БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАЦИЕНТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АНТАГОНИСТАМИ VEGF Российский патент 2018 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам идентификации пациентов, которые получают положительный результат от лечения антагонистом VEGF, например, антителом против VEGF.

Уровень техники

Измерение уровней экспрессии биомаркеров (например, секретируемых белков в плазме) может представлять собой эффективное средство для идентификации пациентов и популяций пациентов, которые будут отвечать на конкретные виды терапии, включая, например, лечение антагонистами VEGF, такими как антитела против VEGF.

Существует необходимость в эффективных средствах для определения, какие пациенты будут отвечать на лечение, и в введении таких определений в эффективные схемы лечения для пациентов с терапией антагонистами VEGF, независимо от того, используют их в качестве единственных средств или объединяют с другими средствами.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам идентификации пациентов, которые получат положительный результат от лечения антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF. Таких пациентов идентифицируют на основании уровней экспрессии генов, указанных в таблице 1 или 2.

Таким образом, один из вариантов осуществления изобретения относится к способам определения пациента, который с большой вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF, где способы включают (a) детекцию экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, в биологическом образце, получаемом у пациента до какого-либо введения антагониста VEGF пациенту, и (b) сравнения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, где по изменению уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента относительно эталонного уровня определяют пациента, который с большой вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF.

Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к способам оптимизации терапевтической эффективности антагониста VEGF для пациента, где способы включают (a) детекцию экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, в биологическом образце, получаемом у пациента до какого-либо введения антагониста VEGF пациенту, и (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, где по изменению уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента относительно эталонного уровня определяют пациента, который с большой вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF.

Со ссылкой на указанные выше варианты осуществления в некоторых дополнительных вариантах осуществления пациент входит в популяцию пациентов, подлежащих тестированию на восприимчивость к антагонисту VEGF, и эталонный уровень представляет собой средний уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов. В некоторых вариантах осуществления изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента представляет собой повышение относительно эталонного уровня. В некоторых вариантах осуществления изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента представляет собой снижение относительно эталонного уровня. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один ген в биологическом образце, получаемом у пациента, детектируют посредством измерения мРНК. В некоторых вариантах осуществления экспрессию по меньшей мере одного гена в биологическом образце, получаемом у пациента, детектируют посредством измерения уровней белка в плазме. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой опухолевую ткань. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают детекцию экспрессии по меньшей мере второго, третьего, четвертого или более гена, указанного в таблице 1 или 2, в биологическом образце у пациента. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один ген выбран из группы, состоящей из: Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM. В некоторых вариантах осуществления антагонист VEGF представляет собой антитело против VEGF, такое как бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления пациент страдает ангиогенным нарушением. В некоторых вариантах осуществления пациент страдает злокачественной опухолью, выбранной из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака легких, глиобластомы и их сочетаний.

Также со ссылкой на указанные выше варианты осуществления способы могут дополнительно включать (c) выбор антагониста VEGF для лечения пациента, когда детектируют изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента относительно эталонного уровня. Кроме того, способы могут включать (d) введение антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб) пациенту.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способам выбора терапии для конкретного пациента в популяции пациентов, рассматриваемых для проведения терапии, где способы включают: (a) детекцию экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, в биологическом образце, получаемом у пациента до какого-либо введения антагониста VEGF пациенту, (b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере одного гена, где по изменению уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента относительно эталонного уровня идентифицируют пациента, который с большой вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF, и (c) выбор антагониста VEGF в качестве терапии, если пациента идентифицировали, как с большой вероятностью реагирующего на лечение антагонистом VEGF, или (d) выбор терапии, которая не представляет собой антагонист VEGF, если пациента не идентифицировали, как с большой вероятностью реагирующего на лечение антагонистом VEGF.

В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой средний уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов. В некоторых вариантах осуществления изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента представляет собой повышение относительно эталонного уровня. В некоторых вариантах осуществления изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента представляет собой снижение относительно эталонного уровня. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают детекцию экспрессии по меньшей мере второго, третьего, четвертого или более гена, указанного в таблице 1 или 2, в биологическом образце у пациента. В некоторых вариантах осуществления терапия (d) представляет собой средство, выбранное из группы, состоящей из антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства, цитотоксического средства и их сочетаний. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают (e) введение эффективного количества антагониста VEGF пациенту, если пациента идентифицируют, как с большой вероятностью реагирующего на лечение антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления антагонист VEGF представляет собой антитело против VEGF, такое как бевацизумаб. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение эффективного количества по меньшей мере второго средства. В некоторых вариантах осуществления второе средство выбрано из группы, состоящей из антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства, цитотоксического средства и их сочетаний.

Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к способам идентификации биомаркера для определения восприимчивости к антагонисту VEGF, где способы включают: (a) детекцию экспрессии биомаркера-кандидата в биологическом образце, получаемом у пациента до введения антагониста VEGF пациенту, и (b) сравнение экспрессии биомаркера-кандидата с эталонным уровнем экспрессии биомаркера-кандидата, где по изменению уровня экспрессии биомаркера-кандидата в образце у пациента относительно эталонного уровня идентифицируют биомаркер-кандидат как биомаркер пациента, который с большой вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой средний уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в популяции пациентов, тестируемых на вероятность того, что они реагируют на лечение антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, ранее получаемом у пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент ранее получал лечение антагонистом VEGF, и у него в настоящее время развиваются метастазы. В некоторых вариантах осуществления антагонист VEGF представляет собой антитело против VEGF, такое как бевацизумаб. Кроме того, способы могут дополнительно включать (c) выбор биомаркера-кандидата с изменением уровня экспрессии относительно эталона для применения в качестве биомаркера для определения восприимчивости к лечению антагонистом VEGF.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способам диагностики ангиогенного нарушения у пациента, где способы включают этапы: (a) детекции уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, или биомаркера, идентифицированного способами, такими как описанные выше способы, в образце, получаемом у пациента до какого-либо введения антагониста VEGF пациенту, и (b) сравнения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена или биомаркера с эталонным уровнем по меньшей мере одного гена, где по изменению уровня экспрессии по меньшей мере одного гена в образце у пациента относительно эталонного уровня идентифицируют пациента, страдающего ангиогенным нарушением. Эти способы могут дополнительно включать (c) выбор антагониста VEGF для лечения пациента, когда в образце у пациента детектируют изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена относительно эталонного уровня. Кроме того, способы могут дополнительно включать (d) введение антагониста VEGF пациенту. Кроме того, способы, описываемые в настоящем описании, могут дополнительно включать этап получения образца у пациента, как описано в настоящем описании. Кроме того, способы, описываемые в настоящем описании, можно проводить у пациентов, у которых диагностировали злокачественную опухоль, как описано в настоящем описании, для определения оптимальной схемы лечения.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изменение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена или биомаркера в образце у пациента относительно эталонного уровня можно определять путем вычисления сигнатурной оценки VDV (VDV_i) для образца пациента в соответствии с алгоритмом

в котором Z_g=1,i, Z_g=2,i,… Z_g=n,i представляют собой стандартизованные z-оценки значений экспрессии для каждого гена или биомаркера g, от g=1 до g=n, образца i, и в котором VDV_i ниже первого определяемого порогового уровня указывает на снижение относительно эталонного уровня, и VDV_i выше второго определяемого порогового уровня указывает на повышение относительно эталонного уровня. В некоторых вариантах осуществления значения экспрессии для каждого гена или биомаркера g, от g=1 до g=n, представляют собой значения кПЦР в реальном времени для каждого гена g от g=1 до g=n. В некоторых вариантах осуществления первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -0,5 (например, -4, -3,5, -3, -2,5, -2, -1,5, -1 или -0,5), и второй определяемый пороговый уровень составляет от 0,5 до 4 (например, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4). В некоторых вариантах осуществления первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -1 (например, -4, -3,5, -3, -2,5, -2, -1,5 или -1), и второй определяемый пороговый уровень составляет от 1 до 4 (например, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4). В некоторых вариантах осуществления первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -1,5 (например, -4, -3,5, -3, -2,5, -2 или -1,5), и второй определяемый пороговый уровень составляет от 1,5 до 4 (например, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4). В других вариантах осуществления первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -2 (например, -4, -3,5, -3, -2,5 или -2), и второй определяемый пороговый уровень составляет от 2 до 4 (например, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4).

Эти и другие варианты осуществления дополнительно описаны в подробном описании, которое следует ниже.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1A представлен гистологический и графический анализ плотности микрососудов (MVD) и определение индекса пролиферации клеток нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы (PNET) мышей через 72 часа, 7 суток и 14 суток после обработки mAb против VEGF. Характерные изображения из гистологического анализа плотности сосудов опухоли посредством окрашивания MECA-32 (слева) и индекса пролиферации посредством Ki67 (справа) в различные моменты времени после обработки антителом против VEGF (20X увеличение). Количественное определение из 4-6 опухолей в каждом случае представлено в виде столбчатых диаграмм ниже в виде среднего значения +/- SEM. *P<0,05, NS=незначимое.

Фиг. 1B представляет собой график, демонстрирующий кинетику эффектов антитела против VEGF на опухолевую нагрузку на модели RIP-TβAg. Опухолевая нагрузка у мышей, обрабатываемых антителом против VEGF, (красные столбцы) является значительно ниже, чем у обрабатываемых контролем мышей (черные столбцы) на 21 сутки, но не на 14 сутки исследования. *=p<0,05 (t-критерий), n=5-8 мышей/группа/момент времени.

Фиг. 1C представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней экспрессии генов VDV в ответ на лечение антагонистом VEGF. Уровни экспрессии генов (показанный в виде красных линий) значительно снижаются относительно всех генов (серая гистограмма). Пунктирная красная линия означает изменение среднего значения для этих выбранных генов. Черная пунктирная линия означает среднее кратное изменение для оставшихся генов.

Фиг. 1D представляет собой график, демонстрирующий изменения уровней экспрессии генов в подгруппе генов в ответ на лечение антагонистом VEGF, как оценивают кПЦР. Столбцы представляют собой среднюю экспрессию из трех независимых биологических повторений. Величины ошибок=log₂ стандартное отклонение.

Фиг. 2A представляет собой набор графиков, демонстрирующих изменения ответа генов VDV на блокаду VEGF на модели опухоли установленной подкожно карциномы молочной железы (MDA-MB-231). Образцы опухоли собирали через 24 часа после обработки антителом против VEGF или контролем. Гены в сигнатуре VDV (красные линии) значительно снижаются относительно всех генов (показанных в виде серой гистограммы) в строме (верхний график, микрочип мыши, p<0,0001), но не в опухолевых клетках (нижний график, микрочип человека, не значимые отличия). Кратные изменения индивидуальных транскриптов proxVDV помечены черными буквами на графике плотности микропанели, n=5-10 образцов для каждой когорты обработки.

Фиг. 2B представляет собой набор графиков, демонстрирующих изменения ответа генов VDV на блокаду VEGF на ортотопической (внутричерепной) модели глиобластомы U87. Образцы опухоли собирали через 13-42 суток после обработки антителом против VEGF или контролем. Гены в сигнатуре VDV (красные линии) значительно снижаются относительно всех генов (показанных в виде серой гистограммы) в строме (верхний график, микрочип мыши, p<0,0105), но не в опухолевых клетках (нижний график, микрочип человека, не значимые отличия). Кратные изменения индивидуальных транскриптов proxVDV помечены черными буквами на графике плотности микропанели, n=5-10 образцов для каждой когорты обработки.

Фиг. 2C представляет собой набор графиков, демонстрирующих подавление, наблюдаемое после местного нанесения антитела против VEGF на рану кожи (верхний график, p=0,0125), и в противоположность активацию, когда рекомбинантный VEGF наносят в течение 12 часов (p<0,0001). Кратные изменения индивидуальных транскриптов proxVDV помечены черными буквами.

Фиг. 2D представляет собой гистологические данные и графики, демонстрирующие, что активация сигнального пути VEGF индуцирует экспрессию генов VDV. В отличие от антитела против VEGF снижение экспрессии сигнатуры генов VDV (правый верхний график, p<0,0001) обработкой антителом против Dll4 вызывает повышение экспрессии большинства генов VDV (правый нижний график, p<0,0001) через 48 часов на модели MDA-MB-231, что согласуется с гиперваскуляризацией, выявляемой иммунофлуоресцентным окрашиванием на CD31/PECAM по сравнению с обработкой контролем (левый). Кратные изменения индивидуальных транскриптов proxVDV помечены черными буквами, n=5-10 образцов для каждой когорты обработки.

Фиг. 3 представляет собой теплокарту, демонстрирующую, что большая часть генов proxVDV очевидно не активируется rVEGF in vitro. Анализы экспрессии генов стимуляции rVEGF HUVEC.

Фиг. 3 представляет собой теплокарту, демонстрирующую, что большая часть генов proxVDV явно не активируется rVEGF in vitro. Анализы экспрессии генов стимуляции rVEGF HUVEC. H (часы) означают продолжительность стимуляции rVEGF. Теплокарта, представленная в настоящем описании, показывает результаты анализа экспрессии на микропанели для выбранных зондов VDV. Темно-синий означает максимальное относительное снижение экспрессии, и темно-красный - максимальную степень повышения экспрессии транскриптов. Гены proxVDV заметно не регулируются rVEGF in vitro. Однако вероятно, что еще не охарактеризованная небольшая группа генов VDV (EHD3, PCHD17 и THBD) в значительной степени активируется стимуляцией rVEGF HUVEC. Данные экспрессии для каждой временной точки предоставлены из трех независимых повторений.

Фиг. 4A представляет собой изображения гибридизации in situ (ISH), демонстрирующие, что ESM1 ген proxVDV представляет собой мишень VEGF in vivo, специфически экспрессируемую в ассоциированной с опухолью сосудистой сети. На верхних изображениях (левое и правое): отрицательные контроли ISH со смысловыми олигонуклеотидами, продемонстрирован незначительный фоновый уровень (неспецифическое окрашивание). На нижних изображениях продемонстрирована экспрессия мРНК ESM1 (посредством ISH с антисмысловыми олигонуклеотидами) на срезах опухоли HM7 от животных, обрабатываемых антителом против VEGF или контролем. Черные стрелки указывают на несколько областей значительной экспрессии мРНК ESM1 сосудов (коричневое окрашивание) в препаратах опухолей, обрабатываемых контролем (нижнее изображение, левый слайд). В противоположность этому, ESM1 является практически не детектируемым в препаратах опухолей животных, обрабатываемых антителом против VEGF (нижнее изображение, справа). Все препараты также контрастно окрашивали гематоксилинэозином (H&E).

Фиг. 4B представляет собой график, демонстрирующий количественное определение окрашивания ESM1 (ISH) в препаратах опухолей животных, обрабатываемых контролем и антителом против VEGF. n=10.

Фиг. 4C представляет собой график, демонстрирующий количественное определение окрашивания MECA32 (PLVAP) в препаратах опухолей животных, обрабатываемых контролем и антителом против VEGF. n=10.

Фиг. 4D представляет собой набор гистологических изображений и соответствующий количественный график, демонстрирующие подтверждение активности in vivo ингибиторов пути VEGF в опухолях MDA-MB-231. Обработка in vivo mAb против VEGF сунитинибом или акситинибом эффективно снижала MVD в опухолях через 72 часа после обработки. Животных, несущих опухоли MDA-MB-231, обрабатывали, как указано в материалах и методах, в течение 72 часов, а затем собирали опухоли для гистологических анализов и анализов экспрессии генов. Верхние изображения: плотность сосудов опухоли посредством окрашивания на MECA-32 (PLVAP) и CD31 (красное). Ядра контрастно окрашивали DAPI (синие). Изображения получали при 20X увеличении. На нижнем графике представлено количественное определение (в виде среднего значения +/- SEM) из 8 опухолей в каждой группе обработки. *P<0,05.

Фиг. 4E представляет собой набор графиков, демонстрирующих, что блокада VEGF или ингибирование последующего сигнального пути VEGFR-2 in vivo индуцирует согласующееся снижение экспрессии генов proxVDV. Анализ кПЦР в реальном времени экспрессии генов в 400 мм³ ксенотрансплантатах опухолей MDA-MB-231, собранных через 8 (нижняя панель), 16 (средняя панель) или 72 часа (верхняя панель) после обработки ингибиторами VEGF и VEGFR-2 (сунитинибом и акситинибом). Значения представляют собой среднее значение log₂ кратного изменения относительной экспрессии генов, индуцируемого ингибитором VEGF/VEGFR-2 по сравнению со средней экспрессией генов при обработке контролем. Не относящиеся к сосудам маркеры, такие как E-cadh и CD45, значительно не изменяются в ответ на эти ингибиторы. На нижней панели (через 8 часов после обработки) продемонстрирована обработка только антителом против VEGF, т.к. акситиниб и сунитиниб не обладали выраженной активностью в этот конкретный момент времени. Данные экспрессии генов представляют собой среднее значение 8 биологических повторений от каждой обработки. Величины ошибок представляют собой стандартное отклонение.

Фиг. 5A представляет собой графики, демонстрирующие согласующееся снижение экспрессии proxVDV многими ингибиторами пути VEGF. Анализ экспрессии генов в ксенотрансплантатах опухолей MDA-MB-231, собираемых через 8, 1 или 72 часа после обработки ингибиторами VEGF и VEGFR-2 (сунитинибом и акситинибом). Значения представляют собой среднее значение log₂ кратного изменения относительной экспрессии генов, индуцированного ингибиторами VEGF/VEGFR-2, по сравнению с обработкой контролем. Данные экспрессии генов представляют собой log₂ среднего значения 8 биологических повторений для каждой обработки. Величины ошибок представляют собой стандартное отклонение.

Фиг. 5B представляет собой график, демонстрирующий количественное определение экспрессии генов proxVDV кПЦР в реальном времени в эндотелиальных клетках, отобранных из ксенотрансплантатов опухолей MDA-MB-231, обрабатываемых mAb против амброзии или против VEGF. Значения представляют собой среднее значение log₂ кратного изменения 3 повторений. Величины ошибок представляют собой стандартное отклонение.

Фиг. 6 представляет собой график, демонстрирующий увеличение маркеров VDV в ассоциированных с опухолью эндотелиальных клетках (TAEC) анализами увеличения экспрессии транскриптов VDV ex vivo в только что выделенных FACS TAEC в сравнении с опухолевыми клетками GFP-MDA-MB-231. Относительную экспрессию генов в TAEC в сравнении с опухолевыми клетками измеряли кПЦР в реальном времени выбранных генов. Все тестируемые гены VDV значительно повышались (в 25-200 раз) в TAEC. В отличие от этого экспрессия мРНК Zeb1 (эпителиального маркера) снижалась в TAEC и увеличивалась в опухолевых клетках. Значения представляют собой среднее значение относительного log₂ кратного повышения гена при сравнении TAEC с опухолевыми клетками. Клетки TAEC сортировали как CD31-положительные, CD45-отрицательные и GFP-отрицательные клетки. Опухолевые клетки сортировали по положительному показателю в отношении GFP. Данные экспрессии генов представляют собой среднее значение шести опухолей, которые объединяли для каждого эксперимента сортировки FACS. кПЦР в реальном времени проводили в трех повторениях. Величины ошибок представляют собой стандартное отклонение.

Фиг. 7 представляет собой график, демонстрирующий изменение экспрессии генов (после обработки в сравнении с перед обработкой) в образцах биопсии у 19 пациентов с воспалительным раком молочной железы. Гены в сигнатуре VDV (красные линии) значительно снижаются относительно всех генов (серая гистограмма), p=0,0275.

Фиг. 8A представляет собой набор графиков, демонстрирующих выживаемость без прогрессирования заболевания (верхний) и общую выживаемость (нижний) 103 пациентов с колоректальным раком с доступной мРНК перед лечением в испытании NO16966.

Фиг. 8B представляет собой схему обзора эксперимента для количественной оценки экспрессии 22 генов VDV с использованием микрочипа Fluidigm для кПЦР в реальном времени ангиогенеза.

Фиг. 8C представляет собой график, демонстрирующий корреляцию уровней экспрессии 22 генов VDV в образцах рака толстого кишечника.

Фиг. 8D представляет собой набор графиков, демонстрирующих, что сигнатуры из 22 генов VDV стратифицирует эффект лечения бевацизумабом (bev) для пациентов с колоректальным раком на поздней стадии. Представлена выживаемость без прогрессирования заболевания (верхний) или общая выживаемость (нижний) пациентов с "VDV-высоким" (сплошные линии) в сравнении с пациентами с "VDV-низким" (пунктирные линии), которые получали лечение XELOX (черные) или XELOX+бевацизумаб (Mullen et al., Cell, 147(3):565-576, 2011). PFS (верхний) эффект выборки генов VDV, стартифицированный по уровням экспрессии (взаимосвязь p=0,036), и OS (нижний) эффект выборки генов VDV, стартифицированный по уровням экспрессии (взаимосвязь p=0,37).

Фиг. 9A представляет собой набор графиков, подтверждающих соответствие между полной сигнатурой VDV "VDV" (ось x) и репрезентативной подгруппой из 22 генов "VDV-22" (ось у), используемой для запроса архивного клинического материала. Набор распространенных образцов представлен с архивными образцами у пациентов, которые подходят для условий исследования терапии первой линии метастазов (сравнимых с NO16966). Архивные образцы оценивали в отношении экспрессии полногеномной РНК на микропанелях на основе гранул Illumina DASL; NSCLC=немелкоклеточная карцинома легких, BR=молочная железа, CRC=колоректальная карцинома.

Фиг. 9B представляет собой набор графиков, демонстрирующих стратификацию пациентов NO16966 по уровням экспрессии VEGF-A, PFS (верхний), взаимосвязь p=0,76 и OS (нижний), взаимосвязь p=0,33.

Фиг. 9C представляет собой набор графиков, демонстрирующих стратификацию пациентов NO16966 по уровням экспрессии CD31, PFS (верхний) взаимосвязь p=0,15 и OS (нижний), взаимосвязь p=0,99.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

1. Введение

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для мониторинга за и/или идентификации пациентов, чувствительных или восприимчивых к лечению антагонистами VEGF, например, антителом против VEGF. Изобретение основано на открытии, что определение уровней экспрессии по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23 или более генов, указанных в таблице 1 или 2, перед лечением антагонистом VEGF (таким как антитело против VEGF) является пригодным для идентификации пациентов, чувствительных или восприимчивых к лечению антагонистом VEGF, например, антителом против VEGF. Необязательно для пациентов затем можно выбирать терапию антагонистом VEGF и, кроме того, у пациентов необязательно можно проводить терапию антагонистом VEGF.

II. Определения

Термины "биомаркер" и "маркер" в настоящем описании используют взаимозаменяемо для обозначения молекулярного маркера на основе ДНК, РНК, белка, углевода или гликолипида, экспрессию или наличие которого в образце у индивидуума или пациента можно детектировать стандартными способами (или способами, описываемыми в настоящем описании), и экспрессия или наличие которого является пригодным для мониторинга восприимчивости или чувствительности являющегося млекопитающим индивидуума к антагонисту VEGF. Такие биомаркеры включают, но не ограничиваются ими, гены, указанные в таблицах 1 и 2. Можно определять, что экспрессия такого биомаркера является выше или ниже в образце, получаемом у пациента, чувствительного или восприимчивого к антагонисту VEGF, по сравнению с эталонным уровнем (включая, например, средний уровень экспрессии биомаркера в образцах от группы/популяции пациентов, тестируемых на восприимчивость к антагонисту VEGF; уровнем в образце, ранее получаемом у индивидуума в предшествующие моменты времени, или уровнем в образце у пациента, который получал ранее лечение антагонистом VEGF (таким как антитело против VEGF) в случае первичной опухоли, и у которого в настоящее время могут развиваться метастазы). Индивидуумов с уровнем экспрессии, который является больше или меньше эталонного уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, такого как гены, указанные в таблицах 1 и 2, можно идентифицировать как индивидуумов/пациентов, с большой вероятностью реагирующих на лечение антагонистом VEGF. Например, таких индивидуумов/пациентов, у которых выявляют уровни экспрессии генов не более 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% относительно (т.е. выше или ниже) эталонного уровня (такого как средний уровень, указанный выше), можно идентифицировать как индивидуумов/пациентов, с большой вероятностью реагирующих на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF.

Термины "образец" и "биологические образец" используют взаимозаменяемо для обозначения любого биологического образца, получаемого у индивидуума, включая жидкости организма, ткани организма (например, опухолевую ткань), клетки или другие источники. Жидкости организма представляют собой, например, лимфу, сыворотку, свежую цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови, замороженную цельную кровь, плазму (включая свежую или замороженную), мочу, слюну, семенную жидкость, синовиальную жидкость и цереброспинальную жидкость. Образцы также включают ткань молочной железы, почечную ткань, ткань толстой кишки, ткань головного мозга, ткань слизистой оболочки, синовиальную ткань, кожу, волосяной фолликул, костный мозг и опухолевую ткань. Способы получения биопсий ткани и жидкостей организма у млекопитающих хорошо известны в данной области.

"Эффективный ответ" пациента или "восприимчивость" или "чувствительность" пациента к лечению антагонистом VEGF относится к клиническому или терапевтическому положительному воздействию, сообщаемому пациенту, подвергающемуся риску или страдающему ангиогенным нарушением, благодаря или в результате лечения антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF. Такое положительное воздействие включает клеточные или биологические ответы, полный ответ, a частичный ответ, стабильное заболевание (без прогрессирования или рецидива) или ответ с поздним рецидивом у пациента благодаря или в результате лечения антагонистом. Например, эффективный ответ может представлять собой уменьшение размера опухоли или выживаемость без прогрессирования у пациента, у которого диагностировали экспрессию одного или более биомаркеров, указанных в таблице 1 или 2, в сравнении с пациентом без экспрессии одного или более биомаркеров. По экспрессии генетического биомаркера(ов) эффективно прогнозируют или прогнозируют с высокой чувствительностью такой эффективный ответ.

"Антагонисты", как используют в настоящем описании, относятся к соединениям или средствам, которые ингибируют или снижают биологическую активность молекулы, с которой они связываются. Антагонисты включают антитела, синтетические пептиды или пептиды с нативной последовательностью, иммуноадгезины и низкомолекулярные антагонисты, которые связываются с VEGF, необязательно конъюгированные или слитые с другой молекулой. "Блокирующее" антитело или антитело-"антагонист" представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность антигена, с которым оно связывается.

"Антитело-агонист", как используют в настоящем описании, представляет собой антитело, которое частично или полностью имитирует по меньшей мере один вид функциональной активности представляющего интерес полипептида.

Термин "антитело" в настоящем описании используют в самом широком смысле, и в частности он включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они проявляют желательную биологическую активность.

"Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое идентифицировали и отделили и/или извлекли из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые препятствуют исследовательскому, диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белки или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают (1) до более 95% по массе антитела, как определяют, например, способом Лоури, и в некоторых вариантах осуществления до более 99% по массе; (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием, например, секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности посредством SDS-PAGE в восстановительных или невосстановительных условиях с использованием, например, окрашивания кумасси синим или серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, вследствие того, что по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не содержится. Однако, как правило, выделенное антитело получают посредством по меньшей мере одного этапа очистки.

"Нативные антитела", как правило, представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины приблизительно 150000 Дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, при этом число дисульфидных связей изменяется в тяжелых цепях различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также содержит расположенные с равными интервалами внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь содержит на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на своем другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Предполагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легких цепей и тяжелых цепей.

"Вариабельная область" или "вариабельный домен" антитела относится к аминоконцевым доменам тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельный домен тяжелой цепи можно обозначать как "VH". Вариабельный домен легкой цепи можно обозначать как "VL". Эти домены, как правило, являются наиболее вариабельными частями антитела и содержит антигенсвязывающие участки.

Термин "вариабельный" относится к тому факту, что последовательности определенных участков вариабельных доменов в антителах значительно различаются и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. Однако вариабельность не распределена равномерно на всем протяжении вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями (HVR), в вариабельных доменах легкой цепи и тяжелой цепи. Наиболее высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержат четыре области FR, преимущественно принимающие конфигурацию бета-слоя, соединенные тремя FIVR, которые, образуют петли, соединяющие структуры бета-слоя и в некоторых случаях образующие ее часть. HVR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости за счет областей FR и совместно с HVR из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего участка антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.

"Легкие цепи" антител (иммуноглобулинов) у любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ) на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

В зависимости от аминокислотных последовательностей константных доменов их тяжелых цепей антитела (иммуноглобулины) можно относить к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделять на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов, как правило, хорошо известны и описаны, например, у Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000). Антитело может являться частью более крупной слитой молекулы, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела с одним или более другими белками или пептидами.

Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "полное антитело" используют в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения антитела в его по существу интактной форме, не в виде фрагментов антител, как определено ниже. В частности, термины относятся к антителу с тяжелыми цепями, которые содержат Fc-область.

"Голое антитело" для целей настоящего документа представляет собой антитело, которое не конъюгировано с цитотоксической группой или радиоактивной меткой.

"Фрагменты антител" содержат участок интактного антитела, предпочтительно содержащего его антигенсвязывающую область. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и фрагменты Fv, диатела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Расщеплением папаином антител получают два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых фрагментами "Fab", каждый с одним антигенсвязывающим участком, и остаточный фрагмент "Fc", название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином приводит к образованию фрагмента F(ab')2, который содержит два антигенсвязывающих участка и является еще способным перекрестно связываться с антигеном.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенсвязывающий участок. В одном из вариантов осуществления двухцепочечная разновидность Fv состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в прочной нековалентной ассоциации. В одноцепочечной разновидности Fv (scFv) вариабельной домен одной тяжелой и одной легкой цепи может быть ковалентно связан гибким пептидным линкером, таким образом, что легкая и тяжелая цепи могут объединяться в "димерную" структуру, аналогичную структуре в двухцепочечной разновидности Fv. Именно в этой конфигурации три HVR каждого вариабельного домена взаимодействуют с определенным антигенсвязывающим участком на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть HVR обеспечивают антигенсвязывающую специфичность антитела. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три специфичных к антигену HVR) обладает способностью распознавать антиген и связываться с ним, хотя с меньшей аффинностью, чем целый участок связывания.

Фрагмент Fab содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, а также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab’ отличаются от фрагментов Fab добавлением новых остатков к C-концу тяжелой цепи домена CH1, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем описании представляет собой обозначение для Fab', в котором остаток(и) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. Фрагменты F(ab')₂ антител исходно получали в виде пары фрагментов Fab’, которые содержат цистеины шарнирной области друг между другом. Также известны другие химические соединения фрагментов антител.

"Одноцепочечный Fv" или "scFv" фрагменты антител содержат домены VH и VL антитела, где эти домены содержатся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv формировать желательную структуру для связывания с антигеном. Для обзора scFv, см., например, Pluckthiin, in The Pharmacology of Mono-clonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. (Springer-Verlag, New York:1994), pp 269-315.

Термин "диатела" относится к фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же самой полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечивать спаривания двух доменов в одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образуют два антигенсвязывающих участка. Диатела могут являться бивалентными или биспецифическими. Диатела более подробно описаны, например, в EP 404097, WO 1993/01161, Hudson et al., Nat. Med., 9:129-134 (2003), и Hollinger et al., PNAS USA, 90:6444-6448 (1993). Триотела и тетратела также описаны у Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Термин "моноклональное антитело", как используют в настоящем описании, относится к антителу, получаемому из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций, например, природных мутаций, которые могут содержаться в незначительных количествах. Таким образом, определение "моноклональный" указывает на характер антитела, как не являющееся смесью отдельных антител. В определенных вариантах осуществления такое моноклональное антитело, как правило, включает антитело, содержащее полипептидную последовательность, которая связывается с мишенью, где связывающуюся с мишенью полипептидную последовательность получали способом, который включает отбор одной связывающейся с мишенью полипептидной последовательности из ряда полипептидных последовательностей. Например, способ отбора может представлять собой отбор уникального клона из ряда клонов, таких как совокупность гибридомных клонов, фаговых клонов или клонов рекомбинантной ДНК. Следует понимать, что выбранную связывающуюся с мишенью последовательность можно дополнительно изменять, например, для улучшения аффинности к мишени, для гуманизации связывающейся с мишенью последовательности, для улучшения ее продуцирования в культуре клеток, для снижения ее иммуногенности in vivo, для получения полиспецифического антитела и т.д., и что антитело, содержащее измененную связывающуюся с мишенью последовательность также представляет собой моноклональное антитело по настоящему изобретению. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, содержат различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной антигенной детерминанты на антигене. В дополнение к своей специфичности препараты моноклональных антител обладают преимуществом, которое заключается в том, что они, как правило, не загрязнены другими иммуноглобулинами.

Определение "моноклональный" указывает на характер антитела, как получаемого по существу из гомогенной популяции антител, и его не следует интерпретировать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие использованию в соответствии с настоящим изобретением, можно получать различными техниками, включая, например, гибридомный способ (например, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and Т-Cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), способы рекомбинантных ДНК (см., например, патент США №4816567), технологии фагового дисплея (см., например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol., 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol., 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA, 101(34):12467-12472 (2004), и Lee et al., J. Immunol. Methods, 284(1-2):119-132(2004), и технологии получения антител человека или подобных антителам человека у животных, которые содержат части или все локусы иммуноглобулина человека или гены, кодирующие последовательности иммуноглобулина человека (см., например, WO 1998/24893, WO 1996/34096, WO 1996/33735, WO 1991/10741, Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993), патенты США № 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016; Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol., 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol., 14:826 (1996) и Lonberg and Fluszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995).

Моноклональные антитела в настоящем описании включают "химерные" антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи является идентичным или гомологичным с соответствующими последовательностями в антителах, получаемых из конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, при этом оставшаяся часть цепи(ей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, получаемых из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител при условии, что они проявляют желательную биологическую активность (например, патент США № 4816567 и Morrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела включают антитела PRIMATIZED®, где антигенсвязывающую область антитела получают из антитела, получаемого, например, иммунизацией представляющим интерес антигеном обезьян макак.

"Гуманизированные" формы не принадлежащих человеку антител (например, мышей) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, получаемую из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (реципиентное антитело), в котором остатки из HVR реципиента заменяют остатками из HVR не являющего человеком видами (донорного антитела), такими как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, обладающей желательной специфичностью, аффинностью и/или емкостью. В некоторых случаях остатки FR иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Такие модификации можно проводить для дополнительного улучшения характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям не принадлежащего человеку иммуноглобулина, и все или по существу все FR представляют собой FR последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также необязательно содержит по меньшей мере участок константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, участок константной области иммуноглобулина человека. Более подробно, см., например, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Также см., например, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994) и патенты США № 6982321 и 7087409.

"Антитело человека" представляет собой антитело, которое содержит аминокислотную последовательность, которая соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого у человека, и/или которое получали любыми техниками получения антител человека, как описано в настоящем описании. Такое определение антитела человека конкретно включает гуманизированное антитело, содержащее не принадлежащие человеку антигенсвязывающие остатки. Антитела человека можно получать различными техниками, известными в данной области, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Также доступными для получения моноклональных антител человека являются способы, описанные у Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Также см. van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74 (2001). Антитела человека можно получать введением антигена трансгенному животному, которое модифицировали для получения таких антител в ответ на антигенную нагрузку, но эндогенные локусы которых блокировали, например, иммунизированные ксеномыши (см., например, патенты США № 6075181 и 6150584 относительно технологии XENOMOUSE™). Также см., например, Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006) относительно антител человека, получаемых технологией B-клеточной гибридомы человека.

Термин "гипервариабельная область", "HVR" или "HV" при использовании в настоящем описании относится к областям вариабельного домена антитела, последовательность которого является гипервариабельной и/или образует петли с определенной структурой. Как правило, антитела содержат шесть HVR, три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). В нативных антителах H3 и L3 обладают наибольшим разнообразием шести HVR, и, в частности, предполагают, что H3 играет уникальную роль в обеспечении высокой специфичности антителам. См., например, Xu et al., Immunity, 13:37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology, 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Фактически встречающиеся в природе антитела верблюда, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и стабильными в отсутствие легкой цепи. См., например, Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448 (1993) и Sheriff et al., Nature Struct. Biol., 3:733-736 (1996).

В настоящем описании используется и включено несколько способов описания HVR. По Kabat HVR, которые представляют собой определяющие комплементарность области (CDR), основаны на вариабельности последовательности, и их используют наиболее часто (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Противоположность этому Chothia рассматривает расположение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). HVR AbM представляют собой компромисс между CDR по Kabat и структурных петель по Chothia, и их используют в программном обеспечении для моделирования антител Oxford Molecular's AbM. "Контактные" HVR основаны на анализе доступных кристаллических структур комплекса. Остатки из каждой из этих HVR указаны ниже.

HVR могут содержать "расширенные HVR", как указано ниже: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH. Остатки вариабельного домена нумеруют согласно Kabat et al., выше, для каждого из этих определений расширенных HVR.

"Каркасная область" или остатки "FR" представляют собой такие остатки вариабельного домена, которые отличаются от остатков HVR, как определено в настоящем описании.

Выражение "нумерация остатков вариабельного домена как у Kabat" или "нумерация положений аминокислот как у Kabat" и его варианты относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи, из собрания данных по антителам у Kabat et al., выше. При использовании этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать одну вставку аминокислоты (остаток 52a согласно Kabat) после остатка 52 H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b, и 82c и т.д. согласно Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию по Kabat остатков можно определять для данного антитела путем выравнивая в областях гомологии последовательности антитела со "стандартной" пронумерованной по Kabat последовательностью.

Антитело со "зрелой аффинностью" представляет собой антитело с одним или более изменений в одной или более его HVR, которые приводят к улучшению аффинности антитела к антигену по сравнению с родительским антителом, которое не содержит такого изменения(ий). В одном из вариантов осуществления антитело со зрелой аффинностью обладает наномолярными или даже пикомолярными аффинностями к антигену-мишени. Антитела со зрелой аффинностью получают известными в данной области способами. Например, Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992) описывают созревание аффинности в результате перетасовки домена VH и VL. Случайный мутагенез HVR и/или каркасный остаток описан, например, у Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA, 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene,169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995) и Flawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992).

"Ингибирующие рост" антитела представляют собой антитела, которые предотвращают или снижают пролиферацию клеток, экспрессирующих антиген, с которым связывается антитело.

Антитела, которые "индуцируют апоптоз", представляют собой антитела, которые индуцируют программируемую гибель клеток, как определяют стандартными анализами апоптоза, такими как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сжатие клетки, расширение эндоплазматического ретикулума, фрагментация клетки и/или образование мембранных везикул (называемых апоптотическими тельцами).

"Эффекторные функции" антитела относятся к таким видам биологической активности, которые присущи Fc-области (Fc-области с нативной последовательностью или Fc-области с вариантом аминокислотной последовательности) антитела, и могут изменяться в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC), связывание Fc-рецептора, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, подавление рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток.

Термин "Fc-область" в настоящем описании используют для обозначения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-области с нативной последовательностью и варианты Fc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут изменяться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека, как правило, определяют, как распространяющуюся от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до ее C-конца. С-концевой лизин (остаток 447 согласно системе нумерации EU) Fc-области можно удалять, например, во время получения или очистки антитела или посредством рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Таким образом, композиция интактных антител может содержать популяции антител со всеми удаленными остатками K447, популяции антител с неудаленными остатками K447 и популяции антител, содержащие смесь антител с остатком K447 и без него.

Если не указано иное в настоящем описании, нумерация остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой нумерацию индекса EU как у Kabat et al., выше. "Индекс EU как у Kabat" относится к нумерации остатков EU антитела IgG1 человека.

"Функциональная Fc-область" обладает "эффекторной функцией" Fc-области с нативной последовательностью. Иллюстративные "эффекторные функции" включают связывание C1q, CDC, связывание Fc-рецептора, ADCC, фагоцитоз, подавление рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и т.д. Для таких эффекторных функций, как правило, необходимо, чтобы Fc-область являлась объединенной со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценивать различными анализами, как описано, например, в определениях в настоящем описании.

"Fc-область с нативной последовательностью" содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, встречающейся в природе. Fc-области с нативной последовательностью человека включают Fc-область IgG1 человека с нативной последовательностью (аллотипы не A и A), Fc-область IgG2 человека с нативной последовательностью, Fc-область IgG3 человека с нативной последовательностью и Fc-область IgG4 человека с нативной последовательностью, а также их природные варианты.

"Вариант Fc-области" содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от Fc-области с нативной последовательностью вследствие по меньшей мере одной модификации аминокислоты, предпочтительно одной или более замен аминокислоты. Предпочтительно вариант Fc-области содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с Fc-областью с нативной последовательностью или с Fc-областью родительского полипептида, например, приблизительно от одной приблизительно до десяти замен аминокислот, и предпочтительно приблизительно от одной приблизительно до пяти замен аминокислот в Fc-области с нативной последовательностью или в Fc-области родительского полипептида. Вариант Fc-области в настоящем описании предпочтительно обладает по меньшей мере приблизительно 80% гомологией с Fc-областью с нативной последовательностью и/или с Fc-областью родительского полипептида и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% гомологией с ней, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% гомологией с ней.

Термин "антитело, содержащее Fc-область" относится к антителу, которое содержит Fc-область. С-концевой лизин (остаток 447 согласно системе нумерации EU) Fc-области можно удалять, например, во время очистки антитела или путем рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело. Таким образом, композиция, содержащая антитело, содержащее Fc-область, по настоящему изобретению, может содержать антитело с K447, со всеми удаленными K447 или смесь антител с остатком K447 и без него.

"Рецептор Fc " или "FcR" описывает рецептор, который связывается Fc-областью антитела. В некоторых вариантах осуществления FcR представляет собой нативный FcR человека. В некоторых вариантах осуществления FcR представляет собой FcR, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII, и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), который содержит аналогичные аминокислотные последовательности, которые различаются преимущественно своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM) (см., например, Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Обзор FcR приведен, например, у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). В настоящем описании в термин "FcR" также входят другие FcR, включая такие, которые идентифицируют в будущем.

Термин "рецептор Fc" или "FcR" также включает неонатальный рецептор, FcRn, который ответственен за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)) и регуляцию гомеостаза иммуноглобулинов. Известны способы измерения связывания с FcRn (см., например, Ghetie and Ward, Immunology Today, 18 (12):592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 (7):637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem., 279(8):6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

Связывание с FcRn человека in vivo и время полувыведения из сыворотки полипептидов, связывающихся с высокой аффинностью с FcRn человека, можно оценивать, например, на трансгенных мышах или в линиях трансфицированных клеток человека, экспрессирующих FcRn человека, или на приматах, которым вводят полипептиды с вариантом Fc-области. WO 2000/42072 (Presta) описаны варианты антител с повышенным или ослабленным связыванием с FcR. См. также, например, Shields et al., J. Biol. Chem., 9(2):6591-6604 (2001).

"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcR и осуществляют эффекторные функции. В определенных вариантах осуществления клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют эффекторную функцию(и) ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), естественные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки можно выделять из природного источника, например, из крови.

"Антителозависимая клеточная цитотоксичность" или "ADCC" относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с рецепторами Fc (FcR), находящимися на определенных цитотоксических клетках (например, NK-клетках, нейтрофилах и макрофагах), позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью, а затем уничтожать клетку-мишень посредством цитотоксинов. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR в гематопоэтических клетках обобщена в таблице 3 на стр. 464 Ravetch ad Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы можно проводить анализ ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патенте США №5500362 или 5821337 или патенте США №6737056 (Presta). Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают клетки PBMC и NK-клетки. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на модели на животных, такой как модель, описанная у Clynes et al., PNAS, (USA) 95:652-656 (1998).

"Обусловленная комплементом цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису клетки-мишень в присутствии комплемента. Классический путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с их распознанным антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано у Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996). Варианты полипептида с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области (полипептиды с вариантом Fc-области) и повышенной или сниженной способностью связывания C1q описаны, например, в патенте США № 6194551 B1 и WO 1999/51642. См. также, например, Idusogie et al., J. Immunol., 164:4178-4184 (2000).

"Аффинность связывания", как правило, относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, как используют в настоящем описании, "аффинность связывания" относится к истинной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно представить константой диссоциации (Kd). Аффинность можно измерять общеизвестными в данной области способами, включая способы, описываемые в настоящем описании. Низкоаффинные антитела, как правило, связываются с антигеном медленно и быстро диссоциируют, тогда как высокоаффинные антитела, как правило, связываются с антигеном быстрее и остаются связанными дольше. В данной области известен ряд способов измерения аффинности связывания, любой из которых можно использовать для целей настоящего изобретения. Конкретные иллюстративные и иллюстративные варианты осуществления измерения аффинности связывания описаны ниже.

В одном из вариантов осуществления "Kd" или "значение Kd" по настоящему изобретению измеряют анализом связывания радиоактивно меченного антигена (RIA), проводимым с вариантом Fab представляющего интерес антитела и его антигеном, как описано в следующем ниже анализе. Аффинность связывания в растворе Fab с антигеном измеряют путем уравновешивания Fab с минимальной концентраций (¹²⁵I)-меченого антигена в присутствии серийного разведения немеченого антигена с последующим захватом связанного антигена на планшете, покрытом антителом против Fab (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol., 293:865-881 (1999)). Для определения условий для анализа планшеты для микротитрования (DYNEX Technologies, Inc.) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл захватывающего антитела против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (pH 9,6), а затем блокируют 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение двух-пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc №269620) 100 пМ или 26 пМ [¹²⁵I]-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с оценкой антитела против VEGF, Fab-12 у Presta et al., Cancer Res., 57:4593-4599 (1997)). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи, однако инкубацию можно проводить в течение более длинного периода времени (например, приблизительно 65 часов) для обеспечения наступления равновесия. Затем смеси переносят в захватывающий планшет для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем удаляют раствор и промывают планшет восемь раз 0,1% поверхностно-активным веществом TWEEN-20™ в PBS. Затем планшеты сушат, добавляют 150 мкл/лунку сцинтиллятор (MICROSCINT-20™, Packard), и снимают показания с планшетов на гамма-счетчике TOPCOUNT™ (Packard) в течение десяти минут. Для применения в анализы конкурентного связывания выбирают концентрации каждого Fab, которые обеспечивают менее или равное 20% от максимального связывания.

По другому варианту осуществления Kd или значение Kd измеряют анализами на основе поверхностного плазмонного резонанса с использованием устройства BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с чипами CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). В кратком изложении, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимидгидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) по инструкциям поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ ацетата натрия, pH 4,8 до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед впрыскиванием при скорости потока 5 мкл/минуту, чтобы получать приблизительно десять единиц ответа (RU) связанного белка. После впрыскивания антигена впрыскивают 1 M этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для измерения кинетики впрыскивают двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% поверхностно-активным веществом TWEEN 20™ (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/минуту. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) рассчитывают с использованием простой модели связывания один к одному Ленгмюра (программное обеспечение для оценки BIAcore® version 3.2) посредством одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение k_off/k_on. См., например, Chen et al., J. Mol. Biol., 293:865-881 (1999). Если скорость прямой реакции превышает 10⁶ M^-1с^-1 в указанном выше анализе на основе поверхностного плазмонного резонанса, то скорость прямой реакции можно определять способом гашение флуоресценции, в котором измеряют увеличение или снижение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение =295 нм, испускание =340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C 20 нМ антитела против антигена (формы Fab) в PBS, pH 7,2 в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, как измеряют на спектрометре, таком как спектрофотометре с возможностью остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометре SLM-AMINC0TM серии 8000 (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.

"Скорость прямой реакции", "скорость ассоциации", "ассоциативная скорость" или "k_on" по настоящему изобретению также можно определять, как описано выше, с использованием системы BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).

Термин "по существу аналогичный" или "по существу одинаковый", как используют в настоящем описании, означает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (например, одним, ассоциированным с антителом по изобретению, и другим, ассоциированным с эталонным/сравниваемым антителом), таким образом, что специалист в данной области считает, что различие между двумя значениями является небольшим или не биологически и/или статистически значимым в рамках биологического признака, измеряемого указанными значениями (например, значением Kd). Различие между двумя указанными значениями составляет, например, менее приблизительно 50%, менее приблизительно 40%, менее приблизительно 30%, менее приблизительно 20% и/или менее приблизительно 10% в зависимости от эталонного/сравниваемого значения.

Фраза "по существу сниженный" или "по существу различный", как используют в настоящем описании, означает достаточно высокую степень различия между двумя числовыми значениями (как правило, одним ассоциированным с молекулой, а другие ассоциированы с эталонной/сравниваемой молекулой), таким образом, что специалист в данной области считает, что различие между двумя значениями является статистически значимым в рамках биологических характеристик, измеряемых указанными значениями (например, значением Kd). Различия между двумя указанными значениями составляют, например, более приблизительно 10%, более приблизительно 20%, более приблизительно 30%, более приблизительно 40% и/или более приблизительно 50% в зависимости от значения для эталонной/сравниваемой молекулы.

В определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело, пригодное в настоящем описании, дополнительно содержит изменения аминокислот Fc IgG и обладает повышенной аффинностью связывания с FcRn человека по сравнению с антителом, содержащим Fc IgG дикого типа, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, предпочтительно по меньшей мере в 125 раз, даже более предпочтительно по меньшей мере от 150 приблизительно до 170 раз.

"Нарушение" или "заболевание" представляет собой любое состояние, на которое оказывает положительное воздействие лечение веществом/молекулой или способом по изобретению. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая такие патологические состояния, которые провоцируют у млекопитающего рассматриваемое нарушение. Неограничивающие примеры нарушений, подлежащих лечению в настоящем описании, включают злокачественные и доброкачественные опухоли, нелейкозные и лимфоидные злокачественные новообразования, нейрональные, глиальные, астроцитарные, гипоталамические и другие гландулярные, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластоцельные нарушения и воспалительные, иммунологические и другие ангиогенные нарушения.

Термины "клеточное пролиферативное нарушение" и "пролиферативное нарушение" относятся к нарушениям, которые ассоциированы с некоторой степенью аномальной клеточной пролиферации. В одном из вариантов осуществления клеточное пролиферативное нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В одном из вариантов осуществления клеточное пролиферативное нарушение представляет собой ангиогенез.

"Опухоль", как используют в настоящем описании, относится к любому росту и пролиферации неопластических клеток, несмотря на злокачественную или доброкачественную природу, и всем преканцерогенным и злокачественным клеткам и тканям. Термины "злокачественная опухоль", "злокачественная", "клеточное пролиферативное нарушение", "пролиферативное нарушение" и "опухоль" не являются взаимоисключающими, как указано в настоящем описании.

Термины "злокачественная опухоль" и "злокачественная" относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемой клеточной пролиферацией. Примеры злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают плоскоклеточный рак, рак легких (включая мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), злокачественную опухоль брюшной полости, почечноклеточный рак, желудочный рак или рак желудка (включая злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстого кишечника, колоректальный рак, карциноме эндометрия или карциному матки, карциному слюнной железы, рак почки или почечный рак, рак печени, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному и различные типы рака головы и шеи, а также В-клеточную лимфому (включая фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL) низкой степени злокачественности, мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL, фолликулярную NHL средней степени злокачественности, диффузную NHL средней степени злокачественности, иммунобластную NHL высокой степени злокачественности, лимфобластную NHL высокой степени злокачественности, мелкоклеточную NHL с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности, генерализованную NHL, лимфому мантийных клеток, СПИД-ассоциированную лимфому и макроглобулинемию Вальденстрема), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз и посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство (PTLD), а также аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, эдему (такую как эдема, ассоциированная с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса.

Термин "антинеопластическая композиция" или "композиция против злокачественной опухоли" или "средство против злокачественной опухоли" относится к композиции, пригодной для лечения злокачественной опухоли, содержащей по меньшей мере одно активное терапевтическое средство, например, "средство против злокачественной опухоли". Примеры терапевтических средств (средств против злокачественной опухоли) включают, но не ограничиваются ими, например, химиотерапевтические средства, ингибирующие рост средства, цитотоксические средства, средства, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные средства, вызывающие апоптоз средства, антитубулиновые средства и другие средства для лечения злокачественной опухоли, такие как антитела против HER-2, антитела против CD20, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva™), ингибиторы фактора роста тромбоцитов (например, Gleevec™ (иматиниба мезилат)), ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одной или более следующих мишеней ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BlyS, APRIL, BCMA VEGF или рецептор(ы) VEGF, TRAIL/Apo2, и другие биоактивные и органические химические средства и т.д. В изобретение также входят их сочетания.

