Способ получения арахидоновой кислоты Советский патент 1982 года по МПК C07C57/02 C07C51/00 

Изобретение относится к усовершен ствованному способу получения арахидоновой кислоты. Арахидоновая (цис-5, 8, 11, 1 эйкозатетраеновая) кислота входит в состав липидов клеточных мембран и является физиологически-активным веществом, кроме того она является предшественником простагландинов (ПГ), которые в последнее время находят все более широкое применение в качестве эффективных лекарственных препаратов. В связи с перспективностью использования ПГ в самых различ ных областях медицины и ветеринарии необходимы доступные методы получения как самих ПГ, так и их предшественников. 3 настоящее время для полу чения ПГ, наряду с химическим синтезом, представляющим сложный и многостадийный процесс, широко применяетс их биосинтез из биологических предшественников с помощью ферментных препаратов простагландин-синтетазы,в деляемых из различных источников животного происхождения. Для успешного протекания процесса биосинтеза арахидоновая кислота не должна содержать примесей других кислот, а также изомеров с иным расположением двойных связей, которые активно ингибируют ферментативный процесс превращения субстракта в целевые соединения. Источником получения арахидоновой кислоты (АК) могут служить липиды различного происхождения, в которых наряду с остатками АК содержатся радикалы других жирных кис.гют, отличающихся как количеством углеродных атомов, так и числом и расположением двойных связей. Для получения АК из липидов известен ряд методов, основанных на различии физико-химических свойств липидов, таких как температуры плавпения и кипения, растворимость в различных растворителях, утойчивость комплексов с различными комплексо.образователями, стереохимические свой cjsa молекул и другие характеристики Для разделения жирных кислот широк используют различные их производные, частности бром- и ртуть-производные ненасыщенных жирных кислот fl, а также соединения включения с мочевиной или тиомочевиной 2. Б последнее время для указанной цели все чаще применяют разнообразные хроматографические методы з. Однако применение какого-либо одного из указанных методов не дает возможности выделить из смеси сложного состава индивидуальное вещество в частности арахидоновую кислоту. Известен способ получения АК из липидов животного происхождения, вкл чающий омыление липидов, фракционную низкотемпературную кристаллизацию полученной смеси жирных кислот, обработку концентрата ненасыщенных жир ных кислот мочевиной и кристаллиза-. цию мочевинных комплексов, разложение соединений включения кислот с мочевиной, этерификацию и фракционную перегонку в вакууме, омыление и фрак ционирование в вакууме Совокупность выбранных приемов вы деления и очистки не позволяет получить химически чистую АК, так как ка дая из этих стадий основана лишь на незначительных различиях либо в растворимости, либо в стереохимии молекул, либо в температуре кипения. Для получения концентратов с достаточно высоким процентным содержанием АК приходится несколько раз пов торять отдельнь1е операции, что приводит к большим потерям целевого соединения. Кроме того, указанными методами не удается полностью отделить ся от изомеров АК, которые делают ее непригодной для использования в качестве субстрата в биосинтезе проста гландинов. образом, к недостаткам данного метода следует отнести большую трудоемкость процесса, низкий выход {менее 30%) и неудовлетворительное качество получаемой арахидоновой кислоты . Наиболее близким к предложенному является способ получения арахидоновой кислоты из липидов путем их омыления с использованием низкотемпературной кристаллизации при 0-(-5)°С, звлечения из жидкой фазы неомыляеой части липидов экстракцией петроейным эфиром. Оставшуюся жидкую фазу подкисляют минеральной кислотой , из полученной реакционной массы экстрагируют жирные кислоты петролейным эфиром, экстракт подвергают кристализации при (-28) - (-ЗО), а затем ри (-75) (-78) С, петролейный , эфир отгоняют, полученную смесь кислот подвергают кристаллизации в ацетоне при (-77) (78) С с последуюей его отгонкой. Полученный при этом концентрат арахидоновой кислоты этерифицируют етиловым спиртом и очищают хроматографией на силикагеле, импрегнированном нитратом серебра, в колонке с использованием в качестве элюента гексана и/или диэтилового эфира, причем последний берут в количестве 5 - OQ% от веса гексана. Из полученного концентрата метиловых эфиров выделяют арахидоновую кислоту путем испарения элюента с последующим щелочным гидролизом, экстракцией петролейным эфиром, подкислением полученной реакционной смеси минеральной кислотой и экстракцией арахидоновой кислоты петролейным эфиром f5j. Недостатком данного способа является сложность технологического процесса . Цель изобретения - упрощение процесса и повышение качества целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения арахидоновой кислоты из липидов путем их омыления, низкотемпературной кристаллизации полученной при этом смеси высших жирных кислот, этерификации алканолом, хроматографической очистки на колонке с селикагелем, импрегнированным азотнокислым серебром, щелочного гидролиза полученного эфира арахидоновой кислоты и выделения целевого продукта экстракцией петролейным эфиром кристаллизацию смеси высших жирных кислот осуществляют из диэтилового эфира при (-50) - (-25)С, полученную после этерификации смесь низших алкиловых эфиров жирных кислот подвергают фракционной вакуумной перегонке при остаточном давлении 0,05 0,1 мм рт.ст. и последующую хроматографическую очистку соответствующего эфира арахидоновой кислоты проводят с использованием в качестве элюента системы толуол-ацетон. Основу данного способа выделения АК составляет хроматографическое разделение на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра. Для выделения на колонке в системе толуол-ацетон можно использовать сра нительно бедные смеси, содержащие только . Поэтому в большинстве случаев необходимо лишь небольшое обогащение арахидоновой кислотой сме си жирных кислот, получаемой из исходного сырья. Обычно это обогащение достигается уже после отделения насы щенных и части ненасыщенных кислот низкотемпературной кристаллизацией и перегонкой смеси эфиров жирных кислот в вакууме. В случае же использо вг|.ния сырья, содержащего сравнительно большое количество АК (печень млекопитающих, жир некоторых рыб и т.п), можно ограничиться лишь отделением насыщенных кислот низкотемпературной кристиллизацией их из рас вора в подходящем растворителе. Химически чистую арахидоновую кислоту получают следующим образом. . Метиловый эфир АК, полученный после выделения на колонке, омыляют по Известному методу водны раствором щелочи в спирте. Проведение указанно го процесса в атмосфере инертного га за и при низкой -температуре (tO-SO) . не вызывает каких-либо изменений в структуре АК, что подтверждается раз личными методами (ПМР, УФ- и ИК-спектроскопия, элементный анализ, кулонометрия и т.