Способ получения концентрата ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров из морских липидов Российский патент 2018 года по МПК C11B11/00 

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения из морских жиров алкил-глицериновых эфиров, обладающих высоким биологическим действием.

Под названием «морские липиды» объединено большое количество биологически активных веществ - полиненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, углеводороды, такие как сквален и сквалан, фитостерины и прочие. В состав суммарной липидной некоторых гидробионтов входят необычные липиды - 1-О-алкил-диацилглицерины - соединения, образованные жирными кислотами и спиртами (батиловым, химиловым и селахиловым и др. - 1-O-алкил-глицериновыми эфирами (АГЭ)).

Алкильные радикалы в 1-м положении глицерина бывают насыщенными, как в случае с химиловым и батиловым спиртами, так и ненасыщенными - у селахилового спирта. Обычно в природных смесях сумма этих 3-х спиртов составляет 80-90% и более от всех АГЭ. Для высвобождения АГЭ и дальнейшего их концентрирования сложно-эфирные связи между глицерином и жирными кислотами во 2 и 3-м положениях гидролизуют. Химическая структура алкил-глицериновых эфиров (АГЭ) приведена на фиг.1, при условии, если: R₁= C₁₆H₃₃ - химиловый спирт, R₁= C₁₈H₃₇ - батиловый спирт, R₁= C₁₈H₃₅ - селахиловый спирт.

Липиды с простой эфирной связью, АГЭ, вовлечены в формирование иммунной системы млекопитающих с самых первых дней жизни и являются одним из главных факторов, поддерживающих ее нормальное функционирование в течение всего периода. Широко известно их влияние на гематопоэз, причем, по мнению исследователей, АГЭ нормализуют функцию костного мозга, не вызывая его избыточной стимуляции и, как выяснилось, влияют на функциональную активность головного мозга при профилактике деменций, включая болезнь Альцгеймера, нарушениях когнитивных функций за счет снижения дефицита в нервной ткани плазмалогенов, предшественниками которых они являются. В связи с этим АГЭ успешно применяют в реабилитационной терапии при лечении рака, лучевых поражений, иммунодефицитных состояний, нарушений высшей нервной деятельности и др. (Brohult A., Brohult J., Brohult S., Joelsson I. «Reduce mortality in cancer patient after administration of alkylglycerols» // Acta Obst. Gynecol. Scand. 1986. Vol. 65 P. 779-785; Mitre R., Etienne M., Martinais S., Salmon H., Allaume P., Legrand P., Legrand A.B. «Humoral defence improvement and haematopoiesis stimulation in sows and offspring by oral supply of shark-liver oil to mother during gestation and lactation» // British J. Nutr. 2005. Vol. 94. P. 753-762; Wood P., Khan A., Mankidy R., Goodenowe D. «Plasmalogen deficit: a new and testable hypothesis for the etiology of Alzheimer’s disease». In: «Alzheimer’s disease pathogenesis - Core Concepts, Shifting Paradigms and Therapeutic Targets». 2011. Р. 561-588).

Как показали новейшие исследования, АГЭ с ненасыщенным радикалом (в первую очередь, селахиловый спирт) обладают бóльшей биологической активностью, возможно, значительно бóльшей, чем насыщенные АГЭ (A.-L. Deniau, P. Mosset, D.Le Bot, A.B. Legrand Which alkylglycerols from shark liver oil have anti-tumour activities? / Biochimie. 2010. Р. 1-3). Поэтому поиск методов выделения таких соединений и создания препаратов с их участием является важным в свете профилактики и лечения многих недугов человека.

На данный момент не существует способа получения в одном процессе ненасыщенных и насыщенных АГЭ с высоким выходом, эффективностью производства, снижением временного параметра и упрощением всей технологической схемы, позволяющей осуществлять способ доступными средствами в любой лаборатории.

Известен способ получения концентратов ненасыщенных АГЭ из печени колючей акулы (катрана), гренландской акулы и химеры (Hallgren B., Larsson S.O. «Separation and identification of alkoxyglycerols» // Acta Chem. Scand. 1959. Vol. 13, N 7. P. 2147-2148). Способ осуществляют следующим образом: неомыляемые вещества, извлеченные из гидролизованного печеночного жира рыб, хроматографируют на колонке с активированной окисью алюминия, для элюции АГЭ используют смесь 10%-ного раствора метанола в метиленхлориде. Получены концентраты ненасыщенных АГЭ следующего содержания (по селахиловому спирту) - 47,8% для катрана, 59,4% для гренландской акулы и 53,6% для химеры. Другие уточняющие данные по выделению АГЭ отсутствуют.

