Способ нейропротекции головного мозга при моделировании открытой черепно-мозговой травмы Российский патент 2024 года по МПК A61M16/12 G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано при определении клинической эффективности и безопасности применения инертного газа аргона в качестве нейропротектора при открытой черепно-мозговой травме (ЧМТ).

Уровень техники

В настоящее время известны результаты различных медикаментозных воздействий препаратов нейропротекторного действия с целью лечения нарушений неврологических функций у мышей на модели открытой ЧМТ. К ним, в частности, относятся применение ТИМП2 при приготовлении лекарств для профилактики или лечения ЧМТ (CN 116139259), составы и способы лечения повреждений нервной системы (US 2021236584), соединения и композиции для лечения ЧМТ и способы их применения (US 2018296696) и др. Однако во всех этих моделях применяются лекарственные средства, которые требуют парентерального введения, что является инвазивной процедурой и само по себе может сопровождаться нежелательными побочными эффектами для хронического эксперимента. Не менее важно и то, что данные лекарственные средства метаболизируются в организме и элиминируются органами экскреции (печень, почки), что также может сопровождаться побочными эффектами. Инертные же газы поступают в организм через легкие и покидают его тем же путем в неизменном виде, т.е. не образуя метаболитов, требующих элиминации.

В то же время известны результаты ряда исследований, касающихся воздействия дыхательных газовых смесей, содержащих инертный газ аргон, в качестве нейропротекторов при моделировании ЧМТ.

Известен способ применения фармацевтической композиции, содержащей газовую смесь ксенона и аргона, в качестве защитного средства для органов, в частности, в качестве нейропротектора для лечения и/или предотвращения и/или замедления деградации структуры и/или функции клеток органов (в частности, нейронов) у млекопитающих, страдающих от декомпрессии, неонатальной гипоксии-ишемии, инсульта, ЧМТ, остановки сердца, почечной дисфункции, нейрокогнитивных расстройств и др. (WO 2019008015). Данный способ включает ингаляцию газовой смеси, в которой объемная доля ксенона составляет от 5 до 25%, объемная доля аргона составляет от 5 до 25%, и дополнительно содержит газовую добавку для достижения объемной доли 100%. Использование известного способа не дает технических результатов заявляемого способа, поскольку в составе газовой смеси содержится ксенон, который является анестетиком и может затруднять диагностику неврологического статуса у пациентов, перенесших ЧМТ.

К настоящему времени известно несколько примеров использования газовых смесей, содержащих аргон, в которых особое внимание уделяется изучению нейропротектективных свойств аргона. Большинство из них посвящено изучению нейропротективных свойств в различных моделях ишемического повреждения головного мозга (ГМ), таких как, окклюзия средней мозговой артерии, ЧМТ, остановка кровообращения и другие.

Известна работа Grüßer L., Blaumeiser-Debarry R. и др., в которой рассмотрено влияние аргона на последствия вторичного повреждения после ЧМТ Данные исследования включали ингаляцию газовой смеси: аргон 50%, кислород 50% в течение 2-х часов в модели ЧМТ in vitro. По данным исследования аргон уменьшал гибель нейронов в зоне вторичного повреждения. [Grüßer L., Blaumeiser-Debarry R., Krings M., Kremer В., Höllig A., Rossaint R., Coburn M. Argon attenuates the emergence of secondary injury after traumatic brain injury within a 2-hour incubation period compared to desflurane: an in vitro study. Med Gas Res. 2017; 7 (2): 93-100. doi: 10.4103/2045-9912.208512. Erratum in: Med Gas Res. 2017; 7 (3): 155]. Однако у модели in vitro имеется ряд ограничений, связанных с отсутствием комплекса компенсаторных механизмов, присущих всему организму в отличие от модели in vivo.

