БИОМАРКЕРЫ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С PD-1 И PD-L1 СОСТОЯНИЙ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 G01N33/574 C12Q1/6886 A61P35/00 

Ссылки на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительными заявками на выдачу патентов США с серийным №61/802296, поданной 15 марта 2013 г., с серийным №61/812678, поданной 16 апреля 2013 г., с серийным №61/829236 поданной 30 мая 2013 г., и с серийным №61/883186, поданной 26 сентября 2013 г., содержание которых включено тем самым в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.

Область техники

В настоящем документе представлены биомаркеры для лечения патологических состояний, таких как злокачественное заболевание, и способы использования антагонистов пути PD-L1/PD-1. В частности, представлены биомаркеры для отбора больных и прогнозирования злокачественной опухоли, а также способы терапевтического лечения, изделия промышленного производства и способы их получения, диагностические наборы, способы выявления и способы предложения, связанные с ними.

Уровень техники

Злокачественное заболевание остается одной из наиболее смертельных угроз для здоровья человека. В США каждый год злокачественное заболевание поражает около 1,3 миллиона новых больных, и оно является второй главной причиной смерти после заболевания сердца, что составляет примерно 1 из 4 смертей. Например, злокачественное заболевание легкого является наиболее распространенной формой злокачественного заболевания и основной причиной смерти от злокачественного заболевания среди американских женщин. Также предполагается, что в течение 5 лет злокачественное заболевание может превзойти сердечно-сосудистые заболевания как причина смерти номер один. Причиной большинства таких смертей являются солидные опухоли. Хотя были достигнуты значительные успехи в лечении некоторых злокачественных заболеваний, за последние 20 лет общий 5-летний показатель выживаемости для всех злокачественных заболеваний улучшился только на приблизительно 10%. Злокачественные заболевания или злокачественные опухоли метастазируют и быстро растут неконтролируемым образом, что делает своевременное выявление и лечение крайне сложным.

Несмотря на значительное продвижение в лечении злокачественного заболевания все еще необходимы улучшенные методы лечения.

Все ссылки, цитируемые в настоящем документе, в том числе заявки на выдачу патентов и публикации, включены посредством ссылки во всей их полноте.

Сущность изобретения

Настоящий документ относится к способам идентификации индивидуума с заболеванием или нарушением, который с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, где наличие биомаркера PD-L1 в образце указывает на то, что индивидуум с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, и предоставление рекомендации по поводу того, что индивидуум с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Настоящий документ относится к способам прогнозирования отвечаемости индивидуума с заболеванием или нарушением на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, где наличие биомаркера PD-L1 в образце указывает на то, что индивидуум с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, и предоставление рекомендации по поводу того, что индивидуум будет характеризоваться повышенной вероятностью ответа на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Настоящий документ относится к способам определения вероятности того, что индивидуум с заболеванием или нарушением будет получать пользу от лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, где наличие биомаркера PD-L1 в образце указывает на то, что индивидуум характеризуется повышенной вероятностью получения пользы от лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, и предоставление рекомендации по поводу того, что индивидуум будет характеризоваться повышенной вероятностью получения пользы от лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Настоящий документ относится к способам выбора терапии для индивидуума с заболеванием или нарушением, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума и предоставление рекомендации по поводу того, что выбранная для индивидуума терапия включает лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, на основании наличия биомаркера PD-L1 в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления способы, кроме того, включают введение индивидууму эффективного количества антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1.

Настоящий документ относится к способам лечения заболевания или нарушения у индивидуума, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума и введение индивидууму эффективного количества антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1.

Настоящий документ относится к способам лечения заболевания или нарушения у индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, где лечение основывается на наличии биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума.

Настоящий документ относится к способам предложения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, включающим продвижение среди целевой аудитории применения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, для лечения индивидуум с заболеванием или нарушением на основании наличия биомаркера PD-L1.

Настоящий документ относится к анализам для идентификации индивидуума с заболеванием или нарушением для получения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, и рекомендацию антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, на основании наличия биомаркера PD-L1.

Настоящий документ относится к диагностическим наборам, содержащим один или несколько реагентов для определения наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума с заболеванием или нарушением, где наличие биомаркера PD-L1 означает более высокую вероятность эффективности лечения индивидуума антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, и где отсутствие биомаркера PD-L1 означает меньшую вероятность эффективности лечения индивидуума с заболеванием антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Настоящий документ также относится к изделиям промышленного производства, содержащим упакованные вместе антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, в фармацевтически приемлемом носителе и информационный вкладыш в упаковке, указывающий на то, что антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, предназначен для лечения больного с заболеванием или нарушением на основании экспрессии биомаркера PD-L1. Способы лечения включают в себя любые способы лечения, раскрываемые в настоящем документе. Кроме того, представлены способы изготовления изделия промышленного производства, включающие объединение в упаковке фармацевтической композиции, содержащей антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, и информационного вкладыша в упаковке, указывающего на то, что фармацевтическая композиция предназначена для лечения больного с заболеванием или нарушением на основании экспрессии биомаркера PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов биомаркер PD-L1 выбирают из группы, состоящей из PD-L1, PD-1, PD-L2 и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов биомаркером PD-L1 является связанный с иммунной системой маркер. Согласно некоторым вариантам осуществления связанным с иммунной системой маркером является связанный с Т-клеткой маркер. Согласно некоторым вариантам осуществления связанный с Т-клеткой маркер выбирают из группы, состоящей из CD8A, IFN-g, EOMES, гранзима-А, CXCL9 и каких-либо их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления связанный с иммунной системой маркер выбирают из группы, состоящей из CX3CL1, CD45RO, IDO1, галектина 9, MIC-A, MIC-В, CTLA-4 и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов заболеванием или нарушением является пролиферативное заболевание или нарушение. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов заболеванием или нарушением является связанное с иммунной системой заболевание или нарушение. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов заболеванием или нарушением является злокачественное заболевание. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, почечноклеточного злокачественного заболевания, злокачественного заболевания толстой и прямой кишки, злокачественного заболевания яичника, злокачественного заболевания молочной железы, злокачественного заболевания поджелудочной железы, карциномы желудка, злокачественного заболевания мочевого пузыря, злокачественного заболевания пищевода, мезотелиомы, меланомы, злокачественного заболевания головы и шеи, злокачественного заболевания щитовидной железы, саркомы, злокачественного заболевания предстательной железы, глиобластомы, злокачественного заболевания шейки матки, карциномы вилочковой железы, лейкоза, лимфом, миелом, грибовидных гранулем, злокачественного заболевания клеток Меркеля и других гематологических злокачественных новообразований.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов образец, полученный от индивидуума, выбирают из группы, состоящей из ткани, цельной крови, плазмы, сыворотки крови и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является образец опухолевой ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления образец опухолевой ткани содержит клетки опухоли, инфильтрующиеся в опухоль иммунные клетки, стромальные клетки и какие-либо их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления образец ткани фиксируется в формалине и заливается парафином, архивируется, является свежим или замороженным. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом является цельная кровь. Согласно некоторым вариантам осуществления цельная кровь содержит иммунные клетки, циркулирующие опухолевые клетки и какие-либо их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов образец получают до лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов наличие биомаркера PD-L1 указывает на то, что индивидуум, вероятно, будет получать повышенную клиническую пользу от лечения его антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления повышенная клиническая польза включает относительное повышение одного или нескольких из следующих показателей: общая выживаемость (OS), выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR) и их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов биомаркер PD-L1 отсутствует в образце, если он составляет 0% образца.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов биомаркер PD-L1 присутствует в образце, если он составляет более чем 0% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 1% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 5% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 10% образца.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов биомаркер PD-L1 выявляют в образце с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из FACS, вестерн-блоттинга, ELISA, иммунопреципитации, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, радиоиммуноанализа, дот-блоттинга, иммунологических анализов, HPLC, поверхностного плазмонного резонанса, оптической спектроскопии, масс-спектрометрии, HPLC, qPCR, RT-qPCR, мультиплексной qPCR или RT-qPCR, RNA-Seq, микроматричного анализа, SAGE, метода MassARRAY и FISH, а также их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов биомаркер PD-L1 выявляют в образце с помощью экспрессии белка. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию белка определяют с помощью иммуногистохимии (IHC). Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют с использованием антитела против PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как слабую интенсивность окрашивания с помощью IHC. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как умеренную интенсивность окрашивания с помощью IHC. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как сильную интенсивность окрашивания с помощью IHC. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в опухолевых клетках, инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, стромальных клетках и каких-либо их комбинациях. Согласно некоторым вариантам осуществления окрашиванием является окрашивание мембраны, окрашивание цитоплазмы или их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов отсутствие биомаркера PD-L1 выявляют как отсутствие окрашивания в образце. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов наличие биомаркера PD-L1 выявляют как какое-либо окрашивание в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов биомаркер PD-L1 выявляют в образце с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию нуклеиновой кислоты определяют с использованием qPCR, RT-qPCR, мультиплексной qPCR или RT-qPCR, RNA-Seq, микроматричного анализа, SAGE, метода MassARRAY или FISH. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в опухолевых клетках, инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, стромальных клетках и каких-либо их комбинациях.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, выбирают из группы, состоящей из антагониста, связывающегося с PD-L1, и антагониста, связывающегося с PD-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по лигандному связыванию. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с PD-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с В7-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 и с PD-1, и с В7-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающимся с PD-L1, является антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антителом является моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антителом является человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по лигандному связыванию. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L2. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 и с PD-L1, и с PD-L2.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающимся с PD-1, является антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антителом является моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антителом является человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов дополнительно включается эффективное количество второго терапевтического средства, выбранного из группы, состоящей из цитотоксического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства, радиотерапевтического средства и антиангиогенного средства, а также их комбинаций.

Настоящий документ относится к способам оценивания ответа на лечение индивидуума антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает (а) определение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце, полученном от индивидуума в момент времени при введении или после введения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1; и (b) поддерживание, регулирование или прекращение лечения индивидуума на основании сравнения уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце с эталонными уровнями, при этом изменение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнями является признаком ответа на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Настоящий документ относится к способам наблюдения за ответом индивидуума, получающего лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом указанный способ включает (а) определение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце, полученном от индивидуума в момент времени при введении или после введения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1; и (b) сравнение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце с эталонными уровнями с целью наблюдения за ответом у индивидуумов, получающих лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления эталонные уровни одного или нескольких биомаркеров выбирают из группы, состоящей из (1) уровня одного или нескольких биомаркеров от индивидуума до введения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1; (2) уровня одного или нескольких биомаркеров от эталонной группы; (3) предварительное определение уровня одного или нескольких биомаркеров и (4) уровня одного или нескольких биомаркеров от индивидуума во второй момент времени до первого момента времени.

Согласно некоторым вариантам осуществления изменение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями представляет собой повышение уровней.

Согласно некоторым вариантам осуществления изменение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями представляет собой снижение уровней.

Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько биомаркеров выбирают из группы, состоящей из PD-L1, PD-1, PD-L2 и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из PD-L1, PD-1, PD-L2 и каких-либо их комбинаций, повышаются в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями. Согласно некоторым вариантам осуществления повышение одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из PD-L1, PD-1, PD-L2 и каких-либо их комбинаций, в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями указывает на положительный ответ на лечение.

Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является связанный с иммунной системой маркер. Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является связанный с Т-клеткой маркер.

Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является маркер Т-клеточной активации.

Согласно некоторым вариантам осуществления маркер Т-клеточной активации повышается в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями.

Согласно некоторым вариантам осуществления маркер Т-клеточной активации выбирают из группы, состоящей из CD8, IFN-g, гранзима-А, TNF-a, перфорина и каких-либо их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления повышение маркера Т-клеточной активации, выбранного из группы, состоящей из CD8, IFN-g, гранзима-А, TNF-a, перфорина и каких-либо их комбинаций, в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями указывает на положительный ответ на лечение.

ядерном магнитном резонансе осуществления одним или несколькими биомаркерами является активированная пролиферирующая Т-клетка.

Согласно некоторым вариантам осуществления уровень активированной пролиферирующей Т-клетки повышается в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями.

Согласно некоторым вариантам осуществления активированной пролиферирующей Т-клеткой является CD8+/Ki67+ клетка, CD8+/HLA-DR+/Ki67+ клетка и какие-либо их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является IL-6. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень IL-6 снижается в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение уровня IL-6 в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями указывает на положительный ответ на лечение. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень IL-6 повышается в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями. Согласно некоторым вариантам осуществления повышение уровня IL-6 в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями указывает на отрицательный ответ на лечение.

Согласно некоторым вариантам осуществления биологический образец, полученный от индивидуума, выбирают из группы, состоящей из клетки, ткани, культуры ткани, опухоли, биологической жидкости и их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления биологическую жидкость выбирают из группы, состоящей из плазмы, сыворотки крови, цельной крови, РВМС и их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления тканью является опухолевая ткань. Согласно некоторым вариантам осуществления опухолевую ткань выбирают из группы, состоящей из опухолевых клеток, инфильтрующихся в опухоль клеток, стромальных клеток и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления клеткой является циркулирующая опухолевая клетка (СТС).

Согласно некоторым вариантам осуществления индивидуум страдает от пролиферативного заболевания или нарушения.

Согласно некоторым вариантам осуществления индивидуум страдает от злокачественного заболевания или злокачественного новообразования. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественное заболевание или злокачественное новообразование выбрано из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, почечноклеточного злокачественного заболевания, злокачественного заболевания толстой и прямой кишки, злокачественного заболевания яичника, злокачественного заболевания молочной железы, злокачественного заболевания поджелудочной железы, карциномы желудка, злокачественного заболевания мочевого пузыря, злокачественного заболевания пищевода, мезотелиомы, меланомы, злокачественного заболевания головы и шеи, злокачественного заболевания щитовидной железы, саркомы, злокачественного заболевания предстательной железы, глиобластомы, злокачественного заболевания шейки матки, карциномы вилочковой железы, лейкоза, лимфом, миелом, грибовидных гранулем, злокачественного заболевания клеток Меркеля и других гематологических злокачественных новообразований.

Согласно некоторым вариантам осуществления индивидуум страдает от связанного с иммунной системой заболевания или нарушения.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по лигандному связыванию.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с PD-1. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с В7-1. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 и с PD-1, и с В7-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с PD-L1, является антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антителом является моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антителом является человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по лигандному связыванию.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L2. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 и с PD-L1, и с PD-L2.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с PD-1, является антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антителом является моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антителом является человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Краткое описание чертежей

Файл с патентом или с заявкой на выдачу патента содержит по меньшей мере один графический материал, выполненный в цвете. Копии публикации этого патента или заявки на выдачу патента с цветным графическим материалом(ами) будет предоставлен Ведомством при запросе и оплате необходимого сбора.

