СТАБИЛИЗАТОР ДЛЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ И ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ГИАЛУРОНИДАЗУ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/47 A61K47/00 A61K9/08 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к стабильной жидкой композиции, содержащей гиалуронидазу и стабилизатор для гиалуронидазы, которая обладает преимуществами, заключающимися в том, что она может стабильно поддерживать свою ферментативную активность в жидком состоянии в течение длительного периода времени, и ее просто вводить, таким образом, что она может эффективно использоваться.

Предшествующий уровень техники

Гиалуронидаза, которая представляет собой обобщенный термин для ферментов деградации гиалуроновой кислоты, исходно была известна в качестве фактора распространения Дюран-Рейнальса, но позже, когда обнаружили, что она демонстрирует сильную активность в отношении гиалуроновой кислоты (НА), ее назвали гиалуронидазой (HAase). Этот фермент классифицируется в соответствии с механизмом действия на гиалуронат-4-гликаногидролазу (ЕС 3.2.1.35), распространенную в семенниках, лизосомах и пчелином яде; гиалуронат-3-гликаногидролазу (ЕС 3.2.1.36), представленную в пиявках; и гиалуронат-лиазу (ЕС 4.2.2.1), представленную у бактерий.

В частности, поскольку гиалуронидазы (РН-20) в семенниках связаны с сайтом заякоривания гликозилфосфатидилинозитола (GPI) на акросомальной части спермия, они представляют собой важные ферменты, вызывающие оплодотворение путем деградации толстого внешнего слоя стенки снаружи яйцеклетки. Известно, что β (1-4) связь между N-ацетил-D-глюкозамином и D-глюкуроновой кислотой, присутствующая в гиалуроновой кислоте (НА), хондроитине и хондроитинсульфатах, гидролизуется путем действия РН-20. Общая молекулярная формула этих ферментов представляет собой C₂₄₅₅H₃₇₇₅N₆₁₇O₇₀₄S₂₁ и их молекулярная масса составляет 53870,9 г/моль. У людей шесть генов, включая HYAL1, HYAL2, HYAL3 и PH-20/SPAM1, ассоциируются с ферментами.

С 1950-х годов были всесторонне рассмотрены обширные применения гиалуронидаз. Первое применение представляло собой подкожную инъекцию в парентеральные жидкости и, кроме того, они использовались для инфильтрационного обезболивания и проводниковой анестезии, для увеличения дисперсии стероидов и местных обезболивающих средств в ортопедической, офтальмологической, пластической хирургии, стоматологии, хирургии ротовой полости, гинекологии и отоларингологической хирургии, и использовались для дисперсии жидкостей тела, чтобы они не образовывали скопления, такие как гематома, предупреждение перитонеальной адгезии, предупреждение образования камней и лечение бесплодия.

Гиалуронидазы, имеющиеся в продаже в настоящее время, экстрагируют из семенников барана и затем лиофилизируют. Такие необработанные гиалуронидазы плавят до подходящей концентрации, заполняют во флаконы и затем лиофилизируют для готовых изделий. Изготовленные таким образом гиалуронидазы содержат избыточные количества чужеродных белков. Поэтому гиалуронидазы, полученные способами, известными из уровня техники, имеют не только проблемы со своей стабильностью при превращении в раствор, но также представляют огромную проблему в отношении их практического применения, поскольку их физиологическая активность снижается из-за уменьшения их стабильности с течением времени.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение предназначено для того, чтобы предложить жидкую композицию, которая заменяет лиофилизированные композиции гиалуронидазы предшествующего уровня техники, которые не только обладают проблемами со стабильностью при переводе в раствор, но также обладают огромными проблемами при их практическом применении, поскольку их физиологическая активность снижается вследствие уменьшения их стабильности с течением времени.

Данное изобретение относится к жидкой композиции, содержащей гиалуронидазу, для решения проблем лиофилизированных композиций предшествующего уровня техники, обусловленных их стабильностью и наличием примесей, и снижения их физиологической активности вследствие уменьшения их стабильности с течением времени при приготовлении в жидкой форме из существующих материалов.

Еще одна задача изобретения заключается в том, чтобы предложить способ приготовления жидкой композиции, содержащей гиалуронидазу, обладающей улучшенной стабильностью.

Еще одна задача изобретения заключается в том, чтобы предложить способ очистки, повышающий чистоту и стабильность гиалуронидазы.

Еще одна задача изобретения заключается в том, чтобы предложить стабилизатор для композиции, содержащей гиалуронидазу.

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции, содержащей гиалуронидазу высокой чистоты, и более предпочтительно, к жидкой композиции, содержащей гиалуронидазу, чистота которой составляет 95% или более и специфическая активность составляет 70000 МЕ/мг или более.

Жидкая композиция по изобретению может содержать стабилизатор, содержащий (а) приблизительно от 1 до 50 мМ буферного агента для обеспечения рН от 4,5 до 6,0, (б) от 0,001 до 0,5 об./об.% неионного поверхностно-активного вещества, и (в) от 0,1 до 5 мМ хелатообразующего агента или хлорида щелочного металла и щелочно-земельного металла.

Кроме того, изобретение относится к стабилизатору, улучшающему стабильность композиции, содержащей гиалуронидазу, предпочтительно гиалуронидазу высокой чистоты.

Гиалуронидаза может представлять собой неочищенную гиалуронидазу или очищенную гиалуронидазу. Стабилизатор для гиалуронидазы в соответствии с настоящим изобретением содержит (а) приблизительно от 1 до 50 мМ буферного агента для обеспечения рН от 4,5 до 6,0, (б) от 0,001 до 0,5 об./об.% неионного поверхностно-активного вещества, и (в) от 0,1 до 5 мМ хелатообразующего агента или хлорида щелочного металла и щелочноземельного металла.

Кроме того, изобретение относится к способу получения гиалуронидазы, обладающей улучшенной чистотой и стабильностью, путем очистки содержащего гиалуронидазу материала посредством одного или более чем одного способа, выбранного из группы, состоящей из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 демонстрирует диаграмму очистки путем аффинной хроматографии с использованием голубой сефарозы в соответствии с примером 1 по настоящему изобретению.

Фиг. 2 демонстрирует диаграмму очистки путем катионообменной хроматографии с использованием Mono S в соответствии с примером 2 по настоящему изобретению.

Фиг. 3 демонстрирует диаграмму очистки путем анионообменной хроматографии с использованием DEAE сефарозы в соответствии с примером 3 по настоящему изобретению.

Фиг. 4 демонстрирует диаграмму очистки путем аффинной хроматографии с использованием гепарин-сефарозы в соответствии с примером 4 по настоящему изобретению.

Фиг. 5 демонстрирует анализ путем GPC (гель-хроматографии) после пятой очистки первого высоленного материала в соответствии с примером 5 по настоящему изобретению.

Фиг. 6 демонстрирует анализ путем GPC (гель-хроматографии) после пятой очистки второго высоленного материала в соответствии с примером 5 по настоящему изобретению.

Фиг. 7 демонстрирует анализ путем GPC (гель-хроматографии) после пятой очистки материала Hdase в соответствии с примером 5 по настоящему изобретению.

Фиг. 8 демонстрирует схему способа очистки гиалуронидазы и способа приготовления жидкой композиции с использованием неочищенной или очищенной гиалуронидазы в соответствии с изобретением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее изобретение будет описано более подробно.

