ЛИНЕЙКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ГЕННО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЙ НА ОСНОВЕ ГЕНА SOD2 ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ КЛЕТОК ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА, СВЯЗАННЫХ С ОКСИДАТИВНЫМ СТРЕССОМ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Российский патент 2018 года по МПК C12N15/00 A61P39/06 

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для усиления защиты клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека от оксидативного стресса, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Оксидативный стресс - нарушение баланса между процессами образования активных форм кислорода (свободных радикалов) и процессами их нейтрализации. Он приводит к повреждениям клеток, тканей и органов живого организма, в частности, к преждевременному старению кожи, поскольку из всех систем живого организма именно кожа наиболее подвержена воздействию активных форм кислорода.

Кроме того, наиболее предрасположены к оксидативному стрессу дыхательная система (воздействие большого количества кислорода), мозг (высокая метаболическая активность и низкий уровень эндогенных антиоксидантов), глаза (постоянное УФ-облучение), система кровообращения (колебания уровней кислорода и оксида азота) и репродуктивная система (высокая метаболическая активность сперматозоидов).

Активные формы кислорода могут быть эндогенными, т.е. продуктами различных метаболических процессов в организме. Например, наиболее распространенный окислитель в организме - гидроксид-анион (ОН-) - образуется при многих аэробных процессах. Также активные формы кислорода могут иметь экзогенное происхождение. Они образуются под воздействием ультрафиолетового, ионизирующего и электромагнитного излучения, а также в результате взаимодействия с окислителями из окружающей среды, например, с озоном.

Другой распространенной активной формой кислорода является супероксид-анион (O₂.-). В отличие от гидроксильного радикала, супероксид-анион менее активен, но обладает большим временем жизни. Кроме того, он сам может быть источником образования гидроксид-анионов. В нормальных условиях супероксид-анион, как и другие свободные радикалы, быстро нейтрализуется естественными антиоксидантами - внутриклеточными, мембранными и внеклеточными. К внутриклеточным антиоксидантам относятся белки супероксиддисмутазы, пероксидазы и белок каталазы.

Супероксиддисмутазы - супероксиддисмутаза-1 (цитоплазматическая, или Cu-Zn-содержащая) и супероксиддисмутаза-2 (митохондриальная, или Mn-содержащая) - катализируют превращение супероксид-аниона в кислород и перекись водорода, которая затем утилизируется глутатионпероксидазами и каталазой.

Следовательно, при пониженной активности супероксиддисмутазы или при повышенной скорости образования активных форм кислорода повышаются вероятность и интенсивность оксидативного повреждения клеток и тканей.

Для усиления нейтрализации действия активных форм кислорода и снижения влияния оксидативного стресса существует несколько подходов.

Известно использование органических веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантной активностью. Этот принцип положен в основу при производстве косметических средств.

Так была предложена композиция внутреннего применения для коррекции гормонального старения кожи, содержащая гормоноподобное вещество растительного происхождения диосгенин из корня диоскореи, один или более антиоксидант, выбранный из витамина С, витамина Е, коэнзима Q10, а также - гиалуроновую кислоту (RU 2527344). Было показано, что вышеописанная композиция эффективно корректирует гормональное старение кожи, увеличивает плотность и тургор кожи за счет стимулирования выработки коллагено-эластиновых волокон и обеспечения антиоксидантной защиты. Недостаток данного подхода состоит в том, что эти вещества обладают краткосрочным действием и требуют постоянного применения, могут вызвать побочные явления, например, аллергическую реакцию, применение препаратов антиоксидантов дополняет антиоксидантные системы организма, но полностью не компенсирует их недостаточную работу.

Известно также использование в качестве лекарственных средств собственно белков - антиоксидантов.

Так в патенте US 6045809 для нейтрализации токсического действия активных форм кислорода было предложено использовать композиции фермента - антиоксиданта супероксиддисмутазы и, по крайней мере, одного из липидов (на примере керамидов) или белков (на примере проламинов). Новые фармацевтические композиции предназначены для перорального введения. Недостаток данного подхода состоит в том, что при данном методе введения желаемый терапевтический эффект может оказаться недостигнутым, а также - при недостаточной степени очистки возможны побочные реакции.

В патенте US 8916373 было предложено использовать рекомбинантные модифицированные варианты супероксиддисмутазы-1, у которых за счет созданных мутаций в нуклеотидной последовательности произошли изменения аминокислотной структуры белка (степень идентичности модифицированных вариантов белка и нативного белка не менее 80%). Рекомбинантными плазмидами были транфицированы культуры эмбриональных клеток почек человека (HEK клетки, линия HEK293FT) или эмбриональных фибробластов мыши (3T3s, линии NIH 3Т3), в которых наличие модифицированных белков определяли методом иммуноблоттинга, после чего определяли их ферментативную активность. Было выявлено, что активность некоторых вариантов увеличилась более чем в 3 раза по сравнению с белком дикого типа. Недостатком данного подхода является то, что внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами.

За прототип авторами было принято решение по патенту US 8926965, в котором предлагается использовать белок рекомбинантной супероксиддисмутазы-2 для снижения оксидативного стресса в клетках, тканях и органах.

Марганецзависимая супероксиддисмутаза-2, локализованная в митохондриях, является важным ферментом, который контролирует уровень свободных радикалов в клетке. Поскольку митохондрия серьезно подвержена оксидантной нагрузке, функциональные особенности супероксиддисмутазы-2 актуальны для применения, поскольку способны компенсировать или усугублять оксидативный стресс (Green D.R., Reed J.С., 1998). Многочисленные исследования подтверждают, что митохондриальная супероксиддисмутаза-2 играет важную роль в предохранении клетки от оксидативного стресса. В патенте US 8926965 было предложено использовать рекомбинантный модифицированный вариант супероксиддисмутазы-2, у которой за счет созданных мутаций в нуклеотидной последовательности произошли изменения аминокислотной структуры белка по меньшей мере по K53 и K89 (степень идентичности модифицированного варианта белка и нативного белка не менее 95%). Нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный белок, была введена в клетку-хозяин (клетку млекопитающего, например, человека, приматов, грызунов и др., клетку насекомого, дрожжевую клетку, прокариотические клетки, например бактериальные) с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, который обеспечивал трансляцию белка. Было показано, что ферментативная активность модифицированной супероксиддисмутазы-2 более чем в 10 раз выше, чем у немодифицированного белка. Также было заявлено, что модифицированный пептид можно использовать для уменьшения оксидативного стресса и/или окислительного повреждения клетки как собственно лекарственное средство, так и в композиции с другими активными и вспомогательными компонентами.

Недостатком данного подхода является высокая стоимость получения чистого рекомбинантного белка, более частое его введения при терапии (что увеличивает стоимость терапии и повышает риск побочных явлений) и сложность внутриклеточной доставки препарата. Кроме того, внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами. Также при создании терапевтического средства по прототипу не учтены индивидуальные характеристики пациента.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций, способных препятствовать снижению антиоксидантной активности белка супероксиддисмутазы-2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения экспрессии гена SOD2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, и/или за счет повышения активности белка супероксиддисмутазы-2, ответственного за поддержание окислительно-восстановительного баланса в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Указанная задача решается за счет того, что создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:1 или одну из модифицированных кДНК гена SOD2, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена SOD2 и увеличить активность белка супероксиддисмутазы-2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, в гемопоэтических клетках, или гепатоцитах, или мезенхимальных стволовых клетках, или хондробластах, или клетках поджелудочной железы (например, в клетках панкреатических островков), или миоцитах или фибробластах кожи, или кератоцитах, или эпителиальных клетках роговицы, или в нейронах, ганглиях, Шванновских клетках, астроцитах, олигодендроцитах, микроглии, или в сперматозоидах, или в нефронах, или эндотелиальных клетках, или эпителиальных клетках в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в коже, суставах, печени, надпочечниках, почках, головном и спинном мозге, легких, сердце, сосудах, желудочно-кишечном тракте, простате, поджелудочной железе, глазе, роговице, слизистой оболочке, хрящевой ткани, мышечной ткани в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. При этом генетическая конструкция с кДНК гена SOD2 содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена SOD2, которая несет модификации не затрагивающие структуру белка супероксиддисмутазы-2, а именно: делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена SOD2 используют SEQ ID No:2. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD2 используют SEQ ID No:3. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD2 используют SEQ ID No:4. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD2 используют SEQ ID No:5. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD2 используют SEQ ID No:6. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD2 используют SEQ ID No:7. При этом в качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блок-сополимеры.

Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом из созданной линейки заключающийся в том, что получают кДНК гена SOD2, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Или способ получения каждой биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом из созданной линейки, заключающийся в том, что получают кДНК гена SOD2, модифицируют его по п.п. 3, или 4, или 5 или 6 или 7 или 8, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, и выбранной из линейки с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного для пациента варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.

Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключающийся во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной из линейки именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного для пациента варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного для пациента варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.

Реализация изобретения

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена SOD2, последовательность которой идентична приводимой в базе даных GenBank под номером NM_000636.2 - SOD2 SEQ ID NO:1.

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD2, SEQ ID NO:2, которая

содержит 3 нуклеотидных замены G→C в позициях 199, 286 и 322, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD2, SEQ ID NO:3, которая

содержит 4 нуклеотидные замены G→C в позициях 199, 286, 322 и 370 и замену А→С в позиции 400, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD2, SEQ ID NO:4, которая

содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 199, 286, 322, 370, 562; замену А→С в позиции 400; замену С→А в позиции 521 и замену Т→А в позиции 523, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD2, SEQ ID NO:5, которая содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 199, 286, 322, 370, 562; замену А→С в позиции 400; замену С→А в позиции 521, замену Т→А в позициях 523, замену Т→С в позиции 629 и 2 замены A→G в позициях 631 и 775, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD2, SEQ ID NO:6, которая

содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 199, 286, 322, 370, 562; замену А→С в позиции 400; замену С→А в позиции 521, замену Т→А в позициях 523, замену Т→С в позиции 629 и 4 замены A→G в позициях 631, 757, 775 и 793 не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2.

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD2, SEQ ID NO:7, которая

не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 5 нуклеотидных замен G→С в позициях 199, 286, 322, 370, 562; замену А→С в позиции 400; замену С→А в позиции 521, замену Т→А в позициях 523, замену Т→С в позиции 629 и 4 замены A→G в позициях 631, 757, 775 и 793 не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена SOD2 проводили анализ эндогенной экспрессии гена SOD2 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена SOD2, фибробласты со сниженной экспрессией гена SOD2

2 - кДНК гена SOD2, фибробласты с нормальной экспрессией гена SOD2

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена SOD2

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена SOD2

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена SOD2 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена SOD2 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD2 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена SOD2 в фибробластах с нормальной экспрессией гена SOD2,

2 - кДНК гена SOD2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD2 до трансфекции БАГТС с кДНК гена SOD2

3 - кДНК гена SOD2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD2 после трансфекции БАГТС с кДНК гена SOD2

4 - кДНК гена SOD2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD2 после трансфекции вектором без кДНК гена SOD2

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена SOD2,

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD2 до трансфекции БАГТС с кДНК гена SOD2

7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD2 после трансфекции БАГТС с кДНК гена SOD2

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD2 после трансфекции вектором без кДНК гена SOD2

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена SOD2 уровень кДНК гена SOD2 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК SOD2 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена SOD2 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена SOD2 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения активности белка супероксиддисмутазы-2 в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена SOD2 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК SOD2 представлен график изменения активности белка супероксиддисмутазы-2 в зависимости от разведения клеточного лизата нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК SOD2 (культура В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе генетической конструкции pCDNA 3.1- SOD2 SEQ ID No1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD2 происходит увеличение активности белка супероксиддисмутазы-2 в клеточном лизате.