На фиг. 1 показан типичный IHC анализ контрольных клеточных образцов. (A) Отрицательное контрольное IHC окрашивание родительских клеток HEK-293; (B) IHC окрашивание клеток HEK-293, трансфицированных рекомбинантным человеческим PD-L1 со слабой интенсивностью окрашивания; (С) IHC окрашивание клеток HEK-293, трансфицированных рекомбинантным человеческим PD-L1, со средней интенсивностью окрашивания; (D) IHC окрашивание клеток HEK-293, трансфицированных рекомбинантным человеческим PD-L1, с сильной интенсивностью окрашивания; (Е) положительное контрольное IHC окрашивание ткани образца плацентарной ткани; (F) положительное контрольное IHC окрашивание ткани образца ткани миндалевидной железы. Все IHC окрашивания выполняли с использованием патентованного антитела против PD-L1.

На фиг. 2 показано типичное положительное по PD-L1 IHC окрашивание образцов опухоли от (А) трижды негативного злокачественного заболевания молочной железы; (В) злокачественной меланомы; (С) NSCLC, аденокарциномы.

На фиг. 3 показана корреляция экспрессии PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках либо с PD ответом, либо с PR7CR ответом на лечение антителом против PD-L1 у больных злокачественным заболеванием. PD = прогрессирующее заболевание; PR = частичный ответ; CR = полный ответ. (А) % PD-L1 + инфильтрующиеся в опухоль иммунные клетки в участке образца опухоли с использованием IHC анализа PD-L1. (В) % PD-L1 + IC в общих иммунных инфильтратах в образце опухоли с использованием IHC анализа PD-L1.

На фиг. 4 показана корреляция экспрессии гена PD-L1 в образцах опухоли либо с PD ответом, либо с PR/CR ответом на лечение антителом PD-L1 у больных злокачественным заболеванием с использованием qPCR анализа PD-L1. PD = прогрессирующее заболевание; PR = частичный ответ; CR = полный ответ.

На фиг. 5 показана корреляция экспрессии гена PD-1 в образцах опухоли либо с PD ответом, либо с PR/CR ответом на лечение антителом PD-L1 у больных злокачественным заболеванием. PD = прогрессирующее заболевание; PR = частичный ответ; CR = полный ответ.

На фиг. 6 показана корреляция экспрессий различных генов иммунного ответа в образцах опухоли либо с PD ответом, либо с PR ответом на лечение антителом PD-L1 у больных злокачественным заболеванием. PD = прогрессирующее заболевание; PR = частичный ответ.

На фиг. 7 показана схема серийных опухолевых биоптатов до/в ходе лечения от больных, получающих лечение антителом против PD-L1. Оценивали парные исходные (которые включают в себя опухолевую ткань либо до лечения, либо архивную) и взятые в ходе лечения опухолевые биоптаты от больных, получающих лечение антителом против PD-L1 (n=26), страдающих от различных симптомов, в том числе от меланомы, почечноклеточной карциномы (RCC), немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), злокачественного заболевания головы и шеи (H&N), злокачественного заболевания толстой и прямой кишки (CRC), злокачественного заболевания желудка и злокачественного заболевание молочной железы.

На фиг. 8 показано, что (а) усиление инфильтрации CD8+ Т-клеток соотносили с повышением экспрессии PD-L1 в образцах опухоли от больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1; и (b) повышение маркеров активации Т-клеток, в том числе гранзима-А, перфорина, IFN-g, TNFa и CD8, после лечения антителом против PD-L1 у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1.

На фиг. 9 кратко описываются изменения экспрессии PD-L1 у больных, принимающих лечение антителом против PD-L1.

На фиг. 10 показана (а) повышенная частота пролиферирующих Т-клеток в крови, идентифицированных как являющиеся CD8+/Ki67+ клетками; и (b) повышенная частота активированных пролиферирующих Т-клеток, идентифицированных как являющиеся CD8+/HLA-DR+/Ki67+ клетками, у больных, получающих лечение антителом против PD-L1.

На фиг. 11 показано, что снижение уровня IL-6 в плазме соотносили с больными, отвечающими на лечение антителом против PD-L1, и что повышение уровня IL-6 в плазме соотносили с больными, у которых заболевание прогрессировало при лечении антителом против PD-L1.

На фиг. 12 показана корреляция экспрессий различных генов иммунного ответа в образцах опухоли либо с PD ответом, либо с PR/CR ответом на лечение антителом PD-L1 у больных злокачественным заболеванием. PD = прогрессирующее заболевание; PR = частичный ответ; CR = полный ответ.

На фиг. 13 показана корреляция экспрессий гена IDO1 в образцах опухоли меланомы или NSCLC либо с PD ответом, либо с PR/CR ответом на лечение антителом PD-L1 у больных злокачественным заболеванием. PD = прогрессирующее заболевание; PR = частичный ответ; CR = полный ответ.

На фиг. 14 показано повышение экспрессии PD-L1 в циркулирующих Т-клетках в крови, собранных от больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1. PD = прогрессирующее заболевание; PR = частичный ответ; CR = полный ответ.

На фиг. 15 показана корреляция экспрессии гена цитотоксических Th1-клеток, IFN-g и маркеров миграции Т-клеток в образцах опухоли либо с PD ответом, либо с PR/CR ответом на лечение антителом PD-L1 у больных злокачественным заболеванием. PD = прогрессирующее заболевание; PR = частичный ответ; CR = полный ответ.

На фиг. 16 повышение маркеров активации Т-клеток у больного меланомой, отвечающего на лечение антителом против PD-L1.

На фиг. 17 показана низкая частота внутриопухолевых Т-клеток и отсутствие активации Т-клеток в маркерах активации Т-клеток у больного меланомой, не отвечающего на лечение антителом против PD-L1.

На фиг. 18 показано временное повышение частоты активированных CD8+/HLA-DR+/Ki-67+ Т-клеток в крови больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1.

На фиг. 19 показаны флуктуации в CD4+/ICOS+ Т-клетках с замедленными повышениями в этой популяции Т-клеток, коррелирующими с ответом, и снижениями, коррелирующими прогрессированием заболевания (возникающим после цикла 3).

На фиг. 20 показано, что адаптивное повышение экспрессии PD-L1 является выраженным у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1.

На фиг. 21 показана корреляция экспрессии CTLA4 с ответом на лечение антителом против PD-L1, тогда как экспрессия фракталкина/CX3CL1 коррелировала с прогрессированием.

На фиг. 22 показана корреляция генных сигнатур, ассоциированных с (Т-эффекторными) клетками TefF, (Т-регуляторными) клетками Treg и Th17-клетками с симптомами шести злокачественных заболеваний.

На фиг. 23 показана тенденция к более высокой генной экспрессии опухоли IL17F у больных, которые не отвечают на лечение антителом PD-L1. R = Больные, отвечающие на лечение; nR = Больные, не отвечающие на лечение.

На фиг. 24 показано, что генная экспрессия опухоли IL-17F выше у больных с поздним ответом на лечение антителом PD-L1.

На фиг. 25 показано временное повышение циркулирующих CD8+/HLA-DR+/Ki67+ клеток у больных, получающих лечение антителом против PD-L1. (а) У больных UBC, (b) у всех больных.

На фиг. 26 показано временное повышение в плазме IL-18 у больных, получающих лечение антителом против PD-L1. Кроме того, исходный МСР-1 в плазме был ниже у больных с частичным ответом/полным ответом (PR/CR) на лечение антителом PD-L1. И IL-18, и МСР-1 также были экспрессированы преимущественно в моноцитах.

На фиг. 27 показано, что опухоли с предварительным лечением от больных, у которых прогрессировало заболевание после лечения антителом против PD-L1, демонстрировали пропорционально более высокую миелоидную генную сигнатуру (IL-8, CCL2 и IL1B) с преимущественной экспрессией в миелоидных клетках (например, моноцитах, дендритных клетка).

На фиг. 28 показана корреляция растворимого PD-L1 в крови больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1.

На фиг. 29 показана связь между экспрессией PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках (IC) и ответом на лечение антителом PD-L1. (а) В NSCLC, (b) во всех опухолях.

На фиг. 30 показана связь между экспрессией PD-L1 в опухолевых клетках и ответом на лечение антителом PD-L1. (а) В NSCLC, (b) во всех опухолях.

Подробное описание изобретения

Определения

Термин «антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1» означает молекулу, которая ингибирует взаимодействие партнера связывания с компонентом сигнального пути PD-L1 с одним или несколькими из его партнеров связывания, с тем, чтобы устранить дисфункцию Т-клеток, возникающую из передачи сигнала в пути передачи сигнала PD-1, с результатом, заключающимся в восстановлении или улучшении Т-клеточной функции. Используемый в настоящем документе термин «антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1» включает в себя антагониста, связывающегося с PD-L1, и антагониста, связывающегося с PD-1, а также молекулы, которые вмешиваются во взаимодействие между PD-L1 и PD-1 (например, слияние PD-L2-Fc).

Термин «антагонисты, связывающиеся с PD-L1» означает молекулу, которая снижает, блокирует, ингибирует, отменяет или затрагивает передачу сигнала, возникающую вследствие взаимодействия PD-L1 с одним или несколькими из его партнеров связывания, таких как PD-1, В7-1. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами связывания. Согласно конкретному аспекту антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 и/или В7-1. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонисты, связывающиеся с PD-L1, включают в себя антитела против PD-L1, их связывающие антиген фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, отменяют или затрагивают передачу сигнала, возникающего вследствие взаимодействия PD-L1 с одним или несколькими из его партнеров связывания, таких как PD-1, В7-1. Согласно одному варианту осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, снижает негативный сигнал, опосредованный или обусловленный белками клеточной поверхности, экспрессированными на Т-лимфоцитах и других клетках, опосредуя передачу сигнала через PD-L1 или PD-1, с тем, чтобы сделать дисфункциональную Т-клетку менее дисфункциональной.

Термин «антагонисты, связывающиеся с PD-1» означает молекулу, которая снижает, блокирует, ингибирует, отменяет или затрагивает передачу сигнала, возникающего вследствие взаимодействия PD-1 с одним или несколькими из его партнеров связывания, таких как PD-L1, PD-L2. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-1 с его партнерами связывания. Согласно конкретному аспекту антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. Например, антагонисты, связывающиеся с PD-1, включают в себя антитела против PD-1, их связывающие антиген фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, отменяют или затрагивают передачу сигнала, возникающего вследствие взаимодействия PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. Согласно одному варианту осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, снижает негативный сигнал, опосредованный или обусловленный белками клеточной поверхности, экспрессированными на Т-лимфоцитах и других клетках, опосредуя передачу сигнала через PD-1 или PD-L1, с тем, чтобы сделать дисфункциональную Т-клетку менее дисфункциональной.

Термины «лиганд программируемой смерти 1» и «PD-L1» в настоящем документе относятся к полипептиду PD-L1 с нативной последовательностью, полипептидным вариантам и фрагментам полипептида с нативной последовательностью и полипептидным вариантам (которые далее определяются в настоящем документе). Полипептид PD-L1, описываемый в настоящем документе, может быть полипептидом, который выделяют из ряда источников, таких как типы человеческой ткани или другой источник, или получают способами рекомбинации или синтеза.

Термин «полипептид PD-L1 с нативной последовательностью» означает полипептид с той же аминокислотной последовательностью, что и соответствующий полипептид PD-L1, полученный из природы.

Термин «вариант полипептида PD-L1» или его вариации означает полипептид PD-L1, как правило, активный полипептид PD-L1, определяемый в настоящем документе и характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к любой из последовательностей полипептида PD-L1 с нативной последовательностью, раскрываемых в настоящем документе. Такие варианты полипептида PD-L1 включают в себя, например, полипептиды PD-L1, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавляют или удаляют на N- или С-конце нативной аминокислотной последовательности. Обычно вариант полипептида PD-L1 будет характеризоваться по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, в качестве альтернативы по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к последовательности полипептида PD-L1 с нативной последовательностью, раскрываемого в настоящем документе. Обычно варианты полипептида PD-L1 имеют в длину по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот, в качестве альтернативы, имеют в длину по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 аминокислот или больше. Необязательно варианты полипептида PD-L1 будут иметь не более чем одну консервативную аминокислотную замену по сравнению с полипептидом PD-L1 с нативной последовательностью, в качестве альтернативы, не более чем 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен по сравнению с полипептидом PD-L1 с нативной последовательностью.

Определяемый в настоящем документе термин «антагонист PD-L1» означает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность и/или функцию, опосредованную PD-L1 с нативной последовательностью. Согласно некоторым вариантам осуществления такой антагонист связывается с PD-L1. Согласно одному варианту осуществления антагонистом является полипептид. Согласно другому варианту осуществления антагонистом является антитело против PD-L1. Согласно другому варианту осуществления антагонистом является низкомолекулярный антагонист.Согласно другому варианту осуществления антагонистом является полинуклеотидный антагонист.

Используемые взаимозаменяемо в настоящем документе термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают в себя ДНК и РНК. Нуклеотидами могут быть дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды, или основания и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть включен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы или с помощью реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Модификация нуклеотидной структуры, если имеется, может быть осуществлена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть далее модифицирован после синтеза, например, путем конъюгации с меткой. Другие типы модификаций включают, например, «кэпы», замену одного или нескольких из нуклеотидов природного происхождения аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, сложные фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.п.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.п.), содержащие боковые части, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.п.), содержащие интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.п.), содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.п.), содержащие алкилаторы, содержащие модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.п.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любые из гидроксильных групп, обычно имеющихся в сахарах, могут быть замещены, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищенными стандартными защитными группами, или активированы для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или могут быть конъюгированы с твердыми или полутвердыми подложками. 5'- и 3'-Концевая ОН может быть фосфорилирована или замещена аминами или органическими частями - кэппирующими группами из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть дериватизированы стандартными защитными группами. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы Сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые, как правило, известны в уровне техники, в том числе, например, 2'-O-метил-, 2'-О-аллил, 2'-фтор-или 2'-азидо-рибоза, аналоги карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и нуклеозидные аналоги с удаленными основаниями, такие как метилрибозид. Одна или несколько сложных фосфодиэфирных связей могут быть замещены альтернативными связывающими группами. Такие альтернативные связывающие группы включают в себя без ограничения варианты осуществления в которых фосфат замещен P(O)S («тиоатом»), P(S)S («дитиоатом»), (O)NR₂ («амидатом»), P(O)R, P(O)OR', СО или СН₂ («формацеталем»), в которых каждый R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий эфирную связь (-О-), арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предшествующее описание применяется ко всем полинуклеотидам, рассматриваемым в настоящем документе, в том числе к РНК и ДНК.

Используемый в настоящем документе термин «олигонуклеотид» относится к коротким, однонитевым полинуклеотидам, длина которых составляет по меньшей мере приблизительно несколько нуклеотидов и менее приблизительно 250 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть синтетическими. Термины «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» не являются взаимоисключающими. Вышеприведенное описание для полинуклеотидов в равной мере и полностью применимо к олигонуклеотидам.