"Ангиогенный фактор или средство" представляет собой фактор роста, который стимулирует развитие кровеносных сосудов, например, способствует ангиогенезу, росту эндотелиальных клеток, устойчивости кровеносных сосудов и/или васкулогенезу и т.д. Например, ангиогенные факторы включают, но не ограничиваются ими, например, VEGF и представителей семейства VEGF, P1GF, семейства PDGF, семейства фактора роста фибробластов (FGF), лиганды TIE (ангиопоэтины), эфрины, Del-1, факторы роста фибробластов: кислый (aFGF) и основной (bFGF), фоллистатин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), фактор роста гепатоцитов (HGF)/рассеивающий фактор (SF), интерлейкин-8 (IL-8), лептин, мидкин, плацентарный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF), тромбоцитарный фактор роста, в частности PDGF-BB или PDGFR-бета, плеотрофин (PTN), програнулин, пролиферин, трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-альфа), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-альфа), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)/фактор проницаемости сосудов (VPF) и т.д. Они также включают факторы, которые ускоряют заживление ран, такие как гормон роста, инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I), VIGF, эпидермальный фактор роста (EGF), CTGF и представителей его семейства и TGF-альфа и TGF-бета. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine, 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, таблицу 1, в которой перечислены известные ангиогенные факторы) и Sato, Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).

Термин "VEGF", как используют в настоящем описании, относится к фактору роста эндотелиальных клеток сосудов человека длиной 165 аминокислот и родственным факторами роста эндотелиальных клеток сосудов человека длиной 121, 189 и 206 аминокислот, как описано Leung et al., Science, 246:1306 (1989) и Houck et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), совместно с их природными аллельными и процессированными формами. Термин "VEGF" также относится к VEGF от не являющихся человеком видов, таких как мышь, крыса или примат. В некоторых случаях VEGF от конкретных видов обозначают терминами, такими как hVEGF для VEGF человека, mVEGF для VEGF мыши и т.д. Термин "VEGF" также используют для обозначения усеченных форм полипептида, содержащего аминокислоты от 8 до 109 или от 1 до 109 фактора роста эндотелиальных клеток сосудов человека длиной 165 аминокислот. Упоминание любых таких форм VEGF может быть обозначено в настоящей заявке, например, "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" или "VEGF₁₆₅". Положение аминокислот для "усеченного" нативного VEGF нумеруют, как указано в нативной последовательности VEGF. Например, положение 17 аминокислоты (метионина) в усеченном нативном VEGF также представляет собой положение 17 (метионин) в нативном VEGF. Усеченный нативный VEGF обладает аффинностью связывания с рецепторами KDR и Flt-1, сравнимой с нативным VEGF. По предпочтительному варианту осуществления VEGF представляет собой VEGF человека.

"Антагонист VEGF" относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, ингибировать, аннулировать, снижать или нарушать виды активности VEGF, включая его связывание с VEGF или одним или более рецепторов VEGF, или кодирующей его нуклеиновой кислоты. Предпочтительно антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF. Антагонисты VEGF включают антитела против VEGF и их антигенсвязывающие фрагменты, полипептиды, которые связываются с VEGF и рецепторами VEGF и блокируют взаимодействие лиганд-рецептор (например, иммуноадгезины, пептидные антитела), антитела против рецептора VEGF и антагонисты рецептора VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR, аптамеры, которые связываются с VEGF, и нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностями нуклеиновой кислоты, которая кодирует VEGF или рецептор VEGF (например, РНКи). Согласно одному предпочтительному варианту осуществления антагонист VEGF связывается с VEGF и ингибирует индуцируемую VEGF эндотелиальных клеток in vitro. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с большей аффинностью, чем с не-VEGF или рецептором, не являющимся рецептором VEGF. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с Kd от 1 мкМ и 1 пМ. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF от 500 нМ до 1 пМ.

По предпочтительному варианту осуществления антагонист VEGF выбран из полипептида, такого как антитело, пептидное антитело, иммуноадгезин, низкомолекулярное соединение или аптамер. В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой антитело против VEGF, такое как антитело AVASTIN® или антитело против рецептора VEGF, такое как антитело против VEGFR2 или антитело против VEGFR3. Другие примеры антагонистов VEGF включают VEGF-Trap, мукаген, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (сорафениб), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 и KRN-633.

"Антитело против VEGF" представляет собой антитело, которое связывается с VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью. Предпочтительно антитело против VEGF по изобретению можно использовать в качестве терапевтического средства для направленного воздействия и препятствия развитию заболеваний или состояний, в которые вовлечена активность VEGF. Антитело против VEGF, как правило, не связывается с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, или другими факторами роста, такими как PIGF, PDGF или bFGF. Предпочтительное антитело против VEGF представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с одним и тем же эпитопом, что и моноклональное антитело против VEGF A4.6.1, продуцируемое гибридомой ATCC HB 10709. Более предпочтительно антитело против VEGF представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, получаемое в соответствии с Presta et al., (1997) Cancer Res., 57:4593-4599, включая, но, не ограничиваясь ими, антитело, известное как бевацизумаб (BV, Avastin®). По другому варианту осуществления антитела против VEGF, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, антитела, описываемые в WO 2005/012359. По одному из вариантов осуществления антитело против VEGF содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи любого антитела, описываемого на фигурах 24, 25, 26, 27 и 29 WO 2005/012359 (например, G6, G6-23, G6-31, С6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 и B20.4.1). В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против VEGF, известное как ранибизумаб представляет собой антагонист VEGF, вводимый при заболевании глаз, таком как диабетическая нейропатия и AMD.

Антитело против VEGF "бевацизумаб (BV)", также известное как "rhuMAb VEGF" или "Avastin®", представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, получаемое в соответствии с Presta et al., (1997) Cancer Res., 57:4593-4599. Оно содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антигенсвязывающие определяющие комплементарность области моноклонального антитела мыши против hVEGF A.4.6.1, которое блокирует связывание VEGF человека с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных областей, получают из IgG1 человека и приблизительно 7% последовательности получают из антитела мыши A4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу приблизительно 149000 Дальтон и является гликозилированным. Другие антитела против VEGF включают антитела, описанные патенте США №6884879 и WO 2005/044853.

Антитело против VEGF ранибизумаб или антитело LUCENTIS®, или rhuFab V2 представляет собой фрагмент Fab гуманизированного антитела против VEGF человека со зрелой аффинностью. Ранибизумаб получают стандартными способами рекомбинантной технологии в экспрессирующем векторе Escherichia coli и бактериальной ферментацией. Ранибизумаб является негликозилированным и имеет молекулярную массу ~48000 Дальтон. См. WO 98/45331 и US 20030190317.

Нарушение регуляции ангиогенеза может приводить к аномальному ангиогенезу, т.е. к избыточному, недостаточному или иным образом неадекватному росту новых кровеносных сосудов (например, расположение, временный паттерн или начало ангиогенеза является нежелательным с медицинской точки зрения) в состоянии заболевания или такому, который вызывает состояние заболевания, т.е. ангиогенное нарушение. Избыточный, неадекватный или неконтролируемый ангиогенез возникает, когда существует рост новых кровеносных сосудов, который способствует усугублению состояния заболевания или вызывает состояние заболевания. Новые кровеносные сосуды могут питать пораженные ткани, разрушать нормальные ткани, и в случае злокачественной опухоли новые сосуды могут обеспечивать возможность попадания опухолевых клеток в кровообращение и попадать в другие органы (метастазы опухоли). Состояния болезни, включающие аномальный ангиогенез (т.е. ангиогенные нарушения), включают ненеопластические и неопластические состояния, включая, например, злокачественную опухоль, в частности, васкуляризованные солидные опухоли и метастатические опухоли (включая рак толстого кишечника, рак молочной железы, рак легких (в частности мекоклеточный рак легких), злокачественную опухоль головного мозга (в частности глиобластому) или рак предстательной железы), нежелательную или аберрантную гипертрофию, артрит, ревматоидный артрит (RA), воспалительное заболевание кишечника или IBD (болезнь Крона и язвенный колит), псориаз, псориатические бляшки, саркоидоз, атеросклероз, атеросклеротические бляшки, диабетические и другие пролиферативные ретинопатии, включая ретинопатию недоношенных, ретролентальную фиброплазию, неоваскулярную глаукому, связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна, диабетический отек желтого пятна, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию трансплантата роговицы, отторжение трансплантата роговицы, неоваскуляризацию сетчатки/сосудистой оболочки, неоваскуляризацию внешней поверхности радужной оболочки (рубеоз), неоваскулярное заболевание глаз, рестеноз сосудов, артериовенозные пороки развития (AVM), менингиому, гемангиому, ангиофиброму, гиперплазии щитовидной железы (включая болезнь Грейва), хроническое воспаление, воспаление легких, острое поражение легких/ARDS, сепсис, первичную легочную гипертензию, злокачественный легочный выпот, отек головного мозга (например, ассоциированный с острым инсультом/закрытым повреждением/травмой головы), синовиальное воспаление, оссифицирующий миозит, гипертрофированное образование костей, остеоартрит (OA), рефракторный асцит, поликистоз яичников, эндометриоз, заболевания, связанные с жидкостями "3-го пространства" (панкреатит, синдром сдавливания, ожоги, заболевание кишечника), фиброз матки, преждевременные роды, хроническое воспаление, такое как IBD, отторжение аллотрансплантата почки, воспалительное заболевание кишечника, нефротический синдром, нежелательный или аномальный рост тканевой массы (незлокачественная опухоль), гемофилический гемартроз, гипертрофические рубцы, ингибирование роста волос, синдром Ослера-Вебера, пиогенную гранулему, ретролентальную фиброплазию, склеродермию, трахому, спайки сосудов, синовит, дерматит, преэклампсию, асцит, перикардиальный выпот (такой как выпот, ассоциированный с перикардитом) и плевральный выпот.

Как используют в настоящем описании "лечение" относится к клиническому вмешательству с целью изменить естественное течение заболевания индивидуума или клетки, подлежащей лечению, и его можно проводить для профилактики или во время протекания клинической патологии. Желаемые эффекты лечения включают профилактику частоты возникновения или рецидива заболевания, ослабление симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение состояния или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению используют для замедления развития заболевания или нарушения.

"Эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировании и в течение периодов времени, необходимых для получения желательного терапевтического или профилактического результата.

"Терапевтически эффективное количество" вещества/молекулы по изобретению, агониста или антагониста может изменяться в зависимости от факторов, таких как состояние болезни, возраст, пол и масса индивидуума, и способность вещества/молекулы, агониста или антагониста вызывать желательный ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически положительное действие перевешивает любые токсические или неблагоприятные эффекты вещества/молекулы, агониста или антагониста. Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству антитела, полипептида или антагониста по настоящему изобретению, эффективному для "лечения" заболевания или нарушения у млекопитающего (также называемого пациентом). В случае злокачественной опухоли терапевтически эффективное количество лекарственного средства может снижать число злокачественных клеток, уменьшать размер или массу опухоли, ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно блокировать) инфильтрацию злокачественных клеток в периферические органы, ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно блокировать) метастазирование опухоли, ингибировать до некоторой степени рост опухоли и/или облегчать до некоторой степени один или более симптомов, ассоциированных со злокачественной опухолью. В зависимости от степени, с которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие злокачественные клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. В одном из вариантов осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой ингибирующее рост количество. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое увеличивает выживаемость пациента. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое улучшает выживаемость пациента без прогрессирования заболевания.

"Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозированиях и в течение периодов времени, необходимых для получения желаемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, вследствие того, что профилактическую дозу используют у индивидуумов до заболевания или на его ранней стадии, профилактически эффективное количество является меньше чем терапевтически эффективное количество.

Термин "цитотоксическое средство", как используют в настоящем описании, относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Термин предназначен включать радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства, например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркаляторы, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая фрагменты и/или их варианты, и различные противоопухолевые средства или средства против злокачественных опухолей, описываемые ниже. Другие цитотоксические средства описаны ниже. Тумороцидное средство вызывает разрушение опухолевых клеток.

"Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и CYTOXAN® циклофосфамид, алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан, азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа, этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтиленетиофосфорамид и триметилоломеламин, ацетогенины (в частности буллатацин и буллатацинон), дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®), бета-лапахон, лапахол, колхицины, бетулиновую кислоту, камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин), бриостатин, каллистатин, CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин), подофиллотоксин, подофиллиновую кислоту, тенипозид, криптофицины (в частности криптофицин 1 и криптофицин 8), доластатин, дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1), элеутеробин, панкратистатин, саркодиктин, спонгистатин, азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин, антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)), динемицин, включая динемицин A, эсперамицин, а также хромофор неокарциностатин и родственные хромофоры хромопротеиновых эндииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN® (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин,туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU), аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, триамиприн, тиогуанин, аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, антиадренергические средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан, восполняющие недостаток фолиевой кислоты средства, такие как фолиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамидгликозид, аминолевулиновую кислоту, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бизантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, эльфорнитин, ацетат эллептиния, эпотилон, этоглуцид, нитрат галия, гидроксимочевину, лентинан, лонидаинин, майтанзиноиды, такие как майтазин и ансамитоцины, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, 2-этилгидразид, прокарбазин, полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR), разоксан, ризоксин, сизофиран, спирогерманий, тенуазоновую кислоту, триазиквон, 2,2',2"-трихлортриэтиламин, трихотецены (в частности токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангвидин), уретан, виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®), дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, арабинозид ("Ara-C"), тиотепа, таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащий кремофора сконструированный на основе альбуминовых наночастиц паклитаксела ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и доцетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France), хлорамбуцил, гемцитабин (GEMZAR®), 6-тиогуанин, меркаптопурин, метотрексат, аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин, винбластин (VELBAN®), платину, этопозид (VP-16), ифосфамид, митоксантрон, винкристин (ONCOVIN®), оксалиплатин, лейкововин, винорелбин (NAVELBINE®), новантрон, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, ибандронат, ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифториетилорнитин (DMFO), ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, капецитабин (XELODA®), фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше соединений, а также сочетания двух или более указанных выше соединений, таких как CHOP, сокращенное обозначение для комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном и FOLFOX, сокращенное обозначение для схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN™), комбинированным с 5-FU и лейкововином. Дополнительные химиотерапевтические средства включают цитотоксические средства, пригодные в качестве лекарственных конъюгатов антитела, такие как майтанзиноиды (например, DM1) и, например, ауристатины MMAE и MMAF.

"Химиотерапевтические средства" также включают "противогормональные средства", которые действуют, регулируя, уменьшая, блокируя или ингибируя эффекты гормонов, которые могут способствовать росту злокачественной опухоли, и, как правило, находятся в форме системного лечения или лечения всего организма. Они могут представлять собой сами гормоны. Примеры включают антистрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен EVISTA®, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON®, антипрогестероны, ингибиторы рецепторов эстрогена (ERD), средства, которые функционируют, подавляя или прекращая работу яичников, например, агонисты гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон (LHRH), такие как LUPRON® и ELIGARD® лейпролида ацетат, гозерелина ацетат, бусерелина ацетат и триптерелин, дургие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид, и ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, который регулирует продукцию эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат MEGASE®, экземестан AROMASIN®, форместани, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® и анастрозол ARIMIDEX®. Кроме того, такое определение химиотерапевтических средств включает бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат DIDROCAL®, NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат ZOMETA®, аледронат FOSAMAX®, памидронат AREDIA®, тилудронат SKELID® или ризедронат ACTONEL®, а также троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина), антисмысловые олигонуклеотиды, в частности такие, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигнала, вовлеченных в абберантную клеточную пролиферацию, такие как, например, PKC-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R), вакцины, такие как вакцина THERATOPE®, и генотерапевтические вакцины, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®, ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®, rmRH ABARELIX®, лапатиниба дитозилат (двойной низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы ErbB-2 и EGFR, также известный как GW572016) и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше соединений.

"Ингибирующее рост средство", когда используют в настоящем описании, относится к соединению или композиции, которая ингибирует рост и/или пролиферацию клеток (например, клетки, экспрессирующей Robo4) in vitro или in vivo. Таким образом, ингибирующее рост средство может представлять собой средство, которое значительно снижает процентное содержание экспрессирующих Robo4 клеток в S-фазе. Примеры ингибирующих рост средств включают средства, которые блокируют прохождение клеточного цикла (в точке, отличной от S-фазы), такие как средства, которые индуцируют арест G1 и арест M-фазы. Классические блокаторы M-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как антрациклиновый антибиотик доксорубицин ((8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-α-L-ликсо-гексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтаценедион), эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Такие средства, которые вызывают арест G1, также распространяют свое действие на арест S-фазы, например, алкилирующие ДНК средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и Ara-C. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., глава 1, озаглавленная "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), в частности стр. 13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой лекарственные средства против злокачественной опухоли, получаемые из тисового дерева. Доцетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из тиса европейского, представляет собой полусинтетический аналог паклитаксела (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел способствуют сборке микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки, предотвращая деполимеризацию, которая приводит к ингибированию митоза в клетках.

Как используют в настоящем описании, термин "пациент" относится к любому одному животному, более предпочтительно млекопитающему (включая таких не являющихся человеком животных, как, например, собаки, кошки, лошади, кролики, животные зоопарка, коровы, свиньи, овцы и не являющиеся человеком приматы), для которых лечение является желательным. Наиболее предпочтительно, пациент в настоящем описании представляет собой человека.

"Индивидуум" в настоящем описании представляет собой любого одного являющегося человеком индивидуума, включая пациента, пригодного для лечения, который испытывает или испытывал один или более признаков, симптомов или других показателей ангиогенного нарушения. Предполагают, что в качестве индивидуума включают любых индивидуумов, участвующих в клинических научно-исследовательских испытаниях, которые не проявляют какого-либо клинического признака заболевания, или индивидуумов, участвующих в эпидемиологических исследованиях, или индивидуумов, которых используют в качестве контролей. Индивидуум мог ранее получать лечение антагонистом VEGF или не получать такого лечения. Индивидуум мог не получать ранее второе лекарственное средство, используемое при начале лечения по настоящему описанию, т.е. индивидуум ранее не получал лечение, например, антинеопластическим средством, химиотерапевтическим средством, ингибирующим рост средством, цитотоксическим средством при "исходном уровне" (т.е. в указанный момент времени до введения первой дозы антагониста в способе лечения по настоящему описанию, такой как на сутки скрининга индивидуума до начала лечения). Считают, что такие "не получавшие препарата" индивидуумы, как правило, являются кандидатами для лечения таким вторым лекарственным средством.

Выражение "эффективное количество" относится к количеству лекарственного средства, которое является эффективным для лечения ангиогенных нарушений.

Термин "фармацевтический состав" относится к стерильному препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечивать эффективную биологическую активность лекарственного средства, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для индивидуума, которому будут вводить состав.

"Стерильный" состав является асептическим или не содержит каких-либо живых микроорганизмов и их спор.

"Вкладыш в упаковку" используют для обозначения инструкций, обычно содержащихся в коммерческих упаковках терапевтических продуктов или лекарственных средствах, которые содержат информацию о показаниях, использовании, дозировании, введении, противопоказаниях, других терапевтических продуктах, которые можно комбинировать с упакованным продуктом, и/или предупреждения, касающиеся использования таких терапевтических продуктов или лекарственных средств, и т.д.

"Набор" представляет собой любое изделие (например, упаковку или контейнер), содержащее по меньшей мере один реагент, например, лекарственное средство для лечения ангиогенного нарушения, или зонд для специфической детекции биомаркерного гена или белка по изобретению. Для изделия предпочтительно создают благоприятные условия для продажи, распространяют или продают его в виде единицы для проведения способов по настоящему изобретению.

В случае отсутствия реакции на лекарственное средство(а) индивидуум, который испытывает "клинически неприемлемый высокий уровень токсичности" в результате проводимого ранее или текущего лечения одним или более лекарственных средств, испытывает один или более отрицательных побочных эффектов или неблагоприятных событий, ассоциированных с ним, которые квалифицированный клинический врач рассматривает как значимые, такие как, например, серьезные инфекции, застойная сердечная недостаточность, демиелинизация (приводящая к рассеянному склерозу), значительная гиперчувствительность, нейропатические нарушения, высокая степень аутоиммунной реакции, злокачественная опухоль, такая как рак эндометрия, неходжкинская лимфома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак легких, рак яичника или меланома, туберкулез (ТВ) и т.д.

Под "снижением риска отрицательного побочного эффекта" подразумевают снижение риска побочного эффекта, возникающего в результате лечения антагонистом по настоящему описанию, до более низкой величины по сравнению с риском, наблюдаемым в результате лечения того же самого пациента или другого пациента ранее вводимым лекарственным средством. Такие побочные эффекты включают побочные эффекты, указанные выше в отношении токсичности, и предпочтительно представляют собой инфекцию, злокачественную опухоль, сердечную недостаточность или демиелинизацию.

Под "коррелировать" или "корреляцией" подразумевают сравнение любым способом параметров и/или результатов первого анализа или протокола с параметрами и/или результатами второго анализа или протокола. Например, результаты первого анализа или протокола можно использовать для проведения вторых протоколов и/или результаты первого анализа или протокола можно использовать для определения, следует ли проводить второй анализ или протокол. В соответствии с различными вариантами осуществления по настоящему описанию результаты аналитического анализа можно использовать для определения, следует ли проводить конкретную схему лечения, в которой используют антагонист VEGF, такой как антитело против VEGF.

Слово "метка", когда используют в настоящем описании, относится к соединению или композиции, которая является конъюгированной или слитой непосредственно или опосредованно с реагентом, таким как зонд на основе нуклеиновой кислоты или антитело, и облегчает детекцию реагента, с которым ее конъюгируют или сливают. Метка сама по себе может быть детектируемой (например, метки радиоактивных изотопов или флуоресцентные метки) или в случае ферментативной метки может катализировать химическое изменение соединения или композиции субстрата, которое детектируют. Термин предназначен включать прямое мечение зонда или антитела путем связывания (т.е. физического связывания) детектируемого вещества с зондом или антителом, а также непрямое мечение зонда или антитела посредством способности химически реагировать с другим реагентом, который является непосредственно меченым. Примеры непрямого мечения включают детекцию первичного антитела с использованием флуоресцентно меченого вторичного антитела и введение концевой метки ДНК-зонда биотином, таким образом, что его можно детектировать флуоресцентно меченным стрептавидином.

Термины "уровень экспрессии" или "экспрессируемый уровень" используют взаимозаменяемо, и, как правило, он обозначает количество продукта полинуклеотида или аминокислоты или белка в биологическом образце. "Экспрессия", как правило, относится к процессу, посредством которого кодируемая геном информация преобразуется в структуры, содержащиеся и функционирующие в клетке. Таким образом, по изобретению "экспрессия" гена может относиться к транскрипции в полинуклеотид, трансляции в белок или даже посттрансляционной модификации белка. Фрагменты транскрибируемого полинуклеотида, транслированного белка или белка, подвергнутого посттрансляционной модификации, также следует рассматривать как экспрессируемые, независимо то того происходят они от транскрипта, получаемого альтернативным сплайсингом, или расщепленного транскрипта, или в результате посттрансляционного процессинга белка, например, путем протеолиза. "Экспрессируемые гены" включают гены, которые транскрибируются в полинуклеотид в виде мРНК, а затем транслируются в белок, а также гены, которые транскрибируются в РНК, но не транслируются в белок (например, транспортная и рибосомная РНК).

Как используют в настоящем описании, термин "ковариат" относится к определенным переменным или информации, относящейся к пациенту. В регрессионных моделях часто рассматривают клинические конечные точки, где конечные точки представляют собой зависимую переменную, и биомаркеры представляют собой основные или целевые независимые переменные (регрессоры). Если рассматривают дополнительные переменные из совокупности клинических данных, их обозначают как (клинические) ковариаты.

Термин "клиническая ковариата" используют в настоящем описании для описания любой клинической информации о пациенте, которая, как правило, доступна в основном на начальный момент времени. Такие клинические ковариаты содержат демографическую информацию, такую как пол, возраст и т.д., другую анамнестическую информацию, сопутствующие заболевания, виды сопутствующей терапии, результаты медицинских осмотров, получаемые общие лабораторные показатели, известные характеристики ангиогенных нарушений, клиническое заболевание, определение стадии, момента времени и результата типов предварительного лечения, историю заболевания, а также любую аналогичную информацию, которая может быть ассоциирована с клиническим ответом на лечение.

Как используют в настоящем описании термин "анализ первоначальных данных" или "анализ без поправки" относится к типам регрессионного анализа, где кроме рассматриваемых биомаркеров в регрессионной модели не используют дополнительных клинических ковариат ни в качестве независимых факторов, ни в качестве ковариаты стратификации.

Как используют в настоящем описании, термин "с поправкой на ковариаты" относится к типам регрессионного анализа, где наряду с рассматриваемыми биомаркерами, в регрессионной модели используют дополнительные клинические ковариаты либо в качестве независимых факторов, либо в качестве ковариаты стратификации.

Как используют в настоящем описании, термин "однофакторная" относится к регрессионным моделям или графическим подходам, где в качестве независимой переменной только один из целевых биомаркеров является частью модели. Такие однофакторные модели можно рассматривать с дополнительными клиническими ковариатами или без них.

Как используют в настоящем описании, термин "многофакторный" относится к регрессионным моделям или графическим подходам, где в качестве независимых переменных более одного из целевых биомаркеров являются частью модели. Такие многофакторные модели можно рассматривать с дополнительными клиническими ковариатами или без них.

III. Способы идентификации пациентов, реагирующих на антагонисты VEGF

Настоящее изобретение относится к способам идентификации и/или мониторинга пациентов, которые с большой вероятностью реагируют на терапию антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF). В числе прочего способы являются пригодными для повышения вероятности того, что введение антагониста VEGF (например, антитела против VEGF) пациенту будет являться эффективным. Способы включают детекцию экспрессии одного или более генетических биомаркеров в биологическом образце у пациента, где экспрессия одного или более таких биомаркеров является показателем, является ли пациент чувствительным или реагирующим на антагонисты VEGF, такие как антитела против VEGF. Более конкретно экспрессия по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 генов, указанных в таблице 1 или 2, в образце у пациента, является пригодной для мониторинга, реагирует ли пациент реагирующим на антагонист VEGF, такой как антитело против VEGF, или является чувствительным к нему. В некоторых вариантах осуществления экспрессия по меньшей мере одного гена, выбранного из следующей группы: Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM, является пригодной для мониторинга, будет ли пациент реагировать на антагонист VEGF, такой как антитело против VEGF, или являться чувствительным к нему. Способы могут дополнительно необязательно включать выбор антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб) для введения пациенту и необязательно дополнительно включать введение антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такое как бевацизумаб) пациенту.

Описываемые способы и анализы обеспечивают целесообразные, эффективные и потенциально экономически эффективные средства получения данных и информации, пригодной для оценки подходящих или эффективных видов терапии для лечения пациентов. Например, перед лечением антагонистом VEGF у пациента можно получать образец ткани (например, биопсию опухоли или образец крови) и можно анализировать образец различными анализами in vitro для определения, являются ли клетки пациента чувствительными к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF.