Недостатки способа:

1) осуществление данного способа скорее иллюстрирует само наличие АГЭ в печени гидробионтов, чем действительно предлагает рациональный способ их выделения;

2) хроматографическое выделение АГЭ, без предварительного концентрирования, для получения препаратов в значительных объемах не приемлемо - низкая эффективность метода, проблемы с регенерацией сорбента, а, главное, высокая себестоимость получаемого продукта;

3) использование метилового спирта снижает интерес к способу, так как использует чрезвычайно токсичный растворитель, не допустимый в пищевых производствах.

Известен способ выделения алкил-глицериновых эфиров из жира командорского кальмара Berryteuthis magister (Патент РФ №2415125, МПК C07C 43/13, C07C 41/16, C07C 41/40, опубл. 27.03). Способ включает гидролиз морского жира для выделения свободных жирных кислот и высвобождения неомыляемой фракции, содержащей АГЭ, нейтрализацию полученной жировой смеси кислотой, промывку водой и последовательную двойную кристаллизацию из органического растворителя, фильтрацию и сушку образующегося осадка после каждой кристаллизации. Для проведения первой и второй кристаллизации жировую смесь в органическом растворителе выдерживают сначала в течение 10-12 часов при комнатной температуре, а затем в течение 12-15 часов при 0-4°С.

В процессе используют ацетон или гексан, причем может использоваться только один растворитель во всем процессе или их комбинация.

При использовании в качестве органического растворителя гексана соотношение жировая смесь - гексан составляет при первой кристаллизации 1:10, кг/л, а при второй кристаллизации промежуточного продукта 1:50, кг/л.

При использовании в качестве органического растворителя ацетона целесообразно соотношение жировая смесь - ацетон 1:10, кг/л, как при первой, так и при второй кристаллизации промежуточного продукта.

Метод позволяет получать насыщенные АГЭ с выходом 50-59,0% и чистотой более 99%.

Недостатки:

1) метод использует значительные объемы растворителей, что требует использование больших емкостей, соответствующих фильтровальных установок и постоянную регенерацию растворителей;

2) две кристаллизации метода разделены сушкой осадка для того, чтобы при смене растворителя не было загрязнения одного растворителя другим; сушка реально прерывает процесс и откладывает последующую вторую кристаллизацию на несколько часов;

3) продолжительность проведения всего процесса - от исходного жира до целевого продукта (АГЭ) - составляет не менее 59 часов, в среднем 65 часов, притом, что проведение процесса между стадиями является неразрывным. Такая большая продолжительность процесса крайне негативно сказывается на производительности линии получения АГЭ и не позволяет быстро и своевременно перерабатывать поступающее сырье;

4) АГЭ, выделяемые по данному способу на 98-99% состоят из насыщенных соединений, все ненасыщенные АГЭ, обладающие наибольшей биологической активностью, остаются в неиспользуемом остатке и теряются из-за не разработанности технологии.

Известен способ получения алкил-глицериновых эфиров из морских жиров (Патент РФ №2476611, МПК C22B 7/04, C22B 15/00, C22B 23/00, C22B 4/06, опубл. 27.02.2013), включающий гидролиз морского жира для выделения свободных жирных кислот и высвобождения неомыляемой фракции, содержащей АГЭ, нейтрализацию полученной жировой смеси кислотой, промывку водой и последовательную двойную кристаллизацию из органического растворителя, фильтрацию и сушку образующегося осадка на последней стадии кристаллизации. Для проведения первой кристаллизации жировую смесь комнатной температуры смешивают с органическим растворителем температуры -15°…-5°С при интенсивном перемешивании и сразу отфильтровывают образовавшийся осадок, промывают его небольшим количеством органического растворителя при той же температуре и этот аморфный осадок вновь смешивают с органическим растворителем температуры -15°…-5°С (2-я кристаллизация) при интенсивном перемешивании и сразу отфильтровывают осадок и высушивают его от растворителя при комнатной температуре, получая целевой продукт - АГЭ. Соотношение жировая смесь : органический растворитель при первой кристаллизации составляет 1:1-5, кг/л, на второй также - 1:1-5, кг/л, в расчете на начальное количество жировой смеси. В качестве органических растворителей могут быть взяты ацетон и гексан, причем весь процесс должен использовать только один растворитель для избежания загрязнения одного растворителя другим.