Термин «праймер» относится к однонитевому полинуклеотиду, который способен гибирдизироваться с нуклеиновой кислотой и обеспечивает полимеризацию комплементарной нуклеиновой кислоты, как правило, путем предоставления свободной 3'-ОН-группы.

Термин «малая молекула» относится к любой молекуле с молекулярной массой приблизительно 2000 дальтон или меньше, предпочтительно приблизительно 500 дальтон или меньше.

Используемые взаимозаменяемо термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, в том числе к потомству таких клеток. Клетки-хозяева включают в себя «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированную клетку и потомство, полученное от них, независимо от числа пересевов. Потомство может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновой кислоты, и может содержать мутации. В настоящем документе включается мутантное потомство, обладающее той же функцией или биологической активностью, что и та, по которой осуществлялось скринирование или отбор для первоначально трансформированной клетки.

Используемый в настоящем документе термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной распространять другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединяется. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую его ввели. Определенные векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально соединены. Такие вектора в настоящем документе называют «векторами экспрессии».

Термин «выделенное антитело» означает антитело, которое отделили от компонента его природной окружающей среды. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело очищают до более чем 95% или 99% чистоты, определенной, например, с помощью электрофореза (например, SDS-PAGE, изоэлектрического фокусирования (IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографии (например, ионообменной или обращенно-фазовой HPLC). Для обзора способов оценивания чистоты антитела, см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. В 848:79-87 (2007).

Термин «выделенная нуклеиновая кислота» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которую отделили от компонента ее природной окружающей среды. Выделенная нуклеиновая кислота включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в месторасположении хромосомы, которое отличается от природного месторасположения ее хромосомы.

Термин «антитело» в настоящем документе используется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антитела, в том числе без ограничения моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител такой длины, при которой они проявляют желаемую антиген-связывающую активность.

Термины «антитело против PD-L1» и «антитело, которое связывается с PD-L1» относятся к антителу, которое способно связываться с PD-L1 с достаточной аффинностью так, что антитело применимо в качестве диагностического и/или терапевтического средства для нацеливания на PD-L1. Согласно одному варианту осуществления степень связывания антитела против PD-L1 с неродственным, отличным от PD-L1 белком составляет менее приблизительно 10% связывания антитела с PD-L1, как измерено, например, с помощью радиоиммунного анализа (RIA). Согласно определенным вариантам осуществления антитело против PD-L1 связывается с эпитопом PD-L1, который является консервативным среди PD-L1 от различных видов.

Термин «блокирующее» антитело или «антагонистическое» антитело означает антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность связываемого им антигена. Предпочтительные блокирующие антитела или антагонистические антитела существенно или полностью ингибируют биологическую активность антигена.

Термин «аффинность» относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между отдельным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, используемый в настоящем документе термин «аффинность связывания» относится к свойственной аффинности связывания, которая отражает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X по отношению к ее партнеру Y, как правило, может быть представлена константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена обычными известными в уровне техники способами, в том числе способами, описанными в настоящем документе. Ниже описаны конкретные иллюстративные и типичные варианты осуществления измерения аффинности связывания.

Термин «антитело с созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или несколькими изменениями в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR) по сравнению с исходным антителом, которое не обладает такими изменениями, при этом такие изменения приводят к улучшению аффинности антитела по отношению к антигену.

Термин «фрагмент антитела» относится к отличной от интактного антитела молекуле, содержащей часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают в себя без ограничения Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антитела (например, scFv) и мультиспецифичные антитела, образованные аз фрагментов антитела.

Термин «антитело, которое связывается с тем же эпитопом», что и эталонное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигеном в анализе конкурентного связывания на 50% или больше, и, наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в анализе конкурентного связывания на 50% или больше. В настоящем документе представлен типичный анализ конкурентного связывания.

Термин «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи походит от определенного источника или видов, тогда как оставшаяся тяжелая и/или легкая цепь походит от другого источника или видов.

Термин «класс» антитела относится к типу константного домена или константного участка, содержащего его тяжелую цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Используемые в настоящем документе взаимозаменяемо термины «непроцессированное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» относятся к антителу, обладающему структурой, по сути подобной структуре нативного антитела, или содержащему тяжелые цепи с Fc-участком, как определено в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по сути гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации или возникающие при получении препарата моноклонального антитела, такие варианты, как правило, присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело из препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение «моноклональное» показывает характер антитела, полученного из по сути гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью ряда методик, в том числе без ограничения способом с использованием гибридом, способами рекомбинантной ДНК, способами с использованием фагового дисплея и способами с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов иммуноглобулина человека, в настоящем документе описаны эти способы и другие типичные способы создания моноклональных антител.

Термин «антитело человека» означает антитело, содержащее аминокислотную последовательность, которая соответствует таковой антитела, продуцированного человеком или клеткой человека, или полученного из отличного от человеческого источника, в котором используются репертуар антител человека или другие кодирующие антитело человека последовательности. Это определение антитела человека специально исключает гуманизированное антитело, содержащее отличные от человеческих связывающие антиген остатки.

Термин «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки от отличных от человеческих HVR и аминокислотные остатки от человеческих FR. Согласно определенным вариантам осуществления гуманизированное антитело будет содержать по сути все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по сути все из HVR (например, CDR) соответствуют таковым отличного от человеческого антитела и все или по сути все из FR соответствуют таковым антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константного участка антитела, походящего из антитела человека. Термин «гуманизированная форма» антитела, например, отличного от человеческого антитела, относится к антителу, которое подвергали гуманизации.

Термин «иммуноконъюгат» означает антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичными молекулами, в том числе без ограничения с цитотоксическим средством.

Термин «процентная (%) идентичность аминокислотной последовательности» в отношении эталонной полипептидной последовательности определяют как процентное отношение аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процентной идентичности аминокислотной последовательности может быть осуществлено различными путями, которые известны специалисту в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине последовательностей, подлежащих сравнению. Для целей настоящего документа, однако, значения % идентичности аминокислотной последовательности получают с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была создана в Genentech, Inc., и программный код был подан с документацией пользователя в ведомство по охране авторского права США, Washington D.C., 20559, в котором его зарегистрировали под № регистрации авторского права TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной от Genentech, Inc., South San Francisco, California, или может быть компилирована из программного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для применения на оперативной системе UNIX, в том числе цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не изменяются.

В случаях использования ALIGN-2 для сравнений аминокислотных последовательностей % идентичность аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А к данной аминокислотной последовательности В, с таковой или по отношению к таковой (которая, в качестве альтернативы, может быть названа данной аминокислотной последовательностью А, имеющей или характеризующейся определенной % идентичностью аминокислотной последовательности к данной аминокислотной последовательности В, с таковой или по отношению к таковой) вычисляют следующим образом:

100 умножить на дробь X/Y,

где X представляет собой число аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании программой А и В, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в В. Будет понятно, что если длина аминокислотной последовательности А не равняется длине аминокислотной последовательности В, то % идентичность аминокислотной последовательности А по отношению к В не будет равняться % идентичности аминокислотной последовательности В по отношению к А. Если специально не указано иное, все значения % идентичности аминокислотной последовательности, используемые в настоящем документе, получают так, как описано в непосредственно предшествующем параграфе с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Термин «выявление» подразумевает любые средства выявления, в том числе прямого и опосредованного выявления.

Используемый в настоящем документе термин «биомаркер» относится к индикатору, например, предсказывающему, диагностическому и/или прогностическому, который может быть выявлен в образце. Биомаркер может служить индикатором конкретного подтипа заболевания или нарушения (например, злокачественной опухоли), характеризующихся определенными, молекулярными, патологическими, гистологическими и/или клиническими признаками. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркером является ген. Биомаркеры включают в себя без ограничения полинуклеотиды (например, ДНК и/или РНК), полипептиды, полипептидные и полинуклеотидные модификации (например, посттрансляционные модификации), углеводы и/или молекулярные маркеры на основе гликолипидов.

Используемые взаимозаменяемо в настоящем документе термины «биомаркерная сигнатура», «сигнатура», «биомаркерная сигнатура экспрессии» или «сигнатура экспрессии» относятся к одному или к комбинации биомаркеров, чья экспрессия является индикатором, например, предсказывающим, диагностическим и/или прогностическим. Биомаркерная сигнатура может служить индикатором конкретного подтипа заболевания или нарушения (например, злокачественной опухоли), характеризуемой определенными молекулярными, патологическими, гистологическими и/или клиническими признаками. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркерной сигнатурой является «генная сигнатура». Термин «генная сигнатура» используется взаимозаменяемо с термином «генная сигнатура экспрессии» и относится к одному или к комбинации полинуклеотидов, чья экспрессия является индикатором, например, предсказывающим, диагностическим и/или прогностическим. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркерной сигнатурой является «белковая сигнатура». Термин «белковая сигнатура» используется взаимозаменяемо с термином «белковая сигнатура экспрессии» и относится к одному или к комбинации полинуклеотидов, чья экспрессия является индикатором, например, предсказывающим, диагностическим и/или прогностическим.

Термины «количество» или «уровень» биомаркера, ассоциируемого с увеличенной клинической пользой для индивидуума, означают выявляемый уровень в биологическом образце. Его можно измерять способами, известными специалисту в данной области, а также раскрытыми в настоящем документе. Оцениваемые уровень экспрессии или количество биомаркера могут быть использованы для определения ответа на лечение.

Термины «уровень экспрессии» или «экспрессионный уровень» обычно используются взаимозаменяемо и, как правило, относятся к количеству биомаркера в биологическом образце. Термин «экспрессия», как правило, относится к процессу, посредством которого информация (например, по генному кодированию и/или эпигенетическая) преобразуется в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке. Поэтому, используемый в настоящем документе термин «экспрессия» может относиться к транскрипции в полинуклеотид, трансляции в полипептид или даже полинуклеотидным и/или полипептидным модификациям (например, посттрансляционной модификации полипептида). Фрагменты транскрибированного полинуклеотид а, транслированного полипептида или полинуклеотидных и/или полипептидных модификаций (например, посттрансляционной модификации полипептида) также должны рассматриваться как экпрессированные, будь то происходящие из транскрипта, образованного альтернативным сплайсингом, или разрушенного транскрипта, или из посттрансляционного процессинга полипептида, например, посредством протеолиза. Термин «экспрессированные гены» подразумевает такие, которые транскрибируются в полинуклеотид как mRNA, а затем транслируются в полипептид, а также такие, которые транскрибируются в РНК, но не транслируются в полипептид (например, транспортная и рибосомальная РНК).

Термины «повышенная экспрессия», «повышенные уровни экспрессии» или «повышенные уровни» относятся к усиленной экспрессии или увеличенным уровнем биомаркера у индивидуума по отношению к контролю, такому как индивидуум или индивидуумы, которые не страдают заболеванием или нарушением (например, злокачественной опухолью), или к внутреннему контролю (например, конститутивному биомаркеру).

Термины «пониженная экспрессия», «пониженные уровни экспрессии» или «пониженные уровни» относятся к пониженной экспрессии или уменьшенным уровням биомаркера у индивидуума по отношению к контролю, такому как индивидуум или индивидуумы, которые не страдают заболеванием или нарушением (например, злокачественной опухолью), или к внутреннему контролю (например, конститутивному биомаркеру).

Термины «конститутивный биомаркер» относится к биомаркеру или группе биомаркеров (например, полинуклеотидам и/или полипептидам), которые обычно подобным образом присутствуют во всех типах клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления конститутивным биомаркером является «конститутивный ген». Термин «конститутивный ген» в настоящем документе относится к гену или группе генов, которые кодируют белки, чья активность является необходимой для поддерживания клеточной функции, и которые подобным образом присутствуют во всех типах клеток.

Используемый в настоящем документе термин «амплификация», как правило, относится к процессу получения множественных копий желаемой последовательности. Термин «множественные копии» означает по меньшей мере две копии. Термин «копия» не обязательно означает совершенную комплементарность последовательности или идентичность по отношению к матричной последовательности. Например, копии могут включать в себя нуклеотидные аналоги, такие как дезоксиинозин, преднамеренные изменения последовательности (такие как изменения последовательности, введенные посредством праймера, содержащего последовательность, которая является гибридизируемой, но не комплементарной, по отношению к матричной) и/или ошибки последовательности, которые возникают при амплификации.

Термин «мультиплексная PCR» относится к одной PCR-реакции, выполняемой в нуклеиновой кислоте, полученной из одного источника (например, индивидуума) с использованием более чем одного праймера, установленного с целью амплификации двух или более последовательностей ДНК в одной реакции.

«Жесткость» реакций гибридизации легко определяется специалистом в данной области и, как правило, эмпирически рассчитывается в зависимости от длины зонда, температуры промывания и концентрации соли. Обычно при более длинных зондах требуются более высокие температуры для надлежащего отжига, тогда как для более коротких зондов нужны более низкие температуры. Гибридизация, как правило, зависит от способности денатурированной ДНК к повторному отжигу, если комплементарные нити присутствуют в окружении ниже их температуры плавления. Чем выше степень желаемой гомологии между зондом и гибридизируемой последовательностью, тем выше относительная температура, которую можно использовать. В результате следует, что более высокие относительные температуры будут иметь тенденцию сделать реакционные условия более жесткими, в то время как более низкие температуры - менее жесткими. Для дополнительных подробностей и пояснения жесткости реакций гибридизации см. Ausubel et al., Current Протоколз in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Определенные в настоящем документе термины «жесткие условия» или «условия высокой жесткости» могут быть идентифицированы тем, что: (1) применяются низкая ионная сила и высокая температура для промывания, например, 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°С; (2) применяется при гибридизации денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (объем/объем) формамид с 0,1% альбумином бычьей сыворотки/0,1% Ficoll/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при рН 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°С; или (3) гибридизация в течение ночи в растворе, содержащем 50% формамид, 5 х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 х раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°С, с 10-минутным промыванием при 42°С в 0,2 х SSC (хлорид натрия/цитрат натрия), а затем 10-минутным промыванием высокой жесткости, состоящем из 0,1 х SSC с EDTA при 55°С.

Термин «умеренно жесткие условия» может быть идентифицирован, как описано Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, и включает применение промывающего раствора и условий гибридизации (например, температуры, ионной силы и % SDS) менее жестких, чем описанные выше. Примером умеренно жестких условий является инкубация в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем 20% формамид, 5 х SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрата тринатрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5 х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной порезанной ДНК спермы лосося, а затем промывание фильтров в 1 х SSC при приблизительно 37-50°С. Специалисту в данной области будет известно, как отрегулировать температуру, ионную силу и т.п., необходимые для приведения в соответствие с факторами, такими как длина зонда и т.п.

