Способ моделирования тяжелой черепно-мозговой травмы Российский патент 2018 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано для моделирования на лабораторных животных тяжелой черепно-мозговой травмы с грубыми стойкими нарушениями неврологических и когнитивных функций для мониторинга и разработки способов восстановления функций головного мозга в посттравматическом периоде.

Проблема лечения тяжелой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) по-прежнему остается высоко актуальной и социально значимой, так как в большинстве случаев такая травма приводит к инвалидизации, особенно среди лиц молодого возраста. Как известно, степень неврологического и когнитивного дефицита при черепно-мозговой травме определяется двумя основными факторами: первичным механическим повреждением, включающим в себя гибель клеток и некроз тканей независимо от биологических факторов, и вторичным воздействием, связанным с активацией воспаления, ишемией ткани, апоптозом клеток. Эти вторичные поражения представляют собой основную мишень для развития новых терапевтических подходов.

Для изучения механизмов черепно-мозговой травмы и способов восстановления функций головного мозга используются различные модели на животных. Большинство исследований нейробиологии и нейрохимии последствий острой черепно-мозговой травмы основаны на инвазивных способах ее моделирования: трепанации костей черепа животного, травмы коры головного мозга путем ее размозжения или компрессии, например, с помощью жесткого ударника («контролируемое корковое повреждение»), свободного падения груза, жидкостной перкуссии.

Известны способы формирования очагового повреждения головного мозга у лабораторного животного. Наиболее часто применяемые способы - это «жидкостно-перкуссионная травма мозга», модель «контролируемого коркового повреждения» (O'Connor W.T., Smyth A., Gilchrist M.D. (2011). Animal models of traumatic brain injury: a critical evaluation. Pharmacol. Ther. 130, 106-113). Способы воспроизводят выраженное повреждение головного мозга, нейровоспаление и нарушение поведенческих функций, включая когнитивные расстройства.

Однако вышеперечисленные способы имеют сходные недостатки ввиде быстрого спонтанного восстановления функций головного мозга (в течение 2 недель), кроме того, имеются технические сложности в моделировании травмы.

Наиболее близким по техническому выполнению, достигаемому техническому результату и выбранный за прототип предлагаемого изобретения, выбран известный способ моделирования черепно-мозговой травмы, включающий однократное нанесение дозированного механического воздействия на лобно-теменную область (РФ патент №2486602, МПК G09B 23/28, опубл. от 27.06.2013 г).

Известный способ осуществляют следующим образом. Выполняют однократное ударное воздействие на интактную твердую мозговую оболочку через трепанационное окно в лобно-теменно-височной области с энергией удара не менее 0,06 Дж и не более 0,09 Дж.

Известный способ обеспечивает возможность создания контузионного очага в двигательной зоне коры головного мозга животного, позволяющего вызвать стойкий неврологический дефицит, приводит к разрушению нейронов коры головного мозга, формированию грубого глиального рубца и к развитию стойкого и длительного неврологического дефицита.

Однако известный способ имеет высокую степень смертности лабораторных животных, а также быстрое спонтанное восстановление функций мозга (4-5 недель).

Техническим результатом предлагаемого способа является создание условий, максимально воспроизводящих клиническую картину тяжелого очагового повреждения головного мозга без гибели лабораторного животного.

Технический результат достигается тем, что в известном способе моделирования тяжелой черепно-мозговой травмы, включающем однократное нанесение дозированного механического воздействия на лобно-теменную область, ударное воздействие осуществляют на интактную твердую мозговую оболочку через трепанационное окно в лобно-теменной области, путем свободного падения груза массой 4 г с высоты 80 см, при этом диаметр ударной части соответствует диаметру трепанационного окна.

Предлагаемый способ отвечает критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источники научно-технической и патентной информации, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.