Общий выход по АГЭ - 50-59%.

Недостатки:

1) в продукте содержатся практически только насыщенные АГЭ;

2) способ не обеспечивает полного извлечения АГЭ из липидов, поэтому все ненасыщенные АГЭ, обладающие высоким биологическим потенциалом, остаются в фильтрате и, в дальнейшем, попадают в отходы.

Известен способ выделения и концентрирования алкил-глицериновых эфиров из морских жиров (Patent GB 1,076,706, МПК C07C 43/02, опубл. 19.07.1967). Способ заключается в следующем: морской жир (жир печени акулы) путем переэтерификации с метиловым спиртом (допускаются этиловый и изопропиловый) и щелочным катализатором (КОН или Na-ОСН₃) переводили в метиловые эфиры жирных кислот при температуре 70°С в течение 16 часов и перемешивании, при этом в смесь высвобождались алкил-глицериновые эфиры, оставшийся в смеси метанол упаривали под вакуумом, а АГЭ из общей смеси многократно экстрагировали 90%-ными водно-метанольными или водно-этанольными растворами в соотношении смесь-экстрагент 0,6:1, кг/л, при 50°С и перемешивании в течение 15 минут и отстаивании в течение 2-х часов, фазу с растворителем отделяли и заново экстрагировали смесь при таких же условиях (6 раз), объединенные водно-спиртовые растворы упаривали, получая целевые АГЭ.

Выход суммарных АГЭ (насыщенных и ненасыщенных) - 71%, концентрация в продукте (чистота) - 40%.

Недостатки способа:

1) использование метанола недопустимо в пищевых производствах и не желательно в фармацевтических;

2) способ предполагает использование хорошо отлаженной технологической линии, что затрудняет его внедрение на малых и других рыбохозяйственных и пищевых предприятиях отечественной индустрии;

3) в формуле указано использование низкомолекулярных спиртов для экстракции - 1-3 атома углерода, однако никаких примеров, кроме метанола не приведено, и в описании патента преимущество отдается метанолу;

4) способ также допускает использование в экстракционной смеси уксусной кислоты и ацетонитрила, такие возможности только усложняют регенерацию растворителей и удаление их из конечного продукта;

5) данным способом можно получить суммарные АГЭ с чистотой только 47,7% (авторы указывают, что тот же самый опыт, пример 4, был несколько лучше в лабораторных условиях), что недостаточно для коммерческого применения и предполагает в дальнейшем дополнительные стадии очистки;

6) авторы в описании патента допускают выход АГЭ при 7-8-и кратной экстракции до 90%, но никаких убедительных доказательств не приводят, хотя в примере 4, в котором тыла использована семикратная экстракция, достигается выход в 71%;

7) ни о каком концентрате ненасыщенных АГЭ не может быть речи, так как метод экстракции не избирательный и концентрирование в продукте насыщенных и ненасыщенных АГЭ происходит с одинаковой эффективностью, а предварительного удаления насыщенных АГЭ авторы не проводят;

8) способ достаточно трудоемкий и, судя по описанию, требует повышенных экономических затрат на свое функционирование.

Наиболее близким к заявляемому способу по достигаемому результату является способ выделения алкил-глицериновых эфиров из морских жиров (Patent GB 1,076,707, МПК C07C 41/12, опубл. 19.07.1967). Способ осуществляют следующим образом.

Морской жир (жир печени акулы) переводят в метиловые (или изопропиловые) эфиры жирных кислот с высвобождением АГЭ, используя в реакции калиевую щелочь как катализатор и большой избыток метанола (в случае изопропанола катализатор - изопропилат натрия), затем метиловый спирт удаляют под вакуумом, а смесь многократно экстрагируют 90%-ным водным метанолом (или дихлорэтиленом); выход АГЭ составляет 71% с чистотой продукта - 40% (пример 1, части А и В).

