СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ ГЕНА MTRNR1 ПРИ ОСТРОЙ НЕЙРОСЕНСОРНОЙ ТУГОУХОСТИ, ВЫЗВАННОЙ ПРИМЕНЕНИЕМ АНТИБИОТИКОВ ИЗ ГРУППЫ АМИНОГЛИКОЗИДОВ Российский патент 2008 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и оториноларингологии, может быть использовано для диагностики острых форм тугоухости на фоне применения антибиотиков из группы аминогликозидов у человека.

Антибиотики группы аминогликозидов широко применяются в медицинской практике как бактерицидные препараты при различных тяжелых, в том числе анаэробных, инфекциях. Применение ототоксических антибиотиков, таких как канамицин, гентамицин, неомицин и др. приводит к возникновению острой нейросенсорной тугоухости у 12% пациентов. Преобладает, как правило, тяжелая степень нейросенсорной тугоухости (III степень потери слуха наблюдается в 44% случаев, IV - в 35%).

Острая нейросенсорная тугоухость относится к числу наиболее распространенных и тяжелых заболеваний, как среди детей, так и среди взрослых. Высокая распространенность и неуклонный рост в последние десятилетия данной патологии, а также высокая степень инвалидизации больных с внезапными формами потери слуха определяют важное социально-экономическое и медицинское значение этой проблемы, необходимость исследования механизмов развития данного заболевания с целью разработки эффективных методов диагностики, профилактики и патогенетической терапии с учетом этнической принадлежности и генетической предрасположенности каждого больного. Несмотря на острую социальную значимость проблемы, до сих пор не разработаны способы ранней диагностики и система профилактических мероприятий острой нейросенсорной тугоухости на фоне лечения антибиотиками из группы аминогликозидов.

Острая нейросенсорная тугоухость, развивающаяся на фоне приема аминогликозидов, относится к тем заболеваниям, в которых анамнестические и клинические данные представляют довольно скудный материал для постановки правильного диагноза с определением этиологии заболевания. Вместе с тем, своевременная и точная диагностика этого наследственного дефекта позволит избежать потери слуха у пациента при своевременной отмене терапии аминогликозидами, а при возникновении ототоксического эффекта от лечения позволит наиболее качественно и в самые ранние сроки начинать реабилитационные мероприятия для обеспечения полноценной социальной адаптации лиц с повреждением процесса звуковосприятия.

Преимущества предлагаемой разработки перед существующими аналогами заключаются в оптимальности разрабатываемых подходов ДНК-диагностики заболеваний, основанных на выявлении существующего своеобразия генофонда народов Волго-Уральского региона. Ряд генов митохондриального генома принимает участие в функционировании процесса звуковосприятия у человека. Это гены MTRNR1, tRNALeu, tRNALys, MTTS1, tRNAGlu, отвечающие за различные рРНК и тРНК (del Castillo et al., 2002; Campos et al., 2002). Ототоксичность антибиотиков аминогликозидового ряда для человека обусловлена рядом изменений митохондриального генома. Мутация A1555G гена МТRNR1 была впервые идентифицирована Prezant et al. в 1993 году в многочисленной арабской семье с наследственной несиндромальной глухотой, возникающей после применения антибиотиков из группы аминогликозидов. Частота данной мутации среди больных несиндромальной сенсоневральной глухотой в состоянии гомоплазмии составляет, в среднем, 0,05, тогда как в популяциях Китая и Японии в состоянии гетероплазмии A1555G наблюдается у 1 из 200 слышащих индивидов (Hutchin et al., 1993). Также мутация A1555G достаточно часто встречается во многих европейских и азиатских популяциях. Bacino с соавторами в 1995 году обнаружили мутацию del961T(ins)_n гена MTRNR1 в 35 китайских семьях с глухотой, возникающей после приема антибиотиков-аминогликозидов. По литературным данным, частота данной мутации от 10 до 50% у больных с острой нейросенсорной тугоухостью, возникающей на фоне антибиотикотерапии. Также в некоторых этнических группах (китайцы, японцы, монголы, индонезийцы) у больных острой нейросенсорной тугоухостью на фоне антибиотикотерапии аминогликозидами идентифицируется мутации С1494Т и Т1095С гена MTRNR1, встречающиеся с частотой около 1%.