Обозначения:

культура А

культура В

культура С

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-2 в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения активности супероксиддисмутазы-2 в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6- SOD2 SEQ ID No:7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали активность супероксиддисмутазы-2 в интактной коже. Показано повышение активности супероксиддисмутазы-2 в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией кДНК гена SOD2. (C)

Обозначения:

культура А

культура В

культура С

контрольная биопсия

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-2 до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена SOD2 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена SOD2 представлен анализ изменения активности белка супероксиддисмутазы-2 в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD2, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 20-ти пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD2 SEQ ID No:1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD2 SEQ ID No:2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD2 SEQ ID No:3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD2 SEQ ID No:4, части (E) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD2 SEQ ID No:5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD2 SEQ ID No:6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD2 SEQ ID No:7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена SOD2.

По итогам анализа уровня активности белка супероксиддисмутазы-2 выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности супероксиддисмутазы-2 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:1.

В группе 2 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:2

В группе 3 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:3.

В группе 4 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:4.

В группе 5 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:5.

В группе 6 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:6.

В группе 7 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальная активность супероксиддисмутазы-2 присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена SOD2.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена SOD2

Из рисунка следует, что достижение максимальной активности супероксиддисмутазы-2 в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD2 SEQ ID No:1 (А)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD2 SEQ ID No:2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD2 SEQ ID No:3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD2 SEQ ID No:4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD2 SEQ ID No:5 (Е)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD2 SEQ ID No:6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD2 SEQ ID No:7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена SOD2 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена SOD2, кератоциты до трансфекции

2 - кДНК гена SOD2, эпителий роговицы до трансфекции

3 - кДНК гена SOD2, кератоциты после трансфекции

4 - кДНК гена SOD2, эпителий роговицы после трансфекции

5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции

8 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена SOD2 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена SOD2 в клеточной культуре хондробластов при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена SOD2, до трансфекции

2 - кДНК гена SOD2, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена SOD2 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-2 в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности супероксиддисмутазы-2 в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена SOD2 pCMV6-SOD2 SEQ ID No:4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена SOD2 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение активности супероксиддисмутазы-2 в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена SOD2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-2 в слизистой оболочке рта человека при введении в слизистую оболочку рта биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности супероксиддисмутазы-2 в слизистой оболочке рта. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена SOD2 pCDNA 3.1 SOD2 SEQ ID No:5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена SOD2 с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку рта.

Показано увеличение активности супероксиддисмутазы-2 в лизате биоптата слизистой оболочки рта пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена SOD2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-2 в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности супероксиддисмутазы-2 в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена SOD2 -pCMV6-Kan/NeoSOD2 SEQ ID No:6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена SOD2 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань икроножной мышцы. Показано увеличение активности супероксиддисмутазы-2 в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена SOD2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-2 до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена SOD2 анализировали уровень активности супероксиддисмутазы-2 в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD2.

Каждому из 15-ти пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID NO:1, pCMV6- SEQ ID NO:2, pCMV6- SEQ ID NO:3, pCMV6- SEQ ID NO:4, pCMV6- SEQ ID NO:5, pCMV6- SEQ ID NO:6, pCMV6- SEQ ID NO:7, и плацебо pCMV6- XL5.

По итогам анализа уровня активности супероксиддисмутазы-2 в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности супероксиддисмутазы-2 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:1.

В группе 2 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:2.

В группе 3 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:3.

В группе 4 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:4,

В группе 5 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:5.

В группе 6 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD2 SEQ ID NO:6.

В группе 7 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD2 SEQ ID No:7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена SOD2.

Из данного примера следует, что достижение максимальной активности супероксиддисмутазы-2 в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:1 (А)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:2 (В)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:3 (С)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:4 (D)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:5 (Е)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:6 (F)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:7 (G)

биоптаты пациентов после введения плацебо (Н)

На фиг. 19

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали активность супероксиддисмутазы-2 в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими нативную или модифицированные кДНК гена SOD2.

По итогам анализа активности супероксиддисмутазы-2 в культуре фибробластов пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой происходит максимальное ингибирование в лизате клеточной культуры и соответственно наблюдается максимальная активность супероксиддисмутазы-2. В данном эксперименте максимальное ингибирование в лизате наблюдается при трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6SOD2SEQ ID NO:5, содержащей модифицированную кДНК SOD2, что показано на фигуре 19.

Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.

Обозначения:

1 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС SOD2 SEQ ID No:1 (А)

2 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС SOD2 SEQ ID No:2 (В)

3 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС SOD2 SEQ ID No:3 (С)

4 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС SOD2 SEQ ID No:4 (D)

5 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС SOD2 SEQ ID No:5 (Е)

6 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС SOD2 SEQ ID No:6 (F)

7 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС SOD2 SEQ ID No:7 (G)

8 - клеточный лизат после трансфекции плацебо (Н)

На фиг. 20

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали активность супероксиддисмутазы-2 в лизатах биоптатов кожи этого пациента, после введения ему биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную или модифицированные кДНК гена SOD2.

По итогам анализа активности супероксиддисмутазы-2 в лизате биоптатов кожи пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при введении которой происходит максимальное ингибирование в лизате биоптата кожи и соответственно наблюдается максимальная активность супероксиддисмутазы-2. В данном эксперименте максимальное ингибирование в лизате отмечено при введении биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6 SOD2 SEQ ID NO:6, содержащей модифицированную кДНК SOD2, что показано на фигуре 20.

Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для ее последующего введения пациенту в рамках терапевтической процедуры.

Обозначения:

1 - лизат биоптата после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:1 (А)

2 - лизат биоптата после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:2 (В)

3 - лизат биоптата после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:3 (С)

4 - лизат биоптата после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:4 (D)

5 - лизат биоптата после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:5 (Е)

6 - лизат биоптата после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:6 (F)

7 - лизат биоптата после введения БАГТС SOD2 SEQ ID No:7 (G)

8 - лизат биоптата после введения плацебо (Н)

Реализация изобретения.

При снижении активности генов, кодирующих белки окислительно-восстановительного баланса, например гена SOD2, происходит снижение антиоксидантной активности белка в организме.

Например, изучение трансгенных мышей с инактивированным геном SOD2 методом гомологичной рекомбинации показали, что гомозиготы (null) умерли в течение 10 дней, у них наблюдалось развитие кардиомиопатии, накопление липидов в печени и скелетных мышцах, метаболический ацидоз, и развитие нейродегенеративных заболеваний. У гетерозиготных мышей по аллелю SOD2 наблюдали выраженные дефекты митохондрий и запуска процесса апоптоза, которые проявлялись с возрастом [PMID: 23862693], [PMID: 19293248], [PMID: 15890620], [PMID: 11514315], [PMID: 14679299]

Преимущества использования генетической конструкции с геном SOD2 для коррекции уровня активности белка супероксиддисмутазы-2 в клетках органов и тканей человека, по сравнению с использованием модифицированного белка супероксиддисмутазы-2 по прототипу US8926965 следующие:

1) легче обеспечить более высокий и стабильный уровень белка в клетках,

2) не требуется сложная и дорогостоящая процедура рефолдинга и очистки белкового препарата,

3) обеспечивается транспортировка биологически активной генно-терапевтической субстанции в больший спектр клеток органов и тканей человека, а также более эффективная внутриклеточная транспортировка биологически активной генно-терапевтической субстанции,

4) учитываются индивидуальные характеристики пациента.

Таким образом, для создания линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций по данному изобретению был выбран ген SOD2, а не белок, кодируемый этим геном.

Для получения линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций осуществляют следующие действия:

1. Получение нативной кДНК гена SOD2, содержащей белок-кодирующую область гена SOD2, клонирование ее в промежуточную плазмиду для дальнейших модификаций этой кДНК.

2. Внесение в последовательность нуклеотидов кДНК гена SOD2 модификаций с целью создания линейки кДНК гена SOD2, обеспечивающих достаточный для борьбы с оксидативным стрессом уровень трансляции белка супероксиддисмутазы-2.

3. Клонирование нативной и модифицированных кДНК гена SOD2 в векторные плазмиды, способные обеспечить эффективную экспрессию этой кДНК в клетках органов и тканей человека.

4. Трансформация каждой из полученных генетических конструкций бактериальных клеток E.coli, анализ трансформированных клонов на предмет наличия, ориентации и копийности вставки кДНК и наращивание отобранных клонов для получения необходимого для дальнейшей работы количества вариантов плазмидной ДНК.

5. Выделение линейки генетических конструкций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена SOD2 для создания на ее базе линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.

6. Создание линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций, каждая из которых включает генетическую конструкцию с модифицированной или нативной кДНК гена SOD2, или комбинацию такой конструкции с транспортной молекулой для эффективной трансфекции различных типов клеток органов и тканей и/или введения в органы и ткани человека.

Для доказательства эффективности созданных биологически активных генно-терапевтических субстанций, приводящих к увеличению экспрессии гена SOD2, проводят следующие исследования:

A) Выращивание культур различных типов клеток из биоптатов различных органов и тканей человека, например, фибробластов кожи человека, или хондробластов, или кератоцитов, или эпителиальных клеток роговицы.

B) Выделение РНК из культуры клеток, например, фибробластов кожи человека, или хондробластов, или кератоцитов, или эпителиальных клеток роговицы, и анализ транскрипции гена SOD2 из генома этих клеток.

C) Трансфекция культуры клеток, например, фибробластов кожи человека, или хондробластов, или кератоцитов, или эпителиальных клеток роговицы, биологически активными генно-терапевтическими субстанциями содержащими нативную и/или модифицированные кДНК гена SOD2 и параллельная трансфекция культуры этих же клеток векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена SOD2 в различных комбинациях.

D) Сравнительный анализ изменения уровня кДНК и/или изменения активности белка супероксиддисмутазы-2, после трансфекции в различных комбинациях клеток, например, фибробластов кожи человека, или хондробластов, или кератоцитов, или эпителиальных клеток роговицы, биологически активными генно-терапевтическими субстанциями содержащими нативную и/или модифицированные кДНК гена SOD2 и параллельной трансфекции культуры этих же клеток векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена SOD2. Данный анализ проводят, в частности, перед предполагаемой терапией с целью определения наиболее эффективной для пациента биологически активной генно-терапевтической субстанции.

E) Введение пациентам в органы и ткани культуры клеток с кДНК гена SOD2, например, введение, в кожу человека, аутологичных фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD2 и параллельное введение пациентам в органы и ткани, например, в кожу, культур этих же клеток нетрансфицированных и трансфицированных вектором без вставки кДНК гена SOD2 и/или введение пациентам в органы и ткани биологически активных генно-терапевтических субстанций, например, введение в кожу человека биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и/или модифицированные кДНК SOD2, а также плацебо в различных комбинациях.

F) Сравнительный анализ активности белка супероксиддисмутазы-2 в органах и тканях человека, в частности в коже человека, после введения клеток нетрансфицированных и трансфицированных биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими кДНК гена SOD2 и векторными плазмидами, не содержащими кДНК гена SOD2 и/или биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную или модифицированные кДНК гена SOD2, а также плацебо.

G) Введение пациентам в органы и ткани, например, слизистую оболочку рта, или мышечную ткань биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и/или модифицированные кДНК гена SOD2, а также плацебо.

H) Сравнительный анализ активности белка супероксиддисмутазы-2 в органах и тканях человека, в частности в слизистой оболочке рта, или мышечной ткани человека, после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и/или модифицированные кДНК SOD2 а также плацебо.