Промежуточный концентрат АГЭ (40%-ный) с первой стадии растворяют в ацетоне в соотношении концентрат - ацетон 1:13,2, кг/л, выдерживают при комнатной температуре 16 часов и отфильтровывают осадок, затем охлаждают фильтрат до -13°С, выдерживают 2-е суток и снова отфильтровывают выпавший осадок, растворяют его в 2-кратном количестве этанола, фильтруют и выдерживают при 5°С 16 часов, отфильтровывают выпавшие кристаллы насыщенных АГЭ, а фильтрат еще раз кристаллизуют при -5°С в течение 20 часов, фильтруют, осадки с 2-х последних фильтраций объединяют, получая суммарные насыщенные АГЭ, выход на стадии 51%, общий выход 36%, чистота - >95% (пример 2, часть В), ацетоновый фильтрат (после кристаллизации при -13°С) приупаривают до концентрации вещества 22,7% в растворе, охлаждают до -23°С в течение 16 часов, далее выпавший осадок ненасыщенных АГЭ отделяют. Выход на стадии 60,6%, общий выход 27,3%, чистота 98,0%, содержание ненасыщенной фракции от общей суммы АГЭ не приводится, но судя по йодному числу (верхняя таблица стр. 6) - не более 80% (пример 3).

К недостаткам способа относятся:

1) использование токсичных метанола и дихлорэтилена;

2) сложности при регенерации растворителей (они все взаимно растворимы, образуют при перегонке азеотропы и не будут в дальнейшем чистыми, как изначально);

3) процедуры кристаллизации АГЭ из ацетона (оба варианта) мало согласуются друг с другом - температуры -5°, -13°С, -23°С выбраны скорее произвольно, чем обоснованно; именно этим объясняется низкий выход продукта и сопутствующие в нем примеси;

4) осуществление процесса длительное - несколько суток, сложно судить о технологическом применении такого решения;

5) процесс получения насыщенных и ненасыщенных АГЭ идет не последовательно, разделительной операцией является кристаллизация концентрата АГЭ из ацетона при -13°С (пример 2, часть В) - по первому направлению получают насыщенные АГЭ со своими технологическими режимами, по второму ненасыщенные АГЭ; при этом, каким образом используют отходы в первом и втором случае не уточняется, а они содержат существенные количества насыщенных и ненасыщенных АГЭ;

6) общий выход насыщенных АГЭ 36%, а ненасыщенных АГЭ 27,3%, то есть суммарное извлечение АГЭ из морского жира составляет 63,3% - очень малый выход и низкая степень извлечения по каждой фракции, фактически 40% АГЭ теряется в процессе.

Техническая проблема, поставленная перед изобретением, - разработка эффективного и экономичного способа получения из морских жиров ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров, наряду с насыщенными АГЭ, с целью максимального их извлечения из заготовленного сырья и его комплексной переработки при одновременно высоком качестве целевого продукта (высокая степень чистоты) - ненасыщенных АГЭ, как перспективных средств лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний.

Поставленная техническая проблема решается тем, что в известном способе выделения ненасыщенных и насыщенных алкил-глицериновых эфиров из морских жиров, включающим этерификацию жирных кислот липидной смеси безводным низкомолекулярным спиртом в присутствии катализатора, выделение ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров из суммарных алкил-глицериновых эфиров экстракцией водно-спиртовыми растворами, согласно изобретению, при этерификации жирных кислот в качестве катализатора используют серную кислоту в количестве 1-2% к объему реакционной смеси, а в качестве безводного низкомолекулярного спирта используют этанол. Перед этерификацией жирных кислот ведут гидролиз жира щелочным агентом, подкисляют полученную смесь, промывают водой, затем кристаллизуют насыщенные алкил-глицериновые эфиры из органического растворителя, отделяют их фильтрацией. Полученный фильтрат, содержащий ненасыщенные алкил-глицериновые эфиры, упаривают, затем из него выделяют ненасыщенные алкил-глицериновых эфиров экстракцией этанолом с содержанием воды 25-50%, по объему, при соотношении липидная смесь : экстрагент - 1:3-7, об./об., в результате, получают концентрат ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров. Полученный продукт очищают методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием элюирующей системы петролейный эфир : этилацетат = 10:1 → 10:4,5, об./об.

