КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ВНУТРИКОЖНОГО ВВЕДЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК A61K39/02 

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ ОБЛАСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной вакцинологии, а именно к комбинированным вакцинам для свиней. В частности изобретение относится к комбинированной вакцине для защиты от патогенной инфекции цирковирусом свиней типа 2 (PCV2) и Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), содержащей нереплицирующийся иммуноген PCV2 и нереплицирующийся иммуноген Mhyo. Вакцина характеризуется тем, что она представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния. В другом варианте осуществления изобретение относится к комбинированной вакцине для защиты от патогенной инфекции PCV2 и Mhyo посредством внутрикожного введения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Интенсивное свиноводство в настоящее время в значительной степени основывается на ветеринарных медицинских продуктах для поддержания животных здоровыми и для обеспечения экономичного функционирования. Помимо оптимизации корма и систем управления сельскохозяйственным производством, регулярно используются различные способы обработки: фармацевтические препараты, такие как гормоны или антибиотики, и вакцинация против бактериальных или вирусных патогенов. Некоторые из наиболее существенных заболеваний, поражающих свиней, начиная с молодого возраста и старше, вызываются бактериями, такими как Mycoplasma hyopneumoniae, и вирусами, такими как цирковирус свиней типа 2.

Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) является основным агентом, вызывающим энзоотическую пневмонию (у свиней), хроническое респираторное заболевание у свиней, присутствующее во всем мире. Молодые поросята являются особенно чувствительными к этому контагиозному заболеванию. Бактерия является относительно небольшой, лишена клеточной стенки и принадлежит роду Mollicutes. Эти бактерии ведут паразитический образ жизни на или в клетках-хозяевах. Легочное заболевание в результате Mhyo по большей части является иммуноопосредуемой патологией, ведущей к консолидированной пневмонии. Бактерия колонизирует и повреждает ресничный эпителий легких, что приводит к утрате активности ресничек. В зависимости от условий содержания и стресса, вызванного факторами внешней среды, наиболее проблематичным последствием этого заболевания является то, что оно предрасполагает к различным вторичным инфекциям респираторной системы свиней другими бактериальными и вирусными патогенами. Это дает начало так называемому комплексу респираторных заболеваний у свиней (PRDC), демонстрирующему тяжелые очаги повреждения в легких. Помимо дискомфорта для животного энзоотическая пневмония и PRDC вызывают важные экономические потери в свиноводстве вследствие снижения скорости роста и коэффициента усвоения корма, а также стоимости ветеринарного ухода и применения антибиотиков.

Цирковирус свиней 2 типа (PCV2) связан с мультисистемным синдромом истощения после отъема (PMWS), наблюдаемым у молодых свиней. Клинические признаки и патология были опубликованы в 1996 году и включают прогрессирующую слабость, диспноэ, тахипноэ и иногда иктеричность и желтуху. Новый агент был назван PCV2, в отличие от известного PCV, который был естественным заражающим агентом клеток PK-15. PCV2 является очень мелким безоболочечным вирусом рода Circovirus. Он содержит кольцевой одноцепочечной ДНК-геном с двумя основными генами. Ген ORF2 кодирует вирусный капсидный белок приблизительно из 233 аминокислот. Рекомбинантно экспрессируемые белки ORF2 PCV2 формируют вирусоподобные частицы, которые являются в высокой степени эффективными в качестве субъединичной вакцины.

Против Mhyo существует множество коммерческих вакцин, и они повседневно используются в большинстве коммерческих сельскохозяйственных работ в свиноводстве. Как правило, эти вакцины содержат нереплицирующиеся иммуногены, такие как субъединичные белки и/или бактерины (т.е. убитые бактерии, интактные или нет), которые обычно вводят путем парентеральной инъекции. Некоторыми примерами являются: RespiSure^® (Zoetis), Ingelvac^® M. hyo (Boehringer Ingelheim) и M+Pac^® (Merck Animal Health).

Общепринятая вакцина для профилактического лечения животных, в частности, свиней, от инфекции PCV2, может быть основана на целом инактивированном вирусе PCV2 в качестве (нереплицирующегося) иммуногена. Также в данной области было показано, что кодируемый ORF2 капсидный белок (например, при рекомбинантной экспрессии) является пригодным в качестве субъединичного иммуногена PCV2 для применения в адекватной вакцине. Это может быть понятно, поскольку эта субъединица в организме проявляется так же, как и сам вирус (она формирует вирусоподобные частицы), по существу отличаясь только тем, что ДНК и неструктурные белки не присутствуют внутри капсида. В данной области несколько вакцин против PCV2 являются коммерчески доступными. Porcilis^® PCV (доступная от MSD Animal Health, Boxmeer, Нидерланды) представляет собой вакцину для защиты свиней от цирковируса свиней типа 2, для применения у свиней в возрасте от трех недель и старше. При введении в качестве вакцины с двумя введениями (двумя дозами), длительность иммунитета (DOI) составляет 22 недели, практически полностью охватывая период откорма свиней. Ingelvac CircoFlex^® (доступная от Boehringer Ingelheim, Ingelheim) представляет собой вакцину для защиты свиней от цирковируса свиней типа 2, для применения у свиней от двух недель и старше. Она зарегистрирована в качестве вакцины только с однократным введением (одна доза). Circovac^® (доступная от Merial, Lyon, Франция) представляет собой вакцину для защиты свиней от цирковируса свиней типа 2 для применения у свиней в возрасте трех недель и старше. Suvaxyn^® PCV (доступная от Zoetis, Capelle a/d IJssel, Нидерланды) представляет собой вакцину для защиты свиней от цирковируса свиней типа 2, для применения у свиней в возрасте трех недель и старше. Другие вакцины против PCV2 описаны, например, в WO 2007/028823, WO 2007/094893 и WO 2008/076915.

Для ограничения стресса у животных и расходов и труда для лиц, осуществляющих уход, некоторые вакцины для свиней были получены в качестве комбинированных вакцин. Примерами являются: Ingelvac CircoFLEX и Ingelvac MycoFLEX (Boehringer), которые могут быть смешаны непосредственно перед введением, Fostera^® PCV MH (Zoetis) и Porcilis^® PCV MHyo (MSD Animal Health), которые сочетают в себе антигены из PCV2 и Mhyo.

Важным компонентом вакцин, содержащих нереплицирующиеся иммуногены, является адъювант. Он обеспечивает иммунную стимуляцию нереплицирующимся иммуногеном, который в ином случае не является иммуногенным. Он запускает различные пути иммунной системы, основные механизмы которых не до конца понятны. В ветеринарных вакцинах в качестве адъюванта может использоваться большое разнообразие соединений, например: минеральное масло, например Bayol^® или Markol^®, Montanide^® или парафиновое масло; неминеральное масло, такое как сквален, сквалан или растительные масла, например, этилолеат; соли алюминия, например, гидроксид алюминия или фосфат алюминия; пептиды, такие как диметилглицин или тафтсин; компоненты клеточной стенки бактерий, такие как липид A и мурамилдипептид; (синтетические) полимеры, такие как плюроники, декстраны, карбомеры, пиран или сапонин; цитокины и стимуляторы toll-подобных рецепторов, такие как иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды, содержащие неметилированные CpG-группы; и т.д.

Основной проблемой, подлежащей преодолению при получении адъювантных комбинированных вакцин, является предотвращение взаимодействия между различными вакцинными компонентами, которое может негативно повлиять на иммунный ответ или безопасность или стабильность вакцины. Такое взаимодействие может происходить, например, между самими иммуногенами, например, поскольку некоторые из них являются довольно неочищенными продуктами, как например, бактерины Mhyo. Однако для PCV2 и Mhyo, в данной области уже показано, что нереплицирующиеся иммуногены различных типов этих патогенов можно комбинировать в эффективную вакцину. Однако адъювант может препятствовать или даже повреждать вакцинный иммуноген. Это также является признанным органами регистрации, предоставляющими регистрационные удостоверения, например: USDA требует соблюдения правила 9CFR 113.35 для выявления вироцидной активности в инактивированной вакцине, содержащей живой вирус. Помимо этого, конкретный путь введения может иметь значительное влияние на безопасность адъювантной композиции: адъювант может быть безопасным при введении внутримышечно, но приводить к неприемлемым проблемам безопасности при подкожном введении.

Эти потенциальные проблемы в разработке комплексных комбинированных вакцин являются общепризнанными; см., например, публикацию EMEA: "Note for guidance: requirements for combined veterinary products" (EMEA, 2000, CVMP/IWP/52/97- FINAL); и публикацию Министерства здравоохранения и социальных служб США, Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств, Центра по оценке и изучению биологических препаратов от апреля 1997 года: "Guidance for Industry, for the evaluation of combination vaccines for preventable заболевания: Production, Testing and Clinical Studies", Docket No. 97N-0029. Обе этих публикации касаются эффектов препятствования эффективности и безопасности вакцины при комбинировании иммуногенов и адъювантов.

Таким образом, является трудной разработка комбинированной вакцины, которая индуцирует эффективный иммунный ответ против комплексных комбинаций иммуногенов, относящихся к нескольким видам патогенов. Кроме того, комбинированная вакцина должна быть безопасной для применения у животных, т.е. не должна вызывать значительных побочных реакций, таких как лихорадка, локальное опухание, потеря аппетита и т.д. Также являются значимыми более практичные свойства: комбинированная вакцина в идеальном случае должна быть иметь возможность экономичного производства, быть достаточно стабильной в ходе составления и хранения, и позволять проведение способов тестирования для каждого иммуногена в присутствии других иммуногенов.

В целом, является общеизвестным, что комбинированная вакцинация против множества патогенов не является простой и требует экспериментирования для определения безопасности и эффективности, в частности, когда комбинированная вакцинация проводится посредством адъювантной комбинированной вакцины.

Таким образом, существует потребность в преодолении одного или нескольких недостатков уровня техники и в получении эффективной и безопасной комбинированной вакцины против заболеваний, ассоциированных с инфекциями PCV2 и Mhyo.