I) Введение пациентам в органы и ткани, например, введение в кожу пациента биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и модифицированные кДНК гена SOD2.

J) Сравнительный анализ изменения активности белка супероксиддисмутазы-2 в органах и тканях пациента, в частности в коже, после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и модифицированные кДНК гена SOD2. Данный анализ проводят, в частности, перед предполагаемой терапией с целью выбора наиболее эффективной для пациента биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.

Пример 1.

Получение нативной (немодифицированной) кДНК гена SOD2.

Немодифицированная кДНК гена SOD2 представляет собой последовательность нуклеотидов, идентичную приводимой в базе данных GenBank под номером NM_000636.2; нуклеотиды со 155 по 823 транслируются в аминокислотную последовательность, соответствующую приведенной в GenBank под номером NP_000627.2.

Суммарную РНК получают из клеток человеческой крови с помощью набора PAXGeneBlood RNA Kit (Qiagen, Germany) и используют для получения суммарной кДНК путем обратной транскрипции с помощью обратной транскриптазы RevertAid (ThermoScientific, USA) и случайных 9-нуклеотидных праймеров по методике производителя обратной транскриптазы. Затем, используя суммарную кДНК в качестве матрицы и специфичные, предварительно кинированные праймеры, комплементарные нуклеотидам 37-54 5'-GCTCCCCGCGCTTTCTTA-3' (SOD2F1) и 934-912 5'-AGCAACATCAAGAAATGCTACAA-3' (SOD2R1) из последовательности мРНК SOD2 (GenBank NM_000636.2), получают кДНК SOD2. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят с помощью ДНК-полимеразы Phusion (ThermoScientific, USA), дающей продукты с тупыми концами. ПЦР проводят с помощью амплификатора Master CyclerGradient (Eppendorf, USA) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл суммарной кДНК первой цепи, по 0,1 мкМ каждого праймера SOD2F1 и SOD2R1, 250 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), 100 мМ трис-HCl (рН 8,85 при 20°С), 50 мМ сульфата аммония, 250 мМ хлористого калия, 0,01% Твин-20 и 5 ед. Pfu ДНК-полимеразы (PhusionThermoScientific, USA) при следующих условиях: первоначальная денатурация при 98°С в течение 30 сек., 35 циклов, включающих денатурацию при 98°С в течение 10 сек., отжиг праймеров при 58°С в течение 30 сек. и элонгацию при +68°С в течение 2 мин.

Продукт амплификации выделяют из агарозного геля с помощью набора QIAquickGelExtractionKit (Qiagen, Germany)

Амплифицированный фрагмент кДНК, несущий ген SOD2, клонируют в плазмидном векторе pUC19 (NEB, USA, кат. номер N3041S). ДНК векторной плазмиды pUC19 (NEB, USA, кат. номep N3041S) гидролизуют рестриктазой Smal (NEB, USA), или другой рестриктазой, дающей тупые концы, и обрабатывают щелочной фосфатазой. Амплифицированный фрагмент кДНК и линеаризованную плазмиду pUC19 лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 400000 ед./мл. (NEB, USA, кат номер M0202S) из расчета 1 мкл фермента на 1 мкг ДНК. Лигирование проводят в объеме 20 мкл в присутствии 2 мМ АТФ, 50 мМ трис -HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT в течение 10 ч при 16°C.

Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coliTop10 (http://molbiol.ru/protocol/03_04.html), которые высевают на чашки Петри с L-агаром, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и по 40 мкл на чашку растворов 100 мМ ИПТГ и 2% X-gal. Отдельные колонии анализируют на наличие вставки с помощью ПЦР с праймерами SOD2F1 и SOD2R1 и подтверждают секвенированием по методу Сэнгера, которое показывает наличие клонов с разной ориентацией целевого гена: EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII и HindIII--5'NTR-кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI.

Полученная таким образом клонированная частичная (с 37 по 934 н.п) нативная (немодифицированная) последовательность гена SOD2 длиной 898 н.п. в плазмиде pUC19-SOD2 SEQ ID No:1 имеет первичную структуру, приведенную на фигуре 1.

Пример 2.

Получение модифицированных кДНК гена SOD2.

Модификации проводят таким образом, чтобы не затрагивать первичную структуру белка супероксиддисмутазы-2, а именно, делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность.

В частности для получения линейки кДНК гена SOD2 с целью повышения эффективности транскрипции и трансляции супероксиддисмутазы-2 в клетках тканей и органов человека в нативную последовательность кДНК SOD2, используя принцип оптимизации кодонов, вносят модификации путем замены минорных кодонов на синонимичные мажорные, а также, проводят делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей таким образом, чтобы замены не привели к изменениям в аминокислотной последовательности белка или обрыву аминокислотной цепи при трансляции, не ухудшили процессы транскрипции и трансляции.

Все модификации осуществляют в несколько этапов методом ПЦР мутагенеза набором QuikChange II XL kit или QuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesisKit (AgilentTechnologies, USA,) согласно рекомендациям производителя.http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/200513.

К плазмидной ДНК pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 по Примеру 1 (вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI) в количестве 10-50 нг добавляют 50-100 нг праймера, содержащего необходимую замену, инсерцию или делецию длиной 25-45 н.п. и проводят ПЦР в буфере QuikChangeMultireactionbuffer (AgilentTechnologies, USA) со смесью ферментов QuikChangeMultimix (AgilentTechnologies, USA) при следующих условиях: 95°С, 1 мин; далее от 30 до 35 циклов: 95°С 1 минута, 55°С 1 минута, 65°С 2 минуты/1000 н.п. После проведения ПЦР к амплификационной смеси добавляют 1-2 мкл рестриктазы Dpn I и инкубируют 1-2 часа при 37°С. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coliTop10 (http://molbiol.ru/protocol/03_04.html), которые высевают на чашки с L-агаром, содержащих 100 мкг/мл ампициллина. Трансформированнные колонии анализируют на содержание мутаций секвенированием плазмидной ДНК по методу Сэнгера.

Для получения модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:2 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК SOD2 SEQ ID No:1 (вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНКSOD2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI) используемой в качестве матрицы:

1. SOD2 191-208 F: 5' CTGGCTCCCGTTTTGGGG- 3', комплементарный нуклеотидам 190-208, с заменой G→C в позиции 199,

2. SOD2 275-298 F: 5' CACATCAACGCCCAGATCATGCAG 3', комплементарный нуклеотидам 275-298, с заменой G→С в позиции 286,

3. SOD2 311-333 F: 5' AAGCACCACGCCGCCTACGTGAA 3', комплементарный нуклеотидам 311-333, с заменой G→C в позиции 322.

Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК SOD2 SEQ ID No:2 содержит 3 нуклеотидных замены G→C в позициях 199, 286 и 322, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2 и имеет первичную структуру, приведенную на фигуре 2.

Для получения модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:3 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК SOD2 SEQ ID No:1 (вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы::

1. SOD2 191-208 F: 5' CTGGCTCCCGTTTTGGGG 3', комплементарный нуклеотидам 191-208, с заменой G→С в позиции 199,

2. SOD2 275-298 F: 5' CACATCAACGCCCAGATCATGCAG 3', комплементарный нуклеотидам 275-298, с заменой G→C в позиции 286,

3. SOD2 311-333 F: 5' AAGCACCACGCCGCCTACGTGAA 3', комплементарный нуклеотидам 311-333, с заменой G→C в позиции 322.

4. SOD2 360-384 F: 5' ACCAGGAGGCCTTGGCCAAGGGAGA 3', комплементарный нуклеотидам 360-384, с заменой G→C в позиции 370 и

5. SOD2 389-413 F: 5' ACAGCCCAGATCGCTCTTCAGCCTG 3', комплементарный нуклеотидам 389-413, с заменой А→С в позиции 400.

Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК SOD2 SEQ ID No:3 содержит 4 нуклеотидные замены G→C в позициях 199, 286, 322 и 370 и замену А→С в позиции 400, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2 и имеет первичную структуру, приведенную на фигуре 3.

Для получения модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:4 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК SOD2 SEQ ID No:1 (вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:

1. SOD2 191-208 F: 5' CTGGCTCCCGTTTTGGGG 3', комплементарный нуклеотидам 191-208, с заменой G→C в позиции 199,

2. SOD2 275-298 F: 5' CACATCAACGCCCAGATCATGCAG 3', комплементарный нуклеотидам 275-298, с заменой G→C в позиции 286

3. SOD2 311-333 F: 5' AAGCACCACGCCGCCTACGTGAA 3', комплементарный нуклеотидам 311-333, с заменой G→C в позиции 322,

4. SOD2 360-384 F: 5' ACCAGGAGGCCTTGGCCAAGGGAGA 3', комплементарный нуклеотидам 360-384, с заменой G→C в позиции 370,

5. SOD2 389-413 F: 5' ACAGCCCAGATCGCTCTTCAGCCTG 3', комплементарный нуклеотидам 389-413, с заменой А→С в позиции 400.

6. SOD213-538 F: 5' CCATCAAAAGAGACTTTGGTTCCTTT 3', комплементарный нуклеотидам 513-538, с заменами С→А в позиции 521 и Т→А в позиции 523;

7. SOD2548-576F: 5'AAGGAGAAGCTGACCGCTGCATCTG-TTGG3', комплементарный нуклеотидам 548-576, с заменой G→C в позиции 562.

Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК SOD2 SEQ ID No:4 содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 199, 286, 322, 370, 562; замену А→С в позиции 400; замену С→А в позиции 521 и замену Т→А в позиции 523, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2 и имеет первичную структуру, приведенную на фигуре 4.

Для получения модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:5 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК SOD2 SEQ ID No:1 (вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:

1. SOD2 191-208 F: 5' CTGGCTCCCGTTTTGGGG 3', комплементарный нуклеотидам 191-208, с заменой G→C в позиции 199,

2. SOD2 275-298 F: 5' CACATCAACGCCCAGATCAT-GCAG 3', комплементарный нуклеотидам 275-298, с заменой G→C в позиции 286,

3. SOD2 311-333 F: 5' AAGCACCACGCCGCCTACGTGAA 3', комплементарный нуклеотидам 311-333, с заменой G→C в позиции 322,

4. SOD2 360-384 F: 5' ACCAGGAGGCCTTGGCCAAGGGAGA 3',

комплементарный нуклеотидам 360-384, с заменой G→C в позиции 370,

5. SOD2 389-413 F:

5' ACAGCCCAGATCGCTCTTCAGCCTG 3', комплементарный нуклеотидам 389-413, с заменой А→С в позиции 400,

6. SOD2 513-538 F: 5' CCATCAAAAGAGACTTTGGTTC-СТТТ 3', комплементарный нуклеотидам 513-538, с заменами С→А в позиции 521 и Т→А в позиции 523;

7. SOD2 548-576F: 5' AAGGAGAAGCTGACCGCTGCATC-TGTTGG 3', комплементарный нуклеотидам 548-576, с заменой G→C в позиции 562,

8. SOD2 621-650 F: 5' GGGGACACCTGCAAATTGCTGCT-TGTCCAA 3', комплементарный нуклеотидам 621-650, с заменами Т→С в позиции 629 и A→G в позиции 631,

9. SOD2 761-787F: 5' GCTATTTGGAATGTGATCAACT-GGGAG 3', комплементарный нуклеотидам 761-787, с заменой A→G в позиции 775.

Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК SOD2 SEQ ID No:5 содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 199, 286, 322, 370, 562; замену А→С в позиции 400; замену С→А в позиции 521, замену Т→А в позициях 523, замену Т→С в позиции 629 и 2 замены A→G в позициях 631 и 775, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2 и имеет первичную структуру, приведенную на фигуре 5.

