МОДУЛЬНЫЕ ЧАСТИЦЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ Российский патент 2018 года по МПК A61K9/51 A61K38/20 A61K38/21 A61P35/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки U.S.S.N. 61/899080, поданной 1 ноября 2013 г., и заявки U.S.S.N. 62/040242, поданной 21 августа 2014 г., обе они включены в настоящее описание в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение в целом относится к композициям наночастиц и способам их применения для иммунотерапии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Хотя эффективность терапевтического лечения зависит от механизма действия используемого агента, другие факторы также могут быть важны для индукции оптимального ответа. Например, дозировка и сроки введения относительно начала заболевания, а также ряд сложных проблем, связанных с фармакокинетическими и фармакодинамическими характеристиками, могут быть важными факторами.

На протяжении многих лет проводились различные исследования с целым рядом терапевтических агентов с целью создания оптимальных стратегий для доставки лекарств. Схемы лекарственной терапии различных типов многих заболеваний привели к сочетанной терапии. Например, в некоторых случаях сочетания используются для повышения эффективности с помощью (1) сочетания лекарств, которые имеют одинаковые или отличные мишени заболевания; (2) объединения двух лекарств, где активность двух в сочетании больше, чем сумма активности каждого по отдельности; и (3) сочетания двух лекарств, где одно лекарство действует прямо на патологическое состояние, в то время как другое улучшает симптомы у индивидуума непрямо. Тем не менее, такие разные лекарства с несопоставимой ролью в лечении заболевания часто резко отличаются по химической природе, и принципы доставки лекарств при сочетанной терапии могут быть очень сложными.

Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление композиций и способов для улучшения доставки лекарств и лечения заболеваний.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление композиций и способов для улучшения доставки активного агента к клетке-мишени и эффективности его действия.

Следующей целью настоящего изобретения является предоставление композиций и способов для улучшения доставки и эффективности сочетанной терапии, включающей, по меньшей мере, два активных агента.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление конкретных вариантов сочетанной терапии с целью индукции или усиления иммунного стимулирующего ответа у нуждающегося в этом индивидуума.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раскрыты композиции наночастиц. Композиции наночастиц обычно включают один, предпочтительно два или более активных агентов, нагруженных в носитель для доставки, прикрепленных к его поверхности, и/или заключенных в него. Носители для доставки могут представлять собой нанолипогели, включающие полимерное ядро и липидную оболочку, или биоразлагаемые полимерные наночастицы, такие как наночастицы PLGA. Активные агенты могут представлять собой терапевтические или диагностические агенты, направляющие части, антигены или адъюванты. Относительные концентрации каждого из двух или более активных агентов и их расположение на поверхности или внутри носителя для доставки можно регулировать в процессе получения композиций для адаптации предпочтительных дозирования и презентации, которые будут восприниматься клеткой-мишенью. Загрузка двух или более активных агентов в один носитель для доставки или на него позволяет двум или более активным агентам представляться клетке-мишени одновременно или в ином заранее установленном порядке.

В наиболее предпочтительных вариантах осуществления композиция наночастиц включает, по меньшей мере, один иммуномодулятор. Иммуномодулятор может представлять собой агент, который повышает или усиливает стимулирующий иммунный ответ, например, агент, который усиливает реакцию Т-клеток, повышает активность Т-клеток, увеличивает пролиферацию Т-клеток, снижает ингибиторный Т-клеточный сигнал, усиливает продукцию цитокинов, стимулирует дифференцировку Т-клеток или их эффекторные функции, способствует выживанию Т-клеток, или любое их сочетание. Иллюстративные агенты, которые повышают или усиливают стимуляторный иммунный ответ, включают, но не ограничиваются этим, цитокины и хемокины, такие как интерлейкин-2 (IL-2) и интерферон γ (IFNγ).

Иммуномодулятор может представлять собой агент, который снижает или ингибирует супрессорный иммунный ответ, например, агент, который уменьшает уровень регуляторных Т-клеток (Treg); блокирует дифференцировку Treg, их трафик, эффекторные функции или сочетания этого; повышает порог подавления эффекторных клеток, или любое сочетание этого. Иллюстративные агенты, которые снижают или ингибируют супрессорный иммунный ответ, включают, но не ограничиваются этим, ингибиторы TGF-β, такие как SB505124 или лозартан.

Композиции могут включать направляющую часть. Предпочтительные направляющие части включают пептид RGD, агонист CD40, Т-клеточный рецептор, который распознает антиген p53 и комплекс IL-15/IL-15Rα.

Раскрыты также конкретные сочетания активных агентов. Например, в некоторых вариантах осуществления носитель для доставки нагружается или декорируется IL-2 или IFNγ в сочетании с лозартаном. В других вариантах осуществления носитель для доставки нагружается IL-2 или IFNγ и декорируется направляющей частью, такой как пептид RGD, или антитело против CD40, или его антигенсвязывающий фрагмент.

Раскрываются также искусственные дендритные клетки и композиции, которые имитируют дендритные клетки. В конкретном варианте осуществления искусственная дендритная клетка состоит из нанолипогеля с полимерным ядром и липидной оболочкой или из биоразлагаемой полимерной наночастицы. Нанолипогель или полимерные наночастицы, например, наночастицы PLGA, декорированы комплексом IL-15/IL-15Rα. Искусственная дендритная клетка может быть нагружена одним или более дополнительными активными агентами, такими как IL-2, IFNγ, лозартан, SB505124 или любые их сочетания.

Раскрыты также способы стимуляции или усиления иммунного ответа у индивидуума и лечения рака у индивидуума. Как правило, способы включают введение индивидууму эффективного количества композиции наночастиц для повышения иммунного ответа, уничтожения раковых клеток, препятствия росту раковой опухоли и/или метастазированию, и/или для уменьшения одного или более отрицательных последствий и/или осложнений рака. Этот способ действия может быть терапевтическим или профилактическим. Как таковое, усиление, стимуляция иммунного ответа или вмешательство в него с использованием вводимых частиц является полезным как для разработки вакцин с известными антигенами, так и для подавления аутоиммунных нарушений.

Предлагаются также способы лечения нуждающихся в этом индивидуумов, включающие введение индивидууму композиции наночастиц, включающей носитель для доставки, такой как нанолипогель или полимерная частица, имеющий один или более активных агентов, загруженных в носитель, на него, или иным образом связанных с ним, в сочетании с введением индивидууму дополнительного активного агента. Композицию наночастиц и дополнительный активный агент можно вводить в единой фармацевтической композиции или по отдельности в разных фармацевтических композициях. В особенно предпочтительном варианте осуществления композиция наночастиц включает нанолипогели или другие полимерные частицы, имеющие провоспалительный цитокин (например, IL-2) и/или ингибитор TGFβ (например, лозартан), и дополнительный активный агент представляет собой иммуномодулятор или химиотерапевтический агент. В особенно предпочтительном варианте осуществления один или более активные агенты представляют собой стимуляторы или усилители иммунного ответа, такие как антагонист PD-1 (например, антагонистическое антитело против PD1, антитело против B7-Hl и т.д.), или антагонист CTLA4 (например, антагонистическое антитело против CTLA4), или даже более предпочтительно их сочетание. В другом предпочтительном варианте осуществления дополнительный активный агент представляет собой химиотерапевтический агент, например, доксорубицин.

Способ может быть использован для лечения индивидуума, у которого желательно усиление иммунного ответа (например, увеличение или индукция ответов Т-клеток, таких как пролиферация или активация Т-клеток). Примеры индивидуумов включают индивидуумов, страдающих раком или инфекционным заболеванием. Иммунный ответ (например, повышенный или индуцированный Т-клеточный ответ) может быть против антигена рака или заболевания. Иммунный ответ может быть эффективным для лечения рака или инфекции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой ответ против раковых клеток и/или инфицированных клеток при заболевании и может уменьшить один или более симптомов рака и/или заболевания (например, опухолевую массу, прогрессию опухоли, прогрессию заболевания и т.д.). Предлагаются также схемы лечения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1А представляет собой столбчатую гистограмму, демонстрирующую распределение кумарин-6/ткань (нг/г) в селезенке, печени, легких, сердце и почке мышей через три (3) часа после инъекции кумарин-6-нагруженных наночастиц PLGA. Фигура 1B представляет собой столбчатую гистограмму, демонстрирующую распределение кумарин-6/ткань (нг/г) в селезенке, печени, легких, сердце и почке мышей через шесть (6) часов после инъекции кумарин-6-нагруженных наночастиц PLGA. Фигура 1С представляет собой столбчатую гистограмму, демонстрирующую % позитивных в отношении наночастиц кумарин-6-PLGA клеток в подгруппах клеток (CD11c⁺F4/80^-, CD11c⁺F4/80⁺, CD11c^-F4/80^-, позитивных по B220, позитивных по CD4 и позитивных по CD8) в селезенке (обработанной наночастицами C6-PLGA (заштрихованные столбики), обработанной нефлуоресцентными наночастицами PLGA (незаштрихованные столбики). Фигура 1D представляет собой столбчатую гистограмму, демонстрирующую % позитивных в отношении наночастиц кумарин-6-PLGA клеток в подгруппах клеток (CD11c⁺F4/80^-, CD11c⁺F4/80⁺, CD11c^-F4/80^-, позитивных по B220, позитивных по CD4 и позитивных по CD8) в лимфатическом узле (обработанном наночастицами C6-PLGA (заштрихованные столбики), обработанном нефлуоресцентными наночастицами PLGA (незаштрихованные столбики). *указывает на р<0,05 (органов) по ANOVA и двустороннему критерию Стьюдента.

Фигура 2 представляет собой линейный график, показывающий относительный объем опухоли (мм³) у голых мышей в зависимости от времени (дни) после подкожного приживления ксенотрансплантата опухоли A375C15N (р53+HLA-A2/меланомы человека) и последующей обработки PBS, нанолипогелями с TCR-частицами (с инкапсулированным IL-2), или наночастицами TCR/IL-2 (растворимым специфичным для р53 гибридным белком scTCR/IL-2 (Altor 801, Altor Biosciences, Miramar, FL)).

Фигура 3 представляет собой линейный график, показывающий объем опухоли (мм³) у мышей в зависимости от времени (дни) после лечения 5 мкг наночастиц PLGA с поверхностью, модифицированной анти-CD40 (-▲-); или с поверхностью, модифицированной анти-CD40 и нагруженной IL-2 (-▼-); или, в качестве контролей, пустых частиц (с чистой поверхностью и пустые) (-■-); или с забуференным физиологическим раствором (1X PBS) (-●-), начиная приблизительно через 7 дней после инокуляции клеток меланомы B16F10.

Фигура 4 представляет собой иллюстрацию, показывающую наночастицы PLGA, экспонирующие гибридный белок IL-15RαFC, соединенный с авидином-биотином, включая то, как они получены и как они, как считается, взаимодействуют с клетками-мишенями, такими как NK-клетки, на основе природного взаимодействия между IL-15 (экспрессируемым на дендритных клетках) и рецептором IL-2/15 с промежуточным сродством, экспрессируемым на NK-клетках.

Фигура 5A представляет собой столбчатую гистограмму, демонстрирующую пролиферацию NK (количество клеток) в необработанных контролях и после обработки только наночастицами PLGA, только IL-15, наночастицами, нагруженными IL-15, только комплексом IL-15/IL-15Rα, наночастицами, декорированными комплексом IL-15/IL-15Rα. Фигура 5В представляет собой линейный график, демонстрирующий пролиферацию NK (количество клеток) после обработки только комплексом IL-15/IL-15Rα и наночастицами, декорированными комплексом IL-15/IL-15Rα, в зависимости от концентрации. Фигура 5C представляет собой линейный график, демонстрирующий уровень IFN-γ (нг/мл) после обработки только комплексом IL-15/IL-15Rα и наночастицами, декорированными комплексом IL-15/IL-15Rα, в зависимости от концентрации.

Фигура 6 представляет собой кривую выживаемости Каплана-Мейера, показывающую процент выживаемости в зависимости от времени у мышей B16.Ova (у мышей с введенной производной линией меланомы, клетки которой несут антиген поверхности овальбумин (OVA)), обработанных PBS (-○-), только наночастицами (-●-), только комплексом IL-15/IL-15Rα (--□--), комплексом IL-15/IL-15Rα, декорированным наночастицами PLGA (-□-) и комплексом IL-15/IL-15Rα, декорированным наночастицами, инкапсулирующими OVA (-■-).

Фигура 7 представляет собой иллюстрацию формирования наночастиц PLGA-PEG, декорированных пептидом RGD и инкапсулирующих SB505124, и гипотетический механизм их действия на опухолевые клетки.

Фигура 8 представляет собой ​​схему, иллюстрирующую мышиную модель опухоли, используемую в примере 6 ниже. Опухолевые клетки меланомы B16F10 (500000 клеток) вводили в хвостовую вену мышей C57BL/6 в день 0 и позже вводили в./в. SB505124 и RGD в растворе или наночастицы PLGA-PEG, нагруженные одним или обоими агентами. Мышей забивали, собирали легкие, и подсчитывали опухолевые узлы.

Фигура 9А представляет собой столбчатую диаграмму, демонстрирующую объем опухоли ×10³ (мм³) в зависимости от времени у мышей, обработанных в соответствии с тестом, представленным на фигуре 8. Контроль (-○-), растворимые SB505124 и RGD (Sol SB+Sol RGD (-□-), наночастицы PLGA-PEG, нагруженные SB505124 (SB/NP -Δ-), наночастицы, декорированные RGD (NP-RGD (-∇-)), или наночастицы, нагруженные SB505124 и декорированные RGD (SB/NP-RGD (-♦-)). Фигура 9В представляет собой кривую выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующую процент выживаемости в зависимости от времени у мышей, обработанных в соответствии с тестом, представленным на фигуре 8. Контроль (-○-), растворимые SB505124 и RGD (Sol SB+Sol RGD (-□-), наночастицы, нагруженные SB505124 (SB/NP -Δ-), наночастицы, декорированные RGD (NP-RGD (-∇-)), или наночастицы, нагруженные SB505124 и декорированные RGD (SB/NP-RGD (-♦-)). Фигура 9С представляет собой линейный график, демонстрирующий период полужизни наночастиц (-○-) и наночастиц, декорированных RGD (SB/NP-RGD (-■-)).

Фигура 10А представляет собой точечную гистограмму, демонстрирующую количество опухолей в мышиной модели опухоли после лечения с помощью растворимого SB505124 и RGD (Sol SB+Sol RGD), наночастицами PLGA-PEG, нагруженными SB505124 (SB/NP), наночастицами, декорированными RGD (NP-RGD) или наночастицами, нагруженными SB505124 и декорированными RGD (SB/NP-RGD). Фигура 10B представляет собой кривую выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующую процент выживаемости в зависимости от времени мышей, обработанных растворимыми SB505124 и RGD (Sol SB+Sol RGD (-○-)) или наночастицами, нагруженными SB505124 и декорированными RGD (SB/NP-RGD (-■-)). Фигура 10C представляет собой точечную гистограмму, демонстрирующую количество инвазирующих клеток после лечения наночастицами, нагруженными SB505124 и декорированными RGD (SB/NP-RGD), растворимыми SB505124 и RGD (Sol SB+Sol RGD), наночастицами, нагруженными SB505124 (SB/NP) или TGF-β. В этом тесте анализировали эффекторные клетки (NK, CD8+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки) и регуляторные Т-клетки (CD4+FOXP3+CD25+). Фигура 10D представляет собой столбчатую гистограмму, демонстрирующую миграцию (% от контроля) клеток, обработанных TGF-β, растворимыми SB505124 и RGD или наночастицами, нагруженными SB505124 и декорированными RGD. Раковые клетки (клеточная линия меланомы B16F10), известные как способные к переходу от эндотелиального к мезенхимальному фенотипу (EMT), анализировали в настоящем документе в присутствии TGF-b, и с добавлением NP PLGA-PEG, нагруженных ингибитором TGF-b, и направленных на раковые клетки, гиперэкспрессирующие интегрины.

На фигуре 11А представлена ​​диаграмма, иллюстрирующая мышиную модель опухоли, используемую в приведенных ниже примерах. Опухолевые клетки меланомы B16F10 вводили в хвостовую вену мышей C57BL/6 на день -10. На день 0 мышам вводили в./в. лозартан и RGD в растворе или с одним или с обоими агентами, нагруженными на наночастицы PLGA-PEG. Мышей затем забивали, и считали опухолевые узлы. Фигура 11B представляет собой линейный график, демонстрирующий объем опухоли ×10³ (мм³) в зависимости от времени у животных, обработанных растворимым лозартаном и RGD (Sol Los+Sol RGD (-○-), наночастицами, нагруженными лозартаном (Los NP -Δ-), или наночастицами, нагруженными лозартаном и декорированными RGD (Los/NP-RGD (-▲-)) в соответствии с методом, показанным на фигуре 11А. Фигура 11C представляет собой кривую выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующую процент выживаемости в зависимости от времени у мышей, которым вводили растворимый лозартан и RGD (Sol Los+Sol RGD (-○-),наночастицы, нагруженные лозартаном (Los/NP -Δ-), или наночастицы, нагруженные лозартаном и декорированные RGD (Los/NP-RGD (-▲-)), в соответствии с методом, показанным на фигуре 11А.

Фигура 12 представляет собой столбчатую гистограмму, демонстрирующую уровни IFNγ (нг/мл) после обработки выделенных клеток CD4+ OT-II (специфичных для Ova) либо пустыми наночастицами PLGA (незаштрихованные столбики), либо наночастицами PLGA, инкапсулирующими IL-12 (заштрихованные столбики) и представляющими комплексы MHC-II Ova, при различных концентрациях (125 мкг/мл, 62,5 мкг/мл, 31 мкг/мл, 15 мкг/мл) в течение 4 дней.

Фигура 13А представляет собой столбчатую гистограмму, демонстрирующую кратность увеличения CD8+ Т-клеток, выделенных из PBLCs человека и обработанных наночастицами PLGA, содержащими антиген MART-1 меланомы в контексте HLA-A2, по сравнению с растворимым IL-2 (0,1 нг/мл или 10 нг/мл) плюс антиген MART-1 или IL-2 (0,1 нг/мл или 10 нг/мл) плюс дендритные клетки, которые были пульсированы антигеном MART. Результаты для каждой группы с обработкой показаны в дни 0, 7, 14, 21 и 28 (слева направо). Фигура 13B представляет собой ​​столбчатую гистограмму, демонстрирующую % тетрамер-позитивных CD8+ Т-клеток после обработки наночастицами, содержащими антиген MART-1 меланомы в контексте HLA-A2, по сравнению с растворимым IL-2 (0,1 нг/мл или 10 нг/мл) плюс антиген MART-1 или IL-2 (0,1 нг/мл или 10 нг/мл) плюс дендритные клетки, которые были пульсированы антигеном MART. Результаты для каждой группы с обработкой показаны в дни 0, 7, 14, 21 и 28 (слева направо).

Фигура 14 представляет собой график рассеяния, демонстрирующий влияние обработки при различных сочетаниях и схемах, тестируемое на мышиной меланоме B16F10 в мышиной модели метастазов. «IMM1» относится к нанолипогелям, нагруженным лозартаном и IL-2; «PD1» относится к антагонистическому антителу против PD-1; «Yervoy» относится к антагонистическому антителу против CTLA4; «Los-NLG» относится к нанолипогелям, нагруженным лозартаном, «IL-2» относится к свободному или растворимому IL-2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Определения

При применении в настоящем описании «нанолипогель» относится к наночастице типа ядро-оболочка, имеющей ядро из полимерного матрикса, которая может содержать молекулу-хозяин, в липосомной оболочке, которая может быть однослойной или двухслойной, необязательно поперечно сшитой.

При применении в настоящем описании «молекула-хозяин» относится к молекуле или веществу, которые обратимо связываются с активным агентом с образованием комплекса. В конкретных вариантах осуществления хозяин представляет собой молекулу, которая образует аддукт с активным агентом. Аддукты образуются, когда активный агент (т.е. гость) или часть активного агента вставляют в полость другой молекулы, группы молекул или вещества (т.е. хозяина). Хозяин может представлять собой небольшую молекулу, олигомер, полимер или их сочетание. Иллюстративные хозяева включают полисахариды, такие как амилозы, циклодекстрины и другие циклические или спиральные соединения, содержащие множество колец альдозы, например, соединения, образованные путем связывания 1,4 и 1,6 моносахаридов (таких как глюкоза, фруктоза и галактоза) и дисахаридов (таких как сахароза, мальтоза и лактоза). Другие примеры соединений-хозяев включают криптанды, криптофаны, кавитанды, краун-эфиры, дендримеры, ионообменные смолы, каликсарены, ваниломицины, нигерицины, катенаны, поликатенаны, карцеранды, кукурбитурилы и сферанды.

При применении в настоящем описании «небольшая молекула» относится к молекулам с молекулярной массой менее приблизительно 2000 г/моль, более предпочтительно менее приблизительно 1500 г/моль, наиболее предпочтительно менее приблизительно 1200 г/моль.

При применении в настоящем описании «гидрогель» относится к набухающему в воде полимерному матриксу, образованному из трехмерной сети макромолекул, удерживаемых вместе с помощью ковалентных или нековалентных поперечных сшивок, который может впитывать значительное количество воды (по массе) с образованием геля.

При применении в настоящем описании «наночастица», как правило, относится к частице, имеющей диаметр в диапазоне от приблизительно 10 нм до, но не включая, приблизительно 1 микрон, предпочтительно от 100 нм до приблизительно 1 микрона. Частицы могут иметь любую форму. Наночастицы, имеющие сферическую форму, как правило, называют «наносферами».

При применении в настоящем описании «молекулярная масса», как правило, относится к относительной средней длине цепи основного полимера, если не указано иное. На практике молекулярная масса может быть определена или охарактеризована с использованием различных методов, включая гель-проникающую хроматографию (ГПХ) или капиллярную вискозиметрию. Молекулярные массы при ГПХ представляют как средневзвешенную молекулярную массу (М.м.) в отличие от среднечисленной молекулярной массы (Mn). Капиллярная вискозиметрия дает оценки молекулярной массы в виде характеристической вязкости, определяемой из разбавленного раствора полимера с использованием определенного набора условий - концентрации, температуры и растворителей.

При применении в настоящем описании «средний размер частиц», как правило, относится к статистическим средним размерам частиц (диаметру) частиц в популяции частиц. Диаметр по существу сферической частицы может относиться к физическому или гидродинамическому диаметру. Диаметр несферической частицы может относиться преимущественно к гидродинамическому диаметру. Используемый в данном описании диаметр несферической частицы может относиться к наибольшему линейному расстоянию между двумя точками на поверхности частицы. Средний размер частиц может быть измерен с использованием способов, известных в данной области техники, таких как динамическое рассеяние света.

Термины «монодисперсная» и «равномерно распределенная по размеру» используются в настоящем описании взаимозаменяемо и описывают популяцию наночастиц или микрочастиц, где все частицы имеют одинаковые или почти одинаковые размеры. Используемое в настоящем описании монодисперсное распределение относится к распределению частиц, в котором 90% распределения лежит в пределах 15% от среднего размера частиц, более предпочтительно в пределах 10% от среднего размера частиц, наиболее предпочтительно в пределах 5% от среднего размера частиц.

При применении в настоящем описании «антагонист PD-1», обозначает любую молекулу, которая ослабляет ингибиторное проведение сигнала, опосредованное PD-1, обнаруживаемое на поверхности Т-клеток, В-клеток, природных клеток-киллеров (NK), моноцитов, DC и макрофагов. Такой антагонист включает молекулу, которая прерывает какой-либо ингибиторный сигнал, генерируемый молекулой PD-1 на Т-клетке. Таким образом, антагонист PD-1 может представлять собой молекулу, которая ингибирует, уменьшает, устраняет или иным образом снижает ингибиторную передачу сигнала через сигнальный путь рецептора PD-1. Такое снижение может возникать когда: (i) антагонист PD-1 связывается с рецептором PD-1, не вызывая инициации передачи сигнала, снижая или блокируя ингибиторную передачу сигнала; (ii) антагонист PD-1 связывается с лигандом (например, агонистом) рецептора PD-1, предотвращая его связывание с ним (например, где указанный агонист представляет собой В7-Н1); (iii) антагонист PD-1 связывается или иным образом ингибирует активность молекулы, которая является частью регуляторной цепи, которая, когда не ингибируется, приводит к стимуляции или облегчению иным образом ингибиторной передачи сигнала PD-1; или (iv) антагонист PD-1 ингибирует экспрессию рецептора PD-1 или экспрессию его лиганда, особенно за счет уменьшения или блокирования экспрессии одного или более генов, кодирующих PD-1, или один или более его природных лигандов. Таким образом, антагонист PD-1 может представлять собой молекулу, которая оказывает подавляющее влияние на передачу ингибиторного сигнала PD-1, увеличивая тем самым Т-клеточный ответ на один или более антигенов.

При применении в настоящем описании «антагонист CTLA-4» обозначает соединение, которое уменьшает опосредованное CTLA-4 ингибирование реакций Т-клеток. Например, в Т-клетке CTLA4 обеспечивает ингибирующий импульс в результате связывания лигандов В7, таких как B7-1 и B7-2. Антагонист CTLA4 представляет собой антагонист, который нарушает связывание указанных лигандов с CTLA4 на активированных Т-клетках.

II. Композиции наночастиц

Раскрыты композиции наночастиц, включающие один или более активных агентов, причем каждый нагружен в них, прикреплен к их поверхности, и/или включен в носитель для доставки. Композиции наночастиц имеют ряд преимуществ по сравнению с доставкой активного агента или агентов в клетки-мишени в растворе. Например, композиции наночастиц представляют локализованную концентрацию одного или более активных агентов на наночастицах или в них, что приводит к увеличению авидности, когда наночастица сталкивается с клетками-мишенями. Композиции наночастиц могут также служить в качестве депо активного агента с настраиваемой кинетикой высвобождения, которая может продолжаться в течение нескольких дней для пролонгирования эффективной системной полужизни и эффективности агента или агентов.

