ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ШТАММЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ДИАРЕИ Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 A61K35/742 A23L33/135 C12R1/125 

Основная патентная заявка

Настоящая патентная заявка заявляет приоритет Французской патентной заявки номер FR 1261916, поданной 12 декабря 2012. Содержание Французской патентной заявки полностью включается в настоящее описание путем отсылки.

Область техники

Изобретение имеет отношение к области пробиотических штаммов, в частности пробиотических штаммов Bacillus, предназначенных для применения при лечении и/или профилактике диареи. Данное изобретение также имеет отношение к способу отбора пробиотических штаммов, обладающих особенным свойством воздействовать на абсорбцию (всасывание) воды в толстой кишке.

Уровень техники

В случае нормального функционирования толстый кишечник человека абсорбирует около 99% воды, поступающей в ее просвет, что составляет около 2 литров воды в день. Толстый кишечник обладает способностью всасывать дополнительно до 4 литров воды. Однако при количестве воды свыше 6 литров его способность к абсорбции подавляется и развивается диарея.

Диарея является распространенной проблемой (около двух миллиардов случаев в мире каждый год), которая характеризуется стулом жидкой или мягкой консистенции, более обильным и частым, чем обычно (более 3 дефекаций в день). В экстремальных случаях в день может быть потеряно более 20 литров жидкости.

Диарея является не болезнью, а симптомом. Наиболее общей причиной диареи является проглатывание загрязненной воды или пищи; в таком случае она продолжается один-два дня и не требует лечения. Однако собственно диарея может вызвать обезвоживание, которое может оказаться фатальным, особенно у младенцев, причем при потере веса, достигающей 10%, требуется неотложная больничная помощь. С точки зрения Всемирной организации здравоохранения диарея является второй наиболее общей причиной детской смертности в развивающихся странах и обуславливает 18% смертей детей младше 5 лет (Bryce et al. Lancet, 2005, 365: 1147-1152).

Вызванное диареей обезвоживание происходит в тех случаях, когда потери жидкости не компенсируются. В нормальной ситуации в толстой кишке вода удаляется из экскрементов. Явление обратного всасывания воды, содержащейся в поглощенном веществе, происходит на уровне клеток толстой кишки путем сочетания активного и пассивного транспорта воды и электролитов. На уровне крипт эпителия толстой кишки происходит секреция воды из крови в окружающую среду. У здорового человека эти два явления уравновешивают друг друга и способны сохранять соответствующую гидратацию стула, которая способствует прохождению содержимого через кишечник и улучшает условия циркуляции молекул.

Существует множество различных причин диареи, включая диарею инфекционного происхождения, вызванную вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном, и неинфекционную диарею, такую как диарея, вызванная пищевой непереносимостью, жирной пищей, алкоголем, психологическим фактором, введением лекарственного средства, применением терапевтической процедуры, диарея, связанная с болезнью или с клиническим состоянием, или диарея, связанная с отменой лекарственного средства.

В зависимости от продолжительности симптомов различают острую диарею и хроническую диарею, симптомы которой продолжаются менее двух недель и по меньшей мере две недели, соответственно.

Классическим медикаментозным лечением диареи является, например, лоперамид, оказывающий действие как путем стимулирования абсорбции воды и электролитов так и путем уменьшения времени транзита. Однако уменьшение времени транзита может быть проблематичным при тяжелых инфекциях типа Salmonella, Shigella или Clostridium difficile, так как патогенная бактерия остается в кишечнике в течение длительного времени.

Привлекательной альтернативой для лечения и/или предотвращения диареи являются пробиотики. Наиболее широко используемыми при этом показании пробиотиками являются лактобактерии. Как правило, считается, что пробиотики оказывают благоприятное действие на иммунную систему и на равновесие внутрикишечной флоры.

Другие исследования пытаются определить новые мишени для лечения и предотвращения диареи. Так, документ WO 2004/028480 описывает соединения типа тиазолидинона для уменьшения эффективности транспорта ионов хлора посредством белка CFTR (муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости) и его применения при лечении секреторной диареи. Bradford et al. (Am. J. Physiol. Gastrointes. Liver Physiol., 2009, 296: G886-G898) рассматривают средства лечения непроходимости кишечника и обезвоживания у пациентов с муковисцидозом (при котором наблюдается измененная экспрессия CFTR).

Более того, было описано, что частичная или полная потеря белка NHE3 (натрий-водородный ионообменный белок 3) у мышей с муковисцидозом уменьшала число случаев непроходимости кишечника, а именно посредством увеличения жидкости в кишечнике, и был сделан вывод о том, что NHE3 представляет собой потенциальную мишень для регулирования жидкости в кишечнике у пациентов с муковисцидозом и с измененной экспрессией CFTR.

Следовательно, по-прежнему существует необходимость в новых стратегиях лечения и/или предотвращения диареи.

Раскрытие изобретения

В общем, настоящее изобретение основывается на открытии того факта, что определенные пробиотические штаммы способны действовать непосредственно на диарею, вызывая абсорбцию (поглощение) воды, присутствующей в избытке в толстой кишке. Изобретатели неожиданно обнаружили, что некоторые пробиотические штаммы способны ингибировать экспрессию транспортеров, участвующих в секреции воды в толстой кишке, и/или стимулировать экспрессию транспортеров, участвующих в абсорбции воды в толстой кишке, и могут использоваться для лечения и/или предотвращения диареи.

Итак, эти пробиотические штаммы не действуют как ингибиторы транспортеров, т.е. не действуют путем связывания с транспортерами, затрудняя, таким образом, их функционирование, а влияют на их экспрессию и, следовательно, на количество присутствующих транспортеров.

Более того, учитывая, что эти пробиотические штаммы влияют непосредственно на абсорбцию воды, присутствующей в избытке в толстой кишке, они обладают преимуществом, которое позволяет использовать их для предотвращения и/или лечения любого типа диареи, в частности, независимо от того, является ли диарея инфекционной или неинфекционной и при наличии или при отсутствии дисбиоза.

Таким образом, настоящее изобретение имеет отношение к способу отбора пробиотического штамма для лечения и/или предотвращения диареи, указанный способ включает стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в абсорбцию или секрецию воды в толстой кишке, и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в секрецию воды в толстой кишке, и/или увеличение по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в абсорбцию воды в толстой кишке.

Конкретнее, в первом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к способу отбора пробиотического штамма для лечения и/или предотвращения диареи, при этом указанный способ включает стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR (муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости) и/или на экспрессию белка NHE3 (натрий-водородный ионообменный белок 3), и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3.

В некоторых вариантах осуществления тестируемый штамм представляет собой дрожжевой штамм или бактериальный штамм. В частности, бактериальным штаммом, предназначенным для тестирования, может быть штамм Bacillus, предпочтительно штамм Bacillus subtilis.

В определенных вариантах осуществления экспрессия белка CFTR и/или белка NHE3 оценивается при помощи электрофореза, вестерн-блоттинга, иммуноанализа, иммуногистохимического анализа, иммуноцитохимического анализа, масс-спектрометрии, RT-ПЦР или нозерн-блоттинга.

В другом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к пробиотическому штамму, выбранному с использованием метода согласно изобретению и предназначенному для лечения и/или предотвращения диареи.

В определенных вариантах осуществления пробиотический штамм является штаммом Bacillus subtilis, предпочтительно штаммом Bacillus subtilis CU1, размещенном на хранение в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes / Национальная коллекция культур микроорганизмов, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) 25 октября 2001 под номером I-2745.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к клеткам, полученным путем культивирования пробиотического штамма, выбранного с помощью способа согласно изобретению и предназначенного для лечения и/или предотвращения диареи.