Целесообразно в качестве органического растворителя для экстракции алкил-глицериновых эфиров использовать водный раствор этанола с содержанием воды 40%.

Для повышения выхода ненасыщенных АГЭ экстракцию АГЭ ведут от трех до десяти раз.

Описание общей схемы заявленного способа.

Гидролиз жира из пищеварительной железы командорского кальмара

Начальной стадией выделения АГЭ является щелочной гидролиз липидов пищеварительной железы кальмара, в результате которого происходит отщепление ЖК от молекулы алкил-диацил-глицерина (АДАГ), схема гидролиза приведена на фиг.2.

К 2 кг жира добавляют 1,5 л 96%-ного этанола и 1 л 40%-ого раствора KОН. Реакцию проводят при 60°C в течение 1 ч. Окончание реакции гидролиза контролируют методом тонкослойной хроматографии.

По окончании реакции смесь переносят в делительную воронку, прибавляют 4 л воды и нейтрализуют водным раствором H₂SO₄ до значения рН=4 по индикаторной бумаге. Гидролизованные липиды дважды промывают 3 л 1%-го раствора NaCl.

Осаждение насыщенных алкил-глицериновых эфиров

Отбирают 1 кг гидролизованных липидов, приливают 2,8 л холодного (-15°С) ацетона, интенсивно перемешивают и помещают в морозильную камеру (-15°C) на 18 часов для осаждения (кристаллизация) насыщенных АГЭ. Процесс кристаллизации из ацетона проводят дважды.

Осадок после второй кристаллизации отфильтровывают через фильтрованную бумагу при -15°C. Полученный фильтрат, содержащий жирные кислоты и ненасыщенные алкил-глицериновые эфиры упаривают под вакуумом.

Этерификация жирных кислот смеси

К 100 г полученной смеси прибавляют 300 мл раствор H₂SO₄ в безводном этаноле до ее концентрации в смеси 1-2% (об. %). Реакцию ведут при 70°C и перемешивании в течение 1 ч.

Экстракция ненасыщенных АГЭ

К реакционной смеси (после этерификации жирных кислот) прибавляют 3-кратный объем воды, интенсивно перемешивают, выдерживают в течение 2 ч и отделяют фракцию липидов.

Ненасыщенные АГЭ из смеси липидов многократно экстрагируют (3-10 раз) растворами этанола с содержанием воды 25-50% (об. %) в соотношении 1:3-7, об./об., при интенсивном перемешивании. Образовавшуюся эмульсию разделяют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 5 минут. Отбирают водно-спиртовые растворы после каждой экстракции, объединяют и переэкстрагируют из них АГЭ, добавляя 1 объем этилацетата и 5 объемов 0,9%-ного раствора NaCl при перемешивании, этилацетатный экстракт упаривают под вакуумом, получая концентрат ненасыщенных АГЭ с содержанием более 40%.

Полученный концентрат очищают методом колоночной хроматографии АГЭ на силикагеле, используя элюирующую систему петролейный эфир-этилацетат - 10:1 → 10:4,5, об./об., с повышением градиента.

При разработке способа были найдены решения, позволившие осуществить его наиболее экономичным, а главное, простым способом.

Было найдено, что оптимальные концентрации катализатора - серной кислоты - в процессе этерификации липидов, составляют 1-2%, по объему, от реакционной смеси. Это позволяет полностью завершиться реакции этерификации и не подвергнуть окислению липиды. Уменьшение катализатора менее 1% не обеспечивает прохождение реакции полностью, а свыше 2% начинает протекать реакция осмоления липидной массы, что в том и другом случае недопустимо при выделении АГЭ.

Особо значимым результатом при проведении экспериментальных исследований явилось определение действительных значений концентрации водно-спиртовых растворов при экстракции ненасыщенных АГЭ из смеси этерифицированных липидов. Установлено, что оптимальное содержание воды в водно-спиртовом растворе должно находиться в пределах 25-50%, по объему. Данные растворы позволяют выделять АГЭ с наибольшей чистотой и минимизировать возможные примеси других липидов. Содержание воды в экстрагенте менее 25% резко увеличивает содержание других липидных примесей, а повышение водного компонента более 50% резко снижает экстракционные возможности смеси.