Обычно два или более активных агента нагружаются в носитель для доставки, прикрепляются к его поверхности и/или заключаются в него. Относительными концентрациями каждого из двух или более активных агентов и их расположением на носителе для доставки или внутри него можно управлять в процессе получения композиций для адаптации предпочтительной дозировки и презентации, которые будут восприниматься клеткой-мишенью. Нагрузка двух или более активных агентов в один и тот же носитель для доставки или на него позволяет двум или более активным агентам презентироваться клетке-мишени одновременно или в другом, заранее определенном порядке.

A. Носители для доставки

Носители для доставки в виде наночастиц могут представлять собой, например, нанолипогели, полимерные частицы, частицы кремнезема, липосомы или многослойные везикулы. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления носители для доставки в виде частиц представляют собой композиции наноразмеров, например, от 10 нм до, но не включая, приблизительно 1 микрон. Тем не менее, следует принимать во внимание, что в некоторых вариантах осуществления и для некоторых вариантов применения частицы могут быть меньше или больше (например, микрочастицы и т.д.). Хотя композиции, раскрытые в данном описании, называются композициями наночастиц по всему тексту, следует принимать во внимание, что в некоторых вариантах осуществления и для некоторых вариантов применения композиции в виде частиц могут быть несколько больше, чем наночастицы. Например, композиции в виде частиц могут быть от приблизительно 1 микрона до приблизительно 1000 микрон. Такие композиции могут быть отнесены к композициям микрочастиц.

В предпочтительных вариантах осуществления для лечения рака желательно, чтобы частица быть такого размера, который подходит для доступа к микроокружению опухоли. В конкретных вариантах осуществления частица имеет размер, подходящий для доступа к микроокружению опухоли и/или к опухолевым клеткам в результате повышенной проницаемости и эффекта удержания (EPR). EPR относится к свойству, с помощью которого молекулы определенного размера (например, композиции в виде частиц, обсуждаемые в настоящем документе) имеют тенденцию к накоплению в опухолевой ткани значительно больше, чем они делают это в нормальных тканях. Таким образом, в композициях для лечения рака носитель для доставки предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 25 нм до приблизительно 500 нм включительно, более предпочтительно в диапазоне от приблизительно 50 нм до приблизительно 300 нм включительно.

1. Нанолипогели

Нанолипогели представляют собой наночастицы в виде ядра-оболочки, которые сочетают в себе преимущества как липосом, так и частиц на основе полимеров, для поддерживаемой доставки активных агентов. В некоторых вариантах осуществления нанолипогели могут быть более предпочтительными, чем полимерные наночастицы в качестве носителей для доставки. Обычно нанолипогели могут быть выбраны для совместной нагрузки низкомолекулярным гидрофобным лекарством в сочетании с биологическим агентом (например, белком, пептидом, антителом и т.д.), совместной нагрузки сочетания гидрофобного и гидрофильного лекарства, одного или в сочетаниях, или биологическим агентом, таким как цитокины, антитела, белковые/пептидные факторы, стимулирующие или подавляющие рост, или целые клетки, секретирующие свои продукты, или клеточные лизаты, и/или для вариантов применения, в которых желательны интернализация частицы и внутриклеточная доставка активного агента(ов). В некоторых из этих вариантов осуществления и применения нанолипогели могут демонстрировать повышенную эффективность нагрузки, повышенное поддерживаемое высвобождение и улучшенную терапевтическую эффективность для сочетаний макромолекул и молекул по сравнению с обычными композициями наночастиц.

Как обсуждается более подробно ниже, обычно внешняя оболочка нанолипогеля защищает носитель и обеспечивает биосовместимость, а также поверхность для функционализации с направляющей молекулой(ами). Внешняя оболочка инкапсулирует компоненты так, чтобы они не подвергались воздействию до тех пор, пока это не становится желательным, например, в ответ на условия окружающей среды или стимулы, создавая монодисперсные, воспроизводимые популяции частиц и опосредуя интернализацию в желаемые типы клеток. Внутреннее ядро, которое может представлять собой дендример или другой полимер, имеет отдельные и аддитивные функциональные возможности для внешней оболочки. Например, внутренняя оболочка дает возможность вторичному отложению лекарства, вакцины или визуализирующего агента; увеличивает нагрузку частицы компонентами с различными физико-химическими свойствами; позволяет настроить высвобождение содержимого из частиц; повышает доступность цитозольных ДНК/РНК, лекарства и/или белка путем разрушения эндосом, все это ведет к повышенной эффективности лекарств, презентации антигенов и трансфекции/сайленсингу.

Нанолипогели имеют ядро из полимерного матрикса, содержащее одну или более молекул-хозяев. Полимерный матрикс предпочтительно представляет собой гидрогель, такой как поперечно сшитый блок-сополимер, содержащий один или более поли(алкиленоксид)ных сегментов, таких как полиэтиленгликоль, и один или более алифатических полиэфирных сегментов, таких как полимолочная кислота. Одна или более молекул-хозяев, таких как циклодекстрин, дендример или ионообменная смола, диспергируются в пределах полимерного матрикса или ковалентно связываются с ним. Ядро гидрогеля окружается липосомной оболочкой.

Нанолипогели могут быть сконструированы так, чтобы включать различные активные агенты, которые затем могут высвобождаться контролируемым образом. Активные агенты могут быть диспергированными в матриксе гидрогеля, связанного с одной или более молекулами-хозяевами, диспергированными в липосомной оболочке, ковалентно присоединенными к липосомной оболочке и их сочетаниями. Активные агенты могут быть селективно включены в каждую из этих областей в пределах нанолипогеля. Кроме того, скорость высвобождения активных агентов из каждой из этих областей может настраиваться независимо. Поскольку каждая из этих областей обладает отличными свойствами, включая размер и гидрофобность/гидрофильность, химические части, включенные независимо в каждую из этих областей, могут существенно отличаться по размеру и составу. Например, нанолипогели могут быть нагружены одним или более белками, диспергированными в полимерном матриксе, а также низкомолекулярными гидрофобными лекарствами, связанными с молекулами-хозяевами.

Например, в некоторых вариантах осуществления ядро нанолипогеля содержит два или более активных агента. В предпочтительных вариантах осуществления ядро нанолипогеля содержит как низкомолекулярный гидрофобный активный агент, предпочтительно связанный с одной или более подходящими молекулами-хозяевами, так и гидрофильный активный агент, диспергированный в полимерном матриксе. В конкретных вариантах осуществления гидрофильный активный агент представляет собой белок, такой как терапевтический цитокин. Путем включения гидрофобного активного агента, соединенного с молекулой-хозяином, и гидрофильной молекулы, диспергированной в полимерном матриксе, может быть достигнуто контролируемое высвобождение двух или более активных агентов, включая два или более активных агента с различными физико-химическими характеристиками (такими как растворимость, гидрофобность/гидрофильность, молекулярная масса и их сочетания).

В предпочтительном варианте осуществления молекула-хозяин используется для доставки соединения с низкой молекулярной массой, такого как химиотерапевтическое соединение, где молекула-хозяин задерживает высвобождение соединения с низкой молекулярной массой и более крупного гидрофильного соединения, такого как цитокин, так что высвобождение обеих молекул происходит в течение сходного периода времени.

Таким образом, нанолипогели могут обеспечить одновременное поддерживаемое высвобождение агентов, которые значительно различаются по химическому составу и молекулярной массе. В качестве неограничивающего примера, нанолипогели могут быть нагружены как гидрофобным, низкомолекулярным антигеном, связанным с молекулой-хозяином, так и иммуноадъювантом, таким как иммуностимулирующий белок, диспергированный в полимерном матриксе. Эти нанолипогели могут обеспечить поддерживаемое высвобождение антигена вместе с адъювантом так, чтобы оптимизировать иммунный ответ.

В конкретном примере достигается одновременная поддерживаемая доставка с помощью нанолипогелей иммуностимулирующего белка, интерлейкина-2 (IL-2), а также низкомолекулярной органической молекулы 2-(5-бензо[l,3]диоксол-5-ил-2-трет-бутил-3Н-имидазол-4-ил)-6-метилпиридина, ингибитора трансформирующего фактора роста-β (TGF-β). Эта конструкция приводит к противоопухолевому ответу в мышиной модели, который значительно превосходит достигаемый при введении в растворе каждого агента по отдельности или сочетания этих двух агентов. Кроме того, нанолипогели могут благоприятно модулировать биораспределение одного или более инкапсулированных в них активных агентов.

Нанолипогели обычно имеют сферическую форму со средним размером частиц в диапазоне от приблизительно 50 нм до приблизительно 1000 нм, более предпочтительно от приблизительно 75 нм до приблизительно 300 нм, наиболее предпочтительно от приблизительно 90 нм до приблизительно 200 нм. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нанолипогели обладают средним размером частиц в диапазоне от приблизительно 100 нм до приблизительно 140 нм. Частицы могут быть несферическими.

В зависимости от природы липидов, присутствующих в липосомной оболочке нанолипогелей, могут быть получены нанолипогели, обладающие положительным, отрицательным или приблизительно нейтральным зарядом поверхности. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нанолипогели обладают зарядом поверхности, близким к нейтральному. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нанолипогели обладают ζ-потенциалом от приблизительно 10 мВ до приблизительно -10 мВ, более предпочтительно от приблизительно 5 мВ до приблизительно -5 мВ, более предпочтительно от приблизительно 3 мВ до приблизительно -3 мВ, наиболее предпочтительно от приблизительно 2 мВ до приблизительно -2 мВ.

Гидрофобные активные агенты, такие как белки, могут быть ковалентно соединены с поверхностью нанолипогеля, в то время как гидрофильные активные агенты могут быть ковалентно соединены с поверхностью нанолипогеля или диспергированы в липосомной оболочке. В некоторых вариантах осуществления липосомная оболочка включает один или более ПЭГилированных липидов. В этих случаях один или более активных агентов могут быть конъюгированы с концом одной или более цепей ПЭГ, присутствующих на поверхности липосомной оболочки.

В другом варианте осуществления липид модифицируют для включения части авидина, что позволяет биотинилировать направляющую часть, присоединить к нему детектируемую метку или другой активный агент, если это желательно.

В конкретных вариантах осуществления один или более активных агентов ковалентно соединены с поверхностью нанолипогеля через линкерную группу, которая отщепляется в ответ на внешний химический или физический стимул, такой как изменение рН окружающей среды так, чтобы индуцировать высвобождение активного агента в желаемом физиологическом месте.

а. Ядро

Ядро нанолипогеля образовано из полимерного матрикса. Матрикс может включать одну или более молекул-хозяев, как обсуждается более подробно ниже. Ядро нанолипогеля может дополнительно включать один или более активных агентов. Активные агенты могут образовывать комплексы с молекулой-хозяином, диспергированной в полимерном матриксе, или с их сочетаниями.

Полимерный матрикс нанолипогелей может быть образован из одного или более полимеров или сополимеров. Путем изменения состава и морфологии полимерного матрикса можно добиться разнообразных характеристик контролируемого высвобождения, позволяя доставлять умеренные постоянные дозы одного или более активных агентов в течение длительных периодов времени.

Полимерный матрикс может быть образован из не поддающихся биодеградации или биодеградируемых полимеров; однако, предпочтительно полимерный матрикс является биодеградируемым. Полимерный матрикс может быть выбран так, чтобы деградировать в течение периода времени от одного дня до одного года, более предпочтительно от семи дней до 26 недель, более предпочтительно от семи дней до 20 недель, наиболее предпочтительно от семи дней до 16 недель.

В общем предпочтительными являются синтетические полимеры, хотя могут быть использованы природные полимеры. Типичные полимеры включают поли(гидроксикислоты), такие как поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота), поли(молочная кислота-со-гликолевая кислота), полигидроксиалканоаты, такие как поли-3-гидроксибутират или поли-4-оксибутират; поликапролактоны; поли(ортоэфиры); полиангидриды; поли(фосфазены); поли(лактид-со-капролактоны); поли(гликолид-со-капролактоны); поликарбонаты, такие как тирозинполикарбонаты; полиамиды (включая синтетические и природные полиамиды), полипептиды и поли(аминокислоты); полиэфирамиды; другие биосовместимые полиэфиры; поли(диоксаноны); поли(алкиленалкилаты); гидрофильные полиэфиры; полиуретаны; простые полиэфиры; полиацетали; полицианоакрилаты; полисилоксаны; поли(оксиэтилен)/поли(оксипропилен)сополимеры; поликетали; полифосфаты; полигидроксивалераты; полиалкиленоксалаты; полиалкиленсукцинаты; поли(малеиновые кислоты), поливиниловые спирты, поливинилпирролидон; поли(алкиленоксиды), такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); дериватизированные целлюлозы, такие как алкилцеллюлозы (например, метилцеллюлоза), гидроксиалкилцеллюлозы (например, гидроксипропилцеллюлоза), простые эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, нитроцеллюлозы, полимеры акриловой кислоты, метакриловой кислоты или их сополимеры или производные, включая сложные эфиры, поли(метилметакрилат), поли(этилметакрилат), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат) (совместно обозначаемые в настоящем документе как «полиакриловые кислоты»), а также их производные, сополимеры и смеси.

Используемый в настоящем документе термин «производные» включает полимеры, имеющие замены, добавления химических групп и другие модификации относительно полимерных остовов, описанных выше, обычно сделанные специалистами в данной области техники. Природные полимеры, включая белки, такие как альбумин, коллаген, желатин, проламины, такие как зеин, и полисахариды, такие как альгинат и пектин, также могут быть включены в полимерный матрикс. Несмотря на то, что для формирования полимерного матрикса могут быть использованы различные полимеры, обычно конечный полимерный матрикс должен представлять собой гидрогель. В некоторых случаях, когда полимерный матрикс содержит природный полимер, природный полимер представляет собой биополимер, который деградирует в результате гидролиза, такой как полигидроксиалканоат.

В предпочтительных вариантах осуществления полимерный матрикс содержит один или более поперечно сшиваемых полимеров. Предпочтительно поперечно сшиваемые полимеры содержат одну или более фотополимеризуемых групп, что позволяет осуществлять поперечную сшивку полимерного матрикса с последующим формированием нанолипогеля. Примеры подходящих фотополимеризуемых групп включают виниловые группы, акрилатные группы, метакрилатные группы и акриламидные группы. Фотополимеризуемые группы, когда они присутствуют, могут быть включены в остов поперечно сшиваемых полимеров, в пределах одной или более боковых цепей поперечно сшиваемых полимеров, в один или более концы поперечно сшиваемых полимеров или в их сочетания.

Полимерный матрикс может быть образован из полимеров, имеющих различные молекулярные массы, с тем, чтобы сформировать нанолипогели, имеющие свойства, включая скорость высвобождения лекарств, оптимальные для конкретных вариантов применения. Обычно полимеры, которые образуют полимерный матрикс, обладают средней молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 500 Да до 50 кДа. В тех случаях, когда полимерный матрикс образован из не сшиваемых поперечно полимеров, полимеры обычно обладают средней молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 1 кДа до приблизительно 50 кДа, более предпочтительно от приблизительно 1 кДа до приблизительно 70 кДа, наиболее предпочтительно от приблизительно 5 кДа до приблизительно 50 кДа. В тех случаях, когда полимерный матрикс образован из поперечно сшиваемых полимеров, полимеры обычно обладают более низкой средней молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 500 Да до приблизительно 25 кДа, более предпочтительно от приблизительно 1 кДа до приблизительно 10 кДа, наиболее предпочтительно от приблизительно 3 кДа до приблизительно 6 кДа. В конкретных вариантах осуществления полимерный матрикс образован из поперечно сшиваемого полимера, имеющего среднюю молекулярную массу приблизительно 5 кДа.

В некоторых вариантах осуществления полимерный матрикс образован из поли(алкиленоксид)полимера или блок-сополимера, содержащего один или более поли(алкиленоксид)ных сегментов. Поли(алкиленоксид)ный полимер или поли(алкиленоксид)ные сегменты полимера могут содержать от 8 до 500 повторяющихся единиц, более предпочтительно от 40 до 300 повторяющихся единиц, наиболее предпочтительно от 50 до 150 повторяющихся единиц. Подходящие поли(алкиленоксиды) включают полиэтиленгликоль (также обозначаемый как оксид полиэтилена или ПЭГ), полипропилен-1,2-гликоль, поли(пропиленоксид), полипропилен-1,3-гликоль и их сополимеры.

В некоторых вариантах осуществления полимерный матрикс образован из алифатического сложного полиэфира или блок-сополимера, содержащего один или более алифатических полиэфирных сегментов. Предпочтительно сложные полиэфиры или сегменты полиэфиров представляют собой поли(молочную кислоту) (PLA), поли(гликолевую кислоту), PGA или поли(лактид-со-гликолид) (PLGA).

В предпочтительных вариантах осуществления полимерный матрикс образован из блок-сополимера, содержащего один или более поли(алкиленоксид)ных сегментов, один или более алифатических полиэфирных сегментов, и необязательно одну или более фотополимеризуемых групп. В этих случаях один или более поли(алкиленоксид)ных сегментов пропитывают полимер с необходимой гидрофильностью так, что результирующий полимерный матрикс образует подходящий гидрогель, в то время как полиэфирные сегменты дают полимерный матрикс с настраиваемой гидрофобностью/гидрофильностью и/или желаемыми характеристиками деградации in vivo.

Скорость деградации полиэфирных сегментов и часто соответствующая скорость высвобождения лекарства может варьироваться от нескольких дней (в случае чистой PGA) до нескольких месяцев (в случае чистой PLA), и может легко регулироваться путем варьирования соотношения PLA к PGA в полиэфирных сегментах. Кроме того, поли(алкиленоксиды), такие как ПЭГ, и алифатические сложные полиэфиры, такие как PGA, PLA и PLGA, созданы как безопасные для использования у человека; эти вещества используются в клинической практике у человека, включая системы доставки лекарств, в течение более 30 лет.

В некоторых вариантах осуществления полимерный матрикс образован из три-блок-сополимера, содержащего центральный поли(алкиленоксид)ный сегмент, прилегающие алифатические полиэфирные сегменты, присоединенные к любому концу центрального поли(алкиленоксид)ного сегмента, и одну или более фотополимеризуемых групп. В предпочтительном варианте осуществления центральный поли(алкиленоксид)ный сегмент представляет собой ПЭГ, и алифатические полиэфирные сегменты представляют собой PGA, PLA или PLGA.

Обычно средняя молекулярная масса центрального поли(алкиленоксид)ного сегмента больше, чем средняя молекулярная масса соседних полиэфирных сегментов. В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса центрального поли(алкиленоксид)ного сегмента, по меньшей мере, в три раза больше, чем средняя молекулярная масса одного из соседних сегментов полиэфира, более предпочтительно, по меньшей мере, в пять раз больше, чем средняя молекулярная масса одного из соседних полиэфирных сегментов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в десять раз больше, чем средняя молекулярная масса одного из соседних полиэфирных сегментов.

В некоторых случаях центральный поли(алкиленоксид)ный сегмент обладает средней молекулярной массой в интервале от приблизительно 500 Да до приблизительно 10000 Да, более предпочтительно от приблизительно 1000 Да до приблизительно 7000 Да, наиболее предпочтительно от приблизительно 2500 Да до приблизительно 5000 Да. В конкретных вариантах осуществления средняя молекулярная масса центрального поли(алкиленоксид)ного сегмента составляет приблизительно 4000 Да. Обычно каждый прилегающий полиэфирный сегмент обладает средней молекулярной массой в интервале от приблизительно 100 Да до приблизительно 3500 Да, более предпочтительно от приблизительно 100 Да до приблизительно 1000 Да, наиболее предпочтительно от приблизительно 100 Да до приблизительно 500 Да.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения полимерный матрикс образован из тройного блок-сополимера, показанного ниже

где m и n независимо для каждого случая представляют собой целые числа от 1 до 500, более предпочтительно от 10 до 150.

Примеры предпочтительных природных полимеров включают белки, такие как альбумин, коллаген, желатин, и проламины, например, зеин, и полисахариды, такие как альгинат, производные целлюлозы и полигидроксиалканоаты, например, полигидроксибутират. Стабильность микрочастиц in vivo можно регулировать в процессе получения с помощью полимеров, таких как поли(лактид-со-гликолид), сополимеризованный с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Если ПЭГ экспонируется на внешней поверхности, это может увеличить время циркуляции этих веществ из-за гидрофильности ПЭГ.

Примеры предпочтительных небиодеградируемых полимеров включают этиленвинилацетат, поли(мет)акриловую кислоту, полиамиды, сополимеры и их смеси.

Матрикс может также быть получен из полимеров типа геля, таких как альгинат, полученный с помощью традиционных методов ионного гелеобразования. Полимеры сначала растворяют в водном растворе, смешивают с сульфатом бария или каким-либо биологически активным агентом, и затем экструдируют через устройство для формирования микрокапель, которое в некоторых случаях использует поток газообразного азота для разбивания капель. Медленно перемешиваемую (приблизительно 100-170 об/мин) баню с ионной закалкой размещают ниже экструзионного устройства для улавливания образующихся микрокапель. Микрочастицы оставляют инкубироваться в бане в течение от двадцати до тридцати минут с тем, чтобы обеспечить достаточное количество времени для осуществления гелеобразования. Размер микрочастицы контролируется с использованием экструдеров с различным размером или варьирования скоростей потока либо газообразного азота, либо раствора полимера. Хитозановые микрочастицы могут быть получены путем растворения полимера в кислом растворе и его поперечной сшивки с триполифосфатом. Микрочастицы карбоксиметилцеллюлозы (CMC) могут быть получены путем растворения полимера в кислом растворе и осаждения микрочастиц с ионами свинца. В случае отрицательно заряженных полимеров (например, альгината, CMC), положительно заряженные лиганды (например, полилизин, полиэтиленимин) различной молекулярной массы могут быть присоединены за счет ионных сил.

Вероятно, наиболее широко используемыми являются алифатические сложные полиэфиры, в частности, гидрофобная поли(молочная кислота) (PLA), более гидрофильная поли(гликолевая кислота) PGA и их сополимеры, поли(лактид-со-гликолид) (PLGA). Скорость деградации этих полимеров и часто соответствующая скорость высвобождения лекарства может варьироваться от дней (PGA) до месяцев (PLA) и легко регулируется путем вариации соотношения PLA к PGA. Во-вторых, была установлена физиологическая совместимость PLGA и его гомополимеров PGA и PLA с безопасным использованием в организме человека; эти вещества имеют историю различных вариантов клинического применения у человека более 30 лет, включая системы доставки лекарств. Наночастицы PLGA могут быть составлены различными способами, которые улучшают фармакокинетику лекарства и биораспределение в ткани-мишени путем либо пассивного, либо активного направленного действия. Микрочастицы созданы для высвобождения инкапсулированных или присоединенных молекул в течение периода от нескольких дней до нескольких недель. Факторы, влияющие на продолжительность высвобождения, включают рН окружающей среды (более высокая скорость высвобождения при рН 5 и ниже в связи с катализируемым кислотой гидролизом PLGA) и полимерность композиции. Алифатические полиэфиры отличаются по гидрофобности, и это, в свою очередь, влияет на скорость деградации. В частности, гидрофобная поли(молочная кислота) (PLA), более гидрофильная поли(гликолевая кислота) PGA и их сополимеры, поли(лактид-со-гликолид) (PLGA) имеют различные скорости высвобождения. Скорость деградации этих полимеров и часто соответствующая скорость высвобождения лекарства может варьироваться от дней (PGA) до месяцев (PLA) и легко регулируется путем изменения соотношения PLA к PGA.

b. Компоненты оболочки

Нанолипогели включают липосомную оболочку, состоящую из одного или более концентрических липидных монослоев или липидных бислоев. Оболочка может дополнительно включать один или более активных агентов, целевые молекулы или их сочетания.

Нанолипогели включают липосомную оболочку, состоящую из одного или более концентрических липидных монослоев или липидных бислоев. Состав липосомной оболочки может варьироваться, чтобы воздействовать на скорость высвобождения одного или более активных агентов in vivo. Липиды могут также быть ковалентно поперечно-сшитыми, если это желательно, для изменения высвобождения лекарства in vivo.

Липидная оболочка может быть образована из одного липидного бислоя (т.е. оболочка может быть однослойной) или нескольких концентрических липидных бислоев (т.е. оболочка может быть многослойной). Липидная оболочка может быть образована из одного липида; однако в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения липидная оболочка образуется из сочетания более одного липида. Липиды могут быть нейтральными, анионными или катионными при физиологическом значении рН.

Подходящие нейтральные и анионные липиды включают стеролы и липиды, такие как холестерин, фосфолипиды, лизолипиды, лизофосфолипиды и сфинголипиды. Нейтральные и анионные липиды включают, но не ограничиваются этим, фосфатидилхолин (PC) (такой как PC яйца, PC сои), включая 1,2-диацил-глицеро-3-фосфохолины; фосфатидилсерин (PS), фосфатидилглицерин, фосфатидилинозитол (PI); гликолипиды; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин; сфингогликолипиды (также известные как 1-церамидилглюкозиды), такие как церамид галактопиранозид, ганглиозиды и цереброзиды; жирные кислоты, стерины, содержащие группу карбоновой кислоты, такие как холестерин или его производные; и 1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламины, включая 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин или 1,2-диолеоилглицерилфосфатидилэтаноламин (DOPE), 1,2- дигексадецилфосфоэтаноламин (DHPE), 1,2-дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), 1,2-дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) и 1,2-димиристоилфосфатидилхолин (DMPC). Подходящими также являются природные (например, происходящие из тканей L-α-фосфатидил: яичного желтка, сердца, мозга, печени, соевых бобов) и/или синтетические (например, насыщенные и ненасыщенные 1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфохолины, l-ацил-2-ацил-sn-глицеро-3-фосфохолины, 1,2-дигептаноил-SN-глицеро-3-фосфохолин) производные этих липидов.