При вакцинации больших количеств животных также является важным ограничение стресса как для животных, так и для людей, которые их вакцинируют. Кроме того, вакцинация общепринятым внутримышечным путем часто ассоциирована с болью и стрессом для животных и ассоциирована с повышенным риском побочных реакций и инфекций. Одной из возможностей преодоления проблем, ассоциированных с внутримышечным введением, является вакцинация путем введения в дерму, также упоминаемая как внутрикожное введение. Внутрикожная вакцинация позволяет более широкий диапазон областей введения у животного, обеспечивая повышенную свободу действий для потребителя. Это является особенно полезным при вакцинации больших групп свиней, поскольку это позволяет быстрое и неинвазивное применение, создавая меньший стресс как для свиней, так и лиц, осуществляющих введение.

Системный и респираторный локальный иммунный ответ, индуцируемый посредством внутрикожного введения коммерческой инактивированной цельноклеточной вакцины против Mycoplasma hyopneumoniae (Porcilis^® MHYO ID ONCE - MSD Animal Health) по сравнению с двумя коммерческими вакцинами, которые вводили внутримышечным путем, и отрицательным контролем, описан P. Martelli et al., Vet Microbiol. 2014; 168 (2-4): 357-64, которые продемонстрировали, что внутрикожное введение адъювантного бактерина Mhyo индуцирует как системный, так и мукозальный иммунный ответ.

В частности, внутрикожное введение имеет преимущество, состоящее в том, что его можно проводить посредством безыгольных устройств для вакцинации, таких как вакцинатор IDAL^® (доступный от MSD Animal Health, Boxmeer, Нидерланды). "Внутрикожное" введение само по себе не должно приравниваться к "безыгольному" введению. Только когда безыгольное устройство "предназначено для внутрикожного введения", тогда вакцина может быть действительно доставлена (по меньшей мере частично) в дерму. Безыгольное внутрикожное введение является менее инвазивным, чем безыгольная инъекция, и вызывает меньше неблагоприятных системных эффектов у животных и индуцирует превосходный иммунный ответ. Оно также снижает риск передачи посредством игл заболевания между свиньями в ходе процесса вакцинации.

Однако предоставление безопасной и эффективной вакцины, пригодной для внутрикожного введения, является трудным, поскольку объем вакцины должен быть очень небольшим, как правило, в диапазоне приблизительно от 0,1 до 0,5 мл. Таким образом, иммуногены, а также другие компоненты вакцины, такие как возможные адъюванты, не должны быть в высокой степени концентрированными, что повышает риск взаимодействий между различными компонентами вакцин. Как упоминалось выше, вакцины, в которых скомбинированы иммуногены из PCV2 и Mhyo, являются коммерчески доступными. Однако эти комбинированные вакцины предназначены для внутримышечного введения, и непригодны для внутрикожного введения.

ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей было предоставление комбинированной вакцины против заболеваний, ассоциированных с инфекциями PCV2 и Mhyo, пригодной для внутрикожного введения. В частности, задачей было предоставление безопасной и эффективной вакцины, которая может использоваться для профилактического лечения животного от инфекций PCV2 и Mhyo.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно было обнаружено, что эти задачи могут быть достигнуты и, следовательно, один или несколько из недостатков уровня техники могут быть преодолены, путем разработки конкретного адъюванта, который делает возможной комбинированную вакцину, содержащую нереплицирующийся иммуноген цирковируса свиней типа 2 (PCV2) и нереплицирующийся иммуноген Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), где комбинированная вакцина представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния.

В частности, было неожиданно обнаружено, что комбинированная вакцина, содержащая нереплицирующийся иммуноген PCV2 и нереплицирующийся иммуноген Mhyo, где комбинированная вакцина представляет собой эмульсию типа "масло в воде" (т.е. эмульсию, в которой непрерывная фаза является водной, имеющую диспергированную в ней гидрофобную жидкость, дисперсную фазу, которая сама по себе может иметь вторичную или дальнейшую фазу, диспергированную в ней), содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния, может использоваться для безопасного профилактического лечения животного от инфекции PCV2 и инфекции Myho посредством внутрикожного введения.

Также вариантом осуществления изобретения является сама адъювантная композиция, в частности, адъювантная композиция для составления неживой вакцины, где композиция представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

"Комбинированная вакцина" представляет собой вакцину, содержащую иммуногены из более чем одного вида микроорганизмов. Комбинированная вакцина по изобретению содержит иммуногены по меньшей мере из цирковируса свиней типа 2 и из Mycoplasma hyopneumoniae. Таким образом, комбинированная вакцина согласно изобретению может просто называться вакциной "против" PCV2 и Mhyo.

"Вакциной" обычно называют фармацевтическую композицию, которая является безопасной для введения субъекту животному, такому как свинья, и способна индуцировать защитный иммунитет у этого животного против патогенного микроорганизма. Вакцина, как правило, содержит иммунологический активный компонент и фармацевтически приемлемый носитель. "Иммунологически активный компонент" представляет собой одну или несколько иммуногенную молекулу(молекул), такую как нереплицирующиеся иммуногены из PCV2 и Mhyo. Они распознаются иммунной системой данного животного и индуцируют защитный иммунологический ответ.

Вакцина обычно является эффективной для снижения тяжести инфекции, например, путем уменьшения количества патогенов или уменьшения длительности репликации патогена в животном-хозяине.

Также, или возможно в результате этого, вакцина, главным образом, является эффективной в отношении уменьшения или смягчения (клинических) симптомов заболевания, которые могут быть вызваны такой инфекцией или репликацией, или ответом животного на эту инфекцию или репликацию.

"Нереплицирующйися иммуноген" патогена представляет собой любое вещество или соединение, соответствующее патогену, отличное от живого реплицирующегося патогена в целом (либо в форме дикого типа, либо в аттенуированной форме), против которого намереваются индуцировать иммунологический ответ, так что соответствующий вирулентный патоген или один или несколько из его факторов вирулентности будут распознаваться иммунной системной хозяина в результате этого иммунного ответа и в конечном итоге по меньшей мере частично нейтрализоваться. Типичными примерами нереплицирующихся иммуногенов являются убитые целые патогены (этот термин включает патогены в лизированной форме) и субъединицы этих патогенов, такие как капсидные белки, экспрессируемые на поверхности молекулы (например, рекомбинантно экспрессируемые белки или липополисахариды) и экскретируемые молекулы, такие как токсины.

"Профилактическое лечение", направленное против инфекции патогенами, как правило, представляет собой способствование предупреждению, смягчению или излечению инфекции патогеном или нарушения в результате этой инфекции, обусловленной заражением патогенным патогеном после лечения, в частности, для уменьшения нагрузки им хозяина после такого заражения и необязательно для способствования предупреждению или смягчению одного или нескольких клинических проявлений в результате инфицирования патогеном после лечения.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинированной вакцине, содержащей нереплицирующийся иммуноген PCV2 и нереплицирующийся иммуноген Mhyo, отличающейся тем, что комбинированная вакцина представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния.

Каждый из "нереплицирующихся иммуногенов" в комбинированной вакцине согласно изобретению может быть одного типа, или он может быть нескольких типов, например, из одного или из более чем одного штаммов соответствующего патогена. В рамках изобретения нереплицирующийся иммуноген PCV2 предпочтительно представляет собой инактивированный целый вирус PCV2. Еще более предпочтительным является использование белка ORF2 в качестве субъединицы, которую обычно получают из рекомбинантной экспрессирующей системы или доставляют и экспрессируют посредством репликонной частицы. Экспрессия и сборка ORF2 PCV2 может осуществляться посредством рекомбинантного бакуловируса в культуре клеток насекомых. Репликонная частица представляет собой дефектную вирусную частицу, например, частицу альфавируса, разработанную AlphaVax. Родительский PCV2 для последовательности ORF2, которая экспрессируется, может быть любого из серотипов a, b, c или d PCV2, или может быть из химеры из одного или нескольких из этих серотипов.

Нереплицирующийся иммуноген Mycoplasma hyopneumoniae, как правило, содержит убитые целые Mycoplasma hyopneumoniae, т.е. бактерин убитых Mhyo. Бактерин Mhyo предпочтительно происходит из штамма 11 или штамма J.

"Эмульсия типа масла в воде" представляет собой эмульсию, в которой непрерывная фаза является водной, в которой диспергирована гидрофобная жидкость, дисперсная фаза, которая может сама по себе иметь вторичную или дальнейшую фазу, диспергированную в ней. Путем выбора соответствующего типа и концентрации эмульгатора(ов) может быть получена такая эмульсия. Методики и оборудование для получения эмульсии типа "масло в воде" для применения в качестве вакцины хорошо известны в данной области и описаны, например, в справочниках, таких как: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

В рамках изобретения внешняя фаза может содержать нереплицирующиеся иммуногены из PCV2 и Myho и диоксид кремния; и масляная фаза может содержать сквалан и витамин E-ацетат.

Было обнаружено, что комбинированная вакцина согласно изобретению является в высокой степени эффективной, безопасной и стабильной при получении в качестве эмульсии типа "масло в воде". Варианты осуществления и предпочтения для производства эмульсии типа "масло в воде" для комбинированной вакцины согласно изобретению описаны в настоящем описании ниже.

"Сквалан" представляет собой неминеральное масло и также называется гидрогенизированным жиром печени акулы, гексаметилтетракозаном или пергидроскваленом. Его не следует путать со скваленом (CAS nr. 111-02-4), который представляет собой полиненасыщенное C30 масло и метаболизируется в качестве соединения каскада холестерина. Однако сквалан представляет собой полностью гидрогенизированной формой сквалена и, таким образом, он не подвержен окислению. Таким образом, в то время как сквалан может транспортироваться из области инъекции (он, таким образом, "исчезает" из области инъекции) и, таким образом, иногда упоминается как "метаболизируемый", в действительности он является инертным неметаболизируемым маслом (он только физически транспортируется от области инъекции и не метаболизируется).