Наиболее близким к заявляемому способу по совокупности совпадающих существенных признаков является работа Moro F., Fossi F., и др., посвященная определению эффективности острого введения вдыхаемого аргона при ЧМТ у мышей Данные исследования включали ингаляцию газовой смеси: аргон 70%, кислород 30% в течение 24 часов после моделирования ЧМТ у мышей. [Moro F., Fossi F., Magliocca A., Pascente R., Sammali E., Baldini F., Tolomeo D., Micotti E., Citerio G., Stocchetti N., Fumagalli F., Magnoni S., Latini R., Ristagno G., Zanier E.R. Efficacy of acute administration of inhaled argon on traumatic brain injury in mice. Br J Anaesth. 2021; 126 (1): 256-264. doi: 10.1016/j.bja.2020.08.027. Epub 2020 Sep 22]. В результате проведенных экспериментов был получен значимый протективный эффект воздействия аргон-кислородной газовой смеси. По данным исследования аргон ускорял восстановление сенсомоторной функции и улучшал когнитивные и структурные показатели после тяжелой ЧМТ у взрослых мышей.

Однако режим воздействия дыхательной газовой смесью при длительности экспозиции 24 часа, используемый авторами известного способа, является препятствием для использования данной методики в клинической практике, так как пациентам необходимо проводить комплекс лечебно-диагностических мероприятий, что делает невозможным непрерывную ингаляцию в течение такого длительного промежутка времени.

Раскрытие изобретения

Результаты всех выше перечисленных работ говорят о необходимости создания оптимальной модели, в которой возможно максимальное раскрытие нейропротективного эффекта аргона при травматическом повреждении ГМ.

Представляется перспективным изучение средств, уменьшающих степень вторичного повреждения ГМ в посттравматическом периоде, а также подавляющих процессы гибели нейронов в зоне вторичного повреждения после механического воздействия на ГМ.

Целью настоящего исследования являлась оценка влияния 3-кратной 2-часовой ингаляции аргон-кислородной смесью (Ar 70%/О₂ 30%) после моделирования открытой ЧМТ на выраженность неврологического дефицита и степень повреждения ГМ у крыс. В патогенезе вторичного повреждения и гибели нейронов при экзогенном повреждении в отличие от первично ишемического повреждения на первое место выходит ряд молекулярных механизмов, обусловленных прямым воздействием гидродинамического удара как на цитоскелет тела нейрона, так и на цитоскелет аксональных соединений. При непосредственном физическом воздействии на нервную ткань запускается цепь событий, в основе которых лежат молекулярные механизмы, направленные как на запрограммированную гибель (апоптоз), так и защитные механизмы. Результаты данного противостояния зависят от того, каскад каких реакций окажется доминирующим.

В результате ряда исследований установлено, что именно соотношение газов в аргон-кислородной смеси: Ar 70%/О₂ 30%) является наиболее эффективной при повреждениях центральной системы как in vitro, так и in vivo. На основе результатов исследований авторами заявляемого способа было определено, что минимальная длительность ингаляции, при которой наблюдается нейропротективный эффект составляет 2 часа. [Filev, A.D.; Silachev, D.N.; Ryzhkov, LA.; Lapin, K.N.; Babkina, A.S.; Grebenchikov, O.A.; Pisarev, V.M. Effect of Xenon Treatment on Gene Expression in Brain Tissue after Traumatic Brain Injury in Rats. Brain Sci. 2021, 11, 889. https://doi.org/10.3390/brainsci11070889; Antonova, V.V.; Silachev, D.N.; Ryzhkov, I.A.; Lapin, K.N.; Kalabushev, S.N.; Ostrova, I.V.; Varnakova, L.A.; Grebenchikov, O.A. Three-Hour Argon Inhalation Has No Neuroprotective Effect after Open Grebenchikov, O.A.; Pisarev, V.M. Effect of Xenon Treatment on Gene Expression in Brain Tissue after Traumatic Brain Injury in Rats. Brain Sci. 2021, 11, 889. https://doi.org/10.3390/brainsci11070889; Antonova, V.V.; Silachev, D.N.; Ryzhkov, I.A.; Lapin, K.N.; Kalabushev, S.N.; Ostrova, I.V.; Varnakova, L.A.; Grebenchikov, O.A. Three-Hour Argon Inhalation Has No Neuroprotective Effect after Open Traumatic Brain Injury in Rats. Brain Sci 2022, 12, 920. https://doi.org/10.3390/brainsci12070920] На основании патогенеза течения ЧМТ было определено, что для обеспечения нейропротекции в критически важный острейший и острый период повреждения ГМ необходимо проведение 3-кратной ингаляции.