Подходящие катионные липиды включают N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмониевые соли, также обозначаемые как липиды TAP, например, в виде метилсульфатной соли. Подходящие липиды TAP включают, но не ограничиваются этим, DOTAP (диолеоил-), DMTAP (димиристоил-), DPTAP (дипальмитоил-) и DSTAP (дистеароил-). Другие подходящие катионные липиды включают диметилдиоктадециламмония бромид (DDAB), 1,2-диацилокси-3-триметиламмония пропаны, N-[1-(2,3-диолоилокси)пропил]-N,N-диметиламин (DODAP), 1,2-диацилокси-3-диметиламмония пропаны, N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (ДОТМА), 1,2-диалкилокси-3-диметиламмоний пропаны, диоктадециламидоглицилспермин (собак), 3-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин (DC-Chol); 2,3-диолеоилокси-N-(2-(сперминкарбоксамидо)этил)-N,N-диметил-1-пропанаминий трифторацетат (DOSPA), β-аланин холестерин, бромид цетилтриметиламмония (СТАВ), диC₁₄-амидин, N-трет-бутил-N'-тетрадецил-3-тетрадециламинопропионамидин, N-(альфа-триметиламмониоацетил)дидодецил-D-глутамата хлорид (TMAG), дитетрадеканоил-N-(триметиламмониоацетил)диэтаноламина хлорид, 1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксиспермил)пропиламид (DOSPER) и производные N,N,N',N'-тетраметил-,N'-бис(2-гидроксиэтил)-2,3-диолеоилокси-1,4-бутандиаммония йодида, l-[2-(ацилокси)этил]-2-алкил(алкенил)-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиния хлорида, такие как l-[2-(9(Z)-октадеценоилокси)этил]-2-(8(Z)-гептадеценил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиния хлорид (DOTIM) и l-[2-(гексадеканоилокси)этил]-2-пентадецил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиния хлорид (DPTIM) и четвертичные аммониевые производные 2,3-диалкилоксипропила, содержащие гидроксиалкильную группу на четвертичном амине, например, 1,2-диолеил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DORI), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DORIE), 1,2-диолеилокспропил-3-диметилгидроксипропиламмония бромид (DORIE-НР), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксибутиламмония бромид (DORIE-НВ), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксипентиламмония бромид (DORIE-HPE), 1,2-димиристиилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DMRIE), 1,2-дипальмитилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DPRIE) и 1,2-дистерилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DSRIE).

Другие подходящие липиды включают ПЭГилированные производные нейтральных, анионных и катионных липидов, описанных выше. Включение одного или более ПЭГилированных производных липидов в липидную оболочку может приводить к нанолипогелю, который экспонирует полиэтиленгликольные цепи на своей поверхности. Полученные нанолипогели могут обладать повышенной стабильностью и временем циркуляции in vivo по сравнению с нанолипогелями, не имеющими цепей ПЭГ на своих поверхностях. Примеры подходящих ПЭГилированных липидов включают дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль (DSPE-PEG), включая DSPE PEG (М.м. 2000) и DSPE PEG (М.м. 5000), дипалмитоилглицеросукцинат-полиэтиленгликоль (DPGS-PEG), стеарил-полиэтиленгликоль и холестерил-полиэтиленгликоль.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения липидная оболочка формируется из сочетания более одного липида. В некоторых вариантах осуществления липидная оболочка формируется из смеси, по меньшей мере, трех липидов. В конкретных вариантах осуществления липидная оболочка формируется из смеси фосфатидилхолина (PC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG) и холестерина.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липидная оболочка формируется из смеси одного или более ПЭГилированных фосфолипидов и одного или более дополнительных липидов или стеринов. В некоторых случаях молярное отношение одного или более ПЭГилированных липидов к одному или более дополнительным липидам или стеринам находится в интервале от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:6, более предпочтительно от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:6, наиболее предпочтительно от приблизительно 1:3 до приблизительно 1:5. В конкретных вариантах осуществления молярное отношение одного или более ПЭГилированных липидов к одному или более дополнительным липидам или стеринам составляет приблизительно 1:4.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липидная оболочка формируется из смеси одного или более фосфолипидов и одного или более дополнительных липидов или стеринов. В некоторых случаях молярное отношение одного или более фосфолипидов к одному или более дополнительным липидам или стеринам находится в интервале от приблизительно 1:1 до приблизительно 6:1, более предпочтительно от приблизительно 2:1 до приблизительно 6:1, наиболее предпочтительно от приблизительно 3:1 до приблизительно 5:1. В конкретных вариантах осуществления молярное отношение одного или более фосфолипидов к одному или более дополнительным липидам или стеринам составляет приблизительно 4:1.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения липидная оболочка формируется из смеси фосфолипидов, таких как фосфатидилхолин (PC), ПЭГилированный фосфолипид, такой как 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG), и холестерина. В конкретных вариантах осуществления липидная оболочка формируется из смеси фосфатидилхолина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG) и холестерина в молярном отношении 3:1:1.

2. Полимерные частицы

Носитель для доставки в виде наночастиц также может представлять собой полимерную частицу, например, микро- или наночастицу.

Частицы могут быть биодеградируемыми или небиодеградируемыми.

Примеры полимеров, которые могут быть использованы для получения полимерных частиц, рассмотрены выше в отношении компонента полимерного матрикса нанолипогелей.

Примеры предпочтительных биодеградируемых полимеров включают полимеры оксикислот, таких как молочная кислота и гликолевая кислота, и сополимеры с ПЭГ, полиангидриды, поли(орто)эфиры, полиуретаны, поли(масляную кислоту), поли(валериановую кислоту), поли(лактид-со-капролактон), их смеси и сополимеры. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения частицы состоят из одного или более сложных полиэфиров.

Например, частицы могут содержать один или более следующих сложных полиэфиров: гомополимеры, включающие единицы гликолевой кислоты, обозначаемые в настоящем документе «PGA», и единицы молочной кислоты, такие как поли-L-молочная кислота, поли-D-молочная кислота, поли-D,L-молочная кислота, поли-L-лактид, поли-D-лактид и поли-D,L-лактид, совместно обозначаемые в настоящем документе как «PLA», и единицы капролактона, такие как поли(ε-капролактон), совместно обозначаемые в настоящем документе как «PCL»; и сополимеры, включающие единицы молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как различные формы поли(молочной кислоты-со-гликолевой кислоты) и поли(лактида-со-гликолида), характеризуемые соотношением молочная кислота:гликолевая кислота, совместно обозначаемые в настоящем документе как «PLGA»; и полиакрилаты, а также их производные. Примеры таких полимеров включают также сополимеры полиэтиленгликоля (ПЭГ) и указанных выше сложных полиэфиров, такие, как различные формы PLGA-PEG или сополимеров PLA-PEG, совместно обозначаемые в настоящем документе как «ПЭГилированные полимеры». В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения участок ПЭГ может быть ковалентно связан с полимером с образованием «ПЭГилированных полимеров» с помощью расщепляемого линкера. Также могут быть использованы альгинатные полимеры.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения частицы состоят из PLGA. PLGA является безопасным, одобренным FDA полимером. Частицы PLGA являются предпочтительными, так как они могут защитить активный агент (т.е. инкапсулированный агент), способствуют пролонгированному высвобождению и доступны для добавления направляющих частей. Например, полимер частицы может иметь структуру:

(Поли(молочная-со-гликолевая кислота) PLGA+H₂O=вариабельная деградация (от дней до недель).

Частицы могут содержать один или более конъюгатов полимеров, содержащих связи между концами полимера и направляющей части, обнаруживаемой метки или другого активного агента. Например, модифицированный полимер может представлять собой PLGA-PEG-фосфонат. В другом примере частица модифицируется для включения части авидина и биотинилированной направляющей части, детектируемой метки, или к ней может быть присоединен другой активный агент.

Примеры предпочтительных природных полимеров включают белки, такие как альбумин, коллаген, желатин, и проламины, например, зеин, и полисахариды, такие как альгинат, производные целлюлозы и полигидроксиалканоаты, например, полигидроксибутират. Стабильность частиц in vivo можно регулировать в процессе получения с помощью полимеров, таких как поли(лактид-со-гликолид), сополимеризованный с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Если ПЭГ экспонируется на внешней поверхности, он может увеличить время циркуляции этих веществ из-за гидрофильности ПЭГ.

Примеры предпочтительных небиодеградируемых полимеров включают сополимер этилена и винилацетата, поли(мет)акриловую кислоту, полиамиды, сополимеры и их смеси.

3. Другие носители для доставки

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения носители для доставки представляют собой липосомы. Липосомы представляют собой обычно сферические везикулы, состоящие из слоистой фазы липидного бислоя. Липосомы могут представлять собой, например, многослойные везикулы (MLV), маленькие однослойные липосомные везикулы (SUV), большие однослойные везикулы (LUV) или кохлеарные везикулы. Липосомы, мисцеллы и другие носители для доставки на основе липидов, пригодные для получения раскрытых композиций наночастиц, известны в данной области техники. См., например, Torchilin, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 58(14):1532-55 (2006).

Носители для доставки также могут представлять собой частицы диоксида кремния. Подходящие частицы диоксида кремния, пригодные для получения раскрытых композиций наночастиц, также известны в данной области техники. См., например, Barbe, et al., Advanced Materials, 16(21):1959-1966 (2004) и Argyo, et al., Chem. Mater., 26(1):435-451 (2014).

B. Активные агенты

Композиции наночастиц, раскрытые в данном описании, как правило, включают нанолипогель или микро- или наночастицу или другой носитель для доставки, где один или более активных агентов загружаются в них, прикрепляются к их поверхности и/или заключаются внутрь носителя для доставки. В некоторых вариантах осуществления два, три, четыре или более активных агентов загружаются в них, прикрепляются к их поверхности и/или заключатся внутрь носителя для доставки. Два или более агентов могут быть загружены в них, прикреплены к их поверхности и/или заключены в них в пределах одной и той же частицы или различных частиц.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция включает два или более различных типа частиц, имеющих один и тот же или отличный активный агент(ы), связанные с ними.

Композиция может включать один или более активных агентов, которые не загружаются в раскрытый носитель(и) для доставки, не прикрепляются к его поверхности и/или не заключаются в него. Например, такие активные агенты могут быть свободным или растворимым активным агентом(ами), или активным агентом(ами) в отличном носителе или в лекарственной форме, но тем не менее, быть частью той же фармацевтической композиции, что и композиция наночастиц.

Как описано более подробно ниже, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанные способы включают введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции наночастиц, которая включает один, два, три или более активных агентов, загружаемых в носитель для доставки, прикрепляемых к его поверхности, и/или заключаемых в него, в сочетании с одним, двумя, тремя или более дополнительными активными агентами, которые вводят индивидууму в виде одной или более отдельных композиций. В некоторых вариантах осуществления дополнительные активные агенты вводят индивидууму совместно, но не загружают в раскрытый носитель(и) для доставки, не прикрепляют к его поверхности и/или не заключают в него, и они могут быть, например, свободными или растворимыми, или находиться в другом носителе или лекарственной форме. Любой из раскрытых активных агентов может быть загружен в носитель для доставки, прикреплен к его поверхности и/или заключен внутри него и введен нуждающемуся в этом индивидууму как часть композиции наночастиц. Любой из раскрытых активных агентов может быть введен индивидууму в виде свободного или растворимого агента или как часть другой единицы лекарственной формы, или в виде лекарственной формы, вводимой индивидууму в сочетании с композицией наночастиц.

Примеры активных агентов включают, например, опухолевые антигены, CD4+ Т-клеточные эпитопы, цитокины, химиотерапевтические агенты, радионуклиды, низкомолекулярные ингибиторы передачи сигнала, фототермические антенны, сигнальные молекулы иммунологической опасности, другие иммунотерапевтические агенты, ферменты, антибиотики, противовирусные агенты, антипаразитарные агенты (против гельминтов, простейших), факторы роста, ингибиторы роста, гормоны, антагонисты гормонов, антитела и их биологически активные фрагменты (включая и гуманизированные, одноцепочечные и гибридные антитела), антигенные и вакцинные композиции (включая адъюванты), пептидные лекарства, противовоспалительные агенты, иммуномодуляторы (включая лиганды, которые связываются с Toll-подобными рецепторами (включая, но не ограничиваясь CpG олигонуклеотидами) для активации врожденной иммунной системы, молекулы, которые мобилизуют и оптимизируют адаптивную иммунную систему, молекулы, которые активируют или позитивно регулируют действие цитотоксических Т-лимфоцитов, естественных клеток-киллеров и хелперных Т-клеток, а также молекулы, которые инактивируют или негативно регулируют супрессорные или регуляторные Т-клетки), агенты, которые стимулируют захват носителя для доставки в клетки (включая дендритные клетки и другие антигенпрезентирующие клетки), нутрицевтики, такие как витамины, и олигонуклеотидные лекарства (включая ДНК, РНК, антисмысловую нуклеиновую кислоту, аптамеры, малые интерферирующие РНК, рибозимы, внешние управляющие последовательности для рибонуклеазы Р и агенты, образующие триплекс).

В предпочтительных вариантах осуществления один или более активных агентов представляют собой иммуномодулятор, такой как агент, стимулирующий иммунный ответ, или агент, который блокирует иммуносупрессию. В особенно предпочтительных вариантах осуществления активные агенты направлены на блокаду контрольной точки опухоли или на костимулирующие молекулы. Считается, что композиции наночастиц и способы применения, описанные в настоящем документе, могут повысить эффективность и/или уменьшить токсичность по сравнению с агентом, вводимым в одиночку. Например, как описано более подробно ниже, некоторые композиции и способы включают совместное введение адъювантных наночастиц (обычно биодеградируемой композиции наночастиц, инкапсулирующих низкомолекулярное лекарство и/или биологический агент) в сочетании с традиционными методами лечения рака (например, с иммунотерапией или химиотерапией, связанных со свойствами иммунной сигнализации). Такие комбинированные лекарства и схемы лечения могут повысить эффективность, снизить токсичность и снизить общую дозу при введении. Конкретные варианты осуществления обсуждаются более подробно ниже.

1. Агенты, стимулирующие иммунный ответ

Один или более активных агентов могут представлять собой агенты, стимулирующие иммунный ответ. Иммунная система состоит из клеточного (управляемого Т-клетками) и гуморального (управляемого В-клетками) элементов. Обычно принято считать, что для рака индукция мощного опосредованного клетками иммунного ответа является более эффективной, чем активация гуморального иммунитета. Клеточный иммунитет зависит от взаимодействия и кооперации ряда различных типов клеток иммунной системы, включая антигенпрезентирующие клетки (APC; важным компонентом которых являются дендритные клетки), цитотоксические Т-клетки, естественные клетки-киллеры и хелперные Т-клетки. Таким образом, активный агент может представлять собой агент, который увеличивает клеточный (управляемый Т-клетками) иммунный ответ, гуморальный (управляемый В-клетками) иммунный ответ или их сочетание. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения агент усиливает Т-клеточный ответ, повышает активность Т-клеток, увеличивает пролиферацию Т-клеток, снижает ингибиторный Т-клеточный сигнал, усиливает продукцию цитокинов, стимулирует дифференцировку или эффекторную функцию Т-клеток, способствует выживанию Т-клеток или действует на любое их сочетание.

Примеры иммуномодулирующих агентов включают цитокины, ксантины, интерлейкины, интерфероны, олигодезоксинуклеотиды, глюканы, факторы роста (например, TNF, CSF, GM-CSF и G-CSF), гормоны, такие как эстрогены (диэтилстильбэстрол, эстрадиол), андрогены (тестостерон, HALOTESTIN® (флюоксиместерон)), прогестины (MEGACE®, мегэстрола ацетат), PROVERA® (медроксипрогестерона ацетат)), и кортикостероиды (преднизолон, дексаметазон, гидрокортизон).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения агент представляет собой молекулу, связанную с воспалением, такую как цитокин, металлопротеазу или другую молекулу, включая, но не ограничиваясь этим, IL-1β, TNF-α, TGF-бета, IFN-γ, IL-17, IL-6, IL-23, IL-22, IL-21 и MMPs.

a. Цитокины

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, один из активных агентов представляет собой провоспалительный цитокин. Цитокины обычно выступают в качестве гормональных регуляторов или сигнальных молекул в концентрациях от нано- до пикомолярных и способствуют клеточной сигнализации. Цитокин может представлять собой белок, пептид или гликопротеин.

Иллюстративные цитокины включают, но не ограничиваются этим, интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 и т.д.), интерфероны (например, интерферон-γ), макрофаг-колониестимулирующий фактор, гранулоцит-колониестимулирующий фактор, фактор некроза опухоли, ингибиторный фактор лейкоцитов (LIF), хемокины, SDF-1α и семейство цитокинов CXC.

b. Хемокины

В другом варианте осуществления, по меньшей мере, один из активных агентов представляет собой провоспалительный хемокин. Хемокины представляют собой семейство небольших цитокинов. Их название происходит от их способности вызывать направленный хемотаксис у близлежащих чувствительных клеток. Таким образом, они являются хемотаксическими цитокинами. Белки классифицируются как хемокины в соответствии с общими структурными характеристиками, такими как небольшой размер (размер у всех них составляет приблизительно 8-10 килодальтон), а также присутствие четырех остатков цистеина в консервативных положениях, которые являются ключевыми для формирования их 3-мерной структуры. Хемокины разделены на четыре основных подсемейства: CXC, CC, CX3C и XC. Хемокины индуцируют клеточную сигнализацию путем связывания с трансмембранными рецепторами, сопряженными с G-белками (т.е. рецепторами хемокинов).

2. Агенты, которые блокируют супрессию иммунитета

По меньшей мере, один из активных агентов может представлять собой агент, который блокирует, ингибирует или уменьшает супрессию иммунитета, или агент, который блокирует, ингибирует или снижает биологическую активность фактора, который способствует подавлению иммунитета. Становится все более очевидным, что ассоциированное с опухолью подавление иммунитета не только в значительной степени способствует прогрессии опухоли, но также является одним из основных факторов, ограничивающих активность иммунотерапии рака. Антигенспецифическая толерантность Т-клеток является одним из основных механизмов уклонения опухоли, и антигенспецифическая природа нечувствительности опухоли указывает на то, что хозяева-опухоленосители не способны поддерживать специфические для опухоли иммунные ответы, несмотря на еще сохраняющуюся чувствительность к другим иммунным стимулам (Willimsky, et al., Immunol. Rev., 220:102-12 (2007), Wang, et al. Semin Cancer Biol., 16:73-9 (2006), Frey, et al., Immunol. Rev., 222:192-205 (2008), Nagaraj, et al., Clinical Cancer Research, 16(6):1812-23 (2010)).

а. Агенты, уменьшающие Tregs

Регуляторные Т-клетки (Tregs) необходимы для поддержания аутотолерантности, так как дефекты в их компартменте приводят к тяжелым аутоиммунным заболеваниям. Тем не менее, эта важная функция контрастирует с их вредным воздействием на иммунологический надзор опухоли и противоопухолевый иммунитет. Увеличение Tregs в опухолях и кровотоке раковых больных участвует в патогенезе рака и прогрессии заболевания, и идентифицированы механизмы, от их пролиферации до путей траффика, ответственные за их аккумуляцию. Эксперименты in vivo указывают на несколько растворимых или зависимых от контактов факторов опухолей, вносящих вклад в генерацию Treg, включая циклооксигеназу-2, CD70, Gall, TGF-β, индоламин-2,3-диоксигеназу и другие еще не выявленные факторы. Повышенная локальная пролиферация Treg или сниженный апоптоз может способствовать увеличению числа опухолевых Treg. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один из агентов снижает циклооксигеназу-2, CD70, Gall, TGF-β или индоламин-2,3-диоксигеназу, уменьшает местную пролиферацию Treg и/или увеличивает апоптоз Treg, в частности, в пределах или вблизи опухоли.

Различные иммунотерапевтические подходы к преодолению антагонистического действия, оказываемого Tregs, рассмотрены в статьях Mougiakakos Adv Cancer Res, 107:57-117 (2010), De Rezende, et al., Arch. Immunol. Ther. Exp., 58(3):179-90 (2010) и Curiel, Curr. Opin. Immunol., 20(2):241-246 (2008).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения агент снижает Tregs; блокирует дифференцировку Treg, трафик, эффекторные функции или их сочетания; повышает порог подавления эффекторных клеток, или любое их сочетание. Иллюстративные агенты, разрушающие Tregs или блокирующие их функции, включают антитело против CD25, циклофосфамид, денилейкин дифтитокс (онтак, гибридный белок IL-2 и дифтерийного токсина, LMB-2 (иммунотоксин Pseudomonas, направленный на CD25), лечение CpG и антитело против CTLA4 (Curiel, Curr Opin Immunol, 20(2):241-246 (2008)).

Направленное действие на специфичные для опухолевых антигенов Tregs также может быть эффективным в отношении снижения способности опухолей избегать иммунной системы. Специфичные для опухолевых антигенов Tregs встречаются в природе и индуцируются вакцинацией. Опухолевые Tregs, экспрессирующие фолатный рецептор 4, могут быть обогащенными как антигенспецифические клетки, и их истощение у мышей-опухоленосителей улучшало опосредованное иммунной системой отторжение опухоли. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции наночастиц направлены на опухолевые Tregs, экспрессирующие фолатный рецептор 4.

В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один из агентов представляет собой модулятор TGF-β. После того, как латентный TGF-β высвобождается из опухолевой клетки, он связывается с интегрином на поверхности опухолевой клетки, что приводит к активации латентного TGF-β. В результате, повышенные концентрации TGF-β в микроокружении опухоли поддерживают иммуносупрессию путем рекрутизации регуляторных Т-клеток (Massayo, et al., Eur J Clin Med Oncol., (4):27-32 (2013).

i. SB505124

Рост молекул TGF-β может быть подавлен ингибитором TGF-β, таким как SB505124 (2-(5-бензо[1,3]диоксол-5-ил-2-трет-бутил-3Н-имидазол-4-ил)-6-метилпиридин). SB505124 (также известный как SB-505124 или сокращенно SB) является селективным ингибитором рецепторов типа I TGF-β - ALK4, ALK5 и ALK7 (DaCosta, et al., Mol Pharmacol. 65:744-52 (2004)). В конкретном варианте осуществления SB505124 образует комплекс с молекулой-хозяином, такой как циклодекстрин.

II. Лозартан

Другой модулятор TGF-β представляет собой лозартан (также известный как COZAAR©). Лозартан, наиболее известный как антагонист рецепторов ангиотензина II, также негативно регулирует TGF-β (Guo, et al., Zhonghua Nei Ke Za Zhi, 42:403-8 (2003)). Лозартан (2-бутил-4-хлор-1-{[2'-(1H-тетразол-5-ил)бифенил-4-ил]метил}-1H-имидазол-5-ил)метанол) имеет структуру:

Лозартан хорошо всасывается после перорального введения и подвергается существенной первой фазе метаболизма с получением метаболита 5-карбоновой кислоты, обозначаемого как ΕΧΡ3174. Этот метаболит является длительно действующим (от 6 до 8 часов), неконкурентным антагонистом рецептора AT1, а также способствует фармакологическим эффектам лозартана. Лозартан идентифицирован в качестве лекарства по ряду показаний, включая гипертонию, необязательно в сочетании с другими антигипертензивными лекарствами, диабетическую нейропатию, необязательно в сочетании с гипогликемическими агентами, хроническую сердечную недостаточность, и в сочетании с гидрохлоротиазидом (HCTZ) для снижения риска развития инсульта. Калиевую соль составляли в виде таблеток с количеством 12,5, 25, 50 и 100 мг, а также в виде порошка для суспендирования 2,5 мг/мл. Комбинированное лекарство лозартана с HCTZ (Hyzaar) также доступно в виде таблеток с количеством 50 мг/12,5 мг, I00 мг/12,5 мг и 100 мг/25 мг. Композиции и составы, включающие лозартан и его фармацевтические соли и имидазольные производные, и способы их применения описаны в патентах США Nos. 5138069, 5153197, 5128355, 5155118, 5210079 и 5354867.

В некоторых вариантах осуществления лозартан или его фармацевтическая соль, имидазольное производное или метаболит загружается в носитель для доставки, прикрепляется к его поверхности и/или заключается в него, например, в полимерную наночастицу или нанолипогель. Предпочтительно, второй активный агент также загружается в носитель для доставки, прикрепляется к его поверхности и/или заключается в него. Второй активный агент может представлять собой второй иммуномодулятор, например, IL-2. В конкретном варианте осуществления наночастицы PLGA или нанолипогели нагружаются лозартаном и IL-2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения носители для доставки включают направляющую часть, такую, как пептид RGD.

Способы нагрузки этих агентов на наночастицы могут включать такие способы, как описанные ниже в примерах 3 и 7, соответственно. Частицы могут представлять собой наночастицы PLGA, нанолипогели или другие биологически разлагаемые полимеры.