Изобретение относится к жидкой композиции, содержащей гиалуронидазу, чистота которой составляет 95% или более и специфическая активность составляет 70000 МЕ/мг или более.

Гиалуронидазы в соответствии с изобретением могут представлять собой ферменты, обычно получаемые из семенников млекопитающих, например людей, быков, баранов и свиней. Гиалуронидазы, обычно имеющиеся в продаже, представляют собой гиалуронидазы, получаемые путем высаливания семенников млекопитающих и затем лиофилизации или путем депирогенизации после высаливания и затем их лиофилизации. Например, материал семенников млекопитающих, который однократно высаливают и затем лиофилизируют, материал семенников, который дважды высаливают и затем лиофилизируют, или материал семенников, который дважды высаливают, депирогенизируют и затем лиофилизируют, может быть использован в качестве материала-источника для процесса очистки. Гиалуронидазы в соответствии с предшествующим уровнем техники экстрагируют путем двухкратного высаливания из семенников барана, лиофилизации, диализа, депирогенизации, и затем лиофилизации, и экстрагированные гиалуронидазы смешивают с большим количеством белков, отличающихся от гиалуронидаз.

Лиофилизированные гиалуронидазы, имеющиеся в продаже в неочищенном состоянии, включают большое количество примесей, и поэтому их чистота является низкой, и при приготовлении в жидкой композиции их стабильность является низкой. Кроме того, лиофилизированная композиция является неудобной, поскольку она должна быть приготовлена в жидкую форму перед ее применением. Таким образом, существует острая потребность в жидкой композиции, содержащей гиалуронидазу, предпочтительно гиалуронидазу высокой чистоты, обладающей превосходной стабильностью.

Гиалуронидаза, включенная в жидкую композицию в соответствии с изобретением, включает гиалуронидазу, чистота которой составляет 95% или более и специфическая активность составляет 70000 МЕ/мг или более, путем очистки неочищенного материала ферментов с использованием одного или двух более комбинированных способов, выбранных из группы, состоящей из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

Измерение активности гиалуронидаз, очищенных в соответствии с изобретением, осуществляют посредством анализа, изложенного в "Hyaluronidase for injection" в British Pharmacopoeia Monograph (Британской фармакопее). В этом описании утверждается, что стабильность гиалуронидаз может поддерживаться при активности (содержание или специфическая активность) гиалуронидаз, измеренной в соответствии с анализом, изложенным в "Hyaluronidase for injection" в British Pharmacopoeia Monograph, составляющей по меньшей мере 90% или более, например от 90% до 115%, по сравнению с их исходной активностью (100%), которую измеряют до их хранения. В отношении стандартов для оценки стабильности, хотя в анализе в "Hyaluronidase for injection" в British Pharmacopoeia Monograph, установлена стандартная температура измерения 37°С, рН 6,4 и время 20 мин в качестве условий для измерения активности гиалуронидаз, измерение в данном описании может быть осуществлено при температуре, находящейся в диапазоне от 36,5°С до 37,5°С, в диапазоне рН от 6,39 до 6,41 для времени хранения 20 мин и т.п.

Гиалуронидаза, полученная путем осуществления способа очистки в соответствии с настоящим изобретением, гарантирует то, что может быть получен белок, обладающий высокой биологической ферментативной активностью. Соответственно, в изобретении предложен фермент высокой чистоты, обладающий такой специфической активностью, что биологическая активность гиалуронидазы составляет 70000 МЕ/мг или более, предпочтительно 90000 МЕ/мг или более.

Жидкая композиция, содержащая гиалуронидазу в соответствии с изобретением, не только сохраняет стабильность в соответствии с вышеприведенными стандартами измерения, но также может поддерживать стабильность в течение длительного периода времени таким образом, что содержание гиалуронидазы поддерживается на уровне 90% или более при хранении при температурных условиях от 2 до 8°С в течение от 0 до 29 недель.

Кроме того, подтверждено, что высокоочищенная гиалуронидаза по изобретению является безопасной в соответствии с тестированием ответной реакции в виде анафилактического шока и тестированием пассивной кожной анафилактической реакции в качестве тестов антигенности, проводимых с использованием крыс.

В качестве материала источника, используемого для способа очистки в соответствии с изобретением, может быть использован сам материал, выделенный из семенников млекопитающих, продукт, полученный путем высаливания материала, продукт, полученный путем высаливания материала и затем его депирогенизации, или лиофилизированная форма материала или продукта. Например, материал семенников млекопитающих, который однократно высолен и затем лиофилизирован, материал семенников, который дважды высолен и затем лиофилизирован, или материал семенников, который дважды высолен, депирогенизирован и затем лиофилизирован, может быть использован в качестве материала-источника для процесса очистки.

В одном из воплощений способа очистки в соответствии с изобретением гиалуронидазы могут представлять собой гиалуронидазы, полученные путем очистки материала посредством аффинной хроматографии с использованием голубой сефарозы, катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии и аффинной хроматографии с использованием гепарин-сефарозы. Предпочтительно, они могут представлять собой гиалуронидазы, очищенные путем осуществления аффинной хроматографии с использованием голубой сефарозы, катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии, аффинной хроматографии с использованием гепарин-сефарозы и гель-фильтрации.

Предпочтительно, катионообменная хроматография может представлять собой катионообменную хроматографию с использованием Mono S или SP сефарозы и СМ сефарозы, и анионообменная хроматография может представлять собой анионообменную хроматографию с использованием DEAE сефарозы или Q сефарозы.

Аффинная хроматография и ионообменная хроматография может быть осуществлена посредством стандартных способов и, например они включают процессы нанесения, уравновешивания, промывания, элюции и регенерации. В отношении раствора, используемого для каждого процесса, существует уравновешивающий раствор (основной раствор) и промывающий, элюирующий и регенерационный растворы, которые готовят путем добавления в уравновешивающий раствор других компонентов. Предпочтительные примеры уравновешивающего раствора и промывающего раствора, и регенерирующих растворов, используемых для каждого процесса, изложены в следующей таблице.

Для способа очистки в соответствии с изобретением предпочтительно гель-фильтрация может быть осуществлена после проведения хроматографии, и примеры гель-фильтрации могут включать гель-фильтрацию с использованием сефакриловой смолы, супердекса и суперозы. В одном из воплощений изобретения гель-фильтрация может быть осуществлена посредством стандарных способов и, например, она может быть осуществлена с использованием от 1 до 50 мМ ацетата натрия, от 0,1 до 5 мМ щелочного металла или щелочно-земельного металла, 0,001~0,5 об./об.% неионного поверхностно-активного вещества и уравновешивающего раствора с рН 4,5~5,5.

В соответствии с одним из воплощений изобретения в аффинной хроматографии с использованием голубой сефарозы можно использовать в качестве буферов уравновешивающий, промывающий, элюирующий и регенерирующий буферы. В качестве уравновешивающего буфера может быть использован глицин и, предпочтительно, от 1 до 50 мМ глицин может быть использован в качестве уравновешивающего буфера и его предпочтительный рН составляет от 8,0 до 11,0. Ионное поверхностно-активное вещество может быть использовано в качестве промывающего буфера, предпочтительно оно может быть использовано в количестве от 0,1 до 0,5 об./об.%, и наиболее предпочтительно оно может быть использовано в количестве 0,3%. Хлорид натрия может быть использован в качестве элюирующего буфера и предпочтительно может быть использован от 35 до 200 мМ хлорид натрия.