Известен способ детекции мутации A1555G гена MTRNR1 посредством рестрикционного анализа с помощью рестриктазы HaeIII (Prezant Т. R., Agapian J. V., Bohlman M. С.et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness. 1993. Nature Genet. V.4. P.289-294). Однако данный метод позволяет выявить только мутацию A1555G, а мутации del961T(ins)_n, C1494T и Т1095С остаются за пределами амплифицируемого участка, оставаясь недосягаемыми для детекции.

Прототипом изобретения является работа Orita M. с соавторами, предложенная в 1989 году (Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya Т. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism. // Protocols Natl. Acad. Sci. - 1989. - V.86. - P.2766-2770). Разработанный Orita M. с соавторами метод выявления однонуклеотидных замен и делеций позволяет идентифицировать различные мутации в ДНК. Время исследования составляет 4 дня.

Техническим результатом изобретения является сокращение времени исследования до 2-х суток.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови, проведение полимеразной цепной реакции, идентификацию мутаций A1555G, del961T(insC_n), C1494T, Т1095С, амплификацию проводят с помощью специфических олигонуклеотидов:

A1555G (F) 5' gctcagcctatataccgccatcttcagcaa 3'

A1555G (R) 5' tttccagtacacttaccatgttacgactgg 3'

del961T(F) 5' ccaccgcggtcacacgattaa 3'

del961T(R) 5' ttctggcgagcagttttgttga 3', после чего для идентификации данных мутаций проводят анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP-анализ).

Способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл венозной крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используют метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Метью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA. // Methods in Molecular Biology /Ed. Walker J.M.Y.L.: Human Press. 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан объемом 50 мл, туда же добавляют 30 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис HCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 0,4 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на 16 часов в термостате при температуре 37°С. Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке:

4. К лизату добавляют 0,5 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7,8.

5. Смесь встряхивают на шейкере и центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин.

6. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК и неденатурированные белки.

7. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем хлороформом.

8. Препараты осаждают двумя объемами охлажденного этанола 96%.

9. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента кодирующего региона гена MTRNR1. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров для детекции мутаций del961T(ins)_n и Т1095С гена MTRNR1 и их оптимальные концентрации в реакционной смеси подобраны с помощью пакета биологических программ DNASTAR (Primer select 5.05 1993-2002). Последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемые для рестрикционного анализа мутации A1555G, предложенные Prezant Т. R. с соавторами (1993), также могут быть использованы для детекции мутаций С1494Т и A1555G гена MTRNR1 посредством SSCP анализа. Используют следующие последовательности олигонуклеотидов:

A1555G (F) 5' gctcagcctatataccgccatcttcagcaa 3'

A1555G (R) 5' tttccagtacacttaccatgttacgactgg 3'

del961T(F) 5' ccaccgcggtcacacgattaa 3'

del961T(R) 5' ttctggcgagcagttttgttga 3'.

Состав реакционной смеси: 0,8 мкг геномной ДНК, соответствующее кол-во каждого олигонуклеотида (Таблица), 125 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещают в 12,5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20. К полученной смеси прибавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл стерильного минерального масла. Режим амплификации: предварительная денатурация 4 минуты при 94°С, затем 30 циклов со следующими параметрами - 94°С - 45 секунд, 58°С - 45 секунд, 72°С - 1 минута. После 30-го цикла проводят инкубацию при 72°С в течение 7 минут. После проведения ПЦР 10 мкл амплификата смешивают с 3,3 мкл 0,5М NaOH и 0,3 мкл 0,5М ЭДТА и нагревают в течение 15 минут при 43°С. После этого к амплификатам добавляют 3 мкл формамида, смешанного с 0,5% раствором бромфенолового синего и 0,5% раствором ксиленцианола, и наносят на 10% полиакриламидный гель (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида 29:1, 49:1) с 5% глицерином (Savov et al., 1992; Spinardi et al., 1991).