В иллюстративном анализе для проверки эффективности противоопухолевого действия различных частиц и/или дозировок активных агентов животным инокулируют клетки меланомы B16F10 в заднюю конечность. Рост опухоли прослеживают и, начиная приблизительно через 7 дней, когда опухоль достигает площади 0,5 мм², животных подвергают курсу инъекции вокруг опухоли 5 мкг наночастиц (a) нагруженных IL-2 и лозартаном; или, в качестве контроля, (b) пустыми частицами (сходно с анализами, описанными в приведенных ниже примерах).

b. Агенты, которые снижают супрессорные клетки миелоидного происхождения

Супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) могут представлять собой основную популяцию антигенпрезентирующих клеток, ответственных за индукцию антигенспецифической толерантности CD8+ Т-клеток при раке. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиция включает агент, который уменьшает количество или активность MDSC. Типичные агенты, которые могут быть использованы для снижения MDSC, включают, но не ограничиваются этим, дифференцирующие агенты, такие как полностью транс-ретиноевая кислота, химиотерапевтические лекарства, аминобифосфонаты, ингибиторы тирозинкиназ (например, сунитиниб), ингибиторы циклооксигеназы 2 и ингибирование функции MDSC с помощью ингибиторов фосфодиэстеразы 5 (сильденафила), и синтетические тритерпеноиды, (например, метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксоолеана-1,9(11)-диен-28-овой кислоты (также обозначаемый как CDDO-Me и бардоксолон метил) ((Nagaraj, et al., Clinical Cancer Research, 16(6):1812-23 (2010)).

c. Антагонисты PD-1

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активные агенты представляют собой антагонисты PD-1. Активация Т-клеток, как правило, зависит от специфического для антигена сигнала с последующим контактом Т-клеточного рецептора (TCR) с антигенным пептидом, презентируемым с помощью главного комплекса гистосовместимости (MHC), в то время как степень этой реакции контролируется положительными и отрицательными независимыми от антигена сигналами, исходящими от множества костимуляторных молекул. Последние, как правило, представляют собой члены семейства CD28/B7. Наоборот, фактор программируемой смерти-1 (PD-1) является членом семейства CD28 рецепторов, который при индукции на Т-клетках вызывает негативный иммунный ответ. Контакт между PD-1 и одним из его лигандов (B7-H1 или В7-DC) индуцирует ингибиторный ответ, который снижает пролиферацию Т-клеток и/или силу, и/или длительность Т-клеточного ответа. Соответствующие антагонисты PD-1 описаны в патентах США Nos. 8114845, 8609089 и 8709416 и включают

соединения или агенты, которые либо связываются с лигандом и блокируют лиганд PD-1, мешая связыванию или ингибируя связывание лиганда с рецептором PD-1, либо связываются непосредственно с рецептором PD-1 и блокируют его, не индуцируя ингибирующую передачу сигнала через рецептор PD-1.

В некоторых вариантах осуществления антагонист рецептора PD-1 непосредственно связывается с рецептором PD-1, не индуцируя ингибирующую передачу сигнала, а также связывается с лигандом рецептора PD-1, снижая или ингибируя инициируемую лигандом передачу сигнала через рецептор PD-1. За счет снижения числа и/или количества лигандов, которые связываются с рецептором PD-1 и вызывают передачу ингибиторного сигнала, меньше клеток ослабляются в результате негативного сигнала, поступающего в результате передачи сигнала с PD-1, и может быть достигнут более надежный иммунный ответ.

Считается, что сигнализация через PD-1 управляется путем связывания с лигандом PD-1 (например, B7-H1 или В7-DC) в непосредственной близости к пептидному антигену, презентируемому главным комплексом гистосовместимости (MHC) (см., например, Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 105:10275-10276 (2008)). Таким образом, белки, антитела или малые молекулы, которые предотвращают совместное связывание PD-1 и TCR на мембране Т-клеток также являются полезными антагонистами PD-1.

В предпочтительных вариантах осуществления антагонисты рецептора PD-1 представляют собой низкомолекулярные антагонисты или антитела, которые снижают или вмешиваются в передачу сигнала с рецептора PD-1 путем связывания с лигандами PD-1 или с самим PD-1, особенно когда за этим не следует совместное связывание PD-1 с TCR, тем самым не запуская передачу ингибиторного сигнала через рецептор PD-1.

Другие антагонисты PD-1, охватываемые способами настоящего изобретения, включают антитела, которые связываются с PD-1 или с лигандами PD-1 и другие антитела.

Подходящие антитела против PD-1 включают, но не ограничиваются этим, антитела, которые описаны в следующих публикациях:

PCT/IL03/00425 (Hardy et al., WO/2003/099196),

PCT/JP2006/309606 (Korman et al., WO/2006/121168),

PCT/US2008/008925 (Li et al., WO/2009/014708),

PCT/JP03/08420 (Honjo et al., WO/2004/004771),

PCT/JP04/00549 (Honjo et al., WO/2004/072286),

PCT/IB2003/006304 (Collins et al., WO/2004/056875),

PCT/US2007/088851 (Ahmed et al., WO/2008/083174),

PCT/US2006/026046 (Korman et al., WO/2007/005874),

PCT/US2008/084923 (Terrett et al., WO/2009/073533),

Berger et al., Clin. Cancer Res., 14:30443051 (2008).

Конкретным примером антитела против PD-1 является MDX-1106 (см. Kosak, патент US 20070166281 (опубл. 19 июля 2007 г.) в парагр. 42), антитело человека против PD-1, предпочтительно вводимое в дозе 3 мг/кг.

Иллюстративные антитела против В7-Hl включают, но не ограничиваются этим, антитела, которые описаны в следующих публикациях:

PCT/US06/022423 (WO/2006/133396, опубл. 14 декабря 2006 г.)

PCT/US07/088851 (WO/2008/083174, опубл. 10 июля 2008 г.)

US 2006/0110383 (опубл. 25 мая 2006 г.)

Конкретным примером антитела против В7-Н1 является MDX-1105 (патент WO/2007/005874, опубликованный 11 января 2007 г.)), антитело человека против В7-Н1.

В отношении антител против В7-DC см. патенты 7411051, 7052694, 7390888 и опубликованную заявку США No. 2006/0099203.

Антитело может представлять собой биспецифическое антитело, которое включает антитело, которое связывается с рецептором PD-1, соединенное мостиком с антителом, которое связывается с лигандом PD-1, таким как B7-H1. В некоторых вариантах осуществления связывающая часть PD-1 снижает или ингибирует передачу сигнала через рецептор PD-1.

Другие иллюстративные антагонисты рецептора PD-1 включают, но не ограничиваются этим, полипептиды В7-DC, включая гомологи и варианты этих соединений, а также активные фрагменты любого из вышеперечисленного, и гибридные белки, которые включают любой из них. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гибридный белок включает растворимую часть B7-DC, соединенную с участком Fc антитела, такого как IgG человека, и не включает все или часть трансмембранного участка B7-DC человека.

Антагонист PD-1 может также представлять собой фрагмент B7-H1 млекопитающего, предпочтительно мыши или примата, предпочтительно человека, где фрагмент связывается с PD-1 и блокирует его, но не приводит к передаче ингибиторного сигнала через PD-1. Фрагменты могут также быть частью гибридного белка, например, гибридного белка Ig.

Другие пригодные полипептидные антагонисты PD-1 включают антагонисты, которые связываются с лигандами рецептора PD-1. Они включают рецепторный белок PD-1 или его растворимые фрагменты, которые могут связываться с лигандами PD-1, такими как B7-Hl или В7-DC, и предотвращать связывание с эндогенным рецептором PD-1, таким образом предотвращая передачу ингибиторного сигнала. В7-Н1, как также было показано, связывается с белком B7.1 (Butte et al., Immunity, Vol. 27, pp. 111-122, (2007)). Такие фрагменты включают также растворимую часть ECD белка PD-1, которая включает мутации, такие как мутация A99L, которая увеличивает связывание с природными лигандами (Molnar et al., PNAS, 105:10483-10488 (2008)). Может также быть использован B7-1 или его растворимые фрагменты, которые могут связываться с лигандом В7-H1 и предотвращать связывание с эндогенным рецептором PD-1, предотвращая тем самым передачу ингибиторного сигнала.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты PD-1 и В7-H1, как ДНК, так и РНК, а также молекулы миРНК также могут представлять собой антагонисты PD-1. Такие антисмысловые молекулы предотвращают экспрессию PD-1 на Т-клетках, а также продукцию лигандов Т-клеток, таких как B7-H1, PD-Ll и/или PD-L2. Например, миРНК (например, из приблизительно 21 нуклеотида в длину, которая является специфической для гена, кодирующего PD-1, или кодирующего лиганд PD-1, и олигонуклеотиды которой могут быть легко приобретены коммерчески), комплексируемая с носителями, такими как полиэтиленимин (см. Cubillos-Ruiz et al., J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009), легко захватываются клетками, которые экспрессируют PD-1, а также лиганды PD-1, и снижает экспрессию этих рецепторов и лигандов, достигая снижения передачи ингибиторного сигнала в Т-клетках, тем самым активируя Т-клетки.

d. Антагонисты CTLA4

Другие молекулы, пригодные для опосредования эффектов Т-клеток при иммунном ответе, также рассматриваются в качестве активных агентов. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула представляет собой агент, который связывается с молекулой, опосредующей иммунный ответ, которая не представляет собой PD-1. В предпочтительном варианте осуществления молекула является антагонистом CTLA4, например, антагонистическим антителом против CTLA4. Пример антитела против CTLA4, которое рассматривается как используемое в способах по настоящему изобретению, включает антитело, как описано в патенте PCT/US2006/043690 (Fischkoff et al., WO/2007/056539).

Дозировки антитела против PD-1, против В7-H1 и против CTLA4 известны в данной области техники и могут находиться в диапазоне от 0,1 до 100 мг/кг, с предпочтительными более короткими диапазонами от 1 до 50 мг/кг и более предпочтительными диапазонами от 10 до 20 мг/кг. Соответствующая доза для индивидуума-человека составляет от 5 до 15 мг/кг, наиболее предпочтительно 10 мг/кг антитела (например, антитела человека против PD-1, такого как MDX-1106).

Конкретные примеры антитела против CTLA4, используемого в способах согласно изобретению, представляют собой ипилимумаб, также известный как MDX-010 или MDX-101, антитело человека против CTLA4, предпочтительно вводимое в дозе приблизительно 10 мг/кг, и тремелимумаб, антитело человека против CTLA4, предпочтительно вводимое в дозе приблизительно 15 мг/кг. См. также статью Sammartino, et al., Clinical Kidney Journal, 3(2):135-137 (2010), опубликованную в интернете в декабре 2009 г.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения антагонист представляет собой небольшую молекулу. Ряд небольших органических соединений, как было показано, связывается с лигандом B7-1, предотвращая связывание с CTLA4 (см. Erbe et al., J. Biol. Chem., 277:7363-7368 (2002). Такие небольшие органические соединения могут быть введены отдельно или вместе с антителом против CTLA4 для снижения передачи ингибиторного сигнала Т-клеток.

3. Адъюванты и антигены

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции наночастиц используются в составе вакцинных композиций или в качестве адъювантов для стимуляции иммунной системы. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант нагружают в носитель для доставки, прикрепляют к его поверхности и/или заключают внутри него. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант вводят в сочетании с активным агентом, загруженным в носитель для доставки, прикрепленным к его поверхности и/или заключенным внутри него. Антиген и/или адъювант может быть свободным от частиц. Например, антиген и/или адъювант может быть растворимым.

Эти антигены также могут быть абсорбированы после введения. Например, так как NLGs могут абсорбировать опухолевые антигены in situ, то NLGs можно вводить с иммуностимулятором и/или химиотерапевтическим агентом, а затем абсорбировать опухолевый антиген после гибели опухолевых клеток. Пептид, белок и вакцины на основе ДНК могут быть использованы для индукции иммунитета при различных заболеваниях или состояниях. Клеточный иммунитет необходим для обнаружения и уничтожения инфицированных вирусом клеток. Большинство традиционных вакцин (например, вакцин на основе белков) может индуцировать только гуморальный иммунитет. Вакцины на основе ДНК представляют собой уникальное средство для вакцинации против вируса или паразита, потому что вакцина на основе ДНК может индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Кроме того, вакцины на основе ДНК являются потенциально более безопасными, чем традиционные вакцины. ДНК-вакцины являются относительно более стабильными и экономически более эффективными для получения и хранения. ДНК-вакцины состоят из двух основных компонентов, несущих ДНК (или носителей для доставки) и ДНК, кодирующих антигены. Носители ДНК защищают ДНК от деградации, и могут облегчить поступление ДНК в конкретные ткани или клетки и экспрессию на эффективном уровне.

a. Адъюванты

Примеры иммунологических адъювантов, которые могут быть связаны с частицами, включают, но не ограничиваются этим, лиганды TLR, лиганды рецептора лектина С-типа, лиганды NOD-подобных рецепторов, лиганды RLR и лиганды RAGE. Лиганды TLR могут включать липополисахарид (LPS) и его производные, а также липид А и его производные, включая, но не ограничиваясь этим, монофосфориллипид А (MPL), гликопиранозиллипид А, PET-липид А и 3-O-дезацил-4'-монофосфориллипид А. В конкретном варианте осуществления иммунологический адъювант представляет собой MPL. В другом варианте осуществления иммунологический адъювант представляет собой LPS. Лиганды TLR могут также включать, но не ограничиваются этим, лиганды TLR3 (например, полиинозиновая-полицитидиловая кислота (поли(I:C)), лиганды TLR7 (например, имиквимод и резиквимод) и лиганды TLR9.

b. Антигены

Антигены могут представлять собой пептиды, белки, полисахариды, сахариды, липиды, нуклеиновые кислоты или их сочетания. Антиген может быть получен из вируса, бактерии, паразита, растения, простейшего, грибка, ткани или трансформированной клетки, такой как раковая или лейкозная клетка, и может представлять собой целую клетку или ее иммуногенный компонент, например, компоненты клеточной стенки или ее молекулярные компоненты.

Подходящие антигены известны в данной области техники и доступны из коммерческих, правительственных и научных источников. В одном варианте осуществления антигены представляют собой целые инактивированные или ослабленные организмы. Эти организмы могут представлять собой инфекционные организмы, такие как вирусы, паразиты и бактерии. Эти организмы могут также представлять собой опухолевые клетки. Антигены могут быть очищенными или частично очищенными полипептидами, происходящими из опухолей или вирусных или бактериальных источников. Антигены могут представлять собой рекомбинантные полипептиды, полученные путем экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный антиген, в гетерологичной системе экспрессии. Антигены могут представлять собой ДНК, кодирующую всю или часть антигенного белка. ДНК может быть в виде ДНК вектора, такой как ДНК плазмиды.

Антигены могут быть предоставлены в виде отдельных антигенов или могут быть представлены в сочетании. Антигены также могут быть предоставлены в виде сложных смесей полипептидов или нуклеиновых кислот.

i. Вирусные антигены

Вирусный антиген может быть выделен из любого вируса, включая, но не ограничиваясь этим, вирус из любого из следующих семейств вирусов: Arenaviridae, Arterivirus, Astroviridae, Baculoviridae, Badnavirus, Barnaviridae, Birnaviridae, Bromoviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Capillovirus, Carlavirus, Caulimovirus, Circoviridae, Closterovirus, Comoviridae, Coronaviridae (например, Coronavirus, такой как вирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS)), Corticoviridae, Cystoviridae, Deltavirus, Dianthovirus, Enamovirus, Filoviridae (например, вирус Марбурга и вирус Эбола (например, штамм Заира, Рестона, Берега Слоновой Кости, или Судана)), Flaviviridae, (например, вирус гепатита С, вирус 1 лихорадки Денге, вирус 2 лихорадки Денге, вирус 3 лихорадки Денге и вирус 4 лихорадки Денге), Hepadnaviridae, Herpesviridae (например, вирус 1, 3, 4, 5 и 6 герпеса человека и цитомегаловирус), Hypoviridae, Iridoviridae, Leviviridae, Lipothrixviridae, Microviridae, Orthomyxoviridae (например, вирус гриппа А, и В, и С), Papovaviridae, Paramyxoviridae (например, вирус кори, эпидемического паротита и респираторно-синцитиальный вирус человека), Parvoviridae, Picornaviridae (например, полиовирус, риновирус, гепатовирус и афтовирусы), Poxviridae (например, вирус коровьей оспы и вирус оспы), Reoviridae (например, ротавирус), Retroviridae (например, лентивирус, такой как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)-1 и ВИЧ-2), Rhabdoviridae (например, вирус бешенства, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.), Togaviridae (например, вирус краснухи, вирус лихорадки Денге и т.д.) и Totiviridae. Подходящие вирусные антигены включают также весь или часть белка М Денге, белка Е Денге, DlNSl Денге, D1NS2 Денге и D1NS3 Денге.

Вирусные антигены могут происходить от конкретного штамма, такого как вирус папилломы, вирус герпеса, т.е. вирус простого герпеса 1 и 2; вирус гепатита, например, вирус гепатита А (HAV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус дельта-гепатита D (HDV), вирус гепатита Е (HEV) и вирус гепатита G (HGV), вирусы клещевого энцефалита; вирусы парагриппа, ветряной оспы, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра, ротавирус, риновирус, аденовирус, вирусы Коксаки, конского энцефалита, японского энцефалита, желтой лихорадки, лихорадки долины Рифт и лимфоцитарного хореоменингита.

ii. Бактериальные антигены

Бактериальные антигены могут происходить от любых бактерий, включая, но не ограничиваясь этим, Actinomyces, Anabaena, Bacillus, Bacteroides, Bdellovibrio, Bordetella, Borrelia, Campylobacter, Caulobacter, Chlamydia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Cytophaga, Deinococcus, Escherichia, Francisella, Halobacterium, Heliobacter, Haemophilus, Hemophilus influenza type В (HIB), Hyphomicrobium, Legionella, Leptspirosis, Listeria, Meningococcus A, B и C, Methanobacterium, Micrococcus, Myobacterium, Mycoplasma, Myxococcus, Neisseria, Nitrobacter, Oscillatoria, Prochloron, Proteus, Pseudomonas, Phodospirillum, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Spirillum, Spirochaeta, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Thiobacillus, и Treponema, Vibrio и Yersinia.

iii. Антигены паразитов

Антигены паразитов могут быть получены из паразитов, например, но не ограничиваясь этим, антиген, полученный из Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis и Schistosoma mansoni. Они включают антигены Sporozoan, антигены Plasmodian, такие как все или часть белка Circumsporozoite, белка поверхности Sporozoite, антигена печеночной стадии, белка, связанного с апикальной мембраной, или белка поверхности Merozoite.

iv. Аллергены и антигены окружающей среды

Антиген может представлять собой аллерген или антиген окружающей среды, такой как, но не ограничиваясь этим, антиген, происходящий от природных аллергенов, таких как аллергены пыльцы (аллергены пыльцы деревьев, лекарственных растений, сорняков и травы), аллергены насекомых (вдыхаемые, аллергены слюны и яда), аллергены шерсти и перхоти животных и пищевые аллергены. Важные аллергены пыльцы деревьев, трав и лекарственных растений происходят из таксономических отрядов Fagales, Oleales, Pinales и platanaceae включая среди прочего березу (Betula), ольху (Alnus), орешник (Corylus), граб (Carpinus) и оливковое дерево (Olea), кедр (Cryptomeriaand Juniperus), платан (Platanus), из отряда Poales, включая, т.е. травы родов Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale и Sorghum, из отрядов Asterales и Urticales, включая среди прочего лекарственные растения родов Ambrosia, Artemisia и Parietaria. Другие аллергические антигены, которые могут быть использованы, включают аллергены клещей домашней пыли рода Dermatophagoides и Euroglyphus, амбарных клещей, например, Lepidoglyphys, Glycyphagus и Tyrophagus, аллергенов тараканов, мошек и блох, например, Blatella, Periplaneta, Chironomus и Ctenocepphalides, аллергены млекопитающих, таких как кошки, собаки и лошади, птиц, ядовитые аллергены, включая аллергены, происходящие от жалящих или кусающих насекомых, таких как насекомые таксономического отряда Hymenoptera, включая пчел (надсемейство Apidae), ос (надсемейство Vespidea), и муравьев (надсемейство Formicoidae). Тем не менее, другие аллергенные антигены, которые могут быть использованы, включают ингаляционные аллергены из грибов, таких как грибы родов Alternaria и Cladosporium.

v. Опухолевые антигены

Антиген может представлять собой опухолевый антиген, включая ассоциированный с опухолью или специфичный для опухоли антиген, такой как, но не ограничиваясь этим, альфа-актинин-4, гибридный белок Bcr-Abl, Casp-8, бета-катенин, cdc27, cdk4, cdkn2A, coa-1, гибридный белок dek-can, EF2, гибридный белок ETV6-AML1, гибридный белок LDLR-фикозилтрансферазу AS, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, mum-1, 2 и 3, нео-PAP, миозин класса I, OS-9, гибридный белок pml-RARa, PTPRK, K-ras, N-ras, триозфосфатизомеразу, Bage-1, Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, Mage-Al,2,3,4,6,10,12, Mage-C2, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2 и Trp2-Int2, MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), тирозиназу, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5(58), CEA, RAGE, NY-ESO (LAGE), SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/Neu, BCR-ABL, Е2А-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, антигены вируса Эпштейна-Барра, EBNA, антигены Е6 и Е7 вируса папилломы человека (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, С-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17,1, NuMa, K-ras, β-катенин, CDK4, Mum-1, pl6, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, теломеразу, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, а-фетопротеин, 13HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29/BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/КР1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, МА-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-СО-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 связывающий белок/белок, связанный с циклофилином C), TAAL6, TAG72, TLP и TPS.

4. Другие активные агенты

Другие активные агенты, которые могут быть загружены в носитель для доставки, прикреплены к его поверхности и/или заключены в него, или введены в сочетании с композицией наночастиц, включают терапевтические, питательные, диагностические и профилактические агенты. Активные агенты могут представлять собой низкомолекулярные активные агенты или биологические макромолекулы, такие как белки, полипептиды или нуклеиновые кислоты. Подходящие низкомолекулярные активные агенты включают органические и металлоорганические соединения. Низкомолекулярные активные агенты могут быть гидрофильными, гидрофобными или амфифильными соединениями.

Примеры диагностических агентов включают парамагнитные молекулы, флуоресцентные соединения, магнитные молекулы и радионуклиды, агенты рентгеновской визуализации и контрастирующие агенты.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения носитель для доставки включает один или более противораковых агентов. Типичные противораковые агенты включают, но не ограничиваются этим, алкилирующие агенты (такие как цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, мехлорэтамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, дакарбазин, ломустин, кармустин, прокарбазин, хлорамбуцил и ифосфамид), антиметаболиты (например, фторурацил (5-FU), гемцитабин, метотрексат, цитозинарабинозид, флударабин и флоксуридин), антимитотики (включая таксаны, такие как паклитаксел и децетаксел и алкалоиды барвинка, такие как винкристин, винбластин, винорелбин и виндезин), антрациклины (включая доксорубицин, даунорубицин, вальрубицин, идаруцибин и эпирубицин, а также актиномицины, такие как актиномицин D), цитотоксические антибиотики (включая митомицин, пликамицин и блеомицин), ингибиторы топоизомеразы (включая камптотецины, такие как камптотецин, иринотекан и топотекан, а также производные эпиподофиллотоксинов, такие как амсакрин, этопозид, этопозида фосфат и тенипозид), антитела к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF), такие как бевацизумаб (AVASTIN®), другие соединения против VEGF; талидомид (THALOMID®) и его производные, такие как леналидомид (REVLIMID®); эндостатин; ангиостатин; ингибиторы рецепторных тирозинкиназ (RTK), такие как сунитиниб (SUTENT®); ингибиторы тирозинкиназ, такие как сорафениб (Nexavar®), эрлотиниб (Tarceva®), пазопаниб, акситиниб и лапатиниб; ингибиторы трансформирующего фактора роста-α или трансформирующего фактора роста-β и антитела против рецептора эпидермального фактора роста, такие как панитумумаб (VECTIBIX®) и цетуксимаб (ERBITUX®).

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, в частности, для лечения рака, один или несколько активных агентов могут представлять собой химиотерапевтический агент, который обладает свойствами иммунологической сигнализации.

5. Направляющие части

Одна или несколько направляющих частей (также называемых в настоящем документе как направляющие молекулы) могут быть загружены в носитель для доставки, прикреплены к его поверхности и/или заключены внутри него. Предпочтительно направляющая часть располагается на внешней поверхности носителя для доставки.

Иллюстративные направляющие молекулы включают белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, липиды, сахариды или полисахариды, которые связываются с одной или более мишенями, связанными с органами, тканями, клетками или внеклеточным матриксом, или с конкретным типом опухоли или инфицированной клетки. Степень специфичности, с которой носители для доставки направляются, можно модулировать посредством выбора направляющей молекулы с подходящей аффинностью и специфичностью. Например, антитела очень специфичны. Они могут быть поликлональными, моноклональными, являться фрагментами, быть рекомбинантными или одноцепочечными, многие из них являются коммерчески доступными или могут быть легко получены с использованием стандартных методов. Специфичные для Т-клеток молекулы и антигены, которые связываются антигенпрезентирующими клетками, а также молекулы, направленные на опухоль, могут быть связаны с поверхностью нанолипогеля и/или с молекулой-хозяином. Направляющие молекулы могут быть конъюгированы с концом одной или более цепей ПЭГ, присутствующих на поверхности частицы.

В некоторых вариантах осуществления направляющая часть представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически узнает опухолевый маркер, который присутствует исключительно или в повышенных количествах на злокачественной клетке (например, опухолевый антиген). Подходящие направляющие молекулы, которые могут быть использованы для направления наночастиц к представляющим интерес клеткам и тканям, а также способы конъюгации направляющих молекул с наночастицами известны в данной области техники. См., например, Ruoslahti, et al. Nat. Rev. Cancer, 2:83-90 (2002). Типичные опухолевые антигены, которые могут быть мишенью антигенсвязывающих молекул, таких как антитела, рассмотрены выше в отношении антигенов вакцин.

Направляющие молекулы могут также включать нейропилины и эндотелиальные направляющие молекулы, интегрины, селектины и молекулы адгезии.

В некоторых вариантах осуществления направляющая часть направляет частицу к антигенпрезентирующим клеткам (APCs), и, в частности, к подклассу APCs, известному как дендритные клетки. Дендритные клетки экспрессируют ряд рецепторов клеточной поверхности, которые могут опосредовать эндоцитоз. Направление экзогенных антигенов к молекулам поверхности, связанным с интернализацией, на антигенпрезентирующих клетках, присутствующих системно, облегчает захват частицы и может преодолеть главную ограничивающую скорость стадию при лечении.