В соответствии с одним из воплощений изобретения в катионообменной хроматографии можно использовать буфер, и в качестве буферов можно использовать уравновешивающий, элюирующий и регенерирующий буферы. Уравновешивающий буфер, содержащий фосфат натрия, хелатообразующий агент и неионное поверхностно-активное вещество, может быть использован в качестве уравновешивающего буфера и, предпочтительно, может быть включен от 1 до 50 мМ фосфат натрия, от 0,1 до 5 мМ хелатообразующий агент, и от 0,001 до 0,5 об./об.% неионное поверхностно-активное вещество, и, предпочтительно, его рН составляет от 5,5 до 6,5. Хлорид натрия может быть использован в качестве элюирующего буфера, и, наиболее предпочтительно, может быть использован от 35 до 200 мМ хлорид натрия.

В соответствии с одним из воплощений изобретения для анионообменной хроматографии в качестве буферов могут быть использованы уравновешивающий, уравновешивающий после нанесения и регенерирующий буферы. Фосфат калия может быть использован в качестве уравновешивающего буфера, предпочтительно, может быть использован от 1 до 50 мМ фосфат калия, и его предпочтительный рН составляет от 6,5 до 7,5. Хлорид натрия может быть использован в качестве уравновешивающего буфера после нанесения и предпочтительно может быть использован от 50 до 100 мМ хлорид натрия.

В соответствии с одним из воплощений изобретения для аффинной хроматографии с использованием гепарин-сефарозы в качестве буферов может быть использован уравновешивающий, промывающий, элюирующий и регенерирующий буфер. В качестве уравновешивающего буфера может быть использован уравновешивающий буфер, содержащий ацетат натрия, хелатообразующий агент и неионное поверхностно-активное вещество, и, предпочтительно, может быть использован от 1 до 50 мМ ацетат натрия, от 0,1 до 5 мМ хелатообразующий агент, и от 0,001 до 0,5 об./об.% неионное поверхностно-активное вещество, и его предпочтительный рН составляет от 4,0 до 5,5. Хлорид натрия может быть использован в качестве элюирующего буфера и, предпочтительно, может быть использован от 200 до 700 мМ хлорид натрия.

Диапазоны специфических активностей ферментов в концентратах, полученных после соответствующей очистки, представлены в следующей таблице 2.

Жидкая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть введена посредством путей парентерального введения, и, например, она может быть парентерально введена путем инъекции.

Жидкая композиция может дополнительно содержать хлорид натрия и лактозу в качестве эксципиентов помимо гиалуронидазы, и она может содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель и т.п., но не ограничиваться ими.

Кроме того, еще один аспект изобретения относится к стабилизатору для гиалуронидазы и, подробнее, к стабилизатору, содержащему приблизительно от 1 до 50 мМ буферного агента для обеспечения рН от 4,5 до 6,0, от 0,001 до 0,5% неионного поверхностно-активного вещества, и от 0,1 до 5 мМ хелатообразующего агента или хлорида щелочного металла и щелочноземельного металла.

Гиалуронидазы, в отношении которых применим стабилизатор, могут представлять собой неочищенные гиалуронидазы или очищенные гиалуронидазы, и предпочтительно они представляют собой очищенные гиалуронидазы.

Гиалуронидазы могут представлять собой ферменты, обычно получаемые из семенников млекопитающих, например людей, быков, баранов и свиней, или рекомбинантные гиалуронидазы, экспрессируемые путем трансдукции гиалуронидаз, полученных у млекопитающих, в микроорганизмы или клетки животных, или клетки растений. Способы продуцирования рекомбинантных гиалуронидаз идентичны обычным способам получения в микроорганизмах или в клетках животных или растений в соответствии с рекомбинантными способами генов млекопитающих, и иллюстративные способы описаны в Frost et al., 1997, BBRC, 236, 10-15; Lin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10071-10075; Reitinger et al., 2008, Protein Expression and Purification, 57, 226-233; Kordowicz et al., Европейский патент, WO 2000/077221.

Гиалуронидазы включают ферменты, полученные путем однократного высаливания семенников млекопитающих и лиофилизации, ферменты, полученные путем двухкратного высаливания семенников и затем лиофилизации, ферменты, полученные путем двухкратного высаливания семенников, депирогенизации и затем лиофилизации и т.п. Кроме того, гиалуронидазы могут представлять собой ферменты, очищенные посредством одного или двух более комбинированных способов, выбранных из группы, состоящей из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации и, предпочтительно, они могут представлять собой гиалуронидазы, очищенные посредством вышеприведенных способов очистки и чистота которых составляет 95% или более, и специфическая активность составляет 70000 МЕ/мг или более. Способы очистки представляют собой способы, описанные выше.

Для стабилизации жидкой композиции в соответствии с изобретением величина рН представляет собой один из основных факторов и независимо от использованных здесь буферных агентов рН корректируют в пределах значений, включающих от приблизительно 4,0 до приблизительно 7,0, предпочтительно, от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, например, значений, выбранных из группы, состоящей из 4,5, 4,7, 5,0, 5,5, 5,7 и 6,0. рН может быть получен путем корректирования с использованием кислоты или основания, известного в релевантной области техники, или путем использования подходящей смеси компонентов буферных агентов, или того и другого.

Фармацевтически приемлемые буферы, подходящие для изобретения, могут включать без ограничения один или более чем один комбинированный буферный агент, выбранный из группы, состоящей из сукцинатного буфера, ацетатного буфера, фосфатного буфера, цитратного буфера, малонатного буфера, буфера MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), буфера Tris и глицинового буфера. Предпочтительная концентрация буферных агентов может быть подходящим образом определена при рассмотрении предполагаемых рН условий желаемого раствора и типа используемых буферных агентов и, например, она может составлять от 1 до 50 мМ, предпочтительно от 10 до 30 мМ.

Неионное поверхностно-активное вещество стабилизатора может представлять собой сложный эфир полиоксиэтиленсорбита и жирной кислоты (Tween). Например, оно может представлять собой вещество, выбранное из группы, состоящей из полисорбата 20 (Tween 20), полисорбата 80 (Tween 80) и Triton Х-100.

Хелатообразующий агент относится к молекуле, содержащей два или более чем два атома-донора электронов, способных образовывать координационную связь с единичным ионом металла, и, предпочтительно, он может представлять собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Концентрация хелатообразующего агента может составлять от 0,1 мМ до 5 мМ, предпочтительно от 0,5 мМ до 1 мМ.

Хлорид щелочного металла и щелочно-земельного металла может представлять собой MgCl₂. Концентрация MgCl₂ может составлять от 0,1 мМ до 5 мМ, предпочтительно от 0,5 мМ до 5 мМ.

Примеры стабилизатора могут включать MgCl₂, неионное поверхностно-активное вещество и буферный агент для обеспечения рН от 4,0 до 6,0, или включают EDTA, неионное поверхностно-активное вещество, и буферный агент для обеспечения рН от 4,0 до 6,0.

В первой очистке путем аффинной хроматографии можно использовать буфер, и в качестве буферов могут быть использованы уравновешивающий, промывающий, элюирующий и регенерирующий буферы. Глицин может быть использован в качестве уравновешивающего буфера, предпочтительно от 1 до 50 мМ глицин может быть использован в качестве уравновешивающего буфера, и предпочтительный его рН составляет от 8,0 до 11,0. Ионное поверхностно-активное вещество может быть использовано в качестве промывающего буфера, предпочтительно оно может быть использовано в количестве от 0,1 до 0,5%, и наиболее предпочтительно оно может быть использовано в количестве 0,3%. Хлорид натрия может быть использован в качестве элюирующего буфера и предпочтительно, может быть использовано от 35 до 200 мМ хлорида натрия.

