БИОСЕНСОР Российский патент 2018 года по МПК G01N27/327 G01N27/414 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к биосенсору.

Уровень техники

В последние годы в области биосенсоров были опубликованы технологии, которые позволяют неинвазивно использовать живые клетки для анализа (см., например, патентную литературу 1). Патентная литература 1 раскрывает биосенсор, имеющий структуру, в которой детектирующая поверхность, которая обнаруживает изменение физических свойств отрицательного заряда, покрыта фенилборнокислотными группами, которые связываются с сиаловой кислотой в образце (в самой клетке или в сахарной цепи, выделенной из клетки).

Список литературы

Патентная литература

Патентная литература 1: Выложенная в открытый доступ заявка на патент Японии №2010-107496.

Краткое раскрытие сущности изобретения

Техническая задача

Хотя в биосенсоре, описанном в вышеуказанной Патентной литературе 1, клетки и т.п. не подвергаются инвазии, нельзя сказать, что человеческий организм не подвергается инвазии при отборе клеток. Иными словами, желательно иметь биосенсор, который способен еще сильнее снизить нагрузку на человеческий организм, например биосенсор, который может обнаруживать детектируемое вещество по образцам слез, пота, слюны или т.п. В этой связи следует отметить, что в слезах и т.п., помимо глюкозы в качестве детектируемого вещества содержатся белки, такие как альбумин, и существует опасность, что белки понизят чувствительность измерения в виде шума.

Поэтому целью настоящего изобретения является получение биосенсора, который может проводить анализ на основе образца, неинвазивно отобранного из человеческого организма.

Решение поставленной технической задачи

Биосенсор по настоящему изобретению представляет собой биосенсор, содержащий вещество-идентификатор, которое связывается с детектируемым веществом, и электрод, заряженный зарядом вещества-идентификатора, при этом биосенсор содержит ингибитор, который подавляет присоединение недетектируемого вещества (т.е. вещества, не подлежащего детектированию) к по меньшей мере одному из вещества-идентификатора и электрода; вещество-идентификатор контактирует с электродом; ингибитор получен из полимерного соединения, имеющего более длинную молекулярную цепь, чем вещество-идентификатор; на поверхности электрода образуется самособирающийся монослой из вещества-идентификатора и ингибитора; и такой биосенсор обнаруживает изменение плотности заряда электрода, вызываемое связыванием детектируемого вещества с веществом-идентификатором.

В дополнение к этому, биосенсор по настоящему изобретению представляет собой биосенсор, содержащий вещество-идентификатор, которое связывается с детектируемым веществом, и электрод, заряженный зарядом вещества-идентификатора, при этом биосенсор содержит ингибитор, который подавляет присоединение недетектируемого вещества к по меньшей мере одному из вещества-идентификатора и электрода; биосенсор содержит тонкую пленку на электроде, образованную из вещества-идентификатора, и один или два либо более ингибиторных слоев, сформированных на тонкой пленке и содержащих ингибитор; и такой биосенсор обнаруживает изменение плотности заряда электрода, вызываемое связыванием детектируемого вещества с веществом-идентификатором.

Кроме того, биосенсор по настоящему изобретению представляет собой биосенсор, содержащий вещество-идентификатор, которое связывается с детектируемым веществом, и электрод, заряженный зарядом вещества-идентификатора, при этом биосенсор содержит ингибитор, который подавляет присоединение недетектируемого вещества к по меньшей мере одному из вещества-идентификатора и электрода; вещество-идентификатор связывается с ингибитором; и биосенсор обнаруживает изменение плотности заряда электрода, вызываемое связыванием детектируемого вещества с веществом-идентификатором.

Полезный эффект, достигаемый с использованием изобретения

Согласно настоящему изобретению связывание недетектируемого вещества с веществом-идентификатором или присоединение недетектируемого вещества к поверхности электрода может подавляться ингибитором, и благодаря этому чувствительность измерения может улучшиться. Таким образом, биосенсор может более надежно измерять концентрации глюкозы на основе образца, неинвазивно отобранного из человеческого организма.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает схематическое изображение общей конфигурации биосенсора согласно первому варианту осуществления изобретения.

Фиг. 2 показывает схематическое изображение конфигурации идентифицирующей части в биосенсоре согласно первому варианту осуществления изобретения.

Фиг. 3 является графиком, показывающим зависимость между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора в биосенсоре согласно первому варианту осуществления изобретения.

Фиг. 4 показывает схематическое изображение конфигурации идентифицирующей части в биосенсоре согласно второму варианту осуществления изобретения.

Фиг. 5 показывает схематическое изображение конфигурации идентифицирующей части в биосенсоре согласно модификации второго варианта осуществления изобретения.

Фиг. 6 показывает схематическое изображение, используемое для пояснения идентифицирующей части в биосенсоре согласно второму варианту осуществления изобретения.

Фиг. 7 является графиком, иллюстрирующим зависимость (1) между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора в биосенсоре согласно второму варианту осуществления изобретения.

Фиг. 8 является графиком, иллюстрирующим зависимость (2) между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора в биосенсоре согласно второму варианту осуществления изобретения.

Фиг. 9 является графиком, иллюстрирующим зависимость (3) между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора в биосенсоре согласно второму варианту осуществления изобретения.

Фиг. 10 является графиком, показывающим зависимость (4) между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора в биосенсоре согласно второму варианту осуществления изобретения.

Фиг. 11 показывает схематическое изображение конфигурации идентифицирующей части в биосенсоре согласно модификации третьего варианта осуществления изобретения.

Фиг. 12 является графиком, показывающим зависимость между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора в биосенсоре согласно третьему варианту осуществления изобретения.

Описание вариантов осуществления изобретения

Варианты осуществления настоящего изобретения подробно описываются ниже со ссылкой на чертежи.