Изобретение относится к способам мониторинга чувствительности или восприимчивости пациента к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF. Способы можно проводить в различных форматах анализа, включая анализы, которыми детектируют экспрессию гена или белка (такие как ПЦР и иммуноферментные анализы) и биохимические анализы, которыми детектируют соответствующую активность. На основании определения экспрессии или наличия таких биомаркеров в образцах прогнозируют, будет ли пациент, у которого получают образец, являться чувствительным к биологическому действию антагониста VEGF, такого как антитело против VEGF. Изобретение заявителей в настоящем описании заключается в том, что изменение (т.е. повышение или снижение) экспрессии по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или более генов, указанных в таблице 1 или 2, в образце у пациента коррелирует с наблюдаемой эффективностью лечения такого пациента антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF. Пример 1 демонстрирует, что повышенные уровни генов в таблице 2 коррелируют с эффективностью такого лечения, и, таким образом, в различных вариантах осуществления детекция таких уровней в способах, описываемых в настоящем описании, входит в изобретение. В других вариантах осуществления изобретение включает панель тестов для анализов экспрессии генов из таблицы 1 или таблицы 2, например, панель тестов, содержащую зонды, специфичные к этим генам или их подгруппе (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или более гонов, указанных в таблице 1 или 2). Такая панель тестов может содержать, например, зонды на микрочипе для применения в таком анализе.

Способами по изобретению можно определять вероятность, с которой конкретный индивидуум (например, пациент), с большей вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF, детектируя уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, и сравнивая уровень экспрессии гена с эталонным уровнем экспрессии. Например, эталонный уровень экспрессии может представлять собой средний уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в группе/популяции пациентов, тестируемых на восприимчивость к антагонисту VEGF. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень экспрессии представляет собой уровень экспрессии по меньшей мере одного гена в образце, ранее получаемом у индивидуума в более ранний момент времени. В других вариантах осуществления индивидуумы представляют собой пациентов, которые ранее получали лечение антагонистом VEGF в условиях первичной опухоли. В некоторых вариантах осуществления индивидуумы представляют собой пациентов, у которых развиваются метастазы. Индивидуумы, у которых уровень экспрессии является большим или меньшим эталонного уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, идентифицируют как индивидуумов/пациентов, которые с большей вероятностью реагируют на лечение антагонистом VEGF. Индивидуумов/пациентов, у которых уровни экспрессии генов составляют не более 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% относительно (т.е. выше или ниже) среднего значения, идентифицируют как пациентов, которые с большей вероятностью реагируют на лечение антагонистом VEGF. Уровень экспрессии гена можно определять с использованием по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, или любой линейной комбинации генов, указанных в таблице 1 или 2 (например, среднего значения, средневзвешенного значения или медианы) известными в данной области способами и описанными, например, у Sokal R.R. and Rholf F.J., (1995) "Biometry: the principles and practice of statistics in biological research", W.FI. Freeman and Co. New York, NY. Как указано выше, способы необязательно могут дополнительно включать выбор антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб) для введения пациенту и необязательно дополнительно включать введение антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб) пациенту.

В любом из описанных выше способов можно рассчитывать сигнатурную оценка VDV (VDV_i), которая предоставляет количественную информацию относительно степени, с которой экспрессия конкретной выборки генов является совокупно сверхэкспрессированной или сниженно экспрессируемой относительно центрированного среднего значения. Например, VDV можно рассчитывать для каждого образца i, для которого анализировали все гены VDV (см., например, таблицу 1 или 2), которое представляет собой взвешенное среднее значение z-показателей для анализируемых генов VDV и которое получают по алгоритму

в котором Z_g=_1,i, Z_g=_2,i,… Z_g=_n,i представляют собой стандартизированные z-показатели значений экспрессии каждого гена или биомаркера g от g=1 до g=n i образца, и для которого VDV ниже первого определяемого порогового уровня означает понижение относительно эталонного уровня (например, совокупную сниженную экспрессию), и указанное выше VDV_i второго определяемого порогового уровня означает повышение относительно эталонного уровня (например, совокупную сверхэкспрессию). Значения экспрессии для каждого гена или биомаркера g от g=1 до g=n могут представлять собой, например, значения кПЦР в реальном времени для каждого гена g или биомаркера от g=1 до g=n. Первый определяемый пороговый уровень может составлять от -4 до -0,5 (например, -4, -3,5, -3, -2,5, -2, -1,5, -1 или -0,5), и второй определяемый пороговый уровень может составлять от 0,5 до 4 (например, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4). В некоторых случаях первый определяемый пороговый уровень может составлять от -4 до -1 (например, -4, -3,5, -3, -2,5, -2, -1,5 или -1), и второй определяемый пороговый уровень может составлять от 1 до 4 (например, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4). В других случаях первый определяемый пороговый уровень может составлять от -4 до -1,5 (например, -4, -3,5, -3, -2,5, -2 или -1,5), и второй определяемый пороговый уровень может составлять от 1,5 до 4 (например, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4). Альтернативно, первый определяемый пороговый уровень может составлять от -4 до -2 (например, -4, -3,5, -3, -2,5 или -2), и второй определяемый пороговый уровень может составлять от 2 до 4 (например, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу мониторинга, будет ли пациент с ангиогенным нарушением реагировать на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF, включающему оценку в качестве биомаркера экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, (например, по меньшей мере одного из Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM) в образце у пациента, получаемом до введения какого-либо антагониста VEGF пациенту. Изменение (т.е. повышение или понижение) экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, относительно эталонного уровня (см. выше) означает, что пациент реагирует на лечение антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу мониторинга чувствительности или восприимчивости пациента к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF. Этот способ включает оценку экспрессии гена по меньшей мере из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или более генов, указанных в таблице 1 или 2, в образце у пациента и прогнозирование чувствительности или восприимчивости пациента к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF, где изменение (т.е. повышение или снижение) экспрессии по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или более генов, указанных в таблице 1 или 2, коррелирует с чувствительностью или восприимчивостью пациента к эффективному лечению антагонистом VEGF. В соответствии с этим способом у пациента до введения какого-либо антагониста VEGF получают биологический образец и подвергают анализу для оценки, содержатся ли продукты экспрессии по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или более генов, указанных в таблице 1 или 2, в образце. Если экспрессия 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или более генов, указанных в таблице 1 или 2, изменяется (т.е. повышается или снижается) относительно эталонного уровня (например, см. выше), определяют, что пациент является чувствительным или восприимчивым к лечению антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF. Как указано выше, способы необязательно могут дополнительно включать выбор антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб) для введения пациенту и необязательно дополнительно включать введение антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб) пациенту.

Специалист в области медицины, в частности, касающейся применения диагностических тестов и лечения терапевтическими средствами, понимает, что биологические системы являются до некоторой степени изменчивыми и не всегда полностью прогнозируемыми, и, таким образом, много хороших диагностических тестов или терапевтических средств в некоторых случаях являются неэффективными. Таким образом, в конечном итоге определение наиболее подходящего курса лечения для отдельного пациента остается на усмотрение лечащего врача в зависимости от результатов тестов, состояния и истории пациента и его или ее собственного опыта. Также могут возникать случаи, например, когда выбор лечить пациента антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF, даже когда для пациента не прогнозируют, что он является особенно чувствительным к антагонистам VEGF, делается на основании данных диагностических тестов или других критериев, в частности, если все или большая часть других тривиальных видов лечения являлись безрезультатными, или если предполагают некоторый синергизм при проведении совместно с другим лечением.

В дополнительно описанных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу прогнозирования чувствительности пациента к лечению антагонистом VEGF, таким как антитело против VEGF, или прогнозированию, будет ли пациент эффективно реагировать на лечение антагонистом VEGF, включающему оценку уровня одного или более экспрессируемых в образце генетических биомаркеров, идентифицированных в настоящем описании, и прогнозирование чувствительности пациента к ингибированию антагонистом VEGF, где уровни экспрессии одного или более таких генетических биомаркеров коррелируют с высокой предрасположенностью пациента к эффективной реакции на лечение антагонистом VEGF.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу идентификации биомаркера, по уровню экспрессии которого прогнозируют чувствительность или восприимчивость конкретного пациента к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF, включающему: (a) измерение уровня экспрессии биомаркера-кандидата в группе клеток, которые обладают определенным диапазоном чувствительности к антагонисту VEGF, и (b) определение корреляции между уровнем экспрессии, серопозитивными реакциями или наличием указанного биомаркера-кандидат в клетках и чувствительностью или восприимчивостью пациента к антагонисту VEGF, где корреляция указывает, что по уровню экспрессии, серопозитивной реакции или наличию указанного биомаркера можно прогнозировать восприимчивость пациента к лечению антагонистом VEGF. В одном из вариантов осуществления такого способа группа клеток представляет собой группу образцов, подготавливаемых из образцов, получаемых у пациентов или из экспериментальных моделей на животных. В дополнительном варианте осуществления группа клеток представляет собой группу линий клеток в ксенотрансплантатах мыши, где восприимчивость, например, можно определять мониторингом молекулярного маркера восприимчивости, например, по меньшей мере одного из Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM.

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации биомаркера, который является пригодным для мониторинга чувствительности или восприимчивости к антагонисту VEGF, такому как антитело против VEGF, где способ включает: (a) измерение уровня биомаркера-кандидата в образцах у пациентов с ангиогенными нарушениями, получаемых до того, как пациентам вводят какую-либо дозу антагониста VEGF, где изменение (т.е. повышение или снижение) экспрессии биомаркера-кандидата относительно контроля свидетельствует о том, что биомаркер является диагностическим для более эффективного лечения ангиогенного нарушения антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления биомаркер является генетическим, и его экспрессию анализируют.

Образец можно получать у пациента, у которого подозревают или у которого диагностировали ангиогенное нарушение, и который, таким образом, с большой вероятностью нуждается в лечении, или у здорового индивидуума, у которого не подозревают какого-либо нарушения. Для оценки экспрессии маркера в способах по настоящему изобретению можно использовать образцы пациента, такие как образцы, содержащие клетки или белки, или нуклеинов кислоты, продуцируемые этими клетками. В способах по настоящему изобретению уровень биомаркера можно определять путем оценки количества (например, абсолютного количества или концентрации) маркеров в образце, предпочтительно в образце ткани (например, образце опухолевой ткани, таком как биопсия). Кроме того, уровень биомаркера можно оценивать в жидкостях или выделениях организма, содержащих детектируемые уровни биомаркеров. Пригодные в качестве образцов жидкости или выделения организма в настоящем изобретении включают, например, кровь, мочу, слюну, кал, плевральную жидкость, лимфатическую жидкость, мокроту, асцит, секрет предстательной железы, цереброспинальную жидкость (CSF) или любой другой секрет организма или его производное. Подразумевают, что слово кровь включает цельную кровь, плазму, сыворотку или любое производное крови. Оценка биомаркера в таких жидкостях или выделениях организма иногда может являться предпочтительной в тех случаях, когда инвазивный способ отбора проб является непригодным или затруднительным. Однако в случае образцов, которые представляют собой жидкости организма, образец, подлежащий тестированию в настоящем описании, предпочтительно представляет собой кровь, синовиальную ткань или синовиальную жидкость, наиболее предпочтительно кровь.

Образец может быть замороженным, свежим, фиксированным (например, фиксированным формалином), центрифугированным и/или погруженным (например, погруженным в парафин) и т.д. Образец клеток, как правило, можно подвергать различным хорошо известным способам подготовки и хранения после сбора (например, выделения нуклеиновых кислот и/или белков, фиксации, хранению, замораживанию, ультрафильтрации, концентрированию, выпариванию, центрифугированию и т.д.) до оценки количества маркера в образце. Аналогично, биопсии также можно подвергать способам подготовки и хранения после сбора, например, фиксации.

Как указано выше, все способы необязательно могут дополнительно включать выбор антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб) для введения пациенту и необязательно дополнительно включать введение антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб) пациенту.

A. Детекция экспрессии генов

Генетические биомаркеры, описываемые в настоящем описании, можно детектировать любым известным в данной области способом. Например, образцы тканей или клеток у млекопитающих можно анализировать подходящим способом, например, мРНК или ДНК из представляющего интерес генетического биомаркера анализом нозерн-блот, дот-блот или полимеразной цепной реакции (ПЦР), гибридизацией на матрице, анализом с защитой от РНКаз или с использованием ДНК-микрочипов для анализа SNP, которые являются коммерчески доступными, включая снимки микропанелей ДНК. Например, в данной области хорошо известны анализы ПЦР (RT-ПЦР) в реальном времени, такие как анализы количественной ПЦР. В иллюстративном варианте осуществления изобретения способ детекции мРНК из представляющего интерес генетического биомаркера в биологическом образце включает получение кДНК из образца посредством обратной транскрипции с использованием по меньшей мере одного праймера, амплификацию получаемой таким образом кДНК и детекцию наличия амплифицированной кДНК. Кроме того, такие способы могут включать один или более этапов, которые позволяют определять уровни мРНК в биологическом образце (например, одновременно анализируя уровни сравниваемой контрольной последовательности мРНК гена "домашнего хозяйства", такого как представитель семейства актинов). Необязательно можно определять последовательность амплифицированной кДНК.

1. Детекция нуклеиновых кислот

В одном конкретном варианте осуществления экспрессию генов, указанных в таблице 1 или 2, можно проводить технологией RT-ПЦР. Используемые для ПЦР зонды можно метить детектируемым маркером, таким как, например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металлов или фермент. Такие зонды и праймеры можно использовать для детекции наличия экспрессируемых генов, указанных в таблице 1 или 2, в образце. Как понятно специалисту в данной области, очень много различных праймеров и зондов можно получать на основании последовательностей, предоставленных в настоящем описании, и эффективно использовать для амплификации, клонирования и/или определения наличия и/или уровней экспрессируемых генов, указанных в таблице 1 или 2.

Другие способы включают протоколы, в которых анализируют или детектируют мРНК по меньшей мере из одного из генов, указанных в таблице 1 или 2 (например, мРНК Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM), в образце тканей или клеток способами на основе микропанелей. С использованием микропанелей нуклеиновых кислот тестируемые и контрольные образцы мРНК из тестируемых и контрольных образцов ткани подвергают обратной транскрипции и метят с получением зондов кДНК. Затем зонды подвергают гибридизации с микропанелью нуклеиновых кислот, иммобилизованных не твердой подложке. Микропанель конфигурируют таким образом, что последовательность и положение каждого члена микропанели являются известными. Например, на твердой подложке можно располагать подборку генов, для которых существует вероятность экспрессии при определенных состояниях заболевания. Гибридизация меченого зонда с конкретным членом микропанели указывает на то, что в образце, из которого получали зонд, экспрессируется такой ген. Анализом дифференциальной экспрессии генов в пораженной ткани можно получать ценную информацию. В технологии микропанелей используют способы гибридизации нуклеиновых кислот и вычислительные технологии для оценки профиля экспрессии мРНК тысяч генов в одном эксперименте (см., например, WO 2001/75166). Касательно обзора составления микропанелей см., например, патент США 5700637, патент США 5445934, и патент США 5807522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996) и Cheung et al., Nature Genetics, 21(Suppl):15-19 (1999).

Кроме того, можно применять профилирование ДНК и способ детекции, в котором используют микропанели, описанные в EP 1753878. В этом способе быстро идентифицируют и проводят различие между различными последовательностями ДНК с использованием анализа короткого тандемного повтора (STR) и микропанелей ДНК. В одном из вариантов осуществления меченую последовательность-мишень STR гибридизуют с микропанелью ДНК, несущей комплементарные зонды. Длина таких зондов изменяется в диапазоне возможных STR. Меченые одноцепочечные области гибридов ДНК избирательно удаляют с поверхности микропанели с использованием ферментативного расщепления после гибридизации. Число повторов в неизвестной мишени устанавливают на основании паттерна ДНК-мишени, которая остается гибридизованной с микропанелью.

Один из примеров процессора для микропанели представляет собой систему Affymetrix GENECHIP®, которая является коммерчески доступной и содержит микропанели, получаемые прямым синтезом олигонуклеотидов на поверхности стекла. Можно использовать другие системы, которые известны специалисту в данной области.

Другие способы определения уровня биомаркера наряду с RT-ПЦР или другим способом на основе ПЦР включают протеомные способы, а также индивидуальные генетические профили, которые являются необходимыми для лечения ангиогенных нарушений в зависимости от реакции пациента на молекулярном уровне. Специализированные микропанели в настоящем описании, например, олигонуклеотидные микропанели или микропанели кДНК, могут содержать один или более биомаркеров с профилями экспрессии, которые коррелируют с чувствительностью или резистентностью к одному или более антителам против VEGF. Другие способы, которые можно использовать для детекции нуклеиновых кислот для применения в изобретении, включают высокопроизводительный анализ экспрессии последовательности РНК, включая геномный анализ на основании РНК, такой как, например, секвенирование РНК.

Доступны многие ссылочные материалы, которые предоставляют руководство по применению указанных выше способов (Kohler et al, Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982) и Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987)). Анализ "нозерн"-блот представляет собой хорошо известный в данной области общепринятый способ и описан, например, в Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. Характерные протоколы для оценки статуса генов и продуктов генов можно найти, например, у Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, разделы 2 ("нозерн"-блоттинг), 4 (саузерн-блоттинг), 15 (иммуноблоттинг) и 18 (анализ ПЦР).

2. Детекция белков

Касательно детекции биомаркеров-белков, таких как по меньшей мере одного из Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM, например, доступны различные анализы белков, включая, например, способы на основе антител, а также масс-спектроскопию и другие сходные способы, известные в данной области. В случае способов на основе антител, например, образец можно приводить в контакт с антителом, специфичным к указанному биомаркеру в условиях, достаточных для образования комплекса антитело-биомаркер, а затем детекции указанного комплекса. Для анализа широкого спектра тканей и образцов, включая плазму или сыворотку, детекцию наличия биомаркера-белка можно проводить различными способами, такими как вестерн-блоттингом (с иммунопреципитацией или без нее), 2-х мерным SDS-PAGE, иммунопреципитацией, активируемой флуоресценцией сортировкой клеток (FACS), проточной цитометрией и способами ELISA. Доступен широкий спектр способов иммунологического анализа с использованием такого формата анализа, см., например, патенты США № 4016043, 4424279 и 4018653. Они включают как одновалентные, так и двухвалентные "сэндвич"-анализы неконкурентных типов, а также общепринятые анализы конкурентного связывания. Такие анализы также включают прямое связывание меченного антитела биомаркером-мишенью.

Сэндвич-анализы входят в число наиболее пригодных и широко используемых анализов. Существуют различные варианты способов сэндвич-анализа, и предполагают, что все они входят в настоящее изобретение. В кратком изложении, в характерном прямом анализе немеченое антитело иммобилизуют на твердом субстрате, и образец, подлежащий тестированию, приводят в контакт со связанной молекулой. После подходящего периода инкубации в течение периода времени, достаточного для обеспечения образования комплекса антитело-антиген, затем добавляют второе антитело, специфичное к антигену, меченное репортерной молекулой, способной продуцировать детектируемый сигнал, и инкубируют, обеспечивая период времени, достаточный для образования другого комплекса антитела-антигена-меченого антитела. Любое непрореагировавшее вещество промывают и определяют наличие антигена путем наблюдения сигнала, продуцируемого репортерной молекулой. Результаты могут быть качественными путем простого наблюдения видимого сигнала, или их можно количественно определять, сравнивая с контрольным образцом, содержащим известные количества биомаркера.

Изменения прямого анализа включают одновременный анализ, в котором образец и меченое антитело добавляют одновременно к связанному антителу. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области, включая любые незначительные изменения, как будет понятно. В характерном прямом сэндвич-анализе первое антитело, обладающее специфичностью к биомаркеру, является ковалентно или пассивно связанным с твердой поверхностью. Твердая поверхность, как правило, представляет собой стекло или полимер, где наиболее широко используемые полимеры представляют собой целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен. Твердые подложки могут находиться в форме пробирок, гранул, дисков или микропланшетов или любой другой поверхности, подходящей для проведения иммунологического анализа. Способы связывания хорошо известны в данной области и, как правило, состоят из перекрестного ковалентного связывания или физической адсорбции, комплекс полимер-антитело промывают при подготовке для тестируемого образца. Затем к твердофазному комплексу добавляют аликвоту образца, подлежащего тестированию, и инкубируют в течение периода времени, достаточного (например, 2-40 минут или в течение ночи, если удобнее) и в подходящих условиях (например, от комнатной температуры до 40°C, такой как от 25°C до 32°C включительно) для обеспечения связывания любой субъединицы, содержащейся в антителе. После периода инкубации промывают твердую фазу с субъединицей антитела и сушат, и инкубируют со вторым антителом, специфичным к участку биомаркера. Второе антитело связано с репортерной молекулой, которую используют для обозначения связывания второго антитела с молекулярным маркером.

Альтернативный способ включает иммобилизацию биомаркеров-мишеней в образце, а затем воздействие на иммобилизованную мишень специфическим антителом, которое может являться или не являться меченным репортерной молекулой. В зависимости от количества мишени и силы сигнала репортерной молекулы связанную мишень можно детектировать прямым мечением антителом. Альтернативно, комплекс мишень-первое антитело подвергают воздействию вторым меченым антителом, специфичным к первому антителу, с образованием тройного комплекса мишень-первое антитело-второе антитело. Комплекс детектируют по сигналу, испускаемому репортерной молекулой. Под "репортерной молекулой", как используют в настоящем описании, подразумевают молекулу, которая по своей химической природе обеспечивает аналитически идентифицируемый сигнал, который обеспечивает детекцию связанного с антигеном антитела. Наиболее широко используемые репортерные молекулы в этом типе анализа представляют собой ферменты, флуорофоры или содержащие радионуклид молекулы (т.е. радиоактивные изотопы) и хемилюминесцентные молекулы.

В случае ферментативного иммунологического анализа фермент конъюгируют со вторым антителом, как правило, посредством глутаральдегида или периодата. Как будет понятно, тем не менее, существует широкий спектр различных способов конъюгации, которые являются легкодоступными специалисту в данной области. Широко используемые ферменты в числе прочих включают пероксидазу хрена, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу и щелочную фосфатазу. Используемые с конкретными ферментами субстраты, как правило, выбирают для получения после гидролиза соответствующим ферментом детектируемого изменения цвета. Примеры подходящих ферментов включают щелочную фосфатазу и пероксидазу. Также вместо хромогенных субстратов, указанных выше, можно применять флуорогенные субстраты, которые приводят к образованию флуоресцентного продукта. Во всех случаях к комплексу первое антитело-молекулярный маркер добавляют меченное ферментом антитело, обеспечивают возможность его связывания, а затем отмывают избыток реагента. Затем к комплексу антитело-антиген-антитело добавляют раствор, содержащий соответствующий субстрат. Субстрат взаимодействует с ферментом, связанным со вторым антителом, приводя к образованию качественного видимого сигнала, который можно дополнительно количественно оценивать, как правило, спектрофотометрически, чтобы получать представление о количестве биомаркера, который содержится в образце. Альтернативно, флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин и родамин, можно химически связывать с антителами, не изменяя их связывающей способности. При активации облучением светом конкретной длины волны меченное фторхромом антитело поглощает энергию света, индуцирующую состояние возбуждения в молекуле, с последующим испусканием света характерного цвета, визуально детектируемого с использованием оптического микроскопа. Как и в EIA обеспечивают связывание флуоресцентно меченого антитела с комплексом первое антитело-молекулярный маркер. Затем после отмывания несвязавшегося реагента оставшийся тройной комплекс подвергают воздействию света соответствующей длины волны, наблюдаемая флуоресценция указывает на наличие представляющего интерес молекулярного маркера. Способы иммунофлуоресценции и EIA являются общепринятыми в данной области. Однако также можно применять другие репортерные молекулы, такие как радиоактивный изотоп, хемилюминесцентные или биолюминесцентные молекулы.

B. Наборы

Изобретение также относится к наборам или промышленным изделиям для применения для детекции биомаркеров. Такие наборы можно использовать для определения, будет ли индивидуум с ангиогенным нарушением эффективно реагировать на антагонист VEGF. Эти наборы могут содержать средства для переноски, разделенные на камеры, с получением строго изолированных одного или более контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., где каждый из контейнеров содержит один из отдельных элементов, используемых в способе. Например, один из контейнеров может содержать зонд, который является меченым для детекции или который можно метить для детекции. Такой зонд может представлять собой антитело или полинуклеотид, специфичный к белку или транскрипту, соответственно. В случае, когда в наборе используют гибридизацию нуклеиновой кислоты для детекции нуклеиновой кислоты-мишени, набор также может содержать контейнеры, содержащие нуклеотид(ы) для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, и/или контейнер, содержащий репортерные средства, такие как связывающий биотин белок, например, авидин или стрептавидин, связанный с репортерной молекулой, такой как ферментная, флуоресцентная или радиоизотопная метка.

Такой набор, как правило, содержит описанный выше контейнер и один или более других контейнеров, содержащих вещества, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по использованию. На контейнере может содержаться этикетка для указания, что композицию используют для конкретного применения, а также на ней можно указывать инструкции для применения in vivo или in vitro, такого как описанное выше применение.

Наборы по изобретению имеют ряд вариантов осуществления. Характерный вариант осуществления представляет собой набор, содержащий контейнер, этикетку на указанном контейнере и композицию, содержащуюся в указанном контейнере, где композиция содержит первичное антитело, которое связывается с белком-биомаркером или аутоантителом-биомаркером, и на этикетке на указанном контейнере указано, что композицию можно использовать для оценки наличия таких белков или антител в образце, и где набор содержит инструкции по использованию антитела для оценки наличия белков-биомаркеров в конкретном типе образцов. Набор может дополнительно содержать набор инструкций и веществ для подготовки образца и применения антитела к образцу. Набор может содержать первичное и вторичное антитело, где вторичное антитело конъюгировано с меткой, например, ферментной меткой.

Другой вариант осуществления представляет собой набор, содержащий контейнер, этикетку на указанном контейнере и композицию, содержащуюся в указанном контейнере, где композиция содержит один или более полинуклеотидов, которые гибридизуются с комплементом биомаркера, указанного в таблице 1 или 2, в жестких условиях, и на этикетке на указанном контейнере указывают, что композицию можно использовать для оценки наличия биомаркера, указанного в таблице 1 или 2, в образце, и где набор содержит инструкции по использованию полинуклеотида(ов) для оценки наличия биомаркера РНК или ДНК в конкретном типе образцов.

Другие необязательные компоненты набора включают один или более буферов (например, блокирующий буфер, промывающий буфер, буфер для субстрата и т.д.), другие реагенты, такие как субстрат (например, хромоген), который химически изменяют ферментативной меткой, раствор для демаскировки эпитопов, контрольные образцы (положительные и/или отрицательные контроли), контрольное препарат(ы) и т.д. Наборы также могут содержать инструкции по интерпретации результатов, получаемых с использованием набора.