Первоначально предшественник сквалана был получен из печени акулы, однако по экологическим соображением его заменили на другие природные источники, такие как оливковое масло, или на химический синтез. Таким образом, в определение сквалана включены натуральные, синтетические или полусинтетические формы, или их смеси. Сквалан является коммерчески доступным с различной чистотой, например: из растительного источника, от Worlee (Squalane, растительный) или Croda (Pripure Squalane); или синтетическим, например, от Kuraray (Squalane-PE). В рамках изобретения предпочтительной является высокая чистота сквалана: предпочтительно более 75%, более предпочтительно более 80, 90, или еще более 95%, в указанном порядке предпочтительности.

Сквалан в комбинированной вакцине согласно изобретению, как правило, присутствует в количестве от 1 до 15% масс./об. вакцины. Более предпочтительно, сквалан присутствует в количестве от 3 до 12% масс./об., или даже от 5 до 9% масс./об. вакцины, в указанном порядке предпочтительности, например, при 5%, 6%, 7%, 8% или 9% масс./об. Наиболее предпочтительно сквалан присутствует в количестве приблизительно 6,8% масс./об. вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления комбинированной вакцины согласно изобретению вакцина содержит сквалан в количестве от 1 до 15% масс./об.

"Витамин E-ацетат" представляет собой ацетатный сложный эфир витамина E (токоферол), и он может происходить из растительных материалов, таких как семена, орехи, фрукты или листья, или из жирных типов мяса, однако также он может быть продуцирован синтетически. Некоторыми альтернативными наименованиями являются: токоферилацетат или альфа-токоферолацетат. В определение витамина E-ацетата включены натуральные, синтетические или полусинтетические формы, или их смеси. Витамин E-ацетат является коммерчески доступным с различной степенью чистоты. Витамин E-ацетат для применения в комбинированной вакцине согласно изобретению может представлять собой DL-альфа-токоферол-ацетат, который является рацематом химического вещества с номером CAS: 7695-91-2.

Витамин E-ацетат в комбинированной вакцине согласно изобретению обычно присутствует в количестве от 2 до 20% масс./об. вакцины. Более предпочтительно, витамин E-ацетат присутствует в количестве от 4 до 16% масс./об. или даже от 6 до 10% масс./об. вакцины, в указанном порядке предпочтительности, как например, 6%, 7%, 8%, 9% или 10% масс./об. Наиболее предпочтительно: витамин E-ацетат присутствует в количестве приблизительно 8% масс./об. вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления комбинированной вакцины согласно изобретению вакцина содержит витамин E-ацетат в количестве от 2 до 20% масс./об.

"Кремнезем" представляет собой диоксид кремния. Диоксиды кремния широко описаны для применения в адъювантных композициях и часто обозначаются как диоксид кремния фармацевтической категории. Общим для всех типов диоксида кремния фармацевтической категории является то, что они представляют собой коллоидный диоксид кремния и используются в фармацевтической промышленности в течение практически 50 лет. Среди этого типа диоксида кремния доступны типы диоксида кремния с различной площадью поверхности, гидрофильные и гидрофобные (например, метилированные), кристаллические или аморфные (такие как пирогенный диоксид кремния), а также с различными степенями гранулирования. Примером типа диоксида кремния, который предпочтительно используется в адъювантных композициях, является аморфный диоксид кремния (который может быть гидрофильным или гидрофобным, однако предпочтительно является гидрофильным, как используют в рамках настоящего изобретения). Распространенным типом аморфного диоксида кремния является пирогенный диоксид кремния, который также известен как пирогенный диоксид кремния, поскольку его получают в пламени, он состоит из микроскопических капель аморфного диоксида кремния, вплавленных в разветвленные цепеобразные трехмерные вторичные частицы, которые затем агломерируют в третичные частицы.

Диоксид кремния для применения в комбинированной вакцине по изобретению может иметь размер частиц от 100 до 700 м²/грамм, более предпочтительно от 300 до 500 м²/грамм, еще более предпочтительно от 350 до 410 м²/грамм, наиболее предпочтительно приблизительно 395±25 м²/грамм. Площадь поверхности может быть определена способами, известными в данной области, например, путем вычисления с использованием способа адсорбции азота Brunauer (Brunauer, S. et al., J. Am. Chem. Soc., 60, 309 (1938)).

Такие продукты являются коммерчески доступными, например, под торговым наименованием Aerosil^® или Aeroperl^® (под этими торговыми наименованиями доступно множество вариантов, такие как варианты с различными площадями поверхности, гидрофобные или гидрофильные, кристаллические или аморфные). Примером является Aerosil^® 380 от Evonik Resource Efficiency GmbH, Германия, или S5130 от Sigma-Aldrich, имеющий размер частиц приблизительно 0,007 мкм, pH (4% дисперсия) от 3,7 до 4,5, и насыпную плотность приблизительно 50 г/л.

Диоксид кремния в комбинированной вакцине согласно изобретению обычно присутствует в количестве от 0,02 до 2% масс./об. вакцины. Более предпочтительно, диоксид кремния присутствует в количестве от 0,05 до 1,0% масс./об., или даже от 0,1 до 0,4% масс./об. вакцины, в указанном порядке предпочтительности, таком как 0,1%, 0,2%, 0,3% или 0,4% масс./об. Наиболее предпочтительно: диоксид кремния присутствует в количестве приблизительно 0,2% масс./об. вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления комбинированной вакцины согласно изобретению вакцина содержит диоксид кремния в количестве от 0,02 до 2% масс./об.

Комбинированная вакцина по изобретению, как правило, содержит фармацевтически приемлемый носитель, который предпочтительно представляет собой воду. Предпочтительно вода представляет собой воду высокой степени чистоты, такую как дважды дистиллированная, микрофильтрованная или обратно-осмотическая вода. Более предпочтительно вода представляет собой воду для инъекций, и она является стерильной и по существу свободной от пирогенов.

Удобным признаком вакцин на основе эмульсий типа "масло-в-воде" является то, что иммуногены обычно находятся в водной фазе. Это означает, что масляную фазу можно получать и эмульгировать в воде отдельно с использованием способов и технологий, которые сами по себе не совместимы с поддержанием качества и жизнеспособности вакцинных иммуногенов; например, с использованием высокоэнергетического эмульгирования при высоких температурах. Это приводит к масляной эмульсии по изобретению, которая представляет собой эмульсию типа "масло в воде" из сквалана, витамина E-ацетата и диоксида кремния в воде. Для получения комбинированной вакцины по изобретению водную фазу с иммуногенами и диоксидом кремния и масляную эмульсию с другими адъювантами комбинируют путем осторожного перемешивания при комнатной температуре.

Комбинирование двух композиций вызывает разбавление каждой из них. Следовательно, каждая из них должна быть получена в качестве промежуточной композиции, в которой концентрация различных компонентов является более высокой, чем в конечной вакцине, на коэффициент, равный использованному разведению. Как правило, водную фазу и масляную эмульсию можно смешивать в любом объемном соотношении между 10:90 и 90:10.

Комбинированная вакцина согласно изобретению предпочтительно содержит водную фазу и масляную эмульсию - обе как описано - в объемном соотношении между 20:80 до 80:20. Таким образом, в одном варианте осуществления комбинированную вакцину согласно изобретению получают из смеси водной фазы и масляной эмульсии в объемном соотношении от 20:80 до 80:20. Предпочтительно объемное соотношение составляет от 30:70 до 70: 30; от 40:60 до 60:40; или даже объемное соотношение составляет приблизительно 50:50, в указанном порядке предпочтительности.

Очевидно, когда комбинированное соотношение водной фазы и масляной эмульсии составляет приблизительно 50:50, тогда каждая из двух композиций должна содержать ее различные компоненты в количестве или в концентрации, которые в два раза превышают желаемые в конечном вакцинном составе, который получен путем комбинирования двух промежуточных композиций.

В предпочтительном варианте осуществления масляную эмульсию по изобретению получают с использованием эмульгатора с величиной HLB (гидрофильно-липофильный баланс) от 8 до 20; предпочтительным эмульгатором является полисорбат 80.

Полисорбат 80 относится к химическому веществу с CAS № 9005-65-6, также называемому полиоксиэтилена сорбитана моноолеатом. Он имеет величину HLB приблизительно 15 и является коммерчески широко доступным, например, в качестве Tween 80.

Предпочтительно, полисорбат 80 присутствует в комбинированной вакцине согласно изобретению в количестве от 0,5 до 10% масс./об. вакцины. Более предпочтительно, полисорбат 80 присутствует в количестве от 0,7 до 7% масс./об., от 1,0 до 5% или даже от 2 до 4% масс./об. вакцины, в указанном порядке предпочтительности.

Наиболее предпочтительно полисорбат 80 присутствует в количестве приблизительно 3,2% масс./об. вакцины.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления комбинированная вакцина согласно изобретению содержит полисорбат 80 в количестве от 0,5 до 10% масс./об.

Масляную эмульсию по изобретению можно получать в любом масштабе и с использованием любого подходящего оборудования для гомогенизации, такого как от: Microfluidizer^TM, Silverson^TM, Ultra Turrax^TM или Dispax reactor (IKA). Специалист в данной области может проводить и оптимизировать такой процесс эмульгирования для контроля размера частиц дисперсной фазы (здесь: масляные адъюванты). Вместе с выбором типа и концентрации эмульгатора(ов), это контролирует фармацевтические свойства эмульсии, а также ее стабильность. Основные параметры процесса эмульгирования самого по себе представляют собой: потребляемую энергию (мощность и об/мин), температуру, длительность и число повторяющихся циклов. Детали вариантов осуществления процесса эмульгирования приведены ниже.

Размер частиц дисперсной фазы предпочтительно является довольно небольшим. Когда диаметр частиц дисперсной фазы составляет менее приблизительно 1 микрометра, такие эмульсии часто называют "субмикронными эмульсиями". В одном из вариантов осуществления эмульсии типа "масло в воде" комбинированной вакцины согласно изобретению представляет собой субмикронную эмульсию.

Оборудование для измерения размера частиц размером 1 микрометр или менее является общедоступным, например, путем измерения лазерной дифракции. Как правило, размер частиц выражают в нанометрах (нм) и в качестве среднего размера частиц, также известного как медианный диаметр, выражаемого в качестве D50 совокупного распределения размера частиц.