1. Первый вариант осуществления изобретения

(1-1) Общая конфигурация

Биосенсор 10, показанный на фиг. 1, содержит идентифицирующую часть 12А и полевой транзистор (FET) 14 в качестве детектирующей части. Биосенсор 10 идентифицирует глюкозу, содержащуюся в образце, как детектируемое вещество в идентифицирующей части 12А и преобразует идентифицированную информацию в электрический сигнал в FET 14 для последующей детекции концентрации глюкозы в образце. В контексте настоящего изобретения примеры образцов могут включать неинвазивно полученные образцы, а именно образцы пота, слез и слюны, как биологических жидкостей, за исключением крови. В дополнение к глюкозе в этих образцах содержатся белки, такие как альбумин, т.е. недетектируемые вещества.

Идентифицирующая часть 12А включает электрод 16 и рецептор 20А на электроде 16. В случае данного варианта осуществления изобретения в идентифицирующей части 12А из части цилиндрической стенки на одной боковой поверхности электрода 16 формируется контейнер 18, и вещество-идентификатор и ингибитор содержатся в контейнере 18. Электрод 16 может быть изготовлен из Au (золота), но может также изготавливаться, например, из Ag (серебра) или Cu (меди). Рецептор 20А формируется из самособирающегося монослоя (Self-Assembled Monolayer или SAM), содержащего вещество-идентификатор и ингибитор. SAM обычно рассматривается как тонкая органическая пленка, в которой на поверхности раздела твердое тело/жидкость или на поверхности раздела твердое тело/газ органические молекулы спонтанно собираются вместе и спонтанно образуют монослой.

Функция вещества-идентификатора состоит в том, чтобы связываться с глюкозой, содержащейся в образце. В качестве вещества-идентификатора может применяться фенилборная кислота и, кроме того, например, ее производные (например, фенилборная кислота, содержащая винильную группу) и могут также использоваться глюкозосвязывающие белки (GBP) и их производные. Например, фенилборная кислота создает отрицательный заряд при связывании с глюкозой.

Ингибитор препятствует связыванию белка, такого как альбумин, т.е. недетектируемого вещества, с фенилборной кислотой или присоединению белка к поверхности электрода 16. В случае данного варианта осуществления изобретения ингибитор получают из полимерного соединения. В качестве полимерного соединения может использоваться олигоэтиленгликоль, имеющий более длинную молекулярную цепь, чем вещество-идентификатор; кроме того, может также использоваться, например, полиэтиленгликоль.

Как показано на фиг. 2, один конец каждого из вещества-идентификатора 38 и ингибитора 39 адсорбируется на одной боковой поверхности электрода 16 с образованием SAM. В вещество-идентификатор 38 и ингибитор 39 вводится тиольная группа (-SH) или дисульфидная группа (-S-S-) с образованием производных тиолов или дисульфидов. Эти производные тиолов или дисульфидов могут образовывать высокоплотную тонкую пленку на поверхности металла, такого как Au, Ag или Cu. Например, фенилборная кислота при введении в нее тиольной группы образует прочную связь, такую как Au-S. Вещество-идентификатор 38 связывается с глюкозой на другом конце. Ингибитор 39 специфически связывается с недетектируемым веществом на другом конце.

FET (полевой транзистор) 14 включает исток 24 и сток 26, сформированные на поверхности полупроводникового субстрата (подложки) 22, и изолирующую затвор пленку 28, сформированную на полупроводниковом субстрате (подложке) 22, истоке 24 и стоке 26 (фиг. 1). Для FET 14 могут использоваться как n-канальные, так и p-канальные МОП [металл-оксид-полупроводник]-структуры (англ. MOS). Металлический электрод 30 формируется на изолирующей затвор пленке 28. Металлический электрод 30 электрически соединяется с электродом 16 электропроводом 31. Металлический электрод 30 может быть сформирован из Au, Ag, Cu и т.п.

Полупроводниковый субстрат (подложка) 22 может быть изготовлена из Si (кремния), Ga (галлия), As (мышьяка), ITO (оксида индия-олова), IGZO (оксида индия-галлия-цинка), IZO (оксида индия-цинка) и т.п., либо для этой цели может использоваться органический полупроводник, углеродный полупроводник (например, углеродные нанотрубки, графеновый полупроводник или алмазный полупроводник) или т.п. Изолирующая затвор пленка 28 может быть образована из оксида или нитрида, такого как SiO₂ (диоксид кремния), Si₃N₄(SiN_x) (аморфный нитрид кремния), Ta₂O₅ (оксид тантала) или Al₂O₃ (оксид алюминия).

Источник питания 34 и амперметр 36 электрически соединены с истоком 24 и стоком 26, и поэтому ток стока, перетекающий из истока 24 в сток 26, может быть измерен. При изменении плотности заряда на изолирующей затвор пленке 28 изменяется и величина тока стока. Иными словами, для поддержания тока стока на постоянном уровне при изменении плотности заряда на изолирующей затвор пленке 28 необходимо изменить напряжение затвора. Путем измерения изменения напряжения затвора полевого транзистора FET 14 электрически измеряется и изменение плотности заряда на изолирующей затвор пленке 28.

В то же время, может использоваться электрод сравнения 32, как показано на вышеуказанной фигуре. Электрод сравнения 32 - это электрод 16, который имеет потенциал сравнения в FET 14 и электрически соединен с веществом-идентификатором 38 в идентифицирующей части 12А биосенсора.

(1-2) Способ изготовления

Идентифицирующая часть 12А, показанная на фиг. 2, может быть изготовлена следующим способом. Сначала на стеклянный субстрат (подложку) с помощью напылительного аппарата поочередно наносятся Cr (хром) и Au для формирования электрода 16. Затем часть цилиндрической стенки из стекла закрепляется на электроде 16 с помощью эпоксидной смолы с последующей обработкой путем промывки смешанным раствором серной кислоты и пероксида водорода и дополнительной промывкой сначала чистой водой, затем этанолом.