Во второй очистке путем катионообменной хроматографии можно использовать буфер, и в качестве буферов могут быть использованы уравновешивающий, элюирующий и регенерирующий буферы. Уравновешивающий буфер может включать фосфат натрия, EDTA и Tween 80, предпочтительно может быть включен от 1 до 50 мМ фосфат натрия, от 0,1 до 5 мМ EDTA, и от 0,001 до 0,5% Tween 80, и предпочтительный рН его составляет от 5,5 до 6,5. Хлорид натрия может быть использован в качестве элюирующего буфера и наиболее предпочтительно может быть использован от 35 до 200 мМ хлорид натрия.

В анионообменной хроматографии третьей очистки можно использовать буфер, и в качестве буферов можно использовать уравновешивающий, уравновешивающий после нанесения и элюирующий буферы. В качестве уравновешивающего буфера может быть использован фосфат калия, предпочтительно, может быть использован от 1 до 50 мМ фосфат калия, и предпочтительный его рН составляет от 6,5 до 7,5. В качестве уравновешивающего буфера после нанесения может быть использован хлорид натрия и, предпочтительно, может быть использован от 50 до 100 мМ хлорид натрия.

В аффинной хроматографии четвертой очистки можно использовать буфер, и в качестве буферов можно использовать уравновешивающий, промывающий, элюирующий и регенерирующий буфер. Уравновешивающий буфер может включать ацетат натрия, EDTA и Tween 80, предпочтительно, может быть использован от 1 до 50 мМ ацетат натрия, от 0,1 до 5 мМ EDTA, и от 0,001 до 0,5% Tween 80, и предпочтительный его рН составляет от 4,0 до 5,5. В качестве элюирующего буфера может быть использован хлорид натрия и, предпочтительно, может быть использован от 200 до 700 мМ хлорид натрия.

В гель-фильтрации пятой очистки можно использовать буфер, и в качестве буфера может быть использован уравновешивающий буфер. В качестве уравновешивающего буфера может быть использован буфер, включающий ацетат натрия, MgCl₂ и Tween 80, предпочтительно, от 1 до 50 мМ ацетат натрия, от 0,1 до 5 мМ MgCl₂, и от 0,001 до 0,5% Tween 80, и предпочтительный его рН составляет от 4,5 до 5,5. Жидкая композиция относится к любым формам водных растворов и любым типам суспензий, и она отличается тем, что ее вводят подкожным путем.

Поскольку жидкая композиция в соответствии с конкретным воплощением изобретения может поддерживать свою активность в течение длительного периода времени таким образом, что содержание гиалуронидазы поддерживается на уровне 90% или более даже при хранении при температурных условиях от 2 до 8°С в течение до 29 недель, она может решить проблему предшествующего уровня техники, заключающуюся в том, что физиологическая активность уменьшается вследствие уменьшения стабильности со временем.

В конкретном воплощении изобретения в способе очистки гиалуронидазы осуществляют стадию приготовления материала-источника путем экстрации гиалуронидазы из семенников барана и лиофилизации; первую стадию очистки материала-источника с использованием аффинной хроматографии с использованием голубой сефарозы; вторую стадию очистки с использованием катионообменной хроматографии после первой стадии очистки; третью стадию очистки с использованием анионообменной хроматографии после второй очистки; четвертую стадию очистки с использованием аффинной хроматографии после третьей стадии очистки; и пятую стадию очистки с использованием гель-фильтрации после четвертой стадии очистки, и типы конкретных буферов, используемых на каждой стадии, и их предпочтительные диапазоны являются такими, как описано в отношении жидкой композиции выше.

Жидкая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть введена посредством путей парентерального введения и, например, она может быть введена парентерально путем инъекции.

Жидкая композиция может дополнительно включать хлорид натрия и лактозу в качестве эксципиентов помимо гиалуронидазы, и она может включать фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель и т.п., но не ограничиваться ими.

Кроме того, еще один аспект изобретения относится к стабилизатору для гиалуронидазы и подробней к стабилизатору, содержащему приблизительно от 1 до 50 мМ буферного агента для обеспечения рН от 4,5 до 6,0, от 0,001 до 0,5% неионного поверхностно-активного вещества, и от 0,1 до 5 мМ хелатообразующего агента или хлорида щелочного металла и щелочноземельного металла.

Гиалуронидазы, в отношении которых применим стабилизатор, могут представлять собой неочищенные гиалуронидазы или очищенные гиалуронидазы и, предпочтительно, они представляют собой очищенные гиалуронидазы.

Гиалуронидазы могут представлять собой ферменты, обычно получаемые из семенников млекопитающих, например людей, быков, баранов и свиней, или рекомбинантные гиалуронидазы, экспрессируемые путем трансдукции гиалуронидаз, полученных у млекопитающих, в микроорганизмы или клетки животных, или клетки растений. Способы продукции рекомбинантных гиалуронидаз идентичны обычным способам получения в микробах или в клетках животных или растений в соответствии с рекомбинантными способами генов млекопитающих, и иллюстративные способы описаны в Frost et al., 1997, BBRC, 236, 10-15; Lin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10071-10075; Reitinger et al., 2008, Protein Expression and Purification, 57, 226-233; Kordowicz et al., Европейский патент WO 2000/077221.

Гиалуронидазы включают ферменты, полученные путем однократного высаливания семенников млекопитающих и лиофилизации, ферменты, полученные путем двухкратного высаливания семенников и затем лиофилизации, ферменты, полученные путем двухкратного высаливания семенников, депирогенизации и затем лиофилизации и т.п. Кроме того, гиалуронидазы могут представлять собой ферменты, очищенные посредством одного или двух более комбинированных способов, выбранных из группы, состоящей из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации и, предпочтительно, они могут представлять собой гиалуронидазы, очищенные посредством вышеприведенных способов очистки и чистота которых составляет 95% или более и специфическая активность составляет 70000 МЕ/мг или более. Способы очистки представляют собой способы, описанные выше.

Для стабилизации жидкой композиции в соответствии с изобретением величина рН представляет собой один из основных факторов и независимо от использованных здесь буферных агентов рН корректируют в пределах значений, включающих от приблизительно 4,0 до приблизительно 7,0, предпочтительно, от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, например, значений, выбранных из группы, состоящей из 4,5, 4,7, 5,0, 5,5, 5,7 и 6,0. рН может быть получен путем корректирования с использованием кислоты или основания, известного в релевантной области техники, или путем использования подходящей смеси компонентов буферных агентов, или путем их обоих.

Фармацевтически приемлемые буферы, подходящие для изобретения, могут включать без ограничения один или более чем один комбинированный буферный агент, выбранный из группы, состоящей из сукцинатного буфера, ацетатного буфера, фосфатного буфера, цитратного буфера, малонатного буфера, буфера MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), буфера Tris и глицинового буфера. Предпочтительная концентрация буферных агентов может быть подходящим образом определена при рассмотрении предполагаемого условия рН желаемого раствора и типа используемых буферных агентов и, например, она может составлять от 1 до 50 мМ, предпочтительно от 10 до 30 мМ.

Неионное поверхностно-активное вещество стабилизатора может представлять собой сложный эфир полиоксиэтиленсорбита и жирной кислоты (Tween). Например, оно может представлять собой вещество, выбранное из группы, состоящей из полисорбата 20 (Tween 20), полисорбата 80 (Tween 80) и Triton Х-100.