Направляющие к дендритным клеткам молекулы включают моноклональные или поликлональные антитела или их фрагменты, которые узнают и связываются с эпитопами, расположенными на поверхности дендритных клеток. Направляющие к дендритным клеткам молекулы также включают лиганды, которые связываются с рецептором клеточной поверхности на дендритных клетках. Один такой рецептор, лектин DEC-205, использован in vitro и на мышах для бустерной стимуляции на 2-4 порядка как гуморального (на основе антител), так и клеточного (CD8 Т-клеточного) ответов (Hawiger, et al., J. Exp. Med., 194(6):769-79 (2001); Bonifaz, et al., J. Exp. Med., 196(12):1627-38 (2002); Bonifaz, et al., J. Exp. Med., 199(6):815-24 (2004)). В этих экспериментах антигены соединяли с тяжелой цепью антитела против DEC205, и рекомбинантную молекулу антитела использовали для иммунизации.

Другие разнообразные молекулы рецептор-опосредованного эндоцитоза, включая специфичный для маннозы лектин (рецептор маннозы) и рецепторы Fc-области IgG, также являются мишенью в этом случае со сходным повышением эффективности презентации антигена. Другие подходящие рецепторы, которые могут быть мишенями, включают, но не ограничиваются этим, DC-SIGN, 33D1, SIGLEC-Н, DCIR, CD11с, рецепторы белков теплового шока и рецепторы-мусорщики.

Другие рецепторы, которые могут быть мишенями, включают toll-подобные рецепторы (TLRs). TLRs узнают и связываются с молекулярным паттерном, ассоциированным с патогенами (PAMPs). PAMPs направлены на TLR на поверхности дендритных клеток и подают сигнал к интернализации, в результате чего потенциально увеличивается захват антигена DC, созревание и стимулирующая способность Т-клеток. PAMPs, конъюгированные с поверхностью частицы или совместно инкапсулированные, включают неметилированные CpG ДНК (бактериальной), двухцепочечную РНК (вирусную), липополисахарид (бактериальный), пептидогликан (бактериальный), липоарабиноманнин (бактериальный), зимозан (дрожжей), микоплазменные липопротеины, такие как MALP-2 (бактериальный), флагеллин (бактериальный), поли(инозиновую-цитидиловую) кислоту (бактериальную), липотейхоевую кислоту (бактериальную) или имидазохинолины (синтетические).

Направляющие молекулы могут быть ковалентно связаны с носителями для доставки с использованием различных способов, известных в данной области техники. В предпочтительных вариантах осуществления направляющую часть присоединяют к носителю для доставки путем ПЭГилирования или с помощью мостика биотин-авидин.

a. Агонист CD40

В конкретном варианте осуществления направляющая часть направлена на CD40. Часть может представлять собой агонист CD40. Молекула клеточной поверхности CD40 является членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей и широко экспрессируется иммунными, гематопоэтическими, сосудистыми, эпителиальными и другими клетками, включая широкий спектр опухолевых клеток, Vonderheide, Clin Cancer Res, 13(4):1083-1088 (2007). В качестве потенциальной мишени для терапии рака CD40 может опосредовать регрессию опухоли посредством как непрямого влияния на активацию иммунной системы, так и путем прямого цитотоксического действия на опухоль, приводя к механизму действия агонистов CD40 по типу «два-в-одном». Агонисты CD40 известны в данной области техники и рассмотрены в Vonderheide, Clin Cancer Res, 13(4):1083-1088 (2007). Иллюстративные агонисты включают, но не ограничиваются этим, рекомбинантный CD40L (рекомбинантный тример человека), CD-870, 893 (IgG2 mAb полностью человеческое), SGN-40 (гуманизированное IgGl) и HCD 122 (IgG1 mAb полностью человеческое). Растворимые агонистические антитела против CD40, как показано, заменяют Т-клетки хелперы, предоставляемые CD4+ лимфоцитами, в мышиных моделях иммунитета, опосредованного Т-клетками (Khalil, et al., Update Cancer Ther., 2:61-65 (2007)). В предпочтительном варианте осуществления направляющая часть представляет собой агонистическое антитело против CD40, лиганд CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент.

b. Лиганд интегрина

В другом варианте осуществления направляющая часть представляет собой лиганд интегрина. Исследования показывают, что интегрины гиперэкспрессируется на поверхности опухолевых клеток и, таким образом, могут служить в качестве маркера, который характеризуется различиями в опухолевых клетками и нормальных клетках. Некоторые интегрины также активируют TGF-β через внеклеточный путь. После того, как латентный TGF-β высвобождается из опухолевой клетки, он связывается с интегрином на поверхности опухолевой клетки, что приводит к активации латентного TGF-β. Повышенные концентрации TGF-β в микроокружении опухоли поддерживают иммуносупрессию и привлекают регуляторные Т-клетки к окружению опухоли.

Пептид RGD может выполнять двойную функцию: он не только является типичным лигандом, направленным на интегрин (Ruoslahti E., et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12:697-715 (1996)), но также служит в качестве иммунного сигнала опасности, активируя APCs (Altincicek, et al., Biol Chem., 390,1303-11 (2009)). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления пептид RGD загружается в носитель для доставки, прикрепляется к его поверхности и/или заключается внутри него.

с. Т-клеточный рецептор, который узнает антиген p53

В конкретном варианте осуществления направляющая часть представляет собой Т-клеточный рецептор (TCR), который узнает антиген р53 в контексте MHC человека. Рекомбинантные белки Т-клеточного рецептора, происходящие от бактериальных, эукариотных или дрожжевых клеток, включают Т-клеточные рецепторы, состоящие из альфа-, бета-цепей или гамма/дельта-цепей (α/β TCR или γ/δ TCRs). Например, консервативная последовательность полноразмерных эктодоменов, происходящая от TCR α (TCRAR2 5ʹCCC0GGCCACTTTCAGGAGGAGG-3ʹ) (SEQ ID NO:1) и β (TCRBR 5ʹ-GTCCTGTCTGCAC-CATCCTC-3ʹ) (SEQ ID NO:2).

d. IL-15/IL-15Rα

В другом варианте осуществления направляющая часть представляет собой комплекс IL-15/IL-15Rα. Интерлейкин-15 (IL-15) представляет собой цитокин, который использует определенные субъединицы рецептора совместно с IL-2, и, таким образом, имеет некоторые перекрывающиеся механизмы действия. IL-15 экспрессируется дендритными клетками и обеспечивает решающий сигнал для пролиферации и примирования естественных клеток-киллеров (NK). Соответственно, комплекс IL-15/IL-15Rα может быть использован для направления композиций наночастиц, например, на природные клетки-киллеры (NK).

IL-15 человека: MRISKPHLRS ISIQCYLCLL LNSHFLTEAG IHVFILGCFS AGLPKTEANWVNVISDLKKI EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISLESGDASIHDT VENLIILANN SLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQSFVHIVQMFIN TS (SEQ ID NO:3)

Рецептор IL-15 человека: MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL (SEQ ID NO:4)

C. Молекулы-хозяева

Молекулы-хозяева представляют собой молекулы или материалы, которые обратимо связываются с активным агентом с образованием комплекса. В силу своей способности обратимо образовывать комплексы с активными агентами, молекулы-хозяева могут функционировать для контроля высвобождения комплексированного активного агента in vivo.

В некоторых случаях молекула-хозяин представляет собой молекулу, которая образует комплекс включения с активным агентом. Комплексы включения образуются, когда активный агент (т.е. гость) или часть активного агента вставляется в полость другой молекулы, группы молекул или материала (т.е. в хозяина). Как правило, молекула-гость связывается с молекулой-хозяином, не затрагивая остов или структуру хозяина. Например, в случае комплексов включения размер и форма имеющейся полости в молекуле-хозяине остаются по существу неизменными вследствие образования комплекса.

Молекула-хозяин может представлять собой небольшую молекулу, олигомер, полимер или их сочетание. Иллюстративные хозяева включают полисахариды, такие как амилозы, циклодекстрины и другие циклические или спиральные соединения, содержащие множество колец альдозы, например, соединения, образующиеся в результате 1,4 и 1,6 связей моносахаридов (таких как глюкоза, фруктоза и галактоза) и дисахаридов (таких как сахароза, мальтоза и лактоза). Другие примеры соединений-хозяев включают криптанды, криптофаны, кавитанды, краун-эфиры, дендримеры, ионообменные смолы, каликсарены, валиномицины, нигерицины, катенаны, поликатенаны, карцеранды, кукурбитурилы и сферанды.

В других вариантах осуществления органические соединения или материалы, являющиеся хозяевами, включают углеродные нанотрубки, фуллерены и/или материалы-хозяева на основе графемы. Углеродные нанотрубки (CNTs) представляют собой аллотропы углерода с цилиндрической наноструктурой. Нанотрубки являются членами структурного семейства фуллеренов, которое включает также сферические бакминстер-фуллерены, и концы нанотрубки могут быть кепированы полусферами со структурами бакминстер-фуллеренов. Их название происходит от их длинной полой структуры со стенками, образованными листами углерода толщиной в один атом, называемыми графеном. Эти листы прокатываются при специфических и дискретных («хиральных») углах, и сочетание прокатного угла и радиуса определяет свойства нанотрубки. Нанотрубки могут быть классифицированы как однослойные нанотрубки (SWNTs) и многослойные нанотрубки (MWNTs). Нанотрубки и/или фуллерены могут служить в качестве хозяев, например, путем инкапсулирования или захвата материала, который предназначен для доставки (т.е. гостя), в трубку или в фуллерены. В качестве альтернативы, внешняя часть и/или внутренняя область трубок и/или фуллеренов может быть функционализирована функциональными группами, которые могут образовывать комплекс с гостем, предназначенным для доставки. Комплексирование включает, но не ограничивается этим, ионные взаимодействия, водородные связи, взаимодействия Ван-дер-Ваальса, и pi-pi взаимодействия, такие как pi-укладка.

Графены также представляют собой аллотроп углерода. Структура графена представляет собой плоский лист толщиной в один атом sp²-связанных атомов углерода, которые плотно упакованы в сотовую кристаллическую решетку. Графен является базисным структурным элементом некоторых углеродных аллотропов, включая графит, уголь, углеродные нанотрубки и фуллерены. Гость, подлежащий доставке, может быть связан и/или комплексирован с графеном или функционализован графеном, как описано выше для нанотрубок и фуллеренов.

Вещество хозяина может также представлять собой неорганическое веществ, включая, но не ограничиваясь этим, неорганические фосфаты и кремнезем.

Подходящих молекул-хозяев обычно выбирают для включения в нанолипогели или наночастицы с точки зрения идентичности активного агента(ов), подлежащего доставке, и желаемого профиля высвобождения лекарства. Для того чтобы образовывать комплекс с активным агентом, подлежащим доставке, молекулу-хозяина, как правило, выбирают так, чтобы она была комплементарна активному агенту и с точки зрения стерических свойств (размера) и электронных свойств (заряд и полярность). Например, в случае молекул-хозяев, которые образуют комплексы включения с активным агентом, подлежащем доставке, молекула-хозяин обычно обладает полостью подходящего размера для включения активного агента. Кроме того, молекула-хозяин обычно обладает полостью подходящей гидрофобности/гидрофильности для стимуляции образования комплекса с активным агентом. Сила взаимодействия гость-хозяин будет влиять на профиль высвобождения лекарственного активного агента из нанолипогеля или наночастицы, причем более сильное взаимодействие гость-хозяин обычно дает более длительное высвобождение лекарственного средства.

Как правило, молекулы-хозяева диспергированы в полимерном матриксе, который формирует ядро нанолипогеля или наночастиц. В некоторых случаях одна или более молекул-хозяев ковалентно связаны с полимерным матриксом. Например, молекулы-хозяева могут быть функционализированы одной или более боковыми реакционноспособными функциональными группами, которые взаимодействуют с полимерным матриксом. В конкретных вариантах осуществления молекулы-хозяева содержат одну или более боковых реакционноспособных функциональных групп, которые взаимодействуют с полимерным матриксом, поперечно сшивая полимерный матрикс. Примеры подходящих активных функциональных групп включают метакрилаты, акрилаты, виниловые группы, эпоксиды, тиираны, азиды и алкины.

В некоторых вариантах осуществления молекула-хозяин представляет собой циклодекстрин. Циклодекстрины представляют собой циклические олигосахариды, содержащие шесть (α-циклодекстрин), семь (β-циклодекстрин), восемь (γ-циклодекстрин), или более α-(l,4)-связанных остатков глюкозы. Гидроксильные группы циклодекстринов ориентированы к внешней стороне кольца, в то время как кислород гликозидов и два кольца необмениваемых атомов водорода направлены внутрь полости. В результате циклодекстрины обладают гидрофобной внутренней полостью в сочетании с гидрофильной внешней. При объединении с гидрофобным активным агентом активный агент (т.е. гость) вставляется в гидрофобную внутреннюю часть циклодекстрина (т.е. хозяина).

Циклодекстрин может быть химически модифицирован таким образом, что некоторые или все первичные или вторичные гидроксильные группы макроцикла, или оба типа функционализируются одной или более боковыми группами. Боковые группы могут представлять собой химически активные функциональные группы, которые могут вступать в реакцию с полимерным матриксом, таким как метакрилаты, акрилаты, виниловые группы, эпоксиды, тиираны, азиды, алкины и их сочетания. Боковые группы могут также служить для модификации растворимости циклодекстрина. Примеры групп такого типа включают сульфинил, сульфонил, фосфат, ацил и C₁-С₁₂-алкильные группы, необязательно замещенные одной или более (например, 1, 2, 3 или 4) гидроксильными, карбоксильными, карбонильными, ацильными группами, окси- и оксогруппами. Способы модификации этих спиртовых остатков известны в данной области техники, и многие производные циклодекстрина являются коммерчески доступными.

Примеры подходящих циклодекстринов включают α-циклодекстрин; β-циклодекстрин; γ-циклодекстрин; метил-α-циклодекстрин; метил-β-циклодекстрин; метил-γ-циклодекстрин; этил-β-циклодекстрин; бутил-α-циклодекстрин; бутил-β-циклодекстрин; бутил-γ-циклодекстрин; пентил-γ-циклодекстрин; гидроксиэтил-β-циклодекстрин; гидроксиэтил-γ-циклодекстрин; 2-гидроксипропил-α-циклодекстрин; 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин; 2-гидроксипропил-γ-циклодекстрин; 2- гидроксибутил-β-циклодекстрин; ацетил-α-циклодекстрин; ацетил-β-циклодекстрин; ацетил-γ-циклодекстрин; пропионил-β-циклодекстрин; бутирил-β-циклодекстрин; сукцинил-α-циклодекстрин; сукцинил-β-циклодекстрин; сукцинил-γ-циклодекстрин; бензоил-β-циклодекстрин; пальмитил-β-циклодекстрин; толуолсульфонил-β-циклодекстрин; ацетилметил-β-циклодекстрин; ацетилбутил-β-циклодекстрин; глюкозил-α-циклодекстрин; глюкозил-β-циклодекстрин; глюкозил-γ-циклодекстрин; мальтозил-α-циклодекстрин; мальтозил-β-циклодекстрин; мальтозил-γ-циклодекстрин; карбоксиметиловый эфир α-циклодекстрина; карбоксиметиловый эфир β-циклодекстрина; карбоксиметиловый эфир γ-циклодекстрина; карбоксиметилэтил-β-циклодекстрин; фосфатный эфир α-циклодекстрина; фосфатный эфир β-циклодекстрина; фосфатный эфир γ-циклодекстрина; 3-триметиламмоний-2-гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир β-циклодекстрина; карбоксиметил-α-циклодекстрин; карбоксиметил-β-циклодекстрин; карбоксиметил-γ-циклодекстрин и их сочетания.

Предпочтительные циклодекстрины включают α-циклодекстрины, β-циклодекстрины и γ-циклодекстрины, функционализированные одной или более боковыми акрилатными или метакрилатными группами. В конкретном варианте осуществления изобретения молекула-хозяин представляет собой β-циклодекстрин, функционализированный множественными метакрилатными группами. Пример молекулы-хозяина этого типа проиллюстрирован ниже, где R представляет собой C₁-C₆-алкильную группу.

В качестве еще одного примера, молекула-хозяин может также представлять собой вещество, которое временно связывается с активным агентом посредством ионных взаимодействий. Например, обычные ионообменные смолы, известные в данной области техники как используемые в контролируемом высвобождении лекарств, могут служить в качестве молекул-хозяев. См., например, Chen, et al. "Evaluation of ion-exchange microspheres as carriers for the anticancer drug doxorubicin: in vitro studies." J. Pharm. Pharmacol. 44(3):211-215 (1992) and Farag, et al. "Rate of release of organic carboxylic acids from ion exchange resins" J. Pharm. Sci. 77(10):872-875(1988).

В качестве иллюстрации, когда активный агент, подлежащий доставке, представляет собой катионные частицы, подходящие ионообменные смолы могут включать группу сульфоновой кислоты (или модифицированную группу сульфоновой кислоты) или необязательно модифицированную группу карбоновой кислоты на физиологически приемлемом каркасе. Сходно, когда активный агент представляет собой анионные частицы, подходящие ионообменные смолы могут включать группы на основе аминов (например, триметиламина для сильного взаимодействия, или диметилэтаноламина для более слабого взаимодействия). Катионные полимеры, такие как полиэтиленимин (PEI), могут функционировать в качестве молекул-хозяев для сложных олигонуклеотиды, такие как значение миРНК.

В других случаях молекула-хозяин представляет собой дендример, такой как дендример поли(амидоамин) (PAMAM). Катионные и анионные дендримеры могут функционировать в качестве веществ хозяина путем ионного механизма связывания с активными агентами, как описано выше. Кроме того, дендримеры среднего размера, такие как третье и четвертое поколение дендримеров PAMAM, могут иметь внутренние пустоты пространства, которые могут вместить активные агенты, например, путем комплексообразования нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах осуществления молекула-хозяин представляет собой дендример, конъюгированный с циклодекстрином. В некоторых вариантах осуществления циклодекстрин(ы) защищает первичные амины дендримера. Подходящие дендримеры и циклодекстрины описаны выше. Немодифицированный дендример (т.е. дендример PAMAM 4 поколения (G4)) эмпирически лучше при эндосомном разрушении, чем дендример, конъюгированный с циклодекстрином (CD) (см. примеры ниже). Не будучи связанными какой-либо теорией, считается, что концевые аминогруппы дендримеров PAMAM обеспечивают буферирование эндосом и разрушают эндосомы в результате эффекта протонной губки. Соответственно, увеличение CD приводит к уменьшению разрушения эндосом. Как обсуждается в приведенных ниже примерах, различные сочетания дендримеров и циклодекстринов может быть использовано для модуляции эффективности трансфекции и уровня разрушения эндосом в клетке.

Предпочтительно, чтобы одна или более молекул-хозяев присутствовала в количестве от приблизительно 0,1% до приблизительно 40% масс./масс. от полимерного матрикса, более предпочтительно от приблизительно 0,1% до приблизительно 25% масс./масс. от общего состава.

III. Методы получения, нагрузки и фармацевтические композиции

А. Методы получения и нагрузки

1. Нанолипогели

Нанолипогель представляет собой наночастицу, которая сочетает в себе преимущества как липосом, так и частиц на основе полимеров для поддерживаемой доставки нуклеиновых кислот, белков и/или малых молекул. Нанолипогель может быть в форме сфер, дисков, стержней или других геометрических форм с различными соотношениями сторон. Наносфера может быть более крупной, т.е. представлять собой микрочастицу. Нанолипогель, как правило, образуется из синтетических или природных полимеров, способных к инкапсулированию агентов путем дистанционной нагрузки и с настраиваемыми свойствами, так чтобы облегчить различные скорости высвобождения. Скорости высвобождения модулируются путем варьирования отношения полимера к липиду от 0,05 до 5,0, более предпочтительно от 0,5 до 1,5.

Нанолипогели создаются для нагрузки агентами либо до, либо во время, либо после образования и затем функционируют как носители с контролируемым высвобождением агентов. Нанолипогель может быть нагружен более чем одним агентом, так чтобы последовательно достигалось контролируемое высвобождение множества агентов.

Нанолипогель нагружается одним или более первыми агентами в процессе образования и одним или более вторыми агентами после образования с помощью процесса регидратации нанолипогеля в присутствии вторых агентов. Например, нанолипогель нагружается молекулой, которая служит в качестве адъюванта, и в нанолипогель после этого заключается один или более антигенов-мишеней после образования для контролируемого высвобождения адъюванта вместе с антигенами.

2. Полимерное наночастицы

a. Эмульсионный метод

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полимерную наночастицу получают с использованием метода испарения легколетучего растворителя в эмульсионной среде. Например, полимерное вещество растворяют в органическом растворителе, не смешивающемся с водой, и смешивают с раствором лекарственного средства или сочетания растворов лекарственных средств. Органический растворитель, не смешивающийся с водой, может представлять собой, но не ограничиваться этим, одно или более из следующего: хлороформ, дихлорметан и ацилацетат. Лекарство может быть растворено в одном из следующего, но не ограничиваться этим: ацетоне, этаноле, метаноле, изопропиловом спирте, ацетонитриле и диметилсульфоксиде (ДМСО). Водный раствор затем добавляют в полученный раствор смеси с получением эмульсионного раствора путем эмульгирования. Метод эмульгирования может представлять собой, но не ограничиваться этим, обработку образца ультразвуком или гомогенизацию с помощью гомогенизатора. Пептиды или флуорофоры, или лекарственные средства могут быть связаны с поверхностью полимерного матрикса частицы, инкапсулированы в него, окружены им и/или распределены в нем.

b. Метод Нанопреципитации

В другом варианте осуществления настоящего изобретения полимерные наночастицы получают с использованием способов нанопреципитации или устройств микрофлуидизации. Полимерное вещество смешивают с лекарством или с сочетаниями лекарств в смешивающемся с водой органическом растворителе.

Полученный в результате раствор смеси затем добавляют к водному раствору с получением раствора наночастиц.

c. Иллюстративные методы получения

Частицы могут быть получены из различных полимеров с использованием различных методов, которые могут быть выбраны на основе критериев, включающих полимерную композицию частицы, агент(ы), нагружаемые в частицу или связанные с ней, в соответствии с методом, который известен в данной области техники. Примеры методов представлены ниже.

a. Выпаривание растворителя. В этом способе полимер растворяют в летучем органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Лекарство (либо растворимое, либо диспергированное в виде мелких частиц), добавляют к раствору, и смесь суспендируют в водном растворе, который содержит поверхностно-активное вещество, такое как поли(виниловый спирт). Полученную эмульсию перемешивают до тех пор, пока большая часть органического растворителя не выпарится, оставляя твердые частицы. Полученные частицы промывают водой и сушат в течение ночи в лиофилизаторе. Этим способом могут быть получены частицы с различными размерами (0,5-1000 микрон) и морфологией. Этот метод пригоден для относительно стабильных полимеров, таких как сложные полиэфиры и полистирол.

Тем не менее, лабильные полимеры, такие как полиангидриды, могут деградировать в процессе получения из-за присутствия воды. Для этих полимеров более пригодны следующие два метода, которые выполняются в полностью безводных органических растворителях.

b. Микроинкапсуляция расплавом полимера. В этом способе полимер сначала расплавляется, а затем смешивается с твердыми частицами. Смесь суспендируют в несмешивающемся с водой растворителе (например, силиконовом масле) и при непрерывном перемешивании нагревают до температуры на 5°С выше точки плавления полимера. Как только эмульсия стабилизируется, она охлаждается до тех пор, пока частицы полимера не затвердевают. Полученные частицы промывают путем декантации с петролейным эфиром с получением свободно текучего порошка. С помощью этого метода получают частицы с размерами от 0,5 до 1000 микрон. Внешние поверхности сфер, полученных с помощью этого метода, как правило, являются гладкими и плотными. Этот метод используется для получения частиц, изготовленных из сложных полиэфиров и полиангидридов. Тем не менее, этот способ ограничен полимерами с молекулярной массой между 1000-50000.

c. Удаление растворителя. Этот метод в первую очередь предназначен для полиангидридов. В этом методе лекарственное средство диспергируют или растворяют в растворе выбранного полимера в летучем органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Эту смесь суспендируют при перемешивании в органическом масле (например, в силиконовом масле) с образованием эмульсии. В отличие от выпаривания растворителя этот способ может быть использован для получения частиц из полимеров с высокими температурами плавления и различной молекулярной массой. С помощью этого метода могут быть получены частицы с размером в диапазоне 1-300 микрон. Внешняя морфология сфер, полученных с помощью этого метода, существенно зависит от типа используемого полимера.

d. Высушивание при распылении. В этом методе полимер растворяют в органическом растворителе. Известное количество активного лекарственного средства суспендируют (нерастворимые лекарства) или сорастворяют (растворимые лекарства) в растворе полимера. Раствор или дисперсию затем высушивают при распылении. Типичные параметры метода для минираспылительной сушки (Buchi), являются следующими: концентрация полимера =0,04 г/мл, температура на входе =-24°С, температура на выходе =13-15°С, установочное положение аспиратора =15, установка насоса =10 мл/мин, поток распыления=600 нл/час и диаметр форсунки =0,5 мм. Получают микрочастицы в диапазоне между 1-10 микрон с морфологией, которая зависит от типа используемого полимера.

е. Частицы гидрогеля. Частицы, созданные из полимеров типа геля, такого как альгинат, получают с помощью традиционных методов ионного гелеобразования. Полимеры сначала растворяют в водном растворе, смешивают с сульфатом бария или каким-либо биологически активным агентом, и затем экструдируют через устройство для образования микрокапель, в котором в некоторых случаях используют поток газообразного азота для разбивания капель. Медленно перемешиваемую (приблизительно 100-170 об/мин) заряженную ионами баню помещают ниже экструзионного устройства, чтобы поймать образующиеся микрокапли. Частицы оставляют инкубироваться в бане в течение от двадцати до тридцати минут, с тем, чтобы обеспечить достаточное количество времени для возникновения геля. Размер частиц контролируют путем использования экструдеров различного размера или с помощью изменения скоростей потока раствора либо газообразного азота, либо полимера. Частицы хитозана могут быть получены путем растворения полимера в кислом растворе и поперечной сшивки его с триполифосфатом. Частицы карбоксиметилцеллюлозы (CMC) могут быть получены путем растворения полимера в кислом растворе и осаждения частиц ионами свинца. В случае отрицательно заряженных полимеров (например, альгината, CMC) положительно заряженные лиганды (например, полилизин, полиэтиленимин) различной молекулярной массы могут быть присоединены с помощью ионных сил.

B. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут быть получены для введения парентеральным (внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным (в./в.) способом или путем подкожной инъекции), покапельным путем или в виде депо, при составлении в лекарственных формах, подходящих для каждого способа введения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции вводят системно, например, путем внутривенного или внутрибрюшинного введения, в количестве, эффективном для доставки композиций к клеткам-мишеням. Другие пути включают покапельное введение или введение через слизистую оболочку.

В некоторых вариантах осуществления композиции вводят местно, например, путем инъекции непосредственно в участок, подлежащий лечению. В некоторых вариантах осуществления композиции инъецируют или иным образом вводят непосредственно в одну или более опухоли или пораженные ткани. Как правило, местная инъекция вызывает повышенную локальную концентрацию композиций, которая выше, чем концентрация, которая может быть достигнута с помощью системного введения. В некоторых вариантах осуществления композиции доставляются локально в соответствующие клетки с помощью катетера или шприца. Другие средства доставки таких композиций в клетки местно включают использование инфузионных насосов или включение композиций в полимерные имплантаты, которые могут вызывать замедленное высвобождение композиций в непосредственной близости от имплантата.

Композиции могут быть предоставлены клеткам либо непосредственно, например, путем контактирования их с клеткой, либо непрямо, например, в результате действия на какой-либо биологический процесс. Например, композиции могут быть составлены в физиологически приемлемом носителе или наполнителе, и их вводят в ткань или жидкость, окружающей клетку. Композиции могут пересекать клеточную мембрану путем простой диффузии, эндоцитоза или с помощью любого активного или пассивного механизма транспорта.

Выбранная доза зависит от желаемого терапевтического эффекта, от пути введения и от продолжительности желаемого лечения. Как правило, композиции наночастиц можно вводить в диапазоне от приблизительно 0001 мг/кг до 100 мг/кг на одно введение (например, ежедневно, или 2, 3, 4, 5 или более раз в неделю, или 2, 3, 4, 5 или более раз в месяц и т.д., как обсуждается более подробно ниже). Путь введения может быть рассмотрен, в том числе при определении дозирования. Например, в конкретном варианте осуществления композицию наночастиц вводят в диапазоне от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг (например, ежедневно, или 2, 3, 4, 5 или более раз в неделю, или 2, 3, 4, 5 или более раз в месяц и т.д., как обсуждается более подробно ниже) путем внутривенного или интерпретационного введения или в диапазоне от 0,0001 мг/кг до 1 мг/кг (например, ежедневно, или 2, 3, 4,, 5 или более раз в неделю, или 2, 3, 4, 5 или более раз в месяц и т.д., как обсуждается более подробно ниже) для подкожного введения (например, для местной инъекции в прилегающую к опухоли ткань или микроокружение опухоли). Более иллюстративные варианты дозирования обсуждаются ниже.

1. Составы для парентерального введения

В предпочтительном варианте осуществления композиции вводят в водном растворе путем парентеральной инъекции. Состав может быть в виде суспензии или эмульсии. В общем, предлагаются фармацевтические композиции, включающие эффективные количества одного или более активных агентов, необязательно включающие фармацевтически приемлемые разбавители, консерванты, солюбилизаторы, эмульгаторы, адъюванты и/или носители. Такие композиции могут включать разбавители, такие как стерильная вода, забуференный физиологический раствор с различным содержанием буферирующих веществ (например, Трис-HCl, ацетата, фосфата), рН и ионной силы; и, необязательно, добавки, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, TWEEN® 20, TWEEN® 80, также обозначаемые как полисорбат 20 или 80), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия) и консерванты (например, тимерзол, бензиловый спирт). Примерами неводных растворителей или разбавителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. составы могут быть лиофилизированными и ресуспендируемыми непосредственно перед использованием. Состав может быть стерилизован, например, фильтрованием через задерживающий бактерии фильтр, введением в композиции стерилизующих агентов, облучением композиций или нагреванием композиций.

2. Составы для местного введения, введения через слизистую оболочку и перорального введения

Введение

Композиции могут быть применены местно или покапельно. Местное введение может включать нанесение на легкие, носоглотку, ротовую полость (сублингвально, буккально), влагалище или слизистую оболочку прямой кишки. Эти способы введения могут оказаться эффективными при составлении оболочки с элементами для транспорта через слизистую. Композиции могут быть доставлены в легкие во время ингаляции и проходить через эпителиальную выстилку легких в кровоток при доставке либо в виде аэрозоля, либо в виде спрея с высушенными частицами, имеющими аэродинамический диаметр менее приблизительно 5 микрон.

Может быть использован широкий спектр механических устройств, предназначенных для доставки терапевтических лекарств в легкие, включая, но не ограничиваясь этим, небулайзеры, дозирующие ингаляторы и порошковые ингаляторы, все они хорошо известны специалистам в данной области техники.

Составы для введения в слизистую оболочку, как правило, представляют собой частицы лекарственного средства, высушенные при распылении, которые могут быть включены в таблетку, гель, капсулу, суспензию или эмульсию. Стандартные фармацевтические наполнители доступны от любого разработчика рецептур.

Пероральные составы могут быть в форме жевательной резинки, полосок геля, таблеток, капсул или пастилок. Пероральные составы могут включать наполнители или другие модификации частицы, которые могут обеспечивать защиту в кишечнике или повышенную доставку через желудочно-кишечный тракт, включая эпителий и слизистую оболочку кишечника (см. Samstein, et al. Biomaterials. 29(6):703-8 (2008).

Могут быть также получены трансдермальные составы. Они, как правило, представляют собой мази, лосьоны, спреи или пластыри, причем все они могут быть получены с использованием стандартных методов. Трансдермальные составы могут включать усилители проницаемости. Химические усилители и физические методы, включая электропорацию и микроиглы, могут использоваться в сочетании с этим методом.

IV. Способы лечения

A. Способ стимуляции или усиления иммунного ответа

Композицию наночастиц можно вводить нуждающемуся в этом индивидууму в количестве, эффективном для индукции, повышения или увеличения иммунного ответа у индивидуума. Как правило, иммунный ответ представляет собой стимулирующий иммунный ответ. Например, композиции могут быть введены в количестве, эффективном для увеличения клеточного (управляемого Т-клетками) иммунного ответа, гуморального (управляемого В-клетками) иммунного ответа, активности Т-клеток и/или пролиферации Т-клеток, для снижения ингибиторного сигнала Т-клеток, для повышения продукции цитокинов, для стимуляции Т-клеточной дифференцировки или эффекторной функции, для стимуляции выживания Т-клеток, или любого их сочетания.

В некоторых вариантах осуществления композиции могут снижать или ингибировать супрессорный иммунный ответ. Например, композиции могут быть введены в эффективном количестве для снижения Tregs, блокирования дифференцировки Treg, трафика и/или эффекторной функции, повышения порога супрессии эффекторных клеток или любого их сочетания.

Носители для доставки особенно пригодны для одновременной или регулярной доставки двух или более активных агентов к одной и той же клетке-мишени. Например, совместная загрузка более двух активных агентов в один и тот же носитель для доставки или на него может увеличить вероятность того, что оба агента будут доставлены к одной и той же клетке-мишени. Пользователь может управлять тем, какие активные агенты представлены на поверхности носителя для доставки и какие инкапсулированы в него. Таким образом, пользователь может определить, как и когда каждый активный агент представляется клетке-мишени (т.е. рецептору на внешней поверхности клетки с последующим эндоцитозом внутрь клетки и т.д.).

Совместная доставка также позволяет одновременно направленно действовать по двум разным путям. Например, композиция наночастиц может индуцировать или повышать стимуляторный иммунный ответ и одновременно снижать или уменьшить супрессорный иммунный ответ. Как правило, такие композиции включают, по меньшей мере, два активных агента, первый из которых увеличивает стимуляторный иммунный ответ, а второй из которых уменьшает супрессорный иммунный ответ. Иллюстративная композиция включает провоспалительный цитокин, такой как IL-2, и ингибитор TGF-β, такой как SB505124 или лозартан. В другом варианте осуществления частицы включают направляющую часть, например, часть, направляющую на опухоль, такую как пептид RGD.

В другом варианте осуществления каждый из активных агентов загружают в отдельные частицы, которые доставляются индивидууму вместе или по отдельности, например, когда не требуется, чтобы оба агента действовали на одну и ту же клетку или локализовались в одном и том же микроокружении.

Композиции наночастиц, раскрытые в данном документе, могут быть также разработаны для имитации функций APC и Т-хелперных клеток, которые могут быть снижены и/или неэффективны у онкологических больных. Иммунитет у человека состоит из двух эволюционно выработанных ответов - врожденного и адаптивного. Презентация APCs триггерных молекул, либо чужеродных молекул, либо «своих» молекул, которые обычно не представлены иммунной системе, имеет большое значение для обоих типов ответа. Эти молекулы, которые в совокупности обозначаются как «сигналы опасности», предупреждают иммунную систему, в частности, с помощью APCs о наличии заболевания или ситуаций, которые могут привести к заболеванию. Наночастицы могут быть задействованы для активации сигнализации об опасности и даже имитации активированных APCs, выступая в качестве искусственных APCs (aAPCs). В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения частицы предназначены для имитации дендритных клеток или функционирования в качестве искусственных дендритных клеток. В конкретном варианте осуществления частицы представляют комплекс IL-15/IL-15Rα на своей поверхности.

Активность или эффективность композиции наночастиц может сравниваться с контролем. Подходящие контроли известны в данной области техники. Например, контролем может быть индивидуум до лечения. Активность или эффективность композиции может представлять собой изменение в состоянии или симптоме индивидуума после лечения.

Контролем также может служить индивидуум с тем же состоянием или симптомами, которого лечат параллельно теми же самыми активными агентами в растворимой форме или в другом носителе для доставки. В некоторых вариантах осуществления используют меньше активного агента, активный агент вводят реже или используют их сочетание по сравнению с введением того же самого активного агента в растворимой форме или в другом носителе для доставки. Например, в некоторых вариантах осуществления в 10, 25, 50, 75, 100, 500, 1000, 5000 или 10000 раз меньше активного агента используют в композиции наночастиц по сравнению с активным агентом, вводимым в растворимой форме.

Как правило, раскрытые композиции наночастиц демонстрируют улучшенную активность, эффективность или действенность. Например, терапевтический потенциал активного агента(ов), доставляемого носителем, может превышать потенциал агента(ов) в отсутствие носителя для доставки. Улучшенный терапевтический потенциал раскрытых носителей для доставки может быть обусловлен увеличением авидности агента(ов) к клеткам-мишеням, одновременной высокой локальной концентрацией двух или более терапевтических агентов, одновременным затуханием супрессорных элементов и усилением стимуляторных элементов иммунной системы, избирательной направленностью стимуляторных элементов иммунной системы, прямой направленностью на больные клетки или любым их сочетанием.

B. Заболевания, подлежащие лечению

Композиции наночастиц могут быть введены профилактически или терапевтически нуждающемуся в этом индивидууму в количестве, эффективном для предотвращения, задержки, лечения или уменьшения тяжести заболевания или расстройства или одного или более его симптомов. Раскрытые композиции дают возможность лечения и контролирования многих заболеваний с помощью лекарств, чей системный период полужизни и биораспределение имеют большое значение и которые могут быть менее эффективными или неэффективными при введении в растворимой форме или иным образом при отсутствии носителя для доставки.

Заболевание или нарушение может представлять собой, например, рак или инфекцию.

1. Рак

Раскрытые композиции могут быть использованы для лечения доброкачественных или злокачественных раковых заболеваний и опухолей. Лечение может быть прямо направлено на раковые клетки и уничтожать их, непрямо направлено на раковые клетки за счет увеличения иммунного ответа против раковых клеток; или на их сочетание.

У взрослого животного, как правило, в большинстве органов и тканей поддерживается баланс между обновлением клеток и гибелью клеток. Различные типы зрелых клеток в организме имеют заданный срок жизни; как только эти клетки гибнут, путем пролиферации и дифференцировки различных типов стволовых клеток возникают новые клетки. В нормальных условиях возникновение новых клеток регулируется таким образом, что количество любого конкретного типа клеток остается постоянным. Иногда, тем не менее, возникают клетки, которые уже не реагируют на обычные механизмы контроля роста. Эти клетки дают начало клонам клеток, которые могут распространяться до значительного объема, образуя опухоль или новообразование. Опухоль, которая не способна к неограниченному росту и не способна к существенной инвазии в здоровую окружающую ткань, является доброкачественной. Опухоль, которая продолжает расти и становится прогрессирующе инвазивной, является злокачественной. Термин рак относится конкретно к злокачественной опухоли. В дополнение к неконтролируемому росту злокачественные опухоли характеризуются метастазами. При этом процессе небольшие кластеры раковых клеток отделяются от опухоли, проникают в кровеносные или лимфатические сосуды и переносятся к другим тканям, где они продолжают пролиферировать. Таким образом, первичная опухоль в одном месте может индуцировать рост вторичной опухоли в другом месте.

Раскрытые композиции могут задерживать или ингибировать рост опухоли у индивидуума, уменьшать рост или размер опухоли или устранять ее полностью, ингибировать или уменьшать метастазирование опухоли и/или ингибировать или уменьшать симптомы, связанные с развитием или ростом опухоли. Например, в некоторых вариантах осуществления композиции уменьшают опухолевую массу у индивидуума или замедляют или предотвращают рост опухоли с течением времени.

Злокачественные опухоли, которые могут быть подвергнуты лечению, классифицируются в настоящем документе в соответствии с эмбриональным происхождением ткани, из которой произошла опухоль. Карциномы представляют собой опухоли, происходящие из тканей эндодермы или эктодермы, таких как кожа или эпителиальная выстилка внутренних органов и желез. Саркомы, которые возникают менее часто, происходят из мезодермальных соединительных тканей, таких как костная, жировая и хрящевая ткань. Лейкозы и лимфомы представляют собой злокачественные опухоли кроветворных клеток костного мозга. При лейкозах опухолевые клетки пролиферируют в виде отдельных клеток, в то время как лимфомы имеют тенденцию к росту в виде опухолевых масс. Злокачественные опухоли могут появляться в многочисленных органах или тканях организма с возникновением рака.

Типы рака, которые можно лечить при помощи предлагаемых композиций и способов, включают, но не ограничиваются этим, злокачественные опухоли сосудов, такие как множественная миелома, а также солидные типы рака, включая аденокарциномы и саркомы костей, мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, прямой кишки, пищевода, почки, печени, легких, носоглотки, поджелудочной железы, предстательной железы, кожи, желудка и матки. В некоторых вариантах осуществления раскрытые композиции используются для одновременного лечения нескольких типов рака. Композиции также могут быть использованы для лечения метастазов или опухолей с множественными местами локализации.

Введение не ограничивается лечением существующей опухоли или инфекционного заболевания, но также может использоваться для профилактики или снижения риска развития таких заболеваний у индивидуума, т.е. для профилактического применения. Потенциальные кандидаты для профилактической вакцинации включают лиц с высоким риском развития рака, т.е. с личной или семейной историей определенных типов рака.

2. Инфекции

Композиции могут быть использованы для стимуляции иммунного ответа у индивидуума, страдающего инфекцией, например, вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией или протозойной инфекцией. Таким образом, в одном варианте осуществления предлагается способ лечения инфекции путем введения эффективного количества композиции наночастиц для повышения иммунного ответа против инфекции.

Иллюстративные инфекции, которые можно лечить, включают, но не ограничиваются этим, инфекции, вызываемые микроорганизмами, включая, но не ограничиваясь этим, Actinomyces, Anabaena, Bacillus, Bacteroides, Bdellovibrio, Bordetella, Borrelia, Campylobacter, Caulobacter, Chlamydia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Cytophaga, Deinococcus, Escherichia, Francisella, Halobacterium, Heliobacter, Haemophilus, Hemophilus influenza type B (HIB), Hyphomicrobium, Legionella, Leptspirosis, Listeria, Meningococcus A, B и C, Methanobacterium, Micrococcus, Myobacterium, Mycoplasma, Myxococcus, Neisseria, Nitrobacter, Oscillatoria, Prochloron, Proteus, Pseudomonas, Phodospirillum, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Spirillum, Spirochaeta, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Thiobacillus и Treponema, Vibrio, Yersinia, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis и Schistosoma mansoni.

С. Иллюстративные стратегии лечения заболеваний

В данном описании раскрыты также конкретные сочетания активных агентов и проиллюстрированы в приведенных ниже примерах.

1. Провоспалительный цитокин и ингибитор TGF-β

Одна иллюстративная стратегия лечения заболевания включает введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции наночастиц, включающей провоспалительный цитокин и ингибитор TGF-β. Два агента могут быть загружены в одну и ту же частицу или на нее, или в отдельные частицы или на них и введены совместно. В предпочтительном варианте осуществления провоспалительный цитокин и ингибитор TGF-β загружают в один и тот же носитель для доставки или на него, например, в нанолипогель или полимерные наночастицы, такие как PLGA. Провоспалительный цитокин может представлять собой IL-2 или IFNγ, а ингибитор TGF-β может представлять собой SB505124 или лозартан. В конкретном варианте осуществления нанолипогель или наночастицы PLGA совместно нагружают рекомбинантным IL-2 и лозартаном. В других вариантах осуществления изобретения носитель для доставки декорирован направляющей частью, такой как RGD.

Способ получения композиций наночастиц, содержащих провоспалительные цитокины и/или ингибиторы TGF-β, обсуждаются более подробно в приведенных ниже примерах. Например, дозы от 0,5 мг до 5 мг были испытаны на мышах. Предпочтительный диапазон доз для этих активных агентов от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг частиц или нанолипогелей при внутривенном или внутрибрюшинном, или инфузионном пути введения (например, ежедневно или 2, 3, 4, 5 или более раз в неделю, или 2, 3, 4, 5 или более раз в месяц и т.д., как обсуждается более подробно ниже); или от 0,0001 мг/кг до 1 мг/кг подкожно (например, ежедневно или 2, 3, 4, 5 или более раз в неделю; или 2, 3, 4, 5 или более раз в месяц и т.д., как обсуждается более подробно ниже). Установлено, что 5 мг нанолипогелей, нагруженных IL-2 и лозартаном, как правило, содержат приблизительно 50 нг IL-2 и приблизительно 200 мкг лозартана.

2. Провоспалительный цитокин и направляющая часть

Другой пример стратегии лечения заболевания включает введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции наночастиц, включающей направляющую часть и провоспалительный цитокин. Как обсуждалось выше, направляющая молекула может представлять собой, например, RGD. В других вариантах осуществления направляющая часть представляет собой Т-клеточный рецептор (TCR) или агонистическое антитело против CD40. Предпочтительные провоспалительные цитокины представляют собой IL-2 или IFNγ.

В конкретном варианте осуществления направляющая часть представляет собой Т-клеточный рецептор (TCR), который узнает антиген р53 в контексте MHC человека.

В другом варианте осуществления направляющая часть представляет собой агонист CD40, например, антитело против CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент. Подходящие агонисты CD40 известны в данной области техники и описаны выше.

Соответственно, раскрывается носитель для доставки, такой как нанолипогель или наночастица, такая как наночастица PLGA, нагруженные IL-2 и декорированные Т-клеточным рецептором (TCR), который узнает антиген р53 в контексте MHC человека. Раскрывается также носитель для доставки, такой как нанолипогель или наночастица, такая как наночастица PLGA, нагруженные IL-2 и декорированные агонистом CD40. Раскрывается также нанолипогель или наночастица, такая как наночастица PLGA, нагруженные IFNγ и декорированные Т-клеточным рецептором (TCR), который узнает антиген р53 в контексте MHC человека, или агонистом CD40.

Предпочтительная дозировка этих активных агентов находится в диапазоне от приблизительно 10 мг/кг до 100 мг/кг (например, ежедневно, или 2, 3, 4, 5 или более раз в неделю, или 2, 3, 4, 5 или более раз в месяц, и т.д., как обсуждается более подробно ниже).

3. IL-15/IL-15α

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции наночастиц предназначены для имитации APCs, таких как дендритные клетки. Интерлейкин-15 (IL-15) представляет собой цитокин, который использует определенные субъединицы рецептора совместно с IL-2, и, таким образом, имеет некоторые перекрывающиеся механизмы действия. IL-15 экспрессируется дендритными клетками и индуцирует важный сигнал для пролиферации и примирования природных клеток-киллеров (NK). IL-15 прочно связывается с субъединицей рецептора, не являющейся общей с IL-2, обозначаемой IL-15Rα. IL-15Rα способна связывать IL-15 независимо от других субъединиц. Считается, что это свойство позволяет IL-15, продуцируемому одной клеткой, подвергаться эндоцитозу другой клеткой, а затем презентироваться третьей клеткой. Растворимые комплексы IL-15/IL-15Rα могут быть получены как экспонируемые на носителях для доставки, где они действуют подобно искусственной дендритной клетке.

Считается, что поливалентная презентация комплексов IL-15/IL-15Rα на поверхности носителей для доставки облегчает адгезию частиц к NK-клеткам. Фактически комплексы IL-15/IL-15Rα на наночастицах более эффективно распространяются на NK-клетки, чем только IL-15 или растворимые комплексы IL-15/IL-15Rα (см. примеры ниже). При стимуляции комплексами IL-15/IL-15Rα на наночастицах эти NK-клетки также демонстрируют повышенные уровни секреции интерферона-γ даже при концентрациях наночастиц, которые не стимулируют значительных уровней клеточного деления. Комплексы IL-15/IL-15Rα на наночастицах также способствуют экспансии CD8⁺ Т-клеток.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления нанолипогель или наночастицы, такие как наночастицы PLGA, декорируются комплексами IL-15/IL-15Rα. Нанолипогель или наночастица могут быть дополнительно нагружены одним или более дополнительными активными агентами. Один или более дополнительные агенты могут представлять собой противораковый агент или иммуномодулятор, например, IL-2 или ингибитор TGF-β, такие как лозартан. В некоторых вариантах осуществления нанолипогель или наночастицу дополнительно нагружают одним или более антигенами или адъювантами, например, опухолевым антигеном.

Предпочтительная дозировка этих активных агентов находится в диапазоне от приблизительно 1 мг/кг до 50 мг/кг, или от приблизительно 1 мг/кг до 5 мг/кг; или от приблизительно 10 мг/кг до 50 мг/кг; или 1-5 мг/кг - 10-50 мг/кг (например, ежедневно, или 2, 3, 4, 5 или более раз в неделю, или 2, 3, 4, 5 или более раз в месяц, и т.д., как обсуждается более подробно ниже).

D. Адъювантные стратегии и варианты сочетанного лечения

В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц используется в качестве адъюванта и совместно вводится в сочетании с дополнительным активным агентом, который не загружают на раскрытую композицию наночастиц или в нее. Адъювантная и сочетанная терапия может включать введение дополнительных активных агентов вместе в той же смеси с частицами, или в отдельных смесях.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения один или более активных агентов (таких как ингибитор TGF-β и/или провоспалительный цитокин) загружают в нанолипогели или в другой носитель для доставки или на них с образованием композиции наночастиц и вводят индивидууму в сочетании с одним или более дополнительными активными агентами, которые находятся в свободной или в растворимой форме или даже в виде части отдельной единицы лекарственной формы.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает два, три или более активных агентов, некоторые из которых загружаются в частицы или на них, а некоторые из них не загружаются.

Различные активные агенты могут иметь одинаковые или разные механизмы действия. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сочетание приводит к аддитивному эффекту при лечении заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сочетания приводят более чем к аддитивному эффекту при лечении заболевания или нарушения. Например, в конкретных вариантах осуществления композиция наночастиц увеличивает или улучшает иммуностимулирующую или усиливающую иммунитет терапию или действие химиотерапевтического агента.

Композиция наночастиц и один или более дополнительных свободных или растворимых активных агентов могут быть введены индивидууму как часть схемы лечения. Схема лечения, как правило, относится к лечению заболевания или способу достижения желаемого физиологического изменения или изменения в симптоме заболевания, такого как увеличение или снижение ответа иммунной системы на антиген или иммуноген, такого как увеличение или снижение количества или активности одной или более клеток или типов клеток, которые вовлечены в такой ответ, где указанное лечение или способ включает введение животному, такому как млекопитающее, особенно человек, достаточного количества двух или более химических агентов или компонентов указанной схемы для эффективного лечения заболевания или для получения указанного физиологического изменения или изменения в симптоме заболевания, где химические агенты или компоненты вводят совместно, например, как часть той же самой композиции, или вводят по отдельности и независимо друг от друга в одно и то же время или в разное время (т.е. введение каждого агента или компонента отделено определенным периодом времени от одного или более агентов или компонентов). Предпочтительно при введении одного или более агентов или компонентов достигается более высокий результат, чем у любого из агентов или компонентов при введении по отдельности или при изолированном введении. Предпочтительно один или более активных агентов находятся в композиции наночастиц.

Композиции наночастиц и/или дополнительный активный агент(ы) можно вводить вместе или по отдельности ежедневно в течение ограниченного периода времени, такого как до 3 дней, или до 5 дней, или до 7 дней, или до 10 дней, или до 15 дней, или до 20 дней или до 25 дней, все это конкретно охватывается настоящем изобретением. В некоторых вариантах осуществления композицию наночастиц и/или дополнительный активный агент(ы) вводят каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 дней. В некоторых вариантах осуществления частота введения составляет один раз в неделю, или один раз каждые две недели, или один раз каждые четыре недели, или два раза каждую неделю. В некоторых вариантах осуществления эффективным является однократное введение. В некоторых вариантах осуществления необходимо два или более введения.