В рамках изобретения размер частиц выражают в качестве D50 в нм при определении с использованием Mastersizer^® (Malvern Instruments). Измерение размера частиц можно проводить в (концентрированной) масляной эмульсии или в комбинированной вакцине; коэффициент рефракции частиц масляной фазы по изобретению составляет 1,48. Отчет об анализе размера частиц Malvern Mastersizer предоставляет D50 как D(0,50). Таким образом, в одном варианте осуществления субмикронной эмульсии типа "масло в воде" в комбинированной вакцине согласно изобретению масляные капли имеют D50 500 нм или менее; предпочтительно D50 составляет 250 нм или менее. Более предпочтительно D50 составляет 150 нм или менее.

Существует множество способов, доступных для продуцирования таких субмикронных эмульсий, как правило, с использованием высокоэнергетического процесса эмульгирования, например, с использованием гомогенизаторов высокого давления, ротор-статорных устройств, смесителей, ультразвуковых волн, микропористых мембран или микроканальных устройств.

Предпочтительный способ высокоэнергетического эмульгирования в рамках изобретения представляет собой использование гомогенизатора высокого давления, предпочтительно Microfluidizer^TM (Microfluidics). Как правило, достаточными являются 3 пропускания при давлении от 500 до 1500 бар (т.е. от 7000 до 22000 фунт./кв. дюйм). Эмульсии, полученные таким образом, обычно имеют частицы дисперсной фазы с D50 500 нм или менее, и имеют узкое распределение размеров; в рамках изобретения дисперсная фаза представляет собой капли масляных адъювантов.

Как правило, эмульсии с такими частицами очень тонкого размера в дисперсной фазе получают за несколько стадий. Таким образом, получают первоначальную относительно грубую масляную эмульсию путем низкоэнергетического перемешивания, после чего следует одна или несколько последующих высокоэнергетических обработок для достижения дальнейшего уменьшения размера частиц. Затем, "микрофлюидизированную" масляную эмульсию, содержащую адъюванты и необязательно эмульгатор в воде, комбинируют с водной фазой, содержащей иммуногены, с получением комбинированной вакцины согласно изобретению.

По причинам однородности и качества продукта, не только медианный диаметр частиц, но также распределение размера частиц, также известное как распределение размера, можно преимущественно подвергать мониторингу и контролировать. Распределение размера масляных капель в субмикронной эмульсии типа "масла в воде" комбинированной вакцины согласно изобретению предпочтительно является относительно узким. Показателем распределения размера частиц является D90 совокупного распределения размера частиц.

Таким образом, в одном варианте осуществления субмикронной эмульсии типа "масло в воде" комбинированной вакцины согласно изобретению масляные капли имеют D90 ниже 900 нм, более предпочтительный D90 составляет менее 500 нм, 400 нм или даже менее 300 нм, в указанном порядке предпочтительности. Наиболее предпочтительно D90 составляет приблизительно от 150 до 250 нм.

Одним из преимуществ эмульсии, имеющей такой малый размер частиц и распределение, является то, что ее можно стерилизовать посредством фильтрации без значительной потери материала, поскольку типичные фильтры для стерилизации имеют размер пор приблизительно 0,2 микрометра. Такая стерилизация на фильтре преодолевает потребность в других способах стерилизации, которые могут снижать качество компонентов масляной эмульсии, например, путем нагревания, воздействия химических веществ или облучения.

Таким образом, комбинированная вакцина согласно изобретению обычно содержит нереплицирующиеся иммуногены из PCV2 и Mhyo в количествах, которые способны индуцировать у данного животного защитный иммунный ответ против ассоциированных с ними заболеваний, как описано выше.

Специалист в данной области способен без труда определить эффективность комбинированной вакцины согласно изобретению, например, путем мониторинга иммунологического ответа после вакцинации или после заражения, например, путем мониторинга признаков у данного животного заболевания, клинических показателей или путем повторного выделения патогена и сравнения этих результатов с ответом на вакцинацию-заражение, наблюдаемым у животных с имитирующей вакцинацией.

В качестве рекомендации, количества иммуногенов, подлежащих применению в комбинированной вакцине согласно изобретению, может быть основано на количествах, используемых в соответствующих одновалентных или комбинированных вакцинах с этими иммуногенами. Например, комбинированная вакцина согласно изобретению может содержать на миллилитр: от 1 до 150 мкг ORF2 PCV2; и Mhyo: 2-50% масс./об. инактивированной концентрированной культуры Mhyo. Способы количественного определения этих иммуногенов хорошо известны в данной области и также могут быть основаны на количественном определении на основе ELISA против определенных стандартов.

Комбинированную вакцину согласно изобретению можно преимущественно комбинировать с одним или несколькими дополнительными антигенами или иммуногенами, реплицирующимися или нереплицирующмися, целыми или разрушенными. Таким образом, в одном варианте осуществления комбинированная вакцина согласно изобретению может содержать по меньшей мере один дополнительный антиген или иммуноген.

Дополнительный антиген или иммуноген представляет собой либо аттенуированную форму микроорганизма, которая является патогенной для свиней, либо нереплицирующийся антиген или иммуноген, происходящий из микроорганизма, патогенного для свиней. Микроорганизм может представлять собой любой вирус, бактерию, паразит, гриб, риккетсию, простейший организм и/или паразит, который является патогенным для свиней. Примерами таких микроорганизмов, патогенных для свиней, являются: вирус псевдобешенства, парвовирус свиней, классический вирус лихорадки свиней, свиной вирус гриппа, вирус ящура, вирус эпидемической диареи свиней, трансмиссивный гастроэнтеровирус, респираторный коронавирус свиней, вирус везикулярного стоматита, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Brachyspira, E. coli, Haemophilus, Streptococcus, Salmonella, Clostridia, Pasteurella, Erysipelothrix, Leptospira, Bordetella, Toxoplasma, Isospora и Trichinella. Предпочтительные антигены или иммуногены представляют собой один или несколько из: Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Brachyspira hyodysenteriae и свиного вируса гриппа.

Выявленные эффекты комбинированной вакцины согласно изобретению представляют собой:

для Mhyo: предупреждение или сокращение очагов в легких, вызванных Mhyo, как например, консолидированной пневмонии и хронического респираторного заболевания. Для Mhyo наиболее надежным показателем эффективности вакцины является снижение показателей легочных очагов после заражения Mhyo. Такие очаги повреждения обычно оценивают в ходе некропсии путем макроскопической оценки легочной консолидации на основе шкалы Гудвина (Goodwin et al., 1969, J. Hyg. Camb., vol. 67, p. 465-476); эта шкала находится в диапазоне от нуля вплоть до максимум 55 баллов/животное для полностью пораженных легких;

для PCV2: предупреждение или уменьшение клинических признаков истощения или замедления роста в результате заболевания, присутствия макроскопических и микроскопических очагов, характерных для заболевания, и наличия вирусного антигена или ДНК в микроскопических лимфоидных очагах повреждения. Для PCV2 наиболее надежным показателем эффективности вакцины является тестирование присутствия вирусной нуклеиновой кислоты посредством кПЦР в сыворотке, материале фекального мазка, материале назального мазка, паховом лимфатическом узле, мезентерическом лимфатическом узле, миндалевидной железе и легком. Индукция антител против PCV2 после вакцинации коррелирует с защитой.

В предпочтительном варианте осуществления комбинированная вакцина предназначена для свиней. Термин "свинья" относится к животным семейства Suidae и предпочтительно к животным рода Sus, которые также называют свиными. Примерами являются дикая или домашняя свинья, боров, дикий кабан, бабируса или бородавочник. Они также включают свиней, указываемых произвольными наименованиями, например, с указанием их пола или возраста, как например: свиноматка, матка, кабан, хряк, боров, ромсвинка, отъемыш или поросенок. Кроме того, термин "свинья" относится к животным семейства свиных любого типа, такого как тип для разведения или тип для откорма, и к родительским линиям любого из этих типов.

Комбинированная вакцина согласно изобретению может быть составлена различными способами, как описано в настоящем описании.

В одном варианте осуществления комбинированную вакцину согласно изобретению предоставляют в качестве готового для применения состава, т.е. в качестве состава, в котором все компоненты вакцины легко смешиваются так, чтобы комбинированную вакцину можно было прямо использовать для вакцинации без необходимости в каких-либо дополнительных стадиях смешения или восстановления.

В альтернативном варианте осуществления комбинированная вакцина согласно изобретению может быть получена из набора, содержащего по меньшей мере два контейнера: один из контейнеров содержит все компоненты комбинированной вакцины по изобретению за исключением иммуногена Myho; а другой контейнер содержит иммуноген Myho. Иммуноген PCV или Myho может быть предоставлен, например, в лиофилизированной форме или в качестве стерильной суспензии, такой как водная суспензия. Лиофилизированная форма может представлять собой лиофилизированный кек в контейнере, например, бутылке, но также он может представлять собой лиосферу, как используют в технологии Sphereon^TM.

Затем элементы набора вместе воплощают комбинированную вакцину согласно изобретению. Содержимое по меньшей мере двух контейнеров может быть восстановлено in situ непосредственно перед применением, т.е. перед вакцинацией. После восстановления нереплицирующегося иммуногена из Mhyo образуется полная комбинированнная вакцина согласно изобретению. Это также называют смешением вакцины "на месте" или "в полевых условиях".

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к набору, содержащему по меньшей мере два контейнера: один из контейнеров содержит нереплицирующийся иммуноген из PCV2 в эмульсии типа "масло в воде", содержащей сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния; и другой контейнер содержит нереплицирующийся иммуноген из Mhyo.

В альтернативном варианте осуществления оба иммуногена, PCV2 и Mhyo, могут быть предоставлены в одном контейнере, например, в качестве водного раствора или дисперсии, или в лиофилизированной форме, необязательно дополнительно содержащем диоксид кремния, и который восстанавливают перед применением с компонентами второго контейнера, содержащего (другие) адъюванты в форме эмульсии типа o/w.