В частности, данное изобретение имеет отношение к клеткам Bacillus subtilis, полученным путем культивирования штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745, предназначенного для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

Настоящее изобретение также имеет отношение к способу лечения и/или профилактики диареи у пациента, при этом данный способ включает введение пациенту эффективного количества клеток, полученных путем культивирования пробиотического штамма, выбранного с помощью способа согласно изобретению.

В определенных вариантах осуществления способ лечения и/или предотвращения диареи включает введение клеток Bacillus subtilis, полученных путем культивирования пробиотического штамма Bacillus subtilis, предпочтительно штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745.

В другом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к композиции, предназначенной для применения при лечении и/или предотвращении диареи, при этом указанная композиция содержит по меньшей мере один пробиотический штамм согласно изобретению, или клетки, полученные культивированием указанного штамма. В частности, композиция содержит клетки Bacillus subtilis, полученные культивированием штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745.

Формы диареи, которые можно лечить профилактически и/или терапевтически в соответствии с изобретением, включают острую диарею и хроническую диарею.

В определенных вариантах осуществления диарея, которую лечат в соответствии с изобретением, является диареей инфекционной природы, которая вызвана вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном.

В других вариантах осуществления диарея, которую лечат в соответствии с изобретением, является диареей неинфекционной природы.

Диарея неинфекционной природы может быть, например, диареей, вызванной пищевой непереносимостью, диареей, вызванной жирной диетой, диареей, вызванной алкоголем, диареей, вызванной психологическим фактором, диареей, вызванной введением лекарственного препарата, диареей, вызванной применением терапевтической процедуры, диареей, связанной с болезнью или с клиническим состоянием, или диареей, связанной с отменой лекарственного средства.

Более подробное описание определенных предпочтительных вариантов осуществления изобретения приведено ниже.

Подробное описание изобретения

Как было упомянуто выше, настоящее изобретение имеет отношение к установлению пробиотических штаммов, способных влиять на абсорбцию воды в толстой кишке посредством прямого воздействия на уровень транспортеров, участвующих в регуляции жидкости в кишечнике, и их применению в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения и/или предотвращения диареи.

I. Способ отбора пробиотических штаммов

Целью способа отбора согласно изобретению является установление пробиотического штамма, пригодного для лечения и/или предотвращения диареи.

Таким образом, настоящее изобретение имеет отношение к отбору пробиотического штамма, предназначенного для лечения и/или предотвращения диареи, при этом указанный способ включает следующие стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в абсорбцию или секрецию воды в толстой кишке, и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в секрецию воды в толстой кишке, и/или увеличение по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в абсорбцию воды в толстой кишке.

Примером транспортера, связанного с секрецией воды в толстой кишке, является белок CFTR (муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости).

Примером транспортера, связанного с абсорбцией воды в толстой кишке, является белок NHE3 (натрий-водородный ионообменный белок 3).

Предпочтительный способ согласно изобретению отличается тем, что он включает следующие стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR и/или на экспрессию белка NHE3, и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3.

Штамм, выбранный в результате применения способа согласно изобретению, таким образом, является пробиотическим штаммом, пригодным для лечения и/или предотвращения диареи.

Термин "пробиотический штамм" в данном описании предназначен для обозначения штамма живого микроорганизма, который оказывает благоприятное воздействие на здоровье хозяина.

Как правило, хозяином является человек, однако можно допустить, что хозяином может быть другое млекопитающее, например собака, кошка, жвачное животное, а именно, овца, коза, теленок, корова, олень, верблюд, лошадь, кабан, в частности свиньи и поросята, leporids (заячьи), муридовые (мышиные) и грызуны семейства Caviidae (свинковые).

Тестируемые штаммы

Штаммом, тестируемым с использованием способа согласно изобретению, может быть любой штамм микроорганизма.

В определенных вариантах осуществления тестируемым штаммом является дрожжевой штамм. В числе дрожжей, которые могут проходить тестирование, можно упомянуть, например, дрожжи рода Saccharomyces, в частности виды Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae, дрожжи рода Kluyveromyces, в частности вид Kluyveromyces marxianus.

В других вариантах осуществления тестируемым штаммом является бактериальный штамм.

Тестируемый штамм предпочтительно выбирают из бактерий, признанных безопасными для людей и/или животных.

В числе бактерий, которые могут проходить тестирование, можно упомянуть, например, бактерии рода Bifidobacterium, в частности виды Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve; бактерии рода Lactobacillus, в частности виды Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosu и Lactobacillus salivarius; бактерии рода Weisella, в частности виды Weisella cibaria, Weisella kimchii, Weisella thailandensis; бактерии рода Bacillus, в частности виды Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus и Bacillus clausii; бактерии рода Lactococcus, в частности вид Lactococcus lactis; бактерии рода Enterococcus, в частности виды Enterococcus faecium, Enterococcus fecalis; бактерии рода Streptococcus, в частности вид Streptococcus thermophilus; бактерии рода Escherichia, в частности вид Escherichia coli.

Экспрессия CFTR и/или NHE3

Способ согласно изобретению включает оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного транспортера, связанного с абсорбцией или секрецией воды в толстой кишке, в частности на экспрессию белка CFTR и/или белка NHE3.

При использовании в описании "белок CFTR" подразумевает белок, который у человеческого вида кодируется геном CFTR ("муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости"), который располагается на локусе 7q31.2, на участке q31.2 длинного плеча хромосомы 7. Ген CFTR является высоко консервативным среди видов. У человека белок CFTR имеет, например, полипептидную последовательность с учетным номером в GenBank NP_00483, которая содержит 1480 аминокислот.

Белок CFTR формирует проницаемый для ионов хлора и тиоцианата канал в эпителиальных клетках.

Белок CFTR экспрессируется на апикальном полюсе эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы, желчных протоков, кишечных крипт, трахео-бронхиального дерева, почечных канальцев, половой системы и потовых желез.

Было продемонстрировано, что ингибиторы CFTR, такие как тиазолидинон, находят применение при лечении и/или профилактике диареи (Verkman et al., Curr. Pharm. Des., 2006, 12: 2235-2247).

Следовательно, протестированный в методе отбора согласно изобретению штамм, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR, можно использовать для лечения и/или предотвращения диареи.

При использовании в описании "белок NHE3" подразумевает белок, который у человеческого вида кодируется геном NHE3 ("натрий-водородный ионообменный белок 3", также известный под названием SLC9A3 "представитель 3 семейства 9 переносчиков растворенных веществ"), который располагается на хромосоме 13. У людей белок NHE3 имеет, например, полипептидную последовательность с учетным номером в GenBank NP_004165, которая содержит 834 аминокислоты.

Белок NHE3 экспрессируется в нефроне почки и в апикальной мембране эндотелиальных клеток стенки кишечника, где он, главным образом, отвечает за поддержание баланса натрия.

Показано, что генетически модифицированные мыши с инактивированным геном NHE3 страдают от диареи (Schultheis et al., 1998, Nat. Genet 19: 282-285).

Следовательно, протестированный в методе отбора согласно изобретению штамм, вызывающий увеличение экспрессии белка NHE3, можно использовать для лечения и/или предотвращения диареи.

В контексте настоящего изобретения количественное определение воздействия тестируемого штамма на экспрессию транспортера, участвующего в абсорбции или секреции воды в толстой кишке, в частности на экспрессию белка CFTR и/или белка NHE3, может осуществляться с помощью любого метода, известного специалисту в данной области техники (см., например, Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY), так как сущность используемого способа не является критическим или ограничивающим фактором.