Все такие варианты введения композиции наночастиц могут осуществляться до или после введения дополнительного активного агента(ов). В качестве альтернативы, введение одной или более доз активного агента(ов) может быть в скользящем временном порядке с введением композиции наночастиц с возникновением равномерного или неравномерного курса лечения, в результате чего вводят одну или более доз активного агента(ов), затем следует одна или более доз композиции наночастиц, затем следует одна или более доз дополнительного активного агента(ов); или наоборот, все в соответствии с той схемой, которая выбрана или желательна исследователю или врачу, вводящему агенты.

В некоторых вариантах осуществления композицию наночастиц вводят, по меньшей мере, за 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 или 30 часов до или после введения дополнительного активного агента(ов). В других вариантах осуществления дополнительный активный агент(ы) вводят, по меньшей мере, за 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 или 30 часов до или после введения композиции наночастиц.

В иллюстративной стратегии нуждающемуся в этом индивидууму вводят композицию наночастиц, включающую провоспалительный цитокин и/или ингибитор TGF-β в сочетании с одним или более дополнительными агентами, стимулирующими или повышающими иммунный ответ. Агенты типа провоспалительного цитокина и/или ингибитора TGF-β могут быть загружены в одну и ту же частицу или на нее, или в отдельные частицы или на них и вводиться совместно. В некоторых вариантах осуществления только нанолипогели или частицы, включающие провоспалительный цитокин, или включающие ингибитор TGF-β, вводят индивидууму в отсутствие другого агента. В предпочтительном варианте осуществления провоспалительный цитокин и ингибитор TGF-β загружают в один и тот же носитель для доставки, например, в нанолипогель или полимерные наночастицы, такие как PLGA, или на него. Провоспалительный цитокин может представлять собой IL-2 или IFNγ и ингибитор TGF-β может представлять собой SB505124 или лозартан. В конкретном варианте осуществления нанолипогель или наночастицу PLGA совместно загружают рекомбинантным IL-2 и лозартаном.

Один или более дополнительных агентов, стимулирующих или усиливающих иммунный ответ, могут представлять собой агент, который уменьшает супрессорный иммунный ответ у индивидуума. Типичные агенты описаны более подробно выше и включают, например, антагонисты PD-1 и антагонисты CTLA4. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антагонист PD-1 представляет собой антагонистическое антитело против PD-1, и антагонист CTLA4 представляет собой антагонистическое антитело против CTLA4.

В предпочтительных вариантах осуществления один или более дополнительных агентов, стимулирующих или усиливающих иммунный ответ, не загружают в нанолипогель или другой носитель для доставки частиц или на него. Один или более дополнительных агентов, стимулирующих или усиливающих иммунный ответ, можно вводить индивидууму в свободной или в растворимой форме, или в другой обычной лекарственной форме.

В иллюстративном предпочтительном варианте осуществления лозартан и/или IL-2 загружают в нанолипогели или наночастицы, такие как наночастицы PLGA, или на них, вводимые индивидууму в сочетании с антителами против PD-1, против CTLA4 или их сочетанием.

Не будучи связанными какой-либо теорией, полагают, что, когда один или более агенты, стимулирующие иммунный ответ, такие как антагонистическое антитело против PD-1 и/или антагонистическое антитело против CTLA4, вводят совместно в сочетании с нанолипогелями или частицами, нагруженными провоспалительным цитокином, таким как IL-2, и/или ингибитором TGF-β, таким как лозартан, или связанными с ними, (1) стимулирующий иммунный ответ агент(ы) можно вводить в более низкой дозе; (2) стимулирующий иммунный ответ агент(ы) будет демонстрировать сниженные побочные эффекты или токсичность у индивидуума; (3) стимулирующий иммунный ответ агент будет проявлять повышенную активность, и/или (4) результат, достигаемый агентом, стимулирующим иммунный ответ, в сочетании с нагруженными нанолипогелями или частицами у индивидуума будет сильнее, чем аддитивный эффект, при сравнении с введением стимулирующего иммунный ответ агента(ов) без нагруженных нанолипогелей или частиц; или с введением нагруженных нанолипогелей или частиц в отсутствие стимулирующего иммунный ответ агента(ов).

При другой иллюстративной стратегии нуждающемуся в этом индивидууму вводят композицию наночастиц, включающую провоспалительный цитокин и/или ингибитор TGF-β в сочетании с одним или более химиотерапевтическими агентами. Агенты, такие как провоспалительный цитокин и/или ингибиторы TGF-β, могут быть загружены в одну и ту же частицу или на нее, или в отдельные частицы или на них и вводиться совместно. В некоторых вариантах осуществления только нанолипогели или частицы, включающие провоспалительный цитокин или включающие ингибитор TGF-β, вводят индивидууму в отсутствие других агентов. В предпочтительном варианте осуществления провоспалительный цитокин и ингибитор TGF-β загружают в один и тот же носитель для доставки, например, в нанолипогель или полимерную наночастицу, такую как PLGA, или на них. Провоспалительный цитокин может представлять собой IL-2 или IFNγ и ингибитор TGF-β может представлять собой SB505124 или лозартан. В конкретном варианте осуществления нанолипогель или наночастица PLGA совместно загружены рекомбинантным IL-2 и лозартаном.

В предпочтительных вариантах осуществления один или более химиотерапевтических агентов не загружаются в нанолипогель или другой носитель для доставки частиц или на него. Один или более химиотерапевтических агентов можно вводить индивидууму в свободной или в растворимой форме, или в другой обычной лекарственной форме. Примеры химиотерапевтических агентов описаны выше. В конкретном варианте осуществления химиотерапевтический агент представляет собой доксорубицин.

В иллюстративном предпочтительном варианте осуществления лозартан и/или IL-2 загружают в нанолипогели или наночастицы, такие как наночастицы PLGA, или на них и вводят индивидууму в сочетании с доксорубицином.

Как обсуждалось выше в отношении агентов, стимулирующих иммунный ответ, аналогичным образом считается, что, когда один или более химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин, совместно вводят в сочетании с нанолипогелями или частицами, загруженными или связанными с провоспалительным цитокином, таким как IL-2, и/или ингибитором TGF-β, таким как лозартан, (1) химиотерапевтический агент(ы) можно вводить в более низкой дозе; (2) химиотерапевтический агент(ы) будет демонстрировать пониженные побочные эффекты или токсичность по отношению к индивидууму; (3) химиотерапевтический агент будет проявлять повышенную активность, и/или (4) результат, достигаемый под действием химиотерапевтического агента в сочетании с загруженными нанолипогелями или частицами, будет у индивидуума сильнее, чем аддитивный эффект, при сравнении с введением химиотерапевтического агента(ов) без нагруженных нанолипогелей или частиц; или с введением нагруженных нанолипогелей или частиц в отсутствие химиотерапевтического агента(ов).

Сочетанные варианты лечения и схемы лечения могут быть использованы для индукции, повышения или усиления иммунного ответа (например, повышения или индукции ответа Т-клеток, такого как пролиферация или активация Т-клеток) у нуждающегося в этом индивидуума. Типичные индивидуумы включают индивидуумов, страдающих раком или инфекционным заболеванием, как описано более подробно выше. Иммунный ответ (например, повышение или индукция ответа Т-клеток) может представлять собой ответ против рака или антигена заболевания. Иммунный ответ может быть эффективным в отношении лечения рака или инфекции. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммунный ответ представляет собой ответ против раковых или патологически инфицированных клеток и может уменьшать один или более симптомов рака или заболевания (например, опухолевую массу, прогрессию опухоли, прогрессию заболевания и т.д.).

Предпочтительные дозировки композиций наночастиц, включающих провоспалительный цитокин и/или ингибитор TGF-β, рассмотрены выше. В других конкретных вариантах осуществления, таких как композиции адъювантов и способы, описанные в настоящем документе, композицию наночастиц вводят в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг до 100 мг/кг или от приблизительно 0,1 мг/кг до 1 мг/кг; или от приблизительно 10 мг/кг до 100 мг/кг; или от 0,1-1 мг/кг до 10-100 мг/кг (например, ежедневно, или 2, 3, 4, 5 или более раз в неделю, или 2, 3, 4, 5 или более раз в месяц и т.д., как обсуждалось более подробно выше).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Трафик наночастиц к селезенке и представление дендритным клеткам

Материалы и методы

Наночастицы получали и характеризовали в соответствии с описанными ранее протоколами (Look, et al., J. Clinical Investigation, 123(4):1741-9 (2013), Shirali, et al., Am. J. Transplant, 11(12):2582-92 (2011)). Частицы PLGA, флуоресцентный зонд (кумарин 6), растворяли с PLGA в этилацетате и эмульгировали с поли(виниловым спиртом) и авидин-пальмитатом с использованием ультразвукового зонда. Частицам PLGA затем давали отвердеть, их промывали и затем лиофилизировали. Биотинилированный поли(этиленгликоль) добавляли к частицам PLGA в отношении 1,33 мкг на мг частицы перед использованием в экспериментах.

Исследование биораспределения: получали частицы (2 мг на животных) и затем вводили внутрибрюшинно мышам. Забирали органы, взвешивали и визуализировали с помощью системы визуализации IVIS для получения количественного измерения флуоресценции. Для гистологического анализа селезенку быстро замораживали в заключающей среде ОСТ, а затем получали срезы на замораживающем микротоме с заряженными салазками. Срезы фиксировали в ледяном ацетоне в течение 10 минут, а затем окрашивали антителами. Срезы ткани визуализировали на микроскопе Nikon TE-2000.

Результаты

Транспортировка наночастицами антигенов к APCs является первым важным этапом мобилизации клеточного иммунного ответа против этих антигенов. Эксперимент предназначался для отслеживания накопления наночастиц in vivo. Наночастицы PLGA нагружали флуоресцентным агентом, кумарином-6, и вводили мышам. Результаты представлены на фигурах 1А-1D. На фигуре 1А показано, что через 3 часа после внутривенной инъекции мышам наночастиц, нагруженных флуоресцентным агентом, кумарином-6, эти наночастицы были широко рассеяны среди ряда тканей; тем не менее, через 6 часов (фигура 1B), флуоресцирующие наночастицы были в значительной степени сосредоточены в селезенке. Большие популяции иммунных клеток концентрировались в определенных тканях, особенно в селезенке. На фигурах 1C-1D показано, что наночастицы с кумарином-6 заметно связывались с популяциями антигенпрезентирующих клеток, в частности с дендритными клетками и макрофагами в селезенке (1С), а также в лимфатическом узле (1D), еще одном важном месте, участвующем в стимуляции иммунной системы.

Пример 2: Наночастицы стимулируют противоопухолевые эффекты IL-2

Материалы и методы

Наногели получали с липосомами, экструдированными из липидной смеси в молярном отношении холестерин:фосфатидилхолин:1,2-дистеароил-SW-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] 1:2:0,1. Липосомы лиофилизировали, а затем регидратировали смесью акрилатной молочной кислоты-поли(этиленгликоль)-молочной кислоты, флуоресцентного зонда (родамина В), комплексированного в неметилированных β-циклодекстринах, и Irgacure 2959. Частицы подвергали отвердеванию под УФ-светом, промывали и центрифугировали, и дистанционно нагружали 100 мкг/мл IL-2 человека (пролекином). Наногели функционализировали авидином с использованием гидрохлорида сульфо-N-гидроксисукцинимид/1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (SNHS/EDC). Биотинилированный рецептор Т-клеток добавляли в концентрации 10 мкг TCR на мг наночастиц. (Look, et al., J. Clinical Investigation, 123(4):1741-9 (2013), Joshi, et al., J. Control Release, 161(1):25-37 (2012), Danhier, et al., J. Control Release, 161(2):505-22 (2012), Elamanchili, et al., Vaccine, 22(19):2406-12 (2004), Shirali, et al., Am. J. Transplant, 11(12):2582-92 (2011)).

Результаты

Иммунодефицитным (голым) мышам ксенотрансплантировали подкожно 10⁵ клеток меланомы A37C515N человека, экспрессирующих антиген р53. В моменты времени, указанные на фигуре 2 (стрелки), мышам, каждой из них, внутривенно вводили наночастицы, соединенные с Т-клеточным рецептором (TCR), который узнает этот антиген р53 в контексте MHC человека, и нагруженные цитокином IL-2 или растворимым специфичным для p53 гибридным белком scTCR/IL-2 (Altor Biosciences, Miramar, FL). На фигуре 2 показано, что средние объемы опухолей у мышей, обработанных гибридным белком, снижались приблизительно на 40% по сравнению с опухолями у контрольных мышей, получавших PBS. Однако в конце периода исследования средние объемы опухолей у мышей, получавших наночастицы, были снижены приблизительно на 70%, даже при том, что количество IL-2, загруженного в наночастицы, было приблизительно в 1000 раз меньше по сравнению с относительной концентрацией IL-2 в гибридном белке TCR/IL-2. Повышенная авидность для IL-2 и/или TCR на наночастице относительно растворимого гибридного белка может объяснять высокую противоопухолевую активность препарата наночастиц.

Пример 3: IL-2 или IFN-гамма в сочетании с антителом против CD40 на наночастицах проявляют противораковую активность.

Материалы и методы

Наночастицы PLGA получали, как описано в примере 1. IFN-гамма (100 мкг/мл) нагружали в 100 мг PLGA. Биотинированное антитело против CD40 (10 мкг/мл) добавляли в концентрации 1 мг/мл полимера наночастиц с поверхностью, модифицированной авидином, как описано в примере 1.

Результаты

IL-2, который продуцируется и секретируется активированными Т-клетками, может быть объединен на наночастицах с другими иммуностимулирующими агентами для индукции противоопухолевого эффекта. Один из таких агентов представляет собой агонистическое антитело против CD40. (Honeychurch, J., Glennie, MJ, Johnson, PW, Illidge, TM.: Anti-CD40 monoclonal antibody therapy in combination with irradiation results in a CD8 T-cell-dependent immunity to B-cell lymphoma. Blood 2003; 102:1449-1457). CD40 представляет собой костимуляторный белок, найденный на APCs, и он требуется для их активации. Такая активация происходит, когда CD40 связывается с CD40L (CD154), белком, который экспрессируется главным образом на активированных Т-клетках и является членом суперсемейства молекул TNF. Агонистическое антитело против CD40 содействует функции CD40L в активации АРСs, и, таким образом, наночастица, несущая агонистическое антитело против CD40 и IL-2 в сочетании, может придать некоторые функциональные свойства хелперной Т-клетке.

При активации происходит гомотримеризация некоторых членов суперсемейства TNF, указывая на роль валентности и высокоавидных взаимодействий во время передачи сигнала. Действительно, как и следовало ожидать, для достижения эффективного ответа на плазматической мембране могут потребоваться олигомеры более высокого порядка (Grell, et al., Cell, 83: 793-802 (1995), Tanaka, et al., Nat. Med., 4: 31-36 (1998), Schneider, et al., J. Exp. Med.,187: 1205-121 (1998)).

Таким образом, проводились опыты для определения того, взаимодействуют ли наночастицы, экспонирующие антитело против CD40, с мишенями с более высокой авидностью и способны ли воспроизводить физиологические требования к мощной сигнализации, которая не может быть достигнута с помощью растворимых мономерных комплексов или комплексов антител против CD40.

Животным инокулировали клетки меланомы B16F10 в заднюю конечность. Рост опухоли прослеживали и приблизительно через 7 дней, когда опухоль достигала площади 0,5 мм², животных обрабатывали вокруг опухоли 5 мкг наночастиц PLGA (a) с поверхностью, модифицированной антителом против CD40; (b) с поверхностью, модифицированной антителом против CD40, и нагруженных IL-2; или, в качестве контроля, (с) пустыми наночастицами (с чистой поверхностью и пустыми), или (d) забуференным физиологическим раствором (IX PBS). Ненагруженные наночастицы PLGA не оказывали влияния на рост опухоли по сравнению с обработкой PBS (фигура 3). Только IL-2 на наночастицах имел незначительные противоопухолевые свойства или не имел их. Агонистическое антитело против CD40 на наночастицах действительно демонстрировало существенный противораковый эффект в течение срока эксперимента, что указывает на то, что представление этого антитела на поверхности само по себе может иметь терапевтическое применение (фигура 3). Наиболее мощный ответ наблюдался с наночастицами, содержащими агонистическое антитело против CD40 и IL-2 (фигура 3).

Пример 4: IL-15 на наночастицах активирует NK-клетки.

Материалы и методы

Поли(лактид-со-гликолид) (PLGA) 50/50 со средней молекулярной массой 80 кДа получали от DURECT Corporation (Cupertino, CA) и использовали для получения наночастиц. Наночастицы формировались с использованием метода эмульсии масла в воде или метода двойной эмульсии вода-в-масле-в-воде для гидрофильных инкапсулирующих агентов. Эмульсии обрабатывали ультразвуком 3 раза по 10 секунд каждый на ультразвуковом процессоре 600W (Sonics & Materials Inc, Newtown, CT) ультразвуковым зондом, и давали затвердеть в течение 1,5-3 часов в 0,2% растворе поли(винилового спирта). Поверхность наночастиц модифицировали конъюгатами авидин-пальмитата, как описано ранее. Частицы промывали dH₂O, лиофилизировали и хранили при -20°С.

Гетеродимер IL-15:IL-15Rα человека был любезно предоставлен национальным институтом рака в Frederick (Frederick, MD). Гетеродимер IL-15 вводили в реакцию в молярном отношении 1:10 с NHS-LC-LC-биотином (Thermo Scientific, Rockford, IL), затем диализовали в течение 48 час в PBS для удаления избытка непрореагировавшего биотина. Биотинилированные гетеродимеры IL-15 добавляли к наночастицам в указанных концентрациях и инкубировали на ротационном шейкере в течение 15 мин при комнатной температуре.

Результаты

Интерлейкин-15 (IL-15) представляет собой цитокин, который использует определенные субъединицы рецептора совместно с IL-2, и, таким образом, имеет некоторые перекрывающиеся механизмы действия. IL-15 экспрессируется дендритными клетками и индуцирует важный сигнал для пролиферации и примирования природных клеток-киллеров (NK). IL-15 прочно связывается с субъединицей рецептора, не являющейся общей с IL-2, обозначаемой IL-15Rα. IL-15Rα способна связывать IL-15 независимо от других субъединиц. Считается, что это свойство позволяет IL-15, продуцируемому одной клеткой, подвергаться эндоцитозу второй клеткой, а затем презентироваться третьей клетке. Так как могут быть получены растворимые комплексы IL-15/IL-15Rα, можно оценить потенциальную противораковую активность комплекса IL-15/IL-15Rα. Такие комплексы IL-15/IL-15Rα также могут быть нагружены на наночастицы и действовать в некоторых отношениях как искусственная дендритная клетка (фигура 4).

Эксперименты были предназначены для проверки способности наночастиц, декорированных комплексом IL-15/IL-15Rα, модулировать иммунный ответ. Результаты показывают, что поливалентная презентация комплексов IL-15/IL-15Rα на поверхности наночастиц облегчает адгезию наночастиц к NK-клеткам. Комплексы IL-15/IL-15Rα на наночастицах более эффективно распространяются на NK-клетки, чем только IL-15 или растворимые комплексы IL-15/IL-15Rα (фигура 5А). При стимуляции комплексов IL-15/IL-15Rα на наночастицах, эти NK-клетки также демонстрировали повышенные уровни интерферона-γ даже при концентрациях наночастиц, которые не стимулируют значительных уровней клеточного деления (фигуры 5С и 5В, соответственно). Результаты также показывают, что комплексы IL-15/IL-15Rα на наночастицах стимулируют экспансию CD8⁺ Т-клеток.

Пример 5: IL-15 на наночастицах демонстрирует противоопухолевую активность.

Материалы и методы

Частицы IL-15/IL15R использовали, как описано в примере 4. Клетки B16-OVA (ATCC) культивировали в среде DMEM (Gibco) и суспендировали в 2×10⁶ клеток/мл в 1X PBS (поддерживая на льду) непосредственно перед инъекцией. Для исследований подкожных опухолей самок 6-8-недельных мышей C57BL/6 наркотизировали AErrane (изофлуораном; Baxter) и правый задний бок брили перед подкожной инъекцией 50 мкл клеточной суспензии. Рост опухолей прослеживали, и лечение начинали, когда средняя площадь опухоль достигала ~5,5 мм² (через 8-10 дней после инъекции В16; мышей перегруппировывали для нормализации размеров опухоли в разных группах). Мышей наркотизировали изофлуораном для введения нанолипогеля, которое осуществляли внутрь опухоли. Каждая доза состояла из 2 мг IL-15/IL-15R NP. Проводили слепое для наблюдателей исследование в отношении площади опухоли и исследований выживаемости. Мышей подвергали эвтаназии диоксидом углерода, когда любой размер опухоли был >15 мм, когда проявлялся любой признак заболевания, или через одну неделю после лечения для исследований анализов FACS. Пять мышей на группу подвергали эвтаназии в различных временных точках, и опухоли извлекали и взвешивали.

Результаты

С учетом способности комплексов IL-15/IL-15Rα на наночастицах стимулировать сильный ответ NK-клеток, планировались опыты по определению эффективности этих комплексов в модели рака. В этом примере выбрана модель метастатического заболевания В16, потому что комплексы IL-15/IL-15Rα, как известно, играют важную роль в иммунной реакции на эти опухоли. Использовали производную линию меланомы B16.OVA, чьи клетки несут на поверхности антиген овальбумина (OVA). Это дает дополнительную возможность оценить направленный на опухоль эффект наночастиц.

Наночастицы декорировали комплексами IL-15/IL-15Rα и дополнительно нагружали белком овальбумином, свободным от эндотоксина. 10⁵ клеток меланомы B16.OVA вводили мышам C57BL/6 и через 1, 2 и 7 дней после этого группам из 5 мышей вводили забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), нагруженный наночастицами PLGA, 1 мкг полных комплексов IL-15/IL-15Rα или таким же количеством комплексов IL-15/IL-15Rα, нагруженных на наночастицы, с инкапсулированным овальбумином или без него. На фигуре 6 показаны результаты. Все мыши, получавшие PBS или ненагруженные наночастицы, погибали менее чем за 50 дней. Мыши, получавшие комплексы IL-15/IL-15Rα, либо в растворе, либо нагруженные на наночастицы, выживали в течение более длительного периода времени. Наиболее эффективным было лечение наночастицами, нагруженными комплексом IL-15/IL-15Rα плюс овальбумин, демонстрируя, что направленность наночастиц на опухоли улучшает противоопухолевые эффекты комплекса IL-15/IL-15Rα (фигура 6).

Пример 6: Направленное действие ингибитора TGF-β SB505124 с RGD пептидом характеризуется противоопухолевой активностью

Материалы и методы

Синтез и характеристика наночастиц RGD/SB

Конъюгация кислотного конца PLGA и аминоконца ПЭГ осуществлялась следующим образом. Кислотный конец PLGA (500 мг) и 10-кратный избыток NHS и DCC растворяли в 10 мл безводного DCM. После перемешивания при комнатной температуре в течение четырех часов реакционный раствор фильтровали через фильтр PTFE для удаления осадка. Активированный NHS PLGA получали путем осаждения в холодном этиловом эфире. После высушивания в вакууме активированный NHS PLGA растворяли в безводном DCM с эквивалентным молярным отношением NH₂-PEG-COOH, и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре. Конъюгат осаждали в холодном этиловом эфире и высушивали в вакууме с выходом выше 90%. Пептид RGD конъюгировали с карбоксильной группой PLGA-PEG-COOH с использованием NHS и EDC. При использовании этого блок-сополимера инкапсулировали лекарство, ингибитор TGF-β, в наночастицы с использованием метода диализа. Конкретно, лекарство и полимер растворяли в ДМСО, и раствор переносили в диализную мембрану (MWCO 100000). Диализ проводили в течение 24 часов против DI воды. После этого водный раствор частиц центрифугировали и обрабатывали ультразвуком, чтобы сконцентрировать частицы.

Размер наночастиц или ID определяли с помощью динамического рассеяния света (DLS) с использованием Zetasizer (Malvern). Концентрация образца поддерживалась на уровне 0,5 мг/мл. Количество инкапсулированного SB получали из измерения его поглощения путем растворения 10 мл наночастиц SB в 990 мл ДМСО, что вызывало высвобождение SB в раствор ДМСО. Затем измеряли поглощение при 300 нм. При использовании предварительно построенной калибровочной кривой поглощения SB в соответствии с его титруемой концентрацией рассчитывали концентрацию инкапсулированного SB. Профиль высвобождения SB определяли в соответствии с другим протоколом. Один миллилитр наночастиц PBS-SB получали в пробирке Эппендорфа при умеренном встряхивании. В каждый момент времени пробирку центрифугировали, чтобы осадить наночастицы, а супернатант собрали. Супернатант разводили в 100 раз в ДМСО, и измеряли его поглощение при 300 нм.

Результаты

Исследования показали, что интегрин гиперэкспрессируется на поверхности опухолевых клеток и может служить в качестве маркера, который отличает опухолевые клетки и нормальные клетки. Интегрин также активирует TGF-β через внеклеточный путь. После того, как латентный TGF-β высвобождается из опухолевой клетки, он связывается с интегрином на поверхности опухолевой клетки, что приводит к активации латентного TGF-β. В результате повышенные концентрации TGF-β в микроокружении опухоли поддерживают иммуносупрессию путем привлечения регуляторных Т-клеток (Massayo, et al., Eur J Clin Med Oncol., (4):27-32 (2013). Повышенный уровень молекул TGF-β может быть ингибирован ингибитором TGF-β, таким как SB505124 (2-(5-бензо[3]диоксол-5-ил-2-трет-бутил-3Н-имидазол-4-ил)-6-метилпиридин). SB-505124 является селективным ингибитором рецепторов типа I ALK4, ALK5 и ALK7 трансформирующего фактора роста-бета (DaCosta, et al., Mol Pharmacol. 65:744-52 (2004)), также известным как SB505124 (также сокращенно SB).

В этом примере SB505124 загружают непосредственно в наночастицы PLGA-PEG, как описано выше.