Используемая в настоящем документе методика «полимеразной цепной реакции» или «PCR», как правило, означает процедуру, при которой незначительные количества определенного фрагмента нуклеиновой кислоты, РНК и/или ДНК, амплифицируют, как описано в патенте США №4683195, выданном 28 июля 1987 г. Как правило, должна быть доступна информация последовательности от концов представляющего интерес участка или за его пределами так, что могут быть разработаны олигонуклеотидные праймеры; эти праймеры будут идентичными или подобными по последовательности противоположным нитям шаблона, подлежащей амплификации. 5'-Концевые нуклеотиды двух праймеров могут совпадать с концами амплифицируемого материала. PCR может быть использована для амплификации специфических последовательностей РНК, специфических последовательностей ДНК из общей геномной ДНК и кДНК, транскрибируемой от общей клеточной РНК, бактериофаговой или плазмидной последовательностей и т.д., см., в общем смысле, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Используемая в настоящем документе PCR считается одним, но не единственным, примером метода реакции полимеразы нуклеиновой кислоты для амплификации тестируемого образца нуклеиновой кислоты, включающего применение известной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в качестве праймера и применения полимеразы нуклеиновой кислоты для амплификации или создания специфического фрагмента нуклеиновой кислоты или для амплификации или создания специфического фрагмента нуклеиновой кислоты, комплементарного конкретной нуклеиновой кислоте.

Термин «количественная полимеразная цепная реакция реального времени» или «qRT-PCR» означает форму PCR, при которой количество продукта PCR измеряют на каждой стадии PCR-реакции. Эта методика была описана в различных публикациях, в том числе в Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004); и Ma et al., Cancer Cell 5:607-616(2004).

Термин «микрочип» относится к упорядоченному расположению на субстрате гибридизируемых элементов матрицы, предпочтительно полинуклеотидных зондов Термин «полинуклеотид» при использовании в единственном числе или во множественном числе, как правило, означает любой полирибонуклеотид или полидезоксирибонуклеотид, который может быть немодифицированной РНК или ДНК или модифицированной РНК или ДНК. Так, например, определяемые в настоящем документе полинуклеотиды включают в себя без ограничения одно- и двухнитевую ДНК, ДНК, содержащую одно- и двухнитевые участки, одно- и двухнитевую РНК и РНК, содержащую одно- и двухнитевые участки, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми, или чаще двухнитевыми, или включают в себя одно- и двухнитевые участки. Кроме того, используемый в настоящем документе термин «полинуклеотид» означает трехнитевые участки, содержащие РНК или ДНК или и РНК, и ДНК. Нити на таких участках могут быть от одной и той же молекулы или от разных молекул. Участки могут включать в себя все из одной или нескольких молекул, но чаще включают в себя только участок некоторых из молекул. Одной из молекул участка тройной спирали участок часто является олигонуклеотид. Термин «полинуклеотид» конкретно включает кДНК. Термин включает ДНК (в том числе кДНК) и РНК, которые содержат одно или несколько модифицированных оснований. Таким образом, ДНК или РНК с остовами, модифицированными для стабильности или для других целей, являются «полинуклеотидами», как этот термин рассматривается в настоящем документе. Более того, ДНК или РНК, содержащие нетипичные основания, такие как инозин, или модифицированные основания, такие как меченные тритием основания, включаются определенным в настоящем документе термином «полинуклеотиды». Как правило, термин «полинуклеотид» охватывает все химически, ферментативно и/или метаболически модифицированные формы немодифицированных полинуклеотидов, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток, в том числе простых и комплексных клеток.

Термин «олигонуклеотид» означает относительно короткий полинуклеотид, в том числе без ограничения однонитевые дезоксирибонуклеотиды, одно- или двухнитевые рибонуклеотиды, гибриды РНК:ДНК и двухнитевые ДНК. Олигонуклеотиды, такие как о л иго нуклеотиды однонитевых ДНК-зондов, часто синтезируют химическими методами, например, с использованием автоматизированных синтезаторов олигонуклеотидов, которые коммерчески доступны. Однако олигонуклеотиды могут быть получены рядом других способов, в том числе опосредованными рекомбинантной ДНК методиками in vitro и путем экспрессии ДНК в клетках и организмах.

Используемый в настоящем документе термин «диагноз» относится к идентификации или классификации молекулярного или патологического синдрома, заболевания или состояния (например, злокачественной опухоли). Например, термин «диагноз» может относиться к идентификации конкретного типа злокачественной опухоли. Термин «диагноз» также может относиться к классификации конкретного подтипа злокачественной опухоли, например, посредством гистопатологического критерия или посредством молекулярных признаков (например, подтипа, характеризуемого экспрессией одного или комбинации биомаркеров (например, конкретных генов или кодируемых указанными генами белков)).

Используемый в настоящем документе термин «содействие диагнозу» относится к способам, которые помогают осуществлению клинического определения в отношении наличия или природы конкретного типа симптома или состояния заболевания или нарушения (например, злокачественной опухоли). Например, способ содействия диагнозу заболевания или состояния (например, злокачественной опухоли) может включать измерение определенных биомаркеров в биологическом образце от индивидуума.

Используемый в настоящем документе термин «образец» относится к композиции, которая получена или походит от представляющего интерес субъекта и/или индивидуума и содержит клеточный и/или другой молекулярный объект, который подлежит описанию и/или идентификации, например, на основе физических, биохимических, химических и/или физиологических характеристик. Например, фраза «образец заболевания» и ее вариации относятся к какому-либо образцу, полученному от представляющего интерес субъекта, который, как ожидается или как известно, содержит клеточный и/или молекулярный объект, подлежащий описанию. Образцы включают в себя без ограничения первичные или культивируемые клетки или клеточные линии, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, тромбоциты, сыворотку крови, плазму, стекловидную жидкость, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, фолликулярную жидкость, семенную жидкость, амниотическую жидкость, молоко, цельную кровь, клетки крови, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, мокроту, слезы, пот, слизь, опухолевые лизаты и тканевую культуральную среду, тканевые экстракты, такие как гомогенизированная ткань, опухолевая ткань, клеточные экстракты и их комбинации.

Под термином «образец ткани» или «образец клетки» подразумевается коллекция подобных клеток, полученных из ткани субъекта или индивидуума. Источником образца ткани или клетки может быть твердая ткань из свежего, замороженного и/или консервированного органа, образца ткани, биопсии и/или аспирационный биоптат; кровь или любые составляющие крови, такие как плазма; жидкости организма, такие как спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость; клетки субъекта в любой период созревания или развития. Образцом ткани также могут быть первичные или культивируемые клетки или клеточные линии. Необязательно, образец ткани или клетки получают от пораженных заболеванием ткани/органа. Образец ткани может содержать соединения, которые в природе не смешиваются с тканью, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксирующие средства, питательные вещества, антибиотики или подобные.

Используемые в настоящем документе термины «эталонный образец», «эталонная клетка», «эталонная ткань», «контрольный образец», «контрольная клетка» или «контрольная ткань» относятся к образцу, клетке, ткани, стандарту или уровню, которые используют с целью сравнения. Согласно одному варианту осуществления эталонный образец, эталонную клетку, эталонную ткань, контрольный образец, контрольную клетку или контрольную ткань получают из здоровой и/или непораженной заболеванием части организма (например, ткани или клеток) того же субъекта или индивидуума. Например, здоровые и/или непораженные заболеванием клетки или ткань соседствуют с пораженными заболеванием клетками или тканью (например, клетки или ткани соседствуют с опухолью). Согласно другому варианту осуществления эталонный образец получают из необработанной ткани и/или клетки организма того же субъекта или индивидуума. Согласно еще одному варианту осуществления эталонный образец, эталонную клетку, эталонную ткань, контрольный образец, контрольную клетку или контрольную ткань получают из здоровой и/или непораженной заболеванием части организма (например, ткани или клеток) индивидуума, который не является субъектом или индивидуумом. Согласно еще одному варианту осуществления эталонный образец, эталонную клетку, эталонную ткань, контрольный образец, контрольную клетку или контрольная ткань получают из необработанной ткани и/или клетки организма индивидуума, который не является субъектом или индивидуумом.

Для целей настоящего документа термин «срез» образца ткани означает отдельную часть или кусок образца ткани, например, тонкий слой ткани или клеток, вырезанный из образца ткани. Следует понимать, что несколько срезов образцов ткани могут быть взяты и подвержены анализу при условии, что один и тот же срез образца ткани может быть анализирован и на морфологическом, и на молекулярном уровнях, или анализирован в отношении и полипептидов, и полинуклеотидов.

Термин «коррелят» или «корреляция» означает сравнение, любым путем, характеристики и/или результатов первого анализа или протокола с характеристикой и/или результатами второго анализа или протокола. Например, можно использовать результаты первого анализа или протокола при выполнении вторых протоколов, и/или можно использовать результаты первого анализа или протокола для определения того, будет ли выполнен второй анализ или протокол. Что касается варианта осуществления анализа полинуклеотид а или протокола, можно применять результаты анализа экспрессии полинуклеотида или протокола для определения того, будет ли выполнен конкретный терапевтический режим.

«Ответ индивидуума» или «ответ» может быть оценен с использованием любой конечной точки, определяющей пользу для индивидуума, в том числе без ограничения (1) ингибирование, до некоторой степени, развития заболевания (например, развития злокачественной опухоли), в том числе замедление и полная задержка; (2) уменьшение размера опухоли; (3) ингибирование (т.е. снижение, замедление или полная остановка) инфильтрации злокачественных клеток в соседние периферические органы и/или ткани; (4) ингибирование (т.е. снижение, замедление или полная остановка) метастизирования; (5) облегчение, до некоторой степени, одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением (например, со злокачественной опухолью); (6) увеличение длительности жизни без развития заболевания и/или (9) пониженная смертность на данный момент времени после лечения.

Термин «эффективный ответ» больного или «отвечаемость» больного на лечение медицинским препаратом и подобное выражение относятся к клинической или терапевтической пользе для больного с риском заболевания или нарушения, такого как злокачественное заболевание, или страдающего от такового. Согласно одному варианту осуществления такая польза включает в себя что-либо одно или несколько из продления выживаемости (в том числе общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования заболевания), результата в виде объективного ответа (в том числе полного ответа или частичного ответа) или улучшения признаков или симптомов злокачественного заболевания. Согласно одному варианту осуществления биомаркер (например, экспрессия PD-L1, например, определяемая с использованием IHC) используют для выявления больного, у которого прогнозируется повышение вероятности ответа на лечение медицинским препаратом (например, антителом против PD-L1), в отличие от больного, у которого биомаркер не экспрессируется. Согласно одному варианту осуществления биомаркер (например, экспрессия PD-L1, например, определяемая с использованием IHC) используют для выявления больного, у которого прогнозируется повышение вероятности ответа на лечение медицинским препаратом (например, антителом против PD-L1), относительно больного, у которого биомаркер не экспрессируется на том же уровне. Согласно одному варианту осуществления наличие биомаркера используют для выявления больного, который с большей вероятностью будет отвечать на лечение медицинским препаратом, относительно больного, у которого нет биомаркера. Согласно другому варианту осуществления наличие биомаркер используют для выявления больного, который характеризуется повышенное вероятностью получения пользы от лечения медицинским препаратом, относительно больного, у которого нет биомаркера.

Термин «выживаемость» относится к больному, остающемуся живым и включает в себя общую выживаемость, а также выживаемость без прогрессирования.

Термин «общая выживаемость» относится к больному, остающемуся живым в течение определенного периода времени, такого как 1 год, 5 лет и т.д., со времени постановки диагноза или начала лечения.

Термин «выживаемость без прогрессирования» относится к больному, остающемуся живым без прогрессирования злокачественной опухоли или без наступления ухудшения.

Термин «продление выживаемости» означает увеличение общей выживаемости или выживаемости без прогрессирования у получающего лечение больного относительно неполучающего лечение больного (т.е. относительно больного, которого не лечат медицинским препаратом) или относительно больного, у которого не экспрессируется биомаркер с выявляемым уровнем, и/или относительно больного, получающего лечение одобренным противоопухолевым средством. Объективный ответ означает измеримый ответ, в том числе полный ответ (CR) или частичный ответ (PR).

Под термином «полный ответ» или «CR» подразумевается исчезновение всех признаков злокачественной опухоли в ответ на лечение. Это не всегда означает, что злокачественная опухоль была вылечена.

Термин «частичный ответ» или «PR» означает уменьшение размера одной или нескольких опухолей или поражений, или уменьшение степени злокачественной опухоли в организме в ответ на лечение.

Используемая в настоящем документе фраза «по сути такой же» означает достаточно высокую степень подобия между двумя числовыми значениями так, что специалист в данной области сможет увидеть разницу между двумя значениями с небольшой биологической и/или статистической значимостью или без таковой в контексте биологической характеристики, измеренной указанными значениями (например, значений Kd или экспрессии). Разница между указанными двумя значениями составляет, например, менее приблизительно 50%, менее приблизительно 40%, менее приблизительно 30%, менее приблизительно 20% и/или менее приблизительно 10%, как функция эталонного/сравнительного значения.

Используемая в настоящем документе фраза «по сути отличный» означает достаточно высокую степень различия между двумя числовыми значениями так, что специалист в данной области сможет увидеть разницу между двумя значениями с небольшой биологической и/или статистической значимостью или без таковой в контексте биологической характеристики, измеренной указанными значениями (например, значений Kd). Разница между указанными двумя значениями составляет, например, более приблизительно 10%, более приблизительно 20%, более приблизительно 30%, более приблизительно 40% и/или более приблизительно 50%, как функция для эталонной/сравнительной молекулы.

Используемый в настоящем документе термин «метка» относится к выявляемому соединению или композиции. Метка, как правило, конъюгируется или сливается непосредственно или опосредованно с реагентом, таким как полинуклеотидный зонд или антитело, и облегчает выявление реагента, с которым она конъюгирована или слита. Метка сама по себе может быть выявляемой (например, радио изотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае, если это ферментная метка, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которые приводят к в результате к выявляемому продукту.

Термин «эффективное количество» средства относится к количеству, эффективному при дозировках и в течение периодов времени, необходимому для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству терапевтического средства для лечения или предупреждения заболевания или нарушения у млекопитающего. В случае злокачественных заболеваний терапевтически эффективное количество терапевтического средства может снижать число раковых клеток, снижать размер первичной опухоли, ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы, ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли, ингибировать до некоторой степени рост опухоли и/или облегчать до некоторой степени один или несколько симптомов, ассоциированных с нарушением. В тех случаях, когда лекарственное средство может предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Для противораковой терапии эффективность in vivo может быть измерена, например, путем оценивания длительности выживания, времени до прогрессирования заболевания (ТТР), частот ответа (RR), длительности ответа и/или качества жизни.