Для получения модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:6 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК SOD2 SEQ ID No:1 (вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:

1. SOD2 191-208 F: 5' CTGGCTCCCGTTTTGGGG 3', комплементарный нуклеотидам 191-208, с заменой G→C в позиции 199,

2. SOD2 275-298 F: 5' CACATCAACGCCCAGATCAT-GCAG 3', комплементарный нуклеотидам 275-298, с заменой G→C в позиции 286

3. SOD2 311-333 F: 5' AAGCACCACGCCGCCTACGTGAA 3', комплементарный нуклеотидам 311-333, с заменой G→C в позиции 322.

4. SOD2 360-384 F: 5' ACCAGGAGGCCTTGGCCAAGGGAGA 3', комплементарный нуклеотидам 360-384, с заменой G→C в позиции 370.

5. SOD2 389-413 F: 5' ACAGCCCAGATCGCTCTTCAGCCTG 3', комплементарный нуклеотидам 389-413, с заменой А→С в позиции 400.

6. SOD2 513-538 F: 5' CCATCAAAAGAGACTTTGGT-TCCTTT 3', комплементарный нуклеотидам 513-538, с заменами С→А в позиции 521 и Т→А в позиции 523; и

7. SOD2 548-576 F: 5' AAGGAGAAGCTGACCGCTGCATCT-GTTGG 3', комплементарный нуклеотидам 548-576, с заменой G→C в позиции 562.

8. SOD2 621-650 F: 5' GGGGACACCTGCAAATTGCTGCT-TGTCCAA 3', комплементарный нуклеотидам 621-650, с заменами Т→С в позиции 629 и A→G в позиции 631 и

9. SOD2 761-787 F: 5' GCTATTTGGAATGTGATCAACT-GGGAG 3', комплементарный нуклеотидам 761-787, с заменой A→G в позиции 775.

10. SOD2 744-773 F: 5' GGCCTGATTATCTGAAAGCTA-TTTGGAATG 3', комплементарный нуклеотидам 744-773, с заменой A→G в позиции 757,

11. SOD2 783-809 F: 5' GGGAGAATGTGACTGAAAGA-TACATGG 3', комплементарный нуклеотидам 783-809, с заменой A→G в позиции 793.

Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК SOD2 SEQ ID No:6 содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 199, 286, 322, 370, 562; замену А→С в позиции 400; замену С→А в позиции 521, замену Т→А в позициях 523, замену Т→С в позиции 629 и 4 замены A→G в позициях 631, 757, 775 и 793 не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2 и имеет первичную структуру, приведенную на фигуре 6.

Для получения модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:7 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК SOD2 SEQ ID No:1 (вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-SOD2 SEQ ID No:1 с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:

1. SOD2 191-208 F: 5' CTGGCTCCCGTTTTGGGG 3', комплементарный нуклеотидам 191-208, с заменой G→C в позиции 199,

2. SOD2 275-298 F: 5' CACATCAACGCCCAGATCAT-GCAG 3', комплементарный нуклеотидам 275-298, с заменой G→C в позиции 286,

3. SOD2 311-333 F: 5' AAGCACCACGCCGCCTACGTGAA 3', комплементарный нуклеотидам 311-333, с заменой G→C в позиции 322,

4. SOD2 360-384 F: 5' ACCAGGAGGCCTTGGCCAAGGGAGA 3', комплементарный нуклеотидам 360-384, с заменой G→C в позиции 370,

5. SOD2 389-413 F: 5' ACAGCCCAGATCGCTCTTCAGCCTG 3', комплементарный нуклеотидам 389-413, с заменой А→С в позиции 400,

6. SOD2 513-538 F: 5' CCATCAAAAGAGACTTTGG-ТТССТТТ 3', комплементарный нуклеотидам 513-538, с заменами С→А в позиции 521 и Т→А в позиции 523;

7. SOD2 548-576 F: 5' AAGGAGAAGCTGACCGCTGCATC-TGTTGG 3', комплементарный нуклеотидам 548-576, с заменой G→C в позиции 562.

8. SOD2 621-650 F: 5' GGGGACACCTGCAAATTGCTGC-TTGTCCAA 3', комплементарный нуклеотидам 621-650, с заменами Т→С в позиции 629 и A→G в позиции 631,

9. SOD2 761-787 F: 5' GCTATTTGGAATGTGATCAAC-TGGGAG 3', комплементарный нуклеотидам 761-787, с заменой A→G в позиции 775.

10. SOD2 744-773 F: 5' GGCCTGATTATCTGAAAGCTAT-TTGGAATG 3', комплементарный нуклеотидам 744-773, с заменой A→G в позиции 757,

11. SOD2 783-809 F: 5' GGGAGAATGTGACTGAAAGAT-ACATGG 3', комплементарный нуклеотидам 783-809, с заменой A→G в позиции 793.

12. а также для удаления 5' -нетранслируемой области гена SOD2 из последовательности с внесенными заменами с помощью ПЦР мутагенеза с праймером: 5' GACTCTAGAGGATCCCCGCCACCATGTTGAGCCGGGCAGTGTG 3' для варианта с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI

13. а также для удаления 3' -нетранслируемой области гена SOD2 из последовательности с внесенными заменами с помощью ПЦР мутагенеза с праймером: 5' ATGGCTTGCAAAAAGTAAGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGG 3' для варианта с ориентацией целевого гена HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI

14. а также для удаления 5' -нетранслируемой области гена SOD2 из последовательности с внесенными заменами с помощью ПЦР мутагенеза с праймером: 5' GAATTCGAGCTCGGTACCCGCCACCATGTTGAGCCGGGCAGTG 3' для варианта с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII

15. а также для удаления 3' -нетранслируемой области гена SOD2 из последовательности с внесенными заменами с помощью ПЦР мутагенеза с праймером: 5' ATGGCTTGCAAAAAGTAAGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTG 3' для варианта с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII

Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК SOD2 SEQ ID No:7 не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 199, 286, 322, 370, 562; замену А→С в позиции 400; замену С→А в позиции 521, замену Т→А в позицииях 523, замену Т→С в позиции 629 и 4 замены A→G в позициях 631, 757, 775 и 793 не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-2 и имеет первичную структуру, приведенную на фигуре 7.

Таким образом, получают линейку из 7 векторов на базе плазмиды pUC19, в которой клонированы кодирующие нативная и модифицированные нуклеотидные последовательности гена SOD2, (при этом каждый вектор из линейки получен в двух вариантах и содержит целевой ген с ориентацией EcoRI-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTRHindIII и целевой ген с ориентацией HindIII--5'NTR- кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI для создания генетических экспрессионных конструкций на базе разных векторов) для создания линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.

Пример 3.

Создание генетических конструкций с модифицированными и нативной кДНК гена SOD2 для получения на их базе биологически активных генно-терапевтических субстанций.

Для экспрессии кДНК гена SOD2 в клетках органов и тканей человека полученные варианты кДНК SOD2 по Примеру 1 и Примеру 2 помещают в векторную плазмиду, при выборе которой используют следующие критерии выбора:

1) плазмида должна обязательно реплицироваться в E.coli, желательно с высокой копийностью;

2) в плазмиде должен быть бактериальный фактор селекции;

3) в векторе должно быть наличие эукариотических регуляторных элементов - обязательных промотора и терминатора (сигнала полиаденилирования), например, энхансер и интронный(е) элемент(ы);

4) наличие удобного полилинкера для клонирования. Примером такой плазмиды может быть pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo (OriGene, USA) или pCDNA 3.1(+) (ThermoFisherScientific, USA).

При клонировании кДНК гена SOD2 в pCDNA 3.1(+) кодирующая нуклеотидная последовательность помещается под контроль промотора цитомегаловируса человека CMV, эффективного в эукариотических клетках, и сигнала полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Также данная плазмида обладает бактериальным фактором селекции - геном устойчивости к ампициллину, и эукариотическим фактором селекции - геном устойчивости к неомицину. При клонировании учитывают последовательность расположения сайтов HindIII и EcoRI в полилинкере pCDNA 3.1(+) и поэтому для клонирования в данный вектор используют HindIII-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTR-Eco RI ориентированный фрагмент в pUC19 по примеру 1.

При клонировании кДНК гена SOD2 в pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo кодирующая нуклеотидная последовательность помещается под контроль промотора цитомегаловируса человека CMV, эффективного в эукариотических клетках, и сигнала полиаденилирования гена гормона роста человека. Также данная плазмида обладает бактериальным фактором селекции - геном устойчивости к ампициллину. При клонировании учитывают последовательность расположения сайтов EcoRI и HindIII в полилинкере pCMV6-XL5 (pCMV6-Kan/Neo) и поэтому для клонирования в данный вектор используют Eco RI -5'NTR-кДНК SOD2-3'NTR- HindIII ориентированный фрагмент в pUC19 по примеру 1.

Векторные плазмиды pUC19-SOD2 SEQ ID No:1 с частичной нативной (немодифицированной) последовательностью гена SOD2 (с 37 по 934 н.п.), pUC19-SOD2 SEQ ID No:2, pUC19-SOD2 SEQ ID No:3, pUC19-SOD2 SEQ ID No:4, pUC19-SOD2 SEQ ID No:5, pUC19-SOD2 SEQ ID No:6, с частичной модифицированной путем замены оснований нуклеотидной последовательностью гена SOD2 (с 37 по 934 н.п.) и pUC19-SOD2 SEQ ID No:7 с модифицированной кДНК гена SOD2 и лишенной нетранслируемыех 5' и 3' областей данного гена, а также векторные плазмиды pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1(+) для дальнейшей экспрессии гена SOD2 в эукариотических клетках, гидролизуют рестриктазами EcoRI и HindIII(NEB, USA) при 37°С в соответствующем буфере (Маниатис Т., и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984).

Продукты рестрикции разделяют с помощью электрофореза в геле 1% агарозы, окрашивают раствором бромистого этидия и фрагменты ДНК, соответствующие гену-вставке HindIII-5'NTR-кДНК SOD2-3'NTR-EcoRI, либо Eco RI -5'NTR-кДНК SOD2-3'NTR-HindIII и линеаризованной плазмиде pCMV6-XL5 и pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1(+), вырезают, выделяют из геля с помощью набора для выделения из геля QIAquickGelExtractionKit из примера 1 и смешивают. Полученную смесь рестрикционных фрагментов лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Лигирование проводят в течение 10-15 мин при комнатной температуре, а затем - при 12°С в течение 10 ч. Лигированную ДНК используют для трансформации клеток E-coli по стандартной методике с использованием хлористого кальция.

Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB с ампициллином (100 мкг/мл). Плазмидную ДНК из ампициллин-устойчивых колоний выделяют с помощью набора для выделения плазмид QiagenSpinMiniprepKit, анализируют с помощью гидролиза рестриктазами EcoRI и HindIII и отбирают генетические конструкции, содержащие в своем составе кодирующую последовательность гена SOD2 под контролем промотора цитомегаловируса CMV, и сигналом полиаденилирования гена гормона роста, обозначаемую как pCMV6 SOD2 SEQ ID No:(1-7) или pCMV6-Kan/Neo SOD2 SEQ ID No:(1-7) или pCDNA 3.1SOD2 SEQ ID No:(1-7). Наличие вставки кДНК гена SOD2, ее последовательность и ориентацию также подтверждают с помощью секвенирования ДНК генетических конструкций по методу Сэнгера.

Бактерии, содержащие полученные генетические конструкции на базе векторов pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1(+), выращивают на жидкой среде LB с ампициллином, лизируют и выделяют плазмидную ДНК для трансфекции специальным набором для выделения плазмид QiagenMaxiKit для получения соответствующих биологически активных генно-терапевтических субстанций.