Набор по изобретению и его элементы может включать любой из вариантов осуществления (предпочтительных или нет), как описано в настоящем описании, для комбинированной вакцины согласно изобретению, или любую комбинацию двух или более из этих вариантов осуществления комбинированной вакцины согласно изобретению.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу получения комбинированной вакцины согласно изобретению, включающему стадии:

- получения водной фазы, содержащей нереплицирующийся иммуноген из PCV2 и Mhyo, и

- смешения указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния, с получением эмульсии типа "масло в воде".

В альтернативном аспекте изобретение относится к способу получения комбинированной вакцины согласно изобретению, включающему стадии:

- получения водной фазы, содержащей нереплицирующийся иммуноген из PCV2,

- смешения указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния, для формирования эмульсии типа "масло в воде", и

- смешения указанной эмульсии типа "масло в воде" с нереплицирующимся иммуногеном из Mhyo.

В следующем аспекте изобретение относится к способу получения комбинированной вакцины согласно изобретению, включающему стадии:

- получения нереплицирующегося иммуногена из Mhyo в лиофилизированной форме,

- получения водной фазы, содержащей нереплицирующийся иммуноген, из PCV2,

- смешения указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквален, витамин E-ацетат и диоксид кремния, и

- восстановления указанного лиофилизированного не восстанавливающегося иммуногена из Mhyo с указанной смесью водной фазы и масляной эмульсии.

В следующем аспекте изобретение относится к способу получения комбинированной вакцины согласно изобретению, включающему стадии:

- получения нереплицирующегося иммуногена из PCV в лиофилизированной форме,

- получения водной фазы, содержащей нереплицирующийся иммуноген, из Mhyo и диоксида кремния,

- смешения указанной водной фазы с масляной эмульсией, содержащей сквалан и витамин E-ацетат, и

- восстановления указанного лиофилизированного нереплицирущегося иммуногена из PCV с указанной смесью водной фазы и масляной эмульсии.

На различных этапах этих способов могут быть добавлены дополнительные стадии, например, для дополнительной обработки, например, для очистки или хранения. Также способ получения может вовлекать смешение с дополнительным антигеном или иммуногеном, или фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как стабилизаторы или консерванты.

Как описано, комбинированную вакцину согласно изобретению, которая может быть получена способом согласно изобретению, можно преимущественно использовать для внутрикожного введения свинье для защиты против инфекции и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией PCV2 и Mhyo.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к эмульсии типа "масло в воде", содержащей сквалан, витамин E-ацетат, диоксид кремния, нереплицирующиеся иммуногены из PCV2 и Mhyo, для применения в вакцинации в кожу животного, такого как свинья, против PCV2 и Mhyo.

В следующем аспекте изобретение относится к применению нереплицирующихся иммуногенов из PCV2 и Mhyo для производства комбинированной вакцины для животного, такого как свинья, отличающемуся тем, что вакцина представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния.

Комбинированную вакцину согласно изобретению можно использовать для вакцинации свиней против PCV2 и Mhyo.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу вакцинации животного, такого как свинья, против PCV2 и Mhyo, посредством внутрикожного введения указанному животному эмульсии типа "масло в воде", содержащей сквалан, витамин E-ацетат, диоксид кремния и нереплицирующийся иммуноген из PCV2 и Mhyo.

Альтернативно, в сходном варианте осуществления изобретение относится к способу вакцинации животного, такого как свинья, против PCV2 и Mhyo, путем внутрикожного введения указанному животному комбинированной вакцины согласно изобретению.

Таким образом, комбинированную вакцину согласно изобретению обычно вводят в кожу животного, т.е. применяют посредством внутрикожного введения. Этого можно достигать различными способами, например, с использованием классического шприца или иглы для подкожной инъекции. Альтернативно парентеральное введение можно проводить посредством некоторого способа безыгольной инъекции, доставляющего вакцину посредством внутрикожного аппликатора, такого как аппликатор IDAL^® от MSD Animal Health.

Чтобы быть пригодным для внутрикожного введения, объем дозы комбинированной вакцины согласно изобретению для животного обычно составляет от 0,05 до 1,0 мл на животное; предпочтительно от 0,1 до 0,5 мл, более предпочтительно приблизительно 0,2, 0,3 или 0,4 мл, наиболее предпочтительно приблизительно 0,2 мл на дозу для животного, в указанном порядке предпочтительности.

Режим введения для способа вакцинации согласно изобретению данной свинье может представлять собой введение за одну или несколько доз или способом, совместимым с практическими аспектами свиноводства.

При необходимости данному животному можно проводить второе или последующие введения комбинированной вакцины согласно изобретению позднее в жизни, так называемые бустерные вакцинации. Однако комбинированную вакцину согласно изобретению оптимизируют таким образом, чтобы одной дозы вакцинации обычно было достаточно для обеспечения иммунной защиты в ходе соответствующего периода жизни животного, например, на стадии откорма свиньи в возрасте вплоть до 6 месяцев.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления комбинированную вакцину согласно изобретению вводят данному животному только один раз, т.е. она представляет собой вакцину для однократного применения.

Предпочтительно, режим для способа вакцинации интегрируют в существующие схемы вакцинации другими вакцинами, которые могут потребоваться для данной свиньи, для дальнейшего уменьшения стресса для животных и снижения трудозатрат. Эти другие вакцины можно вводить одновременным, совместным или последовательным образом, совместимым с их зарегистрированным применением. Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации свиней согласно изобретению комбинированную вакцину согласно изобретению вводят в комбинации с другой вакциной для свиней.

В случае, когда данным животным является свинья, рассматриваемая свинья для вакцинации в рамках изобретения может представлять собой свинью любого возраста, в котором она является чувствительной к вакцинации и/или предрасположенной к заболеванию или инфекции, от которых вакцина защищает. Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации свиней согласно изобретению комбинированную вакцину согласно изобретению вводят молодой свинье, т.е. свинье в возрасте приблизительно 2 месяцев. Альтернативно комбинированную вакцину согласно изобретению вводят взрослой свинье. т.е. свинье в возрасте приблизительно 6 месяцев.

Вследствие высокой распространенности Mhyo и PCV2 и вследствие широко распространенного применения вакцин против одного или нескольких из этих патогенов, многие свиноматки являются серопозитивными по антителам против одного или нескольких из Mhyo и PCV2. Следовательно, молодая свинья, которая употребила молозиво таких свиноматок, может быть MDA+ (позитивная по антителам материнского происхождения). Это не является препятствием для эффективности комбинированной вакцины согласно изобретению, поскольку она также является эффективной у свиней MDA+. Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации согласно изобретению комбинированную вакцину согласно изобретению вводят свинье MDA+.

Введение комбинированной вакцины согласно изобретению можно проводить либо в качестве профилактического, либо в качестве терапевтического лечения, либо в качестве и того, и другого, поскольку оно препятствует как развитию, так и прогрессированию инфекции Mhyo и PCV2. Применение комбинированной вакцины согласно изобретению будет способствовать уменьшению инфекции одним или обоими из Mhyo и PCV2 в свином стаде, на ферме или у свиней на данном географическом регионе. Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу уменьшения инфекции Mhyo и PCV2, или ассоциированных с ней признаков заболевания у свиней, отличающемуся тем, что способ включает внутрикожное введение указанной свинье комбинированной вакцины согласно изобретению.

Изобретение далее описан посредством приведенных ниже неограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение комбинированной вакцины

Комбинированную вакцину, согласно изобретению, получали следующим образом:

Эту масляную эмульсию в концентрации 2x получали согласно представленным ниже стадиям процесса:

- требуемые количества витамина E-ацетата и сквалана отвешивали и объединяли в стакане,

- смесь витамин E-ацетат/сквалан гомогенизировали посредством низкоэнергетического перемешивания (магнитная мешалка) при комнатной температуре,

- требуемое количество полисорбата 80 отвешивали и добавляли к гомогенизированной смеси витамин E-ацетат/сквалан,

- комбинированную смесь вновь гомогенизировали посредством низкоэнергетического перемешивания при комнатной температуре,

- гомогенизированную смесь стерилизовали посредством фильтрации через 0,2-микрометровый фильтр (Pall, Ultipor^TM N66),

- требуемое количество (стерилизованного нагреванием) диоксида кремния отвешивали и добавляли в гомогенизированную смесь, после чего комбинированную смесь вновь гомогенизировали посредством низкоэнергетического перемешивания при комнатной температуре,

- смесь нагревали при 65-75°C,

- воду для инъекций (стерилизованную) нагревали до 65-75°C,

- нагретую масляную фазу и воду предварительно смешивали с использованием высокоэнергетического перемешивания посредством Ultra Turrax со стержнем N18, в течение 5-15 минут; температуру снижали от 65 до 55°C,

- предварительную смесь пропускали 3 раза через Microfluidizer^TM при 800 бар; температуру поддерживали ниже 50°C с использованием охлаждающей спирали.

Для конечной масляной эмульсии проверяли полноту и уровень гомогенизации посредством световой микроскопии. Кроме того, также проверяли pH (7,34) и осмолярность (221 мосм/кг). Измерения размера частиц продемонстрировали: D100=300 нм; D99=250 нм; D90=200 нм и D50=130 нм.

Водную фазу (в концентрации 2x) получали путем использования требуемого количества каждого из нереплицирующихся иммуногенов: Mhyo: 6% об./об. концентрированной 10x инактивированной культуры, и PCV: 50 мкг ORF2.

Далее обе концентрированных композиции (масляная эмульсия с адъювантами и водная фаза с иммуногенами) объединяли в приблизительном соотношении по объему 50:50 путем низкоэнергетического перемешивания при комнатной температуре.