В дополнительных конкретных вариантах осуществления наборов на основе антител, набор может содержать, например: (1) первое антитело (например, прикрепленное к твердой подложке), которое связывается с белком-биомаркером, и необязательно (2) второе отличное антитело, которое связывается с белком или первым антителом и конъюгировано с детектируемой меткой.

Для наборов на основе олигонуклеотидов набор может содержать, например: (1) олигонуклеотид, например, меченный для детекции олигонуклеотид, гибридизующийся с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-биомаркер, или (2) пару праймеров, пригодную для амплификации молекулы-биомаркера нуклеиновой кислоты. Набор также может содержать, например, буферное средство, консервант или белок стабилизатор. Набор может дополнительно содержать компоненты, необходимые для детекции детектируемой метки (например, фермент или субстрат). Набор также может содержать контрольный образец или серию контрольных образцов, которые можно анализировать и сравнивать с тестируемым образцом. Каждый компонент набора можно помещать в индивидуальный контейнер, и все различные контейнеры могут находиться в одной упаковке наряду с инструкциями по интерпретации результатов анализов, проводимых с использованием набора.

C. Статистика

Как используют в настоящем описании, общая форма алгоритма прогнозирования заключается в описании функции одного или многих биомаркеров, потенциально включающих клинические ковариаты для прогнозирования ответа или его отсутствия, или, в более общем смысле, прогнозирования благоприятного действия или отсутствия благоприятного действия в отношении соответственно определенных клинических конечных точек.

Простейшая форма алгоритма прогнозирования состоит из однофакторной модели без ковариат, где прогноз определяют посредством порога или пороговой величины. Это можно формулировать в отношении функции Хевисайда для конкретного порога с и измерения биомаркера x, где получают двойной прогноз A или В, затем если H(x-c)=0, то прогнозируют A. Если H(x-c)=1, то прогнозируют B.

Это является простейшим способом использования измерений однофакторного биомаркера в алгоритмах прогнозирования. В случае, когда такой простой алгоритм является достаточным, он обеспечивает возможность простой идентификации направления эффекта, т.е. являются ли благоприятными для пациента высокие или низкие уровни экспрессии.

Ситуация может быть более сложной, если необходимо учитывать клинические ковариаты, и/или если в многомерных алгоритмах прогнозирования используют многие биомаркеры. Два гипотетических примера ниже иллюстрируют рассматриваемые исходы.

Поправка на ковариату (гипотетический пример)

Для биомаркера X в популяции клинического испытания выявлено, что высокие уровни экспрессии ассоциированы с худшей клинической реакцией (однофакторный анализ). Более подробный анализ демонстрирует, что в популяции существует два типа клинической реакции, первая группа, которая обладает худшей реакцией по сравнению со второй группой, и в то же время экспрессия биомаркера для первой группы, как правило, является выше после введение по меньшей мере одной дозы антагониста VEGF. Анализ с поправкой на ковариату выявляет, что для каждой из групп отношение клинической пользы к клинической реакции является обратным, т.е. в группах более низкие уровни экспрессии ассоциированы с лучшей клинической реакцией. Общий противоположный эффект был замаскирован типом ковариаты, и анализом с поправкой на ковариату в качестве части алгоритма прогнозирования менял направление на противоположное.

Многофакторное прогнозирование (гипотетический пример)

Для биомаркера X в популяции клинического испытания выявлено, что высокие уровни экспрессии незначительно ассоциированы с худшей клинической реакцией (однофакторный анализ). Для второго биомаркера Y проводили аналогичное наблюдение с использованием однофакторного анализа. Комбинация X и Y выявляла, что наблюдают хорошую клиническую реакцию, если уровни обоих биомаркеров являются низкими. Это составляет алгоритм для прогнозирования благоприятного действия, если оба биомаркера ниже определенных порогов (и связь с прогностической функцией Хевисайда). Для комбинированного алгоритма простой алгоритм больше не применяют в однофакторном отношении, например, наличие низких уровней экспрессии для X автоматически не прогнозирует лучшую клиническую реакцию.

Эти простые примеры демонстрируют, что алгоритмы прогнозирования с ковариатами и без них нельзя рассматривать на одномерном уровне каждого биомаркера. Комбинация многих биомаркеров плюс потенциальная поправка на ковариаты не позволяет оценивать простые взаимосвязи с одиночными биомаркерами. Вследствие того, что маркерные гены, в частности в сыворотке, можно использовать в моделях прогнозирования на основании многих маркеров, потенциально включающих другие клинические ковариаты, направление положительного действия одного маркерного гена в таких моделях невозможно определять простым способом, и оно может находиться в противоречии с направлением, выявляемым в многофакторных анализах, т.е. ситуация, как описано для одного маркерного гена.

Клинический врач может использовать любой из нескольких известных в данной области способов для определения эффективности конкретной схемы дозирования антагониста VEGF. Например, для определения относительной эффективной восприимчивости к терапии можно использовать визуализацию in vivo (например, MRI) для определения размера опухоли и для идентификации каких-либо метастазов. Режимы дозирования можно регулировать для обеспечения оптимального желательного ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно вводить дозу, можно вводить несколько дробных доз в течение определенного периода времени или можно пропорционально снижать или повышать дозу, на что указывает необходимость терапевтической ситуации.

Врач-специалист в данной области может легко определять и предписывать эффективное количество необходимой фармацевтической композиции в зависимости от таких факторов, как конкретный тип антагониста. Например, врач может начинать с доз такого антагониста, такого как антитело против VEGF, применяемого в фармацевтической композиции, на уровнях более низких, чем это необходимо для получения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до тех пор, пока не получают желаемое действие. Эффективность вводимой дозы или схемы лечения антагонистом можно определять, например, оценкой признаков и симптомов у пациента с использованием стандартных измерений эффективности.

В еще одном варианте осуществления индивидуум получает лечение одним и тем же антагонистом, таким как антитело против VEGF, по меньшей мере дважды. Таким образом, первичное и вторичное воздействие антагонистом предпочтительно проводить одним и тем же антагонистом и более предпочтительно все воздействия антагонистом проводить одним и тем же антагонистом, т.е. лечение при первых двух воздействиях и предпочтительно всех воздействиях проводят одним типом антагониста VEGF, например, антагонистом, который связывается с VEGF, таким как антитело против VEGF, например, бевацизумабом.

Во всех способах по изобретению, указанных в настоящем описании, антагонист (такой как антитело, которое связывается с VEGF) может быть неконъюгированным, таким как голое антитело, или может быть конъюгированным с другой молекулой для дополнительной эффективности, такой как, например, для увеличения времени полужизни.

Предпочтительное антитело-антагонист в настоящем описании представляет собой химерное, гуманизированное антитело или антитело человека, более предпочтительно антитело против VEGF и наиболее предпочтительно бевацизумаб.

В другом варианте осуществления антагонист VEGF (например, антитело против VEGF) представляет собой только лекарственное средство, вводимое индивидууму.

В одном из вариантов осуществления антагонист представляет собой антитело против VEGF, которое вводят в дозе приблизительно 100 или 400 мг каждые 1, 2, 3 или 4 недели или вводят в дозе приблизительно 1, 3, 5, 10, 15 или 20 мг/кг каждые 1, 2, 3 или 4 недели. Дозу можно вводить в виде однократной дозы или в виде многократных доз (например, 2 или 3 дозы), таких как инфузии.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу определения после этапа диагностики, следует ли продолжать введение антагониста VEGF (например, антитела против VEGF) индивидууму с ангиогенным нарушением, включающему измерение уменьшения размера опухоли способами визуализации, такими как радиография и/или MRI, после введения антагониста в первый раз, измерение уменьшения размера опухоли у индивидуума способами визуализации, такими как радиография и/или MRI, после введения антагониста во второй раз, сравнение результатов визуализации в первый раз и второй раз у индивидуума, и если оценка является меньше в случае второго раза, чем в случае первого раза, сохранение введения антагониста.

В еще одном дополнительном варианте осуществления этап входит в способ лечения для тестирования реакции индивидуума на лечение после этапа введения для определения, является ли уровень реакции эффективным для лечения ангиогенного нарушения. Например, этап включают для тестирования оценки визуализации (радиографической и/или MRI) после введения и ее сравнения с результатами визуализации на исходном уровне, получаемыми до введения, для определения, является ли лечение эффективным, посредством определения, изменилась ли она и насколько сильно она изменилась. Этот тест можно повторять в различные планируемые или непланируемые интервалы времени после введения для определения сохранения частичной или полной ремиссии. Альтернативно, способы в настоящем описании включают этап тестирования индивидуума до введения для того, чтоб выявлять присутствует ли один или более биомаркеров или симптомов ангиогенных нарушений, как указано выше.

В одном из вариантов осуществления изобретения для лечения ангиогенного нарушения индивидууму не вводят другого лекарственного средства, отличного от антагониста VEGF, такого как антитело против VEGF.

В любом из способов в настоящем описании антагонист VEGF можно вводить в комбинации с эффективным количеством второго лекарственного средства (где антагонист VEGF (например, антитело против VEGF) представляет собой первое лекарственное средство). Подходящие вторые лекарственные средства включают, например, антинеопластическое средство, химиотерапевтическое средство, ингибирующее рост средство, цитотоксическое средство или их сочетания.

Любые такие вторые лекарственные средства можно использовать в комбинации друг с другом или сами по себе с первым лекарственным средством, таким образом, выражение "второе лекарственное средство", как используют в настоящем описании, не означает, что оно является только лекарственным средством в дополнение к первому лекарственному средству. Таким образом, второе лекарственное средство необязательно представляет собой одно лекарственное средство, а может состоять или содержать более одного такого лекарственного средства.

Такие вторые лекарственные средства, как указано в настоящем описании, как правило, используют в одинаковых дозах и с одинаковыми способами введения, как используют в настоящем описании ниже или приблизительно от 1 до 99% используемых выше доз. Если такие вторые лекарственные средства обязательно используют, предпочтительно их используют в меньших количествах, чем если бы первое лекарственное средство не присутствовало, в частности, в последующих дозированиях после начального дозирования первым лекарственным средством, таким образом, чтобы исключать или снижать побочные эффекты, вызываемые ими.

Для способов повторного лечения, описываемых в настоящем описании, где второе лекарственное средство вводят в эффективном количестве наряду с воздействием антагониста, его можно вводить при любых воздействиях, например, только при одном воздействии или при более чем одном воздействии. В одном из вариантов осуществления второе лекарственное средство вводят при первичном воздействии. В другом варианте осуществления второе лекарственное средство вводят при первичном и вторичных воздействиях. В еще одном дополнительном варианте осуществления второе лекарственное средство вводят при всех воздействиях. Предпочтительно после первичного воздействия, такого как стероидом, уменьшать количество такого второго лекарственного средства или устранять, таким образом, чтобы уменьшать воздействие на индивидуума средством с побочными эффектами, таким как преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, и циклофосфамид.

Комбинированное введение второго лекарственного средства включает совместное введение (одновременное введение) с использованием отдельных составов или одного фармацевтического состава, и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно существует период времени, при котором оба (или все) активных средства (лекарственных средства) одновременно проявляют виды своей биологической активности.

Антагонист в настоящем описании вводят любым подходящим способом, включая парентеральное, местное, подкожное, интраперитонеальное, внутрилегочное, интраназальное и/или внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное (в/в), внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. Также предусматривают интратекальное введение. Кроме того, антагонист можно подходящим образом вводить посредством импульсной инфузии, например, с использованием снижающихся доз антагониста. Предпочтительно проводить дозирование внутривенно или подкожно и более предпочтительно посредством внутривенной инфузии(ий).

Если обеспечивают многочисленные введения антагониста, каждое введение можно проводить с использованием одного и того же или другого способа введения. В одном из вариантов осуществления каждое введение проводят посредством внутривенного введения. В другом варианте осуществления каждое введение проводят посредством подкожного введения. В еще одном варианте осуществления введения проводят посредством внутривенного и подкожного введения.

В одном из вариантов осуществления антагонист, такой как антитело против VEGF, вводят в виде медленной внутривенной инфузии, а не внутривенно струйно или болюсно. Например, стероид, такой как преднизолон или метилпреднизолон, (например, приблизительно 80-120 мг в/в, более конкретно приблизительно 100 мг в/в) вводят приблизительно за 30 минут до любой инфузии антитела против VEGF. Для антитела против VEGF, например, проводят инфузию по выделенной линии.

Для первичной дозы многодозового введения антитела против VEGF или для однократной дозы, если введение включает только одну дозу, такую инфузию предпочтительно начинать при скорости приблизительно 50 мг/час. Ее можно увеличивать, например, при увеличении скорости приблизительно 50 мг/час приблизительно каждые 30 минут до максимальной скорости приблизительно 400 мг/час. Однако если индивидуум испытывает связанную с инфузией реакцию, предпочтительно снижать скорость инфузии, например, до половины от текущей скорости инфузии, например, от 100 мг/час до 50 мг/час. Предпочтительно инфузию такой дозы антитела против VEGF (например, приблизительно суммарной дозы 1000 мг) завершать в течение приблизительно 255 минут (4 часов 15 минут). Необязательно индивидуумы получают профилактическое лечение ацетаминофен/парацетамолом (например, приблизительно 1 г) и дифенгидрамином HCl (например, приблизительно 50 мг или эквивалентной дозы аналогичного средства) перорально через приблизительно от 30 до 60 минут после начала инфузии.

Если вводят более чем одну инфузию (дозу) антитела против VEGF для получения общего воздействия, вторую или последующие инфузии антитела против VEGF в этом варианте осуществления инфузии предпочтительно начинать при более высокой скорости, чем начальную инфузию, например, приблизительно при 100 мг/час. Эту скорость можно увеличивать, например, при увеличении скорости приблизительно 100 мг/час каждые приблизительно 30 минут до максимальной скорости приблизительно 400 мг/час. Для индивидуумов, которые испытывают связанную с инфузией реакцию, предпочтительно снижают скорость инфузии до половины скорости, например, от 100 мг/час до 50 мг/час. Предпочтительно инфузия такой второй или последующей дозы антитела против VEGF (например, приблизительно суммарной дозы 1000 мг) завершают приблизительно за 195 минут (3 часа 15 минут).

В предпочтительном варианте осуществления антагонист представляет собой антитело против VEGF, и его вводят в дозе приблизительно от 0,4 до 4 грамм, и более предпочтительно антитело вводят в дозе приблизительно от 0,4 до 1,3 грамм с частотой от одной до четырех доз в течение периода приблизительно один месяц. Еще более предпочтительно доза представляет собой приблизительно от 500 мг до 1,2 грамм, и в других вариантах осуществления составляет приблизительно от 750 мг до 1,1 грамм. В таких аспектах антагонист предпочтительно вводят в двух-трех дозах и/или вводят в течение периода приблизительно от 2 до 3 недель.

В одном из вариантов осуществления индивидууму ранее никогда не вводили какое-либо лекарственное средство(а) для лечения ангиогенного нарушения. В другом варианте осуществления индивидууму или пациенту ранее вводили одно или более лекарственных средств для лечения ангиогенного нарушения. В дополнительном варианте осуществления индивидуум или пациент являлся нечувствительным к одному или более лекарственным средствам, которые ранее вводили. Такие лекарственные средства, к которым индивидуум может быть невосприимчивым, включают, например, антинеопластические средства, химиотерапевтические средства, цитотоксические средства и/или ингибирующие рост средства. Более конкретно лекарственные средства, к которым индивидуум может являться невосприимчивым, включают антагонисты VEGF, такие как антитела против VEGF. В дополнительном аспекте такие антагонисты включают антитело или иммуноадгезин, таким образом, что предусматривают повторное лечение одним или более антител или иммуноадгезинов по настоящему изобретению, к которым индивидуум являлся ранее невосприимчивым.

IV. Лечение антагонистом

После того, как идентифицируют популяцию пациентов наиболее восприимчивых или чувствительных к лечению антагонистом, лечение антагонистом по настоящему описанию отдельно или в комбинации с другими лекарственными средства приводит к улучшению ангиогенного нарушения. Например, такое лечение может приводить к уменьшению размера опухоли или выживаемости без прогрессирования заболевания. Кроме того, лечение комбинацией антагониста по настоящему описанию и по меньшей мере одним вторым лекарственным средством(ами) предпочтительно приводит к аддитивному, более предпочтительно синергическому (или более аддитивному) терапевтическому действию у пациента. Предпочтительно в таком комбинированном способе интервал времени между по меньшей мере одним введением второго лекарственного средства и по меньшей мере одним введением антагониста по настоящему описанию составляет приблизительно один месяц или менее, более предпочтительно приблизительно два недели или менее. Введение антагонистов VEGF, как описано в настоящем описании, необязательно входит в изобретение. Таким образом, в дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли (например, колоректального рака, рака молочной железы, рака легких или глиобластомы) у пациента введением антагониста VEGF (например, антитела против VEGF, такого как бевацизумаб), где пациента идентифицируют или идентифицировали способами, описываемыми в настоящем описании, как пациента, который получит пользу от такого лечения.

Специалисту в области медицины следует понимать, что точный способ введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антагониста VEGF после того, как у пациента диагностировали высокую вероятность восприимчивости к антагонисту, остается на усмотрение лечащего врача. На способ введения, включая дозирование, комбинацию с другими средствам, интервалы времени и частоту введения и т.п. может влиять диагностирование у пациента высокой вероятности восприимчивости к такому антагонисту, а также состояние и история пациента. Таким образом, даже пациенты, у которых диагностировали ангиогенное нарушение, для которых спрогнозировали, что они являются относительно нечувствительными к антагонисту, могут все еще получать положительный результат от лечения им, в частности, в комбинации с другими средствами, включая средства, которые могут изменять восприимчивость пациента к антагонисту.

Композицию, содержащую антагонист, формулируют, дозируют и вводят в соответствии с добросовестной медицинской практикой. Рассматриваемые факторы в этом контексте включают конкретный тип ангиогенного нарушения, подлежащего лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину ангиогенного нарушения, участок доставки средства, возможные побочные эффекты, тип антагониста, способ введения, схему введения и другие факторы, известные врачам-терапевтам. Эффективное количество антагониста, которое необходимо вводить, зависит от таких рассматриваемых факторов.

В качестве общего предложения эффективное количество антагониста, вводимого парентерально в дозе, находится в диапазоне приблизительно от 20 мг приблизительно до 5000 мг в одной или более дозах. Иллюстративные режимы дозирования антител, таких как антитела против VEGF, включают 100 или 400 мг каждые 1, 2, 3 или 4 недели, или вводят дозу приблизительно 1, 3, 5, 10, 15 или 20 мг/кг каждые 1, 2, 3 или 4 недели. Дозу можно вводить в виде однократной дозы или в виде многократных доз (например, 2 или 3 доз), таких как инфузии.

Однако, как указано выше, эти рекомендуемые количества антагониста являются предметом значительной части изобретения, относящегося к терапевтическому лечению. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и схемы является получаемый результат, как указано выше. В некоторых вариантах осуществления антагонист вводят как можно раньше относительно первого признака, диагностики, появления или возникновения ангиогенного нарушения.

Антагонист вводят любым подходящим способом, включая парентеральное, местное, подкожное, интраперитонеальное, внутрилегочное, интраназальное и/или внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. Также предусматривают интратекальное введение. Кроме того, антагонист можно подходящим образом вводить посредством импульсной инфузии, например, с использованием снижающихся доз антагониста. Наиболее предпочтительно проводить дозирование посредством внутривенных инъекций.

Совместно с антагонистами по настоящему описанию можно вводить второе лекарственное средство, как указано выше. Комбинированное введение включает совместное введение с использованием отдельных составов или одного фармацевтического состава и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно существует период времени, при котором оба (или все) лекарственных средства одновременно проявляют виды своей биологической активности.

Кроме введения антагонистов пациенту общепринятыми способами, как указано выше, настоящее изобретение относится к введению путем генотерапии. Такое введение нуклеиновых кислот, кодирующих антагонист, входит в выражение "введение эффективного количества антагониста". Касательно использования генотерапии для получения внутриклеточных антител см., например, WO 1996/07321.

Существует два основных подхода доставки нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетки пациента in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту инъецируют непосредственно пациенту, как правило, в участок, где необходим антагонист. Для лечения ex vivo извлекают клетки пациента, вводят нуклеиновую кислоту в эти выделенные клетки и модифицированные клетки вводят непосредственно пациенту или, например, инкапсулируют в пористые мембраны, которые имплантируют пациенту (см., например, патенты США № 4892538 и 5283187). Существует ряд способов, доступных для введения нуклеиновых кислоты в жизнеспособные клетки. Способы изменяются в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культивируемые клетки in vitro или в клетки предполагаемого хозяина in vivo. Способы, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают использование липосом, электропорации, микроинъекции, слияния клеток, DEAE-декстран, способ осаждения фосфатом кальция и т.д. Широко используемый вектор для доставки гена ex vivo представляет собой ретровирус.

В настоящее время предпочтительные способы переноса нуклеиновых кислот in vivo включают трансфекцию вирусными векторами (такими как аденовирус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус) и системы на основе липидов (пригодные липиды для опосредованного липидами переноса генов представляют собой, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых ситуациях желательно предоставлять источник нуклеиновой кислоты совместно со средством, специфическим к клеткам-мишеням, таким как антитело, специфическое к мембранному белку клеточной поверхности на клетке-мишени, лиганду рецептора на клетке-мишени и т.д. В случае, когда применяют липосомы, можно использовать белки, которые связываются с мембранным белком клеточной поверхности, ассоциированным с эндоцитозом, для направленной доставки и/или для облегчения поглощения, например, капсидные белки или их фрагменты для конкретного типа клеток, антитела к белкам, которые подвергаются нейтрализации при циркуляции, и белки, которые обеспечивают направленную доставку в определенный участок внутри клетки и увеличивают время полужизни в клетке. Способ опосредованного рецепторами эндоцитоза описан, например, Wu et al., J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987) и Wagner et al., PNAS USA, 87:3410-3414 (1990). Протоколы мечения генов и генотерапии описаны, например, у Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992) и в WO 1993/25673.

Антагонист VEGF можно комбинировать в фармацевтическом комбинированном составе или режиме дозирования в виде комбинированного лечения по меньшей мере с одним дополнительным соединением, обладающим противоопухолевыми свойствами. По меньшей мере одно дополнительное соединение фармацевтического комбинированного состава или режима дозирования предпочтительно обладает комплементарными видами активности с композицией антагониста VEGF, таким образом, что они не оказывают отрицательного влияния друг на друга.

По меньшей мере одно дополнительное соединение может представлять собой химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, цитокин, ингибирующее рост средство, противогормональное средство и их сочетания. Такие молекулы подходящим образом содержаться в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели. Фармацевтическая композиция, содержащая антагонист VEGF (например, антитело против VEGF), также может содержать терапевтически эффективное количество антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства, цитотоксического средства или их сочетания.

В одном из аспектов первое соединение представляет собой антитело против VEGF и по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой терапевтическое антитело отличное от антитела против VEGF. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой антитело, которое связывается с маркером поверхности злокачественной клетки. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой антитело против HER2, трастузумаб (например, Herceptin®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA). В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой антитело против HER2, пертузумаб (Omnitarg™, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, см. US 6949245). В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой антитело (или голое антитело, или ADC), и дополнительное антитело представляет собой второе, третье, четвертое, пятое, шестое антитело или более, таким образом, что комбинация таких второго, третьего, четвертого, пятого, шестого или более антител (или голого антитела, или такого как ADC) является эффективной для лечения ангиогенного нарушения.

Другие схемы лечения в соответствии с настоящим изобретением могут включать введение средства против злокачественных опухолей антагониста VEGF и, включая, но, не ограничиваясь ими, лучевую терапию и/или трансплантаты костного мозга и периферической крови, и/или цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство или ингибирующее рост средство. В одном из таких вариантов осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой средство или комбинацию средств, таких как, например, циклофосфамид, гидроксидаунорубицин, адриамицин, доксорубицин, винкристин (ONCOVIN™), преднизолон, CHOP, CVP или COP, или иммунотерапевтические средства, такие как антитело против PSCA, антитело против HER2 (например, HERCEPTIN®, OMNITARG™). Комбинированное лечение можно вводить в виде одновременной или последовательной схемы дозирования. При последовательном введении комбинацию можно вводить при двух или более введениях. Комбинированное введение включает совместное введение с использованием раздельных составов или одного фармацевтического состава и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно существует период времени, при котором оба (или все) активные средства одновременно проявляют виды своей биологической активности.

В одном из вариантов осуществления лечение антителом против VEGF включает комбинированное введение средства против злокачественных опухолей, определяемого в настоящем описании, и одного или более химиотерапевтических средств или ингибирующих рост средств, включая совместное введение смесей различных химиотерапевтических средств. Химиотерапевтические средства включают таксаны (такие как паклитаксел и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики. Препарат и схемы дозирования для таких химиотерапевтических средств можно использовать по инструкциям производителя, или как определяет эмпирически специалист в данной области. Препарат и схемы дозирования для такой химиотерапии также описаны в "Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.

Подходящие дозы для любого из указанных выше совместно вводимых средств представляют собой дозы, используемые в настоящее время, и их можно снижать в результате комбинированного действия (синергизма) недавно идентифицированного средства и других химиотерапевтических средств или видов лечения.

Комбинированное лечение может обеспечивать "синергизм", и он доказано "синергическим", т.е. эффект, получаемый, когда активные ингредиенты используют совместно, является больше, чем сумма эффектов, которые являются результатом раздельного использования соединений. Синергическое действие можно получать, когда активные ингредиенты: (1) совместно формулируют и водят или доставляют одновременно в комбинированном, стандартном лекарственном составе; (2) доставляют поочерердно или параллельно в виде отдельных составов, или (3) посредством некоторых других схем лечения. При доставке в поочередном лечении можно получать синергическое действие, когда соединения вводят или доставляют последовательно, например, посредством различных инъекций в отдельные шприцы. Как правило, во время поочередного лечения эффективную дозу каждого активного ингредиента вводят последовательно, т.е. сериями, тогда как в комбинированном лечении эффективные дозы двух или более активных ингредиентов вводят совместно.