Экспериментально установлены следующие оптимальные соотношения жировой смеси и водно-спиртовых растворов при экстракции ненасыщенных АГЭ - 1:3-7, об./об, соответственно. Оказалось, что использование соотношения менее 1:3 приводит к загрязнению экстрагента посторонними липидными примесями (холестерин и др.), что делает затруднительным работу с этим раствором в дальнейшем. Увеличение соотношения более 1:7, об./об., не оказывает влияние на извлекаемые ненасыщенные АГЭ, т.е. увеличение экстрагента станет затратным при осуществлении способа.

Использование метода колоночной хроматографии на силикагеле позволяет очистить концентрат ненасыщенных АГЭ до содержания в нем основного вещества более 96%. Достижение данного результата обеспечивается также использованием новой элюирующей системы для выделения чистых ненасыщенных АГЭ: система петролейный эфир-этилацетат, 10:1 → 10:4,5, об./об., с повышением градиента. Отклонение от параметров системы в ту или другую сторону снижало выход или чистоту продукта.

Изобретение иллюстрируется следующими фиг. и табл. На фиг 1. приведена структурная формула алкил-глицериновых эфиров; на фиг. 2 - схема щелочного гидролиза алкил-диацил-глицеридов (АДАГ); в табл. 1 представлен состав липидов пищеварительной железы командорского кальмара; в табл. 2 представлен состав липидов в продуктах (и полупродуктах) на разных стадиях выделения ненасыщенных АГЭ.

Способ осуществляют следующим образом.

ПРИМЕР 1. Выделение насыщенных и ненасыщенных АГЭ из жира пищеварительной железы командорского кальмара Berryteuthis magister.

Состав исходных липидов представлен в табл. 1. Основными классами липидов пищеварительной железы являются алкил-диацил-глицерины (АДАГ) и свободные жирные кислоты, 37,5% и 29,7% соответственно. Кроме перечисленных компонентов, в состав липидов входят также триацил-глицерины (18,5%), холестерин (7,0%). Полярные липиды, эфиры стеринов и воски присутствуют в незначительных количествах.

Качественный и количественный состав смесей липидов на всех стадия процесса оценивают, используя метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) (пластинки «Sorbfil», система гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота 50:50:1, об./об./об.) с использованием планшетного сканера и оценки плотности (интенсивности) проявленных на ТСХ-хроматограммах пятен, применяя программу «ТСХ-менеджер версия 3.1 2005 @PinSoft».

Состав АГЭ, выделенных из гидролизованных липидов, а также полученных фракций определяли ГХ-МС.

Берут 100 кг пищеварительной железы (замороженные внутренности кальмара) нагревают в шнеке с водяной рубашкой и сепарируют. Получают 48,5 кг жира.

Гидролиз липидов пищеварительной железы кальмара

К 2 кг жира добавляют 1,5 л 96%-ного этанола и в 1 л 40%-ого раствора КОН. Реакцию проводят при 60°С в течение 1 ч. Окончание реакции гидролиза контролируют методом тонкослойной хроматографии.

По окончании реакции смесь переносят в делительную воронку, прибавляют 4 л воды и нейтрализуют водным раствором H₂SO₄ до значения pH=4 по индикаторной бумаге. Отделившиеся липиды дважды промывают 3 л 1%-ного водного раствора NaCl.

Получено 1,76 кг гидролизованного жира.

Выход (на исходную массу липидов) - 88%.

Состав липидов после проведенного гидролиза показан в сводной табл. 2.

Выделение насыщенных алкил-глицериновых эфиров

После щелочного гидролиза проводят кристаллизацию насыщенных АГЭ из ацетона, согласно разработанному ранее методу (Патент РФ №2476611, МПК C22B 7/04, C22B 15/00, C22B 23/00, C22B 4/06, опубл. от 27.02.2013, «Способ получения алкил-глицериновых эфиров из морских жиров» / Касьянов С.П., Латышев Н.А., Чу Куанг Чуен). На первой стадии кристаллизации при -15°С образовывался осадок, который повторно осаждают из ацетона при той же температуре.

Отбирают 1 кг гидролизованных липидов, приливают 2,8 л холодного (-15°С) ацетона, интенсивно перемешивают и помещают в морозильную камеру (-15°С) на 18 часов для осаждения насыщенных АГЭ. Процесс повторяют при тех же самых условиях. Выпавший осадок отфильтровывают через фильтрованную бумагу при -15°С. Полученный фильтрат, содержащий жирные кислоты и ненасыщенные алкил-глицериновые эфиры упаривают под вакуумом.