Термины «злокачественное заболевание» и «злокачественный» относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток, или описывают их. Это определение включает доброкачественные и злокачественные заболевания. Термин «злокачественное заболевание ранней стадии» или «опухоль ранней стадии» означает злокачественное заболевание, которое не является инвазивным или метастатическим или классифицируется как злокачественное заболевание стадии 0, I или II. Примеры злокачественного заболевания включают в себя без ограничения карциному, лимфому, бластому (в том числе медуллобластому и ретинобластому), саркому (в том числе липосаркому и саркому синовиальных клеток), нейроэндокринные опухоли (в том числе карциноидные опухоли, гастриному и злокачественное заболевание островковых клеток), мезотелиому, шванному (в том числе нейрому слухового нерва), менингиому, ад ено карциному, меланому и лейкоз или лимфоидные злокачественные новообразования. Более конкретные примеры таких злокачественных заболеваний включают в себя плоскоклеточное злокачественное заболевание (например, эпителиальное плоскоклеточное злокачественное заболевание), злокачественное заболевание легкого, в том числе мелкоклеточный рак легкого (SCLC), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), аденокарциному легкого и сквамозную карциному легкого, злокачественное заболевание брюшины, печеночно-клеточное злокачественное заболевание, злокачественное заболевание желудка или желудочно-кишечного тракта, в том числе желудочно-кишечное злокачественное заболевание, злокачественное заболевание поджелудочной железы, глиобластому, злокачественное заболевание шейки матки, злокачественное заболевание яичника, злокачественное заболевание печени, злокачественное заболевание мочевого пузыря, гепатому, злокачественное заболевание молочной железы (в том числе метастатическое злокачественное заболевание молочной железы), злокачественное заболевание толстой кишки, злокачественное заболевание прямой кишки, злокачественное заболевание толстой и прямой кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, почечное или ренальное злокачественное заболевание, злокачественное заболевание предстательной железы, злокачественное заболевание вульвы, злокачественное заболевание щитовидной железы, карциному печени, карциному анального канала, карциному полового члена, злокачественное заболевание клеток Меркеля, грибовидные гранулемы, злокачественное заболевание яичка, злокачественное заболевание пищевода, опухоли желчных путей, а также злокачественное заболевание головы и шеи и гематологические злокачественные новообразования. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественным заболеванием является трижды негативное метастатическое злокачественное заболевание молочной железы, в том числе любая гистологически подтвержденная трижды негативная (ER-, PR-, HER2-) аденокарцинома молочной железы с локально рецидивирующим или метастатическим заболеванием (при этом локально рецидивирующее заболевание не поддается иссечению с лечебной целью).

Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в такой форме, которая обеспечивает эффективность биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем и которая не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому состав собираются вводить.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, не являющемуся активным ингредиентом и не токсичному для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает в себя без ограничения, буфер, наполнитель, стабилизатор или консервант.

Используемый в настоящем документе термин «лечение» (и грамматические его вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественное течение заболевания индивидуума, подлежащего лечению, и может осуществляться либо для предотвращения, либо в течение клинической патологии. Желаемые эффекты лечения включают без ограничения предотвращение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости развития заболевания, улучшение или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию или улучшенный прогноз. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением используют для задерживания развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Термин «противораковая терапия» относится к терапии, применимой при лечении злокачественной опухоли. Примеры противораковых терапевтических средств включают в себя без ограничения, например, химиотерапевтические средства, ингибирующие рост средства, цитотоксические средства, средства, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные средства, апоптические средства, противотубулиновые средства и другие средства для лечения злокачественной опухоли, антитела против CD20, ингибиторы тромбоцитарного фактора роста (например, Gleevec™ (иматиниб мезилат)), ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одной или несколькими из следующих целей PDGFR-beta, BlyS, APRIL, рецептор(ы) ВСМА, TRAIL/Аро2, и другие биоактивные и органические химические средства и т.п. Их комбинации также охватываются настоящим изобретением.

Используемый в настоящем документе термин «цитотоксическое средство» относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Термин предназначен для включения в себя радиоактивных изотопов (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивных изотопов Lu), химиотерапевтических средств, например, метотрексата, адриамицина, алкалоидов барвинка (винкристина, винбластина, этопозида), доксорубицина, мелфалана, митомицина С, хлорамбуцила, даунорубицина или других интеркалирующих средств, ферментов и их фрагментов, таких как нуклеолитические ферменты, антибиотиков и токсинов, таких как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, в том числе их фрагментов и/или вариантов, и различных противоопухолевых или противораковых средств, раскрытых ниже. Ниже описаны другие цитотоксические средства. Опухолецидное средство вызывает разрушение клеток опухоли.

Термин «химиотерапевтическое средство» относится к химическому соединению, применимому в лечении злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают в себя алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклосфосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пиросульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе альтерамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкампотецин, скополектин и 9-аминокампотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелесин, карзелесин и бизелесин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин-1 и криптофицин-8); доластатин; дуокармицин (в том числе синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; мустаргены, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтаминоксида гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилмустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин-гамма II и калихеамицин-омега II (см., например, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, пероральный ингибитор альфа-4-интегрин; динемицин, в том числе динемицин А; эсперамицин; а также неокарзиностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые енедииновые антибиотические хромофоры), аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карбицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин (в том числе ADRIAMYCIN®, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин, липосомная инъекция доксорубицина HCl (DOXIL®), липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®), пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX®) и деоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), капецитабин (XELODA®), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; препараты, подавляющие функцию коры надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; восполнитель фолиевой кислоты, такой как фролиниковая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквуон; элфорнитин; эллиптиний ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и анзамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраерин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK^® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквуон; 2,2',2'-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин (ELDISINE^®, FILDESIN^®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например паклитаксел (TAXOL®), композиция паклитаксела на основе наночастиц из генно-инженерного альбумина (ABRAXANE™) и доцетаксел (TAXOTERE®); хлоранбуцил; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; содержащие платину средства, такие как цисплатин, оксалиплатин (например, ELOXATIN®) и карбоплатин; винкас, который предотвращает полимеризацию тубулина при формировании микротрубочек, в том числе винбластин (VELBAN®), винкристин (ONCOVIN®), виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин (NAVELBINE®); этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, в том числе бексаротен (TARGRETIN®); бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золендроновую кислоту/золендронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®), тилудронат (SKELID®) или ризедронат (ACTONEL®); троксацитабин (аналог нуклеозида цитозина 1,3-диоксолан); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, те, которые ингибируют экспрессию генов в сигнальных путях, связанных с аномальной пролиферацией клеток, например, такие как РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы-1 (например, LURTOTECAN®); rmRH (например, ABARELIX®); BAY439006 (сорафениб; Bayer); SU-11248 (сунитиниб, SUTENT®, Pfizer); перифозин, ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), протеосомный ингибитор (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®); CCI-779; типифарниб (R11577); орафениб, АВТ510; ингибитор Bcl-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®); пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже); ингибиторы тирозинкиназы (см. определение ниже); ингибиторы серин-треонинкиназы, такие как рапамицин (сиролимус, RAPAMUNE®); ингибиторы фарнезилтрансферазы, такие как лонафарниб (SCH 6636, SARASAR™); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из вышеупомянутых; а также комбинации двух или более из вышеупомянутых, такие как CHOP, сокращенное наименование для комбинированной терапии циклофосфамида, доксорубицина, винкристина и преднизолона; и FOLFOX, сокращенное наименование для режима лечения оксалиплатином (ELOXATIN™) в комбинации с 5-FU и лейковорином.

Определяемые в настоящем документе химиотерапевтические средства включают в себя «противогормональные средства» или «эндокринные терапевтические средства», которые действуют с регуляцией, снижением, блокированием или ингибированием эффектов гормонов, которые могут обеспечивать рост злокачественной опухоли. Они сами могут быть гормонами, в том числе без ограничения противоэстрогены со смешанным профилем агониста и антагониста, в том числе тамоксифен (NOLVADEX®), 4-гидрокситамоксифен, торемифен (FARESTON®), идоксифен, долоксифен, рлоксифен (EVISTA®), триоксифен, кеоксифен и селективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), такие как SERM3; чистые противоэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестран (FASLODEX®) и ЕМ800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецептора эстрогена (ER), ингибировать связывание с ДНК, повышать обмен ER и/или подавлять содержание ER); ингибиторы ароматазы, в том числе стероидные ингибитора ароматазы, такие как форместан и эксемистан (AROMASIN®) и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®), летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид, и другие ингибиторы ароматазы включают в себя ворозол (RIVISOR®), мегестрол ацетат (MEGASE®), фадрозол и 4(5)-имидазолы; агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, в том числе лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®), гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, в том числе прогестины, такие как мегестрол ацетат и медроксипрогестерон ацетат, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин, и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, все трансретиноевая кислота и фенритинид; онапристон; противопрогестероны; даунрегуляторы рецепторов эстрогена (ERD); противоандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из вышеупомянутых; а также комбинации двух или более из вышеупомянутых.

Используемый в настоящей заявке термин «пролекарство» относится к предшественнику или производной форме фармацевтически активного вещества, которое является менее цитотоксическим к опухолевым клеткам, по сравнению с исходным лекарственным средством и способно ферментативно активизироваться или превращаться в более активную родительскую форму. См., например, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986), и Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Пролекарства в соответствии с настоящим изобретением включают в себя без ограничения фосфат-содержащие пролекарства, тиофосфат-содержащие пролекарства, сульфат-содержащие пролекарства, пептид-содержащие пролекарства, модифицированные D-аминокислотой пролекарства, гликозилированные пролекарства, (3-лактам-содержащие пролекарства, содержащие необязательно замещенный феноксиацетамид пролекарства или содержащие необязательно замещенный фенилацетамид пролекарства, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активное цитотоксическое свободное лекарственное средство. Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут быть дериватизированы в пролекарственную форму для применения в настоящем изобретении включают в себя без ограничения описанные выше химиотерапевтические средства.

Используемый в настоящем документе термин «ингибирующее рост средство» относится к соединению или композиции, которые ингибируют рост клетки (например, клетки, чей рост зависит от экспрессии PD-L1 либо in vitro, либо in vivo). Примеры ингибирующих рост средств включают в себя средства, которые блокируют ход клеточного цикла (в фазе, отличной от S-фазы), такие как средства, которые индуцируют задержку G1 и задержку М-фазы. Классические блокаторы М-фазы включают в себя алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомерызы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те средства, которые задерживают G1, также распространяются на задержку S-фазы, например, алкилирующие ДНК средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-С. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell цикл regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особенно стр. 13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой противораковые средства, получаемые из тисового дерева. Доцетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из европейского тиса, является полусинтетическим аналогом паклитаксела (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел обеспечивают сборку микротрубочек из тубулиновых димеров и стабилизируют микротрубочки путем предотвращения деполимеризации, что приводит к ингибированию митоза в клетках.

Под термином «лучевая терапия» понимают применение направленного гамма-излучения или бета-излучения для индуцирования достаточного повреждения клетки так, чтобы ограничить ее способность нормально функционировать или вообще разрушить клетку. Следует учитывать, что имеется множество известных в уровне техники путей для определения дозировки и длительности лечения. Типичные виды лечения осуществляют в форме однократного введения, а типичные дозировки варьируют от 10 до 200 единиц (Grays) в сутки.

Термины «пациент», «индивидуум» или «субъект» представляют собой млекопитающего. Млекопитающие включают в себя без ограничения домашних животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от людей приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). Согласно определенным вариантам осуществления пациент индивидуумом или субъектом является человек.

Используемый в настоящем документе термин «одновременно» относятся к введению двух или более терапевтических средств, при этом по меньшей мере часть введения перекрывается по времени. Следовательно, одновременное введение включает режим дозирования, при котором введение одного или нескольких средств продолжается после прекращения введения одного или нескольких других средств.

Под термином «снижение или ингибирование» подразумевают способность вызывать общее снижение на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше. Уменьшение или ингибирование может относиться к симптомам нарушения, подлежащего лечению, наличию или размеру метастаз или размеру первичной опухоли.

Используемый термин «инструкция по применению препарата» относится к обычно помещаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов или медикаментов инструкциям, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях, других терапевтических продуктах, подлежащих комбинированию с упакованным продуктом, и/или предостережениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов или медикаментов и т.п.

Термин «изделие промышленного производства» означает любой производимый продукт (например, упаковку или контейнер) или набор, содержащие по меньшей мере один реагент, например, медикамент, для лечения заболевания или нарушения (например, злокачественной опухоли), или зонд для специфичного выявления описанного в настоящем документе биомаркера. Согласно определенным вариантам осуществления производимый продукт или набор продвигается, распределяется или продается как единица для осуществления описанных в настоящем документе способов.

Термин «целевая аудитория» означает группу людей или организацию, для которых или для которой конкретный медикамент продвигается или предназначается для продвижения, путем маркетинга или предложения, особенно для конкретных применений, видов лечения или показаний, например, индивидуумы, группы населения, читатели газет, медицинской литературы и журналов, телезрители или пользователи Интернета, слушатели радио или Интернета, врачи, компании по производству лекарственных средств и т.п.

Используемая в настоящем документе фраза «на основании» означает, что информация об одном или нескольких биомаркерах используется для принятия информированного решения о лечении, при этом информация предоставляется на информационном вкладыше в упаковке или в маркетинговом/рекламном руководстве и т.п.

Как известно специалисту в данной области, ссылка на «приблизительно» по отношению к значению или параметру в настоящем документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на эти значение или параметр как таковые. Например, обозначение, относящееся к «приблизительно X», включает обозначение «X».

Следует понимать, что описанные в настоящем документе аспект и варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя «состоящие из» и/или «состоящие, по сути, из» аспектов и вариантов осуществления. Используемая в настоящем документе форма единственного числа включает ссылки во множественном числе, если не указано иное.

I. Способы и применения

Настоящий документ относится к способам применения биомаркеров PD-L1. В частности, представлены способы применения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, и биомаркера PD-L1.