Для профилактики или лечение заболевания подходящее дозирование дополнительного терапевтического средства зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, вводят ли антагонист VEGF и дополнительное средство в превентивных или терапевтических целях, предшествовавшей терапии, истории болезни пациента и его реакции на антагонист VEGF и дополнительное средство и решения лечащего врача. Антагонист VEGF и дополнительное средство подходящим способом вводят пациенту один раз или в течение серии лечений. Антагонист VEGF, как правило, вводят, как указано выше. В зависимости от типа и тяжести заболевания приблизительно от 20 мг/м² до 600 мг/м² дополнительного средства представляет собой начальную кандидатную дозу для введения пациенту, например, посредством одного или более отдельных введений или посредством непрерывной инфузии. Одно из характерных суточных дозирований может находиться в диапазоне приблизительно от или приблизительно 20 мг/м², 85 мг/м², 90 мг/м², 125 мг/м², 200 мг/м², 400 мг/м², 500 мг/м² или более в зависимости от указанных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких суток или более в зависимости от состояния лечение сохраняют до желаемого подавления возникновения симптомов заболевания. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз приблизительно 20 мг/м², 85 мг/м², 90 мг/м², 125 мг/м², 200 мг/м², 400 мг/м², 500 мг/м², 600 мг/м² (или любое их сочетание). Такие дозы можно вводить периодически, например, каждую неделю или каждые две, три недели, четыре, пять или шесть (например, таким образом, чтобы пациент получал приблизительно от двух приблизительно до двадцати, например, приблизительно шесть доз дополнительного средства). Можно вводить начальную более высокую ударную дозу с последующим введением одной или нескольких менее низких доз. Однако пригодными могут являться другие режимы дозирования. За эффективностью такой терапии легко наблюдать общепринятыми способами и анализами.

V. Фармацевтические составы

Для хранения терапевтические составы антагонистов, используемые в соответствии с настоящим изобретением, получают смешиванием антагониста, обладающего желаемой степенью чистоты с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Для общей информации, касающейся составов см., например, Gilman et al., (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania.; Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al, (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; and Lieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker.

Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин, консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид, гексаметонийхлорид, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутил или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и мета-крезол), низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины, хелатирующие средства, такие как ЭДТА, сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, образующие соль противоионы, такие как натрий, комплексные соединения с металлами (например, комплексные соединения Zn-белок), и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Иллюстративные составы антитела против VEGF описаны в патенте США № 6884879. В определенных вариантах осуществления антитела против VEGF формулируют в дозе 25 мг/мл в одноразовых флаконах. В определенных вариантах осуществления 100 мг антител против VEGF формулируют в 240 мг α,α-трегалоза дигидрата, 23,2 мг фосфата натрия (одноосновного моногидрата), 4,8 мг фосфата натрия (двухосновного безводного), 1,6 мг полисорбата 20 и воде для инъекций USP. В определенных вариантах осуществления 400 мг антител против VEGF формулируют в 960 мг α,α-трегалоза дигидрате, 92,8 мг фосфата натрия (одноосновного моногидрата), 19,2 мг фосфата натрия (двухосновного безводного), 6,4 мг полисорбата 20 и воде для инъекций USP.

Лиофилизированные составы, адаптированные для подкожного введения, описаны, например, в патенте США № 6267958 (Andya et al.,). Такие лиофилизированные составы можно восстанавливать подходящим разбавителем до высокой концентрации белка и восстановленный состав можно вводить подкожно млекопитающим, подлежащим лечению по настоящему описанию.

Также предусматривают кристаллические формы антагониста. См., например, US 2002/0136719A1.

Состав по настоящему изобретению также может содержать более одного активного соединения (второе лекарственное средство, как указано выше), предпочтительно активного соединения с комплементарными видами активности, которые не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Тип и эффективные количества таких лекарственных средств зависят, например, от количества и типа антагониста VEGF, содержащегося в составе, и клинических параметров индивидуума. Предпочтительно такие вторые лекарственные средства являются такими, как указано выше.

Активные ингредиенты также можно заключать в микрокапсулы, например, получаемые способами коацервации или интерфазной полимеризацией, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в микроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Можно получать препараты с длительным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антагонист, где матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с длительным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамината, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролидацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляной кислоты.

Составы, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко получать фильтрованием через стерильные фильтрационные мембраны.

ПРИМЕРЫ

Следующие ниже примеры предоставлены для иллюстрации, а не для ограничения описываемого в настоящей заявке изобретения.

Пример 1. Материалы и методы

Линии мышей и модели

Авторы получали мышей RIP-TβAg из Exelixis, Inc. и мышей Beige Nude XID от Harlan. Животных содержали и ухаживали за ними в соответствии с рекомендациями Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) at Genentech, Inc.

Схемы лечения и дозирование

Все схемы лечения проводили в соответствии с рекомендациями IACUC. У исследуемых животных проводили ежесуточные наблюдения и измеряли массу тела по меньшей мере дважды в неделю. Способы, используемые для внутричерепного введения опухоли, включая наблюдение за ростом опухоли и реакции на терапию посредством биолюминесцентной визуализации, были описаны ранее (Ozawa and James, J. Vis. Exp., 41:1-5, 2010). Получали моноклональное антитело против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) B20-4.1.1, антитело против амброзии (контроль) и антитело против Dll4 и очищали, как описано ранее (Fuh et al., J. Biol. Chem., 281:6625-6631, 2006), и дозировали при 5 или 10 мг/кг дважды в неделю посредством интраперитонеальной (и/п) инъекции для всех экспериментов на иммунокомпрометированных мышах и один раз в неделю (при 5 мг/кг) на мышах RIP-TβAg. Сунитиниб дозировали при 60 мг/кг ежесуточно пероральным принудительным кормлением. Анализы Заживление ран проводили, как описано ранее у Bais et al. (Cell, 141:166-177, 2010).

Иммунофлуоресцентное окрашивание и гистологический количественный анализ

Целые поджелудочные железы, вырезанные у несущих опухоль мышей RIP-TβAg, инкубировали в сахарозе (30%) в течение 5-10 минут при 4°C с последующим промыванием PBS (дважды каждые 15 минут). Затем поджелудочные железы помещали в криомодули, содержащие оптимальную среду для температуры резания (OCT, Sakura Finetek) и хранили при -70°C. Срезы (6 мкм) панкреатических желез отрезали от каждого блока OCT с использованием устройства криостата (Leica Microsystems) и хранили при -70°C до использования для окрашивания. Для иммунофлуоресцентного окрашивания замороженные срезы сушили на воздухе при комнатной температуре и фиксировали холодным ацетоном в течение 5-10 минут. Затем срезы снова сушили и блокировали в течение 30-60 минут буфером, содержащим 2,5% BSA и 5% сыворотку осла в PBS. Окрашивание первичными антителами, разведенными в блокирующем буфере (разведения в соответствии с рекомендациями производителя), проводили в течение ночи при 4°C. Затем срезы промывали PBS и подвергали воздействию вторичных антител, разведенных 1:300 в блокирующем буфере в течение 30-60 минут, а затем снова промывали в PBS. В завершении срезы погружали в DAKO (DAKO), содержащий 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, Molecular Probes) для визуализации ядер.

Для иммунофлуоресцентного окрашивания использовали следующие антитела: первичное антитело крысы против MECA-32 мыши (Invitrogen, Inc.), антитело кролика Ki67 и клон SP6 (Research Diagnostics, Inc.). Вторичные антитела включали конъюгированные с Alexa-594 антитела осла против антитела крысы и антитела кролика и конъюгированные с Alexa-488 антитела осла против антитела кролика и антитела козы против антитела курицы (Invitrogen, Inc.). Опухоли на окрашенных препаратах идентифицировали с использованием микроскопа и фотографировали с использованием Axioskop и программного обеспечения Axiovision (Zeiss, Inc.), и проводили гистологический количественный анализ на изображениях с использованием настраиваемых алгоритмов в программном обеспечении Metamorph (Molecular Dynamics). В каждый момент времени рассчитывали среднее измерение по меньшей мере из 3-5 изображений на островок поджелудочной железы/опухоль×5 опухолей из каждой мыши×3 мыши=45-75 изображений/момент времени/обработка из 15 независимых очагов. Для анализов плотности микрососудов (MVD) на моделях имплантированной опухоли у 6 мышей на группу обработки собирали опухоли и погружали в блоки O.C.T. Из тканей на криостате получали срезы толщиной 16 мкм на Leica CM3050S и окрашивали антителом к CD31 (BD Biosciences). Изображения получали с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss Axiolmager Z1 под контролем программного обеспечения TissueFAXS. Файлы изображений загружали в программное обеспечение для анализа TissueStudio (v 1.5, Deflniens). Некротические ткани и дефекты окрашивания, такие как ткани кожи и складки идентифицировали автоматически и исключали на основе окрашивания ядер. Плотность сосудов рассчитывали в виде отношения CD31-положительных пикселей к общей площади жизнеспособной опухоли.

Эксперименты с использованием микропанели

Тотальную РНК экстрагировали из контрольных опухолей и опухолей RIP-TβAg, обработанных антителом против VEGF, через 7 суток обработки как указано ниже: мыши анестезировали с использованием 0,25% авертина, инъецируемым интраперитонеально в соответствии с массой тела. Вскрывали брюшную полость для доступа к панкреатическому протоку и перфузировали поджелудочную железу через общий желчный проток. Поджелудочную железу перфузировали приблизительно 2,5 мл Liberase TL (Roche), разбавленным в соответствии с инструкциями производителя. Затем вырезали поджелудочную железу из брюшной полости и дополнительно макроскопически препарировали опухоль из экзокринной поджелудочной железы. Опухоли суспендировали в свежем перфузионном растворе и перемешивали при 37°C в течение 5-6 минут, а затем повторно анализировали под микроскопом для препарирования и удаляли любые оставшиеся фрагменты экзокринной поджелудочной железы. Затем чистые опухоли быстро замораживали в растворе RNAlater (Qiagen, Inc.). Для всех экспериментов с имплантатами на иммунодефицитных мышах животных подвергали эвтаназии в конце периода исследования и вырезали и быстро замораживали опухоли. Экстрагировали тотальную РНК и анализировали микропанели с использованием микропанели Agilent Whole Mouse Genome 44K, Affymetrix HGU133-plus2 или микропанели Agilent Whole Human Genome по инструкциям производителя.

Культура клеток

Клетки фибробластов кожи D551 (ATCC) культивировали в среде M199 (Invitrogen) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich), пенициллина (100 единиц/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Первичные эндотелиальные клетки сосудов пуповины человека (HUVEC) приобретали у Lonza Walkersville и поддерживали в среде EGM-2 (Lonza Walkersville). Кодиционированные среды: D551 клетки выращивали до 90% конфлуэнтности, меняли среду на EGM-2, через 7 суток инкубации собирали супернатант и хранили при 4°C.

Трансфекция HUVEC и анализ на разрастание

Подавление экспрессии гена COL4A2, NID2 и MEST: клетки выращивали до 70% конфлуэнтности и трансфицировали миРНК с использованием DharmaFECT1 по инструкциям производителя (Thermo Scientific). Конечная концентрация всех миРНК для трансфекции составляла 12,5 нМ, и снижение экспрессии мРНК для каждого гена подтверждали кПЦР в реальном времени. Через 24 часа после трансфекции клетки трипсинизировали и смешивали с гранулами микронисителя цитодекс (Sigma-Aldrich) в отношении 1×10⁶ клеток на 2500 гранул. Покрытие проводили в течение четырех часов при 37°C и вручную перемешивали смеси каждые 20 минут. Затем покрытие гранулы переносили в 6-луночную чашку и оставляли в течение 18-20 часов в EGM-2 при 37°C и 5% CO₂. На следующие сутки покрытые гранулы промывали EGM-2 и растворяли в растворе фибриногена (2 мг мл-1, Sigma-Aldrich) в EGM-2. Раствор приблизительно с 200 гранулами, покрытыми HUVEC, добавляли к 0,625 Ед. мл^-1 тромбина (Sigma) в одну лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей. 8×10⁴ клеток фибробластов кожи (D551) высевали на поверхность сгустка и инкубировали с 2 мл D551 кондиционированной среды/EGM-2 (1:3), содержащей 20 мкг/мл антител. Среду меняли каждые 2 суток и завершали анализы на 4 сутки. Прорастания HUVEC визуализировали иммуноокрашиванием в фибриновых гелях, фиксированных в 4% параформальдегиде (PFA), в течение 2 часов при комнатной температуре, затем блокировали блокирующим буфером (DAKO) в течение 4 часов при комнатной температуре, инкубировали с Alexa Fluor 488 фаллоидином (1:100) и Hoecsht 33258 (1:1000) (Invitrogen) в течение ночи при 4°C с последующей визуализацией. Для получения изображений использовали Image Xpress Micro и разрастание HUVEC анализировали с использованием программного обеспечения MetaXpress. Измеряли три компонента роста сосудов. Общий рост представляет собой суммарную длину всех отростков на гранулу, средний рост представляет собой число ответвлений отростков на гранулу, и общие процессы на гранулы определяли подсчетом количества отростков, происходящих непосредственно из клеток, выстилающих поверхность гранулы. Для статистического анализа оценивали 4 лунки для каждого условия, и каждый эксперимент повторяли 3 раза.

Количественные анализы экспрессии генов

РНК получали с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen) по протоколу производителя. 500 нг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора High Capacity cDNA reverse transcription (Applied Biosystems). ПЦР в реальном времени проводили на приборе Applied Biosystems 7500. Зонды Taqman для всех тестируемых генов приобретали у Applied Biosystems. Относительные уровни экспрессии каждого гена нормализовали на актин.

Определение сигнатуры экспрессии генов в клинических образцах

Патоморфолог оценивал срезы их архивных образцов опухоли у пациентов, включенных в группу лечения XELOX NO16966, и области с большим содержанием опухолей макропрепарировали для последующего выделения РНК с использованием набора FFPE RNA isolation (Roche, 7-10 срезов на пациента). Уровни РНК оценивали после синтеза кДНК стандартными способами с использованием протокола кПЦР на платформе Fluidigm Biomark по протоколу производителя.

Получение и применение сигнатуры генов

Значения отношения log₂ интенсивности микропанелей Agilent WMG к нормализованным интенсивностям робастного среднего значения многомерной микропанели (RMA) (также на логарифмической шкале) из микропанелей Affymetrix Mouse430.2 импортировали в R в виде выборки экспрессий с использованием пакета программ "Biobase", и аппроксимировали линейную модель к каждому признаку с использованием функций "lmFit" и "eBayes" в пакете программ "limma". Признаки, которые значительно (p<0,05) подавлялись в образцах, обрабатываемых антителом против VEGF, (по сравнению с контрольными образцами, обрабатываемыми антителом против амброзии), сохранялись и транслировались в идентификаторы EntrezGene. Совокупность этих генов принимали за характерный признак чувствительной к VEGF сосудистой сети. Степень, с которой такая сигнатура экспрессии генов VDV изменялась в других экспериментах, определяли аппроксимацией линейной модели к данным микропанели с использованием пакета программ "limma" (как указано выше) и расчетом среднего значения t-статистики от гена в сигнатуре способом Falcon and Gentleman (Bioinformatics, 23:257-258, 2007).

Статистические способы выбора биомаркера

Статистические задачи могут включать следующие этапы:

1. Предварительный отбор биомаркеров-кандидатов

2. Предварительный отбор релевантных прогностических клинической ковариат эффективности реакции

3. Отбор прогностических функций биомаркера на одномерном уровне

4. Отбор прогностических функций биомаркера, включая клинические ковариаты, на одномерном уровне

5. Отбор прогностических функций биомаркера на многомерном уровне

6. Отбор прогностических функций биомаркера, включая клинические ковариаты, на многомерном уровне.

В следующем ниже тексте подробно описаны различные этапы.

1: Предварительный отбор биомаркеров-кандидатов

Статистический предварительный отбор биомаркеров-кандидатов направлен на определение силы ассоциации с величинами клинической пользы. Для этой цели различные клинические конечные точки можно трансформировать в получаемые суррогатные баллы, например, в виде порядковой оценки степени баллов клинической пользы в отношении TTP, в которых избегают цензурированные наблюдения. Такие суррогатные трансформированные величины можно легко использовать для простого анализа корреляции, например, непараметрическим подходом корреляции Спирмена. Альтернативно, можно использовать измерения биомаркера в виде метрических ковариат в модели регрессии время-событие, такой как, например, пропорциональная регрессия рисков Кокса. В зависимости от статистического распределения значений биомаркера, на этом этапе может являться необходимой определенная предварительная обработка, такая как, например, стабилизирующее дисперсию преобразования и использование подходящих шкал или, альтернативно, этап стандартизации, такой как использование процентилей вместо необработанных измерений. Дополнительный подход представляет собой рассмотрение двумерной диаграммы рассеяния, например, посредством отображения разброса (ось x=значение биомаркера, ось y=величина клинической пользы) на основании одного пациента. Получают определенные непараметрические линии регрессии, например, посредством сглаживающих сплайнов, которые могут быть пригодными для визуализации ассоциации биомаркера и клинической пользы.

Целью этих различных подходов является предварительный отбор кандидатов биомаркера, для которых демонстрируют определенную ассоциацию с клинической пользой по меньшей мере в одной из применяемых измерений благоприятного действия, при этом результаты других измерений не являются противоречивыми. Когда существуют доступные контрольные группы, то различия в ассоциации биомаркеров с клинической пользой в различных группах могут служить признаком дифференциального прогноза, что делает биомаркер(ы) подходящим для дальнейшего рассмотрения.

2: Предварительный отбор релевантных прогностических клинической ковариат эффективности реакции

Статистический предварительный отбор клинических ковариат, как определено в настоящем описании, соответствует подходам предварительного отбора биомаркеров и также направлен на определение силы ассоциации с величинами клинической пользы. Таким образом, по существу применяют аналогичные способы, таким как рассматриваемые в пункте 1 выше. Для предварительного отбора релевантных клинических ковариат в дополнение к статистическим критериям можно применять критерии из клинической практики и теоретических знаний.

Прогностическая величина клинических ковариат может быть взаимосвязана с прогностической величиной биомаркеров. При необходимости их рассматривают для улучшения алгоритмов прогнозирования.

3: Отбор прогностических функций биомаркеров на одномерном уровне

Термин "прогностическая функция" используют в широком смысле для обозначения числовой функции измерения биомаркера, которая приводит к нормированному числу для обозначения целевого прогноза.

Простой пример представляет собой выбор функции Хевисайда для конкретного порога с и измерения биомаркера x, где получают двойной прогноз A или В, в том случае, когда H(x-c)=0, то прогнозируют predict A. Если H(x-c)=1, то прогнозируют B.

Вероятнее всего, это представляет собой наиболее распространенный способ применения однофакторных измерений биомаркера в алгоритмах прогнозирования. Определение "прогностической функции", как указано выше, включает обращение к существующим данным обучающего множества, которые можно использовать для исследования возможностей прогнозирования. Можно выбирать различные пути для получения подходящего порога с из обучающего множества. Сначала для определения порога можно использовать диаграмму рассеяния со сглаживающим сплайном, указанным в пункте 1. Альтернативно, можно выбирать определенную процентиль распределения, например, медиану или квартиль. Пороги также можно систематически получать, исследуя все возможные пороги в соответствии с их прогностическим потенциалом по отношению к измерениям клинической пользы. Затем эти результаты можно наносить на график для обеспечения возможности отбора вручную или применения определенных исследовательских алгоритмов для оптимальности. Это можно осуществлять на основании определенных клинических конечных точек с использованием модели Кокса, где в каждом тестируемом пороге биомаркер используют в качестве бинарной ковариаты. Затем результаты клинических конечных точек можно рассматривать совместно для выбора порога, который обеспечивает прогноз в соответствии с обеими конечными точками.

Другой редко встречающийся подход выбора прогностической функции может быть основан на регрессионной модели Кокса с постоянными параметрами, получаемой из обучающей выборки, со значениями биомаркера (возможно, трансформированными) в виде ковариаты. Дополнительная возможность основана на решении на определенном отношении правдоподобия (или его монотонном преобразовании), где целевые плотности распределения вероятности предопределены в обучающем множестве для выделения состояний прогнозирования состояний. Затем биомаркер подставляют в некоторую функцию прогнозируемых критериев.

4: Отбор прогностических функций биомаркера, включающих клинические коварианты, на одномерном уровне

Однофакторный относится к использованию только одного биомаркера по отношению к клиническим ковариатам, это может являться многофакторной моделью. Этот подход соответствует исследованию без клинических ковариат, за исключением того, что способы должны позволять вводить релевантную ковариантную информацию.

Способ выбора порога на основе диаграммы рассеяния обеспечивает только ограниченное использование ковариат, например, бинарная ковариата должна быть закодирована цветом на диаграмме. Если анализ основан на определенном регрессионном подходе, то, как правило, облегчается использование ковариат (также большей их част за один раз). Исследование порог на основании модели Кокса, описываемой в пункте 3 выше, позволяет легко вводить ковариаты и, таким образом, приводит к исследованию однофакторного порога с поправкой на ковариаты. Поправку на ковариаты можно проводить в виде ковариат в модели или включением в стратифицированный анализ.

Кроме того, другие виды выбора прогностических функций позволяют вводить ковариаты.

Это не вызывает затруднений для выбора модели Кокса в качестве прогностической функции. Это включает возможность оценки влияния ковариат на уровне взаимодействия, что означает, например, что для различных возрастных групп применяют различные прогностические критерии.

Для типа отношения правдоподобия прогностических функций плотности прогноза следует рассчитывать с включением ковариат. Для этой цели можно использовать методологию многофакторного распознавания изображений или значения биомаркера можно корректировать посредством множественной регрессии ковариат (до оценки плотности).

Для этой цели можно использовать способ CART (Classification and Regression Trees, Breiman et al., Wadsworth, Inc.: New York, 1984), в котором применяют биомаркер (уровень необработанных измерений) плюс клинические ковариаты и в качестве реакции используют измерение клинической пользы. Проводят поиск порогов и выявляют тип дерева решения функции, включающей ковариаты для прогнозирования. Пороги и алгоритмы, выбираемые по CART, часто являются близкими к оптимальным, и их можно комбинировать и унифицировать, рассматривая различные измерения клинической пользы

5: Отбор прогностических функций биомаркера на многомерном уровне

Когда существует несколько кандидатов биомаркера, которые сохраняют свой прогностический потенциал при выборе различных одномерных прогностических функций, затем можно получать дополнительное улучшение посредством комбинаций биомаркеров, т.е. рассматривая многофакторные прогностические функции.

На основе простой модели функции Хевисайда можно оценивать комбинации биомаркеров, например, рассматривая двумерные диаграммы рассеяния значений биомаркера, где указаны оптимальные пороги. Затем комбинацию биомаркеров можно получать, комбинируя различные функции Хевисайда посредством логических операторов "И" и "ИЛИ" с получением улучшенного прогноза.

Для этой цели можно использовать способ CART, в котором применяют многие биомаркеры (уровень необработанных измерений) и измерение клинической пользы в качестве реакции для получения порогов биомаркеров и типа дерева решений функций для прогнозирования. Пороги и алгоритмы, выбираемые по CART, часто являются близкими к оптимальным, и их можно комбинировать и унифицировать, рассматривая различные измерения клинической пользы.

Регрессию Кокса можно применять на различных уровнях. Первый способ заключается в ведении многих биомаркеров в бинарном способе (т.е. на основе функций Хевисайда с определенными порогами). Другая возможность заключается в применении биомаркеров в метрическом способе (после подходящих преобразований) или смеси бинарного и метрического подхода. Ветвящаяся многофакторная прогностическая функция относится к типу Кокса, как описано в пункте 3 выше.

Подход на основе многофакторного отношения правдоподобия является затруднительным для выполнения, но представляет собой другую возможность для многофакторных прогностических функций.

6: Отбор прогностический функций биомаркера, включающих клинические ковариаты, на многомерном уровне

В случае, когда существуют релевантные клинические ковариаты, можно получать дополнительное улучшение комбинацией многих биомаркеров со многими клиническими ковариатами. Выбор различных прогностических функций оценивают в отношении возможностей включения клинических ковариат.

На основе простых логических комбинаций функций Хевисайда для биомаркеров можно вводить дополнительные ковариаты в прогностическую функцию на основе модели логистической регрессии, получаемой в обучающем множестве.

Способ CART и ветвящихся деревьев решений можно легко использовать с дополнительными ковариатами, в котором их включают в прогностический алгоритм.

Во всех прогностических функциях на основе регрессии Кокса можно использовать дополнительные клинические ковариаты. Существует возможность оценки влияния ковариат на уровне взаимодействий, что означает, например, что для разных возрастных групп применяют различные прогностические критерии.

Подход на основе многофакторного отношения правдоподобия непосредственно не расширяют для использования дополнительных ковариат.

Статистические способы анализа гистологических и клинических данных

Количественные гистологические данные из различных экспериментов на животных наносили на график с использованием программного обеспечения Microsoft Excel. Для сравнения данных представляющих интерес выборок применяли t-критерий Стьюдента и различия со значениями p<0,05 считали значимыми. 103 биопсии от 1017 пациентов из группы, включающих XELOX (капецитабин и оксалиплатин), в испытании NO16966 анализировали на экспрессию генов VDV. Значения кПЦР в реальном времени нормализовали на гены домашнего хозяйства и относительно универсального эталонного образца для получения значений дельта-дельта Ct. Затем значение дельта-дельта Ct каждого из 22 генов VDV представляло собой центрированное среднее значение и дисперсию, приведенную к Z-показателю.

Для каждого образца i, для которого анализировали все гены VDV, рассчитывали сигнатурную оценку VDV (VDV_i). VDV_i представляет собой среднее взвешенное z-показателей анализируемых генов VDV и вычисляется по алгоритму

где Z_g,i представляет собой стандартизованный z-показатель значения кПЦР в реальном времени гена g образца i и n в этом случае равно 22. Значение VDV_i предоставляет количественную информацию касательно степени, с которой экспрессия конкретной выборки генов является совместно сверхэкспрессированной или пониженно экспрессированной относительно центрированного среднего.

Для сравнения клинических исходов (PFS и OS) между маркером и/или подгруппами лечения использовали логарифмический ранговый критерий и регрессию Кокса с медианой времени, рассчитываемой анализом Каплана-Мейера. Все статистические тесты являлись двусторонними.