В общем, уровень экспрессии белка может быть определен с помощью прямого метода, такого как метод электрофореза, вестерн-блоттинг, метод иммуноанализа, иммуногистохимический метод, иммуноцитохимический метод или метод масс-спектрометрии.

Кроме того, уровень экспрессии белка может быть определен непрямым способом.

Непрямой метод может включать измерение уровня транскрипции соответствующего гена, например, с помощью RT-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой), предпочтительно с помощью количественной RT-ПЦР, или с помощью нозерн-блоттинга.

Другим примером непрямого метода является метод, который включает в себя измерение активности белка, активности белка, который коррелирует с количеством присутствующего функционального белка.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью электрофореза.

Электрофорез позволяет разделить белки в соответствии с их молекулярной массой. Обычно используется электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем лаурилсульфат натрия (также называемый SDS-PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Также можно использовать двухмерный электрофорез, такой как изоэлектрическое фокусирование, при этом возможно разделение белков в соответствии с их молекулярной массой и их изоэлектрической точкой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью Вестерн-блоттинга.

Вестерн-блоттинг включает разделение белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, а затем перенос белков из полиакриламидного геля на поддерживающую мембрану, на которой интересующие белки обнаруживают путем использования меченых антител, специфических к указанным белкам.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью иммуноанализа. При использовании в описании "иммуноанализ" означает какой-либо метод, использующий реакцию антиген-антитело для обнаружения и определения количества антигенов, антител или сходных субстанций. Комплекс антиген-антитело можно визуализировать несколькими способами. В большинстве случаев антитело является антителом, конъюгированным с ферментом (например, пероксидазой), который может катализировать реакцию, вызывающую окрашивание (например, иммунопероксидазное окрашивание). Альтернативно, антитела могут быть помечены флуорофором (например, FITC, родамином, техасским красным или Alexa Fluor). Затем комплекс антитело-антиген обнаруживают с помощью иммунофлуоресценции.

Моноклональные антитела, специфические к человеческому белку CFTR и человеческому белку NHE3, хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью иммуногистохимического анализа. Термин "иммуногистохимический анализ" имеет отношение к методу, основанному на использовании антител и предназначенному для определения локализации белка в тканях. Ткань в большинстве случаев фиксируют, промывают, а затем пермеабилизируют. Затем ткань инкубируют с первичными антителами, специфически распознающими нужный белок (в данной ситуации, например, белок CFTR или белок NHE3). Добавляют вторичные антитела, соединенные с системой обнаружения. Системой обнаружения является, например, флуорохром или фермент, который в присутствии субстрата вызывает цветную реакцию. Это вторичное антитело распознает константную область Fc первичного антитела, причем оно должно происходить из видов, отличных от видов первичного антитела. После заключения в среду, защищающую флюоресценцию образца, в том случае, если это флуорохром, или в присутствии субстрата, в том случае, если это фермент, ткань исследуют, используя флуоресцентный или конфокальный микроскоп. Затем уровень экспрессии представляющего интерес белка может быть определен с помощью денситометрии (измерения оптической плотности), путем измерения интенсивности флуоресценции или с помощью спектрофотометрии.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью иммуноцитохимического анализа.

Иммуноцитохимический анализ является методом, сходным с иммуногистохимическим анализом, кроме того, что исходный образец является цитологическим препаратом, а не тканью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью масс-спектрометрии.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью RT-ПЦР.

RT-ПЦР состоит из обратной транскрипции РНК в ДНК с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР). RT-ПЦР предпочтительно является количественной RT-ПЦР, которая позволяет количественно определить исходную РНК, соответствующую нужному белку.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью нозерн-блоттинга.

Нозерн-блоттинг представляет собой метод, состоящий из разделения РНК в соответствии с размером с помощью гель-электрофореза, затем переноса РНК из геля на мембрану, где она может быть обнаружена с помощью меченого гибридизационного зонда, который является специфическим к РНК белка, который нужно определить количественно.

Биологический образец

Один метод согласно изобретению включает оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного транспортера, участвующего в абсорбции или секреции воды в толстой кишке, в частности на экспрессию белка CFTR и/или белка NHE3, в биологическом образце.

Использованный в описании термин "биологический образец" используется в его широком смысле. Биологический образец может быть любой биологической тканью, в которой экспрессируется представляющий интерес белок (в частности, белок CFTR или белок NHE3) и, следовательно, может быть обнаружен и количественно определен.

Биологическими образцами, которые могут использоваться при применении способа отбора согласно изобретению, могут быть, например, образцы кишечника, протоков поджелудочной железы, желчных протоков, почечных канальцев, трахеобронхиального дерева, половой системы, потовых желез и нефрон почки.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления биологический образец является образцом кишечника, предпочтительно, образцом толстой кишки.

Образец ткани предпочтительно получают от животной модели, например, с помощью биопсии. Животная модель предпочтительно является млекопитающим, например мышью, крысой, кроликом, свиньей, обезьяной, или цыпленком. Животное-модель может быть трансгенным животным.

Предпочтительным биологическим образцом согласно изобретению является образец ткани, содержащей колоноциты, т.е. клетки слизистой оболочки толстой кишки.

Биологический образец также может быть биологическим материалом, полученным из ткани, в которой экспрессируется представляющий интерес белок.

Полученный биологический материал, например, выбирают из клеток, выделенных из образца ткани, или из белков, экстрагированных из клеток, выделенных из образца ткани.

Термин "биологический образец" также включает клетки клеточной линии, экспрессирующей представляющий интерес белок, в частности белок CFTR и/или белок NHE3.

Примеры клеточных линий, экспрессирующих белок CFTR, включают Сасо-2 клетки, выделенные из толстой кишки, НТ-29 клетки, выделенные из толстой кишки, или Т84 клетки, выделенные из толстой кишки.

Примеры клеточных линий, экспрессирующих белок NHE3, включают Сасо-2 клетки, выделенные из толстой кишки, НТ-29 клетки, выделенные из толстой кишки, или Т84 клетки, выделенные из толстой кишки.

Эти клеточные линии имеются в продаже, например, от АТСС (Американская коллекция типовых культур).

В некоторых вариантах осуществления биологический образец является белковым экстрактом, выделенным из клеток или из тканей, экспрессирующих представляющий интерес белок, в частности белок CFTR и/или NHE3. Методы выделения белков хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, "Protein Methods", D.M. Bollag et al. 2^nd Ed., 1996, Wiley-Liss; "Protein Purification Methods: A Practical Approach", E.L. Harris and S. Angal (Eds.), 1989; "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", S. Roe, 2^nd Ed., 2001, Oxford University Press; "Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization", H. Ahmed, 2005, CRC Press: Boca Raton, FL). Кроме того, имеются коммерческие наборы для выделения белков из тканей или из биологических жидкостей. Такие наборы продают, например, компании BioRad Laboratories (Hercules, СА), BD Biosciences Clontech (Mountain View, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), Calbiochem (San Diego, CA), Pierce Biotechnology (Rockford, IL) и Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Специалисту в данной области техники ясно, как выбрать набор, наиболее подходящий для определенной ситуации.

Действие тестируемого штамма

В способе согласно изобретению воздействие тестируемого штамма на экспрессию транспортера, участвующего в абсорбции или секреции воды в толстой кишке, в частности белка CFTR и/или белка NHE3, определяется путем сравнения уровня экспрессии представляющего интерес белка, измеренного в биологическом образце, полученном от животного-модели, которого лечили тестируемым штаммом, и уровня экспрессии нужного белка, измеренного в биологическом образце (того же вида) полученном от животного-модели (того же вида), которое не подвергалось лечению тестируемым штаммом. Последнее из упомянутых животных называется контрольным животным.