Полученные генетические экспрессионные конструкции используют для получения на их базе биологически активных генно-терапевтических субстанций, которые в дальнейшем применяют для трансфекции эукариотических клеток органов и тканей и/или введения в органы и ткани человека. В качестве контрольных плазмид используют исходный вектор pCMV6-XL5, (pCMV6-Kan/Neo) или pCDNA 3.1(+) без вставки кДНК гена SOD2.

Пример 4.

Наращивание генетической конструкции в бактериальной культуре.

Для получения препаративных количеств векторной плазмиды, содержащей один из вариантов кДНК гена SOD2, полученными конструкциями по примеру 3 трансформируют бактериальные клетки E.coli (Маниатис Т., и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984) и выращивают полученные клоны бактерий, содержащие конструкцию, в присутствии бактериального фактора селекции - устойчивости к ампициллину.

Лигазную смесь по примеру 3 используют для трансформации компетентных клеток E.coli штамма XLblue. Предварительный отбор клонов, содержащих вставку кДНК гена SOD2 в правильной ориентации и единичной копии, осуществляют путем гидролиза плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и HindIII и анализа продуктов рестрикции путем электрофореза в 1.2% агарозном геле. Отобранные клоны используют для препаративного наращивания плазмидной ДНК с целью дальнейшей трансфекции в культуры фибробластов (хондробластов, кератоцитов и др.).

Для получения препаративных количеств генетических экспрессионных конструкций по Примеру 3 выращивали 20 мл ночной культуры E.coli в LB-среде с 150 мкг/мл ампициллина. Этой культурой инокулировали 500 мл LB-среды с 100 мкг/мл ампициллина, рост осуществляли в шейкере-инкубаторе в течение 16 часов при 37°С и 200 об/мин. Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью набора EndoFreePlasmidMaxiKit (Qiagen, Germany). Выход составил 350 мкг ДНК.

Пример 5.

Культивирование эукариотических клеток, например, фибробластов для последующих трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией и анализа экспрессии гена SOD2.

Для последующей трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей один из вариантов кДНК SOD2 по примеру 3, выращивают первичные культуры фибробластов человека из биоптатов кожи пациентов.

Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (MedaxSRL) берут образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, например за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 3 мм, массой - до 20 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Выращивание первичной культуры клеток осуществляют на чашках Петри при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂ в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Трипсинизацию и пересев производят каждые 5 дней, для трипсинизации клетки промывали раствором PBS и инкубировали 30 минут при 37°С в растворе, содержащем 0.05% трипсина и 1 мМ ЭДТА. Для нейтрализации трипсина к клеткам добавляли 5 мл культуральной среды и центрифугировали суспензию при 600 об/мин 5 минут. Рост культуры фибробластов после 4-5 пассажей осуществляли в культуральных флаконах емкостью 75 мл в среде, содержащей 10 г/л DMEM, 3.7 г/л Na₂CO₃, 2.4 г/л HEPES, 10% фетальной сыворотки и 100 Ед/мл ампициллина. Смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 10⁶ клеток.

Часть культуры фибробластов, предназначенную для выделения РНК с последующим анализом транскрипции гена SOD2, центрифугировали при 1000 об/мин 20 минут и дважды отмывали в буферном растворе PBS центрифугированием при 600 об/мин в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендировали в 1.5 мл стабилизирующего реагента RNAlater и хранили при 4°С в течение 10 дней для последующего выделения РНК.

Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasyMiniKit. (Qiagen, Germany). Выделенную РНК анализировали спектрофотометрически, измеряя соотношение оптической плотности при 260 и 280 нм, а также с помощью капиллярного электрофореза на приборе QIAxcel (Qiagen, Germany), используя картридж RNA Qiality Control. Для дальнейшей работы использовали только те образцы, для которых общее количество выделенной РНК было не менее 50 мкг РНК, соотношение D260: D280 - не менее 1,8, а соотношение полос 28S: 18S на капиллярном электрофорезе - не ниже 1:1.

Синтез суммарной кДНК первой цепи проводили, используя обратную транскриптазу RevertAid (Thermo Scientific, USA), согласно рекомендациям изготовителя. 1-2 мкг суммарной РНК использовали в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК. В реакционную смесь для проведения обратной транскрипции вносили 100-200 ед. обратной транскриптазы и 10 пМ случайного 9-нуклеотидного праймера.

Пример 6.

Анализ эндогенной экспрессии гена SOD2 в культуре первичных фибробластов.

Анализ транскрипции гена SOD2 из генома фибробластов проводят с целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции этих клеток генетическими конструкциями с кДНК гена SOD2.

Для анализа используют клеточные линии фибробластов кожи, фибробласты с низкой экспрессией гена SOD2 и фибробласты с нормальной экспрессией гена SOD2, из которых выделяют РНК по стандартной методике (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984).

Выделенную РНК анализируют методом ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена SOD2, используют прямой праймер SOD2FA1 5'-CTGATTTGGACAAGCAGCAA-3' и обратный праймер SOD2-RA1 5'-CTGGACAAACCTCAGCCCTA-3'. Длина продукта амплификации - 199 нуклеотидов. В качестве референтного гена используют ген бета-2-микроглобулина В2М, уровень экспрессии которого в фибробластах сопоставим с таковым в норме для гена SOD2.

ПЦР-амплификацию проводят с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, USA) или другого набора для ПЦР в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого прймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляют на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 50°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин., затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек., отжиг праймеров 60°С - 30 сек. и элонгацию 72°С - 30 сек.

В качестве положительного контроля используют концентрацию ампликонов, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов SOD2 и В2М. В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду (кривые накопления ПЦР продуктов отрицательного и положительных контролей для упрощения визуализации на фигуре 8 не показаны).

Количество ПЦР продуктов - кДНК генов SOD2 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивают в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

По итогам анализа экспрессии гена SOD2 в разных культурах фибробластов (с низкой экспрессией гена SOD2 и с нормальной экспрессией гена SOD2) были отобраны клоны от пациентов одного возраста и одного типа старения, в которых количество ПЦР-продукта, соответствующего кДНК гена SOD2, была в 10-20 раз ниже таковой кДНК гена В2М. Кривые накопления специфических ПЦР-продуктов приведены на фигуре 8.

Пример 7.

Трансфекция клеточной культуры фибробластов со сниженной экспрессией гена SOD2 биологически активной генно-терапевтической субстанцией с целью подтверждения увеличения экспрессии гена SOD2 в культуре данных клеток.

Для оценки эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции, содержащей немодифицированную кДНК гена SOD2 по примеру 3, этой биологически активной генно-терапевтической субстанцией трансфицируют первичную культуру фибробластов человека со сниженной экспрессией гена SOD2, отобранную по примеру 6.

Данную культуру фибробластов выращивают в культуральных флаконах (25 см²) до момента, когда клетки покрывают 50-70% поверхности флакона. Полученные клетки трансфицируют биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- SOD2 SEQ ID No:1 в присутствии транспортной молекулы (например, дендримера) и вектором pCMV6-XL5 в качестве контроля.

6-луночный планшет с DMEM-средой с 10% фетальной телячьей сывороткой (1.6 мл в лунке) засевали фибробластами из расчета 1-4×10⁵ клеток на лунку. Инкубировали клетки в течение 18 часов при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Затем 2 мкг плазмидной ДНК растворяли в среде DMEM без сыворотки с буфером Трис-HCl 20 мМ с 1 мМ ЭДТА, рН 7-8 (минимальная концентрация ДНК - 0.1 мкг/мкл). Конечный объем смеси составлял 100 мкл.

В качестве транспортной молекулы использовали раствор дендримера SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия).

Приготовление комплекса ДНК-дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями: к 15 мкл раствора дендримера (с концентрацией 3 мкг/мкл) добавляли 5 мкл (с концентрацией 0,5 мкг/мкл) раствора плазмидной ДНК и тщательно перемешивали. Затем инкубировали смесь ДНК с дендримером в течение 5-10 минут при температуре 15-25°С.

Из лунок планшета с клеточной культурой осторожно отбирали среду (не нарушая клеточного слоя) и промывали клетки 3 мл буфера PBS. К раствору, содержащему комплексы ДНК-дендример, добавляли 600 мкл среды DMEM с фетальной сывороткой и переносили эту смесь в лунки планшета с клетками. Клетки инкубировали с комплексами 2-3 часа при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Затем осторожно удаляли среду и промывали клеточный слой 3 мл буфера PBS. Затем добавляли культуральную среду и инкубировали 24-48 часов при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO₂, после чего оценивали уровень кДНК гена SOD2 и контрольной кДНК гена В2М с помощью амплификации в режиме реального времени как описано в примере 6. Результаты анализа приведены на фигуре 9.

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена SOD2 уровень кДНК гена SOD2 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК SOD2 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена SOD2 многократно увеличился (до уровня выше уровня кДНК гена SOD2 в нормальных фибробластах).

Показано, что в клетках трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6-SOD2SEQIDNo1 наблюдается увеличение экспрессии целевого гена SOD2

Пример 8.

Трансфекция клеточной культуры фибробластов с нормальной экспрессией гена SOD2 биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD2 с целью подтверждения увеличения при этом активности белка супероксиддисмутазы-2 в культуре данных клеток.

Для оценки изменения уровня активности белка супероксиддисмутазы-2 в культуре фибробластов, использовали три варианта клеточной культуры - нетрансфицированные фибробласты, обработанные водным раствором дендримеров (А), трансфицированные векторной плазмидой, например, pCDNA 3.1(+), не содержащей кДНК гена SOD2 (В) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе той же самой векторной плазмиды, содержащей кДНК гена SOD2 - pCDNA 3.1SOD2 SEQ ID No:1(C). Трансфекцию клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCDNA 3.1SOD2 SEQ ID No:1 и вектором pCDNA 3.1(+) в присутствии транспортных молекул (дендримеров) проводят как описано в примере 7.

Клеточный осадок, соответствующий 2×10⁶ клеток промывали фосфатным буфером и ресуспендировали во льду в лизирующем буфере, содержащем 25 мМ ХЕПЕС рН 7.9, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 10% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид. Лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин.

Активность белка супероксиддисмутазы-2 определяли непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, USA). Принцип метода состоит в том, что супероксиддисмутаза-2 снижает концентрацию супероксид-аниона, что приводит к ингибированию реакции с участием супероксид-аниона и, следовательно, к уменьшению интенсивности окраски анализируемого раствора, содержащего краситель WST-1 с максимумом поглощения при 440 нм.

Анализ проводили по методике, рекомендуемой производителем. Из графика, приведенного на фигуре 10, следует, что лизат культуры клеток, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCDNA 3.1SOD2SEQIDNo1, ингибирует цветную реакцию полностью без разведения и при разведении 1:10. Таким образом показано, что транфекция фибробластов полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, несущей кДНК гена SOD2, приводит к повышению активности супероксиддисмутазы-2 в клетках фибробластов.

Пример 9.

Введение в кожу человека клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD2 с целью подтверждения увеличения после этого активности белка супероксиддисмутазы-2 в биоптате кожи человека.

С целью анализа изменения активности белка супероксиддисмутазы-2 в тканях человека пациентам в кожу предплечья вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированных (А), трансфицированных вектором без вставки, например, pCMV6-XL5 (В) и модифицированный биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе рСМV6- SOD2 SEQ ID No:7(C) в комбинации с транспортными молекулами - липосомами TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA),

Приготовление суспензии липосом проводили по методике производителя (Promega, TransFast Transfection Reagent, Instruction for Use of Product, E2431) с некоторыми изменениями: к 0,4 мг порошка липосом добавляли 0,4 мл стерильной воды степени очистки Nuclease-Free. Суспензию хорошо перемешивали взбалтыванием. Полученный полупродукт суспензии липосом выдерживали в течение 18 часов при температуре - 20°С, затем оттаивали при комнатной температуре, ресуспендировали встряхиванием или на настольном миксере типа «ВОРТЕКС».