Технический результат предлагаемого способа заключается в обеспечении создания условий для формирования контузионного очага в сенсомоторной зоне коры головного мозга животного, позволяющего изучать, помимо локальных, травматические изменения, которые сопровождаются вторичной гибелью нервных клеток в отдаленных отделах мозга, чувствительных к травме, таких как гиппокамп, зубчатая извилина, зрительный бугор, а также оценивать грубые двигательные нарушения, изменения тонкой координации движений, дефицит когнитивных функций. Предлагаемый способ позволяет исключить самопроизвольное быстрое восстановление функций (до 5 месяцев), что дает возможность проследить и оценить эффективность терапии, в том числе клеточной, направленной на восстановление функций головного мозга при черепно-мозговой травме. При скорости падения груза массой 4 грамма на заданную область с высоты 80 см в подлежащем мозговом веществе возникают повреждения в виде разрыва твердой мозговой оболочки, образования очагов геморрагического ушиба или размозжения мозгового вещества, характерных для тяжелой черепно-мозговой травмы. Возникающее в данных корковых представительствах тяжелое очаговое повреждение приводит к разрушению нейронов коры головного мозга, формированию грубого глиального рубца и к развитию стойкого и длительного дефицита неврологических и когнитивных функций. Ударное воздействие груза с массой более 4 грамм с высоты более 80 см приводит к гибели животного либо при нанесении травмы, либо в течение 48 часов после нее. При энергии ударного воздействия менее 4 грамм с высоты менее 80 см выраженных когнитивных и неврологических расстройств не наблюдается. В некоторых случаях развивается легкий геми- или монопарез, который разрешается в течение 7 суток.

Черепно-мозговая травма моделировалась в группе из 70-ти 8-10 недельных аутбренных мышей самцов линии C57BL/6 с массой тела 20-22 г.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Наркотизированное животное (1,5% изофлурана) жестко фиксируют в стереотаксической установке для мышей «Narishige» (Япония) для того, чтобы свести к минимуму вариабельность травматического повреждения и последующего нарушения функций из-за произвольных движений животного. Стереотаксическая установка совмещена с установкой для нанесения открытой фокальной черепно-мозговой травмы, которая представляет собой стальную стойку, закрепленную на металлической платформе. К стойке с помощью системы шарниров прикреплены два металлических стержня, расположенные в параллельных плоскостях и служащие для фиксации стерильной полипропиленовой трубы с внутренним диаметром 4 мм. Стерильная полипропиленовая труба закреплена с помощью системы шарниров таким образом, что ее высота и угол относительно нижней платформы и металлической стойки могли меняться. Через данную полипропиленовую трубу сбрасывают груз для нанесения фокального удара по заданной области головы.

Мышь дышит самостоятельно, трахея не интубирована. Хирургическую стадию наркоза определяют по отсутствию у животного роговичного рефлекса. Голову животного прижимают к стальной пластине для предотвращения перелома челюсти и достижения горизонтального расположения свода черепа к торцевому участку груза, а также снижения рассеивания энергии удара. Затем на коже головы, свободной от шерсти и обработанной асептическим раствором, делают срединный продольный разрез (1 см) и производят трепанацию фрезой костей черепа (bregma 2 мм, 2 мм латеральнее от срединной линии). Твердую мозговую оболочку оставляют неповрежденной. Груз, представляющий собой стальной цилиндр весом 4 г, поднимают на высоту 80 см, затем сбрасывают, тем самым нанося удар по области трепанационного окна (диаметр ударной части соответствует трепанационному окну 3 мм). После нанесения травмы кожу животных плотно ушивают хирургической нитью (0,2 мм), шов обрабатывают антисептическим раствором. В течение эксперимента температуру животных поддерживают на уровне 36,5-37,5°С с помощью электрической грелки. После моделирования ЧМТ мышей оставляют для восстановления от наркоза, затем возвращают в жилые клетки. Животным обеспечивают послеоперационный уход и свободный доступ к воде и пище.

Сформировавшиеся когнитивные и неврологические нарушения сохраняются в течение 5 месяцев.