Таким образом, например, при применении способа согласно изобретению, при котором биологический образец берется у животного-модели, установленное количество клеток, полученных культивированием тестируемого штамма, вводится животному-модели.

Данное количество клеток может быть введено однократно.

Альтернативно, данное количество клеток может быть введено несколько раз или в один и тот же день или в течение нескольких дней или недель.

Клетки, полученные культивированием тестируемого штамма, могут быть введены с помощью любого способа, подходящего для используемой животной модели. Например, введение может осуществляться с помощью инъекции, в частности внутрижелудочной инъекции, раствора или суспензии, содержащей подходящий разбавитель (среду) и установленное количество клеток, полученных культивированием тестируемого штамма. Такой же объем раствора, содержащего только разбавитель, вводится контрольному животному.

Более того, при применении способа согласно изобретению, в котором биологический образец является линией клеток, воздействие тестируемого штамма определяется путем сравнения уровня экспрессии интересующего белка, измеренного в клетках клеточной линии, которые были обработаны тестируемым штаммом, и уровня экспрессии нужного белка, измеренного в клетках (той же самой клеточной линии), которые не подвергались обработке тестируемым штаммом. Последние из упомянутых клетки называются контрольными клетками.

Таким образом, например, при применении способа согласно изобретению, в котором биологический образец представляет собой клеточную линию, клетки клеточной линии инкубируют с установленным количеством раствора или суспензии, содержащей подходящий разбавитель и установленное количество клеток, полученных при культивировании тестируемого штамма. Контрольные клетки клеточной линии инкубируют в тех же самых условиях в присутствии того же самого объема раствора, содержащего только разбавитель.

Методы культивирования штамма, является ли он дрожжевым штаммом или бактериальным штаммом, известны в данной области техники, при этом специалист в данной области техники знает, каким образом оптимизировать условия культивирования для каждого штамма в зависимости от природы.

Более того, специалист в данной области техники знает, как определить оптимальное количество клеток, полученных путем культивирования тестируемого штамма, предназначенных для введения животному-модели или для инкубации с клетками клеточной линии.

Например, клетки Bacillus subtilis получают культивированием штамма Bacillus subtilis в культуральной среде, в частности, как описано в книге Biotechnology, 5th edition, R. Scriban, Edition Tec. & Doc., 1999, ISBN: 2-7430-0309-X.

Как правило, метод получения клеток Bacillus subtilis культивированием штамма Bacillus subtilis включает стадии:

- посев в культуральную среду инокулума штамма Bacillus subtilis,

- культивирование в аэробных условиях для размножения клеток,

- отделение биомассы от культуральной среды для получения клеток Bacillus subtilis.

Полученные таким образом клетки Bacillus subtilis находятся преимущественно в вегетативной форме.

Выражение "преимущественно в вегетативной форме" означает, что по меньшей мере 70% клеток находятся в вегетативной форме, предпочтительно по меньшей мере 80% и более предпочтительно по меньшей мере 90%.

"Вегетативная форма" бактерии обозначает форму бактерии, помещенной в благоприятные условия.

Примером благоприятных условий является нелимитирующая культуральная среда при температуре и значении pH, благоприятных для размножения бактерий.

Нелимитирующая культуральная среда содержит все ингредиенты, необходимые для размножения клеток.

Способ получения клеток Bacillus subtilis также может включать промежуточную стадию размещения клеток в неблагоприятные условия, между стадией культивирования в аэробных условиях и стадией отделения биомассы. Клетки Bacillus subtilis, полученные в конце такого способа получения, преимущественно находятся в спорулирующей форме.

Выражение "преимущественно в спорулирующей форме" означает, что по меньшей мере 70% клеток находятся в спорулирующей форме, предпочтительно по меньшей мере 80% и более предпочтительно по меньшей мере 90%.

"Спорулирующая форма" бактерии обозначает форму бактерии, помещенной в неблагоприятные условия. Таким образом, спорулирующая форма является устойчивой формой, которая позволяет бактерии противостоять неблагоприятным условиям среды, таким как, например, отсутствие питательных веществ, т.е., лимитирующая питательная среда, недостаток воды, широкое колебание значений pH или температуры, или прохождение через пищеварительный тракт.

Неблагоприятные условия для клеток бактерий создают, например, не обновляя культуральную среду бактерий, прекращая поставку питательных веществ в культуральную среду, используя лимитирующую питательную среду, изменяя температуру, изменяя значение pH или их комбинацию.

Способ получения клеток Bacillus subtilis также может содержать дополнительную стадию высушивания клеток для получения клеток Bacillus subtilis в сухой форме.

Выражение "клетки Bacillus subtilis в сухой форме" означает, что биомасса, полученная в конце данного способа получения клеток Bacillus subtilis, содержит более 90% сухого вещества, предпочтительно более 95% сухого вещества.

Высушивание представляет собой, например, сушку лиофилизацией, сушку способом вихревого напыления или сушку распылением.

Установление пробиотического штамма, подходящего для лечения и/или предотвращения диареи

Путем сравнения уровня экспрессии интересующего белка, измеренного в образце, обработанном тестируемым штаммом, и уровня экспрессии интересующего белка, измеренного в контрольном образце, можно установить, вызывает ли тестируемый штамм уменьшение или увеличение экспрессии интересующего белка или оказывает ли он воздействие на указанную экспрессию.

Как было сказано выше, штамм, установленный с помощью метода отбора согласно изобретению и вызывающий уменьшение экспрессии по меньшей мере одного транспортера, участвующего в секреции воды в толстой кишке, и/или увеличение экспрессии по меньшей мере одного транспортера, участвующего в абсорбции воды в толстой кишке, является пробиотическим штаммом, который может использоваться при лечении и/или предотвращении диареи.

Изобретатели продемонстрировали, что такой пробиотический штамм способен вызывать абсорбцию воды, присутствующей в избытке в толстой кишке, и поэтому находит применение при лечении и/или предотвращении диареи.

"Уменьшение экспрессии транспортера, участвующего в секреции воды в толстой кишке", означает значимое уменьшение экспрессии указанного транспортера относительно его экспрессии при отсутствии тестируемого штамма.

"Значимый" характер этого уменьшения определяется с помощью статистического анализа.

В том случае, когда воздействие на экспрессию транспортера определяется с помощью иммуногистохимического анализа, "уменьшение экспрессии транспортера" соответствует значимому уменьшению интенсивности флуоресценции / мкм², что соответствует экспрессии указанного транспортера относительно экспрессии при отсутствии тестируемого штамма.

"Увеличение экспрессии транспортера, участвующего в абсорбции воды в толстой кишке", обозначает значимое увеличение экспрессии указанного транспортера относительно его экспрессии при отсутствии тестируемого штамма.

"Значимый" характер этого увеличения определяется с помощью статистического анализа.

В том случае, когда воздействие на экспрессию транспортера определяется с помощью иммуногистохимического анализа, "увеличение экспрессии транспортера" соответствует значимому увеличению интенсивности флуоресценции / мкм², что соответствует экспрессии указанного транспортера относительно экспрессии при отсутствии тестируемого штамма.

Специалисту в данной области техники понятно, что установление пробиотического штамма, пригодного для лечения и/или предотвращения диареи, может быть осуществлено с помощью только одного способа отбора согласно изобретению. Способ согласно изобретению может быть осуществлен при использовании биологического образца одного типа, например, данного животного-модели, или при использовании нескольких типов биологических образцов, например, клеточной линии, а затем по меньшей мере одного животного-модели.