После этого в контейнер 18 заливается смешанная жидкость, полученная смешиванием (в соотношении 9:1) этанолового растворителя, содержащего 1 мМ олигоэтиленгликоля (гидрокси-EG₆-ундекантиол), с этаноловым растворителем, содержащим 1 мМ 4-меркаптофенилборной кислоты. Поддержание этого состояния в течение заданного периода времени приводит к хемосорбции олигоэтиленгликоля и фенилборной кислоты на поверхности электрода 16 и формированию самособирающегося монослоя. В конце концов смешанная жидкость удаляется, после чего проводится промывка сначала этанолом, затем чистой водой. Идентифицирующая часть 12А может быть изготовлена данным способом.

(1-3) Действие и эффект

В биосенсоре 10, сформированном, как описано выше, сначала в идентифицирующую часть 12А добавляется образец (фиг. 2). Глюкоза 40, содержащаяся в образце, достигает нижней части рецептора 20А и связывается с веществом-идентификатором 38. При этом вещество-идентификатор 38 создает отрицательный заряд. Поверхность электрода 16 заряжается отрицательным зарядом. С другой стороны, белок 42, такой как альбумин, содержащийся в образце, связывается с ингибитором 39, и последний препятствует достижению белком нижней части рецептора 20А, т.е. вещества-идентификатора 38, или поверхности электрода 16.

Электрод 16 электрически соединен с металлическим электродом 30 полевого транзистора (FET) 14 и, следовательно, если поверхность электрода 16 заряжается отрицательным зарядом, то плотность заряда на изолирующей затвор пленке 28 изменяется. Измеряется изменение напряжения затвора, сопровождающее изменение плотности заряда на изолирующей затвор пленке 28 полевого транзистора (FET) 14. Таким образом, биосенсор 10 может детектировать концентрацию глюкозы, содержащейся в образце.

В этой связи, необходимо отметить, что белок 42 несет отрицательный заряд и, следовательно, увеличивает отрицательный заряд, которым заряжена поверхность электрода 16, связываясь с веществом-идентификатором 38 или присоединяясь к поверхности электрода 16. Вследствие этого в традиционных биосенсорах возникает проблема значительного снижения чувствительности измерения.

В случае данного варианта осуществления изобретения в биосенсоре 10 достижению белком 42 вещества-идентификатора 38 или поверхности электрода 16 препятствует ингибитор 39, содержащийся в рецепторе 20А. Соответственно, в биосенсоре 10 связывание белка 42 с веществом-идентификатором 38 или присоединение белка к поверхности электрода 16 может подавляться, и, следовательно, может подавляться заряд электрода 16 излишним отрицательным зарядом. Таким образом, в биосенсоре 10 чувствительность измерения может улучшиться, и, следовательно, концентрация глюкозы в образце, неинвазивно отобранном из человеческого организма, может измеряться более надежно.

(1-4) Зависимость между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора

Далее, биосенсор, содержащий идентифицирующую часть, показанную на фиг. 2, был изготовлен способом, описанным выше в разделе "(1-2) Способ изготовления". В идентифицирующей части в качестве вещества-идентификатора использовалась фенилборная кислота, в качестве ингибитора - олигоэтиленгликоль. Затем в идентифицирующую часть помещался образец, содержащий альбумин, и измерялось изменение напряжения затвора полевого транзистора по мере постепенного изменения концентрации глюкозы.

В качестве образца использовался забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), имеющий pH 7,4 и содержащий 4 г/л альбумина, и глюкоза добавлялась в него поэтапно в количестве от 100 мкМ до 10 мМ для постепенного увеличения концентрации глюкозы. Результаты показаны на фиг. 3.

На фиг. 3 вертикальная ось показывает изменение напряжения затвора (мВ), а горизонтальная ось показывает логарифм (log) концентрации глюкозы. Коэффициент корреляции составил 0,992, наклон кривой составил 19,761, и было подтверждено, что между логарифмом концентрации глюкозы и изменением напряжения затвора существует линейная зависимость. Другими словами, можно сказать, что на биосенсор не влияет шум в виде белка и поэтому количественное изменение напряжения затвора увеличивается в соответствии с концентрацией глюкозы. Вышеуказанные результаты подтвердили, что за счет использования рецептора, сформированного из монослоя, содержащего вещество-идентификатор и ингибитор, подавляется увеличение отрицательного заряда, вызываемое присутствием белка.

2. Второй вариант осуществления изобретения

Идентифицирующая часть 12В согласно второму варианту описывается ниже со ссылкой на фиг. 4, на которой цифровые обозначения частей прибора соответствуют их цифровым обозначениям на фиг. 2. Идентифицирующая часть 12В согласно этому варианту отличается от идентифицирующей части в вышеописанном первом варианте тем, что вещество-идентификатор 38 не закрепляется на одной боковой поверхности электрода 16.

(2-1) Конфигурация идентифицирующей части

Рецептор 20В, содержащийся в идентифицирующей части 12В, формируется из сополимера, в котором вещество-идентификатор 38 связано с ингибитором 41. В случае данного варианта осуществления изобретения рецептор 20В содержит также ускоритель разложения и сшивающий агент.

Ингибитор 41 формируется из гидрофильного полимера. Гидрофильный полимер - это полимер, содержащий гидрофильную функциональную группу (гидроксильную группу или карбоксильную группу) и представляющий собой гидрогель, бумагу, суперабсорбирующий полимер (SAP) или т.п. В случае данного варианта в качестве ингибитора 41 используется гидрогель.

