Гидрогель для замещения дефектов биологических тканей Российский патент 2018 года по МПК A61K31/198 A61K31/715 A61K33/00 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии и регенеративной медицине, и может быть использовано для заместительной, реконструктивной и регенеративной хирургии.

Обширные повреждения внутренних органов восстанавливаются в ограниченном объеме, на их месте, как правило, формируется соединительнотканный рубец, что обусловлено низкой пролиферативной активностью зрелых клеток, особенностями архитектоники повреждаемой биологической ткани и особенностями межклеточного матрикса в постнатальном периоде онтогенеза. В частности, обращает на себя внимание ограниченная способность поперечно-полосатой скелетной мускулатуры к самостоятельной регенерации, что оправдывает необходимость в разработке методик ее артифициального восстановления.

Перспективным направлением для восстановления обширных дефектов биологических тканей, в том числе мышечной, является их заполнение гидрогелем, который с одной стороны может выполнять функцию каркаса для пролиферирующих клеток, а с другой быть носителем для различных лекарственных препаратов и даже стволовых клеток (Севастьянов В.И. Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2014. №3. С. 93-108).

Известен инъекционный гетерогенный биополимерный гидрогель на основе гидролизата эмбриональных или постнатальных коллагенсодержащих тканей животного происхождения (Севастьянов В.И., Перова Н.В. Инъекционный гетерогенный биополимерный гидрогель для заместительной и регенеративной хирургии и способ его получения // Патент России №2433828, 20.11.2011. Бюл. №32). Важнейшим недостатком данного гидрогеля, а также аналогичных продуктов, в состав которых входит коллаген, является непредсказуемая по срокам их биодеградация, зависящая от индивидуальных особенностей организма, зачастую время существования гидрогелевой матрицы недостаточно для формирования полноценного регенеранта.

Известен биоактивный резорбируемый пористый 3d-матрикс для регенеративной медицины получаемый на основе полилактида (Севастьянов В.И., Попов В.К. Биоактивный резорбируемый пористый 3d-матрикс для регенеративной медицины и способ его получения // Патент России №2533457, 20.11.2014. Бюл. №32).

Важнейшим недостатком данного матрикса является необходимость его хирургической имплантации в пораженную ткань или орган, в то время как инъекционное введение гидрогелей является низкоинвазивным. Преимуществом инъекционно вводимых гидрогелей, в отличие от предложенного матрикса, является равномерное заполнение ими всего объема дефекта биологической ткани, а также удобство применения.

Известен также биодеградируемый полимерный гидрогель на основе таксанов (Власов Г.П., Палтуев P.M., Семиглазов В.Ф. Биодеградируемый полимерный носитель для постановки противоопухолевого лекарственного средства (варианты) // Патент России №2493848, 27.09.2013. Бюл. №27). Предложенный гидрогель на основе таксанов выступает как эффективная система по доставке лекарственных препаратов в пораженный орган.

Главным недостатком гидрогеля на основе таксанов, является невозможность его использования в качестве каркаса для пролиферации клеток и регенерации органа.

Известен также гидрогель карбоксиалкиламида хитозана (Ложье Э., Гуше Ф., Перро Ж-П. Гидрогель карбоксилалкиламида хитозана, его приготовление и применение в косметологии и дерматологии // Патент России №2476201, 27.02.2013. Бюл. №6).

Важнейшим недостатком данного гидрогеля является его несостоятельность в качестве конструкта для пролиферации клеток паренхимы внутренних органов, он используется как препарат для местного применения при лечении ожогов кожи.

Ближайшим аналогом предлагаемого гидрогеля является биогель альгината натрия с добавлением хитозана (Юсова А.А., Гусев И.В., Липатова И.М. Свойства гидрогелей на основе смесей альгината натрия с другими полисахаридами природного происхождения // Химия растительного сырья, 2014, №4, с. 59-66). В состав данного биогеля входят альгинат натрия и сукцинилированный хитозан.

Альгинат натрия - порошок белого цвета, по химической формуле представляет собой семейство неразветвленных двойных сополимеров: остатков β-D-маннуроновой кислоты и α-L-гулуроновой кислоты, соединенных 1→4 гликозидными связями. При добавлении воды превращается в гелеобразную массу.

Сукцинилированный хитозан - карбоксил-содержащее водорастворимое производное хитозана, получаемое по реакции N-ацилирования путем обработки хитозана янтарным ангидридом в его уксусном растворе. Гетерополимер D-глюкозоамина и N-ацетил-D-глюкозоамина, соединенных 1,4-β-гликозидной связью, хитозан обладает антибактериальными, антигрибковыми, антивирусными и иммуномодулирующими свойствами, может быть использован как компонент гелевых композиций, как доставщик лекарственных веществ.