Для приготовления комплекса ДНК-липосомы к 400 мкл раствора липосом (с концентрацией 1 мг/мл) добавляли 400 мкл раствора плазмидной ДНК (с концентрацией 150 мкг/мл) и тщательно перемешивали. Затем инкубировали смесь ДНК с липосомами в течение 5-10 минут при температуре 15-25°С и использовали далее в качестве биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Для последующей трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией выращивают первичные культуры фибробластов человека из биоптатов кожи пациентов по примеру 5.

Для трансфекции из лунок планшета с клеточной культурой осторожно отбирали среду (не нарушая клеточного слоя) и промывали клетки 3 мл буфера PBS. К раствору, содержащему комплексы ДНК-липосомы, добавляли 600 мкл среды DMEM с фетальной сывороткой и переносили эту смесь в лунки планшета с клетками. Клетки инкубировали с комплексами 2-3 часа при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Затем осторожно удаляли среду и промывали клеточный слой 3 мл буфера PBS. Затем добавляли культуральную среду и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Часть клеточной культуры центрифугировали при 700 об/мин, дважды отмывали клетки физиологическим раствором, ресуспендировали в физиологическом растворе из расчета 1 млн клеток в 200 мкл и использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Очаги введения культур фибробластов располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга. Активность супероксиддисмутазы-2 оценивали в лизатах биоптатов кожи пациента непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, USA) как описано в примере 8. Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения суспензии фибробластов. Взятие биопсии осуществляли из участков введения суспензии фибробластов, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (MedaxSRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин.

Как видно из фигуры 11, в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- SOD2 SEQ ID No: 7, произошло увеличение активности белка супероксиддисмутазы-2, тогда как при введении контрольных культур фибробластов (нетрансфицированных и трансфицированных вектором без вставки кДНК гена SOD2 pCMV6-XL5) активность белка супероксиддисмутазы-2 в коже не изменялась.

Таким образом, показана эффективность биологически активной генно-терапевтической субстанции, несущей модифицированную кДНК гена SOD2: трансфекция фибробластов полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, несущей модифицированную кДНК гена SOD2, приводит к повышению активности белка супероксиддисмутазы-2 в клетках фибробластов.

Пример 10.

Трансфекция культур фибробластов из биоптатов группы различных пациентов биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную к ДНК SOD2.

С целью подтверждения индивидуального характера увеличения активности белка супероксиддисмутазы-2 до различного уровня при трансфекции клеточных культур фибробластов пациентов биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена SOD2 анализировали уровень активности белка супероксиддисмутазы-2 в клеточных лизатах фибробластов, трансфицированных разными биологически активными генно-терапевтическими субстанциями по примеру 3, содержащими модифицированные и нативную кДНК SOD2 в группе пациентов в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD2.

Последовательность нативной кДНК SOD2 приведена на фигуре 1, SEQ ID No:1., последовательности модифицированных кДНК SOD2 приведены на фигуре 2-7 (SEQ ID No:2. SEQ ID No:3. SEQ ID No:4, SEQ ID No:5, SEQ ID No:6, SEQ ID No:7).

Вырастили культуры фибробластов из однотипных биоптатов кожи, отобранных из зоны внутренней боковой поверхности в области локтевого сустава 20 пациентов, выбранных случайным образом по примеру 5, отобрали аликвоты и оценили уровень супероксиддисмутазы-2 в клеточных лизатах. Клеточный осадок, соответствующий 2×10⁶ клеток, промывали фосфатным буфером и ресуспендировали во льду в лизирующем буфере, содержащем 25 мМ ХЕПЕС рН 7.9, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 10% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид. Лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин, концентрацию белка в супернатанте определяли методом Брэдфорда ([Bradford М.М. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.]).

Затем каждую из 20-ти культур фибробластов разделили на 8 частей. Одну часть, обозначенную (А), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:1, содержащей немодифицированную к ДНК SOD2 (SEQ ID No:1.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. Вторую часть, обозначенную (В), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:2, содержащей вариант 1 модифицированной кДНК SOD2 (SEQ ID No:2.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 3-ю часть, обозначенную (С), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID NO:3, содержащей вариант 2 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:3 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 4-ю часть, обозначенную (D), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:4, содержащей вариант 3 модифицированной кДНК SOD2 (SEQ ID No:4.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 5-ю часть, обозначенную (Е), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:5, содержащей 4 вариант модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:5 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 6-ю часть, обозначенную (F), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:6, содержащей вариант 5 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:6.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 7-ю часть, обозначенную (G), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:7, содержащей вариант 6 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:7 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 8-ю часть, обозначенную (Н), трансфицировали по примеру 7 векторной плазмидой pCMV6-XL5, не содержащей кДНК SOD2 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.

Активность супероксиддисмутазы-2 определяли через 72 часа после трансфекции непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD AssayKit-WST (Sigma-Aldrich, USA). Анализ проводили по методике, рекомендуемой производителем. Предварительно проводили оценку степени ингибирования цветной реакции в зависимости от концентрации чистого препарата супероксиддисмутазы-2. Исходя из данных предыдущих экспериментов, описанных в примере 8, лизат разводили в 5 раз.

По итогам анализа уровня активности супероксиддисмутазы-2 выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности супероксиддисмутазы-2 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное ингибирование в лизате, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при трансфекции немодифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошло 3 культуры из 20.

В группе 2 максимальное ингибирование в лизате, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при трансфекции 1 вариантом модифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошло 3 культуры из 20

В группе 3 максимальное ингибирование в лизате, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при трансфекции 2 вариантом модифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошло 2 культуры из 20.

В группе 4 максимальное ингибирование в лизате, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2 наблюдалось при трансфекции 3 вариантом модифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошли 2 культуры из 20.

В группе 5 максимальное ингибирование в лизате, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при трансфекции 4 вариантом модифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошло 3 культуры из 20.

В группе 6 максимальное ингибирование в лизате, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при трансфекции 5 вариантом модифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошли 2 культуры из 20.

В группе 7 максимальное ингибирование в лизате, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при трансфекции 6 вариантом модифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошло 5 культур из 20.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное ингибирование в лизате, соответствующее максимальной активности супероксиддисмутазы-2, присутствует при трансфекции вектором, не содержащим кДНК гена SOD2.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена SOD2

Из данного примера следует, что достижение максимальной активности супероксиддисмутазы-2 в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование биоптатов пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов на предмет максимальной эффективности терапевтического воздействия, созданных биологически активных генно-терапевтических субстанций в рамках линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.

Пример 11.

Трансфекции клеточной культуры кератоцитов и эпителиальных клеток глаза биологически активной генно-терапевтической субстанцией без транспортной молекулы с целью подтверждения при этом увеличения экспрессии гена SOD2 в данных культурах клеток.

С целью выяснения эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции, содержащей кДНК SOD2, в различных типах клеток, трансфицировали кератоциты и эпителиальные клетки роговицы человека, без использования транспортных молекул.

Биопсийный материал из области лимба в виде круга диаметром 1-1.5 мм помещали в чашку Петри в сбалансированный солевой раствор Хэнкса, добавляли диспазу (20 мкл 25 ед/мл) и гентамицин и инкубировали 24 часа при 4°С. Затем отделяли эпителиальный слой от стромы и нарезали обе ткани кусочками 1-2 мм³.

Суспензию эпителиальных клеток получали путем инкубирования кусочков тканей в растворе Трипсин-ЭДТА в течение 15 минут при 37°С. Трипсинизацию останавливали добавлением соевого ингибитора трипсина в PBS. Клеточные суспензии отмывали центрифугированием при 700 об/мин и ресуспендировали в бессывороточной среде DMEM с гентамицином. Клетки растили в 25 см² флаконах с 5 мл среды при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Через 24 часа среду с не прикрепившимися клетками удаляли и добавляли 5 мл свежей среды. Пересев производили каждые 7 дней в соотношении 1:2-1:3.

Суспензию кератоцитов получали путем инкубирования в среде RPMI-1640 с коллагеназой 300 ед/мл в течение 2 часов. Затем отмывали клетки и ресуспендировали в среде DMEM с 20% телячьей сывороткой и антибиотиком-антимикотиком. Клетки растили в 25 см2 флаконах с 1 мл среды при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Пересев производили каждые 7 дней в соотношении 1:4.

Поскольку эффективность трансфекции кератоцитов низкая, использовали биологически активную генно-терапевтическую субстанцию на основе плазмиды pCMV6-Kan/Neo SOD2 SEQ ID No:2, содержащую дополнительный фактор селекции - ген neo^r, придающий устойчивость к антибиотику генетицину.

Биологически активную генно-терапевтическую субстанцию добавляли к клеткам и инкубировали клетки 1 час при 37°С. После инкубации добавляли бессывороточную среду DMEM к эпителиальным клеткам и среду DMEM, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки к кератоцитам и продолжали инкубировать 24 часа. После 24-часового инкубирования клетки высевали в новую среду DMEM, содержащую 400 μg/mL фактора селекции - антибиотика G418 (Geneticin). Выжившие клетки культивировали в течение 2 недель в 25 см³ флаконах с 5 мл среды с G418. Всего выращивали 24 образца культур эпителиальных клеток и 24 образца культур кератоцитов.

Каждые 24 часа из каждой культуры отбирали аликвоту по 500 мкл суспензии с целью выделения РНК и анализа уровня специфической кДНК. Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasyMiniKit (Qiagen, Germany). Образцы РНК были сгруппированы в 3 группы по 8 образцов с близкой концентрацией и объединены. Анализ уровня специфической кДНК гена SOD2 проводили с помощью амплификации в режиме реального времени по методике и с праймерами по примеру 6, используя набор реагентов iTaqUniversalSYBRGreenSupermix (Bio-Rad, USA), амплификатор CFX96 (Bio-RadUSA) и программное обеспечение Bio-RadCFXManager 2.1. Максимальное увеличение экспрессии (транскрипции) гена SOD2 наблюдали на 3 сутки для эпителиальных клеток и на 5 сутки - для кератоцитов.

На фигуре 13 приведены кривые накопления специфического продукта амплификации, соответствующего кДНК гена SOD2, в кератоцитах и эпителиальных клетках роговицы.

Показано, что в кератоцитах и эпителиальных клетках роговицы человека, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- Kan/Neo SOD2 SEQ ID No:2, без транспортной молекулы, наблюдается усиление экспрессии целевого гена SOD2

Пример 12.

Трансфекции клеточной культуры хондробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с целью подтверждения при этом увеличения экспрессии гена SOD2 в данных культуре клеток.

С целью выяснения эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции, содержащей кДНК гена SOD2, в различных типах клеток, а также с целью оценки влияния транспортной молекулы на успешность трансфекции этой субстанцией - трансфицировали хондробласты человека, используя в качестве транспортной молекулы амфифильные блок-сополимеры.

Биоптаты хрящевой ткани массой 50-150 мг измельчали на фрагменты до 10 мм³ и инкубировали в буферном растворе с коллагеназой II, гиалуронидазой и трипсином в течение 48 часов при 37°С. Клетки отмывали бессывороточной средой DMEM, ресуспендировали в той же среде с гентамицином и выращивали при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO₂ во флаконах 75 см2 с 15 мл среды. Рост осуществлялся в бессыворотчной среде, так как в монослойной культуре хондроциты меняют форму и биохимические свойства. Пересев производили каждые 4 дня в соотношении 1:3, клетки снимали с поверхности флакона раствором трипсин-ЭДТА с 0.02% раствором Версена.