В качестве электрофорезного буфера используют 0,5хТВЕ. Электрофорез в геле длиной 23 см, толщиной 1 мм проходит при температуре +4°С (в холодильной камере) при напряжении 100 В в течение 48 часов. Затем фрагменты ДНК в геле фиксируют в 10% растворе уксусной кислоты в течение 30 минут при непрерывном покачивании на шейкере. После этого гель промывают три раза дистиллированной водой в течение двух минут, инкубируют в 0,1% водном растворе AgNO₃, содержащем 0,15% формалин и 0,02% тиосульфата натрия. После проявления гель заливают 10% раствором уксусной кислоты для остановки окраски. Время исследования составляет 2 дня. Идентификацию генотипов проводят по критерию присутствия или отсутствия дополнительных полос в сравнении с контрольной ДИК (норма) и панели образцов ДНК с мутациями A1555G, del961T(ins)_n, C1494T и Т1095С гена MTRNR1.

На фигурах 1 и 2 представлен SSCP-анализ продуктов амплификации гена MTRNR1. Фигура 1. SSCP-анализ участка 1 гена MTRNR1. Дорожка 1 - молекулярный маркер λpUC19/Pstl; дорожка 2 - образец, содержащий мутацию Т1095С, дорожки 3, 4 - образцы, содержащие мутацию del961TinsC_n, дорожка 5 - образец с нормальной последовательностью ДНК. Фигура 2. SSCP-анализ участка 2 гена MTRNR1. Дорожка 1 - молекулярный маркер λpUC19/Pstl; дорожка 2 - образец, содержащий мутацию A1555G в состоянии гомоплазмии, дорожка 3 - образец, содержащий мутацию A1555G в состоянии гетероплазмии, дорожка 4 - образец, содержащий мутацию C1494T.

В качестве конкретных примеров в целом были обследованы 70 неродственных пациентов с острой нейросенсорной тугоухостью, возникшей на фоне применения антибиотиков из группы аминогликозидов, а также 231 пробанд с диагнозом двухсторонняя нейросенсорная тугоухость предположительно наследственной этиологии, состоящих на учете в Республиканском сурдологическом центре Республиканской детской клинической больницы г.Уфы, членов их семей, а также здоровых доноров, проживающих в Волго-Уральском регионе. Диагноз глухоты или тугоухости устанавливался на основе данных тональной пороговой аудиометрии (аудиометр «GSI-61», Grason Stadler Instruments, USA), акустической импедансометрии (импедансометр «Zodiac 901», Дания) и регистрации отоакустической эмиссии (система «ILO 92», Otodynamics Ltd., Великобритания). Наследственный характер глухоты в семьях устанавливали на основании генеалогических данных и ретроспективного анализа анамнеза больных с целью исключения возможного влияния факторов внешней среды во время пренатального и постнатального развития: учитывали отсутствие инфекций, травм слухового аппарата.

Молекулярно-генетический анализ частот мутаций A1555G, del961T(ins)_n, C1494T и Т1095С гена MTRNR1 проводился у больных, страдающих сенсоневральной тугоухостью третьей и четвертой степени и глухотой, предположительно наследственной этиологии, возникшей после терапии аминогликозидами.

Мутации A1555G, C1494T и Т1095С гена MTRNR1 не обнаружены ни у одного из обследуемых нами пациентов и в группе контроля.