Основным недостатком биогеля на основе альгината натрия с добавлением хитозана является: отсутствие добавок, оказывающих влияние на пролиферацию клеток, что способствует заселению гелевого имплантата фибробластами. Так, внутримышечное введение биогеля на основе альгината натрия и сукцинилированного хитозана сопровождается образованием соединительнотканной капсулы вокруг имплантата, что значительно затрудняет заселение его клетками паренхимы задействованного органа.

Задачи: Улучшить регенерацию биологических тканей путем введения гидрогеля образующего в области места повреждения каркас для регенерации пораженного органа. Разработать биосовместимый гидрогель, устойчивый к спонтанной биодеградации, контролируемыми механическими свойствами и архитектоникой образующегося в тканях, после введения геля, тканеинженерного конструкта.

Гидрогель для замещения дефектов биологических тканей, в качестве основного компонента, включает альгинат натрия с модифицирующими добавками (D-аспарагин и силикат натрия (или силикат калия), что, в отличие от биогеля на основе альгината натрия с добавлением хитозана, позволяет регулировать скорость биодеградации, механические свойства и морфологию образующегося в тканях, после введения геля, тканеинженерного конструкта.

Гидрогель, предлагаемый для заполнения дефектов биологических тканей, в том числе крупных мышечных дефектов, состоит из (в мас.%):

- альгинат натрия от 5% до 10% по массе

- D-аспарагин от 0,01% до 1% по массе

- силикат натрия (или силикат калия) от 0,05% до 1% по массе

- остальное - высокоочищенная вода.

Разброс массовых долей компонентов препарата обусловлен различием к предъявляемым требованиям по структурным и механическим характеристикам гидрогелевого имплантата. Повышение содержания альгината натрия в пределах предложенных мас.% позволяет увеличить плотность, прочность, а также сократить размер ячеек формирующегося в тканях, после введения гидрогеля, конструкта. Варьируя процентное содержание альгината натрия, можно заполнять дефекты разных по своим механическим свойствам и строению тканей.

С ростом содержания D-аспарагина, обладающего антипролиферативными свойствами, увеличивается временной отрезок от имплантации гидрогеля до заселения его клетками, что препятствует его инкапсуляции соединительнотканной оболочкой и тормозит массивное заселение образующегося конструкта пролиферирующими фибробластами.

С ростом содержания силиката натрия (или силиката калия) в образующемся после имплантации гидрогеля конструкте, увеличивается содержание кремниевых кислот, которые повышают прочность и значительно продлевают время существования образующегося в тканях полимерного каркаса, предназначенного для заселения клетками регенерирующей ткани.

Техническим результатом изобретения является внутримышечное введение гидрогеля на основе альгината натрия, D-аспарагина и силиката натрия (или силиката калия), что проявляется на 40-е сутки от начала исследования наличием мелкоячеистого конструкта, с единичными клетками, находящимися в стенках его ячеек, на границе имплантата видны клетки с удлиненными ядрами, по морфологии сходные с миоцитами, признаков образования фиброзной капсулы вокруг имплантата не выявлено.

Таким образом, применение имплантатов на основе предлагаемого альгинатного геля модифицированного силикатом натрия (или силикатом калия) с добавкой D-аспарагина перспективно для разработки нового метода лечения грубых дефектов мышечной ткани.

Основными компонентами гидрогеля являются альгинат натрия, D-аспарагин и силикат натрия (или силикат калия):

Натрия альгинат - Химическая формула: (C6H7O6Na)n. Представляет собой соль альгиновой кислоты, натуральный полисахарид, добываемый из красных и бурых морских водорослей. В готовом виде он выглядит как светло-бежевый порошок, прекрасно впитывающий воду. Именно гигроскопичность натрия альгината позволяет эффективно использовать его в качестве удерживающего влагу агента, а также гелеобразователя, стабилизатора и вещества для капсулирования лекарств.

D-аспарагин - Химическая формула D-аспарагина: C4H8N2O3. D-аспарагин представляет собой белый кристаллический порошок без запаха, растворимый в воде, химическое название - правовращающий изомер моноамида аспарагиновой кислоты.

Силикат натрия - Химическая формула: Na2SiO3. Представляет собой белый мелкодисперсный порошок без определенного вкуса и запаха. Растворяясь в воде, образует вязкий раствор. В разбавленных растворах силикат натрия распадается на анионы кремниевой кислоты и катионы натрия. Под действием на силикат натрия кислот образуются кремниевые кислоты, степень полимеризации которых зависит от условий протекания химической реакции.

Силикат калия - Химическая формула: K2SiO3. Представляет собой белый мелкодисперсный гигроскопичный порошок без определенного вкуса и запаха. Растворяясь в воде, образует вязкий раствор. В разбавленных растворах силикат калия распадается на анионы кремниевой кислоты и катионы калия. Под действием на силикат калия кислот образуются кремниевые кислоты, степень полимеризации которых зависит от условий протекания химической реакции.