Гидрогель - это гелеобразный материал, в котором гидрофильные полимерные цепи сшиты поперечными связями, что способствует удерживанию большого количества воды. Данный материал отлично впитывает воду. Примеры гидрогелей включают полигидроксиэтилметакрилат (поли-НЕМА, обозначаемый также как поли-2-гидроксиэтилметакрилат), поливинилпирролидон (PVP) и поливиниловый спирт (PVA). Поли-НЕМА может быть гомополимером гидроксиэтилметакрилата (НЕМА) или сополимером с другим мономером (например, 2,3-дигидроксипропилметакрилат или глицеролметакрилат (GMA)). Поли-НЕМА, если он является сополимером, имеет тенденцию к повышенному содержанию воды. Помимо этого, PVP может быть гомополимером N-винил-2-пирролидона (NVP) или сополимером, полученным с использованием NVP в качестве главного компонента и добавлением НЕМА, метилметакрилата (MMA) или т.п. и сшивающего агента для полимеризации.

Бумага изготавливается путем склеивания растительных волокон или других волокон. Растительные волокна состоят из целлюлозы, гемицеллюлозы или лигнина. Целлюлоза обладает свойством, которое проявляется в том, что большое число гидроксильных групп в ней связаны вместе водородными связями, благодаря чему растительные волокна, составляющие бумагу, склеиваются друг с другом. Примеры других волокон включают минералы, металлы и синтетические смолы в форме волокон. С точки зрения более прочного закрепления вещества-идентификатора 38 предпочтительна бумага, изготовленная из растительных волокон (целлюлозы).

SAP (суперабсорбирующий полимер) - это полимер, который способен абсорбировать и удерживать воду в количестве, превышающем его собственную массу в от нескольких сотен до нескольких тысяч раз. В качестве SAP могут использоваться полимеры акриловой кислоты. Полимеры акриловой кислоты содержат большое число карбоксильных групп и поэтому обладают высокой гидрофильностью и образуют гели, показывающие высокую способность впитывать воду при последующей сшивке в тонкие структуры и получении в форме натриевых солей.

Примеры других гидрофильных полимеров могут включать производные целлюлозы, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (CMC-Na) и гидроксиэтилцеллюлоза (НЕС); полисахариды, такие как альгиновая кислота, гиалуроновая кислота, агароза, крахмал, декстран и пуллулан и их производные; гомополимеры, такие как карбоксивинилполимеры, полиэтиленоксид, поли(мет)акриламид и поли(мет)акриловая кислота, сополимеры гомополимеров с полисахаридами или т.п. и сополимеры мономеров, составляющих гомополимеры, и других мономеров; белки, такие как коллаген и желатин и их производные; полисахариды и мукополисахариды, такие как гликозаминогликаны, например, гепарин, гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, дерматансульфат, декстрансульфат, кератансульфат и гепаринсульфат, хитин и хитозан.

Помимо этого, могут использоваться такие гидрофильные полимеры, как 1-винил-2-пирролидинон, сложный 2-метиловый эфир пропеновой кислоты, монометакрилоилоксиэтилфталат, аммония сульфатоэтилметакрилат, N-винилпирролидон, N,N-диметилакриламид и 2-(метакрилоилоксиэтил)-2-(триметиламмониоэтил)фосфат.

Вышеперечисленные гидрофильные полимеры могут использоваться по отдельности или в комбинации из двух или более видов.

В качестве инициатора полимеризации может использоваться предварительно выбранный известный ускоритель радикальной полимеризации. Предпочтительно использовать такой инициатор, который обладает растворимостью или диспергируемостью в воде и который равномерно распределяется по всей системе. В частности, в качестве инициатора полимеризации в дополнение к водорастворимым пероксидам могут использоваться, например, пероксодисульфат калия и пероксодисульфат аммония и водорастворимые азосоединения, например, VA-044, V-50 и V-501 (изготовитель - Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), смесь из Fe²⁺ и пероксида водорода и т.п.

В качестве сшивающего агента может использоваться N,N'-метилен-бис-акриламид, этиленгликольдиметакрилат, винилметакрилат и т.п.

(2-2) Способ изготовления

Идентифицирующая часть 12В, показанная на фиг. 4, может быть изготовлена следующим способом. Сначала готовятся 0,15 г 4-винилфенилборной кислоты, 1,0 г гидроксиэтилметакрилата, 0,5 г N-(3-диметиламинопропил)метакриламида и 0,05 г N,N'-метилен-бис-акриламида в качестве сшивающего агента и 6,0 г 6,7 мас. % водного раствора акрилата натрия (рН 7,3), и смесь доводится до общего количества 10 г добавлением ультрачистой воды. Все компоненты перемешиваются до полного растворения в контейнере 18. Затем добавляются 25 мкл тетраметилэтилендиамина и 7,5 мг пероксодисульфата калия в качестве инициаторов полимеризации для инициирования полимеризации. Это состояние поддерживается в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании реакции полимеризации раствор, содержащий образовавшийся сополимер, погружается в ультрачистую воду для удаления не прореагировавших компонентов, и в результате можно получить рецептор 20В, в котором сополимеризовались вещество-идентификатор 38 и ингибитор 41. Идентифицирующая часть 12В может быть изготовлена данным способом.

(2-3) Действие и эффект

В идентифицирующей части 12В, изготовленной, как описано выше, гидрофильный полимер (ингибитор) содержит адсорбированные вокруг него молекулы воды и показывает высокое сродство к растворителю. Следовательно, глюкоза входит в контакт с гидрофильным полимером через молекулы воды и растворяется в растворителе, не адсорбируясь. Соответственно, глюкоза, содержащаяся в образце, связывается с фенилборной кислотой в рецепторе 20В, при этом создается отрицательный заряд, и электрод 16 заряжается отрицательным зарядом. Таким образом, в идентифицирующей части 12В может быть получен эффект, подобный эффекту в вышеописанном первом варианте осуществления изобретения.