Хелатообразующий агент относится к молекуле, содержащей два или более чем два атома-донора электронов, способных образовывать координационную связь с единичным ионом металла и предпочтительно он может представлять собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Концентрация хелатообразующего агента может составлять от 0,1 мМ до 5 мМ, предпочтительно от 0,5 мМ до 1 мМ.

Хлорид щелочного металла и щелочно-земельного металла может представлять собой MgCl₂. Концентрация MgCl₂ может составлять от 0,1 мМ до 5 мМ, предпочтительно от 0,5 мМ до 5 мМ.

Примеры стабилизатора могут включать MgCl₂, неионное поверхностно-активное вещество и буферный агент для обеспечения рН от 4,0 до 6,0, или включают EDTA, неионное поверхностно-активное вещество, и буферный агент для обеспечения рН от 4,0 до 6,0

В первой очистке путем аффинной хроматографии можно использовать буфер, и в качестве буферов могут быть использованы уравновешивающий, промывающий, элюирующий и регенерирующий буферы. Глицин может быть использован в качестве уравновешивающего буфера, предпочтительно от 1 до 50 мМ глицин может быть использован в качестве уравновешивающего буфера, и предпочтительный его рН составляет от 8,0 до 11,0. Ионное поверхностно-активное вещество может быть использовано в качестве промывающего буфера, предпочтительно оно может быть использовано в количестве от 0,1 до 0,5%, и наиболее предпочтительно оно может быть использовано в количестве 0,3%. Хлорид натрия может быть использован в качестве элюирующего буфера и предпочтительно может быть использовано от 35 до 200 мМ хлорида натрия.

Во второй очистке путем катионообменной хроматографии можно использовать буфер, и в качестве буферов могут быть использованы уравновешивающий, элюирующий и регенерирующий буферы. Уравновешивающий буфер может включать фосфат натрия, EDTA и Tween 80, предпочтительно может быть включен от 1 до 50 мМ фосфат натрия, от 0,1 до 5 мМ EDTA, и от 0,001 до 0,5% Tween 80, и предпочтительный рН его составляет от 5,5 до 6,5. Хлорид натрия может быть использован в качестве элюирующего буфера и наиболее предпочтительно может быть использован хлорид натрия от 35 до 200 мМ.

В анионообменной хроматографии третьей очистки можно использовать буфер, и в качестве буферов можно использовать уравновешивающий, уравновешивающий после нанесения и элюирующий буферы. В качестве уравновешивающего буфера может быть использован фосфат калия, предпочтительно может быть использован от 1 до 50 мМ фосфат калия, и предпочтительный его рН составляет от 6,5 до 7,5. В качестве уравновешивающего буфера после нанесения может быть использован хлорид натрия, и предпочтительно может быть использован от 50 до 100 мМ хлорид натрия.

В аффинной хроматографии четвертой очистки можно использовать буфер, и в качестве буферов можно использовать уравновешивающий, промывающий, элюирующий и регенерирующий буфер. Уравновешивающий буфер может включать ацетат натрия, EDTA и Tween 80, предпочтительно, может быть использован от 1 до 50 мМ ацетат натрия, от 0,1 до 5 мМ EDTA, и от 0,001 до 0,5% Tween 80, и предпочтительный его рН составляет от 4,0 до 5,5. В качестве элюирующего буфера может быть использован хлорид натрия, и предпочтительно может быть использован от 200 до 700 мМ хлорид натрия.

В гель-фильтрации пятой очистки можно использовать буфер, и в качестве буфера может быть использован уравновешивающий буфер. В качестве уравновешивающего буфера может быть использован буфер, включающий ацетат натрия, MgCl₂ и Tween 80, предпочтительно от 1 до 50 мМ ацетат натрия, от 0,1 до 5 мМ MgCl₂, и от 0,001 до 0,5% Tween 80, и предпочтительный его рН составляет от 4,5 до 5,5. Жидкая композиция относится к любым формам водных растворов и любым типам суспензий, и она отличается тем, что ее вводят подкожным путем.

Поскольку жидкая композиция в соответствии со специфическим воплощением изобретения может поддерживать свою активность в течение длительного периода времени таким образом, что содержание гиалуронидазы поддерживается на уровне 90% или более даже при хранении при температурных условиях от 2 до 8°С в течение до 29 недель, она может решить проблему предшествующего уровня техники, заключающуюся в том, что физиологическая активность уменьшается вследствие уменьшения стабильности со временем.

В специфическом воплощении изобретения в способе очистки гиалуронидазы осуществляют стадию приготовления материала-источника путем экстрации гиалуронидазы из семенников барана и лиофилизации; первую стадию очистки материала-источника с использованием аффинной хроматографии с использованием голубой сефарозы; вторую стадию очистки с использованием катионообменной хроматографии после первой стадии очистки; третью стадию очистки с использованием анионообменной хроматографии после второй очистки; четвертую стадию очистки с использованием аффинной хроматографии после третьей стадии очистки; и пятую стадию очистки с использованием гель-фильтрации после четвертой стадии очистки, и типы конкретных буферов, используемых на каждой стадии, и их предпочтительные диапазоны являются такими, как описано в отношении жидкой композиции выше.

В соответствии с вышеприведенным способом очистки гиалуронидазы высокой чистоты по изобретению, чистота ранее полученных гиалуронидаз может быть увеличена.

Кроме того, в соответствии с инъекцией гиалуронидазы высокой чистоты по изобретению, ее стабильность может быть сохранена путем удаления чужеродных белков, которые представляют собой проблему ранее получаемых гиалуронидаз.

Кроме того, жидкая композиция, дополнительно содержащая стабилизатор в дополнение к очищенной гиалуронидазе, обладает теми преимуществами, что она может стабильно поддерживать свою активность в течение длительного периода времени и может быть просто введена.

Далее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры. Тем не менее они просто иллюстрируют изобретение, и объем изобретения никоим образом не ограничен этими примерами.

Пример 1: Аффинная хроматография с использованием голубой сефарозы (первая очистка)

Материалы, используемые для очистки гиалуронидаз в данном эксперименте, представляют собой, как указано в таблице 3 ниже, 1) лиофилизированный материал после первого высаливания из семенников в соответствии с предшествующими способами (первый высоленный материал), 2) лиофилизированный материал после второго высаливания (второй высоленный материал), и 3) лиофилизированный материал после депирогенизации (название материала: Гиалуронидаза (ниже Hdase) Shanghai Liamim Co.), и их используют в последующих 5-стадийнных способах очистки.

Способ хроматографии состоит из способов нанесения, уравновешивания, промывания, элюирования и регенерации. В первой очистке с использованием аффинной хроматографии используемые здесь буферы представлены в таблице 4 ниже.

Для первой очистки гиалуронидазы в качестве смолы использовали голубую сефарозу 6 Fast Flow, и ее использовали для заполнения колонок с внутренним диаметром 1,6 см до тех пор, пока высота смолы не достигнет 10 см. 1 г материала гиалуронидазы растворяли в 500 мл (2 мг/мл) уравновешивающего буфера (10 мМ глицин, рН 10,0), и фильтрат, остающийся после фильтрования, использовали в качестве образца для анализа.