Полученный продукт представляет собой смесь насыщенных АГЭ с чистотой 99,6%, основным компонентом которой являлся химиловый спирт (содержание 95,7%).

Выход насыщенных АГЭ составил 11,0% от взятых на кристаллизацию липидов, или 42,0% от содержания АГЭ в гидролизованных липидах.

Выделение ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров

Для выделения ненасыщенных АГЭ были использованы объединенные фильтраты, полученные после кристаллизации при -15°C. Смесь липидов после удаления ацетона подвергают этерификации.

К 100 г полученной смеси прибавляют 300 мл раствора H₂SO₄ в безводном этаноле до содержания серной кислоты в смеси 1% (об. %). Реакцию проводят при 70°С и перемешивании в течение 1 ч.

К реакционной смеси (после этерификации жирных кислот) прибавляют 3-х кратный объем воды, интенсивно перемешивают, выдерживают 2 ч и отделяют фракцию липидов.

Далее 6 раз экстрагируют ненасыщенные АГЭ из липидной смеси водным раствором этанола с содержанием воды 50%, при соотношении липиды : экстрагент - 1:5, об./об. В результате, получают субстанцию с содержанием суммарных АГЭ 53,9%. Анализ состава АГЭ показал, что содержание ненасыщенных АГЭ составило 77,5%, основными компонентами которых были изомеры селахилового спирта 18:1 (67,2%).

Концентрат ненасыщенных АГЭ представлял собой коричневатую маслянистую жидкость при 20-25°C и твердую маргариноподобную массу при 0-5°С со слабым не выраженным запахом.

Выход АГЭ на стадии экстракции составил 43,7% от содержания АГЭ в смеси липидов, взятых на экстракцию.

Общий выход ненасыщенных АГЭ (от исходного содержания в жире) - 43,2%.

ПРИМЕР 2.

Для получения АГЭ было взято 2 кг гидролизованного жира из печени кальмара, полученного в Примере 1.

Выделение ненасыщенных АГЭ было проведено как в Примере 1 со следующими изменениями:

- в процессе этерификации содержание серной кислоты в реакционной смеси составляло 1,4%, по объему;

- экстракцию этерифицированной липидной смеси для выделения ненасыщенных АГЭ проводили водным этанолом с содержанием воды 40%;

- при экстракции соотношение липидная смесь : экстрагент составляло 1:7, об./об.;

- количество экстракций 10.

Содержание ненасыщенных АГЭ в концентрате - 44,6% по массе.

Выход на стадии - 44,5%.

Общий выход 44,0%.

ПРИМЕР 3.

Часть А

Для получения АГЭ было взято 2 кг гидролизованного жира из печени кальмара, полученного в Примере 1.

Выделение ненасыщенных АГЭ было проведено как в Примере 1 со следующими изменениями:

- в процессе этерификации содержание серной кислоты в реакционной смеси составляло 2,0%, по объему;

- экстракцию этерифицированной липидной смеси для выделения ненасыщенных АГЭ проводили водным этанолом с содержанием воды 25%;

- при экстракции соотношение липидная смесь : экстрагент составляло 1:3, об./об.;

- количество экстракций 3.

Содержание ненасыщенных АГЭ в концентрате - 40,1% по массе.

Выход на стадии 42,0%.

Общий выход 41,6%.

Часть B

Полученный продукт (концентрат) ненасыщенных АГЭ очищают методом колоночной хроматографией.

50 г концентрата ненасыщенных АГЭ загружают на хроматографическую колонку с силикагелем (1 кг, 100 мкм, производитель «Sorbfil») и элюируют системой петролейный эфир-этилацетат 10:1→10:4,5, об./об., с повышением градиента. Контроль осуществляют тонкослойной хроматографией. Фракции, содержащие ненасыщенные АГЭ объединяют и упаривают.

Содержание ненасыщенных АГЭ в концентрате -96,8% по массе.

Выход на стадии - 91,1%.

Общий выход 89,5%.