Помимо этого, в рецепторе 20В согласно данному варианту вещество-идентификатор 38 связывается с ингибитором 41, сформированным из гидрофильного полимера, с образованием сополимера. Гидрофильный полимер содержит адсорбированные вокруг него молекулы воды и показывает высокое сродство к растворителю. Поэтому белок входит в контакт с гидрофильным полимером через молекулы воды и растворяется в растворителе, не адсорбируясь. Следовательно, в идентифицирующей части 12В связывание белка, содержащегося в образце, с веществом-идентификатором 38 или присоединение белка к поверхности электрода 16 подавляется ингибитором 41, и благодаря этому чувствительность измерения может улучшиться. Таким образом, биосенсор может более надежно измерять концентрацию глюкозы в образце, неинвазивно отобранном из человеческого организма.

Ингибитор 41 может иметь молекулярную матрицу, имеющую такую же структуру, что и молекулярная структура глюкозы (не показана). Ингибитор 41, имеющий такую молекулярную матрицу, может избирательно "вбирать в себя" глюкозу, содержащуюся в образце, в результате чего чувствительность измерения также может улучшиться.

(2-4) Модификация

Идентифицирующая часть 12С в соответствии с модификацией второго варианта осуществления изобретения описывается ниже со ссылкой на фиг. 5, на которой цифровые обозначения частей соответствуют цифровым обозначениям на фиг. 4. Идентифицирующая часть 12С согласно этому варианту отличается от идентифицирующей части в вышеописанном втором варианте тем, что вещество-идентификатор 38 удерживается на несущей подложке 44.

Рецептор 20С включает несущую подложку 44, вещество-идентификатор 38, удерживаемое на несущей подложке 44, и ингибитор 41, и формируется из сополимера, в котором вещество-идентификатор 38 связано с ингибитором 41.

В качестве несущей подложки 44 могут использоваться проводящие частицы и непроводящие частицы. В качестве проводящих частиц могут использоваться металлические частицы, например, частицы Au, Pt, Ag, Cu и т.п., и неметаллические частицы, например, частицы оксида индия-олова (ITO), проводящие полимеры и т.п. В качестве непроводящих частиц могут использоваться, например, частицы SiO₂ и т.п. Например, при введении тиоловой группы (-SH) или дисульфидной группы (-S-S-) в фенилборную кислоту в качестве вещества-идентификатора с целью получения производных тиола или дисульфида фенилборная кислота может наноситься на поверхность Au-частиц.

Далее описывается способ изготовления рецептора 20С. В частности, сначала смешиваются 9 мл раствора наноколлоидного золота (диаметром 5 нм,) и 1 мл 10 мМ раствора 4-меркаптофенилборной кислоты (изготовитель - Sigma-Aldrich Corporation)/этанола, и полученная смесь выстаивается при 25°С в течение 24 часов для получения раствора фенилборной кислоты/наночастиц золота. Затем смешиваются 1,0 г гидроксиэтилметакрилата (НЕМА), 5 г вышеуказанного раствора фенилборной кислоты/наночастиц золота, 0,5 г N-3-(диметиламино)пропилметакриламида, 3 г 6,7 мас. % водного раствора акрилата натрия (pH 7,3) и 0,05 г N,N'-метилен-бис-акриламида, и смесь доводится ультрачистой водой до общего количества 10 г. После этого добавляются 5 мг пероксодисульфата калия и 5 мкл тетраметилендиамина в качестве инициаторов полимеризации, чтобы инициировать полимеризацию. Это состояние поддерживается в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании реакции полимеризации раствор, содержащий образовавшийся сополимер, погружается в ультрачистую воду для удаления не прореагировавших компонентов, в результате чего можно получить рецептор 20С, в котором сополимеризованы вещество-идентификатор 38 и ингибитор 41. Идентифицирующая часть 12С может быть изготовлена данным способом.

Как показано на фиг. 6, некоторое количество вещества-идентификатора 38, нанесенного на несущую подложку 44, связывается с ингибитором 41 (цифровое обозначение 45 на фигуре) с образованием сополимера. Оставшаяся часть вещества-идентификатора 38, нанесенного на несущую подложку 44, связывается с глюкозой 40, содержащейся в образце. Глюкоза 40, содержащаяся в образце, связывается с веществом-идентификатором 38, вследствие чего создается отрицательный заряд, и электрод 16 заряжается отрицательным зарядом. Следовательно, может быть получен эффект, подобный эффекту в вышеописанном первом варианте осуществления изобретения.

Кроме того, в идентифицирующей части 12С, в соответствии с данной модификацией, вещество-идентификатор 38 связывается с ингибитором 41, полученным из гидрофильного полимера, с образованием сополимера, и, следовательно, ингибитор может препятствовать связыванию белка, содержащегося в образце, с веществом-идентификатором 38 или присоединению белка к поверхности электрода 16. Таким образом, и в идентифицирующей части 12С согласно указанной модификации может достигаться эффект, подобный эффекту в вышеописанном втором варианте осуществления изобретения.

Далее, в идентифицирующей части 12С, согласно указанной модификации, вещество-идентификатор 38 удерживается на несущей подложке 44, и поэтому вещество-идентификатор 38 также может легко закрепляться, особенно на бумаге.

Зависимость между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора

Биосенсор, содержащий идентифицирующую часть, показанную на фиг. 4, изготовлен способом, описанным выше в "(2-2) Способ изготовления". В качестве образца использовался забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), имеющий рН 7,4 и содержащий 4 г/л альбумина; к этому раствору поэтапно добавлялась глюкоза в количестве от 50 мкМ до 1,25 мМ для постепенного увеличения концентрации глюкозы. Результаты представлены на фиг. 7.

