Препарат для предотвращения образования глиальных рубцов Российский патент 2018 года по МПК A61K9/08 A61K31/198 A61P25/28 

Предлагаемое изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к неврологии и нейрохирургии, может быть использовано в комплексной терапии при остром повреждении спинного мозга различного генеза для предотвращения образования глиального рубца.

Ключевой причиной неблагоприятного прогноза в восстановлении неврологического дефицита у пациентов с острым повреждением спинного мозга является формирование глиального рубца на месте очага повреждения ткани спинного мозга. Глиальный рубец является как механическим, так и молекулярным (синтез веществ, тормозящих рост аксонов) барьером для прорастания аксонов дистально от очага повреждения (Бэр М. Нейропротекция. Модели, механизмы, терапия / М. Бэр - Москва. Бином Лаборатория знаний, 2014. - 436 с.).

Разработка препаратов, способных предотвратить образование глиального рубца, является перспективным направлением современной медицинской науки. Традиционно используемые в начальный период острого повреждения ЦНС нейропротективные и глиопротективные препараты, главной целью назначения которых является стимуляция регенерации ЦНС, не способны стимулировать эффективную регенерацию аксонов, ремиелинизацию проводящих путей ЦНС и предотвратить формирование глиального рубца (Бэр М. Нейропротекция. Модели, механизмы, терапия / М. Бэр - Москва. Бином Лаборатория знаний, 2014. - 436 с.).

До настоящего времени для решения проблемы неврологического дефицита применялись методы, направленные на активацию аксонального роста и восстановление непрерывности проводящих путей в поврежденном спинном мозге за счет имплантации в зону перерыва коллагенового матрикса «Сферо®ГЕЛЬ», трансплантации различных экзогенных материалов, участков периферического нерва, ганглиев, интратекальной трансфузии аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (Бэр М. Нейропротекция. Модели, механизмы, терапия / М. Бэр - Москва. Бином Лаборатория знаний, 2014. - 436 с.).

Но даже при использовании эффективных стимуляторов регенерации нервной ткани глиальный рубец на месте очага повреждения спинного мозга формируется быстрее, чем регенерируют аксоны. Таким образом, растущие аксоны «упираются» в образованный рубец и реиннервации дистальных от очага повреждения нервной ткани участков спинного мозга не происходит.

Не вызывает сомнений предотвращение глиозной трансформации спинного мозга после его острого повреждения.

Существующие подходы, направленные на предотвращение образования глиального рубца, подразделяют на 2 группы: 1) использование средств, воздействующих на клетки в области очага повреждения спинного мозга (цитостатики, моноклональные антитела к цитокинам, участвующие в развитии глиоза и их рецепторов, низкодозовое рентгеновское излучение); 2) препараты, модифицирующие состав межклеточного матрикса (бактериальная хондроитиназа, 2-2'-дипиридин - хелатор железа и ингибитор отложения коллагена IV, моноклональные антитела, нейтрализующие активность ингибиторного миелинового белка Nogo-A) (Бэр М. Нейропротекция. Модели, механизмы, терапия / М. Бэр - Москва. Бином Лаборатория знаний, 2014. - 436 с.).

За ближайший аналог нами приняты препараты из группы антиметаболитов. В основном препараты данной группы содержат 0,05 г активного вещества и вспомогательные вещества: желатин; крахмал картофельный; сахар молочный; кальция стеарат. Препараты представляют собой структурные аналоги аденина, гипоксантина и гуанина, входящие в состав нуклеиновых кислот. Их действие направлено на ингибирование критических процессов, необходимых для протекания репликации ДНК и деления клетки. Основной их областью применения является онкология, но в связи с выраженной иммуносупрессивной и противовоспалительной активностью также применяются в ревматологии, а также в трансплантологии.

Каждый из перечисленных ранее подходов, направленных на торможение образования глиального рубца, имеет определенные недостатки: низкая эффективность действия, низкая специфичность, серьезные побочные эффекты, высокая стоимость и низкая доступность.

Основными недостатками цитостатической терапии являются: высокая токсичность, ингибирование митотических реакций как в растущих (молодых), так и в зрелых клетках. (Антосюк О.Н., Марвин А.М., Марвин Н.А. Сравнительный анализ воздействия цитостатических препаратов на нестабильность генома Drosophila melanogaster // Биомедицина. 2014. №3 С. 83-91.)