Для трансфекции клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена SOD2 использовали амфифильные блок-сополимеры. Применяли методику по (IntJPharm, 2012, 427, 80-87) или в (Macromol. Biosci. 2011, 11, 652-661), с некоторыми изменениями. Блок-сополимер синтезировали из смеси линейного полиэтиленимина (ПЭИ) (Polyscience Inc., США) и бифункционального полиэтиленгликоля (ПЭГ) N-гидроксисукцинимидил-75-N-(3-малеимидопропионил)-амидо-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73 - тетракосаоксапента-гептаконтаноата (MAL-dPEG™-NHS ester, Quanta BioDesign, Ltd., США) в боратном буфере. Полиплекс готовили за 1 час до введения в клетки, смешивая раствор блок-сополимера с ДНК генетической конструкции pCMV6- Kan/Neo SOD2 SEQ ID No:3 с модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:3. Смесь для трансфекции добавляли к суспензии клеток в 1 мл культуральной среды DMEM с 10% фетальной сывороткой и ампициллином.

Так как для трансфекции использовали конструкцию, содержащую фактор селекции (устойчивость к генетицину), то клетки после трансфекции выращивали в 25 см³ флаконах с 5 мл среды с генетицином в течение 12 дней, меняя среду каждые 4 дня. Каждые 24 часа из каждой культуры отбирали аликвоту по 500 мкл суспензии с целью выделения РНК и анализа уровня специфической кДНК. Выделение РНК производили с помощью набора RNeasyMiniKit(Qiagen, Germany). Образцы РНК были сгруппированы в 3 группы по 8 образцов с близкой концентрацией и объединены. Анализ уровня специфической кДНК SOD2 проводили с помощью амплификации в режиме реального времени по методике и с праймерами по примеру 6, используя набор реагентов iTaqUniversalSYBRGreenSupermix (Bio-Rad, USA), амплификатор CFX96 (Bio-Rad, USA) и программное обеспечение Bio-RadCFXManager 2.1. Максимальное увеличение транскрипции SOD2 наблюдали на 5 сутки. На фигуре 14 приведены кривые накопления специфического продукта амплификации, соответствующего кДНК гена SOD2.

Показано, что в хондробластах трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе рСМV6- Kan/Neo SOD2 SEQ ID No:3, используя в качестве транспортной молекулы амфифильные блок-сополимеры, наблюдается усиление экспрессии целевого гена SOD2

Пример 13.

Введение в кожу человека биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена SOD2 с целью подтверждения при этом увеличения активности супероксиддисмутазы-2 в коже человека.

С целью анализа изменения активности белка супероксиддисмутазы-2 пациентам вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую генетическую конструкцию с кДНК гена SOD2 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена SOD2 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья.

В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) по примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCMV6 SOD2 SEQ ID No:4, которая содержит модифицированную кДНК гена SOD2 (SEQ ID No:4), и плазмиду pCMV6-XL5, используемую в качестве плацебо - которая не содержит кДНК гена SOD2, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9.

Полученные биологически активную генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо - около 0,3 мл для каждого. Очаги введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.

Активность супероксиддисмутазы-2 оценивали в лизатах биоптатов кожи пациента непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, USA) no примеру 8. Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи в зоне введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL) далее как описано в примере 9.

Показано, что в коже пациента в области введения биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена SOD2, произошло увеличение активности супероксиддисмутазы-2, тогда как при введении плацебо активность супероксиддисмутазы-2 в коже не изменялась. Результаты отражены на фигуре 15

Пример 14.

Введение в слизистую оболочку рта человека биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена SOD2 с целью подтверждения при этом увеличения активности супероксиддисмутазы-2 в слизистой оболочке рта человека.

С целью анализа изменения активности белка супероксиддисмутазы-2 пациентам вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую генетическую конструкцию с кДНК гена SOD2 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена SOD2 с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку рта.

В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) по примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCDNA 3.1 SOD2 SEQ ID No:5, которая содержит модифицированную кДНК гена SOD2 (SEQ ID No:5), и плазмиду pCDNA 3.1(+), используемую в качестве плацебо, которая не содержит кДНК гена SOD2, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9.

Полученные биологически активную генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 1-2 мм. Объем вводимого раствора биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо - около 0,3 мл для каждого. Очаги введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 2-4 см друг от друга.

Активность супероксиддисмутазы-2 оценивали в лизатах биоптатов слизистой оболочки рта пациента непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, USA).

Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков слизистой оболочки рта в зоне введения биологически активной генно-терапевтической субстанции, а также из интактных участков и в зоне введения плацебо, используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL), далее по примеру 9.

Показано, что в слизистой оболочке рта пациента в области введения биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена SOD2, произошло увеличение активности супероксиддисмутазы-2, тогда как при введении плацебо активность супероксиддисмутазы-2 в слизистой оболочке рта не изменялась. Результаты отражены на фигуре 16.

Пример 15.

Введение в мышечную ткань человека биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена SOD2 с целью подтверждения при этом увеличения активности супероксиддисмутазы-2 в мышечной ткани человека.

С целью анализа изменения активности белка супероксиддисмутазы-2 пациентам вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена SOD2 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена SOD2 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань икроножной мышцы.

В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) по примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCMV6-Kan/Neo SOD2 SEQ ID No:6, которая содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:1, и плазмиду pCMV6-Kan/Neo, используемую в качестве плацебо, которая не содержит кДНК гена SOD2, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free.

Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9.

Полученные биологически активную генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 15-20 мм. Объем вводимого раствора биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо - около 0,5 мл для каждого. Очаги введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 5-7 см друг от друга

Активность супероксиддисмутазы-2 оценивали в лизатах биоптатов мышечной ткани пациента непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, USA).

Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани в зоне введения биологически активной генно-терапевтической субстанции, а также из интактных участков мышцы и в зоне введения плацебо, используя автоматическое устройство для взятия биопсии MAGNUM (компания BARD, USA), далее по примеру 9.

Показано, что, в мышечной ткани пациента в области введения биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена SOD2, произошло увеличение активности супероксиддисмутазы-2, тогда как при введении плацебо активность супероксиддисмутазы-2 в мышечной ткани не изменялась. Результаты отражены на фигуре 17.

Пример 16.

Введение группе различных пациентов биологически активных генно-терапевтическиих субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК SOD2.

С целью подтверждения индивидуального характера увеличения активности белка супероксиддисмутазы-2 до различного уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена SOD2 анализировали уровень активности белка супероксиддисмутазы-2 в лизате биоптатов кожи группы пациентов в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD2.

Последовательность нативной кДНК SOD2 приведена на фигуре 1, SEQ SOD2 ID No:1., последовательности модифицированных кДНК SOD2 приведены на фигурах 2-7 (SEQ SOD2 ID No:2, SEQ SOD2 ID No:3, SEQ SOD2 ID No:4, SEQ SOD2 ID No:5, SEQ SOD2 ID NO:6, SEQ SOD2 ID No:7).

При этом генетические конструкции, одна из которых содержит нативную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:1, вторая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:2, третья генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:3, четвертая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:4, пятая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:5, шестая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:6, седьмая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:7, восьмая генетическая конструкция (плацебо), представляет собой вектор pCMV6 XL5, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-дендример по примеру 7.

Полученные семь вариантов биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо использовали для введения в кожу пациентам. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора каждой биологически активной генно-терапевтической субстанции составлял около 0,3 мл. Очаги введения биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.

Каждому из 15-ти пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо в кожу предплечья.

Биопсийные образцы брали через 72 часа после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций. Взятие биопсии осуществляли из участков введения биологически активных генно-терапевтических субстанций, плацебо, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин.

А - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:1, содержащий немодифицированную кДНК SOD2 EQ ID No:1 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

В - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID NO:2, содержащий вариант 1 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:2 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

С - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:3, содержащий вариант 2 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:3 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

D - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:4, содержащая вариант 3 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:4 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

Е - - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:5, содержащая 4 вариант модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:5 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

F - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе на базе pCMV6- SEQ ID No:6, содержащая вариант 5 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:6.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

G - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:7, содержащий вариант 6 модифицированной кДНК SOD2 (SEQ ID No:7.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

Н - биоптат, полученный после введения векторной плазмиды PCMV6-XL5, не содержащая кДНК гена SOD2 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

Активность белка супероксиддисмутазы-2 определяли в девяти биоптатах кожи от каждого пациента (от А до Н и в биоптате интактной кожи) через 72 часа после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, USA). Анализ проводили по методике, рекомендуемой производителем. Предварительно проводили оценку степени ингибирования цветной реакции в зависимости от концентрации чистого препарата супероксиддисмутазы-2. Исходя из данных предыдущих экспериментов, описанных в примере 8, лизат разводили в 5 раз.

По итогам анализа уровня активности супероксиддисмутазы-2 выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности супероксиддисмутазы-2 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное ингибирование в лизате биоптата, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при введении немодифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошло 2 биоптата из 15.

В группе 2 максимальное ингибирование в лизате биоптата, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при введении 1 варианта модифицированной кДНК SOD2, В эту группу вошел 1 биоптат из 15.

В группе 3 максимальное ингибирование в лизате биоптата, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при введении 2 варианта модифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошел 1 биоптат из 15.

В группе 4 максимальное ингибирование в лизате биоптата, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при введении 3 варианта модифицированной кДНК SOD2, В эту группу вошел 1 биоптат из 15.

В группе 5 максимальное ингибирование в лизате биоптата, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при введении 4 варианта модифицированной кДНК SOD2, В эту группу вошли 4 биоптата из 15 (26,66% от общего количества).

В группе 6 максимальное ингибирование в лизате биоптата, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при введении 5 варианта модифицированной кДНК SOD2, В эту группу вошел 1 биоптат из 15.

В группе 7 максимальное ингибирование в лизате биоптата, что соответствует максимальной активности супероксиддисмутазы-2, наблюдалось при введении 6 варианта модифицированной кДНК SOD2. В эту группу вошло 5 биоптатов из 15.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное ингибирование цветной реакции, соответствующее максимальной активности супероксиддисмутазы-2, присутствует при введении плацебо - векторной плазмиды, не содержащей кДНК гена SOD2.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное ингибирование цветной реакции, соответствующее максимальной активности супероксиддисмутазы-2, присутствует при введении плацебо - векторной плазмиды, не содержащей кДНК гена SOD2.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена SOD2.

Из данного примера следует, что достижение максимальной активности белка супероксиддисмутазы-2 в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций носит индивидуальный характер и связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование биоптатов пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов на предмет максимальной эффективности терапевтического воздействия, созданных биологически активных генно-терапевтических субстанций в рамках линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.

Пример 17.

Трансфекция клеточной линии фибробластов пациента разными биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК SOD2 с целью персонализированного выбора из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции применительно к данному пациенту для последующей трансфекции этой субстанцией клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали активность супероксиддисмутазы-2 в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими нативную или модифицированные кДНК SOD2. Последовательность нативной кДНК SOD2 приведена на фигуре 1, SEQ ID No:1., последовательности модифицированных кДНК SOD2 приведены на фигуре 2-7 (SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID No:7).

Вырастили культуры фибробластов из биоптата пациента по примеру 5, отобрали аликвоты и провели клеточный лизис: клеточный осадок, соответствующий 2×10⁶ клеток, промывали фосфатным буфером и ресуспендировали во льду в лизирующем буфере, содержащем 25 мМ ХЕПЕС рН 7.9, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 10% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид. Лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин, концентрацию белка в супернатанте определяли методом Брэдфорда.

