СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАТА СЕРЕБРА Российский патент 2018 года по МПК A61K38/17 A61K33/38 C07K14/435 B01J19/08 C01G5/00 

Изобретение относится к способам получения протеината серебра, которые могут быть использованы в биотехнологии, медицине и ветеринарии в составе препаратов с антимикробным действием.

Известен способ получения коллоидных наночастиц серебра путем воздействия пучка ускоренных электронов на водный раствор, содержащий полимер медицинского назначения, например поливинилпирролидон и нитрат серебра (патент RU 2602534, МПК C01G 5/00, В82В 3/00, опубл. 20.11.2016). Недостатком данного способа является то, что он не позволяет получать с помощью электронно-лучевой обработки протеинат серебра. Для этих соединений серебра роль стабилизатора выполняют продукты гидролизата белка, а не полимеры медицинского назначения. В отличие от небиодеградируемого полимера поливинилпирролидона, гидролизаты белка являются биодеградируемым субстратом.

Известен коммерческий бактерицидный лекарственный препарат протеината серебра - препарат протаргол - (Машковский М.Д. - Лекарственные средства /Москва, Новая волна, 2008).

Наиболее близким техническим решением является протаргол, который представляет собой порошок коричневого цвета, растворимый в воде, содержит 7,8-8,3% мас. серебра. Препарат получают взаимодействием щелочного гидролизата белка (казеин, желатин, альбумин) в водном растворе с азотнокислым серебром при повышенной температуре с последующей нейтрализацией раствора и распылительной или лиофильной сушкой готового продукта (Благитко Е.М., Бурмистров В.А., Колесников А.П., Михайлов Ю.И., Родионов П.П. - Серебро в медицине /Новосибирск, Наука-Центр, 2004).

Принципиальным недостатком препарата, полученного известным способом, является невысокая стабильность его лекарственной формы в виде водных растворов различной концентрации, срок годности которых не превышает 1-2 месяца. Это не позволяет серийно выпускать препарат в виде готовых к применению лекарственных форм с длительными сроками хранения. Препарат выпускается в виде субстанции (порошка), из которой готовят экстемпоральные формы в рецептурных отделах аптек или клиник или непосредственно потребителем перед использованием. Срок годности таких форм не превышает 1-2 месяца. Это создает определенные неудобства для потребителей и затрудняет широкое использование протаргола в медицинской и ветеринарной практике.

Задачей изобретения является разработка способа получения протеината серебра с улучшенными показателями по стабильности и сохранности водного раствора, что позволило бы исключить стадию сушки и выпускать препарат в виде водного раствора - готовой к применению лекарственной формы с длительным сроком хранения.

Поставленная задача решается с помощью способа получения протеината серебра, включающего растворение в воде гидролизата белка и соли серебра, и последующей электронно-лучевой обработкой раствора путем пропускания через него пучка ускоренных электронов в поглощенной дозе 5-30 килогрей.

Предпочтительно в качестве гидролизата белка используют гидролизаты желатина (коллагена), альбумина, казеина.

Предпочтительно в качестве водорастворимой соли серебра используют нитрат серебра, ацетат серебра.

Предпочтительно готовят раствор гидролизата белка с концентрацией 5-30 мас. %.

В раствор гидролизата белка вводят раствор соли серебра из расчета конечной концентрации серебра не более 3 мас. % и при соотношении серебро/гидролизат белка 1/5-1/20.

Полученный раствор гидролизата белка и соли серебра перемешивают и переливают в плоскую емкость до образования толщины слоя не более 5 см.

В заявляемом способе протеинат серебра получают электронно-лучевой обработкой водного раствора, содержащего гидролизат белка и водорастворимую соль серебра. Электронно-лучевая обработка заключается в пропускании через раствор пучка ускоренных электронов, получаемых на установке (линейном ускорителе) типа ИЛУ-10 в поглощенной дозе 5-30 кГр (килогрей) или 0,5-3 мРад (мегарад). Для приготовления водных растворов солей серебра используются реактивы марки ОСЧ, ЧДА, деионизированная или дистиллированная вода.

В дистиллированной воде готовят раствор гидролизата белка с концентрацией 5-30 мас. %. В отдельной емкости готовят в дистиллированной воде раствор серебра нитрата с концентрацией 0,5-15 мас. %. Раствор соли серебра вносят в раствор гидролизата белка из расчета конечной концентрации серебра не более 2,5-3 мас. % и соотношения серебро/гидролизат белка 1/5-1/20 (на 1 весовую часть серебра 5-20 весовых частей гилролизата белка). Полученный раствор перемешивают и переливают в плоские емкости из стекла или полимерного материала с таким расчетом, чтобы толщина слоя раствора, подвергаемого электронно-лучевой обработке, не превышала 5 см. Такая толщина позволяет проводить качественную обработку всего объема раствора.