Задачи:

1) Устранение неблагоприятных побочных эффектов (токсичность, ингибирование митотических реакций, снижение себестоимости, повышение эффекта, предотвращение образования глиальных рубцов);

2) Обеспечение эффективности и безопасности препарата;

3) Исключение дополнительного ввода различных веществ как вспомогательной терапии.

Предложенный препарат включает водный раствор D-аспарагина для внутривенного применения. Раствор содержит целевой компонент АК D-аспарагин в виде сухого порошка, на 1000 мл:

- АК D-аспарагин - 5 г,

- остальное - высокоочищенная вода.

Химическая формула D-аспарагина: C4H8N2O3, представляющий собой белый кристаллический порошок без запаха, хорошо растворимый в воде, химическое название моноамид аспарагиновой кислоты.

Препарат получают путем растворения 5 г сухого порошка D-аспарагина в 1000 мл высокоочищенной воды. После растворения препарат оставляют на 1 сутки в термостате при температуре 40°С, после чего его можно использовать.

Технической характеристикой действия препарата является: ингибирование пролиферации клеток D-аспарагином, что обусловлено тем фактом, что в незрелых глиоцитах отмечается низкая ферментативная активность систем по нейтрализации D-аспарагиновой кислоты, что позволяет при высоком уровне ее экзогенного поступления значительно затормозить белковый синтез и, как следствие, пролиферацию клеток глии (D'Aniello, А. & Giuditta, А. (1977). Identification of D-aspartic acid in the brain of Octopus vulgaris Lam. J. Neurochem. 29, 1053-1057). Антипролиферативные свойства D-аспарагина сравнимы лишь с эффектом при использовании цитостатической терапии, однако побочных эффектов, которые вызываются при ее использовании, в ходе эксперимента с D-аспарагином не было выявлено.

Эксперименты проведены на 60 белых нелинейных самцах крыс средней массой 346±75 г. Характеристика групп животных: группа №1 (интактные) - из 20 крыс, спинной мозг которых использован в качестве контрольного; группа №2 (сравнения) - из 20 крыс, которым воспроизводили фокальный фототромбоз кровеносных сосудов грудного отдела спинного мозга с последующим изъятием участка спинного мозга на 17 сутки; группа №3 (опытная) - из 20 животных, которым выполняли моделирование спинального инсульта с последующим внутривенным введением (в вены хвоста) 0,5% раствора D-аспарагина (курсовая доза 21,7 мг/кг) с 3 по 6 сутки и изъятием спинного мозга на 17 сутки.

Моделирование спинального инсульта проводили по модифицированной методике М. Von Euler, путем фототромбоза сосудов грудного отдела спинного мозга лазером с длиной волны 514 нм. В качестве фотосенсибилизатора использован эритрозин, для ингибирования фибринолиза применяли транексамовую кислоту (Von Euler М. Morphological characterization of the evolving rat spinal cord injury after photochemically induced ischemia // Acta Neuropathol. - 1997 Sep; 94(3). - P. 232-239). Для операции применялся золетил-ксилазиновый наркоз.

Эвтаназию крыс проводили на 17 сутки эксперимента. Забор спинного мозга проводили с помощью его выталкивания фосфатным буфером, вводимым через канюлю шприца на 10 мл, вставленную в поясничный отдел позвоночника (Kennedy H.S. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats // Lab Anim (NY). - 2011. - Feb; 40(2):53-7. doi: 10.1038/laban0211-53). После извлечения спинной мозг помещали в цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка (Kierman J.A. Histological and histochemical methods. Theory and practice. - London: Scion Publishing Ltd. - 2008. - 606 p.). Выполняли проводку полученных образцов через изопропанол-минеральное масло, с последующей их заливкой в парафин. Парафиновые блоки нарезали на срезы толщиной 10 мкм на микротоме МПС-2 (СССР). Окрашивание микропрепаратов проводили гематоксилином и эозином. Для фотографии микропрепаратов использовали микроскоп Микмед-5 (Россия) и окулярную камеру Levenhuk-230 (США). Для анализа фотографий микропрепаратов применяли фоторедактор GIMP2. Используя инструмент «сетка», проводили подсчет клеток по ячейкам наложенной на фото сетки, ячейки которой предварительно были откалиброваны с помощью объект-микрометра.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения «Statistica 10 version» фирмы «Stat Soft Inc.», с помощью параметров: медианы (Me), процентилей (р25 и р75), доверительного интервала 95 (ДИ 95). Для проверки гипотезы о гауссовом распределении показателей в исследуемых группах использовали критерий Шапиро-Уилка. В связи с тем, что распределение значений исследуемых показателей в группах отличалось от нормального, их сравнение проводили по непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова, с установлением уровня значимости *р≤0,05.

