения по меньшей мере одного варианта субтилизина, с получением по меньшей мере одного варианта субтилизина.
| WO 9100345 A1, 10.01.1991 | |||
| WO 9920771 A2, 29.04.1999 | |||
| US 2008274938 A1, 06.11.2008 | |||
| МОДИФИЦИРОВАННЫЙ СУБТИЛИЗИН, ДНК, КОДИРУЮЩАЯ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ СУБТИЛИЗИН, ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИ, КОДИРУЮЩИЙ ДНК, И ШТАММ КУЛЬТУРЫ КЛЕТКИ ХОЗЯИНА | 1994 |
|
RU2136756C1 |
| ВАРИАНТ СУБТИЛИЗИНА (ВАРИАНТЫ), КОДИРУЮЩАЯ ЕГО ДНК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР, ОЧИЩАЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ, КОРМ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ, КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ТКАНИ | 1998 |
|
RU2252958C2 |
| PHILIP N | |||
| BRYAN, Protein engineering of subtilisin, Biochimica et Biophysica Acta, 2000, Vol.1543, Issue 2, pp.203-222. | |||