Приведенные ниже адъювантные композиции вакцин получали в качестве эмульсий типа "масло в воде" (o/w) (все проценты представляют собой % масс./об.) с использованием методики, описанной выше. К некоторым композициям при получении масляной эмульсии добавляли гидроксид алюминия в определенном количестве (в качестве двойного концентрата) вместе с полисорбатом 80 и скваланом:

Таблица 1

Композиция 1 Композиция 2 Эталонная композиция 3 Эталонная композиция 4 Полисорбат 80 (d=1,08 г/мл) 3,24% 3,24% 3,24% 3,24% Сквалан (d=0,81 г/мл) 6,75% 6,75% 6,75% 6,75% Витамин E-ацетат (d=0,95 г/мл) 7,94% 7,94% 7,94% 7,94% Aerosil 380 0,2% 0,2% - - Вода для инъекций 28,78% 28,78% 31,97% 28,98% Гидроксид алюминия (Al(OH)₃ 3%) - 9,83% 1,73% 9,83% PBS** + Иммуноген Остальное количество Остальное количество Остальное количество Остальное количество

* Фосфатно-солевой буфер

Пример 2: Эффективность в/к составов PCV2/Mhyo у свиней против инфекции Mhyo

Эффективность вакцинации посредством внутрикожных (в/к) составов Mhyo (0,2 мл, с вакцинацией в правый бок шеи вакциной IDAL^®) против заражения Mhyo тестируют у специальных свободных от патогенов (SPF) поросят (ToJaPigs). Составы получали посредством различной обработки иммуногеном Mhyo и составляли в количестве 5 PCVU/мл (приблизительно 25% масс./об. инактивированной культуры Mhyo). Животных вакцинировали в возрасте 3 недель по следующей схеме (таблица 2). Через четыре недели после вакцинации всех животных инфицировали Mhyo. Всех животных заражали в течение двух последовательных дней в возрасте 7 недель, т.е. через 4 недели после вакцинации, посредством 10 мл интратрахеального штамма 98 Mhyo в количестве 10⁹ и 10⁹ CCU/мл, соответственно. Через три недели после заражения животных умерщвляли и степень индуцированной Mhyo консолидированной пневмонии оценивали в соответствии со шкалой Гудвина (максимальный показатель: 55).

Таблица 2

Группа (N) Иммуногены Адъювант PCV2 Mhyo 1 (15) X X Эталонная композиция 3 2 (15) X X X-Solve12* + Aerosil380 3 (15) - - Невакцинированная контрольная группа

* Запатентованный адъювант Porcilis^® PCV ID (MSD Animal health)

Результаты:

Эффективность вакцинации определяется показателями очагов повреждения в легких (LLS, усредненные), которые были зарегистрированы для каждой свиньи и сравнены с невакцинированной контрольной группой.

Таблица 3

Группа Показатель очагов повреждения в легких (LLS) 1 13,2 2 11,5 3 15,4

Не было достигнуто значимого уменьшения показателя очагов повреждения в легких для любой из вакцин, протестированных в группах 1 и 2, по сравнению с контрольной группой. Вместо этого, показатель очагов повреждения в легких был сходным с невакцинированной контрольной группой.

Таким образом, ни комбинация адъювантов гидроксида алюминия, сквалана, витамина E ацетата и диоксида кремния в комбинации с иммуногенами PCV2 и Mhyo, ни комбинация коммерчески доступной вакцины PCV Porcilis^® PCV ID и диоксида кремния в качестве адъюванта, не были пригодными для безопасного и эффективного внутрикожного введения.

Пример 3: Эффективность вакцины PRRS, восстановленной в составах PCV2/Mhyo ID, у свиней

Задачей данного исследования было сравнение безопасности и серологической эффективности различных вакцин PCV2 и/или Mhyo, содержащих Aerosil200 или Aerosil380, восстановленных с Porcilis® PRRS, при внутрикожном (в/к) введении в шею поросят в возрасте 5 недель. Поросят распределяли на группы лечения, указанные ниже (таблица 4). Поросят вакцинировали внутрикожным путем, когда их возраст составлял приблизительно пять недель. Поросят из групп 4 и 5 вакцинировали Porcillis PRRS с 10^4,5 TCID₅₀ вируса, восстановленных в различных вакцинных составах PCV2-Mhyo, как описано ниже.

Таблица 4

Группа (N) Иммуногены Другие компоненты PCV2 Mhyo 4 (10) X X Porcilis^® PRRS+Aerosil200 5 (10) X X Porcilis^® PRRS+Aerosil380 6 (10) X - Porcilis^® PCV ID+Porcilis^® PRRS; не смешанные (положительный контроль) 7 (10) - - Невакцинированная контрольная группа

- Поросят из группы 4 вакцинировали внутрикожно посредством однократной дозы (0,2 мл) вакцины, составленной с PCV2 (10000 AU/мл; приблизительно 80 мкг/мл;) + M. Hyo (10 PCVU/мл) и адъювантом Aerosil200.

- Поросят из группы 5 вакцинировали внутрикожным путем однократной дозой (0,2 мл) вакцины, составленной с PCV2 (10000 AU/мл) + M. Hyo (10 PCVU/мл) и адъювантом Aerosil380.

- Поросят из группы 6 вакцинировали внутрикожным путем однократной дозой (по 0,2 мл каждой) вакцины Porcilis^® PCV ID+Porcilis^® PRRS, не перемешанными.

- Поросят из группы 7 не вакцинировали (группа отрицательного контроля). Всех животных исследовали в отношении реакций области инъекции.

Всех поросят наблюдали каждые сутки после вакцинации в отношении клинических признаков. Проводили измерение температуры и проводили взятие образцов сыворотки от всех животных. Образцы тестировали в отношении антител против PCV2, M. Hyopneumoniae и PRRSV.

Результаты:

После вакцинации температура тела во всех группах была сравнимой. В день вакцинации все животные имели сравнимые титры антител против PCV2. Титры антител против PCV2 оставались на постоянном уровне во всех группах до конца испытания. Титры антител в контрольной группе 7 снижались с течением времени. В день вакцинации все животные были негативными в отношении антител против PRRS. Все приведенные ниже группы продемонстрировали 0-20% отвечающих на PRRS. Контрольная группа 7 оставалась негативной. В начале исследования все животные были серологически негативными в отношении M. hyopneumoniae. Все группы продемонстрировали 0-20% отвечающих на SD21. На SD28 в большинстве групп были продемонстрированы положительные животные. Контрольная группа 7 не продемонстрировала положительного ответа на M. hyopneumoniae. Результаты ответа IgM-антител (прогностические для введения вакцин) против PCV2 и Mhyo представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5: Процент животных, положительных по специфическим к PCV2 IgM, после вакцинации

Группа SD0 SD14 SD21 4 0 80 40 5 20 50 80 6 0 100 100 7 20 20 20

Таблица 6: Процент положительных по серологическому антительному ответу на Mhyo животных после вакцинации

Группа SD0 SD14 SD21 SD28 4 0 0 20 20 5 0 0 0 10 6 0 0 0 10 7 0 0 0 0

Из этого исследования можно сделать заключение, что ни одна из вакцинированных групп не продемонстрировала приемлемого антительного ответа против PCV2 или Mhyo. Таким образом, ни адъювант Aerosil A380, ни Aerosil A200 при восстановлении посредством Porcilis^® PRRS и иммуногеном PCV2 и Mhyo не были пригодными для безопасного и эффективного внутрикожного введения у свиней.

Пример 4: Эффективность вакцины PRRS, восстановленной в в/к составах Mhyo ID, у свиней против инфекции Mhyo

Эффективность вакцинации внутрикожными (в/к) составами Mhyo, смешанными с PRRS (A212D, 10^5,1 TCID50 /доза) против инфекции Mhyo тестировали у поросят SPF. Составы были получены с различными адъювантами. Животных вакцинировали в/к (0,2 мл) в правый бок шеи в возрасте 3 недель по следующей схеме (таблица 7). Через три недели после вакцинации всех животных инфицировали посредством Mhyo.

Таблица 7:

Группа (N) Иммуногены Вакцинный адъювант PRRS Mhyo 8 (12) X X Эталонная композиция 3 9 (12) - X X-Solve (Porcilis^® MHyo ID once), положительный контроль для Mhyo 10 (12) X - Porcilis^® PRRS, положительный контроль для PRRS

Всех животных инфицировали в течение двух последовательных дней в возрасте 6 недель посредством 10 мл интратрахеального штамма Mhyo 98 в количестве 9 и 8 CCU, соответственно.

Результаты:

Эффективность вакцинации определяли посредством показателей очагов повреждения в легких (LLS), которые регистрировали для каждой свиньи и сравнивали с невакцинированной контрольной группой.

Таблица 8

Показатель очагов повреждения в легких (LLS) Группа Показатель % снижение 8 9,0 22 9 3,0 74 10 11,5 -

Стало возможным показать, что внутрикожное введение комбинации иммуногенов Mhyo и PRRS с оксидом алюминия, скваланом и витамином E-ацетатом в качестве адъювантной композиции в эталонной композиции 3 обеспечивает очень низкий и, таким образом, неприемлемый показатель очагов повреждения в легких в виде снижения на 22% против 74% в группе положительного контроля с использованием коммерческой вакцины Mhyo. Таким образом, комбинация иммуногенов с адъювантами гидроксидом алюминия, скваланом и витамином E-ацетатом не была пригодной для безопасного и эффективного внутрикожного введения.

Пример 5: Эффективность в/к составов PCV2-Mhyo у свиней SPF против заражения Mhyo

Группы из 12 свиней вакцинировали внутрикожным путем по приведенной ниже схеме (таблица 9) в возрасте трех недель (+/- трое суток), группу 17 не вакцинировали, и она служила в качестве контроля заражения Mhyo. Через четыре недели после вакцинации всех животных инфицировали вирулентным штаммом Mhyo. Через три недели после заражения проводили посмертное исследование всех животных в отношении очагов повреждения в легких. Перед вакцинацией, до заражения и при вскрытии проводили взятие образцов крови.

Таблица 9

Группа (N) Адъювант/продукт Иммуноген Mhyo Иммуноген PCV Объем и путь 11 (12) Композиция 1 Штамм 11 PCV2 0,2 мл в/к, правый бок шеи 12 (12) Композиция 1 Штамм J 13 (12) Композиция 2 Штамм 11 14 (12) Эталонная композиция 4 Штамм 11 15 (12) ISA28+micro-fortasol* (Эталон) Штамм 11 16 (12) Porcilis^® Mhyo ID Once** Штамм 11 - 17 (12) -*** - - -

* Montanide^® ISA 28 от Seppic, к которому добавлен микрофлуидизированный витамин E-ацетат

** Группа положительного контроля для Mhyo

*** Невакцинированная контрольная группа

Экспериментальные методики

Серология

Взятие образцов крови (яремная вена) проводили непосредственно перед вакцинацией (T=0, в возрасте трех недель), непосредственно перед заражением (T=4, в возрасте 7 недель) и при вскрытии (T=7, в возрасте 10 недель). Образцы транспортировали при температуре окружающей среды. Из образцов крови получали сыворотку в двух экземплярах. Присутствие соответствующих антител во всех образцах сыворотки определяли в тестах Elisa для M. hyo и PCV в соответствии со стандартными методиками.