На микропрепаратах спинного мозга, полученных от крыс из группы №2 (без применения D-аспарагина), прослеживаются явления выраженной глиозной трансформации спинного мозга. В области проводящих путей наблюдается большое скопление клеток глии (предположительно астроцитов), образующих ячеистые структуры, что свидетельствует о процессе формирования глиального рубца в области очага фототромбоза сосудов спинного мозга (см. рисунок 1 при увеличении X100, рисунок 2, при увеличении Х400).

На микропрепаратах спинного мозга, полученных от крыс из группы №3 (с применением D-аспарагина), наблюдается маленький очаг глиоза, который незначительно нарушает ход проводящих путей. При этом в области очага фототромбоза сосудов грудного отдела спинного мозга, в сравнении с микропрепаратами из группы №2 (без применения D-аспарагина), видно значительно меньшее количество клеток глии, прослеживаются отдельные аксоны, проходящие сквозь область формирующегося глиального рубца (см. рисунок 3, при увеличении X100, 4, при увеличении Х400).

При сравнении численности клеток на микропрепаратах в области очага фототромбоза спинного мозга, полученных от крыс из группы №2 (D-аспарагин не применялся), и на микропрепаратах спинного мозга, полученных от крыс из группы №3 (использован D-аспарагин в курсовой дозе 21,7 мг/кг), видны значительные различия. Плотность распределения клеток глии в очаге фототромбоза на микропрепаратах спинного мозга у крыс из группы №3 (получали D-аспарагин) в три раза ниже в сравнении с данным показателем у крыс из группы №2 (без D-аспарагина), (р≤0,01). Таким образом, плотность распределения клеток в области очага фототромбоза спинного мозга на микропрепаратах из группы №3 (получали D-аспарагин) приближается к величине показателя, полученного в группе №1 (контроль), статистически значимой разницы количества клеток между группой №1 (контроль) и группой №3 (получали D-аспарагин) не выявлено (р≥0,01).

Пример. Нелинейный самец крысы массой 246 г был прооперирован с моделированием фототромбоза сосудов грудного отдела спинного мозга лазером с длиной волны 514 нм. Для операции применяли золетил-ксилазиновый наркоз. С 3 по 6 день после операции вводили 0,5% раствор D-аспарагина внутривенно в вены хвоста. Эвтаназия была проведена на 17 сутки, после чего, с помощью выталкивания фосфатным буфером, вводимым через канюлю шприца, вставленного в поясничный отдел, забирали спинной мозг. Затем выполнили проводку образца через изопропанол-минеральное масло, окрасили полученный микропрепарат, сфотографировали с помощью камеры Levenhuk-230 (США) и провели статистическую обработку полученных результатов с помощью программы «Statistica 10 version». Результаты эксперимента подтверждены рис. 3-4, где рис. 3 показывает область формирующегося глиального рубца, меньшую плотность клеток глии и частично сохраненные аксоны, проходящие сквозь область формирующегося глиального рубца под увеличением в XI00 (окраска гематоксилином эозином). На рис. 4 видны проходящие сквозь область рубца аксоны, под увеличением Х400 (окраска гематоксилином эозином).

Таким образом, внутривенное введение 0,5% раствора D-аспарагина в курсовой дозе 21,7 мг/кг с 3 по 6 сутки от начала экспериментального спинального инсульта, по данным гистологического исследования спинного мозга, проведенного на 17 сутки течения патологии, сопровождается значительно меньшей выраженностью процессов глиозной трансформации, в сравнении с крысами, D-аспарагин не получавших.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, в частности к неврологии и нейрохирургии, и представляет собой препарат для предотвращения образования глиальных рубцов, содержащий D-аспарагин и высокоочищенную воду, где на 1000 мл препарата содержится 5 г сухого порошка D-аспарагина, остальное - высокоочищенная вода. Изобретение обеспечивает значительное торможение белкового синтеза и, как следствие, пролиферации клеток глии, в результате чего достигается предотвращение образования глиальных рубцов, а также устранение таких побочных эффектов, как токсичность и ингибирование митотических реакций. 1 пр., 4 ил.

Препарат для предотвращения образования глиальных рубцов, содержащий целевой компонент D-аспарагин в сухом порошке, на 1000 мл:

D-аспарагин 5 г остальное высокоочищенная вода