Способ протекции ткани ГМ от вторичного повреждения, вызванного прямым механическим воздействием в зоне контакта с повреждающим объектом, а также вторичным, потенциально обратимым повреждением нейронов ГМ, а также аксональных соединений в близости от первичного очага, которое обусловлено гидродинамическим воздействием ударной волны, заключается в 3-кратной 2-часовой ингаляции аргон-кислородной смесью (Ar 70%/О₂ 30%). При этом 1-е двухчасовое воздействие аргон-кислородной смесью осуществляют через 90 минут после ЧМТ, последующие 2-часовые ингаляции осуществляют через 24 часа после ЧМТ и через 48 часов после ЧМТ.

Данная модель является наиболее приближенной к клинической практике, где отсрочка начала введения нейропротективных средств обусловлена сроками госпитализации и первичной диагностикой объема повреждения ГМ. Через 90 минут после моделирования открытой ЧМТ данный режим дозирования влиял на выраженность неврологического дефицита и степень повреждения ГМ у крыс по сравнению с контрольной группой.

На модели открытой ЧМТ, в основе которой лежит метод дозированного контузионного повреждения открытого мозга, был обнаружен эффект более быстрой адаптации и уменьшения объема вторичных повреждений под воздействием 3-кратной 2-часовой ингаляции аргон-кислородной смесью, о чем свидетельствуют как клинические результаты неврологического осмотра с помощью теста «Постановки конечности на опору» (ПКО), так и инструментальные данные - МРТ-исследование ГМ. Установлено, что воздействие аргон-кислородной смесью (Ar 70%/О₂ 30%) оказывает положительный эффект на организм животных в целом, о чем свидетельствует динамика изменения массы тела в посттравматическом периоде в сравнении с группами контроля и группой ложно оперированных животных.

Осуществление изобретения

Экспериментальные животные

Эксперименты были проведены на крысах-самцах линии Wistar весом 330-380 г (n=27). Накануне эксперимента животные не ограничивались в еде и воде.

Животные были случайным образом разделены на 3 группы в зависимости от объема проводимых вмешательств:

- ложно-оперированные животные, которым проводили анестезию, подготовительные мероприятия без ЧМТ и ингаляций (группа ЛО), n=6;

- контрольная группа с ЧМТ+ингаляция газовой смеси: N₂ 70%/О₂ 30% (группа Азот), n=10;

- опытная группа с ЧМТ+ингаляция газовой смеси: Ar 70%/О₂ 30% (группа Аргон), n=11.

Моделирование ЧМТ

После внутрибрюшинного введения 6% хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг было выполнено моделирование ЧМТ в соответствии с методом дозированного контузионного повреждения открытого мозга [Feeney D.M., Boyeson M.G., Linn R.T., et al. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 1981;211(l):67-77. doi:10.1016/0006-8993(81)90067-6]. Кожу на голове крысы выбривали в области операционного поля и обрабатывали антисептиком хлоргексидин 0,05%. Делали разрез кожи вдоль сагиттального шва, отверстие высверливали в теменной и лобной кости черепа с помощью фрезы диаметром 5 мм над левым полушарием в области локализации сенсомоторной коры. Крысу размещали в стереотаксической раме, голову фиксировали по стереотаксическим координатам 2,5 мм латерально от сагиттального шва и 1,5 мм каудально относительно брегмы. Установку для нанесения травмы размещали таким образом, чтобы боек находился над твердой мозговой оболочкой. Для нанесения травмы на боек сбрасывали по направляющим груз массой 50 г с высоты 10 см. Кожу ушивали викрилом №4 и область операции обрабатывали 5% раствором бриллиантового зеленого. До выхода животного из наркоза температуру тела поддерживали на уровне 37±0,5°С с помощью электрической грелки и ректального датчика температуры тела, соединенного с термореле. Ложнооперированным животным также проводили высверливание отверстия в черепе, но без нанесения удара.

Воздействие газовой смесью

Через 90 мин после нанесения травмы животное обезболивали парацетамолом 50 мг/кг п/л и помещали в прозрачную пластиковую камеру объемом 35 литров, в которую в течение 2-х часов подавали газовую смесь (N₂ 70%/О₂ 30% - группа Азот; Ar 70%/O₂ 30% - группа Аргон) с потоком 0,5 литра на одно животное. Одномоментно в камере находились не более 5 животных одной группы.