Предложенный методический подход позволил получить как насыщенные АГЭ с чистотой 96,0% (Биологически активная добавка к пище «Липидомарин»), так и смесь липидов с содержанием ненасыщенных АГЭ 40,1-96,8%. При этом особенностью является использование простых методов выделения, не требующих сложного оборудования, дорогостоящих реактивов и растворителей. Выделение высокочистых ненасыщенных АГЭ (чистота более 96%) было осуществлено методом колоночной хроматографии.

Для проведения многих биологических и медицинских исследований зачастую требуются высокоочищенные препараты, поэтому нами было осуществлено выделение фракции ненасыщенных АГЭ из полученного экстракта с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Для очистки АГЭ использовали систему петролейный эфир-этилацетат (10:1→10:4,5, об./об.) в возрастающей полярности. Выход на данной стадии составил 91,1% от содержания АГЭ в разделяемой смеси липидов. Преимуществом данного метода является возможность выделять чистые классы липидов.

Как видно из вышеприведенных примеров, заявляемый способ позволяет получить целевой продукт хорошего качества с высоким выходом, при этом способ является не только технологически не сложным, но и является экономически выгодным, поскольку максимально использует ценное морское сырье.

Растворы органических растворителей регенерируют, пуская заново в процесс, а не утилизируемый кубовый остаток, остающийся после выпаривания и представляющий собой свободные жирные кислоты, может быть использован в технологии получения концентрата омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (Патент РФ №1581737 от 21.05.1993, «Способ получения концентрата этиловых эфиров эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот», Касьянов С.П., Латышев Н.А., Глушенко Т.В.).

Получаемый по способу препарат расширяет ассортимент отечественных эффективных лекарственных средств для комплексной терапии онкологических больных и пациентов, страдающих нейродегенеративными расстройствами.

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности. Способ выделения ненасыщенных и насыщенных алкил-глицериновых эфиров из морских жиров, включающий этерификации жирных кислот липидной смеси безводным низкомолекулярным спиртом в присутствии катализатора, выделение ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров из суммарных алкил-глицериновых эфиров экстракцией водно-спиртовыми растворами. В качестве катализатора при этерификации жирных кислот используют серную кислоту в количестве 1-2% к объему реакционной смеси, а в качестве безводного низкомолекулярного спирта используют этанол; перед этерификацией жирных кислот ведут гидролиз жира щелочным агентом, подкисляют полученную смесь, промывают водой, затем кристаллизуют насыщенные алкил-глицериновые эфиры из органического растворителя, отделяют их фильтрацией, а полученный фильтрат, содержащий ненасыщенные алкил-глицериновые эфиры упаривают, выделение ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров ведут экстракцией этанолом с содержанием воды 25-50%, по объему, при соотношении липидная смесь : экстрагент - 1:3-7, об./об., после чего полученный продукт очищают методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием элюирующей системы петролейный эфир-этилацетат 10:1 → 10:4,5, об./об. Изобретение позволяет создать эффективный и экономичный способ получения ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров из морских жиров, обеспечивающий высокое качество целевого продукта, а также комплексное использование ценного морского сырья. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Способ выделения ненасыщенных и насыщенных алкил-глицериновых эфиров из морских жиров, включающий этерификации жирных кислот липидной смеси безводным низкомолекулярным спиртом в присутствии катализатора, выделение ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров из суммарных алкил-глицериновых эфиров экстракцией водно-спиртовыми растворами, отличающийся тем, что в качестве катализатора при этерификации жирных кислот используют серную кислоту в количестве 1-2% к объему реакционной смеси, а в качестве безводного низкомолекулярного спирта используют этанол; перед этерификацией жирных кислот ведут гидролиз жира щелочным агентом, подкисляют полученную смесь, промывают водой, затем кристаллизуют насыщенные алкил-глицериновые эфиры из органического растворителя, отделяют их фильтрацией, а полученный фильтрат, содержащий ненасыщенные алкил-глицериновые эфиры упаривают; выделение ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров ведут экстракцией этанолом с содержанием воды 25-50%, по объему, при соотношении липидная смесь : экстрагент - 1:3-7, об./об., после чего полученный продукт очищают методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием элюирующей системы петролейный эфир-этилацетат 10:1 → 10:4,5, об./об.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя для экстракции ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров используют водный раствор этанола с содержанием воды 40%.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров ведут 3-10 раз.