Образец гиалуронидазы наносили на колонки, и используемая скорость нанесения составила 2,0 мл/мин. Затем колонки уравновешивали уравновешивающим буфером и промывали промывающим буфером (0,3% каприлат натрия в основном буфере). Стадии, следующие за уравновешиванием, анализировали при скорости потока 3,0 мл/мин. После промывания смолы вновь уравновешивали уравновешивающим буфером и элюировали элюирующим буфером (135 мМ соль в основном буфере) для сбора вытекающих растворов. Поскольку гиалуронидаза с высокой вероятностью утрачивает свою активность в основных условиях, рН собранных растворов корректировали до 6,0-7,0 путем добавления агента, корректирующего рН, и после завершения элюирования колонки регенерировали посредством регенерирующего буфера (1М соль в основном буфере). Результаты анализа представлены на фиг 1. Выход и специфическая активность, полученная после очистки, представлены в таблице 8 ниже.

Пример 2: Катионообменная хроматография с использованием Mono S (вторая очистка)

Катионообменную хроматографию использовали в качестве второй очистки. С использованием буферов, перечисленных в таблице 5, осуществляли способы нанесения, уравновешивания, промывания, элюирования и регенерации образца.

Для второй очистки гиалуронидазы Mono S использовали в качестве смолы, и ее использовали для заполнения колонок с внутренним диаметром 1,6 см до тех пор, пока высота смолы не достигнет 10 см. Образец, сначала очищенный после примера 1, трижды разводили уравновешивающим буфером (10 мМ фосфат натрия двухосновный, 1 мМ EDTA, 0,1% Tween 80, рН 6,0) и затем использовали в качестве образца для анализа.

Образец гиалуронидазы наносили на колонки, и используемая скорость нанесения составила 2,0 мл/мин. Затем колонки уравновешивали уравновешивающим буфером, и стадии, следующие за уравновешиванием, анализировали при скорости потока 3,0 мл/мин. После уравновешивания смолы промывали промывающим буфером (80 мМ соль в основном буфере). После промывания смол их элюировали элюирующим буфером (125 мМ соль в основном буфере) для сбора вытекающих растворов. После завершения элюирования колонки регенерировали посредством регенерирующего буфера (1М соль в основном буфере). Результаты анализа представлены на фиг. 2. Выход и специфическая активность, полученная после очистки, представлены в таблице 8 ниже.

Пример 3: Анионообменная хроматография с использованием DEAE сефарозы (третья очистка)

Анионообменную хроматографию использовали в качестве третьей очистки. С использованием буферов, перечисленных в таблице 6, осуществляли способы нанесения, уравновешивания и регенерации образца.

Для третьей очистки гиалуронидазы в качестве смолы использовали DEAE сефарозу, и ее использовали для заполнения колонок с внутренним диаметром 1,6 см до тех пор, пока высота смолы не достигнет 5 см. Образец, во второй раз очищенный из примера 2, разбавляли в 1,67 раз уравновешивающим буфером (5 мМ двухосновный фосфат калия, рН 7,1) и затем использовали в качестве образца для анализа.

Образец гиалуронидазы наносили на колонки, и применяемая скорость нанесения составила 2,0 мл/мин. Затем колонки уравновешивали уравновешивающим буфером после нанесения (75 мМ соль в основном буфере), и стадии, следующие за уравновешиванием, анализировали при скорости потока 3,0 мл/мин. После уравновешивания смолы регенерировали посредством регенерирующего буфера (1М соль в основном буфере) без какого-либо отдельной элюирующей стадии. При третьей очистке растворы, которые вытекали без связывания со смолами во время нанесения без какой-либо отдельной стадии элюирования (поток через раствор (F/T)), по-видимому, представляли собой очищенные элюаты гиалуронидазы. Результаты анализа представлены на фиг. 3. Выход и специфическая активность, полученная после очистки, представлены в таблице 8 ниже.

Пример 4: Аффинная хроматография с использованием гепарин-сефарозы (четвертая очистка)

Аффинную хроматографию использовали в качестве четвертой очистки. С использованием буферов, перечисленных в таблице 7, осуществляли способы нанесения, уравновешивания, промывания, элюирования и регенерации образца.

Для четвертой очистки гиалуронидазы, трижды очищенной посредством анионообменной хроматографии, в качестве смолы использовали гепарин-сефарозу 6 fast flow, и ее использовали для заполнения колонок с внутренним диаметром 1,0 см до тех пор, пока высота смолы не достигнет 10 см. 10х концентрацию уравновешивающего буфера (200 мМ ацетат натрия, 10 мМ EDTA, 1,0% Tween 80, рН 4,5) добавляли к образцу, трижды очищенному после примера 3, в 1/9 по объему трижды очищенного образца, и затем использовали в качестве образца для анализа.

Образец гиалуронидазы наносили на колонки, и используемая скорость нанесения составила 0,5 мл/мин. Затем колонки уравновешивали уравновешивающим буфером (20 мМ ацетат натрия, 1 мМ EDTA, 0,1% Tween 80, рН 4,5) и промывали промывающим буфером (200 мМ соль в основном буфере). Стадии, следующие за уравновешиванием, анализировали при скорости потока 1,0 мл/мин. После промывания смолы элюировали элюирующим буфером (500 мМ соль в основном буфере) для сбора вытекающих растворов. После завершения элюирования колонки регенерировали посредством регенерирующего буфера (1М соль в основном буфере). Результирующая блок-схема очистки для данного эксперимента представлена на фиг. 4. Выход и специфическая активность, полученные после очистки, представлены в таблице 8 ниже.

Пример 5: Гель-фильтрация с использованием сефакриловой смолы (пятая очистка)

Гель-фильтрацию использовали в качестве пятой очистки, и используемый здесь уравновешивающий раствор представляет собой раствор, содержащий 10 мМ ацетат натрия, 1 мМ MgCl₂, 0,01% Tween 80 и рН 5,0.

Для пятой очистки посредством гель-фильтрации четырежды очищенной гиалуронидазы в качестве смолы использовали Sephacryl S-200, и ее использовали для заполнения колонок с внутренним диаметром 1,6 см до тех пор, пока высота смолы не достигнет 90 см. Раствор образца, четырежды очищенный в примере 4, концентрировали до 1% или подобного относительно объема смолы и затем использовали в качестве образца для анализа.

Образец гиалуронидазы наносили на колонки, и используемая скорость нанесения составила 0,1 мл/мин. Затем осуществляли способ сортировки вытекающим уравновешивающим буфером (10 мМ ацетат натрия, 1 мМ MgCl₂, 0,01% Tween 80, рН 5,0). Его анализировали при скорости потока 0,1 мл/мин, и растворы, вытекающие при элюировании, собирали. Выход и специфическая активность, полученные после очистки, представлены в таблице 8 ниже.

Результаты тестирования чистоты после пятой очистки в отношении вышеприведенных трех различных образцов гиалуронидазы представлены на фиг. 5-7 и в таблице 8. Выход белка, представленный в таблице 8, относится к выходу после очистки для всех белков, содержащих гиалуронидазу. Как представлено на фиг. 5-7, димеры или полимеры, отличающиеся от гиалуронидаз, не представлены на хроматограмме в соответствии с документами GPC после пятой очистки, и их специфическая активность (МЕ/мг белка) составила 90000 МЕ/мг белка или более, и их чистота (GPC) составила 95% или более.