Далее раствор подвергают воздействию пучка ускоренных электронов на установке типа ИЛУ-10 с таким расчетом, чтобы поглощенная доза составила 5-30 кГр (килогрей). Величина дозы коррелирует с используемой концентрацией серебра. Для малых концентраций серебра (до 0,3%) достаточно 5 кГр, для больших концентраций (3%) - 30 кГр. В процессе обработки раствор становится темно-коричневого цвета с красноватым оттенком из-за образования протеината серебра.

Продолжительность облучения раствора гидролизата белка и соли серебра задается и определяется величиной поглощенной дозы и зависит от технических характеристик установки. На радиационно-технологической установке ИЛУ-10 (энергия электронов 4,9 МэВ, импульсный ток пучка электронов 300 мА) поглощенная доза 15 кГр достигается в течение 1 мин. Дополнительно поглощенная доза контролируется средствами дозиметрического контроля - рабочим дозиметром (СО ПД(Ф)Р) и цветовым индикатором облучения (ЦВИД-3).

Полноту перехода ионного серебра в протеинат серебра проверяют качественной капельной пробой с насыщенным раствором NaCl (Государственная фармакопея СССР, X издание стр. 746). Ионное серебро при добавлении хлорид-ионов образует характерный белый осадок хлорида серебра, нерастворимый в азотной кислоте, но растворимый в избытке раствора аммиака.

После обработки и получения протеината раствор переливают в мерную емкость, доводят дистиллированной водой до необходимой концентрации по серебру. Готовый раствор переливают в емкость из непрозрачного материала. Хранят раствор в герметично закрытом виде в защищенном от света месте.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение стабильности и сохранности водного раствора протеината серебра. Повышенная стабильность водного раствора протеината серебра позволяет выпускать его в виде готовой к применению лекарственной формы с длительным сроком хранения. В свою очередь это позволяет убрать из процесса получения готового лекарственного препарата стадии сушки и последующего экстемпорального растворения препарата. Это удешевляет производство препарата и повышает его потребительские качества.

Сущность изобретения далее иллюстрируется примерами.

Пример 1

Описание способа получения протеината серебра

В сосуде, снабженном мешалкой, готовят раствор гидролизата желатина (коллагена) с концентрацией 20 мас. %, интенсивно перемешивают до полного растворения.

В другом сосуде готовят концентрат нитрата серебра с концентрацией 10 мас. %, перемешивают при комнатной температуре до полного растворения. Полученный раствор соли серебра вносят в сосуд с раствором гидролизата белка в расчете на 1 весовую часть серебра 11 частей гидролизата белка, интенсивно перемешивают и переливают в плоскую емкость из стекла при толщине слоя раствора не более 5 см. Раствор в емкости подвергают воздействию пучка ускоренных электронов с поглощенной дозой 15 кГр.

После обработки и получения протеината раствор переливают в герметично закрывающуюся емкость из непрозрачного материала. Содержание серебра в полученном препарате в пересчете на сухое вещество составляет 8%, что соответствует содержанию серебра в протарголе (7,8-8,3% масс). При получении готовой к применению лекарственной формы (1% или 2% раствор протаргола или 0,08% и 0,16% раствор в пересчете на содержание серебра) полученный раствор разбавляют дистиллированной водой до необходимой концентрации.

Пример 2

Способ получения по п. 1, только вместо гидролизата желатина используется гидролизат казеина.

Пример 3

Способ получения по п. 1, только вместо гидролизата желатина используется гидролизат альбумина.

Пример 4

Способ получения по п. 1, только вместо нитрата серебра используется ацетат серебра.

Пример 5

Способ получения по п. 1, только вместо 15 кГр раствор подвергают воздействию пучка ускоренных электронов в поглощенной дозе 5 кГр. Дозы меньше 5 кГр могут не обеспечить полного превращения нитрата серебра в протеинат серебра.

Пример 6

Способ получения по п. 1, только вместо 15 кГр раствор подвергают воздействию пучка ускоренных электронов в поглощенной дозе 30 кГр. Дозы больше 30 кГр могут привести к радиационной деструкции гидролизата белка и радиолизу воды.

Пример 7

Способ получения по п. 1, только готовят раствор гидролизата желатина в концентрации 30 мас. % и добавляют раствор соли серебра исходя из расчета на 1 весовую часть серебра 20 весовых частей гидролизата желатина (соотношение серебро/гидролизат белка 1/20). Более высокие концентрации гидролизата белка трудно растворимы и могут привести к образованию нестабильного водного раствора препарата.

Пример 8

Способ получения по п. 1, только готовят раствор гидролизата желатина в концентрации 5 мас. % и добавляют раствор соли серебра исходя из расчета на 1 весовую часть серебра 5 весовых частей гидролизата желатина (соотношение серебро/ гидролизат белка 1/5). Использование более низких концентраций малопродуктивно по экономическим соображениям.