Диагностические способы

Настоящий документ относится к способам идентификации индивидуума с заболеванием или нарушением, который с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, где наличие биомаркера PD-L1 в образце указывает на то, что индивидуум с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, и предоставление рекомендации по поводу того, что индивидуум с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Кроме того, настоящий документ относится к способам прогнозирования отвечаемости индивидуума с заболеванием или нарушением на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, где наличие биомаркера PD-L1 в образце указывает на то, что индивидуум с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, и предоставление рекомендации по поводу того, что индивидуум будет характеризоваться повышенной вероятностью ответа на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Кроме того, настоящий документ относится к способам определения вероятности того, что индивидуум с заболеванием или нарушением будет получать пользу от лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, где наличие биомаркера PD-L1 в образце указывает на то, что индивидуум характеризуется повышенной вероятностью получения пользы от лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, и предоставление рекомендации по поводу того, что индивидуум будет характеризоваться повышенной вероятностью получения пользы от лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Кроме того, представлены способы выбора терапии для индивидуума с заболеванием или нарушением, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума и предоставление рекомендации по поводу того, что выбранная для индивидуума терапия включает лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, на основании наличия биомаркера PD-L1 в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления способы, кроме того, включают введение индивидууму эффективного количества антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выбирают из группы, состоящей из PD-L1, PD-1, PD-L2 и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркером PD-L1 является связанный с иммунной системой маркер. Связанный с иммунной системой маркер относится к маркеру, который экспрессируется иммунными клетками или другими клетками (например, опухолевыми клетками, эндотелиальными клетками, фибробластами или другими стромальными клетками). Если экспрессируется клетками, отличными от иммунных клеток, маркер может быть вовлечен в регуляцию биологии и функции иммунных клеток, такую как активация, прайминг, распознавание и представление антигена, продуцирование цитокина и хемокина, пролиферация, миграция, выживаемость, продуцирование антитела и другие. Согласно некоторым вариантам осуществления связанным с иммунной системой маркером является связанный с Т-клеткой маркер. Согласно некоторым вариантам осуществления связанный с Т-клеткой маркер выбирают из группы, состоящей из CD8A, IFN-g, EOMES, гранзима-А, CXCL9 и каких-либо их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления связанный с иммунной системой маркер выбирают из группы, состоящей из CX3CL1, CD45RO, IDOl, галектина 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления наличие биомаркера PD-L1 указывает на то, что индивидуум, вероятно, будет получать повышенную клиническую пользу от лечения его антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления повышенная клиническая польза включает относительное повышение одного или нескольких из следующих показателей: общая выживаемость (OS), выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR) и их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 отсутствует в образце, если он составляет 0% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует в образце, если он составляет более чем 0% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 1% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 5% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 10% образца.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в образце с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из FACS, вестерн-блоттинга, ELISA, иммунопреципитации, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, радио иммуно анализа, дот-блоттинга, иммунологических анализов, HPLC, поверхностного плазмонного резонанса, оптической спектроскопии, масс-спектрометрии, HPLC, qPCR, RT-qPCR, мультиплексной qPCR или RT-qPCR, RNA-Seq, микроматричного анализа, SAGE, метода MassARRAY и FISH, а также их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в образце с помощью экспрессии белка. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию белка определяют с помощью иммуногистохимии (IHC). Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют с использованием антитела против PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как слабую интенсивность окрашивания с помощью ШС.Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как умеренную интенсивность окрашивания с помощью IHC. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как сильную интенсивность окрашивания с помощью IHC.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в опухолевых клетках, инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, стромальных клетках и каких-либо их комбинациях с использованием анализа экспрессии белка, такого как IHC анализ. Инфильтрующиеся в опухоль иммунные клетки включают в себя без ограничения внутриопухолевые иммунные клетки, перитуморальные иммунные клетки или какие-либо их комбинации, другие опухолевые стромальные клетки (например, фибробласты). Такими инфильтрующимися в опухоль иммунными клетками могут быть Т-лимфоциты (такие как CD8+ Т-лимфоциты и/или CD4+ Т-лимфоциты), В-лимфоциты или другие происходящие из костного мозга клетки, в том числе гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), моноциты, макрофаги, дендритные клетки (т.е. интердигитальные дендритные клетки), гистиоциты и клетки-натуральные киллеры.

Согласно некоторым вариантам осуществления окрашивание на биомаркер PD-L1 выявляют как мембранное окрашивание, цитоплазматическое окрашивание и их комбинации. Согласно другим вариантам осуществления отсутствие биомаркера PD-L1 выявляют как отсутствие окрашивания в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в образце с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию нуклеиновой кислоты определяют с использованием qPCR, RT-qPCR, мультиплексной qPCR или RT-qPCR, RNA-Seq, микроматричного анализа, SAGE, метода MassARRAY или FISH.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в опухолевых клетках, инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, стромальных клетках и каких-либо их комбинациях с использованием экспрессии нуклеиновой кислоты, например, анализом qPCR.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, выбирают из группы, состоящей из антагониста, связывающегося с PD-L1, и антагониста, связывающегося с PD-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по лигандному связыванию. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с PD-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с В7-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 и с PD-1, и с В7-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающимся с PD-L1, является антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антителом является моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антителом является человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по лигандному связыванию. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L2. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 и с PD-L1, и с PD-L2.

Согласно некоторым вариантам осуществления образец, полученный от индивидуума, выбирают из группы, состоящей из ткани, цельной крови, плазмы, сыворотки крови и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом является образец ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является образец опухолевой ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления образец опухолевой ткани содержит клетки опухоли, инфильтрующиеся в опухоль иммунные клетки, стромальные клетки и какие-либо их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления образец получают до лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления образец ткани фиксируется в формалине и заливается парафином, архивируется, является свежим или замороженным.

Согласно некоторым вариантам осуществления образцом является цельная кровь. Согласно некоторым вариантам осуществления цельная кровь содержит иммунные клетки, циркулирующие опухолевые клетки и какие-либо их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления заболеванием или нарушением является пролиферативное заболевание или нарушение. Согласно некоторым вариантам осуществления заболеванием или нарушением является связанное с иммунной системой заболевание или нарушение. Согласно некоторым вариантам осуществления заболеванием или нарушением является злокачественное заболевание. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественным заболеванием является немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, почечноклеточное злокачественное заболевание, злокачественное заболевание толстой и прямой кишки, злокачественное заболевание яичника, злокачественное заболевание молочной железы, злокачественное заболевание поджелудочной железы, карциномы желудка, злокачественное заболевание мочевого пузыря, злокачественное заболевание пищевода, мезотелиома, меланома, злокачественное заболевание головы и шеи, злокачественное заболевание щитовидной железы, саркома, злокачественное заболевание предстательной железы, глиобластома, злокачественное заболевание шейки матки, карцинома вилочковой железы, лейкоз, лимфомы, миеломы, грибовидные гранулемы, злокачественное заболевание клеток Меркеля и другие гематологические злокачественные новообразования.

Наличие и/или экспрессия уровня/количества биомаркера (например, PD-L1) могут быть определены качественно и/или количественно на основании любого приемлемого критерия, известного в уровне техники, в том числе без ограничения ДНК, mPvNA, cDNA, белки, фрагменты белков и/или число генных копий. Согласно некоторым вариантам осуществления наличие и/или уровни экспрессии/количества биомаркера в первом образце повышаются или возрастают по сравнению с наличием/отсутствием и/или уровнями экспрессии/количества во втором образце. Согласно некоторым вариантам осуществления наличие/отсутствие и/или уровни экспрессии/количества биомаркера в первом образце снижаются или уменьшаются по сравнению с наличием и/или уровнями экспрессии/количества во втором образце. Согласно некоторым вариантам осуществления вторым образцом является эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань. Кроме того, в настоящем документе раскрывается определение наличия/отсутствия и/или уровней экспрессии/количества гена.

Согласно некоторым вариантам осуществления каких-либо из способов повышенная экспрессия означает полное повышение на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более уровня биомаркера (например, белка или нуклеиновой кислоты (например, гена или mRNA)), выявляемого стандартными в уровне техники известными способами, такими как описываемые в настоящем документе, по сравнению с эталонным образцом, эталонной клеткой, эталонной тканью, контрольным образцом, контрольной клеткой или контрольной тканью. Согласно некоторым вариантам осуществления повышенная экспрессия означает повышение уровня экспрессии/количества биомаркера в образце, при этом повышение составляет по меньшей мере приблизительно 1,5Х, 1,75Х, 2Х, 3Х, 4Х, 5Х, 6Х, 7Х, 8Х, 9Х, 10Х, 25Х, 50Х, 75Х или 100Х уровень экспрессии/количество соответствующего биомаркера в эталонном образце, эталонной клетке, эталонной ткани, контрольном образце, контрольной клетке или контрольной ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления повышение экспрессии означает полное повышение более чем в приблизительно 1,5 раза, приблизительно 1,75 раза, приблизительно 2 раза, приблизительно 2,25 раза, приблизительно 2,5 раза, приблизительно 2,75 раза, приблизительно 3,0 раза или приблизительно 3,25 раза по сравнению с эталонным образцом, эталонной клеткой, эталонной тканью, контрольным образцом, контрольной клеткой или контрольной тканью или внутренним контролем (например, конституционным геном).

Согласно некоторым вариантам осуществления каких-либо из способов пониженная экспрессия означает полное снижение на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более уровня биомаркера (например, белка или нуклеиновой кислоты (например, гена или mRNA)), выявляемого стандартными в уровне техники известными способами, такими как описываемые в настоящем документе, по сравнению с эталонным образцом, эталонной клеткой, эталонной тканью, контрольным образцом, контрольной клеткой или контрольной тканью. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение экспрессия означает снижение уровня экспрессии/количества биомаркера в образце, при этом снижение составляет по меньшей мере приблизительно 0,9Х, 0,8Х, 0,7Х, 0,6Х, 0,5Х, 0,4Х, 0,3Х, 0,2Х, 0,1X, 0,05Х или 0,01Х уровень экспрессии/количество соответствующего биомаркера в эталонном образце, эталонной клетке, эталонной ткани, контрольном образце, контрольное клетке или контрольной ткани.

Наличие и/или уровень экспрессии/количество различных биомаркеров в образце могут быть проанализированы рядом методов, многие из которых известны в уровне техники и понятны специалисту в данной области, в том числе без ограничения иммуногистохимические («IHC»), анализ вестерн-блоттинга, иммунопреципитация, анализы молекулярного связывания, ELISA, ELIFA, клеточная сортировка с активацией флуоресценции (FACS), MassARRAY, протеомические, количественные анализы крови (например, ELISA на сыворотке крови), биохимические анализы ферментативной активности, in situ гибридизация, анализ нозерн-блоттинга, полимеразная цепная реакция (PCR), в том числе количественная PCR в реальном времени (qRT-PCR), и другие способы выявления типа амплификации, такие как, например, анализ разветвленных цепей ДНК, SISBA, ТМА и т.п.), RNA-Seq, FISH, анализ с использованием микрочипа, исследование профиля генной экспрессии и/или серийный анализ генной экспрессии (SAGE), а также любой из широкого ряда анализов, которые могут быть выполнены посредством испытания на белковой, генной и/или тканевой матрице. Типичные протоколы для оценки статуса генов и генных продуктов можно найти, например, в Ausubel et al. eds., 1995, Current Протоколе In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis). Также могут быть использованы мультиплексированные иммуноанализы, такие как доступные из Rules Based Medicine или Meso Scale Discovery (MSD).

Согласно некоторым вариантам осуществления уровень экспрессии биомаркера определяют с использованием способа, включающего (а) выполнение исследования профиля генной экспрессии, PCR (такой как rtPCR или qRT-PCR), RNA-Seq, анализа с использованием микрочипа, SAGE, метода MassARRAY или FISH на образце (таком как образец злокачественной опухоли субъекта); и b) определение наличия и/или уровня экспрессии/количества биомаркера в образце. Согласно некоторым вариантам осуществления, способ с использованием микрочипа включает применение микрочипа, содержащего одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, которые могут гибридизироваться при жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вышеупомянутый ген, или содержащего один или несколько полипептидов (таких как пептиды или антитела), которые могут связываться с одним или несколькими из белков, кодируемых вышеупомянутыми генами. Согласно одному варианту осуществления методом PCR является qPCR. Согласно одному варианту осуществления методом PCR является мультиплексная PCR. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию гена измеряют с помощью микрочипа. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию гена измеряют с помощью qRT-PCR. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию измеряют с помощью мультиплексной PCR.

Способы для оценки mRNA в клетках хорошо известны и включают, например, анализы гибридизации с использованием комплементарных ДНК-зондов (такие как in situ гибридизация с использованием меченных рибозондов, специфичных для одного или нескольких генов, нозерн-блоттинг и родственные методики) и различные анализы амплификации нуклеиновой кислоты (такие как RT-PCR с использованием комплементарных праймеров, специфичных для одного или нескольких генов, и другие способы выявления амплификационного типа, такие как, например, анализ разветвленных цепей ДНК, SISBA, ТМА и т.п.).

Образцы от млекопитающих можно удобно анализировать по mRNA с использованием нозерн-, дот-блоттинга или PCR-анализа. Кроме того, такие способы могут включать одну или несколько стадий, которые позволяют определить содержание целевой mRNA в биологическом образце (например, одновременной проверкой содержания сравнительной контрольной последовательности mRNA «конститутивного» гена, такого как член актинового семейства). Необязательно может быть определена последовательность амплифицированной целевой cDNA.

Необязательные способы в соответствии с настоящим изобретением включают протоколы, согласно которым проверяют или выявляют mRNA, такие как целевые mRNA, в тканевом или клеточном образце технологиями с использованием микрочипов. С использованием микрочипов нуклеиновой кислоты образцы тестируемой и контрольной mRNA от образцов тестируемой и контрольной ткани обратно транскрибируют и метят с образованием зондов cDNA. Затем зонды гибридизируют с матрицей нуклеиновых кислот, иммобилизованных на твердой подложке. Матрица выполнена так, что последовательность и позиция каждого члена матрицы известны. Например, отбор генов, чья экспрессия коррелирует с повышенной или пониженной клинической пользой антиангиогенной терапии, может быть осуществлен на твердой подложке. Гибридизация меченого зонда с конкретным членом матрицы показывает, что образец, из которого получен зонд, экспрессирует этот ген.

Согласно некоторым вариантам осуществления наличие и/или уровень экспрессии/количество измеряют путем наблюдения за уровнями экспрессии белка вышеупомянутого гена. Согласно некоторым вариантам осуществления способ включает осуществление контакта биологического образца с антителами против биомаркера (например, антителами против PD-L1), описываемого в настоящем документе, при условиях, позволяющих связывание биомаркера, и выявление формирующегося комплекса между антителами и биомаркером. Таким способом может быть in vitro или in vivo способ. Согласно одному варианту осуществления антитело используют для отбора субъектов, подходящих для терапии антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, например, биомаркер для отбора индивидуумов.

Согласно некоторым вариантам осуществления наличие и/или уровень экспрессии/количество биомаркерных белков в образце проверяют с использованием IHC и протоколов окрашивания. IHC окрашивание срезов ткани, как было показано, является надежным способом определения или выявления наличия белков в образце. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов биомаркером PD-L1 является PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления PD-L1 выявляют с помощью иммуногистохимии. Согласно некоторым вариантам осуществления повышенной экспрессией биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума является повышенная экспрессия белка, и согласно следующим вариантам осуществления ее определяют с использованием IHC. Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии биомаркера определяют с использованием способа, включающего (а) выполнение IHC анализа образца (такого как образец субъекта со злокачественным заболеванием) с антителом и b) определение уровня экспрессии биомаркера в образце. Согласно некоторым вариантам осуществления интенсивность IHC окрашивания определяют относительно эталона. Согласно некоторым вариантам осуществления эталоном является эталонное значение. Согласно некоторым вариантам осуществления эталоном является эталонный образец (например, контрольный образец окрашивания линии клеток или образец ткани от пациента без злокачественного заболевания).

IHC может быть выполнена в комбинации с дополнительными методиками, такими как морфологическое окрашивание и/или флуоресцентная гибридизация in-situ. Доступны два общих способа IHC - прямой и опосредованный анализы. Согласно первому анализу связывание антитела с целевым антигеном определяют непосредственно. При таком прямом анализе применяют меченый реагент, такой как флуоресцентная метка или меченное ферментом первичное антитело, который может быть визуализирован без дополнительного взаимодействия антитела. В типичном опосредованном анализе неконъюгированное первичное антитело связывается с антигеном, а затем меченое вторичное антитело связывается с первичным антителом. Если вторичное антитело конъюгируют с ферментной меткой, добавляют хромогенный или фторогенный субстрат для обеспечения визуализации антигена. Происходит сигнальная амплификация, поскольку несколько вторичных антител могут реагировать с различными эпитопами на первичном антителе.