Клиническое наблюдение и ректальная температура

Проводили клинические наблюдения и ректальную температуру измеряли непосредственно перед вакцинацией, через четыре часа и через одни и двое суток после вакцинации. Наблюдение и температуру записывали.

Посмертное исследование

В конце этого эксперимента через 4 недели после заражения свиней подвергали седативному воздействию путем электрооглушения, а затем умерщвляли путем кровопускания. Проводили оценку очагов повреждения в соответствии со шкалой Гудвина.

Результаты:

Не наблюдали неприемлемых реакций в области инъекции. Не наблюдали неприемлемой температуры.

Эффективность вакцинации определяли посредством показателей очагов повреждения в легких (LLS), которые регистрировали для каждой свиньи и сравнивали с невакцинированной контрольной группой. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10

Показатель очагов повреждения в легких (LLS) Группа Показатель % снижение 11 8,7 47% 12 6,0 63% 13 2,8 83% 14 13,0 20% 15 20,0 -23% 16 4,0 75% 17 16,3 -

Приведенные выше данные показателей очагов повреждения в легких показывают, что в группах 11, 12 (композиции по изобретению) и 13 (эталонная композиция 2) показатели были приемлемыми, поскольку снижение по сравнению с невакцинированной контрольной группой (группа 17) составляло выше 45% (что использовали в качестве пороговой величины для существенной эффективности). Вместо этого, в группах 14 и 15 показатели были неприемлемыми, поскольку LLS в группе 15 был еще более высоким, чем в невакцинированной контрольной группе, LLS в группе 14 был только несколько снижен по сравнению с группой отрицательного контроля, на 20%.

Таким образом, стало возможным показать, что композиция по изобретению, включающая комбинации адъювантов сквалана, витамина E-ацетата и оксида кремния, обеспечивала приемлемые показатели очагов повреждения в легких, указывающие на эффективную вакцинацию.

Пример 6: Эффективность в/к составов PCV2-Mhyo ID у свиней SPF против заражения PCV

Поросят распределяли на пять групп лечения по 10 поросят в каждой, и им проводили внутрикожную вакцинацию, когда их возраст составлял приблизительно три недели. Поросят из групп 1-3 вакцинировали вакцинами, описанными ниже. В группе 4 вакцинацию проводили посредством Porcilis^® PCV ID и Porcilis^® M Hyo ID ONCE в качестве группы положительного контроля. В группе 5 вакцинацию не проводили (отрицательный контроль). Через три недели после вакцинации (в возрасте 6 недель) всем животным проводили заражение с использованием 5,0 log10 TCID 50/мл штамма I12/11 вируса PCV2b дикого типа, проводимое интраназально (3 мл на ноздрю). Схема лечения представлена ниже в таблице 11. Через три недели после заражения всех животных умерщвляли и проводили взятие образцов паховых лимфатических узлов, мезентерических лимфатических узлов, миндалевидных желез и легкого для выявления PCV2.

Всех поросят наблюдали ежедневно после вакцинации в отношении клинических признаков. Образцы сыворотки собирали в день вакцинации и на SD14, SD20, SD35 и SD42 (в ходе некропсии). Образцы тестировали в отношении антител против нуклеиновой кислоты вируса PCV2 посредством кПЦР. Взятие фекальных мазков проводили на SD20, 35 и SD41 от всех животных и исследовали в отношении нуклеиновой кислоты вируса PCV2 посредством кПЦР.

Таблица 11

Группа (N) Адъювант/продукт Иммуноген Mhyo Иммуноген PCV Объем и путь 18 (10 Композиция 1 Штамм 11 PCV2 0,2 мл ID, правая сторона шеи 19 (10) Композиция 2 20 (10) ISA28*+micro-fortasol 21 (10) Porcilic^® PCV ID +
Porcilis^® M Hyo ID Once** 0,2 мл ID R1 (PCV) + 0,2 мл ID R2 (Mhyo) 22 (10) -*** - - -

* Montanide^® ISA 28 от Seppic, к которому добавляли микрофлуидизированное минеральное масло

** Группа положительного контроля для Myho и PCV2

*** Невакцинированная контрольная группа

Введение

Дозировка и введение

Вакцинации проводили внутрикожным путем (0,2 мл) в правую сторону шеи. В группе 21 вакцинацию проводили два раза в правый бок. Заражение проводили интраназальным путем, 6 мл, 3 мл на ноздрю, с использованием аппликатора MAD.

Тест-система

Использовали только здоровых животных. Для исключения нездоровых животных, их исследовали перед вакцинацией (общий физический внешний вид и отсутствие клинических аномалий или заболевания). Непосредственно перед вакцинацией всех животных нумеровали с использованием ушных бирок. Всех свиней наблюдали ежедневно в отношении клинических признаков заболевания. Наблюдения состояли из системных реакций, таких как потеря аппетита, нежелание двигаться, тенденция лежать, вялость или сонливость, озноб, ощетинивание, отек (особенно вокруг глаз), рвота и диарея, и диспноэ.

Экспериментальные методики

Взятие крови

Взятие образцов крови проводили от всех животных в день вакцинации, за одни сутки до заражения, через две недели и в день некропсии. Проводили взятие минимум 4 мл и максимум 8 мл крови на животное. Это осуществляли для всех свиней по отдельности в соответствии со стандартными методиками. Взятие образцов крови проводили без добавления антикоагулянта.

Фекальные мазки

Взятие фекальных мазков проводили за одни сутки до заражения, через 2 wpc (недели после заражения) и за одни сутки до некропсии. Взятие мазков проводили в среду, содержавшую антибиотики.

Посмертное исследование

Через 3 недели после заражения животных транспортировали в помещение для некропсии. Им проводили анестезию с использованием устройства для электрооглушения и обескровливали в соответствии со стандартными методиками. Туши животных уничтожали в соответствии со стандартными методиками. В ходе некропсии животное вскрывали и внутренние органы исследовали in situ, уделяя особое внимание следующим органам: легкие, паховые и мезентерические лимфатические узлы, миндалевидные железы, тимус, селезенка, печень и почки. Затем образцы миндалевидной железы, легкого, мезентерического лимфатического узла пахового лимфатического узла удаляли и разделяли на две части: одну часть для замораживания и анализа PCV2 посредством кПЦР и одну часть для фиксации с последующим (иммуно)гистохимическим анализом.

Обработка образцов

Сыворотку получали из свернувшихся образцов крови и распределяли на аликвоты (например, 2×0,8 мл). Образцы не инактивировали нагреванием. Фекальные образцы получали из мазков и распределяли на аликвоты (например, 2×0,8 мл). До применения образцы хранили при ≤-15°C. Период между взятием образцов и хранением не превышал 36 (сыворотка) или 48 (мазки) часов.

ELISA с антителами против PCV2

Сыворотки тестировали в отношении антител против PCV2 в соответствии со стандартными методиками. В кратком изложении, образцы сыворотки в серийных разведениях инкубировали на микропланшетах для титрования, покрытых экспрессированным бакуловирусом антигеном ORF2 PCV2. После удаления сыворотки все лунки инкубировали с фиксированным количеством меченного биотином PCV2-специфического моноклонального антитела (MoAb). Затем связанное MoAb инкубировали с конъюгированным с пероксидазой стрептавидином с последующей детекцией с хромофором. Титры определяли как обратную величину интерполированного сывороточного разведения с величиной экстинкции, равной 50% максимальной экстинкции для теста. Результаты выражали в качестве титров log₂. Титры ниже 2,0 log₂ считались отрицательными. Для отрицательных образцов для целей вычисления использовали величину 1,0 log₂.

Количественная ПЦР

Количественную ПЦР (кПЦР) для нуклеиновой кислоты PCV2 проводили на всех сыворотках, фекальных мазках и на 10% гомогенатах тканей миндалевидной железы, легкого, мезентерических лимфатических узлов и паховых лимфатических узлов в соответствии со стандартными методиками. В кратком изложении, ДНК экстрагировали из образцов с использованием коммерческого набора. Геномную ДНК PCV2 в каждом образце количественно определяли посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров и зонда, специфичного к PCV2-ORF2. Количество циклов, при котором специфическая флуоресценция превышает пороговое значение, коррелирует с количеством циклов для набора образцов, содержащего известные количества PCV2-ORF2-содержащей плазмиды. Результаты выражали в качестве log₁₀ копий/мкл экстрагированной ДНК (log₁₀ c/мкл). Величины ниже 1,00 log₁₀ c/мкл считались негативным, их принимали за 0,00 log₁₀ c/мкл для целей вычисления.

Иммуногистология (IHC)

Образцы миндалевидной железы и лимфатических узлов получали дли гистологического исследования. Образцы фиксировали в 10% формалине, заливали парафином и проводили иммуногистохимию для детекции антигена PCV2 на предметных стеклах. Сыворотку кролика против PCV2 использовали в качестве первичного антитела и Envision+ (DAKO, Дания) использовали в качестве системы детекции в соответствии с инструкциями изготовителя. Предметные стекла подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином. Проводили микроскопическое исследование. Для миндалевидной железы и лимфатических узлов характерное коричневое окрашивание оценивали по обычной шкале следующим образом:

0 - Не наблюдали специфического положительного окрашивания клеток,

1 - рассеянное (единичное) положительное окрашивание клеток, присутствующее в (менее) 10% фолликулов,

2 - положительное окрашивание (единичных) клеток, выявленное в 10-50% фолликулов в или очаговые скопления >15 клеток с позитивным окрашиванием в < 10% фолликулов,

3 - специфическое окрашивание в > 50% фолликулов.