Для объективизации данных и динамики когнитивных нарушений используют тесты распознавания нового объекта (Levy A, Bercovich-Kinori A, Alexandrovich AG, Tsenter J, Trembovler V, Lund FE, Shohami E, Stein R, Mayo L (2009) CD38 facilitates recovery from traumatic brain injury. J Neurotrauma 6 (9): 1521-33; Huang TN, Chuang HC, Chou WH, Chen CY, Wang HF, Chou SJ, Hsueh YP (2014) Tbr1 haploinsufficiency impairs amygdalar axonal projections and results in cognitive abnormality. Nat Neurosci 17 (2): 240-247) и условного рефлекса пассивного избегания (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа, 1991, 400 с.). Для оценки динамики неврологических расстройств очаговый неврологический дефицит оценивают по модифицированной для мышей шкале оценки выраженности неврологического дефицита (Beni-Adani L, Gozes I, Cohen Y, Assaf Y, Steingart RA, Brenneman DE, Eizenberg O, Trembolver V, Shohami E (2001) A peptide derived from activity-dependent neuroprotective protein (ADNP) ameliorates injury response in closedhead injury in mice. J Pharmacol Exp Ther 296 (1): 57-63; Beni-Adani L, Eizenberg O, Cohen Y (2000) Correlation between neurological severity score and T2-weighted MRI in head injured mice. Rest. Neurol. Neurosci 16 (3-4): 242), по которой 7-10 баллов расценивается как выраженное повреждение, 4-6 баллов - умеренное повреждение и 1-3 баллов - как легкое. У всех прооперированных животных наблюдаются грубые когнитивные расстройства, восстановления функций кратковременной и долговременной памяти не происходит ни у одного животного в течение 5 месяцев. Восстановление неврологических функций происходит в два этапа. Первая стадия (8-10 баллов) - грубые неврологические изменения в виде глубокого гемипареза на грани с плегией, нарушение двигательных реакций, невозможность выполнения реакций, связанных с поддержанием равновесия и координации движений, сенсорных задач и рефлекторных навыков, длится до 7 суток. На второй стадии (4-6 баллов) в период с 7 суток до 5 месяцев посттравматического периода происходит частичный регресс грубой неврологической симптоматики ввиде умеренного гемипареза и частичного восстановления сенсорных и рефлекторных навыков.

Пример конкретного выполнения дан в виде протокола эксперимента.

Проведена анестезия животного 1,5% изофлурановым наркозом. Дыхание самостоятельное. По отсутствию у животного роговичного рефлекса определена стадия наркоза. Животное фиксировано в стереотаксической установке для мышей «Narishige» (Япония). Голова животного прижата к стальной пластине для предотвращения перелома челюсти и достижения горизонтального расположения свода черепа к торцевому участку груза, а также снижения рассеивания энергии удара. Затем на коже головы, свободной от шерсти и обработанной асептическим раствором, сделан срединный продольный разрез (1 см) и произведена трепанация фрезой костей черепа (bregma 2 мм, 2 мм латеральнее от срединной линии). Твердая мозговая оболочка не повреждена. Груз (масса 4 г), представляющий собой стальной цилиндр, диаметр ударной части 3 мм, поднят на высоту 80 см, нанесен удар по области трепанационного окна.

Травма нанесена однократно. После нанесения травмы в подлежащем мозговом веществе возникли повреждения в виде разрыва твердой мозговой оболочки, видимое тяжелое очаговое повреждение мозга c прогрессирующим его отеком, образование очагов геморрагического ушиба или размозжения мозгового вещества, характерные для тяжелой черепно-мозговой травмы. Кожа животного плотно ушита хирургической нитью (0,2 мм), шов обработан антисептическим раствором. В течение эксперимента температура животного поддерживается на уровне 36,5-37,5°C с помощью электрической грелки. После моделирования черепно-мозговой травмы мышь оставлена для восстановления от наркоза, затем возвращена в клетку с послеоперационным уходом и свободным доступом к воде и пище.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано для моделирования тяжелой черепно-мозговой травмы с грубыми стойкими нарушениями неврологических и когнитивных функций. Для этого осуществляют однократное ударное воздействие свободно падающим грузом на интактную твердую мозговую оболочку через трепанационное окно в лобно-теменной части. При этом в качестве лабораторных животных используют 8-10-недельных аутбренных мышей-самцов линии C57BL/6 с массой тела 20-22 г. Воздействие осуществляют с помощью груза массой 4 г с высоты 80 см. Диаметр ударной части груза соответствует диаметру трепанационного окна. Способ обеспечивает условия моделирования, максимально воспроизводящие клиническую картину тяжелого очагового повреждения головного мозга без гибели лабораторного животного, что необходимо для мониторинга и разработки способов восстановления функций головного мозга в посттравматическом периоде. 1 пр.

Способ моделирования тяжелой черепно-мозговой травмы, включающий однократное ударное воздействие путем свободного падения груза на интактную твердую мозговую оболочку через трепанационное окно в лобно-теменной части лабораторных животных, отличающийся тем, что в качестве лабораторных животных используют 8-10-недельных аутбренных мышей-самцов линии C57BL/6 с массой тела 20-22 г и воздействие осуществляют с помощью груза массой 4 г с высоты 80 см, при этом диаметр ударной части соответствует диаметру трепанационного окна.