Альтернативно, установление пробиотического штамма, способного воздействовать на абсорбцию воды в толстой кишке, может быть осуществлено с помощью способа отбора согласно изобретению, а затем дополнением этого выбора серией тестов и клинических испытаний, хорошо известных специалисту в данной области техники.

II. Применение пробиотического штамма для лечения и/или для профилактики диареи

Изобретение имеет отношение к какому-либо пробиотическому штамму, который установлен способом согласно изобретению, как способный вызвать абсорбцию воды, присутствующей в избытке в толстой кишке, и предназначается для применения при лечении и/или предотвращении диареи. Изобретение также имеет отношение к подобному пробиотическому штамму, который используется при производстве лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения диареи.

Как было отмечено выше, пробиотический штамм может быть любым штаммом микроорганизмов, в частности дрожжевым штаммом или бактериальным штаммом, таким как упомянутые выше штаммы.

В частности, изобретатели продемонстрировали, что штамм Bacillus subtilis CU1, размещенный на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745, является пробиотическим штаммом, который оказывает воздействие на абсорбцию избытка воды в толстой кишке, и поэтому может использоваться для лечения и/или предотвращения диареи.

Этот штамм был описан в документе FR 2837835, который раскрывает «живое вспомогательное средство (адьювант)», содержащее указанный штамм, для иммунизации на уровне гастроинтестинальной слизистой оболочки.

Изобретение также имеет отношение ко всем дрожжевым клеткам или бактериальным клеткам, полученным путем культивирования пробиотического штамма, установленного способом согласно изобретению и подходящего для лечения и/или предотвращения диареи.

Как было указано выше, условия культивирования штамма являются общеизвестными в данной области техники или могут быть легко определены специалистом в данной области.

В частности, данное изобретение имеет отношение к клеткам, полученным культивированием штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745, и предназначенным для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

"Клетки, полученные культивированием штамма Bacillus subtilis CU1, размещенные на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745", называются в дальнейшем "CU1 клетками".

Получение CU1 клеток может осуществляться, как описано выше.

CU1 клетки, используемые при лечении и/или предотвращении диареи, представляют собой клетки в спорулирующей форме и/или в вегетативной форме.

В предпочтительном варианте осуществления CU1 клетки преимущественно находятся в спорулирующей форме.

В предпочтительном варианте осуществления клетки CU1, используемые при лечении и/или предотвращении диареи, находятся в сухой форме.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения CU1 клетки, используемые для лечения и/или предотвращения диареи, преимущественно находятся в спорулирующей форме и в сухой форме.

Изобретение также имеет отношение к любому экстракту пробиотических дрожжевых клеток или экстракту пробиотических бактериальных клеток и любому фильтрату культуры пробиотического штамма, при этом экстракт или фильтрат обладает способностью вызывать уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3 и, следовательно, способен вызывать абсорбцию воды, присутствующей в избытке в толстой кишке.

Способ лечения и/или предотвращения диареи согласно изобретению включает введение пациенту эффективного количества дрожжевых клеток или бактериальных клеток, полученных культивированием пробиотического штамма, установленного описанным в данном документе способом. Эффективное количество дрожжевых клеток или бактериальных клеток, которое может вводиться в одной или более дозировках, определяется врачом. Точное количество, предназначенное для введения, может изменяться от пациента к пациенту, в зависимости от возраста, веса и общего состояния здоровья пациента, происхождения и тяжести диареи и т.д. Точное количество, предназначенное для введения, также может изменяться в зависимости от желаемого терапевтического эффекта (т.е. профилактики диареи или лечения диареи).

Способ введения, пероральный или парентеральный, может быть выбран в зависимости от происхождения диареи и/или в зависимости от возраста пациента и общего состояния здоровья.

В случае предотвращения диареи дрожжевые клетки или бактериальные клетки, полученные культивированием пробиотического штамма, установленного способом согласно изобретению, вводятся до появления симптомов.

В случае лечения диареи дрожжевые клетки или бактериальные клетки, полученные культивированием пробиотического штамма, установленного способом согласно изобретению, вводятся после появления симптомов.

В общем, любую форму диареи можно лечить с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных культивированием указанного пробиотического штамма, включая острые формы диареи и хронические формы диареи.

"Острая диарея" означает диарею, симптомы которой продолжаются менее двух недель, а "хроническая диарея" означает диарею, симптомы которой продолжаются по меньшей мере две недели, предпочтительно по меньшей мере один месяц.

Острая диарея включает, например, вирусный гастроэнтерит, бактериальный гастроэнтерит и пищевую интоксикацию (например, сальмонеллез, шигеллез, инфекции Staphylococcus aureus, инфекции Bacillus cereus, инфекции Escherichia coli).

Хроническая диарея включает, например, синдром пониженного всасывания, гастроэнтеропатию (глютеновую энтеропатию, болезнь Уипла, болезнь Крона и т.д.), моторную диарею (т.е. диарею в результате ускорения прохождения содержимого через кишечник), секреторную диарею (т.е. диарею, являющуюся результатом ускорения водно-электролитной секреции в тонком кишечнике и/или толстой кишке), осмотическую диарею (т.е. диарею, являющуюся результатом присутствия в желудочно-кишечном тракте растворенных веществ, которые плохо абсорбируются и вызывают осмотический эффект).

Другие виды диареи, которые можно лечить с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных культивированием пробиотического штамма согласно изобретению, включают диарею, являющуюся результатом беспокойства или сильных эмоций, диарею, являющуюся результатом пищевой непереносимости (например, лактозы коровьего молока, сорбитола, глютена и т.д.), диарею, являющуюся следствием некоторых видов лечения, например, лечения магнезией, радиотерапии или химиотерапии, или некоторых видов хирургического вмешательства, например, гастрэктомии или резекции подвздошной кишки, диарею, являющуюся следствием переполнения или раздражения желудка, кишечника, толстой кишки и т.д., диарею, являющуюся следствием отмены некоторых веществ, таких как героин, диарею, являющуюся результатом применения некоторых лекарственных средств, таких как антибиотики.

Другие примеры диареи, которые можно лечить с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных культивированием пробиотического штамма согласно изобретению, включают диарею, сопровождающую приступ разлития желчи или несварения желудка, диарею, являющуюся результатом чрезмерного потребления некоторых послабляющих продуктов питания, и диарею бегунов.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления диарея, которую лечат с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных культивированием пробиотического штамма согласно изобретению, не является диареей, вызванной введением антибиотика, или в более общем смысле введением лекарственного средства.

В других предпочтительных вариантах осуществления диарея, которую лечат с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных культивированием пробиотического штамма согласно изобретению, не является диареей инфекционного происхождения.

III. Композиции

Настоящее изобретение также имеет отношение к композиции, предназначенной для применения при лечении и/или предотвращении диареи, при этом указанная композиция содержит по меньшей мере один пробиотический штамм согласно изобретению, или конкретнее клетки, полученные культивированием такого штамма. В частности, композиция содержит эффективное количество клеток, полученных культивированием штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745.

Композиция согласно изобретению может являться пищевой композицией, биоактивной пищевой добавкой или фармацевтической композицией.

Пищевая композиция означает любой тип продукта, напитка или кондитерского изделия.

Пищевая композиция, например, может быть напитком, брикетированным зерновым концентратом, жевательной резинкой, шоколадом, молочным продуктом, таким как, кисломолочный продукт, изготовленный путем сбраживания продукт растительного происхождения.

"Биоактивная пищевая добавка" обозначает пищевой продукт, целью которого является дополнение нормальной диеты. Биоактивная пищевая добавка представляет собой концентрированный источник питательных веществ или других веществ, обладающих питательным или физиологическим действием, отдельно или в комбинации.