п.). Пример 1 . Использование отходов производства инсулина. К 1000,0 г водной эмульсии липидов приливают 500 мл этилового спирта, добавляют 250,0 г ацетата калия и смесь перемешивают в токе азота при 0°C в течение 1 ч, после чего растворитель отгоняют в вакууме {15 20 мм). Остаток после охлаждения до 18 - 20С подкисляют 2000,0 мл разбавленной соляной кислоты (d/°l,03) и выделившуюся смесь жирных кислот извлекают хлороформом (2 раза по 500 мп), хлороформ упаривают в вакууме (13-20 мм), а остаток растворяют в 2000,0 мл серного эфира и под вергают низкотемпературной кристалли зации при (-30) - (-25)С в течение 1,5 - 2 ч с последующим обратным фильтрованием. Осадок смешивают с 250мл серного эфира и снова охлаждают при (-30) - (-25)0 в течение 1,5ч. Смесь фильтруют, а объединенные маточные растворы подвергают дальнейшей кристаллизации при -50С в течение 1,52ч. Выпавший осадок отделяют тем же способом. Фильтрат упаривают в вакууме (15 20 мм), а остаток растворяют в 250 мл метанола, добавляют 1 мл хлористого ацетила и нагревают при кипении в течение 30 мин, после чего отгоняют избыток метанола и образовавшийся метилацетат. К остатку после до 20 - 25 С добавляют охлаждения 200 мл петролейного эфира. Полученный раствор промывают насыщенным водным раствором хлористого натрия, после чего его пропускают через слой силикагеля (50 г, высота слоя 5 см, сушат сернокислым натрием, растворитель удаляют в вакууме 15 20 мм , а остаток 51,0 г подвергают фракционной перегонке при остаточном давлении 0,05 мм. Отбирают фракцию (9,2 г) с т.кип. 126 - 131°С (в парах) , которую хроматографируют на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра. Адсорбент готовят следующим образом. К смеси 150 г силикагеля Л 100/160 меш и 15,0 г нитрата серебра добавляют при интенсивном перемешивании 150 мл дистиллированной воды. Полученную пастообразную массу сушат и затем активируют при 120 - в течение ч. Затем адсорбент охлаждают до 20 - 25°С и добавляют 200 мл толуола при перемешивании, после чего смесь переносят в хроматографическую колонку длиной 800 и диаметром 35 мСмесь метиловых эфиров высших жирных кислот (9,2 г), выделенных при фракционной перегонке, растворяют в 10 мл толуола и наносят на колонку обычным способом. В качестве элюента используют смесь т.олуол-ацетон (9:1)Отбирают фракции по 10 мл, состав которых определяют с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, или с помощью метода ГЖХ. Фракции, содержащие хроматографически чистый метиловый эфир АК, объединяют, растворитель удаляют в вакууме (15 - 20 мл), а остаток растворяют в 25 мл петролейного эфира. Полученный раствор промывают последовательно водой (50 мл). :0,5 М раствором соляной кислоты (50 мл) и вновь водой (2 раза по 50 мл). Эфирный раствор сушат сульфатом натрия , фильтруют, растворитель удаляют в вакууме (15 - 20 мм) и получают 1,б2 г химически чистого метилового эфира ЛК, чистоту которого проверяют методом ГЖХ. Для приготовления арахидоновой кислоты полученный метиловый эфир ее (1,62 г) растворяют в 20 мл метанола (или этанола), добавляют k мл 50%ного водного раствора КОН и смесь перемешивают в токе азота при 40-50 в течение 15 мин. После охлаждения до 25 - к смеси при перемешивании в токе азота добавляют 50 мл раз бавленной соляной кислоты (d 1,05) и АК экстрагируют петролейным эфиром (3 раза по 50 мл). Объединенные эфир ные экстракты сушат сульфатом натрия фильтруют, растворитель удаляют в вакууме (10 - 15 мм), а остаток досушивают при остаточном давлении 0,05 - О,Об мм рт.ст. в течение 30 мин. Получают 1,А8 г арахидоновой кислоты в виде прозрачного желтоватого масла с выходом Ц2,2%, считая на исходные липиды. Показатель преломления полученног образца АК составляет Пр 1,915 (по литературным данным п2.01 ,ij901) , йодное число 333,50 (среднее по результатам трех измерений), что совпадает с расчетным. Число двойных связей в расчете на одну молекулу полученной АК по данным кулонометрического титрования (среднее по результатам трех измерений) и по значению йодного числа -k,0. По данным УФ- и ПМР-спектров полу ченный продукт представляет собой хи мически чистую арахидоновую кислоту. По данным ГЖХ в стандартных условиях метилового эфира АК, приготовле ного обработкой 5 мг АК диазометаном в эфирном растворе, содержание примесей в целевом продукте составляет менее 0,1 (в качестве внутреннего стандарта использовали метиловый эфир линолевой кислоты). Аналогичные результаты были полумены при использовании на стадии омы ления метилового, пропилового и изопропилового спирта. . Пример 2 . Использование отходов производства препарата Арахиден. К 63, отходов, представляющих смесь этиловых эфиров высших жирных кислот и содержащих по данным ГЖХ 3,2 этилового эфира АК, приливают 70 мл этилового спирта и раствор 10 г КОН в 20 мл воды. Смесь перемешивают в токе азота при в течение 1 ч,, затем отгоняют 50 мл спирта, а к остатку после охлаждения до 25 при перемешивании добавляют 100 мл разбавленной соляной кислоты (,05) и извлекают смесь жирных кислот петролейным эфиром (2 раза по 100 мл). Объединенные экстракты промывают водой (2 раза по 150 мл), после чего сушат сульфатом натрия. Петролейный эфир удаляют в вакууме (10 - 15 мм), к остатку добавляют 300 мл серного эфира и полученную смесь подвергают кристаллизации при (-55) - (-50) в течение 2 ч. Вы/1авший осадок отделяют обратным фильтрованием. От маточного раствора отгоняют растворитель в вакууме (10 - 15 мм), а остаток нагревают при кипении со 100 мл метанола в токе азота в присутствии 1 мл хлористого ацетила в течение 2 ч. Реакционную массу затем обрабатывают по методике, приведенной в примере 1. После фракционной перегонки в вакууме (0,05 0,06 мм) выделяют фракцию с т. кип. 126 - 131°С (в парах), из которой получают 1,02 г химически чистой АК с помощью хроматографии на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, и последующим омылением метилового эфира в условиях, описанных в примере 1. Выход арахидоновой кислоты составляет 505, считая на исходную смесь этиловых эфиров высших жирных кислот. Чистоту полученного образца АК доказывают методами, указанными в примере 1. Характеристики продукта идентичны полученным в примере 1. Аналогичные результаты были получены при использовании на стадии омыления метилового, пропилового и изопропилового спиртов. Применение предложенного способа получения АК позволяет использовать большое количество липидных отходов производства эндокринных препаратов. Формула изобретения Способ получения арахидоновой кислоты из липидов путем их омыления.