Пример 9

Сравнение электронных спектров препаратов

На рис. 1 представлены электронные спектры поглощения протаргола (прототип, кривая 1) и препарата протеината серебра (кривая 2), полученного по заявляемому способу (пример 1). Спектры сняты на спектрофотометре Specord М-40. Оба препарата были разбавлены до одинаковой концентрации как по серебру, так и по белку. Как видно из представленных данных, в области поглощения серебра (350-550 нм) электронные спектры обоих препаратов практически совпадают, что указывает на химическую идентичность серебра в этих препаратах.

Пример 10

Сравнение стабильности водных растворов препаратов по их антимикробной активности до и после хранения.

Было проведено сравнительное изучение антибактериальной (бактерицидной и бактериостатической) активности протаргола (прототип) и препарата, полученного по заявляемому способу. Препараты содержали одинаковое количество серебра (8%) в пересчете на сухое вещество. Использовали 2% водные растворы, свежеприготовленные и после длительного срока хранения. Растворы хранили в герметично закрытом виде, в защищенном от света месте при комнатной температуре. Срок хранения 1 год.

В качестве тест-штаммов использовали следующие бактериальные культуры:

- Escherichia coli - грамотрицательная неспороносная бактерия;

- Staphylococcus aureus - грамположительная неспороносная бактерия.

Методика исследования

Материалы и реактивы:

- Физиологический раствор 0,9%;

- L-бульон - стандартизованная питательная среда (состав среды: триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлорид натрия - 10г/л, 0,6% глюкозы, рН-7,2);

- Рыбный питательный агар, РПА.

Антимикробную активность препаратов определяли путем подсчета количества жизнеспособных бактерий в колониеобразующих единицах (КОЕ/мл) при культивировании тест-штамма на жидкой питательной среде в присутствии разведений исследуемых препаратов. В качестве контроля была питательная среда с добавлением тест-штамма, но без добавления препарата.

Для определения антимикробной активности препаратов использовали суспензии бактериальных тест-культур с концентрацией - 10³-10⁴ КОЕ/мл, которые получали разведением свежеприготовленной суточной культуры в L-бульоне. В пробирки с 10 мл суспензии бактерий добавляли расчетное количество раствора препарата (1000, 100, 10 мкл), то есть использовали разведения 1/10, 1/100 и 1/1000. Далее пробирки инкубировали в термостате на качалке (180 оборотов в минуту) при температуре 37°С. Через 24 часа отбирали пробы суспензии, которые раститровывали с целью определения жизнеспособных бактерий. Для подсчета концентрации жизнеспособных бактерий (колониеобразующие единицы, КОЕ) делали десятикратные разведения образцов на физиологическом растворе и высевали на чашки Петри с РПА, которые инкубировали в термостате при 37°С, и через 20 часов учитывали результаты - подсчитывали число выросших колоний и рассчитывали концентрацию жизнеспособных бактерий в КОЕ/мл суспензии. Титровки делали в двух повторах, результаты усредняли.

Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице, антимикробная активность у водного раствора протеината серебра - протаргола, полученного по прототипу, после хранения значительно снизилась, у протеината серебра, полученного по заявляемому способу, практически не изменилась.

Преимущество заявляемого способа получения протеината серебра заключается в повышении стабильности водного раствора - готовой к применению лекарственной формы.

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии. Предложен способ получения протеината серебра. Готовят в дистиллированной воде раствор гидролизата белка и раствор соли серебра. В раствор гидролизата белка вводят раствор соли серебра из расчета конечной концентрации серебра не более 3% мас. и при весовом соотношении серебро/гидролизат белка 1/5-1/20 полученный раствор перемешивают и переливают в плоскую емкость до образования слоя толщиной не более 5 см. Подвергают слой электронно-лучевой обработке путем пропускания через него пучка ускоренных электронов в поглощенной дозе 5-30 кГр. В качестве гидролизата белка используют гидролизаты желатина, казеина, альбумина, в качестве водорастворимой соли серебра – нитрат серебра, ацетат серебра. Изобретение позволяет повысить стабильность и сохранность антимикробной активности водного раствора протеината серебра и выпускать его в виде готовой к применению лекарственной формы с длительным сроком хранения без стадии сушки и последующего экстемпорального растворения препарата. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 10 пр.

1. Способ получения протеината серебра, включающий растворение в воде гидролизата белка и соли серебра, отличающийся тем, что в раствор гидролизата белка вводят раствор соли серебра из расчета конечной концентрации серебра не более 3% мас. и при весовом соотношении серебро/гидролизат белка 1/5-1/20, полученный раствор перемешивают и переливают в плоскую емкость до образования толщины слоя не более 5 см и подвергают электронно-лучевой обработке путем пропускания через него пучка ускоренных электронов в поглощенной дозе 5-30 кГр.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве гидролизата белка используют гидролизаты желатина, казеина, альбумина.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве водорастворимой соли серебра используют нитрат серебра, ацетат серебра.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что готовят раствор гидролизата белка с концентрацией 5-30 мас.%.