Результаты регистрировали в качестве общего показателя, являющегося суммой показателей для индивидуальных тканей.

Результаты:

Серология PCV2

В начале измерения на SD1 титры log 2 для всех групп составляли от 4 до 5. Положительный контроль (группа 21) обеспечил log 2 титр 10 между SD34 и SD41. На той же неделе log 2 титры в группах 18, 19 и 20 составляли от 8 до 10. В группе 22 невакцинированного отрицательного контроля log 2 титр был ниже 4.

Вирусная нагрузка PCV2 в сыворотке (сыворотка кПЦР)

Между SD0 (начало измерения) и SD19 нельзя было обнаружить вирусную нагрузку во всех группах (log10 c/мкл=0).

На SD 34 вирусная нагрузка у положительного контроля (группа 21) возрастала до приблизительно 1,0 log10 c/мкл и далее возрастала до приблизительно 1,6 на SD41.

На SD 34 вирусная нагрузка у невакцинированных отрицательных контролей (группа 22) возрастала до приблизительно 4,1 log10 c/мкл и несколько снижалась на SD41 до приблизительно 3,6.

Вирусная нагрузка в группах 18, 19 и 20 составляла от 1,3 до 1,8 log10 c/мкл на SD34 и от 1,6 до 2,1 на SD41.

Вирусная нагрузка PCV2 в фекальных мазках (кПЦР фекального мазка)

На SD19 (начало измерения) нельзя было обнаружить вирусную нагрузку во всех группах (log10 c/мкл=0).

На SD34 вирусная нагрузка у положительных контролей (группа 21) возрастала до приблизительно 1,5 log10 c/мкл и далее возрастала до приблизительно 2,2 на SD41.

Вирусная нагрузка у невакцинированных отрицательных контролей (группа 22) возрастала до приблизительно 3,6 log10 c/мкл на SD34 и оставалась в основном постоянной вплоть до SD41.

Вирусная нагрузка в группах 18, 19 и 20 находилась в диапазоне группы положительного контроля (приблизительно между 1,5 и 1,8 на SD34 и приблизительно между 1,8 и 2,2 на SD41).

Безопасность

Не наблюдали реакций в области инъекции, которые были неприемлемыми. Максимальное повышение средней температуры составляло 0,4°C в момент времени T=0+4 ч. Таким образом, можно было показать, что вакцинная композиция по изобретению, включающая адъювантные комбинации сквалана, витамина E-ацетата и диоксида кремния, обеспечивала приемлемые результаты в отношении эффективности вакцинации, не вызывая неприемлемых побочных реакций.

Пример 7: применение различных типов диоксида кремния фармацевтической категории для составления комбинированной вакцины

В этом примере показано, что различные типы диоксида кремния во всех случаях аморфного диоксида кремния фармацевтической категории (коллоидного) являются пригодными для получения комбинированной вакцины согласно изобретению. Способ получения вакцины в основном соответствовал примеру 1, хотя для некоторых вакцин диоксид кремния добавляли только после прохождения через Microfluidizer^TM. Это не имело значительного влияния на конечную композицию, все типы диоксида кремния были грубо распределены в конечной композиции со средним размером частиц приблизительно 120 нм. Однако при добавлении диоксида кремния после прохождения через Microfluidizer^TM, очень малый процент всего объема диоксида кремния присутствовал в качестве больших агломератов (твердых частиц) выше 10 мкм (вплоть до 200 мкм). Однако, это не имело негативного влияния на эффективность вакцины. Данные для различных композиций приведены в таблице 12.

Таблица 12

Диоксид кремния Микроскопический вид Mastersizer в мкм Внешний вид pH Осмолярность, мосмоль/кг Aerosil 200 Солюбилизат с частицами вплоть до 3 мкм 0,10=0,08
0,50=0,12
0,90=0,17
0,99=0,22 Однородный, почти белый 7,41 214 Aerosil 200 Солюбилизат с частицами вплоть до 3 мкм, также с твердыми частицами вплоть до 50 мкм 0,10=0,08
0,50=0,12
0,90=0,22
0,99=66,96 Однородный, почти белый 7,42 189 Aerosil 200vv Солюбилизат с частицами вплоть до 3 мкм 0,10=0,08
0,50=0,12
0,90=0,17
0,99=0,23 Homogeneous, nearly white 7,38 212 Aerosil 200vv Солюбилизат с частицами вплоть до 3 мкм, также с твердыми частицами вплоть до 200 мкм 0,10=0,08
0,50=0,12
0,90=13,10
0,99=143,79 Однородный, почти белый 7,42 186 Aeroperl 300 Солюбилизат с частицами вплоть до 3 мкм 0,10=0,08
0,50=0,12
0,90=0,17
0,99=0,22 Однородный, почти белый 7,40 211 Aeroperl 300 Солюбилизат с частицами вплоть до 3 мкм, также с твердыми частицами вплоть до 100 мкм 0,10=0,08
0,50=0,12
0,90=0,18
0,99=63,65 Однородный, почти белый 7,42 187 Aerosil 380F Солюбилизат с частицами вплоть до 3 мкм 0,10=0,08
0,50=0,12
0,90=0,17
0,99=0,22 Однородный, почти белый 7,40 211 Aerosil 380F Солюбилизат с частицами вплоть до 3 мкм, также с твердыми частицами вплоть до 100 мкм 0,10=0,08
0,50=0,13
0,90=25,44
0,99=85,02 Однородный, почти белый 7,41 186

Другими типами диоксида кремния, пригодными для применения в рамках настоящего изобретения, являются Aerosil® 90, Aerosil® 130, Aerosil® 150, Aerosil® 200F, Aerosil® 255, Aerosil® OX 50, Aerosil® TT600 и Aeroperl® 300/30.

Выводы

В Примерах 1-7 показано, что среди протестированных композиций только новая комбинация адъювантов сквалана, витамина E-ацетата и диоксида кремния обеспечивала приемлемые результаты в отношении эффективности вакцинации против инфекций PCV2 и Mhyo инфекции без возникновения неприемлемых побочных реакций. Таким образом, с использованием этой адъювантной композиции может быть предоставлена комбинированная вакцина против PCV2 и Mhyo с использованием нереплицирующегося иммуногена цирковируса свиней типа 2 и Mycoplasma hyopneumoniae для безопасного и эффективного внутрикожного введения.

Изобретение относится к области ветеринарной вакцинологии, а именно к комбинированным вакцинам для свиней. Представлена комбинированная вакцина против патогенной инфекции цирковирусом свиней типа 2 (PCV2) и Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), содержащая нереплицирующийся иммуноген цирковируса свиней типа 2 и нереплицирующийся иммуноген Mycoplasma hyopneumoniae, отличающаяся тем, что комбинированная вакцина представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния. Также представлено применение нереплицирующегося иммуногена цирковируса свиней типа 2 и нереплицирующегося иммуногена Mycoplasma hyopneumoniae для производства указанной комбинированной вакцины для профилактического лечения животного от инфекции цирковирусом свиней типа 2 и инфекции Mycoplasma hyopneumoniae, отличающееся тем, что комбинированную вакцину вводят в дерму животного. Раскрыт способ профилактического лечения животного от инфекции цирковирусом свиней типа 2 и инфекции Mycoplasma hyopneumoniae путем введения в дерму животного указанной комбинированной вакцины. Раскрыта адъювантная композиция для составления неживой вакцины, отличающаяся тем, что композиция представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния. Изобретение предоставляет безопасную и эффективную вакцину против патогенной инфекции цирковирусом свиней типа 2 (PCV2) и Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) для трансдермального введения. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 12 табл., 7 пр.

1. Комбинированная вакцина против патогенной инфекции цирковирусом свиней типа 2 (PCV2) и Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), содержащая нереплицирующийся иммуноген цирковируса свиней типа 2 и нереплицирующийся иммуноген Mycoplasma hyopneumoniae, отличающаяся тем, что комбинированная вакцина представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния.

2. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит сквалан в количестве от 1 до 15% масс./об.

3. Комбинированная вакцина по п.1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит витамин E-ацетат в количестве от 2 до 20% масс./об.

4. Комбинированная вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что она содержит эмульгатор с величиной HLB от 8 до 20.

5. Комбинированная вакцина по п.4, отличающаяся тем, что эмульгатор представляет собой полисорбат 80.

6. Комбинированная вакцина по п.4 или 5, отличающаяся тем, что эмульгатор присутствует в количестве от 0,5 до 10% масс./об.

7. Комбинированная вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что она содержит диоксид кремния в количестве от 0,02 до 2% масс./об.

8. Комбинированная вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что нереплицирующийся иммуноген цирковируса свиней типа 2 представляет собой рекомбинантно экспрессируемый белок, кодируемый геном ORF2 цирковируса свиней типа 2.

9. Комбинированная вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что нереплицирующийся иммуноген Mycoplasma hyopneumoniae содержит убитые целые Mycoplasma hyopneumoniae.

10. Комбинированная вакцина по любому из предшествующих пунктов для применения для профилактического лечения животного от инфекции цирковирусом свиней типа 2 и инфекции Mycoplasma hyopneumoniae, отличающаяся тем, что комбинированную вакцину вводят в дерму животного.

11. Комбинированная вакцина для применения по п.10, где объем комбинированной вакцины, вводимой в дерму животного, составляет от 0,1 до 0,5 мл.

12. Применение нереплицирующегося иммуногена цирковируса свиней типа 2 и нереплицирующегося иммуногена Mycoplasma hyopneumoniae для производства комбинированной вакцины по любому из пп.1-9 для профилактического лечения животного от инфекции цирковирусом свиней типа 2 и инфекции Mycoplasma hyopneumoniae, отличающееся тем, что комбинированную вакцину вводят в дерму животного.

13. Способ профилактического лечения животного от инфекции цирковирусом свиней типа 2 и инфекции Mycoplasma hyopneumoniae путем введения в дерму животного комбинированной вакцины по любому из пп.1-9.

14. Адъювантная композиция для составления неживой вакцины, отличающаяся тем, что композиция представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую сквалан, витамин E-ацетат и диоксид кремния.