9

низкотемпературной кристаллизации полученной при этом смеси высших жирных кислот, этерификации алканолом, использования хроматографической очистки на колонке с силикагеле импрегнированным азотнокислым серебом, щелочного гидролиза полученного эфира арахидоновой кислоты и выделения целевого продукта экстракцией петролейным эфиром, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения качества целевого продукта, кристаллизацию смеси высших жирных кислот осуществляют из диэтилового эфира при (-50) - (-25)С, полученную после этирификации смесь низших алкиповых эфйров жирных кислот подвергают фракционной вакуумной перегонке при остаточном давлении О,05-0,1 мм рт.ст и последующую хроматографическую

776610

очистку соответствующего эфира арахидоновой кислоты проводят с использованием в качестве элюента системы толуол-ацетон.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Хроматография в тонких слоях. Под ред. Э. Шталя. М., Мир, 1970, с. 236 - .

2.Физер Л., Физер М, Реагенты для органического синтеза, т. 2, М., Мир, 1970, с. 316 - 321.

3.Кей.тс М. Техника липидологии. М., MиpJ, 1375, с. 128 - 136.

k. Авторское свидетельство СССР по заявке № 2339+52/23flt, кл. С 07 С 57/02, 1976.

5- Авторское свидетельство СССР по заявке № 2 03863, кл. С 07 С 57/02, 1976 (прототип).