В гене MTRNR1 у четырех обследуемых была выявлена мутация del961TinsC_n. У двух пациентов данная мутация находилась в состоянии гомоплазмии и у двух - в состоянии гетероплазмии. Двум пациентам татарской и русской этнической принадлежности, несущим мутацию del961TinsC_n в состоянии гетероплазмии, диагноз нейросенсорной несиндромальной формы глухоты был поставлен в первые месяцы жизни. Терапию аминогликозидами больные отрицают, однако указывают на тяжелые инфекционные заболевания в возрасте до года. Двое других пациентов - носителей мутации del961TinsC_n в состоянии гомоплазмии русской этнической принадлежности, указывали на тяжелую форму гриппа, перенесенную в раннем детстве. На фоне лечения осложнений после гриппа у данных больных развилась острая нейросенсорная тугоухость. Также были обнаружены мутации 961Т→G и 961Т→А у больных русской этнической принадлежности с диагнозом острой нейросенсорной тугоухости неясной этиологии. Мутация 961Т→G, по литературным данным, характерна для больных острой нейросенсорной тугоухостью из европейских популяций [Mishmar et al., 2003; Achilla et al., 2004]. Тогда как del961TinsC_n чаще встречается у больных из Японии [Tanaka et al., 2004], Кореи и Тайвани [Mishmar et al., 2003], Пакистана [Achilli et al., 2005]. Изменение нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК 961Т→А гена MTRNR1 было выявлено впервые у больного острой нейросенсорной тугоухостью на фоне применения аминогликозидов. Таким образом, частота мутации del961TinsC_n среди пациентов с острой нейросенсорной тугоухостью составила 0,028 (2,8%), а среди пациентов с наследственной несиндромальной глухотой - 0,008 (0,8%). Мутации 961T→G и 961Т→А были выявлены с частотой 0,014 (1,4%) в группе пациентов с острой нейросенсорной тугоухостью.

Полученные высокие значения частоты мутации del961TinsC_n среди больных острой нейросенсорной тугоухостью в Башкортостане подтверждают важность определения этой делеции в гене MTRNR1 при медико-генетическом консультировании пациентов с потерей слуха на фоне лечения антибиотиками из группы аминогликозидов. Поскольку применение антибиотиков аминогликозидового ряда, таких как стрептомицин, канамицин, гентамицин, клиндомицин и др., широко распространено в нашей стране, изучение частоты мутации del961TinsC_n гена MTRNR1 является актуальным для оценки риска возникновения сенсоневральной глухоты в семьях, где данная мутация находится в состоянии гетероплазмии, а также разработки схемы дородовой диагностики повреждений гена MTRNR1 у плода.

Пример 1. Больной Ф.И., 1990 год рождения, город Туймазы, Республика Башкортостан. Диагноз острой нейросенсорной двухсторонней глухоты установлен в 1992 году после курса гентамицина по поводу острой двухсторонней пневмонии. Острая нейросенсорная тугоухость наступила после двух первых инъекций препарата, однако лечение продолжали на основании тяжелого соматического состояния больного. В настоящее время пациент использует слуховой аппарат. Со стороны родителей и ближайших родственников - наследственность не отягощена. Нарушений слуха у родных пациента не выявлено. При молекулярно-генетическом тестировании у больного и его родителей было взято по 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией двух участков кодирующего региона гена MTRNR1 в реакционной смеси, содержащей 0,8 мкг геномной ДНК, соответствующее кол-во каждого олигонуклеотида (Таблица), 125 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 12,5 мкл однократного буфера для ПЦР. Затем провели SSCP-анализ амплифицированных ПЦР-продуктов при постоянном напряжении 100 В. После окончания электрофореза гель окрасили раствором 0,1% водного раствора AgNO₃, содержащего 0,15% формалина и 0,02% тиосульфата натрия. Исследование ДНК больного и его родителей выявило наличие мутации del961TinsC_n у матери в состоянии гетероплазмии. У пациента была выявлена мутация del961TinsC_n в состоянии гомоплазмии, которая явилась причиной глухоты в ответ на терапию антибиотиками аминогликозидового ряда. Время исследования составило 2 дня.