Первичное и/или вторичное антитела, используемые для иммуногистохимии, как правило, будут меченными выявляемым фрагментом. Доступно множество меток, которые могут быть, как правило, сгруппированы в следующие категории: (а) радиоизотопы, такие как ³⁵S, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³Н, и ¹³¹I; (b) частицы коллоидного золота; (с) флуоресцентные метки, в том числе без ограничения хелаты редкоземельных элементов (хелаты европия), техасский красный, родамин, флуоресцеин, дансил, лиссамин, умбеллиферон, фикокритерин, фикоцианин или коммерчески доступные фторофоры, такие как SPECTRUM ORANGE7 и SPECTRUM GREEN7, и/или производные какого-либо одного или нескольких из вышеупомянутых; (d) различные доступные фермент-субстратные метки, некоторые из которых описаны в патенте США №4275149. Примеры ферментных меток включают в себя люциферазы (например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу; патент США №4737456), люцциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдигидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизозоим, сахаридоксидазы (например, глюкозоксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдигидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п.

Примеры фермент-субстратных комбинаций включают в себя, например, пероксидазу хрена (HRPO) с перекисью водорода в качестве субстрата; щелочную фосфатазу (АР) с пара-нитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата и β-D-галактозидазу (β-D-Gal) с хромогенным субстратом (например, п-нитрофенил-β-D-галактозидазу) или фторогенным субстратом (например, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидазу). Для их общего обзора см. патенты США №№4275149 и 4318980.

Согласно некоторым вариантам осуществления каких-либо из способов PD-L1 выявляют с помощью иммуногистохимии с использованием диагностического антитела против PD-L1 (т.е. первичного антитела). Согласно некоторым вариантам осуществления диагностическое антитело против PD-L1 специфично связывается с человеческим PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления диагностическим антителом против PD-L1 является антитело, не являющееся человеческим. Согласно некоторым вариантам осуществления диагностическим антителом против PD-L1 является антитело крысы, мыши или кролика. Согласно некоторым вариантам осуществления диагностическим антителом против PD-L1 является моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления диагностическое антитело против PD-L1 является непосредственно меченым.

Полученные таким образом образцы могут быть приготовлены в виде препарата, покрытого покровным стеклом. Затем осуществляют оценку микроскопического препарата, например, с использованием микроскопа, и может быть использован критерий интенсивности окрашивания, традиционно применяемый в уровне техники. Согласно одному варианту осуществления следует понимать, что, если клетки и/или ткань из опухоли проверяют с использованием IHC, то, как правило, определяют или оценивают окрашивание опухолевой клетки и/или ткани (по сравнению со стромальной или окружающей тканью, которая может присутствовать в образце). Согласно некоторым вариантам осуществления следует понимать, что, если клетки и/или ткань из опухоли проверяют с использованием IHC, то окрашивание включает определение или оценивание инфильтрующихся в опухоль иммунных клеток, в том числе внутриопухолевых или перитуморальных иммунных клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления наличие биомаркера PD-L1 выявляют с помощью IHC в >0% образца, по меньшей мере в 1% образца, по меньшей мере в 5% образца, по меньшей мере 10% в образца.

Согласно некоторым вариантам осуществления каких-либо из способов, анализов и/или наборов наличие биомаркера PD-L1 выявляют с помощью IHC с окрашиванием PD-L1 какой-либо интенсивности. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют с помощью IHC как слабую интенсивность окрашивания. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют с помощью IHC как среднюю интенсивность окрашивания. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют с помощью IHC как сильную интенсивность окрашивания.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют с помощью IHC в опухолевых клетках, инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках и их комбинациях.

Антитела против PD-L1, приемлемые для применения в IHC, хорошо известны в уровне техники. Специалисту в данной области будет понятно, что дополнительные приемлемые антитела против PD-L1 могут быть идентифицированы и охарактеризованы путем сравнения с антителом против PD-L1 с использованием протокола IHC, раскрываемого в настоящем документе, например.

Положительные контроли ткани готовили в качестве образца с использованием плацентарной ткани и ткани миндалевидной железы (сильная интенсивность окрашивания PD-L1); клеток HEK-293, трансфицированных рекомбинантным человеческим PD-L1 (варьирующие степени интенсивности окрашивания PD-L1 от слабой, средней до сильной интенсивности). Далее представлена информация, касающаяся типичного критерия IHC PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления далее представлен критерий для диагностического оценивания IHC PD-L1.

Согласно альтернативным способам можно обеспечивать контакт образца с антителом, специфичным к указанному биомаркеру, при условиях, достаточных для образования комплекса антитело-биомаркер, с последующим выявлением указанного комплекса. Присутствие биомаркера может быть определено рядом способов, таких как процедуры вестерн-блоттинга и ELISA, для анализа широкого многообразия тканей и образцов, в том числе плазмы или сыворотки крови. Доступен широкий ряд методик иммуноанализа с использованием такого формата анализа, см., например, патенты США №№4016043, 4424279 и 4018653. Они включают и моносайтовые и двухсайтовые или «сэндвич»-анализы неконкурентных типов, а также традиционные анализы конкурентного связывания. Эти анализы также включают прямое связывание меченого антитела с целевым биомаркером.

Наличие и/или уровень экспрессии/количество селектируемого биомаркера в образце ткани или клетки также могут быть проверены с помощью анализов функции или активности. Например, если биомаркером является фермент, то можно провести известные в уровне техники анализы по определению или выявлению наличия активности данного фермента в образце ткани или клетки.

Согласно определенным вариантам осуществления образцы нормализуют и по различиям в количестве анализируемого биомаркера, и по изменчивости в качестве используемых образцов, и по изменчивости между сериями анализов. Такая нормализация может быть выполнена путем измерения и включения экспрессии определенных биомаркеров нормализации, в том числе хорошо известных конститутивных генов. В качестве альтернативы, нормализация может быть основана на среднем или медианном сигнале всех анализируемых генов или большой их подгруппы (подход общей нормализация). С использованием подхода «gene-by-gene» измеренное нормализованное количество mRNA опухоли пациента или белка сравнивают с количеством, обнаруженным в эталонном наборе. Нормализованные уровни экспрессии для каждых mRNA или белка на тестируемую опухоль на пациента могут быть выражены как процентное отношение уровня экспрессии, измеренного в эталонном наборе. Измеренные наличие и/или уровень экспрессии/количество в образце конкретного пациента, подлежащего анализу, будут попадать в некоторый процентиль в этом диапазоне, который может быть определен способами, хорошо известными в уровне техники.

Согласно одному варианту осуществления образцом является клинический образец. Согласно другому варианту осуществления образец используют в диагностическом анализе. Согласно некоторым вариантам осуществления образец получают из первичной или метастатической опухоли. Биопсию ткани часто используют для получения типичного фрагмента опухолевой ткани. В качестве альтернативы, опухолевые клетки могут быть получены опосредованно в форме тканей или жидкостей, которые, как известно или предполагается, содержат представляющие интерес опухолевые клетки. Например, образцы поражений злокачественной опухолью легкого могут быть получены путем резекции, бронхоскопии, аспирации тонкой иглой, промываний бронхов или из слюны, плевральной жидкости или крови. Гены или генные продукты могут быть выявлены из злокачественной опухоли или ткани опухоли или из других образцов организма, таких как моча, слюна, сыворотка крови или плазма. Методики, подобные обсуждаемым выше для выявления целевых генов или генных продуктов в злокачественных образцах, могут быть применены для других образцов организма. Злокачественные клетки могут отторгаться от поражений злокачественной опухолью и обнаруживаться в таких образцах организма. Путем скрининга таких образцов организма можно осуществить ранний диагноз образца для таких злокачественных опухолей. Кроме того, прогресс терапии можно легче контролировать путем тестирования таких образцов организма по целевым генам или генным продуктам.

Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань представляют собой отдельный образец или несколько комбинированных образцов от одного и того же субъекта или индивидуума, которые получают в один или несколько моментов времени, отличных от тех при которых получают тестируемый образец. Например, эталонный образец, эталонную клетку, эталонную ткань, контрольный образец, контрольную клетку или контрольную ткань получают в более ранний момент времени от одного и того же субъекта или индивидуума, чем время получения тестируемого образца. Такие эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань могут быть применимыми, если эталонный образец получают при начальном диагнозе злокачественной опухоли, а тестируемый образец получают позже, когда злокачественная опухоль становится метастатической.

Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань являются несколькими комбинированными образцами от одного или нескольких здоровых индивидуумов, которые не являются субъектами или пациентами. Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань являются несколькими комбинированными образцами от одного или нескольких индивидуумов с заболеванием или нарушением (например, злокачественной опухолью), которые не являются субъектами или пациентами. Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань являются объединенными образцами РНК из нормальных тканей или объединенными образцами плазмы или сыворотки крови от одного или нескольких индивидуумов, которые не являются субъектами или пациентами. Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань являются объединенными образцами РНК из тканей опухоли или объединенными образцами плазмы или сыворотки крови от одного или нескольких индивидуумов с заболеванием или нарушением (например, злокачественной опухолью), которые не являются субъектами или пациентами.

Согласно некоторым вариантам осуществления образцом является образец ткани от индивидуума. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является образец опухолевой ткани (например, тканевый биоптат). Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань легкого. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань почки. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является кожная ткань. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань поджелудочной железы. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань желудка. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань мочевого пузыря. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань пищевода. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является мезотелиальная ткань. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань молочной железы. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань щитовидной железы. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань толстой и прямой кишки. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань головы и шеи. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является остеосаркомная ткань. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань предстательной железы. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является ткань яичника, НСС (печени), клетки крови, лимфатические узлы, кость/костный мозг.

Согласно некоторым вариантам осуществления каких-либо из способов заболеванием или нарушением является опухоль. Согласно некоторым вариантам осуществления опухолью является злокачественная опухоль (т.е. злокачественное заболевание). Согласно некоторым вариантам осуществления опухолью и/или злокачественным заболеванием является солидная опухоль или несолидная или опухоль мягкой ткани. Примеры опухолей мягкой ткани включают в себя лейкоз (например, хронический миелогенный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, острый лимфобластомный лейкоз взрослых, острый миелогенный лейкоз, острый лимфобластомный лейкоз зрелых В-клеток, хронический лимфоцитарный лейкоз, пролимфоцитарный лейкоз или лейкоз ворсистых клеток) или лимфому (например, неходжкинскую лимфому, Т-клеточную лимфому кожи или болезнь Ходжкина). Солидная опухоль включает в себя какое-либо злокачественное заболевание тканей организма, отличных от крови, костного мозга или лимфатической системы. Солидные опухоли могут быть далее поделены на опухоли, происходящие из эпителиальных клеток, и опухоли, происходящие из клеток, отличных от эпителиальных. Примеры солидных опухолей из эпителиальных клеток включают в себя опухоли желудочно-кишечного тракта, толстой кишки, толстой и прямой кишки (например, базалоидную карциному толстой и прямой кишки), молочной железы, предстательной железы, легкого, почки, печени, поджелудочной железы, яичника (например, эндометриоидную карциному яичника), головы и шеи, ротовой полости, желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника, толстого кишечника, анального канала, желчного пузыря, губы, носоглотки, кожи, матки, мужского полового органа, органов мочевыделения (например, карциному уротелия, диспластическую карциному уротелия, переходно-клеточную карциному), мочевого пузыря и кожи. Солидные опухоли неэпителиального происхождения включают в себя саркомы, опухоли головного мозга и опухоли костей. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественным заболеванием является немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественным заболеванием является местно распространенный или метастатический немелкоклеточный рак легкого второй линии или третьей линии терапии. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественным заболеванием является аденокарцинома. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественным заболеванием является сквамозноклеточная карцинома.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в образце с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из FACS, вестерн-блоттинга, ELISA, иммунопреципитации, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, радио иммуно анализа, дот-блоттинга, иммунологических анализов, HPLC, поверхностного плазмонного резонанса, оптической спектроскопии, масс-спектрометрии, HPLC, qPCR, RT-qPCR, мультиплексной qPCR или RT-qPCR, RNA-Seq, микроматричного анализа, SAGE, метода MassARRAY и FISH, а также их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют с использованием анализа FACS. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркером PD-L1 является PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию PD-L1 выявляют в образцах крови. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию PD-L1 выявляют в циркулирующих иммунных клетках в образцах крови. Согласно некоторым вариантам осуществления циркулирующей иммунной клеткой является CD3+/CD8+ Т-клетка. Согласно некоторым вариантам осуществления перед анализом иммунные клетки выделяют из образцов крови. Для выделения/обогащения такой популяции клеток может быть использован любой приемлемый способ, в том числе без ограничения клеточный сортинг. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия PD-L1 повышается в образцах от индивидуумов, которые отвечают на лечение ингибитором сигнального пути PD-L1/PD-1, таким как антитело против PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия PD-L1 повышается в циркулирующих иммунных клетках, таких как CD3+/CD8+ Т-клетки, в образцах крови.

Терапевтические способы

Представлены способы лечения заболевания или нарушения у индивидуума, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума и введение индивидууму эффективного количества антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1.

Кроме того, настоящий документ относится к лечению заболевания или нарушения у индивидуума, включающему введение индивидууму эффективного количества антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом лечение основывается на наличии биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выбирают из группы, состоящей из PD-L1, PD-1, PD-L2 и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркером PD-L1 является связанный с иммунной системой маркер. Связанный с иммунной системой маркер относится к маркеру, который экспрессируется иммунными клетками или другими клетками (например, опухолевыми клетками, эндотелиальными клетками, фибробластами или другими стромальными клетками). Если экспрессируется клетками, отличными от иммунных клеток, маркер может быть вовлечен в регуляцию биологии и функции иммунных клеток, такую как активация, прайминг, распознавание и представление антигена, продуцирование цитокина и хемокина, пролиферация, миграция, выживаемость, продуцирование антитела и другие. Согласно некоторым вариантам осуществления связанным с иммунной системой маркером является связанный с Т-клеткой маркер. Согласно некоторым вариантам осуществления связанный с Т-клеткой маркер выбирают из группы, состоящей из CD8A, IFN-g, EOMES, гранзима-А, CXCL9 и каких-либо их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления связанный с иммунной системой маркер выбирают из группы, состоящей из CX3CL1, CD45RO, IDO1, галектина 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления наличие биомаркера PD-L1 указывает на то, что индивидуум, вероятно, будет получать повышенную клиническую пользу от лечения его антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления повышенная клиническая польза включает относительное повышение одного или нескольких из следующих показателей: общая выживаемость (OS), выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR) и их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 отсутствует в образце, если он составляет 0% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует в образце, если он составляет более чем 0% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 1% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 5% образца. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 присутствует, составляя по меньшей мере 10% образца.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в образце с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из FACS, вестерн-блоттинга, ELISA, иммунопреципитации, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, радио иммуно анализа, дот-блоттинга, иммунологических анализов, HPLC, поверхностного плазмонного резонанса, оптической спектроскопии, масс-спектрометрии, HPLC, qPCR, RT-qPCR, мультиплексной qPCR или RT-qPCR, RNA-Seq, микроматричного анализа, SAGE, метода MassARRAY и FISH, а также их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в образце с помощью экспрессии белка. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию белка определяют с помощью иммуногистохимии (IHC). Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют с использованием антитела против PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как слабую интенсивность окрашивания с помощью IHC. Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как умеренную интенсивность окрашивания с помощью ШС.Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют как сильную интенсивность окрашивания с помощью IHC.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в опухолевых клетках, инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, стромальных клетках и каких-либо их комбинациях с использованием анализа экспрессии белка, такого как IHC анализ. Инфильтрующиеся в опухоль иммунные клетки включают в себя без ограничения внутриопухолевые иммунные клетки, перитуморальные иммунные клетки или какие-либо их комбинации, другие клетки опухолевой стромы (например, фибробласты). Такими инфильтрующимися в опухоль иммунными клетками могут быть Т-лимфоциты (такие как CD8+ Т-лимфоциты и/или CD4+ Т-лимфоциты), В-лимфоциты или другие происходящие из костного мозга клетки, в том числе гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), моноциты, макрофаги, дендритные клетки (т.е. интердигитальные дендритные клетки), гистиоциты и клетки-натуральные киллеры.