Биоактивная пищевая добавка поставляется на рынок в лекарственной форме, а именно в таких лекарственных формах, как капсула, пастилка, таблетка, пилюля и других подобных формах, пакетиках с порошком, ампулах с жидкостью, флаконах, снабженных капельницей, и других подобных формах жидких или порошкообразных препаратов, которые предназначаются для приема в измеренных единицах небольшого количества.

Композиция согласно изобретению, например, подходит для ежедневного употребления клеток, полученных культивированием пробиотического штамма, в количестве от 1⋅10⁸ KOE до 1⋅10¹¹ KOE, предпочтительно в количестве от 1⋅10⁹ KOE до 1⋅10¹⁰ KOE, в том случае, когда она предназначена для потребления человеком. Композиция согласно изобретению, например, подходит для ежедневного употребления клеток, полученных культивированием пробиотического штамма в количестве от 1⋅10⁵ KOE до 1⋅10¹¹ KOE, предпочтительно в количестве от 1⋅10⁶ KOE до 1⋅10¹⁰ KOE, в том случае, когда она предназначена применения в ветеринарии.

Термин KOE обозначает колониеобразующую единицу.

IV. Фармацевтические композиции

Вследствие прямого действия на транспортеры, связанные с регуляцией жидкости в кишечнике, пробиотический штамм, установленный методом изобретения или, конкретнее, дрожжевые клетки или бактериальные клетки, полученные культивированием такого штамма, могут использоваться в качестве терапевтического средства.

Эти дрожжевые или бактериальные клетки могут вводиться как таковые или в форме препарата или фармацевтической композиции в присутствии по меньшей мере одного физиологически приемлемого разбавителя (среды) или эксципиента. В контексте настоящего изобретения "физиологически приемлемый разбавитель или эксципиент" означает любую среду или добавку, которая не влияет на эффективность биологической активности активного компонента (в данном случае дрожжевых или бактериальных клеток), и которая не является слишком токсичной для пациента или субъекта при вводимых концентрациях. Физиологически приемлемый разбавитель или эксципиент может быть разбавителем или эксципиентом, подходящим для введения людям и/или животным (в частности млекопитающим).

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут вводиться с использованием любого эффективного сочетания дозировки и способа введения с целью получения желательного терапевтического эффекта. Точное количество, предназначенное для введения, может изменяться от пациента к пациенту, в зависимости от возраста, веса и общего состояния здоровья пациента, происхождения и тяжести диареи и т.д. Способ введения (оральный или парентеральный) может быть выбран в зависимости от происхождения диареи и/или в зависимости от возраста и/или состояния здоровья пациента.

В качестве примера, изобретение имеет отношение к определенной выше фармацевтической композиции, предназначенной для ежедневного использования клеток, полученных культивированием указанного пробиотического штамма в количестве от 1⋅10⁸ KOE до 1⋅10¹¹ KOE, предпочтительно в количестве от 1⋅10⁹ KOE до 10¹⁰ KOE, в том случае, когда она предназначена для потребления человеком.

Данное изобретение также имеет отношение к описанной выше фармацевтической композиции, предназначенной для ежедневного использования клеток, полученных культивированием указанного пробиотического штамма в количестве от 1⋅10⁵ KOE до 1⋅10¹¹ KOE, предпочтительно в количестве от 1⋅10⁶ KOE до 1⋅10¹⁰ KOE, в том случае, когда она предназначена для применения в ветеринарии.

Состав фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению может варьировать в зависимости от способа введения и дозировки, в которой будет использоваться композиция. После заключения в состав по меньшей мере с одним физиологически приемлемым разбавителем или эксципиентом, фармацевтическая композиция изобретения может находиться в любой форме, подходящей для введения млекопитающему, в частности человеку, например, в форме леденцов, таблеток, пилюль, покрытых сахаром, капсул, сиропа, мазей, инъецируемых растворов, суппозиториев и т.д. Специалист в данной области техники знает, как подобрать наиболее подходящие разбавители и эксципиенты для приготовления данного типа композиции. Таким образом, например, такие эксципиенты, как вода, 2,3-бутандиол, раствор Рингера, изотонические растворы хлорида натрия, синтетические моно- или диглицериды и олеиновая кислота часто используются при составлении инъекционных форм. Жидкие композиции, включая эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы, эликсиры и т.д., могут заключаться в состав в присутствии растворителей, солюбилизаторов, эмульгирующих веществ, масел, жирных кислот и других добавок, таких как суспендирующие вещества, консервирующие вещества, подсластители, ароматизирующие вещества, вещества изменяющие вязкость, окрашивающие вещества и т.д. Твердые композиции, предназначенные для введения пероральным путем, могут заключаться в состав в присутствии инертного эксципиента, такого как цитрат натрия, и необязательно таких добавок как связывающие вещества, увлажняющие вещества, разрыхлители, вещества, ускоряющие абсорбцию, смазывающие вещества и т.д.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению создается с целью немедленного высвобождения активного (действующего) компонента или активных компонентов, в частности дрожжевых клеток или бактериальных клеток, полученных культивированием пробиотического штамма. Альтернативно, фармацевтическая композиция может быть создана с целью продолжительного или адресного высвобождения активного компонента или активных компонентов или с целью защиты активного компонента или активных компонентов, например, от внутрижелудочной кислотности и ферментов.

Для этой цели можно использовать покрытия, устойчивые к pH и/или к действию желудочных ферментов, покрытия, чувствительные к значению pH и/или активности ферментов, или биоадгезивные покрытия, которые прилипают к стенкам желудка или кишечника, или можно использовать системы инкапсуляции.

Кроме того, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере один дополнительный активный фармацевтический ингредиент (т.е. в дополнение к дрожжевым или бактериальным клеткам, полученным культивированием пробиотического штамма).

"Активный фармацевтический ингредиент" обозначает какое-либо соединение или вещество, введение которого оказывает терапевтическое или благоприятное воздействие на состояние здоровья или общее состояние пациента или субъекта, которому он вводится.

Таким образом, активный фармацевтический ингредиент может быть активен в отношении предотвращения или лечения диареи путем введения фармацевтической композиции; может быть активен в отношении состояния или симптома, связанного с диареей (например, жара, рвоты или колик в животе); или может увеличивать доступность и/или активность активного компонента или активных компонентов фармацевтической композиции.

Примеры активных фармацевтических ингредиентов, которые могут присутствовать в композиции настоящего изобретения, включают, без ограничения, противовоспалительные средства, антибиотики, жаропонижающие средства, противорвотные средства, антигистаминные средства, витамины, спазмолитические средства и т.д.

В преимущественном варианте осуществления другой активный фармацевтический ингредиент не является штаммом Bacillus subtilis или клетками, полученными культивированием такого штамма, предпочтительно не является бактериальным штаммом или клетками, полученными культивированием такого штамма, более предпочтительно не является пробиотическим штаммом или клетками, полученными культивированием такого штамма.

Примером фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению является композиция, содержащая дрожжевые или бактериальные клетки, полученные культивированием пробиотического штамма, в качестве единственного активного фармацевтического ингредиента.

В предпочтительном варианте осуществления композиция согласно изобретению содержит клетки, полученные культивированием штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745, при этом исключается любой другой бактериальный штамм.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиция согласно изобретению содержит клетки, полученные культивированием штамма Bacillus subtilis CU1 размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745, при этом исключается любой другой бактериальный или дрожжевой штамм.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиция согласно изобретению содержит клетки, полученные культивированием штамма Bacillus subtilis CU1 размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745, в качестве единственного фармацевтически активного ингредиента.