Из фиг. 7 очевидно, что коэффициент корреляции составил 0,9959, наклон кривой составил 6,438, и было подтверждено, что между логарифмом концентрации глюкозы и изменением напряжения затвора существует линейная зависимость. Эти результаты подтвердили, что при использовании сополимера, в котором вещество-идентификатор связано с ингибитором, полученным из гидрофильного полимера, подавляется увеличение отрицательного заряда, вызванное присутствием белка.

Далее, биосенсор, содержащий идентифицирующую часть, показанную на фиг. 5, был изготовлен способом, описанным выше в разделе "(2-4) Модификация". В качестве ингибитора в этом случае использовался гидроксиэтилметакрилат. В качестве образца использовался забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), имеющий рН 7,4 и содержащий 4 г/л альбумина; к этому раствору поэтапно добавлялась глюкоза в количестве от 50 мкМ до 1,25 мМ для постепенного увеличения концентрации глюкозы. Результаты представлены на фиг. 8.

Из фиг. 8 очевидно, что коэффициент корреляции составил 0,9959, наклон кривой составил 6,438, и были получены по существу такие же результаты, что и на фиг. 7. Эти результаты подтвердили, что, даже если используется сополимер, в котором вещество-идентификатор, удерживаемое на несущей подложке, связано с ингибитором, полученным из гидрофильного полимера, то увеличение отрицательного заряда, вызванное присутствием белка, удается подавить.

Далее, биосенсор, в котором ингибитор заменен на целлюлозу в идентифицирующей части, показанной на фиг. 5, был изготовлен способом, описанным ниже. В частности, сначала смешивались 9 мл раствора наноколлоидного золота (диаметр 5 нм) и 1 мл 10 мМ раствора 4-меркаптофенилборной кислоты (изготовитель - Sigma-Aldrich Corporation)/этанола, и полученная смесь выстаивалась при 25°С в течение 24 часов до образования раствора фенилборной кислоты/наночастиц золота. Затем 500 мкл вышеназванного раствора фенилборной кислоты/наночастиц золота по каплям наносились на безворсовую салфетку (для очистки оптики) KimWipes (зарегистрированный товарный знак), разрезанную на куски длиной 40 мм и шириной 10 мм, и высушивались при 60°С. После сушки салфетка KimWipes (зарегистрированный товарный знак) приклеивалась к части электрода затвора с помощью полидиметилсилоксанового раствора (изготовитель - Dow Corning Toray Co., Ltd.) для получения элемента, идентифицирующего молекулы, в котором были смешаны бумага и раствор фенилборной кислоты/наночастиц золота.

В качестве образца использовался забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), имеющий рН 7,4 и содержащий 4 г/л альбумина, к которому поэтапно добавлялась глюкоза в количестве от 10 мкМ до 2 мМ для постепенного увеличения концентрации глюкозы. Результаты представлены на фиг. 9.

Из фиг. 9 очевидно, что коэффициент корреляции составил 0,9846, наклон кривой составил 20,123, и было подтверждено, что между логарифмом концентрации глюкозы и изменением напряжения затвора существует линейная зависимость. Вышеприведенные результаты подтвердили, что, даже если вещество-идентификатор, удерживаемое на несущей подложке, скрепляется с ингибитором, полученным из целлюлозы, то увеличение отрицательного заряда, вызванное присутствием белка, удается подавить.

Помимо этого, был изготовлен биосенсор, в котором в ингибиторе в идентифицирующей части, показанной на фиг. 4, была сформирована молекулярная матрица; способ изготовления описан ниже. Сначала смешивались 0,2 г гидроксиэтилметакрилата (НЕМА), 0,1 г N-3-(диметиламино)пропилметакриламида, 0,01 г винилфенилборной кислоты, 0,02 г N,N'-метилен-бис-акриламида, 300 мкл 6,7 мас. % раствора акрилата натрия (рН 7,3) и 0,009 г глюкозы; полученная смесь доводилась до общего количества 1 г добавлением 100 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 10,0) и растворялась; затем добавлялись 10 мкл пероксосульфата калия (50 мг/мл (от Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и 2 мкл тетраметилендиамина (от TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.) в качестве инициаторов полимеризации для приготовления мономерного раствора.

Затем 15 мкл мономерного раствора наносились по каплям на электрод (квадрат со стороной 5 мм), изготовленный из золота, покрытого PET (полиэтилентерефталат)-пленкой, и подвергались реакции полимеризации в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 12 часов с образованием гидрогеля на электроде. По окончании реакции полимеризации электрод затвора погружался на всю ночь в 0,1 М раствор соляной кислоты/метанола для удаления мономерных компонентов и глюкозы с образованием рецептора, в котором вещество-идентификатор и ингибитор сополимеризованы. Таким способом был изготовлен биосенсор согласно варианту осуществления изобретения, в котором поверхность электрода покрыта рецептором.

Для сравнения такой же рецептор, как выше, был сформирован на площади квадрата со стороной 5 мм на электроде (квадрат со стороной 10 мм), изготовленном из золота, чтобы получить биосенсор, в котором только часть электрода оставалась незащищенной.

1500 мкл 100 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 9,0) наносились по каплям на рецептор изготовленного биосенсора, и напряжение затвора в 1 В и ток истока-стока 700 мкА поддерживались постоянными с помощью устройства для измерения напряжения FET в режиме реального времени. В этом состоянии измерялось изменение поверхностного потенциала электрода затвора после добавления к рецептору 15 мкл 1 М раствора глюкозы и 15 мкл раствора альбумина (100 мг/мл).

Результаты представлены на фиг. 10. На фиг. 10 вертикальная ось показывает напряжение затвора (В), горизонтальная ось - время (секунд). На этой фигуре сплошная линия соответствует результатам биосенсора согласно вышеописанному варианту осуществления изобретения, а пунктирная линия показывает результаты биосенсора, изготовленного для сравнения.