Пример 2. Пациентка А.А., 1978 год рождения, город Уфа, Республика Башкортостан. Слух нормальный, беременность 8 недель. Со стороны мужа наследственность по врожденной глухоте не отягощена. Выявлены нарушения слуха у сына сестры пациентки. Больной был проведен амниоцентез и взята ворсина хориона. Также у супругов взяли по 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией двух участков гена MTRNR1 в реакционной смеси, содержащей 0,8 мкг геномной ДНК, соответствующее кол-во каждого олигонуклеотида (Таблица), 125 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 12,5 мкл однократного буфера для ПЦР. Затем провели SSCP-анализ амплифицированных ПЦР-продуктов при постоянном напряжении 100 В. После окончания электрофореза гель окрасили раствором 0,1% водного раствора AgNO₃, содержащего 0,15% формалина и 0,02% тиосульфата натрия. При исследовании ДНК ворсины хориона была обнаружена мутация del961TinsC_n гена MTRNR1 в состоянии гетероплазмии у пациентки и в состоянии гомоплазмии у плода, что явилось свидетельством о возможном возникновении острой нейросенсорной тугоухости у будущего ребенка в случае применения антибиотиков аминогликозидового ряда. Время исследования составило 2 дня.

Таким образом, нами проведено молекулярно-генетическое изучение распространенности часто встречающейся в нашем регионе мутации del961TinsC_n гена MTRNR1 у 70 больных острой нейросенсорной тугоухостью и глухотой и у 231 неродственного индивида с наследственной несиндромальной глухотой, проживающих на территории республики Башкортостан. Полученные данные позволяют оценивать вероятность возникновения острой нейросенсорной тугоухости и глухоты при антибиотикотерапии аминогликозидами у детей практически с первых дней жизни. Установление с помощью молекулярно-генетических методов вероятности повреждения слуха при проведении антибиотикотерапии с самого рождения позволяет предотвратить повреждение процесса звуковосприятия, а также снизить экономические затраты на проведение дорогостоящих диагностических процедур.

Реакционная смесь для ПЦРМутацияПЦР буфер (х10), мклСмесь dNTP, мклПраймер F, мклПраймер R,
мклОбъем Taq-полимеразы, мкл (ЕД)Объем Н₂О, мклКол-во ДНК, мкг961delTinsC_n1,250,50,190,180,25 (5ЕД)10,380,8A1555G1,250,50,250,250,25 (5ЕД)9,350,8

Данные приводятся из расчета на 1 образец ДНК. Реакция проводится в 12,5 мкл реакционной смеси

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и оториноларингологии. Предложен новый способ определения мутаций гена MTRNR1, позволяющий сократить время исследования до 2-х суток. Изобретение может быть использовано для диагностики острых форм тугоухости. 2 ил., 1 табл.

Способ определения мутаций гена MTRNR1 при острой нейросенсорной тугоухости на фоне применения антибиотиков из группы аминогликозидов, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, идентификацию мутаций A1555G, del961T(ins)_n, C1494T и Т1095С, отличающийся тем, что амплификацию проводят с помощью полимеразной цепной реакции синтеза дНК и специфических олигонуклеотидов:

A1555G (F) gctcagcctatataccgccatcttcagcaa,

A1555G (R) tttccagtacacttaccatgttacgactgg,

de1961T(F) ccaccgcggtcacacgattaa,

de1961T(R) ttctggcgagcagttttgttga,

после чего проводят SSCP анализ, а идентификацию генотипов осуществляют по критерию присутствия или отсутствия дополнительных полос в сравнении с контрольной ДНК и панелью образцов ДНК с мутациями A1555G, de1961T(ins)_n, C1494T и Т 1095С гена MTRNR1.