В группах Азот и Аргон проводили ингаляции продолжительностью 2 часа в течение 3-х дней: в день травмы (0 сутки), через 24 часа после ЧМТ (1-е сутки) и через 48 часов после ЧМТ (2-е сутки). Группе ЛО ингаляции не проводили. После окончания экспозиции газовой смесью проводили оценку общего состояния каждого животного (уровень бодрствования, подвижность). Затем животных перемещали в клетку с предоставлением свободного доступа к воде и пище. В раннем послеоперационном периоде (первые трое суток после ЧМТ) проводили продленную аналгезию жидким раствором парацетамола в поилке из расчета максимальной дозы 337 мг/кг/сут.

Данные физического статуса

Измерение массы тела проводили накануне эксперимента (М0), через 24 часа (M1), через 3 дня (М3), через 7 дней (М7) и через 14 дней (M14).

Оценка неврологического статуса

Неврологический статус оценивали на 3-й день наблюдения после ЧМТ (ПКО-3), на 7-й день наблюдения (ПКО-7) и на 14-й день наблюдения (ПКО-14). Тест ПКО.

Использовали протокол, основанный на методике, описанной Де Риком и соавт.[De Ryck М., Van Reempts J., Borgers M., et al. Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats. Stroke. 1989; 20(10): 1383-1390. doi:10.1161/01.STR.20.10.1383] и модифицированный Ю. Ёолкконеном и соавт.[Jolkkonen J., Puurunen K., Rantakömi S., et al. Behavioral effects of the α2-adrenoceptor antagonist, atipamezole, after focal cerebral ischemia in rats. Eur J Pharmacol. 2000;400(2-3):211-219. doi:10.1016/S0014-2999(00)00409-X]. Крыс приучали к рукам в течение недели до тестирования. Тест состоял из семи испытаний, оценивающих сенсомоторную интеграцию передних и задних конечностей в ответ на тактильную, проприоцептивную и зрительную стимуляцию. Каждый тест оценивали следующим образом: крыса выполняла испытание нормально - 2 балла; крыса выполняла испытание с промедлением >2 с и/или не полностью - 1 балл; крыса не выполнила испытание - 0 баллов. Баллы суммировали, результаты были представлены в виде суммы баллов за тест.

МРТ-исследование

На 14-е сутки после ЧМТ проводили МРТ-исследование животных. Работу выполняли на томографе с индукцией магнитного поля 7 Тесла и градиентной системой 105 мТл/м (BioSpec 70/30, Bruker, Германия). Животных наркотизировали изофлураном (1,5-2%) и помещали в устройство позиционирования с системой стереотаксиса и терморегуляции [Silachev D.N., Uchevatkin A.A., Pirogov Y.A., et al. Comparative evaluation of two methods for studies of experimental focal ischemia: Magnetic resonance tomography and triphenyltetrazoleum detection of brain injuries. Bull Exp Biol Med. 2009;147(2):269-272. doi: 10.1007/s10517-009-0489-z].

Использовали стандартный протокол исследования мозга крысы, который включает в себя получение Т2-взвешенньгх изображений. Для передачи радиочастотного (РЧ) сигнала использовали линейный трансмиттер с внутренним диаметром 72 мм, для детекции РЧ-сигнала - поверхностную приемную катушку для мозга крысы. Использовали следующие импульсные последовательности (ИП): RARE - ИП на основе спинового эха с параметрами: TR=6000 мс, ТЕ=63,9 мс, толщина среза 0,8 мм с шагом 0,8 мм, размер матрицы 256×384, разрешение 0,164×0,164 мм/пиксел. Общая продолжительность сканирования одного животного составляла около 25 мин. Степень повреждения ГМ оценивали с помощью графического анализа МРТ изображений с подсчетом объема поврежденного участка ГМ. Для этого на серии МРТ-изображений с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health image software, Bethesda, MD, США) рассчитывали площадь повреждения в мм² каждого среза. Для этого выделяли отдельно площади неизмененной ткани здорового (S₁) и поврежденного (S₂) полушарий и рассчитывали площадь повреждения по формуле: ΣS=S₁-S₂, где ΣS - площадь повреждения одного среза (мм²). Объем повреждения ГМ рассчитывали по следующей формуле: V=ΣSn×d, где d - толщина одного среза (0,8 мм), ΣSn - сумма площадей повреждения на всех слайдах (мм²). Летальность в группах животных оценивали через 24 ч, на 7-е и 14-е сутки после ЧМТ.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ STATISTICA 10.0 (StatSoft. Inc., США) и GraphPad Prizm. Нормальность распределения признака в выборках оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. Данные представлены как медиана (интерквартильный интервал). Статистические различия в данных, имеющих хотя бы в одной из групп распределение, отличное от нормального, анализировали с использованием U-теста Манна-Уитни с применением поправки Бонферрони для сопоставления трех и более групп, а также критерий Краскела-Уоллиса или U-теста Манна-Уитни для анализа не более 2-х групп.Критерием статистической значимости был уровень Р<0,05.