Пример 2. Идентификация генов, экспрессируемых в сосудистом компартменте опухоли, на который направленно воздействует антитело против VEGF

В качестве первого этапа в идентификации прямых биомаркеров in vivo ингибирующей активности пути VEGF, авторы охарактеризовали биологические последствия нейтрализации VEGF на общепринятой модели нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (PNET) на трансгенных мышах. На модели высоко васкуляризированный генетически сконструированной опухоли RIP-TβAg на мышах (GEMM) ранее было продемонстрировано, что обработка моноклональным антителом против VEGF (mAb) обладает противоопухолевой эффективностью и увеличивает общую выживаемость (Singh et al., J. Pathology, 227(4):417-430, 2012). Гистологические анализы опухолей RlP-TβAg на поздней стадии демонстрировали, что обработка антителом против VEGF вызывала быстрое уменьшение плотности микрососудов (MVD), детектируемое через 72 часа после обработки, и оно достигало плато приблизительно 50% на 7 сутки (фиг. 1A слева). Индуцируемое антителом против VEGF сокращение этой фракции сосудистой сети опухоли (далее в настоящем описании, обозначаемый как "VEGF- зависимая сосудистая сеть" или VDV) в значительной степени не восстанавливается или не увеличивается в моменты времени более поздней обработки (фиг. 1A слева). В этих экспериментах плотность сосудов и индекс пролиферации опухоли оценивали гистологически посредством окрашивания MECA-32 (красный слева) и окрашивания Ki67 (красный справа) соответственно. Ядра контрастно окрашивали DAPI (синий). В отличие от наблюдаемых быстрых антиваскулярных эффектов опосредованные противоопухолевые эффекты нейтрализации VEGF развивались более медленно: уменьшение индекса пролиферации опухоли в группе обработки антителом против VEGF по сравнению с группой обработки контролем (антитело против амброзии) не наблюдали на 7 сутки, но они становились выраженными на 14 сутки (фиг. 1A справа), и последовательное снижение опухолевой нагрузки являлось выраженным только на 21 сутки (фиг. 1B). Это позволяет предположить, что на ранних временных точках биологические последствия блокады VEGF на этой модели преимущественно являются специфичными по отношению к сосудам.

Анализ экспрессии на микропанели цельных опухолей от животных, обрабатываемых в течение семи суток антителом против VEGF, демонстрировал, что экспрессия подавляющего большинства генов не изменялась при сравнении с опухолями от животных, обрабатываемых контрольным антителом. Однако небольшая популяция генов реагировала на лечение антителом против VEGF значительным (вычисленное p<0,01) снижением относительного содержания транскрипта (таблица 3). Следует отметить, что авторы не наблюдали соответствующего повышения экспрессии генов, что подтверждает, что изменения экспрессии генов являлись преимущественно вызванными физическим удалением зависящих от VEGF ассоциированных с опухолью эндотелиальных клеток (фиг. 1C и таблицу 3). Как описано в таблице 3 ниже, гены в сигнатуре VDV являлись упорядоченными по степени ответа на антитело против VEGF в испытании IBC на людях. Ортологи человека и мыши наносили на карту с использованием Ensembl Biomart, где "Log2FC" представлял собой кратное log(2) изменение экспрессии гена после лечения авастином по сравнению с состоянием до лечения. 19 парных образцов от пациентов и PNET мышей анализировали на микропанелях Agilent. Небольшое число генов VDV не содержало зонды к человеку на микропанелях Agilent, и их обозначают как NA в конце таблицы. Кроме того, зонды для некоторых генов VDV мышей не были предоставлены на платформе Agilent, для таких генов Log2Fc продемонстрирован из повторного эксперимента на платформе микропанелей для мышей Affymetrix и отмечен звездочкой*.

Характеризация генов в этой выборке, обладающих дифференциальной (сниженной) экспрессией, выявляла активацию для известных специфичных для эндотелия генов (таблица 3), вовлеченных в развитие кровеносных сосудов (таблица 4). Кроме того, среднее кратное изменение экспрессии для такой выборки генов являлось аналогичным изменению, наблюдаемому для пан-сосудистых маркеров CD31 и PLVAP, а также согласовывались со степенью снижения MVD, как измерено иммуногистохимией пан-сосудистого маркера PLVAP (фиг. 1A и 1C).

Количественная ПЦР (кПЦР в реальном времени) цельных опухолей подтверждала результаты на микропанелях, подтверждая, что маркеры, специфичные к опухолевым (инсулин), эпителиальным (E-Cad и Epcam), пан-гемопоэтическим (CD45) или макрофагальным (CD68) клеткам, значительно не изменяются в результате лечения антителом против VEGF. Также подтверждая данный микропанелей, кПЦР в реальном времени демонстрировала, что несмотря на то, что уровни транскриптов VEGF значительно не изменялись, многие известные эндотелиальные маркеры подавлялись в результате лечения (фиг. 1D).

На основании данных микропанелей и кПЦР в реальном времени идентифицировали подгруппу генов, подавление которых в ответ на антитело против VEGF являлось более выраженным, чем генов в сигнатуре (фиг. 1D), подтверждая, что некоторые из генов сигнатуры должны экспрессироваться более избирательно в сосудах, которые являются чувствительными к лечению антителом против VEGF. В отличие от генов со слабым и средним ответом (фиг. 1D, желтые и красные столбики соответственно), эта выборка генов с высоким ответом (фиг. 1D, фиолетовые столбики) включает маркеры поверхности клеток и известные мишени VEGF, касательно ангиогенеза сетчатки (Toro et al., Blood, 116:4025-4033, 2010; Roberts et al., Mol. Cell. Biol., 24:10515-10528, 2004; Testori et al., Blood, 117:2735-2744, 2011; Lobov et al., Blood, 117:6728-6737, 2011). Таким образом, авторы постулировали, что эти поздние гены представляют собой кандидаты проксимальных биомаркеров ингибирующей активности пути VEGF (гены proxVDV) и с большой вероятностью являются мишенями VEGF, которые более избирательно экспрессируются в VEGF-зависимой сосудистой сети опухолей. В своей совокупности эти результаты позволяют предположить, что сигнатура экспрессии генов VDV отражает по меньшей мере два родственных биологических процесса: (i) непосредственное ингибирование последующей передачи сигналов VEGF и (ii) последующую потерю сосудов, выживаемость которых зависит от передачи сигналов VEGF. В соответствии с этой рабочей гипотезой эндотелиальные гены VDV с большой вероятностью включают проксимальные (proxVDV), а также дистальные (distVDV) суррогатные маркеры последующего ингибирования пути передачи сигнала VEGF в ассоциированных с опухолью эндотелиальных клетках.

Таблица 4
Термины генной онтологии, сверхэкспрессируемые в сигнатуре VDV
a. Онтология биологических процессов GOBPID P-значение Отношение шансов Экспер. подсчет Подсчет Размер Термин GO:0001568 1,659e-30 10,57 6,785 51 385 развитие кровеносных сосудов GO:0072358 9,829e-27 11,35 5,111 42 307 развитие сердечно-сосудистой системы GO:0032501 8,002e-20 3,465 78,43 145 4610 процессы на уровне многоклеточных организмов GO:0001525 6,98e-17 9,984 3,435 27 205 ангиогенез GO:0009653 7,513e-14 4,884 10,34 40 698 морфогенез анатомических структур GO:2000145 1,642e-12 6,281 5,146 27 292 регуляция подвижности клеток GO:2000026 3,997e-12 3,818 14,26 45 809 регуляция развития многоклеточных организмов GO:0009888 5,801e-12 3,667 15,58 47 901 развитие ткани GO:0023052 7,066e-12 2,478 70,26 120 3987 передача сигналов

GO:0007166 1,25e-10 2,676 33,91 72 1924 связанный с рецептором клеточной поверхности путь передачи сигнала GO:0032879 1,428e-10 3,256 17,69 48 1004 регуляция локализации GO:0007155 4,022e-10 4,398 8,01 30 486 клеточная адгезия GO:0000902 6,839e-10 3,51 13,06 39 741 морфогенез клеток GO:0051716 1,061e-09 2,433 52,42 92 3224 клеточный ответ на стимул GO:0022603 1,467e-09 4,37 7,419 28 421 регуляция морфогенеза анатомических структур GO:0001570 8,696e-09 15,27 0,8459 10 48 васкулогенез GO:0048869 1,529e-08 3,118 15,44 40 1031 процесс клеточного развития GO:0040013 1,842e-08 8,857 1,745 13 99 отрицательная регуляция локомоции GO:0048468 1,947e-08 2,812 19,23 46 1115 развитие клеток GO:0048731 2,693e-08 2,53 31,52 62 2288 развитие систем GO:0030336 3,752e-08 9,341 1,533 12 87 отрицательная регуляция клеточной миграции GO:0042330 6,307e-08 3,522 9,376 29 532 таксис GO:0009893 1,02e-07 2,496 24,48 52 1389 положительная регуляция метаболического процесса

GO:0051271 1,021e-07 8,436 1,674 12 95 отрицательная регуляция движения компонентов клетки GO:0044093 1,213e-07 2,808 16,41 40 931 положительная регуляция молекулярной функции GO:0007411 3,51e-07 4,087 5,78 21 328 направление роста аксона GO:0048812 3,608e-07 3,374 9,023 27 512 морфогенез проекции нейрона GO:0030182 3,819e-07 2,824 14,52 36 824 дифференцировка нейрона GO:0007154 5,952e-07 2,121 47,13 78 2982 клеточная коммуникация GO:0040017 6,315e-07 5,375 3,155 15 179 положительная регуляция локомоции GO:0016310 6,357e-07 2,528 19,53 43 1108 фосфорилирование GO:0051272 6,783e-07 5,342 3,172 15 180 положительная регуляция движения клеточных компонентов GO:0042221 7,279e-07 2,602 18,43 41 1141 ответ на химические стимулы GO:0048667 9,499e-07 3,275 8,9 26 505 морфогенез клеток, участвующих в дифференцировке нейронов

GO:0050789 1,172e-06 2,17 74,81 105 5270 регуляция биологического процесса GO:0032990 1,185e-06 3,084 10,19 28 578 морфогенез части клетки GO:0006793 1,34e-06 2,38 22,21 46 1260 метаболические процессы фосфора GO:0030030 1,641e-06 2,758 13,48 33 765 организация проекции клетки GO:0010646 1,784e-06 2,444 19,6 42 1112 регуляция клеточной коммуникации GO:0009966 2,756e-06 2,621 15,19 35 923 регуляция передачи сигнала GO:0022008 3,002e-06 2,528 16,53 37 938 нейрогенез GO:0048870 3,186e-06 3,659 6,098 20 382 подвижность клеток GO:0009887 4,196e-06 2,871 10,87 28 617 морфогенез органов GO:0007507 4,451e-06 3,866 5,164 18 293 развитие сердца GO:0045446 4,495e-06 17,35 0,4527 6 26 дифференцировка эндотелиальных клеток GO:0001569 4,818e-06 17,13 0,4582 6 26 формирование рисунка кровеносных сосудов GO:0048584 4,947e-06 2,568 14,86 34 843 положительная регуляция ответа на стимул

GO:0043549 7,131e-06 3,048 8,724 24 495 регуляция киназной активности GO:0045937 7,801e-06 4,308 3,86 15 219 положительная регуляция метаболических процессов фосфата GO:0001936 1,231e-05 8,512 1,093 8 62 регуляция пролиферации эндотелиальный клеток GO:0008284 1,364e-05 3,179 7,289 21 425 положительная регуляция клеточной пролиферации GO:0030198 1,997e-05 5,91 1,898 10 109 организация внеклеточного матрикса GO:0008015 2,281e-05 3,708 4,741 16 269 циркуляция крови GO:0009725 2,406e-05 2,638 11,3 27 641 Ответ на гормональный стимул GO:0048534 2,486e-05 3,138 6,997 20 397 развитие гемопоэтического или лимфоидного органа GO:0019220 2,551e-05 2,954 8,206 22 489 регуляция метаболических процессов фосфата GO:0010595 2,975e-05 11,81 0,6168 6 35 положительная регуляция миграции эндотелиальных клеток

GO:0010810 3,38e-05 7,291 1,251 8 71 регуляция адгезии клетка-субстрат GO:0042698 3,434e-05 6,244 1,621 9 92 цикл овуляции GO:0001934 3,78e-05 4,201 3,401 13 193 положительная регуляция фосфорилирования белка GO:0048010 4,137e-05 11,04 0,6521 6 37 путь передачи сигнала рецептора фактора роста эндотелия сосудов GO:0006950 5,219e-05 1,815 44,18 69 2507 ответ на стресс GO:0032101 5,353e-05 3,606 4,547 15 258 регуляция ответа на внешний стимул GO:0061041 5,373e-05 8,175 0,9869 7 56 регуляция заживления ран GO:0032268 5,635e-05 2,661 9,924 24 594 регуляция метаболического процесса клеточных белков GO:0001945 5,934e-05 25,18 0,2291 4 13 развитие лимфатических сосудов GO:0007162 6,034e-05 8,011 1,005 7 57 отрицательная регуляция клеточной адгезии GO:0045766 6,761e-05 7,853 1,022 7 58 положительная регуляция ангиогенеза GO:0008285 6,909e-05 2,899 7,525 20 427 отрицательная регуляция клеточной пролиферации

GO:0043627 6,995e-05 4,577 2,644 11 150 ответ на эстрогеновый стимул GO:0050900 7,404e-05 3,915 3,63 13 206 миграция лейкоцитов GO:0021700 7,715e-05 4,973 2,221 10 126 созревание в процессе развития GO:0001974 7,921e-05 13,54 0,4582 5 26 ремоделирование кровеносных сосудов GO:0032835 7,921e-05 13,54 0,4582 5 26 развитие гломерулы GO:0032270 8,472e-05 2,943 7,032 19 399 положительная регуляция метаболического процесса клеточных белков GO:0035556 9,397e-05 1,921 29,33 50 1664 внутриклеточная передача сигнала GO:0001932 9,729e-05 3,013 6,515 18 391 регуляция фосфорилирования белка GO:0042060 9,976e-05 2,741 8,357 21 492 заживление ран GO:0016337 0,0001106 3,214 5,41 16 307 адгезия клетка-клетка GO:0071363 0,0001128 5,282 1,886 9 107 клеточный ответ на стимул фактором роста GO:0010628 0,0001161 2,276 14,47 30 821 положительная регуляция экспрессии гена

GO:0050790 0,0001167 2,351 13,11 28 783 регуляция каталитической активности GO:0051093 0,0001208 7,078 1,117 7 67 негативная регуляция процесса развития GO:0045165 0,0001249 4,267 2,82 11 160 коммитирование клетки GO:0007220 0,0001449 18,88 0,282 4 16 процессинг рецептора Notch GO:0051345 0,000164 2,876 6,785 18 385 положительная регуляция активности гидролиза GO:0018212 0,0001647 4,503 2,432 10 138 модификация пептидил-тирозин GO:0070887 0,0001692 2,072 19,16 36 1087 клеточный ответ на химический стимул GO:0001886 0,0001795 42,33 0,1234 3 7 морфогенез эндотелиальных клеток GO:0001541 0,0001858 8,144 0,8459 6 48 развитие овариального фолликула GO:0010557 0,0002096 2,164 15,68 31 890 положительная регуляция процесса биосинтеза макромолекул GO:0043086 0,0002104 2,728 7,543 19 428 отрицательная регуляция каталитической активности

GO:0030195 0,0002225 10,52 0,564 5 32 отрицательная регуляция коагуляции крови GO:0034446 0,0002369 16,18 0,3172 4 18 зависимое от адгезии к субстрату распластывание клеток GO:0006897 0,0002547 3,098 5,234 15 297 эндоцитоз GO:0050679 0,0002688 5,27 1,674 8 95 положительная регуляция пролиферация эндотелиальных клеток GO:0030168 0,0002748 3,396 4,142 13 235 регуляция активации тромбоцитов GO:0065008 0,0002799 1,783 34,8 55 2016 регуляция биологического качества GO:0070168 0,0002835 33,86 0,141 3 8 отрицательная регуляция развития биоминеральной ткани GO:0051128 0,0002838 2,469 9,684 22 574 регуляция организации клеточного компонента GO:0007178 0,0002866 6,079 1,281 7 75 путь передачи сигнала трансмембранного рецепторного белка серин/треонинкиназы

GO:0090101 0,0002906 7,434 0,9164 6 52 отрицательная регуляция путь передачи сигнала трансмембранного рецепторного белка серин/треонинкиназы GO:0045596 0,0002939 3,054 5,305 15 301 отрицательная регуляция клеточной дифференцировки GO:0042246 0,0002987 9,796 0,5992 5 34 регенерация ткани GO:0002682 0,0003018 2,271 12,44 26 706 регуляция процесса иммунной системы GO:0070482 0,0003078 3,56 3,648 12 207 ответ на уровень кислорода GO:0001300 0,0003093 бесконечность 0,03525 2 2 хронологическое старение клетки GO:0007521 0,0003093 бесконечность 0,03525 2 2 определение пути мышечной клетки GO:0048522 0,0003187 1,841 30,24 49 1922 положительная регуляция клеточного процесса GO:0050818 0,000323 7,275 0,934 6 53 регуляция коагуляции GO:0045860 0,0003382 3,01 5,375 15 305 положительная регуляция активности протеинкиназы GO:0007599 0,0003383 2,549 8,477 20 481 гемостаз

GO:0001933 0,0003581 7,123 0,9517 6 54 отрицательная регуляция фосфорилирования белка GO:0034329 0,0003606 4,054 2,679 10 152 сборка межклеточных контактов GO:0014706 0,0003664 3,487 3,719 12 211 развитие поперечнополосатой мышечной ткани GO:0035239 0,0003664 3,487 3,719 12 211 морфогенез трубочек GO:0071841 0,0003674 1,663 49,66 72 2818 организация компонентов клеток или биогенез на клеточном уровне GO:0030509 0,0003759 5,797 1,339 7 76 путь передачи сигнала BMP GO:0051384 0,000388 4,418 2,221 9 126 ответ на стимулы глюкокортикоидом GO:0008354 0,0004197 28,22 0,1586 3 9 миграция половых клеток GO:0022617 0,0004197 28,22 0,1586 3 9 дазорганизация внеклеточного матрикса GO:0045601 0,0004197 28,22 0,1586 3 9 регуляция дифференцировки эндотелиальных клеток GO:0051918 0,0004197 28,22 0,1586 3 9 отрицательная регуляция фибринолиза

GO:0060627 0,0004433 3,942 2,749 10 156 регуляция опосредованного везикулами транспорта GO:0009968 0,0004471 2,717 6,742 17 391 отрицательная регуляция передачи сигнала GO:0048732 0,0004527 3,401 3,807 12 216 развитие желез GO:0002009 0,0004607 3,205 4,371 13 248 морфогенез эпителия GO:0051130 0,0004695 2,8 6,151 16 349 положительная регуляция организации компонентов клетки GO:0002576 0,0004767 5,554 1,392 7 79 дегрануляция тромбоцитов GO:0002064 0,0004815 6,702 1,005 6 57 развитие эпителиальных клеток GO:0017015 0,0004815 6,702 1,005 6 57 регуляция пути передачи сигнала рецептора трансформирующего фактора роста бета GO:0030855 0,0005169 4,232 2,308 9 136 дифференцировка эпителиальных клеток GO:0009612 0,0005305 4,723 1,85 8 105 ответ на механический стимул GO:0048762 0,0005305 4,723 1,85 8 105 дифференцировка мезенхимальных клеток

GO:0050730 0,0005305 4,723 1,85 8 105 регуляция фосфорилирования пептидила-тирозина GO:0061061 0,0005315 2,766 6,221 16 353 развитие мышечной структуры GO:0030335 0,0005443 4,201 2,325 9 135 положительная регуляция клеточной миграции GO:0002274 0,000555 5,403 1,427 7 81 активация лейкоцитов миелоидного ряда GO:0001503 0,0005782 3,302 3,912 12 222 окостенение GO:0006936 0,0005782 3,302 3,912 12 222 мышечное сокращение GO:0048660 0,0005806 6,448 1,04 6 59 регуляция пролиферации гладкомышечных клеток GO:0008585 0,0005979 5,331 1,445 7 82 развитие яичника GO:0014910 0,0006398 11,92 0,4053 4 23 регуляция миграции гладкомышечных клеток GO:2000379 0,0006398 11,92 0,4053 4 23 положительная регуляция метаболического процесса активных форм кислорода GO:0019538 0,0006644 1,598 56,89 79 3228 метаболический процесс белков

GO:0071900 0,0006835 2,921 5,146 14 292 регуляция серин/треонинкиназной активности белка GO:0051347 0,0006995 2,793 5,763 15 327 положительная регуляция трансферазной активности GO:0016044 0,0007038 2,34 9,658 21 548 организация клеточной мембраны GO:0051704 0,0007045 2,023 16,09 30 913 взаимодействие между организмами GO:0009790 0,0007198 2,202 11,75 24 667 развитие эмбриона GO:0033002 0,0007424 5,124 1,498 7 85 пролиферация мышечных клеток GO:0045944 0,0007803 2,432 8,389 19 476 положительная регуляция транскрипции из промотора РНК-полимеразы II GO:0032496 0,0007913 3,639 2,961 10 168 ответ на липополисахарид GO:0001775 0,0007992 2,571 7,103 17 419 активация клетки GO:0001953 0,0008032 21,16 0,1939 3 11 Отрицательная регуляция адгезии клетка-матрикс GO:0017187 0,0008032 21,16 0,1939 3 11 карбоксилирование пептидил-глутаминовой кислоты

GO:0080090 0,0008098 1,558 67,27 90 3817 регуляция первичного метаболического процесса GO:0050673 0,0008897 4,954 1,543 7 90 пролиферация эпителиальных клеток GO:0010757 0,0009171 112,4 0,05287 2 3 отрицательная регуляция активации плазминогена GO:0001819 0,0009233 3,881 2,503 9 142 положительная регуляция продукции цитокинов GO:0031328 0,0009347 1,962 17,13 31 972 положительная регуляция клеточных процессов биосинтеза GO:0008360 0,000975 5,79 1,146 6 65 регуляция формы клетки GO:0030099 0,0009911 3,526 3,049 10 173 дифференцировка миелоидных клеток

b. Онтология клеточного компонента GOCCID P-значение Отношение шансов Экспер. подсчет Подсчет Размер Термин GO:0044421 6,134e-11 6,593 3,923 22 252 часть внеклеточной области GO:0005581 1,2e-08 10,43 1,384 12 81 коллаген GO:0005615 6,927e-08 3,082 12,87 35 753 внеклеточное пространство GO:0005886 2,337e-07 2,486 24,72 51 1707 плазматическая мембрана

GO:0044459 3,383e-07 2,294 28,98 57 1748 часть плазматической мембраны GO:0005604 3,837e-07 11,44 0,9494 9 57 базальная мембрана GO:0030141 7,723e-06 4,297 3,846 15 225 хранящаяся секреторная гранула GO:0005887 1,712e-05 2,235 19,92 40 1174 интегральный компонент плазматической мембраны GO:0005796 5,637e-05 14,64 0,4273 5 25 просвет в аппарате Гольжди GO:0009897 6,485e-05 5,071 2,171 10 127 внешняя сторона плазматической мембраны GO:0005587 9,504e-05 58,16 0,1026 3 6 коллаген типа IV GO:0031093 0,0001243 8,805 0,7862 6 46 просвет альфа-гранулы тромбоцита GO:0005605 0,0001291 19,45 0,2735 4 16 базальная пластина GO:0005606 0,0001642 43,62 0,1196 3 7 комплекс ламинин-1 GO:0060205 0,0001778 8,189 0,8375 6 49 просвет везикулы связанной с цитоплазматической мембраной GO:0045121 0,0004315 3,947 2,735 10 160 мембранный рафт GO:0005788 0,0005969 4,621 1,88 8 110 просвет эндоплазматического ретикулума GO:0005912 0,0006938 3,697 2,906 10 170 адгезионные контакты GO:0043259 0,0008633 115,9 0,05128 2 3 комплекс ламинин-10 GO:0070022 0,0008633 115,9 0,05128 2 3 комплекс рецептора трансформирующего фактора роста бета

GO:0005578 0,0009301 3,548 3,018 10 191 белковый внеклеточный матрикс

с. Онтология молекулярных функций GOMFID P-значение Отношение шансов Экспер. подсчет Подсчет Размер Термин GO:0005201 4,706e-11 13,3 1,329 14 80 структурный компонент внеклеточного матрикса GO:0005021 5,369e-10 182,3 0,1329 6 8 активность рецептора, активируемого фактором роста эндотелия сосудов GO:0005509 1,059e-08 3,583 10,28 32 619 связывание ионов кальция GO:0005178 3,02e-08 10,98 1,213 11 73 связывание интегрина GO:0019199 1,52e-07 9,187 1,412 11 85 активность трансмембранной рецепторной протеинкиназы GO:0050431 5,162e-07 50,39 0,1827 5 11 связывание трансформирующего фактора роста бета GO:0060089 2,742e-06 2,354 21,36 44 1286 активность молекулярных трансдукторов GO:0005518 8,458e-06 11,21 0,7476 7 45 связывание коллагена

GO:0038023 6,846e-05 2,287 15,45 32 930 активность рецептора передачи сигнала GO:0017154 8,724e-05 59,96 0,09968 3 6 активность рецептора семафорина GO:0005024 0,000149 18,52 0,2824 4 17 активность рецептора, активируемого трансформирующим фактором роста бета GO:0008289 0,0001585 2,793 7,376 19 444 связывание липидов GO:0030246 0,0001911 2,937 6,263 17 377 связывание углеводов GO:0005539 0,0002787 4,192 2,592 10 156 связывание гликозаминогликанов GO:0019899 0,0003593 2,176 14 28 843 связывание ферментов GO:0001871 0,0005776 3,797 2,841 10 171 связывание с определенной структурой GO:0005520 0,0006073 12,03 0,3987 4 24 связывание инсулиноподобного фактора роста GO:0048407 0,0006767 22,48 0,1827 3 11 связывание тромбоцитарного фактора роста

GO:0019834 0,0008154 119,4 0,04984 2 3 ингибирующая активность фосфолипазы A2

Пример 3. Реакции сосудов на блокирование пути передачи сигнала VEGF являются консервативными во многих моделях опухоли

Реакции VDV на блокирование пути передачи сигналов VEGF являются специфичными для стромы и консервативными во многих моделях опухоли

Авторы проводили попытки определить, можно ли детектировать транскрипционную сигнатуру VDV, идентифицированную на модели PNET на поздней стадии на мышах, на других моделях опухоли.

Сначала авторы анализировали реакции цельной опухоли на обработку антителом против VEGF в образцах из модели опухоли устанавливаемой (400 мм³) подкожно карциноме молочной железы человека (MDA-MB-231). Несмотря на то, что анализом неконтролируемой экспрессии генов не удалось установить различие между образцами, обрабатываемыми антителом против VEGF и контролем, краткосрочная обработка (т.е. 24 часа) антителом против VEGF являлась достаточной для индукции значительного смещения экспрессии большей части генов VDV относительно всех других генов (p<0,0001, фиг. 2A, верхняя панель). В соответствии с гипотезой, что гены VDV являются специфичными для эндотелия, изменения экспрессии в этих генах детектировали только посредством зондов на микропанелях для мышей, но не на микропанелях для человека, соответствующие различию между стромальными и опухолевыми клетками (фиг. 2A). Также в соответствии с данными от GEMM RIP-TβAg обработка опухолей подкожного ксенотрансплантата рака молочной железы MDA-MB231 антителом против VEGF индуцировала резкое снижение экспрессии генов-кандидатов proxVDV относительно пан-сосудистых маркеров и других генов VDV.