Как представлено на фиг. 5-7 и в таблице 8, подтверждено, что даже при использовании в вышеприведенной пятистадийной очистке различных исходных материалов (материал после первого высаливания, материал после второго высаливания и Hdase) специфическая активность конечных концентратов, полученных после завершения пятой очистки, составила 90000 МЕ/мг белка или более, и их чистота составила 95% или более. Эти результаты означают, что какие бы материалы гиалуронидазы с каких бы стадий не использовали, вышеприведенные результаты могут быть достигнуты посредством вышеприведенного пятистадийного способа очистки, и конечные концентраты вряд ли содержат димеры или мультимеры помимо гиалуронидаз.

Пример 6: Тестирование стабильности (без добавления стабилизатора)

6-1: Тестирование стабильности концентрата после элюирования после первой очистки

рН каждого концентрата после элюирования, полученного после первой очистки первого высоленного материала, второго высоленного материала и Hdase с использованием аффинной хроматографии в соответствии с примером 1, корректировали до 6,0-7,0 и затем их разливали в определенных количествах и хранили при 4°С. В каждый момент времени содержание гиалуронидаз измеряли, и результаты представлены в таблице 9 ниже.

В каждый момент времени ферментативную активность (или содержание) гиалуронидаз тестировали в соответствии с анализом, изложенным в "Hyaluronidase for injection" в British Pharmacopoeia Monograph. Везде в настоящем описании стабильность гиалуронидаз относится к активности (содержание или специфическая активность) гиалуронидаз, измеренной в соответствии с анализом, изложенным в "Hyaluronidase for injection" в British Pharmacopoeia Monograph.

Ферментативные активности (или содержания) в каждом тестируемом состоянии выражены в виде процентных величин специфической активности или активности, измеренной в каждый момент времени, относительно специфической активности или активности на 0 неделе, представленной в таблице 8, которая принимается равной 100, и они представлены в таблице 9 ниже.

Как видно из таблицы 9 выше, в качестве результата тестирования стабильности содержания при 4°С в отношении концентратов после элюирований, полученных путем первой очистки трех материалов, у которых специфические активности отличаются друг от друга, подтверждено, что все три материала демонстрировали небольшое уменьшение своего содержания до 29 недель. Элюаты, полученные после первой очистки, всего лишь корректировались до рН 6,0-7,0 без каких-либо других стабилизаторов. В то же время, значения содержания, превышающие 100% в таблице 9, полученные в результате измерения физиологической активности, такого как измерение ферментативной активности, по сравнению со стандартными продуктами, рассматриваются как ошибки измерения, которые образуются широкими диапазонами результатов тестирований, как видно в тестах титрования биологических веществ (вакцины, рекомбинантные белки (цитокин, моноклональное антитело и т.п.), анатоксин и т.п.).

6-2: Тестирование стабильности низкоконцентрированного раствора, полученного путем разведения концентрата после элюирования после первой очистки

Концентраты после элюирования, полученные после первой очистки материала Hdase в соответствии с примером 1, разбавляли до приблизительно 1500 МЕ/мл (=100%) и затем разливали и хранили при 4°С. Затем, как видно в таблице 10 ниже, их содержание измеряли в каждый момент времени. Концентрация 1500 МЕ/мл является той же самой как концентрация продуктов, имеющих гиалуронидазы в качестве своего материала.

Содержание при каждом измерении, выраженное в виде процентных величин ферментативной активности, измеренной в конкретный момент времени хранения относительно ферментативной активности на 0 неделю, которая принимается равной 100%, и представлено в таблице 10 ниже. Ферментативная специфическая активность рассчитывается в соответствии со следующей математической формулой:

Как видно в таблице 10 выше, концентраты после элюирования, полученные после первой очистки, демонстрировали небольшое уменьшение своего содержания в течение 29 недель даже при концентрации 1500 МЕ/мл.

Таким образом, в отношении содержаний материалов, концентраты после первой очистки трех материалов были стабильными при 4°С в течение 29 недель и аналогично, они были стабильными при низкой концентрации (1500 МЕ/мл) при 4°С в течение 29 недель.

6-3: Тестирование стабильности концентрата после элюирования, полученного после одностадийной очистки посредством второй очистки и четвертой очистки

Каждый из материалов Hdase подвергали одностадийной очистке посредством второй очистки или четвертой очистки и затем каждый концентрат тестировали в отношении его стабильности. Каждую из второй очистки и четвертой очистки осуществляли по существу в соответствии с примером 2 и примером 4, и Hdase представляет собой образец перед первой очисткой, изложенной в примере 1. Температуры хранения полученных концентратов после элюирований устанавливались равными 4°С, 25°С и 37°С, соответственно, и затем содержания гиалуронидаз измеряли в каждый момент времени, и содержание в них ферментов (доли ферментативной активности) получали в каждый момент времени, как представлено в таблице 11 ниже.

Кроме того, для исследования диапазонов содержания гиалуронидаз при хранении в течение длительного периода времени концентраты, полученные путем осуществления второй очистки, хранили при 4°С в течение 29 недель, и в каждый момент времени измеряли содержание гиалуронидаз. Результаты представлены в таблице 12 ниже.

Как видно из таблицы 11 и таблицы 12, дополнительно к концентратам после первой очистки концентраты, однократно очищенные посредством второй очистки, были стабильны при 4°С в течение 29 недель.

Пример 7: Условия стабилизации

Концентраты, используемые для тестирования условий стабилизации, представляли собой гиалуронидазы, имеющие чистоту 95% или более, которые представляли собой продукты, полученные после пятой очистки материала Hdase в примере 5, которые затем доводили до концентрации 1500 МЕ/мл (=100%) и использовали для приготовления растворов в соответствии с условиями, перечисленными в таблицах, соответственно.

7-1: Стабилизирующие компоненты

Гиалуронидазу, имеющую чистоту 95% или более, корректировали до 1500 МЕ/мл (=100%) и использовали для приготовления растворов в соответствии с условиями, перечисленными в таблице 13 ниже, которые затем хранили при 4°С и тестировали для измерения содержания гиалуронидаз в каждый момент времени. В качестве результата происходило уменьшение содержания, как видно в таблице 13 ниже.

Те же самые гиалуронидазы доводили до 1500 МЕ/мл (=100%) и использовали для приготовления растворов в соответствии с условиями в таблице 14 ниже, которые затем хранили при 4°С и тестировали для измерения содержания гиалуронидаз в каждый момент времени. Полученные таким образом результаты представлены в таблице 15.

Исходя из вышеприведенных результатов, подтверждено, что стабилизирующие компоненты для гиалуронидазы представляют собой комбинированные условия EDTA или MgCl₂ + Tween 80 + рН 4,5-6,0.

7-2: Стабилизирующие концентрацию условия

Гиалуронидазы, используемые в тесте стабильности, представляли собой гиалуронидазы, очищенные более 95%, и тестируемую концентрацию доводили до 1500 МЕ/мл (=100%). Условия, перечисленные в таблице 16 ниже, использовали для получения и проведения тестирования стабильности. Концентрации EDTA, MgCl₂ и Tween 80 уменьшали в два и десять раз, и тестирование стабильности проводили в условиях хранения при 4°С и 25°С.

Результаты теста представлены в таблице 17 ниже.

Как видно из вышеприведенной таблицы, гиалуронидазы были стабильными в течение приблизительно 26 недель в соответствии с условиями 1 и условиями 3, и их стабильность демонстрировала тенденцию к уменьшению при других условиях.