Активность супероксиддисмутазы-2 определяли непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, USA). Анализ проводили по методике, рекомендуемой производителем. Предварительно проводили оценку степени ингибирования цветной реакции в зависимости от концентрации чистого препарата супероксиддисмутазы-2.

Затем культуру фибробластов пациента разделили на 8 частей. Одну часть, обозначенную (А), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:1, содержащей немодифицированную к ДНК SOD2 SEQ ID No:1 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. Вторую часть, обозначенную (В), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:2, содержащей вариант 1 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:2 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 3-ю часть, обозначенную (С), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:3, содержащей вариант 2 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:3 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 4-ю часть, обозначенную (D), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:4, содержащей вариант 3 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:4 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 5-ю часть, обозначенную (Е), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:5, содержащей 4 вариант модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No5 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 6-ю часть, обозначенную (F), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:6, содержащей вариант 5 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:6 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 7-ю часть, обозначенную (G), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:7, содержащей вариант 6 модифицированной кДНКSOD2 SEQ ID No:7 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 8-ю часть, обозначенную (Н), трансфицировали по примеру 7 векторной плазмидой pCMV6-XL5, не содержащей кДНК SOD2 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.

Активность супероксиддисмутазы-2 определяли через 72 часа после трансфекции. Исходя из данных предыдущих экспериментов, описанных в примере 8, лизат разводили в 5 раз.

По итогам анализа активности супероксиддисмутазы-2 в культуре фибробластов пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой происходит максимальное ингибирование в лизате клеточной культуры и соответственно наблюдается максимальная активность супероксиддисмутазы-2. В данном эксперименте максимальное ингибирование в лизате отмечено при трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6 SOD2 SEQ ID No:5, содержащей модифицированную кДНК SOD2, что показано на фигуре 19.

Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.

Пример 18.

Введение в кожу пациента различных биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена SOD2 с целью персонализированного выбора из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции применительно к данному пациенту для последующего введения этой субстанции пациенту в рамках терапевтической процедуры.

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали активность супероксиддисмутазы-2 в лизатах биоптатов кожи этого пациента, после введения ему в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную или модифицированные кДНК гена SOD2. Последовательность нативной кДНК SOD2 приведена на фигуре 1, SEQ ID NO:1., последовательности модифицированных кДНК SOD2 приведены на фигуре 2-7 (SEQ ID NO:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:5, SEQ ID No:6, SEQ ID No:7)

Пациенту вводили 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо в кожу предплечья.

Первая биологически активная генно-терапевтическоая субстанция (А) на базе pCMV6- SEQ ID No:1, содержащая немодифицированную кДНК SOD2 SEQ ID No:1 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

Вторая биологически активная генно-терапевтическая субстанция (В) на базе pCMV6- SEQ ID No:2, содержащая вариант 1 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:2 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

3-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (C) на базе pCMV6- SEQ ID No:3, содержащая вариант 2 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:3 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

4-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (D) на базе pCMV6- SEQ ID No:4, содержащая вариант 3 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:4 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

5-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (E) на базе pCMV6- SEQ ID No:5, содержащая 4 вариант модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:5 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

6-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (F) на базе pCMV6- SEQ ID No:6, содержащая вариант 5 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:6 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

7-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (G) на базе pCMV6- SEQ ID No:7, содержащая вариант 6 модифицированной кДНК SOD2 SEQ ID No:7 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

8-я - векторная плазмида pCMV6-XL5, не содержащая кДНК SOD2 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.

При этом генетические конструкции, одна из которых содержит нативную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:1, вторая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:2, третья генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:3, четвертая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:4, пятая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:5, шестая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:6, седьмая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена SOD2 SEQ ID No:7, восьмая плазмида - плацебо, представляет собой вектор pCMV6 XL5, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-дендример по примеру 7.

Полученные семь вариантов биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора каждой биологически активной генно-терапевтической субстанции составлял около 0,3 мл. Очаги введения биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.

Биопсийные образцы брали через 72 часа после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций. Взятие биопсии осуществляли из участков введения биологически активных генно-терапевтических субстанций, плацебо, а также из интактной кожи используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин.

Активность супероксиддисмутазы-2 определяли в девяти биоптатах кожи пациента через 72 часа после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций непрямым колориметрическим методом с помощью набора SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, USA). Анализ проводили по методике, рекомендуемой производителем. Предварительно проводили оценку степени ингибирования цветной реакции в зависимости от концентрации чистого препарата супероксиддисмутазы-2. Исходя из данных предыдущих экспериментов, описанных в примере 8, лизат разводили в 5 раз.

По итогам анализа активности супероксиддисмутазы-2 в лизате биоптатов кожи пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при введении которой в кожу происходит максимальное ингибирование в лизате биоптата кожи и соответственно наблюдается максимальная активность супероксиддисмутазы-2. В данном эксперименте максимальное ингибирование в лизате биптатата кожи отмечено при введении биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6SOD2SEQ ID NO:6, содержащей модифицированную кДНК SOD2, что показано на фигуре 20.

Таким образом выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для ее последующего введения пациенту в рамках терапевтической процедуры.

Создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом вследствие недостаточной экспрессии гена SOD2, способ ее получения и использования.

Созданная линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций с использованием одной из модифицированных или нативной кДНК гена SOD2 позволяет на практике использовать входящие в линейку биологически активные генно-терапевтические субстанции для повышения до необходимого уровня активности белка супероксиддисмутазы-2 в различных клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека.

В результате проведения предварительных исследований биоптата пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов, определяют, какой вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции из созданной линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций необходимо выбрать для данного пациента для того, чтобы повысить активность белка супероксиддисмутазы-в клетках этих органов и тканей и/или органах и тканях до необходимого уровня применительно к конкретному пациенту. В тех случаях, когда использование биологически активной генно-терапевтической субстанции с нативной кДНК гена SOD2 не приводит к желаемому изменению уровня активности белка супероксиддисмутазы-2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях, необходимо применять субстанцию на основе модифицированной кДНК гена SOD2, приводящей к более эффективной экспрессии гена SOD2.

При использовании заявленной биологически активной генно-терапевтической субстанции не происходит встраивания экзогенного генетического материала в геном клетки.

Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций обеспечивает высокий уровень экспрессии гена SOD2, повышая активность белка супероксиддисмутазы-2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека в частности, в гемопоэтических клетках, или гепатоцитах, или мезенхимальных стволовых клетках, или хондробластах, или клетках поджелудочной железы (например, в клетках панкреатических островков), или миоцитах или фибробластах кожи, или кератоцитах, или эпителиальных клетках роговицы, или в нейронах, ганглиях, Шванновских клетках, астроцитах, олигодендроцитах, микроглии, или в сперматозоидах, или в нефронах, или эндотелиальных клетках, или эпителиальных клетках в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в коже, суставах, печени, надпочечниках, почках, головном и спинном мозге, легких, сердце, сосудах, желудочно-кишечном тракте, простате, поджелудочной железе, глазе, роговице, слизистой оболочке, хрящевой ткани, мышечной ткани в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека.

Таким образом, приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи, а именно, создание линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций, при использовании которых применительно к клеткам органов и тканей и/или органам и тканям человека компенсируются дефекты гена SOD2, влияющие на экспрессию этого гена или на уровень активности белка супероксиддисмутазы-2, кодируемого этим геном, а также компенсируется недостаточная активность белка супероксиддисмутазы-2, вызванная факторами, влияющими на экспрессию гена SOD2.

Повышение эффективности коррекции уровня активности белка супероксиддисмутазы-2 в клетках органов и тканей человека достигают за счет того, что при недостаточной активности этого белка вследствие дефекта гена SOD2 используют не белок, а генетическую конструкцию с кДНК гена SOD2, кодирующую этот белок. При введении генетических конструкций в отличие от введения непосредственно белка, как в прототипе, снижается требуемая частота их введения в связи с пролонгированным действием, а также облегчается внутриклеточная доставка.

Кроме того учитываются индивидуальные характеристики пациента.

Промышленная применимость.

Все приведенные примеры по созданию и использованию созданной линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций подтверждают ее промышленную применимость.

Перечень сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

мл - миллилитр, мкл - микролитр

л - литр

мкг - микрограмм

мг - миллиграмм

г - грамм

мкМ - микромоль

мМ - миллимоль

об/мин - обороты в минуту

нм - нанометр

см - сантиметр

мВт - милливатт

о.е. ф-относительная единица флуоресценции

БАГТС - биологически активная генно-терапевтическая субстанция

РВС - Фосфатно-солевой буфер

DMEM - двойная модификация среды Игла

Группа изобретений относится к медицине и касается средства для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, на основе гена SOD2, связанных с оксидативным стрессом, где клетки органов и тканей выбраны из клеток фибробластов, кератоцитов и эпителиальных клеток глаза, хондробластов; органы и ткани выбраны из кожи, слизистой оболочки рта человека или мышечной ткани человека, представляющего собой совокупность биологически активных генотерапевтических субстанций, каждая из которых представляет собой генно-терапевтическую субстанцию, выбранную из группы генно-терапевтических субстанций, при этом каждая представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, включающей кДНК гена SOD2, с кодирующей последовательностью белка супероксиддисмутазы-1, с делециями 5' и 3'-нетранслируемых областей, а именно полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена SOD2 SEQ ID No: 1, или модифицированной кДНК гена SOD2, при этом в качестве модифицированной кДНК гена SOD2 используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых содержит также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, органов и тканей человека, в сочетании с транспортной молекулой или без нее. Группа изобретений также касается способа получения указанного средства; способа использования указанного средства для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, на основе гена SOD2, связанных с количественным снижением белка SOD2. Группа изобретений обеспечивает высокий и стабильный уровень целевого белка в клетках. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 18 пр., 20 ил.

1. Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, на основе гена SOD2, связанных с оксидативным стрессом, где клетки органов и тканей выбраны из клеток фибробластов, кератоцитов и эпителиальных клеток глаза, хондробластов; органы и ткани выбраны из кожи, слизистой оболочки рта человека или мышечной ткани человека, представляющее собой совокупность биологически активных генотерапевтических субстанций, каждая из которых представляет собой генно-терапевтическую субстанцию, выбранную из группы генно-терапевтических субстанций, при этом каждая представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, включающей кДНК гена SOD2, с кодирующей последовательностью белка супероксиддисмутазы-1, с делециями 5' и 3'-нетранслируемых областей, а именно полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена SOD2 SEQ ID No: 1, или модифицированной кДНК гена SOD2, при этом в качестве модифицированной кДНК гена SOD2 используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых содержит также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена SOD2 и увеличить активность белка супероксиддисмутазы-1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в сочетании с транспортной молекулой или без нее.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что каждая из совокупности созданных генетических конструкций с кДНК гена SOD2 содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена SOD2, которая несет модификации, не затрагивающие структуру белка супероксиддисмутазы-1, а именно нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность.

3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что в каждой из совокупности созданных биологически активных генотерапевтических субстанций в качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры.

4. Способ получения средства по п. 1, заключающийся в том, что получают кДНК гена SOD2, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека, при этом используют кДНК гена SOD2 SEQ ID No: 1, или SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7.

5. Способ использования средства для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, на основе гена SOD2, связанных с количественным снижением белка SOD2 по п. 1, заключающийся в трансфекции выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в совокупности биологически активных генотерапевтических субстанций, в органы и ткани пациента аутологичных клеток пациента, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией, выбранной из совокупности созданных генно-терапевтических субстанций, и/или во введении в органы и ткани пациента генно-терапевтической субстанции или нескольких субстанций, выбранной/выбранных из группы созданных генно-терапевтических субстанций, или сочетанием обозначенных способов.