Данные физического статуса

Значимой разницы в контрольных точках массы животных отмечено не было, однако стоит отметить, что в раннем послеоперационном периоде (1-3-е сутки после ЧМТ) в группах ЛО и Азот отмечалась потеря массы тела, а затем ее постепенный прирост. Однако, при этом, в группе Аргон на протяжении всех 14-ти дней наблюдения отмечалась устойчивая тенденция к набору массы тела.

Данные неврологического осмотра по результатам теста ПКО

По результатам неврологического осмотра у всех животных, которым была моделирована ЧМТ, отмечался значимый неврологический дефицит, который в среднем на 3-й сутки в группах, которым была моделирована ЧМТ, составлял 5 баллов. В группе ЛО также отмечался небольшой неврологический дефицит в среднем 9 баллов. На 7-е сутки наблюдения в группе Аргон была отмечена устойчивая положительная динамика, в то время как в группе Азот неврологический дефицит сохранялся на прежнем уровне, однако значимых отличий не наблюдалось, на 14-е же сутки в группе Аргон в сравнении с группой Азот (р=0,004), но не с группой ЛО (р=0,21), было отмечено выраженное восстановление неврологического статуса медиана которого составила 8,5 (8; 10,3) в группе Аргон, 5 (3; 6) в группе Азот и 11 (8,75; 13,3) в группе ЛО.

Результаты исследования представлены таблице.

Примечание: Для статистической обработки данных применялся тест Kruskal-Wallis, все результаты представлены в виде Медианы и интерквартильных интервалов - Median (Q1; Q3), * - уровень р<0,05

Данные инструментальных исследований, таких как МРТ ГМ, не оставляют сомнений в том, что в группе Аргон объем очага повреждения: 60,2 (45,6; 67,6) мм³ (р=0,0088) был значимо меньше, чем в группе Азот: 40,8 (25,6; 46,1) мм³. С группой же ЛО в группе Аргона значимых отличий не выявлено (р=0,4023), Группа Азот значимо отличалась от группы ЛО, объем очага повреждения в которой составил 39,7 (29,2; 42,4) мм³ (р=0,0019).

Таким образом установлено, что трехкратные ингаляции аргон-кислородной дыхательной смесью (Ar 70%/О₂ 30%) с длительностью экспозиции 2 часа оказывают нейропротективный эффект при открытой ЧМТ, что подтверждается как функциональными пробами оценки неврологического статуса (Тест «ПКО»), так и инструментально по данным МРТ-исследования в виде значимого уменьшения очага повреждения на 14-е сутки наблюдения.

Изобретение тотносится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано при определении клинической эффективности и безопасности применения инертного газа аргона в качестве нейропротектора при открытой черепно-мозговой травме (ЧМТ). Осуществляют 3-кратную 2-часовую ингаляцию газовой смесью состава: аргон-кислород Аr 70%/О₂ 30% с потоком 0,5 л/мин на одно животное через 90 мин после нанесения травмы, через 24 часа после ЧМТ и через 48 часов после ЧМТ. Способ обеспечивает нейропротективный эффект при открытой ЧМТ за счет ингаляции аргон-кислородной дыхательной смесью с длительностью экспозиции 2 часа. 1 табл.

Способ нейропротекции головного мозга при моделировании открытой черепно-мозговой травмы (ЧМТ), включающий ингаляцию газовой смеси, содержащей аргон, отличающийся тем, что осуществляют 3-кратную 2-часовую ингаляцию газовой смесью состава: аргон-кислород Аr 70%/О₂ 30% с потоком 0,5 л/мин на одно животное через 90 мин после нанесения травмы, через 24 часа после ЧМТ и через 48 часов после ЧМТ.