Препарат получают путем растворения 0,5-1 г порошка D-аспарагина в 50 мл высокоочищенной воды в термостате при 40°C, далее к полученной смеси при постоянном помешивании добавляют 5-10 г порошка альгината натрия, полученную смесь выдерживают в термостате при 45°C в течение суток. Далее проводят растворение 0,05-1 г силиката натрия (или силиката калия) в 30 мл высокоочищенной воды. Затем проводят смешивание приготовленных раствором, полученную смесь доводят до 100 мас.% высокоочищенной водой и обрабатывают в гомогенизаторе при 10 тыс. об/мин, в течение 30 минут, при обязательном охлаждении стакана гомогенизатора на ледяной бане. На заключительном этапе препарат выдерживают в термостате при 45°C в течение 12 часов, затем гидрогель готов к использованию.

Препарат апробирован на 24 белых нелинейных самцах крыс средней массой 272±15 грамм, с помощью внутримышечной инъекции в левую бедренную мышцу крыс вводили полученный гидрогель, далее, под влиянием катионов кальция, содержащихся в биологических жидкостях, происходила его полимеризация, с образованием ячеистого конструкта. Эвтаназию проводили на 40 сутки от начала исследования путем декапитации предварительно наркотизированных крыс. Мышцы фиксировали в 10% нейтральном растворе параформальдегида. Выполняли проводку образцов через изопропанол, с последующей заливкой в парафин. Парафиновые блоки нарезали на срезы толщиной 10 мкм на микротоме МПС-2 (СССР). Окрашивание микропрепаратов проводили гематоксилином и эозином.

На микропрепаратах мышечной ткани, полученных от крыс, получивших внутримышечную инъекцию препарата, на границе с геля с мышцей, в перемычках образующихся сетчатых структур каркаса появились единичные клетки с удлиненными ядрами (предположительно миоциты). Признаков наличия соединительнотканной капсулы вокруг имплантата не выявлено. Результаты эксперимента подтверждены на рис. 1 и 2, на которых прослеживается ячеистая структура образующегося после введения гидрогеля каркаса, расположенные в области стенок ячеек каркаса клетки с удлиненными ядрами.

Пример 1. Нелинейный самец крысы, массой 265 гр, получил инъекцию 0,5 мл препарата в мышцы правого бедра. Для операции применяли золетил-ксилазиновый наркоз. Эвтаназия была проведена на 40 сутки, после чего, с помощью экзартикуляции, от трупа отделяли правую заднюю конечность, затем удаляли с нее шкуру и голень. Мышцы бедра фиксировали в 10% нейтральном растворе параформальдегида. Выполняли проводку образцов через изопропанол, с последующей заливкой в парафин. Парафиновые блоки нарезали на срезы толщиной 10 мкм на микротоме МПС-2 (СССР). Окрашивание полученных гистологических срезов проводили гематоксилином и эозином, далее после обезвоживания в ряду спиртов микропрепарат заключали под покровное стекло с помощью полистироловой смолы. Приготовленный микропрепарат, сфотографировали с помощью камеры Levenhuk-230 (США). Результаты эксперимента подтверждены рис. 1 и 2, где рис. 1 показывает область сформировавшегося из введенного препарата сетчатого каркаса и расположенные рядом волокна поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани. На границе с мышцей, в перемычках сетчатого каркаса, видны единичные клетки с удлиненными ядрами (предположительно миоциты), фото сделано под увеличением в Х40 (окраска гематоксилином эозином). На рис. 2 виден сетчатый каркас с единичными клетками, расположенными в стенках его ячеек, прослеживаются отдельные участки, морфологически сходные с формирующимися мышечными волокнами, фото сделано под увеличением X100 (окраска гематоксилином эозином).

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, и может быть использовано для заместительной, реконструктивной и регенеративной хирургии. Описан гидрогель, содержащий, мас.%: альгинат натрия - 5-10; D-аспарагин - 0,01-1,0; силикат натрия или силикат калия - 0,05-1,0; остальное - высокоочищенная вода. Препарат позволяет получить на 40-е сутки внутримышечного введения мелкоячеистый конструкт, с единичными клетками, находящимися в стенках его ячеек, на границе имплантата видны клетки с удлиненными ядрами, по морфологии сходные с миоцитами. 1 пр., 2 ил.

Гидрогель для замещения дефектов биологических тканей, содержащий альгинат натрия, отличающийся тем, что гидрогель имеет, мас.%:

- Альгинат натрия - 5-10,

- D-аспарагин - 0,01-1,0,

- Силикат натрия или силикат калия - 0,05-1,0,

- Остальное - высокоочищенная вода.