Если они не определены иначе, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют такое же значение, которое обычно понятно среднему специалисту в той области техники, к которой относится изобретение. Более того, все публикации, патентные заявки, все патенты и все другие ссылки, сделанные в описании, включаются в описание путем отсылки.

Примеры

Следующие примеры описывают некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Однако должно быть понятно, что данные примеры предоставляются только с целью иллюстрации и не ограничивают каким-либо образом объем данного изобретения.

Описание чертежей

Фиг. 1. Результат воздействия штамма Bacillus subtilis CU1 на экспрессию в толстой кишке белка CFTR. Показана интенсивность флуоресценции / мкм² для контроля (белый) и после лечения CU1 (черный). *Р<0.005

Фиг. 2. Результат воздействия штамма Bacillus subtilis CU1 на экспрессию в толстой кишке белка NHE3. Показана интенсивность флуоресценции / мкм² для контроля (белый) и после лечения CU1 (черный). *Р<0.005

Фиг. 3. Отсутствие воздействия штамма Lactobacillus plantarum на экспрессию в толстой кишке белка CFTR. Показана интенсивность флуоресценции / мкм² для контроля (белый) и после лечения LR (черный). *Р<0.005

Фиг. 4. Отсутствие воздействия штамма Lactobacillus plantarum на экспрессию в толстой кишке белка NHE3. Показана интенсивность флуоресценции / мкм² для контроля (белый) и после лечения LR (черный). *Р<0.005

Фиг. 5. Вода, выведенная (в мг) в фекалии за 60 минут (черный) и в пределах от 60 до 120 минут (белый) после внутривенного введения LPS (15 мг/кг) или физиологического раствора мышам (среднее значение ± SEM, n=10-20). Т-: мыши, без лечения CU1, которые получили инъекцию физраствора; Т+: мыши, без лечения CU1, которые получили инъекцию LPS; T-/CU1: мыши, леченные CU1, которые получили инъекцию физраствора, T+/CU1: мыши, леченные CU1, которые получили инъекцию LPS. * Р<0.05 vs Т-; Р<0.05 vs Т+

Фиг. 6. Вода, выведенная (в мг) в фекалии за 60 минут (черный), в пределах от 60 до 120 минут (серый) и в пределах от 120 и 180 минут (белый) после внутрижелудочного введения касторового масла (200 мкл) или физиологического раствора мышам (среднее значение ± SEM, n=10-19). Т-: мыши, без лечения CU1, которые получили инъекцию физраствора; Т+: мыши, без лечения CU1, которые получили инъекцию касторового масла; T-/CU1: мыши, леченные CU1, которые получили инъекцию физраствора, T+/CU1: мыши, леченные CU1, которые получили инъекцию касторового масла. * Р<0.05 vs Т-; Р<0.05 vs Т+

Пример 1. Отбор пробиотических штаммов, предназначенных для предотвращения и/или лечения диареи

Материалы и методы

Протестированные пробиотические штаммы.

Были протестированы следующие штаммы: штамм Lactobacillus plantarum и штамм Bacillus subtilis CU1.

Клетки Bacillus subtilis CU1 (в дальнейшем CU1) используются в спорулирующей форме и в сухом состоянии.

Клетки Lactobacillus plantarum (в дальнейшем LR) использовали в лиофилизированной, вегетативной форме.

Количественное определение эффекта пробиотического штамма на экспрессию CFTR и NHE3.

Четырех мышей обрабатывали в течение 2 недель, каждую 10⁹ KOE /день CU1.

Четырех мышей обрабатывали в течение 2 недель, каждую 10⁹ KOE / день LR.

Четырех мышей без воздействия CU1 использовали в качестве контроля.

Экспрессию CFTR и NHE3 количественно определяли с помощью иммуногистохимического анализа колоноцитов, полученных от мышей, леченных CU1, и от контрольных мышей, как описано ниже.

Сразу после умерщвления мышей брали образцы проксимального отдела толстой кишки (1 см длиной), промывали их раствором 0.9% NaCl, фиксировали в буферном растворе при содержании 4% формальдегида (6 час) и погружали в 30% раствор сахарозы на 24 часа при 4°С.

Образцы фиксировали в среде Tissue Tek medium (Euromedex, Souffelweyersheim, France) и замораживали в изопентане при -45°С. Затем криостатные срезы фиксировали ацетоном (10 минут, -20°С) и увлажняли в фосфатно-солевом буферном (PBS) - молочном растворе. После инкубации в блокирующем растворе (PBS с 0.25% Тритона Х-100, содержащий 0.1% бычьего сывороточного альбумина (BSA)), срезы инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьими анти-мышиными CFTR (1/100), анти-мышиными NHE3 (1/200) или анти-мышиными TLR4 (1/100) поликлональными антителами (Abcam, Cambridge, UK). Затем срезы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с FITC-мечеными ослиными анти-кроличьими антителами (1/2000, Uptima, , Франция). Затем срезы помещали в заливочную среду "Vectashield HardSet mounting medium" (Abcys, Les Ulis, Франция) и исследовали под флуоресцентным микроскопом Nikon 90i (Nikon, Champigny-sur-Marne, Франция). Интенсивность флуоресценции / мкм² иммуномечения измеряли с помощью программного обеспечения Nis-Elements Ar (Nikon). Проводили исследование пяти срезов от группы, содержащей 4 мышей.

Результаты

Было обнаружено, что из числа протестированных пробиотических штаммов только штамм CU1 Bacillus subtilis оказывает воздействие на экспрессию двух транспортеров CFTR и NHE3, которые участвуют в передвижении воды через слизистую оболочку толстой кишки. Фактически, как показано на фиг. 1, лечение мышей в течение двух недель штаммом Bacillus subtilis CU1 привело к значительному уменьшению экспрессии CFTR на апикальном полюсе колоноцитов в толстой кишке здоровых мышей. И как показано на фиг. 2, лечение мышей в течение двух недель штаммом Bacillus subtilis CU1 привело к значительному увеличению экспрессии NHE3 на апикальном полюсе колоноцитов в толстой кишке здоровых мышей.

В противоположность этому, как показано на фиг. 3 и 4, лечение штаммом L. plantarum незначительно изменяло экспрессию CFTR или NHE3.

Пример 2. Использование пробиотического штамма CU1 для предотвращения и/или лечения диареи

Материал и методы

Модель LPS-индуцированной диареи

Пробиотический штамм (10⁹ KOE/ день/животное) вводили внутрижелудочным путем самцам мышей DBA/2 в течение 14 дней.

Мышей контрольной группы (12 мышей) обрабатывали 200 мкл воды, которую вводили внутривенно, а мышам в тестируемой группе (12 мышей) внутривенно вводили липополисахарид (LPS) Salmonella enteriditis (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Франция) в дозе 15 мг/кг, чтобы вызвать диарею. Мышей размещали в индивидуальные клетки, в которых пол был покрыт слоем алюминия для обеспечения возможности сбора фекалий каждые 30 минут в течение 120 минут после инъекции LPS. Собранные фекалии взвешивали, нагревали при 100°С в течение 24 часов и взвешивали повторно. Разница между влажной массой фекалий (до нагревания) и сухой массой соответствует выведению (экскреции) из организма воды. Диарею оценивали относительно экскреции общего количества воды после введения LPS.

Модель диареи, вызванной касторовым маслом

Пробиотический штамм (10⁹ KOE/ день/животное) вводили внутрижелудочным путем самцам мышей NMRI в течение 14 дней.