Из этой фигуры очевидно, что в биосенсоре согласно данному варианту осуществления изобретения поверхностный потенциал затвора при добавлении 10 мМ глюкозы изменился в отрицательном направлении. Этот результат подтвердил, что в биосенсоре согласно этому варианту был получен отклик на глюкозу. Кроме того, в биосенсоре согласно этому варианту поверхностный потенциал затвора не изменился даже при добавлении альбумина. Это подтвердило, что в биосенсоре согласно данному варианту ингибитор подавляет увеличение отрицательного заряда, вызываемое присутствием белка. С другой стороны, в биосенсоре, изготовленном для сравнения, поверхностный потенциал затвора изменился при добавлении альбумина. Это, вероятно, объясняется тем фактом, что альбумин связывается с электродом.

3. Третий вариант осуществления изобретения

Идентифицирующая часть 12D согласно третьему варианту осуществления изобретения описывается ниже со ссылкой на фиг. 11, на которой цифровые обозначения отдельных деталей соответствуют цифровым обозначениям на фиг. 2. Идентифицирующая часть 12D согласно этому варианту отличается от идентифицирующей части согласно вышеописанному первому варианту тем, что ингибитор формируется на веществе-идентификаторе 38 в виде слоя.

Рецептор 20D содержит тонкую пленку 46, образовавшуюся из вещества-идентификатора 38 и ингибиторного слоя 47, сформированного на тонкой пленке 46 и состоящего из ингибитора.

Тонкая пленка 46 представляет собой самособирающийся слой (SAM), образовавшийся в результате адсорбции одного конца вещества-идентификатора 38 на одной боковой поверхности электрода 16. Ингибиторный слой 47 формируется из гидрофильного полимера, включающего гидрогель, SAP (суперабсорбирующий полимер) или т.п. В случае этого варианта осуществления изобретения ингибиторный слой 47 формируется из гидроксиэтилметакрилата.

Тонкая пленка 46 может быть получена путем формирования самособирающегося монослоя, как в способе, описанном в разделе "(1-2) Способ изготовления" в вышеприведенном первом варианте осуществления изобретения. В частности, золотой субстрат погружается в 1 мМ раствор 4-меркаптофенилборной кислоты (изготовитель - Sigma-Aldrich Corporation)/этанола при 25°С на 24 часа для образования самособирающегося монослоя.

Ингибиторный слой 47 образуется следующим способом. Смешиваются 1,0 г гидроксиэтилметакрилата (НЕМА), 0,5 г N-3-(диметиламино)пропилметакриламида, 6 г 6,7 мас. % водного раствора акрилата натрия (рН 7,3) и 0,05 г N,N'-метилен-бис-акриламида, и полученная смесь доводится до общего количества 10 г добавлением ультрачистой воды. Затем добавляются 5 мг пероксодисульфата калия и 5 мкл тетраметилендиамина в качестве инициаторов полимеризации для инициирования полимеризации. Это состояние поддерживается в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании реакции полимеризации раствор, содержащий образовавшийся сополимер, погружается в ультрачистую воду для удаления не прореагировавших компонентов, в результате чего может быть получен ингибиторный слой 47.

В заключение ингибиторный слой 47, сформированный из гидроксиэтилметакрилата, накладывается на тонкую пленку, образованную из вещества-идентификатора 38, и таким путем можно изготовить идентифицирующую часть 12D.

В идентифицирующей части 12D, изготовленной, как описано выше, гидрофильный полимер (ингибитор) содержит адсорбированные вокруг него молекулы воды и показывает высокое сродство к растворителю. Поэтому глюкоза 40 входит в контакт с гидрофильным полимером через молекулы воды и растворяется в растворителе, не адсорбируясь. Соответственно, глюкоза 40 связывается с веществом-идентификатором 38, создается отрицательный заряд и электрод 16 заряжается отрицательным зарядом. Следовательно, в идентифицирующей части 12D может быть получен эффект, подобный эффекту в вышеописанном первом варианте осуществления изобретения.

К тому же, в рецепторе 20D согласно данному варианту тонкая пленка 46 вещества-идентификатора 38, образовавшаяся на электроде 16, покрывается ингибиторным слоем 47. Гидрофильный полимер, образующий ингибиторный слой 47, содержит адсорбированные вокруг него молекулы воды и показывает высокое сродство к растворителю. Соответственно белок входит в контакт с гидрофильным полимером через молекулы воды и растворяется в растворителе, не адсорбируясь. Таким образом, в идентифицирующей части 12D связывание белка 42, содержащегося в образце, с веществом-идентификатором 38 или присоединение белка к поверхности электрода 16 подавляется ингибиторным слоем 47, в результате чего чувствительность измерения также может улучшиться. Следовательно, биосенсор может более надежно измерять концентрацию глюкозы в образце, неинвазивно отобранном из человеческого организма.

(Модификация)

В вышеописанном третьем варианте осуществления изобретения описан случай, когда число ингибиторных слоев составляет один, но настоящее изобретение не ограничивается этим случаем, и могут быть сформированы два или более ингибиторных слоев из гидрофильных полимеров с разной молекулярной массой.

(Зависимость между концентрацией глюкозы и изменением напряжения затвора)

Далее, биосенсор, содержащий идентифицирующую часть, показанную на фиг. 11, был изготовлен вышеописанным способом. В качестве образца использовался забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), имеющий pH of 7,4 и содержащий 4 г/л альбумина, и к нему поэтапно добавлялась глюкоза в количестве от 10 мкМ до 2 мМ для постепенного увеличения концентрации глюкозы. Результаты показаны на фиг. 12.