Пример 8

8.1: Тестирование стабилизатора для образца Hdase

В отношении неочищенного образца Hdase, в котором первая очистка даже не проводилась, представленном в примере 1, его стабильность тестировали посредством EDTA или MgCl₂ + Tween 80 + рН 5,0. После того, как образец (гиалуронидаза, содержание приблизительно 800~1100 МЕ/мг), используемый в существующих продуктах гиалуронидазы, растворяли в буферах или воде для инъекции (WFI), соответственно, перечисленных в таблице 18 ниже с получением 1500 МЕ/мл (=100%), проводили тестирование его стабильности в условиях хранения 4°С, 25°С и 37°С.

Результаты теста представлены в таблице 19 ниже.

Как видно в таблице 19 выше, материалы, растворенные в WFI, демонстрировали быстрое уменьшение содержания по сравнению с материалами, растворенными в других буферах (EDTA или MgCl₂ + Tween 80 + рН 5,0), и из этого результата можно сделать вывод, что композиция EDTA или MgCl₂ + Tween 80 + рН 5,0 влияет на стабильность гиалуронидаз (4°С).

8-2: Тестирование стабилизатора для очищенных концентратов в соответствии с примерами 2-5

Каждый концентрат, полученный на каждой стадии, которую проводили в последовательности в соответствии с примерами 2-5, разбавляли до 1500 МЕ/мл (=100%) с использованием уравновешивающего буфер на каждой стадии очистки, и тестирование его стабильности осуществляли в условиях хранения 4°С и 37°С. Результаты представлены в таблице 20 ниже.

Как видно из таблицы 20, содержание гиалуронидаз не уменьшалось в течение периода наблюдения.

8-3: Тестирование стабильности образцов, полученных после удаления EDTA/MqCl₂ посредством диализа из концентратов, полученных после очистки в соответствии с примерами 2-5

Для исследования стабилизирующих эффектов EDTA или MgCl₂ после их удаления, когда они используются для стадий очистки, каждый концентрат, полученный после очистки в соответствии с примерами 2-5, разбавленный до 1500 МЕ/мл (=100%), подвергали диализу с использованием буфера, из которого удален EDTA/MgCl₂, представленный в таблице 21 ниже. После этого осуществляли тестирование их стабильности в условиях хранения 4°С и 37°С, и результаты представлены в таблице 22 ниже. При 4°С и 37°С содержание уменьшалось.

Что касается гиалуронидаз высокой чистоты, не возникало никаких проблем при тестировании реакции анафилактического шока и тестировании пассивной кожной анафилактической реакции с использованием крыс, таким образом, их стабильность сохранялась. Поэтому гиалуронидаза высокой чистоты в виде инъекции обладает преимуществом, заключающемся в том, что ее чистота выше по сравнению с гиалуронидазами в виде инъекций, которые имеются в продаже в настоящее время, и она обладает превосходной стабильностью.

Изобретение относится к стабильной водной композиции, содержащей гиалуронидазу, стабилизатор для гиалуронидазы и воду в качестве растворителя. Гиалуронидаза экстрагирована из семенников одного или более млекопитающих, исключая человека, и имеет чистоту 95% или более и специфическую активность 70000 МЕ/мг или более. Стабилизатор гиалуронидазы состоит из буферного агента для обеспечения рН от 4,0 до 6,0, неионного поверхностно-активного вещества от 0,001 до 0,01 об./об.% и от 0,1 до 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты в качестве хелатообразующего агента или МgCl₂. Гиалуронидаза очищена от содержащего гиалуронидазу материала способом аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии или гель-фильтрации. Водная композиция гиалуронидазы по изобретению характеризуется улучшенной стабильностью и может заменить лиофилизированные композиции гиалуронидазы. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 8 ил., 21 табл., 8 пр.

1. Стабильная водная композиция гиалуронидазы, содержащая:

(1) гиалуронидазу, экстрагированную из семенников одного или более млекопитающих, исключая человека, и имеющую чистоту 95% или более и специфическую активность 70000 МЕ/мг или более,

(2) стабилизатор гиалуронидазы, состоящий из буферного агента для обеспечения рН от 4,0 до 6,0; от 0,001 до 0,01 об./об. % неионного поверхностно-активного вещества; и от 0,1 до 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) в качестве хелатообразующего агента или MgCl₂, и

(3) воду в качестве растворителя.

2. Водная композиция гиалуронидазы по п. 1, представляющая собой инъецируемую композицию.

3. Водная композиция гиалуронидазы по п. 1, обладающая стабильностью для поддержания активности гиалуронидазы вплоть до 90% или более по отношению к исходной ферментативной активности, принимаемой за 100, при температурных условиях от 2 до 8°С в течение вплоть до 29 недель.

4. Водная композиция гиалуронидазы по п. 1, где гиалуронидаза представляет собой активный компонент композиции.

5. Водная композиция гиалуронидазы по п. 1, где неионное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана и жирной кислоты и Triton Х-100.

6. Водная композиция гиалуронидазы по п. 5, где неионное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 80 и Triton Х-100.

7. Водная композиция гиалуронидазы по п. 1, где буферный агент выбран из группы, состоящей из сукцинатного буфера, ацетатного буфера, фосфатного буфера, цитратного буфера, малонатного буфера, буфера на основе 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), буфера Tris и глицинового буфера.

8. Водная композиция гиалуронидазы по п. 1, где гиалуронидаза представляет собой экстракт из семенников баранов, быков или свиней.

9. Водная композиция гиалуронидазы по п. 1, где гиалуронидаза очищена от содержащего гиалуронидазу материала посредством одного или более чем одного способа, выбранного из группы, состоящей из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

10. Водная композиция гиалуронидазы по п. 9, где аффинная хроматография представляет собой аффинную хроматографию с использованием голубой сефарозы или аффинную хроматографию с использованием гепарин-сефарозы.

11. Водная композиция гиалуронидазы по п. 9, где гиалуронидаза очищена посредством аффинной хроматографии с использованием голубой сефарозы, катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии и аффинной хроматографии с использованием гепарин сефарозы, следующих друг за другом.

12. Стабилизатор для водной композиции гиалуронидазы, состоящий из буферного агента для обеспечения рН от 4,0 до 6,0; от 0,001 до 0,01 об./об. % неионного поверхностно-активного вещества; и от 0,1 до 1 мМ EDTA в качестве хелатообразующего агента или MgCl₂, где гиалуронидаза имеет чистоту 95% или более и специфическую активность 70000 МЕ/мг или более и экстрагирована из семенников одного или более млекопитающих, исключая человека.

13. Стабилизатор по п. 12, где неионное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана и жирной кислоты и Triton Х-100.

14. Стабилизатор по п. 12, где буферный агент выбран из группы, состоящей из сукцинатного буфера, ацетатного буфера, фосфатного буфера, цитратного буфера, малонатного буфера, буфера MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты), буфера Tris и глицинового буфера.

15. Стабилизатор по п. 12, где гиалуронидаза очищена от содержащего гиалуронидазу материала посредством одного или более чем одного способа, выбранного из группы, состоящей из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

16. Стабилизатор по п. 15, где аффинная хроматография представляет собой аффинную хроматографию с использованием голубой сефарозы или аффинную хроматографию с использованием гепарин-сефарозы.

17. Стабилизатор по п. 16, где гиалуронидаза очищена посредством аффинной хроматографии с использованием голубой сефарозы, катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии, аффинной хроматографии с использованием гепарин-сефарозы и гель-фильтрации, следующих друг за другом.

18. Стабилизатор по п. 12, где гиалуронидаза представляет собой экстракт из семенников баранов, быков или свиней.