Мышей контрольной группы (12 мышей) обрабатывали 200 мкл воды, которую вводили внутрижелудочным путем. Для того чтобы вызвать диарею, "тестируемой" группе (12 самцов мышей NMRI) внутрижелудочным путем вводили 200 мкл касторового масла (Sigma). Мышей размещали в индивидуальные клетки, в которых пол был покрыт слоем алюминия для обеспечения возможности сбора фекалий каждые 30 минут в течение 180 минут после введения касторового масла. Собранные фекалии взвешивали, нагревали при 100°С в течение 24 часов и взвешивали повторно. Разница между влажной массой фекалий (до нагревания) и сухой массой соответствует выведению (экскреции) из организма воды. Диарею оценивали относительно экскреции общего количества воды после введения касторового масла.

Модель диареи, вызванной антибиотиком

Животная модель диареи, вызванной антибиотиками, создавалась с помощью уменьшенного количества антибиотиков (на основе работы Chen et al. 2008, Gastroenterology, 135(6): 1984-92). Введение антибиотиков вызывает дисбиоз (нарушает равновесие) флоры, а также иммунный ответ и изменение количества клеток, продуцирующих слизь, в кишечнике мыши. В частности, лечение антибиотиками может вызвать появление Clostridium difficile.

Профилактическое лечение штаммом CU1 было протестировано на этой модели при использовании 10⁹ KOE/день/животное в течение 14 дней и 18 дней на группах из 5 мышей. Через 7 дней введения штамма CU1 вводили смесь из 5 антибиотиков в питьевой воде в течение 3 дней, затем на следующий день мыши получали антибиотики в виде внутрибрюшинной инъекции клиндамицина. Эффект лечения отмечали на 14 и 18 дни после начала эксперимента. Мыши, которых лечили штаммом CU1, получали штамм на всем протяжении тестирования.

Результаты

Штамм Bacillus subtilis CU1 был исследован на различных моделях диареи у мышей.

Антидиарейные свойства штамма Bacillus subtilis CU1

Как показано на фиг. 4 и 5, было обнаружено, что штамм CU1 в значительной степени предотвращает диарею, вызванную LPS (фиг. 5) и касторовым маслом (фиг. 6).

Фактически, введение клеток CU1 в значительной степени уменьшало количество воды, выделенной в фекалии в течение первого часа после введения LPS (в 4 тестах уменьшение составляло 35%, 38%, 36% и 40%).

Введение клеток CU1 значительно уменьшало количество воды, выделенной в фекалии в течение 2-ого часа на модели диареи, вызванной касторовым маслом (в 3 тестах уменьшение составляло 63%, 46%, 44%).

Штамм CU1 также оказывал профилактическое действие в отношении диареи, вызванной введением антибиотиков. Этот эффект наблюдался после профилактического лечения CU1 клетками: затем мыши демонстрировали нормализацию кишечной микробиоты и улучшение изменений, вызванных антибиотиками, на уровне продуцирующих слизь клеток слизистой оболочки кишки и на уровне макрофагов.

Сравнение с эффектом лоперамида

Было обнаружено, что профилактическое лечение штаммом CU1 в течение 15 дней уменьшает диарею, вызванную LPS или касторовым маслом с такой же эффективностью, как лоперамид (эталонная антидиарейная молекула), введенный в однократной дозе (1 мг/кг) пероральным путем за один час до инициирования диареи. Лоперамид дает в результате 50% уменьшение экскреции воды после LPS (40% для CU1) и 60% после касторового масла (60% для CU1).

Выводы

In vivo штамм Bacillus subtilis CU1 может улучшить абсорбционную способность толстой кишки при состоянии избытка жидкости.

Дополнительные исследования показали, что штамм Bacillus subtilis CU1:

- не влияет на секреторную/абсорбционную способность тонкой кишки на модели с касторовым маслом и модели с LPS,

- отменяет увеличение парацеллюлярной проницаемости, вызванной LPS на уровне стенок толстой кишки, однако не той проницаемости, которая вызвана касторовым маслом,

- уменьшает стремительное отхождение, вызванный касторовым маслом на уровне стенок толстой кишки, что свидетельствует об усилении способности толстой кишки абсорбировать воду в ситуации диареи, вызванной слабительным - касторовым маслом (а не в исходной ситуации).

Таким образом, штамм Bacillus subtilis CU1 и клетки, полученные культивированием этого штамма, пригодны для лечения и/или предотвращения любого типа диареи.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ отбора пробиотического штамма Bacillus, включающий оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR или белка NHE3; пробиотический штамм Bacillus subtilis, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, депонированный в CNCM под регистрационным номером I-2745; клетки, полученные путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, и композиция, содержащая эффективное количество клеток, для применения при лечении и/или предотвращении диареи. Изобретения обеспечивают регулирование абсорбции воды в толстой кишке при лечении и/или профилактике диареи. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 пр.

1. Способ отбора пробиотического штамма для лечения и/или предотвращения диареи, указанный способ включает следующие стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного белка CFTR или белка NHE3 и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, где пробиотическим штаммом является штамм Bacillus.

2. Способ отбора по п. 1, отличающийся тем, что штамм Bacillus является штаммом Bacillus subtilis.

3. Способ отбора по п. 1 или 2, отличающийся тем, что экспрессия белка CFTR и/или белка NHE3 измеряется с помощью электрофореза, вестерн-блоттинга, иммуноанализа, иммуногистохимического анализа, иммуноцитохимического анализа, масс-спектрометрии, ОТ-ПЦР или нозерн-блоттинга.

4. Пробиотический штамм Bacillus, отобранный способом по п. 1 или 2, где указанный штамм вызывает уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, предназначенный для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

5. Пробиотический штамм Bacillus, предназначенный для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 4, отличающийся тем, что пробиотический штамм Bacillus является штаммом Bacillus subtilis CU1, размещенным на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745.

6. Пробиотический штамм Bacillus, предназначенный для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 4, где диарея является острой диареей или хронической диареей.

7. Пробиотический штамм Bacillus, предназначенный для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 6, где диарея является диареей инфекционного происхождения или диареей неинфекционного происхождения.

8. Пробиотический штамм Bacillus, предназначенный для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 5, где диарея является острой диареей или хронической диареей.

9. Пробиотический штамм Bacillus, предназначенный для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 8, где диарея является диареей инфекционного происхождения или диареей неинфекционного происхождения.

10. Клетки, полученные путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, отобранного способом по п. 1 или 2, который вызывает уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, предназначенные для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

11. Клетки, предназначенные для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 10, отличающиеся тем, что пробиотический штамм Bacillus является штаммом Bacillus subtilis CU1, размещенным на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745.

12. Клетки, предназначенные для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 10, где диарея является острой диареей или хронической диареей.

13. Клетки, предназначенные для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 12, где диарея является диареей инфекционного происхождения или диареей неинфекционного происхождения.

14. Клетки, предназначенные для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 11, где диарея является острой диареей или хронической диареей.

15. Клетки, предназначенные для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 14, где диарея является диареей инфекционного происхождения или диареей неинфекционного происхождения.

16. Композиция, содержащая эффективное количество клеток, полученных путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, отобранного способом по п. 1 или 2, который вызывает уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, предназначенная для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

17. Композиция, предназначенная для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 16, отличающаяся тем, что пробиотический штамм Bacillus является штаммом Bacillus subtilis CU1, размещенным на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745.

18. Композиция, предназначенная для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 16, где диарея является острой диареей или хронической диареей.

19. Композиция, предназначенная для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 18, где диарея является диареей инфекционного происхождения или диареей неинфекционного происхождения.

20. Композиция, предназначенная для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 17, где диарея является острой диареей или хронической диареей.

21. Композиция, предназначенная для применения при лечении и/или предотвращении диареи, по п. 20, где диарея является диареей инфекционного происхождения или диареей неинфекционного происхождения.