Авторы обнаружили, что эффекты длительной обработки антителом против VEGF на третьей модели ортотопической внутричерепной глиобластомы U87 также приводили к профилю сниженной экспрессии генов VDV при единственной детекции посредством специфичных к мышам зондов и при более заметном снижении экспрессии генов кандидатов proxVDV (фиг. 2B). Сравнительные профили VDV в ответ на антитело против VEGF также соответственно наблюдали на многих тестируемых моделях ксенотрансплантата человека и опухолях на мышах, обрабатываемых антителом против VEGF.

Таким образом, несмотря на модель опухоли и участок имплантации и независимо от продолжительности обработки антителом сигнатура VDV (состоящая из генов proxVDV и distVDV) обеспечивает возможность соответствующей детекции изменений экспрессии генов, которые отражают последующие биологические последствия в сосудах ингибирования пути VEGF на образцах мРНК цельной опухоли.

Передача сигнала VEGF индуцирует экспрессию генов VDV

Затем авторы оценивали степень, при которой стимуляция VEGF путем соответственного повышения экспрессии генов VDV эндотелия может служить маркером образования незрелых новообразованных сосудов в двух различных патологических состояниях: заживление ран и повышенный опухолевый ангиогенез в ответ на блокирование пути передачи сигнала Dll4/Notch1.

В анализе повреждение кожи мыши in vivo местное добавление рекомбинантого VEGF (rVEGF) в течение 12 часов повышало экспрессию большинства генов VDV в участке повреждения кожи, при этом обработка антителом против VEGF приводила к ожидаемому противоположному эффекту (фиг. 2C). В соответствии с ответом, наблюдаемым в опухолях, эффекты блокады VEGF и местного VEGF являлись наиболее заметными в генах-кандидатах proxVDV.

Следствия индукции неоваскуляризации через ингибирование пути передачи сигнала Dll4/Notch1 оценивали путем обработки мышей, несущих опухоль MDA-MB-231, антителом против Dll4, антителом против VEGF или контрольным антителом против амброзии в течение 48 часов. Путь Dll4/Notch1 увеличивает непродуктивный ангиогенез частично посредством усиления передачи сигнала VEGF (Jakobsson et al., Biochem Soc Trans., 37:1233-1236, 2009; Ridgway et al., Nature, 444:1083-1087, 2006; Jakobsson et al., Nat. Cell Biol., 12(10):943-953, 2010). Гистологический анализ, как и ожидалось, выявлял, что обработка антителом против VEGF индуцировала сокращение сосудов сосудистой сети опухоли, тогда как для опухолей, обрабатываемых антителом против Dll4, демонстрировали повышенную MVD по сравнению с контролями (фиг. 2D слева). Экспрессия генов VDV изменялась соответственно, снижаясь при обработке антителом против VEGF и повышаясь в ответ на блокаду Dll4 (фиг. 2D справа). В этом случае так же, как наблюдали на других моделях, изменение экспрессии кандидатов-генов proxVDV является более выраженным по сравнению с другими генами VDV.

В совокупности эти данные позволяют предположить, что большая часть генов VDV экспрессируется в стимулируемых VEGF новообразованных сосудах, и что их совместная экспрессия с большой вероятностью отражает биологическую активность VEGF, а также относительную плотность VEGF-зависимой сосудистой сети.

Следует отметить, что транскрипционные эффекты активации пути VEGF ранее исследовали как в системах in vitro, так и в системах in vivo. Однако касающиеся транскрипции последствия стимуляции rVEGF в эндотелиальных клетках in vitro не предоставляют достаточной информации для определения, является ли фактически ген истинной мишенью VEGF in vivo. Фактически, авторы в различных условиях выявили, что стимуляция rVEGF HUVEC in vitro не индуцирует транскрипции большей части генов proxVDV, которые авторы идентифицировали (фиг. 3). Такое несоответствие не является удивительным, принимая во внимание системную роль сосудистой сети как интегратора многих стимулов, включая кровоток и механические силы, и что ответы VEGF являются дозозависимыми, а также зависят от условий.

С другой стороны, некоторые из генов, идентифицированных в настоящем описании (включая ESM1), а также гены, которые авторы не идентифицировали как вероятные мишени (включая наряду с другими Pcdh17, EFID3, PRDM1 и THBD см. фиг. 3), достоверно активируются стимуляцией VEGF in vitro. Таким образом, список генов proxVDV, приведенный в настоящем описании, вряд ли является исчерпывающим, и в настоящее время авторы проводят интеграцию массивов данных in vivo и in vitro для идентификации дополнительных мишеней VEGF in vivo.

Пример 4. Гены proxVDV представляют собой проксимальные маркеры in vivo биологической активности опосредованной VEGF/VEGFR-2

Данные гибридизации in situ (ISH) указывают на то, что Esm1 высоко экспрессируется в значительной части сосудов из ксенотрансплантатных опухолей толстой кишки HM7, при этом является практически недектируемым в сосудах из опухолей, обрабатываемых антителом против VEGF (фиг. 4A-4C). Это соответствует тому, что Esm1 является истинным геном proxVDV. Однако поскольку ESM1 регулируется другими стимулами наряду с VEGF (Scherpereel et al., Crit. Care Med., 34(2):532-537, 2006) и вследствие того, что ESM1 также может иногда экспрессироваться в опухолевых клетках, авторы хотели проверить дополнительные гены-кандидаты proxVDV как совокупное и более специфичное средство для оценки in vivo биологической активности последующего пути передачи сигнала VEGF в ответ на утвержденные FDA ингибиторы VEGF/VEGFR-2. Таким образом, в этих экспериментах мышей, несущих установленные опухоли MDA-MB-231, обрабатывали контрольным mAb, mAb против VEGF (в качестве заместителя бевацизумаба), сунитинибом (Sutent®; Escudier, Expert Rev. Anticancer Ther., 10(3):305-317, 2010), низкомолекулярным TKI, который направленно воздействует на VEGFR-2 в числе прочих RTK, или акситинибом (Kindler et al., Lancet Oncol., 12(3):256-262, 2011; Grunwald et al., Onco. Targets Ther., 5:111-117, 2012) более специфическим ингибитором VEGFR-2. Затем, собирали опухоли через 8, 16 или 72 часа после обработки для анализов (фиг. 5A верхняя панель). В соответствии с предыдущими наблюдениями все три ингибитора индуцировали значительное снижение MVD в опухолях, собираемых через 72 часа после обработки (фиг. 4D). Касательно уровня экспрессия генов авторы выявили, что во всех случаях для генов proxVDV демонстрировали более выраженное подавление экспрессии, чем наблюдаемое для пан-сосудистых маркеров Cd31 и Plvap (фиг. 5A). Следует отметить, что на экспрессию Vegfa и несосудистых маркеров E-cad (эпителиального) и Cd45 (гемопоэтического) не оказывали заметного влияния какие-либо тестируемые ингибиторы пути VEGF (фиг. 4E), подтверждая, что изменения экспрессии генов proxVDV, вероятнее всего, являются "целевыми" и специфическими для эндотелия. Через 72 часа сунитиниб, по-видимому, является наиболее сильным ингибитором пути VEGF (фиг. 5A).

Динамика транскрипционных эффектов являлась различной при обработке низкомолекулярным ингибитором и антителом против VEGF. Через 8 часов после обработки сунитинибом или акситинибом не индуцировались значительные изменения экспрессии генов через 8 часов. Только через 16 часов после обработки наблюдали эффекты двух SMI в отношении видимого подавления экспрессии генов proxVDV, и этот эффект повышался через 72 часа после обработки (фиг. 5A). В противоположность этому, через 8 часов после дозирования подавление экспрессии генов proxVDV (но не distVDV) mAb против VEGF (интраперитонеальное введение) являлось выраженным, достигая своего пика через 16 часов после обработки.

Для подтверждения, регулируется ли фактически эта выборка генов proxVDV посредством передачи сигнала VEGF в ассоциированных с опухолью эндотелиальных клетках (TAEC), авторы обрабатывали животных, несущих опухоль MDA-MB-231-GFP, антителом против VEGF или контрольным антителом, а затем выделяли TAEC (Cd31+, Cd45-, GFP-) активируемой флуоресценцией сортировкой клеток (FACS) и сравнивали экспрессию гена ex vivo между двумя различными группами обработки. Авторы обнаружили, что все тестируемые пан-сосудистые маркеры и гены proxVDV в большом количестве содержались в эндотелиальных клетках по сравнению с другими популяциями сортированных клеток (фиг. 6). Гены proxVDV Prnd, Esm1, Nid2, Kcne3, Apj, Apln и Mest соответственно подавлялись в клетках TAEC, выделяемых у животных, которых обрабатывали антителом против VEGF, относительно контролей, тогда как другие гены VDV, такие как Cd31, Plvap, Ets-1 и Hlx не подавлялись (фиг. 5B). Эти данные подтверждают, что Prnd, Esm1, Nid2, Kcne3, Apln, Apj и Mest представляют собой проксимальные и чувствительные биомаркеры биологической активности VEGF и представляют собой кандидатов-репортеров для непосредственного ингибирования пути в ассоциированных с опухолью эндотелиальных клетках in vivo.

Пример 5. Транскрипционные эффекты в сосудах в ответ на блокаду пути передачи сигналов VEGF являются консервативными в опухолях мышей и человека

Для тестирования, являются ли консервативными реакции на нейтрализацию VEGF, которые авторы идентифицировали на моделях на мышах, в сосудистой сети опухоли человека, авторы исследовали эффект блокады VEGF на экспрессию сигнатуры VDV в биопсиях опухолей от пациентов, получавших лечение бевацизумабом (Avastin®). В настоящем описании авторы воспользовались преимуществом опубликованных данных микропанелей из подобранных парных биопсий до лечения и на 21 сутки лечения от 19 пациентов с воспалительным раком молочной железы, получавших лечение одной дозой бевацизумаба в качестве единственного лекарственного средства (Wedam et al., Journal of Clin. Oncology., 24:769-777, 2006). Хотя общепринятыми биоинформатическими анализами предварительно не удалось установить различие в изменениях экспрессии наиболее специфических для сосудов генов в ответ на лечение бевацизумабом в этих биопсиях (Yang et al., Clin Cancer Res., 14:5893-5899, 2008), сфокусированные анализы экспрессии ортологов человека выборки генов VDV выявляли явное снижение экспрессии транскриптов VDV в клинических образцах после лечения бевацизумабом по сравнению с биопсиями до лечения (фиг. 7). Как и в моделях опухолей на мышах авторы наблюдали, что экспрессия некоторых генов proxVDV, таких как ESM1, NID2, PRND, KCNE3 и MEST, снижалась более заметно после обработки, направленной на VEGF. Таким образом выборка генов VDV, идентифицированная авторами на доклинических моделях, обеспечивает детекцию эволюционно консервативной реакции сосудов на ингибирование пути передачи сигнала VEGF в клинических образцах опухоли.

Пример 6. Уровни экспрессии генов VDV в образцах колоректального рака человека до лечения коррелируют с клиническими реакциями в ответ на бевацизумаб

Данные авторов свидетельствуют о том, что сосуды опухолей человека с высоким содержание генов VDV являются исключительно чувствительными к ингибированию передачи сигнала VEGF. В дальнейшем авторы тестировали гипотезу, что по относительному высокому содержанию этих маркеров в образцах опухоли до лечения можно фактически прогнозировать восприимчивость к терапии антителом против VEGF.

Ранее было показано, что бевацизумаб в комбинации с химиотерапией увеличивает выживаемость без прогрессирования (PFS) и общую выживаемость (OS) у пациентов с метастатической колоректальной карциномой (CRC) (Hurwitz et al., N. Engl. J. Med., 350:2335-2342, 2004). NO16966 представляло собой испытание первой линии метастатической CRC, где пациенты получали химиотерапию на основе оксалиплатина (XELOX или FOLFOX-4) в комбинации с плацебо или бевацизумабом, введение бевацизумаба в химиотерапию в этом конкретном исследовании значительно улучшало первичную конечную точку PFS, несмотря на то, что различия OS (вторичная конечная точка) не являлись статистически значимыми (Saltz et al., Journal of Clin. Oncology., 26:2013-2019, 2008). Для тестирования, может ли экспрессия генов VDV коррелировать с клиническими исходами, авторы анализировали уровни экспрессии генов VDV в доступных архивных опухолевых тканях до лечения у 103 пациентов (субпопуляция с доступным биомаркером), которых включали в группы, включающие XELOX. Вследствие ограниченного качества и количества РНК из этих клинических образцов экспрессию генов анализировали в ранее сконструированном и валидированном чипе Fluidigm для "ангиогенеза" на основании кПЦР в реальном времени (фиг. 8B), который содержал 4 различных гена домашнего хозяйства (для нормализации экспрессии генов), VEGF (в качестве контроля) и 22 чувствительных проксимальных и дистальных гена VDV, включающих: (i) пан-сосудистые маркеры, такие как CD31, CD34 и VE-CADH в качестве показателя MVD; (ii) ключевые компоненты пути VEGF и гены proxVDV, включая VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, EPHRINB2, NRP, ESM1, NID2, COL4a2 и LAMA4a, и (iii) дополнительные гены VDV, которые являются компонентами эндотелиального пути передачи сигнала и потенциальными модуляторами биологии VDV, включая DLL-4, NOTCH1, ALK1 и EGFL7 (см. фиг. 9A для валидации этой компактной сигнатуры из 22 генов VDV).

На фигуре 8A представлен анализ Каплана-Мейера OS и PFS у 103 пациентов из испытания NO16966, рассматриваемого в исследовании. У этих пациентов добавление бевацизумаба к химиотерапии обеспечивало статистически значимое благоприятное действие в отношении PFS (HR, 0,59; 95% Cl, от 0,37 до 0,93, p=0,024) и OS (HR, 0,45; 95% Cl, от 0,23 до 0,85, p=0,015). Вследствие того, что предварительные эксперименты на большей части образцов рака толстого кишечника указывали на то, что экспрессия этих 22 генов VDV значительно коррелирует (фиг. 8C), авторы решили использовать средний уровень экспрессии индивидуального гена или балл средней экспрессии подгруппы из 22 генов VDV в качестве основы для классификации образцов CRC как "высокий" или "низкий" в каждом случае (фиг. 8B). Затем авторы тестировали корреляцию между клиническими исходами и "высокой" или "низкой" экспрессией генов до лечения. Как ранее описано, стратификация когорт лечения только по уровням мРНК VEGF до лечения не демонстрирует дифференциальных эффектов на клинические исходы у пациентов, получавших лечение бевацизумабом (фиг. 9B). Кроме того, для пациентов, получавших лечение бевацизумабом, которых классифицировали на "высокие" и "низкие" подгруппы по уровням экспрессии одного гена distVDV (CD31), не выявляли различий в PFS, хотя существовала тенденция к благоприятному действию в отношении OS (фиг. 9C). В любом случае для зависимости VEGF или CD31 и лечения не выявляли какого-либо прогностического эффекта. В частности, когда ту же популяцию пациентов стратифицировали на популяции с "высоким VDV" в сравнении с "низким VDV" (фиг. 8D), величина эффекта и значимость значительно изменялись по сравнению с исходным анализом: у пациентов с "низким VDV" (точечные линии на фиг. 8D) сочетание бевацизумаба и химиотерапии по сравнению с одной химиотерапией приводило к умеренному увеличению PFS (HR, 0,88; 95% Cl, от 0,47 до 1,62, p=0,67) и OS (HR, 0,58; 95% Cl, от 0,25 до 1,33, p=0,2). В противоположность этому у пациентов с "высоким VDV" (фиг. 8D сплошные линии) добавление бевацизумаба к химиотерапии в сравнении с одной химиотерапий обеспечивало заметное и достоверное благоприятное действие в отношении PFS (HR, 0,36; 95% Cl, от 0,17 до 0,77, p=0,0079) и OS (HR, 0,31; 95% Cl, от 0,11 до 0,93; p=0,036). Для зависимости между лечением и статусом маркера демонстрируют значительный прогностический эффект в отношении PFS (p=0,036), но, несмотря на наблюдаемое улучшение относительных рисков у пациентов с "высоким VDV", она не является статистически значимой для OS (p=0,37). Таким образом, в этой относительно небольшой выборке из 103 образцов пациентов более высокая экспрессия совокупной выборки генов VDV конкретно коррелирует с улучшенным клиническим исходом, обеспечиваемым добавлением бевацизумаба к химиотерапии, и обладает прогностическим эффектом в отношении PFS.

Пример 7. Мониторинг восприимчивости или чувствительности пациентов к антагонисту VEGF

В этом примере описан анализ для мониторинга, является ли пациент восприимчивым или чувствительным к антагонисту VEGF. При наличии информированного согласия получают образец (например, крови или биопсии ткани) у одного или более пациентов до лечения антагонистом VEGF (например, антителом против VEGF). Хорошо известными способами выделяют ДНК и сыворотку/плазму. Образцы можно объединять или хранить в виде индивидуальных образцов.

Экспрессию по меньшей мере одного гена, указанного в таблице 1 или 2, оценивают измерением мРНК по меньшей мере одного гена или детекцией белка, кодируемого по меньшей мере одним генов, с использованием ELISA, как описано выше, со следующими ниже заменами: (1) цепи гена человека (например, Nid2) на цепи гена мыши (например, Nid2); (2) биотинилированные поликлональные антитела козы против гена человека (например, Nid2) на биотинилированные поликлональные Ab козы против гена мыши (например, Nid2) и (3) 10% FBS на 0,5% BSA. Пациентов, в образцах у которых выявляют по меньшей мере двукратное увеличение экспрессии по меньшей мере одного гена относительно контроля, как описано в настоящем описании, идентифицируют как пациентов, восприимчивых или чувствительных к лечению антагонистами VEGF.

Несмотря на то, что для ясности и понимания указанное выше изобретение подробно описано посредством иллюстраций и примера, описания и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Описания всех патентов, патентных заявок, научных статей и номера доступа GeneBank, цитируемые в настоящем описании, явно полностью включены посредством ссылки для всех целей, как если бы каждый патент, патентную заявку, научную статью и номер доступа GeneBank конкретно и индивидуально включали посредством ссылки. Такие патентные заявки конкретно включают предварительную патентную заявку США №61/586660, зарегистрированную 13 января 2012 года, на основании которой по настоящей заявке испрашивается приоритет.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ определения, с какой вероятностью пациент с раком реагирует на лечение антагонистом VEGF, и способ выбора терапии для конкретного пациента с раком в популяции пациентов с раком, для которых предполагают проведение терапии. Способы включают детекцию экспрессии по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, состоящей из Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM в биологическом образце, получаемом у пациента до какого-либо введения антагониста VEGF пациенту. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы определения, какие пациенты будут отвечать на лечение, и введение эффективных схем лечения для таких пациентов. 2 н. и 34 з.п. ф-лы, 25 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Способ определения, с какой вероятностью пациент с раком реагирует на лечение антагонистом VEGF, где способ включает:

(a) детекцию экспрессии по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, состоящей из Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM в биологическом образце, получаемом у пациента до какого-либо введения антагониста VEGF пациенту, и

(b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере трех генов с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере трех генов,

где по увеличению уровня экспрессии по меньшей мере трех генов в образце у пациента относительно эталонного уровня экспрессии идентифицируют пациента, который с большей вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF.

2. Способ по п. 1, где пациент входит в популяцию пациентов, тестируемых на восприимчивость к антагонисту VEGF, и эталонный уровень экспрессии представляет собой средний уровень экспрессии по меньшей мере трех генов в популяции пациентов.

3. Способ по п. 1, где экспрессию по меньшей мере трех генов в биологическом образце, получаемом у пациента, детектируют посредством измерения мРНК.

4. Способ по п. 1, где экспрессию по меньшей мере трех генов в биологическом образце, получаемом у пациента, детектируют посредством измерения уровней белка в плазме.

5. Способ по п. 1, где биологический образец представляет собой опухолевую ткань.

6. Способ по п. 1, где указанный способ включает:

(a) детекцию экспрессии по меньшей мере четырех из указанных генов, выбранных из группы, состоящей из Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM;

(b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере четырех генов,

где увеличение уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов в образце у пациента относительно эталонного уровня экспрессии идентифицирует пациента, который с большей вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF.

7. Способ по п. 1, где антагонист VEGF представляет собой антитело против VEGF.

8. Способ по п. 7, где антитело против VEGF представляет собой бевацизумаб.

9. Способ по п. 1, где пациент страдает ангиогенным нарушением.

10. Способ по п. 9, где пациент страдает злокачественной опухолью, выбранной из группы, состоящей из: колоректального рака, рака молочной железы, рака легких, глиобластомы и их сочетаний.

11. Способ по п. 1, дополнительно включающий (c) выбор антагониста VEGF для лечения указанного пациента, когда в образце у пациента детектируют увеличение уровня экспрессии по меньшей мере трех генов относительно эталонного уровня экспрессии.

12. Способ по п. 11, дополнительно включающий (d) введение антагониста VEGF пациенту.

13. Способ по п. 11 или 12, где указанный антагонист VEGF представляет собой антитело против VEGF.

14. Способ по п. 13, где антитело против VEGF представляет собой бевацизумаб.

15. Способ по п. 1, где увеличение уровня экспрессии по меньшей мере трех генов в образце у пациента относительно эталонного уровня экспрессии определяют по расчету сигнатурной оценки VDV (VDV_i) для образца пациента в соответствии с алгоритмом

где Z_g=_1,i, Z_g=_2,i,… Z_g=_n,i представляют собой стандартизированные z-показатели значений экспрессии каждого гена g, от g=1 до g=n образца i, где n представляет собой общее число генов, для которых определяют уровень экспрессии, и

где VDV_i ниже первого определяемого порогового уровня указывает на понижение относительно эталонного уровня экспрессии, и VDV_i выше второго определяемого порогового значения указывает на повышение относительно эталонного уровня экспрессии.

16. Способ по п. 15, где значения экспрессии для каждого гена g от g=1 до g=n представляют собой значения кПЦР в реальном времени для каждого гена g от g=1 до g=n.

17. Способ по п. 15, где первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -0,5 и второй определяемый пороговый уровень составляет от 0,5 до 4.

18. Способ по п. 17, где первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -1 и второй определяемый пороговый уровень составляет от 1 до 4.

19. Способ по п. 18, где первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -1,5 и второй определяемый пороговый уровень составляет от 1,5 до 4.

20. Способ по п. 19, где первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -2 и второй определяемый пороговый уровень составляет от 2 до 4.

21. Способ выбора терапии для конкретного пациента с раком в популяции пациентов с раком, для которых предполагают проведение терапии, где способ включает:

(a) детекцию экспрессии по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, состоящей из Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM в биологическом образце, получаемом у пациента до какого-либо введения антагониста VEGF пациенту;

(b) сравнение уровня экспрессии по меньшей мере трех генов с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере трех генов,

где по увеличению уровня экспрессии по меньшей мере трех генов в образце у пациента относительно эталонного уровня экспрессии идентифицируют пациента, который с большей вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF, и

(c) выбор антагониста VEGF в качестве терапии, если пациента идентифицируют, как с высокой вероятностью реагирующего на лечение антагонистом VEGF, или

(d) выбор терапии, которая не является антагонистом VEGF, если пациента не идентифицируют, как с высокой вероятностью реагирующего на лечение антагонистом VEGF.

22. Способ по п. 21, где эталонный уровень экспрессии представляет собой средний уровень экспрессии по меньшей мере трех генов в популяции пациентов.

23. Способ по п. 21, где указанный способ включает:

(a) детекцию экспрессии по меньшей мере четырех из указанных генов, выбранных из группы, состоящей из Alk1, CD34, CD105, CD144, Col4a1, Col4a2, Dll4, EFNB2, EGFL7, ESM1, LAMA4, NG2, Nid2, Notch1, NRP1, NRP2, RGS5, Sema3f, TSP1, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и VIM;

(b) сравнение указанного уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов с эталонным уровнем экспрессии по меньшей мере четырех генов,

где по увеличению уровня экспрессии по меньшей мере четырех генов в образце у пациента относительно эталонного уровня экспрессии идентифицируют пациента, который с большей вероятностью реагирует на лечение антагонистом VEGF.

24. Способ по п. 21, где терапия (c) представляет собой средство, выбранное из группы, состоящей из: антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства, цитотоксического средства и их сочетаний.

25. Способ по п. 21, дополнительно включающий: (e) введение эффективного количества антагониста VEGF пациенту, если пациента идентифицируют, как с высокой вероятностью реагирующего на лечение антагонистом VEGF.

26. Способ по п. 25, где антагонист VEGF представляет собой антитело против VEGF.

27. Способ по п. 26, где антитело против VEGF представляет собой бевацизумаб.

28. Способ по п. 27, дополнительно включающий введение эффективного количества по меньшей мере второго средства.

29. Способ по п. 28, где второе средство выбрано из группы, состоящей из: антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства, цитотоксического средства и их сочетаний.

30. Способ по п. 21, где терапия (d) представляет собой средство, выбранное из группы, состоящей из: антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства, цитотоксического средства и их сочетаний.

31. Способ по п. 21, где увеличение уровня экспрессии по меньшей мере трех генов в образце у пациента относительно эталонного уровня экспрессии определяют по расчету сигнатурной оценки VDV (VDV_i) для образца пациента в соответствии с алгоритмом

где Z_g=_1,i, Z_g=_2,i,… Z_g=_n,i представляют собой стандартизированные z-показатели значений экспрессии каждого гена g, от g=1 до g=n образца i, где n представляет собой общее число генов, для которых определяют уровень экспрессии, и

где VDV_i ниже первого определяемого порогового уровня указывает на понижение относительно эталонного уровня экспрессии, и VDV_i выше второго определяемого порогового значения указывает на повышение относительно эталонного уровня экспрессии.

32. Способ по п. 31, где значения экспрессии для каждого гена g от g=1 до g=n представляют собой значения кПЦР в реальном времени для каждого гена g от g=1 до g=n.

33. Способ по п. 31, где первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -0,5 и второй определяемый пороговый уровень составляет от 0,5 до 4.

34. Способ по п. 33, где первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -1 и второй определяемый пороговый уровень составляет от 1 до 4.

35. Способ по п. 34, где первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -1,5 и второй определяемый пороговый уровень составляет от 1,5 до 4.

36. Способ по п. 35, где первый определяемый пороговый уровень составляет от -4 до -2 и второй определяемый пороговый уровень составляет от 2 до 4.