Пептид RGD может выполнять двойную функцию: он не только представляет собой типичный лиганд, направленный на интегрин (Ruoslahti, et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12:697-715 (1996)), но и служит в качестве иммунного сигнала опасности, активируя APCs (Altincicek, et al., Biol Chem., (390)1303-11 (2009)).

В этом примере наночастицы PLGA нагружали SB505124 и пептидом RGD. Эти наночастицы индуцировали сильный противоопухолевый эффект с участием выраженной модуляции TGF-β и его активацией и функционированием с помощью нескольких способов (фигура 7); оба агента также модулировали элементы иммунной системы так, что локальное окружение переключалось с супрессорного на стимулирующее. Пептид RGD в силу своей роли в качестве иммунного сигнала опасности может активировать APCs и в результате своего взаимодействия с интегринами он может блокировать связывание между латентным TGF-β и интегрином. SB505124 может ингибировать активацию TGF-β. Таким образом, латентный TGF-β минимально активируется и предотвращается уклонение опухоли от иммунной системы, опосредованное Treg.

На фигурах 8 и 9А-9С обобщены исследования по определению влияния SB505124 и/или RGD на клетки меланомы B16fl0. Лечение начинали через 10 дней после инокуляции мышей опухолевыми клетками (фигура 8). RGD (100 нМ) и/или SB505124 (100 нМ) вводили либо в растворе, либо загруженными на наночастицы, что вызывает задержку клиренса (7 мышей на группу). В одной серии экспериментов животные получали четыре еженедельных инъекции вокруг опухоли, и как объемы опухолей, так и показатели выживаемости прослеживали в течение 5 недель.

Как показано на фигурах 9А и 9В, растворимые SB505124 и RGD имели умеренный противоопухолевый эффект, если таковой наблюдался. То же самое верно, в том случае, когда SB505124 нагружали на наночастицы и вводили мышам. Хотя наночастицы, несущие RGD, по-видимому, имели противоопухолевый эффект, сочетание SB505124 и RGD на наночастицах имело намного более высокий, статистически значимый противоопухолевый эффект. По меньшей мере, частично повышенная эффективность при введении наночастиц может быть обусловлена снижением клиренса, что показано, в случае, когда наночастицы с инкапсулированным кумарином с RGD или без него вводили вокруг опухоли группам из 4 мышей и сканировали в течение 96 часов. Интенсивность флуоресценции показала, что период полужизни RGD, связанного с наночастицами, по меньшей мере, в 4 раза больше, чем у свободного RGD (фигура 9c).

Пример 7: Направленная доставка ингибитора SB505124 TGF-β с пептидом RGD связана с противоопухолевой активностью

Материалы и методы

Материалы представляют собой описанное выше. Для исследования in vivo мышей помещали в автоклавированные микроизолирующие клетки, которые помещали в стойку с герметичным положительным давлением и поддерживали в соответствии с утвержденным ведомственным комитетом Йельского университета протоколом по уходу и использованию животных. Мышей случайным образом распределяли в экспериментальные и контрольные группы по 5-7 животных в каждой. Клетки меланомы B16F10 культивировали, как описано выше. Ксенотрансплантаты меланомы инициировали подкожной имплантацией 5×10⁶ клеток B16F10-OVA или B16F10 в правый задний бок мышей. Через 10 дней каждая мышь получала различные составы лекарств. Все составы вводили непосредственно в опухоль. Для исследования многократных доз все составы вводили один раз в неделю. Ингибирование активности опухоли определяли по объему опухоли, который рассчитывали с использованием следующего уравнения: V=(w)²×(l)/2, где (w) и (l) представляют собой ширину и длину опухоли, измеренные с помощью штангенциркуля.

Для исследования биораспределения в опухолях мыши получали наночастицы RGD с инкапсулированным кумарином-6 путем инъекции внутрь опухоли. Наночастицы без RGD с инкапсулированным кумарином-6 использовали в качестве контроля. С помощью инструмента молекулярной визуализации in vivo (Carestream molecular imaging) мышей сканировали для измерения интенсивности флуоресценции кумарина-6 в опухоли в различные моменты времени после инъекции. Интенсивность флуоресценции кумарина-6 у каждой мыши анализировали в интересующей области (ROI), охватывающей каждую площадь опухоли в каждый момент времени.

Результаты

Опухолевые клетки меланомы 16F10 (500000 клеток) вводили в хвостовую вену мышей C57BL/6 на 0 день. На 5 день мышам вводили в./в. SB505124 и RGD в растворе или в виде нагруженных на наночастицы одного или обоих агентов. Через десять дней мышей забивали, собирали легкие, и подсчитывали опухолевые узлы. На фигуре 10А показано, что введение SB505124 и RGD, связанных с наночастицами, приводило к значительному снижению количества узлов по сравнению с введения двух агентов в растворе; наночастицы, содержащие каждый агент по отдельности, вызвали промежуточный ответ.

Для определения влияния этих агентов на метастатические опухоли в течение более продолжительных периодов времени 500000 клеток меланомы B16fl0 вводили в./в. через хвостовую вену в день 0. Опять мышам-опухоленосителям вводили SB505124 и RGD, либо в растворе, либо нагруженными на наночастицы, в этом случае на дни 5, 12, 19 и 26. На фигуре 10B показано, что лечение SB505124 и RGD, связанными с наночастицами, приводило к значительному увеличению времени выживаемости по сравнению с мышами, получавшими агенты в растворе.

Существует ряд механизмов, с помощью которых SB505124 и RGD, связанные с наночастицами, могут вызвать сильное ингибирующее действие в модели метастатической опухоли. Один убедительный механизм включает процесс метастазирования. Накопленные данные свидетельствуют о том, что подфракция раковых клеток, стволовые раковые клетки (CSCs), обладает исключительными способностями к образованию и обновлению опухоли (Clarke, et al., Cancer Res., 66:9339-9344 (2006); Dalerba, et al., Annu. Rev. Med., 58:267-284 (2007)). CSCs в солидных опухолях, как обычно считается, являются функционально однородной популяцией раковых клеток, которая регулирует поддержание опухоли. В эпителиальной опухоли эти CSCs поддерживают эпителиальные характеристики опухоли, но не обладают способностью мигрировать и, следовательно, не могут обеспечить метастазирование. Только маленькая подгруппа имеет потенциал для миграции и инициации образования метастазов. Это свойство связано с экспрессией TGF-β, который может играть важную роль в метастазировании рака, вызывая эпителиально-мезенхимальный переход (EMT). Таким образом, TGF-β, секретируемый большинством раковых клеток, может функционировать паракринным образом для индукции образования раковых клеток с метастатическим потенциалом.

Эксперименты разрабатывались для определения того, может ли ингибирование TGF-β в микроокружении опухоли предотвратить возникновение мезенхимальных клеток и, таким образом, уменьшить метастатический потенциал опухоли.

Для тестирования потенциального снижения миграции клеток с помощью ингибирования TGF-β использовали анализ методом зарастания царапины (фигура 10C) и анализ формирования сфероида (фигура 10D). В первом случае клетки помещали в лунку, и область царапали наконечником пипетки при t=0. Через 24 часа изобретатели сравнивали миграцию клеток в области царапины в присутствии (1) TGF-β, (2) смеси SB505124, или (3) наночастиц PLGA, несущих RGD на поверхности и нагруженных SB505124. Снижение миграции раковых клеток наносили на график как отношение площади раны (зона, свободная от клеток, через 24 час/зона, свободная от клеток, в 0 часов) (фигура 10C). Аналогичные эффекты наблюдались в анализе образования сфероида in vitro, где изобретатели наблюдали, что синергичное направленное действие RGD и SB505124 способствовало повышенному снижению образования сфероида (фигура 10D). Эти исследования показали, что совместно локализующаяся паракринная доставка RGD и SB505124 существенно ингибирует миграцию раковых клеток и поддерживает концепцию, о том, что направленная доставка на основе наночастиц с RGD дополнительно значительно усиливает антиметастатическое действие ингибитора TGF-β, способствуя удержанию в микроокружении опухоли.

Пример 8: Противоопухолевые эффекты ингибитора TGF-β лозартана в сочетании с пептидом RGD

Материалы и методы

Материалы описаны выше в примере 6. В настоящем примере использовали лозартан вместо SB505124 в той же концентрации.

Результаты

Эффект пептида RGD тестировали также в сочетании с лозартаном. Лозартан, наиболее известный как антагонист рецептора ангиотензина II, также негативно регулирует TGF-β (Guo, et al., Zhonghua Nei Ke Za Zhi, 42:403-8 (2003)). На фигурах 11A-11C показано, что, когда мышам C57BL/6 вводили клетки меланомы B16F10 и затем (1) пустые наночастицы, (2) растворимый лозартан плюс растворимый RGD, (3) наночастицы, нагруженные лозартаном, или (4) наночастицы, нагруженные лозартаном плюс RGD, наночастицы, нагруженные лозартаном плюс RGD, были гораздо более эффективными, чем любой из других вариантов лечения в снижении роста опухоли и в продлении выживаемости мышей-опухоленосителей.

Пример 9: Наночастицы, инкапсулирующие IL-12, стимулируют антигенспецифические CD4+ Т-клетки

Материалы и методы

Способы получения наночастиц PLGA, декорированных авидином и инкапсулирующих IL-12, идентичны примеру 3. IL-12 использовали в концентрации 100 мкг/мл на 100 мг PLGA. Изобретатели использовали биотинилированный пептид/MHC II, специфичный для пептида овальбумина.

Результаты

Одним из способов стимуляции развития более стойкого ответа цитотоксических Т-клеток является содействие CD4⁺ Т-хелперов. CD4⁺ Т-клетки, как показано ранее, спасают истощенные цитотоксические Т-клетки и полностью восстанавливают их функцию in vivo (Aubert, et al., Proc Natl Acad Sci, 108:21182-21187 (2011)). Содействие CD4⁺ Т-клеток может быть представлено ​​в виде CD40-CD40L взаимодействий, как с дендритными клетками, так и с цитотоксическими Т-клетками, таким образом, примируя CD8⁺-противоопухолевые реакции прямым и непрямым способом (Nesbeth, et al., Journal of immunology, 184:5654-5662 (2010), Shafer-Weaver, et al., Cancer Research, 69:6256-626 (2009)). В дополнение к этому CD4⁺ Т-клетки могут также активировать природные клетки-киллеры и макрофаги, стимулируя задержку роста раковых клеток (Corthay, Immunity, 22, 371-383 (2005)). Perez-Diez, A., Blood, 109:5346-5354 (2007). Braumuller, et al., Nature, 494:361-365 (2012)). Кроме того, CD4⁺ Т-клетки могут также направлять киллеры к опухолевым клеткам, у которых негативно регулируется MHC-I, таким образом избегая разрушения цитотоксических Т-клеток путем взаимодействия с молекулами MHC-II, которые могут позитивно регулироваться в некоторых солидных опухолях. Показано также, что перенос специфичных для опухоли CD4⁺ Т-клеток индуцировал клинически стойкие реакции в модели метастатической меланомы (Hunder, et al., The New England journal of medicine, 358, 2698-2703 (2008), Kahn, Journal of immunology, 146:3235-3241 (1991)). Еще важнее, что перенесенные CD4⁺ Т-клетки стимулировали Т-клеточные реакции против неродственных опухолевых антигенов.

Одним из движущих факторов дифференцировки CD4⁺ Т-клеток является цитокиновая среда, и IL-12 играет роль в стимуляции дифференцировки Thl CD4⁺ Т-клеток. Эксперименты планировались для тестирования того, будут ли частицы, инкапсулирующие IL-12 и презентирующие пептидные комплексы MHC-II или лиганды, направленные на поликлональные CD4 Т-клетки, способствовать дифференцировке Thl CD4⁺ Т-клеток из популяции наивных клеток. IL-12 может быть эффективно инкапсулирован в наночастицы PLGA и нанолипогель. CD4⁺ Т-клетки, обработанные наночастицами, инкапсулирующими IL-12, секретировали значительно больше IFN-гамма, чем клетки, инкубированные с пустыми наночастицами (фигура 12). Уровни IL-4, секретируемые этими клетками, были ниже пределов чувствительности метода, что указывает на то, что эти клетки являются Thl CD4⁺ Т-клетками. Кроме того, наночастицы, инкапсулирующие IL-12, способствовали положительной регуляции экспрессии CD44, CD25 и CD27 по сравнению с исходной наивной популяцией клеток и клетками, обработанными пустыми наночастицами.

Уровень комплексов MHC-II, презентирующих Ova, на поверхности наночастиц по изобретению, инкапсулирующих IL-12, титровали, и последующий ответ CD4 Т-клеток сравнивали с клетками, экспонированными с пустыми наночастицами. При использовании мечения клеток индийским фиолетовым показано, что более высокий процент CD4⁺ ОТ-II клеток, инкубированных с наночастицами, инкапсулирующими IL-12, пролиферировал. Кроме того, эти клетки были более сильно активированы, чем CD4⁺ Т-клетки, что видно по их экспрессии более высоких уровней CD25 и CD44 и секреции значительно более высоких уровней интерферона-гамма (фигура 13А). Заключается, что инкапсулирование IL-12 в наночастицы, направленные на CD4, повышает ответ и активацию CD4⁺ Т-клеток.

Пример 10: Иммунологические механизмы противоопухолевых эффектов нанолипогелей

Для тестирования возможности использования наночастиц для расширения популяции Т-клеток, специфичных для опухолевого антигена, которые могут проявлять противоопухолевые эффекты, получали наночастицы, содержащие антиген MART-1 меланомы в контексте HLA-A2, и представляли их CD8+ Т-клеткам, выделенным из pBLs человека, (фигуры 13А-13В). Как показано на фигуре 13А, эти наночастицы были очень эффективны в расширении популяции Т-клеток в течение 28 дней в культуре, с максимальным увеличением приблизительно в 150 раз через 21 день в культуре. Экспансия была гораздо более выражена, чем экспансия, полученная при экспозиции культур Т-клеток с растворимым IL-2 плюс антиген MART-1 или с IL-2 плюс дендритные клетки, которые были пульсированы антигеном MART-1 (фигура 13A). С 14 дня культивирования и далее большинство Т-клеток в культурах, обработанных наночастицами, нагруженными MART, формировали тетрамеры при экспозиции с MART (фигура 13В), что указывает на то, что расширенная популяция Т-клеток действительно является высоко антигенспецифичной.

Пример 11: Нанолипогели лозартан/IL-2 являются адъювантом, который усиливает эффективность терапии антителами против PD1 и против CTLA4

Материалы и методы

Для исследования in vivo мышей помещали в автоклавированные микроизолирующие клетки, которые помещали в стойку с герметичным положительным давлением и поддерживали в соответствии с утвержденным протоколом. Мышей случайным образом распределяли в экспериментальные и контрольные группы по 6-8 животных в каждой. Клетки меланомы B16F10 культивировали следующим образом: клетки меланомы B16F10 культивировали в среде DMEM с 10% FBS. После достижения конфлуэнтности клетки открепляли с помощью трипсин-ЭДТА и 2×l0⁵ клеток вводили внутривенно (в хвостовую вену в./в. инъекции B16F10 (200000 клеток/50 мкл) (Gorelik et al., Nat Med., 7(10):1118-22 (2001)).

Через 7-10 дней начинали лечение, причем каждая доза состояла из 5 мг нанолипогелей, вводимых внутривенно путем инъекции в хвостовую вену. Антитела против CTLA4 и против PD-1 вводили в./б. со схемой доз, указанной в таблице.

Виды in vivo - модель метастазов

Мыши C57BL/6 (группы 1-10)

Лечение

в./в. (группа 10)

Схема

Доза×(количество повторов)

«IMM1» в этом примере и в таблице 1, фигуре 14 и в связанном с ними описании относится к нанолипогелям («NLG»), нагруженным как IL-2, так и лозартаном. Нанолипогели имеют одну и ту же композицию полимеров и липидов, что и нанолипогели, описанные в приведенных выше примерах. «PD1» в этом примере и в таблице 1, фигуре 14 и в связанном с ними описании относится к антагонистическому антителу против PD-1.

«Yervoy» в этом примере и в таблице 1, фигуре 14 и в связанном с ними описании относится к антагонистическому антителу против CTLA4.

Таблица 1 Схема лечения для групп 1-12 Группа Лекарство N Доза Схема введения лекарства Цикл 1 IMM1 10* 5 мг 7, 14, 21, 28, 35 2 IMM1 10* 5 мг 7, 10, 13, 16, 19 3 IMM1 5 5 мг 7, 10, 13, 16, 19
34, 37, 40, 43, 46 Повторный еще раз через 2 недели 4 IMM1 8** 0,5 мг 7, 10, 13, 16, 19 4a IMM1 2** 0,5 мг 7, 10 5 PD1 5* 100 мкг 7 и 10 день 6 PD1+LosNLG 5* 100 мкг/0,5 мг 7 и 10 день 7 LosNLG 5* 0,5 мг 7 и 10 день 8 PD1+IMM1 5* 100 мкг/0,5 мг 7 и 10 день 9 Yervoy 5* 100 мкг 7 и 10 день 10 Yervoy+IMM1 5* 100 мкг/0,5 мг 7 и 10 день 11 Yervoy+1MM1 5* 100 мкг/0,5 мг 7 и 10 день для mAb 7 день для IMM1 12 PD1+IMM1 5* 100 мкг/0,5 мг 7 и 10 день для mAb 7 день для IMM1 - * Забой 3 мышей для подсчета метастазов в легких, массы печени, взятия крови для секвенирования TCR и CBC, фиксации ткани легкого и окраски опухоли и Т-клеток.
- ** Забой 2 мышей для подсчета метастазов в легких, массы печени, взятия крови для секвенирования TCR и CBC, фиксации ткани легкого и окраски опухоли и Т-клеток.
- mAb, вводимые в./б. на 7 и 10 день.
- Часть групп 1-4 оставляли на тестирование выживаемости в дополнение к подгруппе, забиваемой на 14 день для анализов крови, опухоли и тканей.
- Животных групп 5-12 всех забивали на 14 день для анализов крови, опухоли и тканей.

Результаты

Данные эксперимента, проиллюстрированного на фигуре 14, демонстрируют два важных момента. (1) Частота и доза могут иметь большое значение для терапевтической функции IMM1 (Лозартан-IL2) в нанолипогелях по отдельности. Например, IMM-1, вводимый три раза в самой высокой дозе, снижает количество метастатических поражений сильнее, чем в 10 раз сниженная доза, вводимая с той же частотой. (2) Кроме того, показано, что антитела против PD1 и против CTLA4 функционируют сильнее, чем аддитивно с IMM1 и/или что IMM-1 работает как адъювант или усиливает терапевтический ответ этих антител. Например, IMM1, вводимые дважды в 10 раз более низкой дозе, и антитело против PD1 само по себе связаны с более высоким количеством метастазов в легких по сравнению с введением обоих агентов (терапевтически эффект более чем аддитивный). То же самое относится и к антителу против CTLA4 (Yervoy).

Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической композиции наночастиц, предназначенной для иммунотерапии. Композиция включает (a) носитель для доставки, выбранный из группы, состоящей из нанолипогеля, содержащего полимерное ядро и липидную оболочку, и биодеградируемой полимерной наночастицы; и (b) IL-2 и лозартан, загруженные в носитель для доставки, прикрепленные к его поверхности и/или заключенные в носитель для доставки. Также предложен способ увеличения или улучшения иммуностимулирующего или усиливающего иммунитет действия агента, стимулирующего иммунный ответ, способ увеличения или улучшения химиотерапевтического действия химиотерапевтического агента, способ лечения рака. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 11 пр.

1. Фармацевтическая композиция наночастиц, предназначенная для иммунотерапии, включающая:

(a) носитель для доставки, выбранный из группы, состоящей из нанолипогеля, содержащего полимерное ядро и липидную оболочку, и биодеградируемой полимерной наночастицы; и

(b) IL-2 и лозартан, загруженные в носитель для доставки, прикрепленные к его поверхности и/или заключенные в носитель для доставки.

2. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.1, в которой носитель для доставки представляет собой нанолипогель, содержащий полимерное ядро, сформированное из не сшиваемых поперечно полимеров.

3. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.1 или 2, в которой носитель для доставки представляет собой нанолипогель, содержащий полимерное ядро, сформированное из одного или более поперечно сшиваемых полимеров, которые необязательно поперечно сшиты с помощью одной или более фотополимеризуемых групп.

4. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.1 или 2, в которой носитель для доставки представляет собой нанолипогель, содержащий полимерное ядро, сформированное из блок-сополимеров, содержащих один или более поли(алкиленоксид)ных сегментов, выбранных из полиэтиленгликольных, полипропиленовых, 1,2-гликольных, поли(пропиленоксид)ных и/или полипропилен-1,3-гликольных сегментов; и/или одного или более алифатических полиэфирных сегментов, выбранных из полимолочной кислоты (PLA), полигликолевой кислоты (PGA) и/или полилактид-со-гликолида (PLGA); и необязательно одной или более фотополимеризуемых групп.

5. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.4, в которой блок-сополимер представляет собой три-блок-сополимер, содержащий центральный поли(алкиленоксид)ный сегмент, прилегающие алифатические полиэфирные сегменты, присоединенные к любому концу центрального поли(алкиленоксид)ного сегмента, и необязательно одну или более фотополимеризуемых групп.

6. Фармацевтическая композиция наночастиц по любому из пп.1, 2 и 5, в которой носитель для доставки представляет собой нанолипогель, содержащий ядро из полимерного матрикса, содержащего одну или более молекул-хозяев, диспергированных в пределах полимерного матрикса или ковалентно связанных с ним, и липидную оболочку.

7. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.6, в которой молекулу-хозяина выбирают из группы, состоящей из полисахаридив, циклодекстринов, криптандов, криптофанов, кавитандов, краун-эфиров, дендримеров, катенанов, поликатенанов, карцерандов, сферандов, углеродных нанотрубок, фуллеренов, неорганических фосфатов и кремнезема.

8. Фармацевтическая композиция наночастиц по любому из пп.1, 2, 5 и 7, в которой носитель для доставки представляет собой нанолипогель, содержащий полимерное ядро, содержащее одну или более молекул-хозяев и липидную оболочку; и где каждый из IL-2 и лозартана диспергирован в пределах полимерного ядра, диспергирован в пределах липидной оболочки и/или присоединен к липидной оболочке.

9. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.8, в которой лозартан связан с молекулой-хозяином и IL-2 диспергирован в пределах полимерного ядра.

10. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.6, в которой одна или более молекул-хозяев включает циклодекстрин, который нефункционализирован или функционализирован одной или более реакционноспособными функциональными группами, которые реагируют с ядром из полимерного матрикса, и/или одной или более реакционноспособными функциональными группами, которые модифицируют растворимость циклодекстрина.

11. Фармацевтическая композиция наночастиц по любому из пп.1, 2, 5, 7, 9 и 10, в которой носитель для доставки представляет собой нанолипогель, содержащий липидную оболочку, сформированную из смеси фосфолипидов, ПЭГилированного фосфолипида и холестерина.

12. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.1, в которой носитель для доставки представляет собой полимерную наночастицу, сформированную из одного или более полимеров, выбранных из полимеров оксикислот и сополимеров оксикислот с полиэтиленгликолем, полиангидридов, поли(орто)эфиров, полиуретанов, поли(масляной кислоты), поли(валериановой кислоты), поли(лактид-со-капролактона), и их смесей и сополимеров.

13. Фармацевтическая композиция наночастиц по любому из пп.1, 2, 5, 7, 9, 10 и 12, в которой носитель для доставки декорируется направляющей частью, выбранной из пептида RGD, агониста CD40, антитела против CD40 или его фрагмента, Т-клеточного рецептора (TCR), комплекса IL-15/IL-15Rα или группы, направленной на антиген представленных клеток.

14. Фармацевтическая композиция наночастиц по любому из пп.1, 2, 5, 7, 9, 10 и 12, которая дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент, представляющий собой иммуномодулятор или химиотерапевтический агент, где по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент не загружен в носитель для доставки, не прикреплен к его поверхности и/или не заключен в него.

15. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.14, в которой иммуномодулятор представляет собой агент, стимулирующий иммунный ответ; блокирующий иммунную супрессию агент; или агент, направленный на блокаду контрольной точки опухоли или на костимулирующие молекулы.

16. Фармацевтическая композиция наночастиц по п.15, в которой агент, стимулирующий иммунный ответ, представляет собой антагонист PD-1, антагонист CTLA4 или их комбинацию; и/или в которой химиотерапевтический агент представляет собой доксорубицин.

17. Способ увеличения или улучшения иммуностимулирующего или усиливающего иммунитет действия агента, стимулирующего иммунный ответ, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 в комбинации с агентом, стимулирующим иммунный ответ, для повышения иммуностимулирующего или усиливающего иммунитет действия агента, стимулирующего иммунный ответ, где фармацевтическую композицию наночастиц вводят индивидууму совместно с или раздельно от указанного агента, стимулирующего иммунный ответ.

18. Способ по п.17, где фармацевтическую композицию и агент, стимулирующий иммунный ответ, вводят индивидууму раздельно и независимо, одновременно или в разное время.

19. Способ по любому из пп.17 или 18, где агент, стимулирующий иммунный ответ, представляет собой антагонист PD-1 или антагонист CTLA4.

20. Способ увеличения или улучшения химиотерапевтического действия химиотерапевтического агента, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 в комбинации с химиотерапевтическим агентом для повышения химиотерапевтического действия химиотерапевтического агента, где фармацевтическую композицию наночастиц вводят индивидууму совместно с или раздельно от указанного химиотерапевтического агента.

21. Способ по п.20, где фармацевтическую композицию и химиотерапевтический агент вводят индивидууму раздельно и независимо, одновременно или в разное время.

22. Способ по п. 20 или 21, где химиотерапевтический агент представляет собой доксорубицин.

23. Способ лечения рака, включающий введение индивидууму, страдающему раком, эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 для снижения одного или более симптомов рака.