На фиг. 12 очевидно, что коэффициент корреляции составил 0,9877, наклон кривой составил 25,94, и было подтверждено, что между логарифмом концентрации глюкозы и изменением напряжения затвора наблюдается линейная зависимость. Вышеприведенные результаты подтвердили, что при наложении ингибитора, полученного из гидрофильного полимера, в виде слоя на тонкую пленку, образованную из вещества-идентификатора, подавляется увеличение отрицательного заряда, вызываемое присутствием белка.

4. Модификации

Настоящее изобретение не ограничивается вышеописанными вариантами осуществления, и в пределах духа настоящего изобретения могут вноситься соответствующие изменения. Например, среди раскрытых выше вариантов описан случай, когда детектирующая часть биосенсора представляет собой FET (полевой транзистор), но настоящее изобретение не ограничивается только этим вариантом, и могут также использоваться светопринимающие элементы, такие как фотодиоды и фотоумножители, термисторы, кварцевые микровесы (QCM), элементы, использующие поверхностный плазмонный резонанс, и т.п.

Кроме того, описан случай, когда идентифицирующая часть и детектирующая часть биосенсора электрически соединены электропроводом, но настоящее изобретение не ограничивается этим случаем, идентифицирующая часть и детектирующая часть биосенсора могут быть одним целым. Иными словами, электрод может быть сформирован прямо на пленке, изолирующей затвор полевого транзистора (FET), как детектирующая часть биосенсора.

Перечень цифровых обозначений

10 биосенсор

12A, 12В, 12С, 12D идентифицирующая часть прибора

14 FET (детектирующая часть)

16 электрод

28 изолирующая затвор пленка

30 металлический электрод

31 электропровод

38 вещество-идентификатор

39, 41 ингибитор

40 глюкоза (детектируемое вещество)

42 белок (недетектируемое вещество)

44 несущая подложка

46 тонкая пленка

47 ингибиторный слой.

Изобретение может быть использовано для осуществления анализа образца, неинвазивно отобранного из человеческого организма. Биосенсор согласно изобретению содержит вещество-идентификатор, которое связывается с детектируемым веществом, электрод, заряженный зарядом вещества-идентификатора, биосенсор также содержит ингибитор, который подавляет присоединение недетектируемого вещества к по меньшей мере одному из вещества-идентификатора и электрода; причем вещество-идентификатор контактирует с электродом; ингибитор получен из полимерного соединения, содержащего более длинную молекулярную цепь, чем вещество-идентификатор; а на поверхности электрода образуется самособирающийся монослой из вещества-идентификатора и ингибитора; и биосенсор способен детектировать изменение плотности заряда электрода, вызванное связыванием детектируемого вещества с веществом-идентификатором. Также предложены еще два варианта бирсенсора. Изобретение обеспечивает возможность создания биосенсора, который способен еще сильнее снизить нагрузку на человеческий организм, например биосенсор, который может обнаруживать детектируемое вещество по образцам слез, пота, слюны или т.п., т.е. веществ, полученных неинвазивным методом. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил.

1. Биосенсор, содержащий вещество-идентификатор, которое связывается с детектируемым веществом, и электрод, заряженный зарядом вещества-идентификатора, при этом указанный биосенсор содержит ингибитор, который подавляет присоединение недетектируемого вещества к по меньшей мере одному из вещества-идентификатора и электрода; причем вещество-идентификатор контактирует с электродом; ингибитор получен из полимерного соединения, содержащего более длинную молекулярную цепь, чем вещество-идентификатор; на поверхности электрода образуется самособирающийся монослой из вещества-идентификатора и ингибитора; и биосенсор способен детектировать изменение плотности заряда электрода, вызванное связыванием детектируемого вещества с веществом-идентификатором.

2. Биосенсор по п. 1, в котором детектируемым веществом является глюкоза.

3. Биосенсор, содержащий вещество-идентификатор, которое связывается с детектируемым веществом, и электрод, заряженный зарядом вещества-идентификатора, при этом указанный биосенсор содержит ингибитор, который подавляет присоединение недетектируемого вещества к по меньшей мере одному из вещества-идентификатора и электрода; причем биосенсор содержит тонкую пленку на электроде, образованную из вещества-идентификатора, и один или два либо более ингибиторных слоев, сформированных на этой тонкой пленке и содержащих ингибитор; и биосенсор способен детектировать изменение плотности заряда электрода, вызванное связыванием детектируемого вещества с веществом-идентификатором.

4. Биосенсор, содержащий вещество-идентификатор, которое связывается с детектируемым веществом, и электрод, заряженный зарядом вещества-идентификатора, при этом указанный биосенсор содержит ингибитор, который подавляет присоединение недетектируемого вещества к по меньшей мере одному из вещества-идентификатора и электрода; причем вещество-идентификатор связано с ингибитором; и биосенсор способен детектировать изменение плотности заряда электрода, вызванное связыванием детектируемого вещества с веществом-идентификатором.

5. Биосенсор по п. 4, в котором вещество-идентификатор удерживается на частице.

6. Биосенсор по п. 4, в котором ингибитор содержит молекулярную матрицу, имеющую структуру, комплементарную молекулярной структуре детектируемого вещества.

7. Биосенсор по п. 5, в котором ингибитор содержит молекулярную матрицу, имеющую структуру, комплементарную молекулярной структуре детектируемого вещества.

8. Биосенсор по любому из предшествующих пп. 1-7, в котором электрод соединен с пленкой, изолирующей затвор полевого транзистора.

9. Биосенсор по любому из предшествующих пп. 1-7, в котором вещество-идентификатор является фенилборной кислотой.

10. Биосенсор по п. 8, в котором вещество-идентификатор является фенилборной кислотой.

11. Биосенсор по п. 8, в котором электрод расположен на отдалении от полевого транзистора и электрически соединен электропроводом с металлическим электродом на изолирующей затвор пленке.