Согласно некоторым вариантам осуществления окрашивание на биомаркер PD-L1 выявляют как мембранное окрашивание, цитоплазматическое окрашивание и их комбинации. Согласно другим вариантам осуществления отсутствие биомаркера PD-L1 выявляют как отсутствие окрашивания или неокрашивание в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в образце с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию нуклеиновой кислоты определяют с использованием qPCR, RT-qPCR, мультиплексной qPCR или RT-qPCR, RNA-Seq, микроматричного анализа, SAGE, метода MassARRAY или FISH.

Согласно некоторым вариантам осуществления биомаркер PD-L1 выявляют в опухолевых клетках, инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, стромальных клетках и каких-либо их комбинациях с использованием экспрессии нуклеиновой кислоты, например, анализом qPCR.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, выбирают из группы, состоящей из антагониста, связывающегося с PD-L1, и антагониста, связывающегося с PD-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по лигандному связыванию. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с PD-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с В7-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 и с PD-1, и с В7-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающимся с PD-L1, является антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антителом является моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антителом является человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонистом, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по лигандному связыванию. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L2. Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов, анализов и/или наборов антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 и с PD-L1, и с PD-L2.

Примеры антитела против PD-L1, применимого для способов в соответствии с настоящим изобретением, и способы его получения описываются в РСТ заявке на выдачу патента WO 2010/077634 А1, которая включена в настоящем документ посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело против PD-L1 способно ингибировать связывание между PD-L1 и PD-1 и/или между PD-L1 и В7-1. Согласно некоторым вариантам осуществления антителом против PD-L1 является моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антителом против PD-L1 является фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из фрагментов Fab, Fab'-SH, Fv, scFv и (Fab')2. Согласно некоторым вариантам осуществления антителом против PD-L1 является гуманизированное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антителом против PD-L1 является антитело человека.

Согласно одному варианту осуществления антитело против PD-L1 содержит полипептид вариабельной области тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где

(а) последовательностью HVR-H1 является GFTFSX1SWIH (SEQ ID NO: 1);

(b) последовательностью HVR-H2 является AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO: 2);

(c) последовательностью HVR-H3 является RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3); кроме того, где X1 представляет собой D или G; Х2 представляет собой S или L; Х3 представляет собой Т или S.

В одном конкретном аспекте X1 представляет собой D; Х2 представляет собой S, и Х3 представляет собой Т. В другом аспекте полипептид дополнительно содержит каркасные последовательности вариабельной области тяжелой цепи, помещенные между HVR согласно формуле (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). В следующем аспекте каркасные последовательности происходят от человеческих консенсусных каркасных последовательностей. В дополнительном аспекте каркасные последовательности составляют консенсусный каркас подгруппы III VH. В еще одном аспекте по меньшей мере одна из каркасных последовательностей является следующей

HC-FR1, представляющей собой EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 4),

HC-FR2, представляющей собой WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 5),

HC-FR3, представляющей собой RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 6),

HC-FR4, представляющей собой WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 7).

В еще одном аспекте полипептид тяжелой цепи дополнительно объединяется с вариабельной областью легкой цепи, содержащей HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где

(a) последовательность HVR-L1 представляет собой RASQX4X5X6TX7X8A (SEQ ID NO: 8);

(b) последовательность HVR-L2 представляет собой SASX9LX10S (SEQ ID NO: 9);

(c) последовательность HVR-L3 представляет собой QQX11X12X13X14PX15T (SEQ ID NO: 10);

кроме того, где Х4 представляет собой D или V; Х5 представляет собой V или I; Х6 представляет собой S или N; Х7 представляет собой А или F; Х8 представляет собой V или L; Х9 представляет собой F или Т; Х10 представляет собой Y или А; X11 представляет собой Y, G, F или S; Х12 представляет собой L, Y, F или W; Х13 представляет собой Y, N, А, Т, G, F или I; Х14 представляет собой Н, V, Р, Т или I; X15 представляет собой A, W, R, Р или Т.

В еще одном аспекте Х4 представляет собой D; Х5 представляет собой V; Х6 представляет собой S; Х7 представляет собой А; Х8 представляет собой V; Х9 представляет собой F; Х10 представляет собой Y; X11 представляет собой Y; Х12 представляет собой L; Х13 представляет собой Y; Х14 представляет собой Н; X15 представляет собой А. В еще одном аспекте легкая цепь дополнительно содержит каркасные последовательности вариабельной области легкой цепи, помещенные между HVR согласно формуле (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В еще одном аспекте каркасные последовательности происходят от человеческих консенсусных каркасных последовательностей. В еще одном аспекте каркасные последовательности составляют консенсусный каркас каппа I VL. В еще одном аспекте по меньшей мере одна из каркасных последовательностей является следующей

LC-FR1, представляющей собой DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 11),

LC-FR2, представляющей собой WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 12),

LC-FR3, представляющей собой GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 13),

LC-FR4, представляющей собой FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 14).

Согласно другому варианту осуществления представлено выделенное антитело против PD-L1 или связывающий антиген фрагмент, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, в которой

(a) тяжелая цепь содержит HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где дополнительно

(i) последовательность HVR-H1 представляет собой GFTFSX1SWIH (SEQ ID NO: 1),

(ii) последовательность HVR-H2 представляет собой AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO: 2),

(iii) последовательность HVR-H3 представляет собой RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3);

(b) легкая цепь содержит HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где дополнительно

(i) последовательность HVR-L1 представляет собой RASQX4X5X6TX7X8A (SEQ ID NO: 8),

(ii) последовательность HVR-L2 представляет собой SASX9LX10S (SEQ ID NO: 9),

(iii) последовательность HVR-L3 представляет собой QQX11X12X13X14PX15T (SEQ ID NO: 10);

кроме того, где X1 представляет собой D или G; Х2 представляет собой S или L; Х3 представляет собой Т или S; Х4 представляет собой D или V; Х5 представляет собой V или I; Х6 представляет собой S или N; Х7 представляет собой А или F; Х8 представляет собой V или L; Х9 представляет собой F или Т; Х10 представляет собой Y или А; X11 представляет собой Y, G, F или S; Х12 представляет собой L, Y, F или W; Х13 представляет собой Y, N, А, Т, G, F или I; Х14 представляет собой Н, V, Р, Т или I; X15 представляет собой A, W, R, Р или Т.

Согласно конкретному аспекту X1 представляет собой D; Х2 представляет собой S, и Х3 представляет собой Т. В другом аспекте Х4 представляет собой D; Х5 представляет собой V; Х6 представляет собой S; Х7 представляет собой А; Х8 представляет собой V; Х9 представляет собой F; Х10 представляет собой Y; X11 представляет собой Y; Х12 представляет собой L; Х13 представляет собой Y; Х14 представляет собой Н; X15 представляет собой А. В следующем аспекте X1 представляет собой D; Х2 представляет собой S, и Х3 представляет собой Т, Х4 представляет собой D; Х5 представляет собой V; Х6 представляет собой S; Х7 представляет собой А; Х8 представляет собой V; Х9 представляет собой F; Х10 представляет собой Y; X11 представляет собой Y; Х12 представляет собой L; Х13 представляет собой Y; Х14 представляет собой Н, и Х15 представляет собой А.

В дополнительном аспекте вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько каркасных последовательностей, помещенных между HVR как (НС-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), а вариабельные области легкой цепи содержат одну или несколько каркасных последовательностей, помещенных между HVR как (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В еще одном аспекте каркасные последовательности происходят от человеческих консенсусных каркасных последовательностей. В еще одном аспекте каркасные последовательности тяжелой цепи происходят от последовательности подгруппы I, II или III по Kabat. В еще одном аспекте каркасная последовательность тяжелой цепи представляет собой консенсусный каркас подгруппы III VH. В еще одном аспекте одна или несколько из каркасных последовательностей тяжелой цепи являются следующими

В еще одном аспекте каркасные последовательности легкой цепи происходят от последовательности каппа подгруппы I, II или III по Kabat. В еще одном аспекте каркасные последовательности легкой цепи составляют консенсусный каркас каппа I VL. В еще одном аспекте одна или несколько из каркасных последовательностей легкой цепи являются следующими

В следующем конкретном аспекте антитело, кроме того, содержит человеческую или мышиную константную область. В еще одном аспекте человеческую константную область выбирают из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В следующем конкретном аспекте человеческой константной областью является IgG1. В еще одном аспекте мышиную константную область выбирают из группы, состоящей из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В еще одном аспекте мышиной константной областью является IgG2A. В следующем конкретном аспекте антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В следующем конкретном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом «безэффекторной Fc-мутации» или агликозилирования. Согласно следующему варианту осуществления безэффекторная Fc-мутация представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

Согласно еще одному варианту осуществления представлено антитело против PD-L1, содержащее последовательность вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, где

(а) тяжелая цепь дополнительно содержит последовательность HVR-H1, HVR-Н2 и HVR-H3, характеризующуюся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 15), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 16) и RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3), соответственно, или

(b) легкая цепь дополнительно содержит последовательность HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, характеризующуюся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 17), SASFLYS (SEQ ID NO: 18) и QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 19), соответственно.

Согласно конкретному аспекту идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В другом аспекте вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько каркасных последовательностей, помещенных между HVR как (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), а вариабельные области легкой цепи содержат одну или несколько каркасных последовательностей, помещенных между HVR как (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В следующем аспекте каркасные последовательности происходят от человеческих консенсусных каркасных последовательностей. В еще одном аспекте каркасные последовательности тяжелой цепи происходят от последовательности подгруппы I, II или III по Kabat. В еще одном аспекте каркасная последовательность тяжелой цепи представляет собой консенсусный каркас подгруппы III VH. В еще одном аспекте одна или несколько из каркасных последовательностей тяжелой цепи являются следующими

В еще одном аспекте каркасные последовательности легкой цепи происходят от последовательности каппа подгруппы I, II или III по Kabat. В еще одном аспекте каркасные последовательности легкой цепи составляют консенсусный каркас каппа I VL. В еще одном аспекте одна или несколько из каркасных последовательностей легкой цепи являются следующими

В следующем конкретном аспекте антитело дополнительно содержит человеческую или мышиную константную область. В еще одном аспекте человеческая константная область выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В следующем конкретном аспекте человеческая константная область представляет собой IgG1. В еще одном аспекте мышиная константная область выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В еще одном аспекте мышиная константная область представляет собой IgG2A. В следующем конкретном аспекте антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В следующем конкретном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом «безэффекторной Fc-мутации» или агликозилирования. Согласно следующему варианту осуществления безэффекторная Fc-мутация представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

Согласно следующему варианту осуществления представлено выделенное антитело против PD-L1, содержащее последовательность вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, в которой

(a) последовательность тяжелой цепи характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к последовательности тяжелой цепи Y

(b) последовательности легкой цепи характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к последовательность легкой цепи

Согласно конкретному аспекту идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В другом аспекте вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько каркасных последовательностей, помещенных между HVR как (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), а вариабельные области легкой цепи содержат одну или несколько каркасных последовательностей, помещенных между HVR как (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В следующем аспекте каркасные последовательности происходят от человеческих консенсусных каркасных последовательностей. В дополнительном аспекте каркасные последовательности тяжелой цепи происходят от последовательности подгруппы I, II или III по Kabat. В еще одном аспекте каркасная последовательность тяжелой цепи представляет собой консенсусный каркас подгруппы III VH. В еще одном аспекте одна или несколько из каркасных последовательностей тяжелой цепи являются следующими

В еще одном аспекте каркасные последовательности легкой цепи происходят от последовательности каппа подгруппы I, II или III по Kabat. В еще одном аспекте каркасные последовательности легкой цепи составляют консенсусный каркас каппа I VL. В еще одном аспекте одна или несколько из каркасных последовательностей легкой цепи являются следующими

В следующем конкретном аспекте антитело дополнительно содержит человеческую или мышиную константную область. В еще одном аспекте человеческая константная область выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В следующем конкретном аспекте человеческая константная область представляет собой IgG1. В еще одном аспекте мышиная константная область выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В еще одном аспекте мышиная константная область представляет собой IgG2A. В следующем конкретном аспекте антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В следующем конкретном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом продуцирования в прокариотических клетках. В следующем конкретном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом «безэффекторной Fc-мутации» или агликозилирования. Согласно следующему варианту осуществления безэффекторная Fc-мутация представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

Согласно следующему варианту осуществления настоящее изобретение относится к композициям, содержащим какое-либо из вышеописываемых антител против PD-L1 в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем.

Согласно следующему варианту осуществления представлена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность вариабельной области легкой цепи или тяжелой цепи антитела против PD-L1, в которой

(a) тяжелая цепь дополнительно содержит последовательность HVR-H1, HVR-Н2 и HVR-H3, характеризующуюся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 15), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 16) и RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3), соответственно, a

(b) легкая цепь дополнительно содержит последовательность HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, характеризующуюся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 17), SASFLYS (SEQ ID NO: 18) и QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 19), соответственно.

Согласно конкретному аспекту идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В аспекте вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько каркасных последовательностей, помещенных между HVR как (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), а вариабельные области легкой цепи содержат одну или несколько каркасных последовательностей, помещенных между HVR как (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). В следующем аспекте каркасные последовательности происходят от человеческих консенсусных каркасных последовательностей. В дополнительном аспекте каркасные последовательности тяжелой цепи происходят от последовательности подгруппы I, II или III по Kabat. В еще одном аспекте каркасная последовательность тяжелой цепи представляет собой консенсусный каркас подгруппы III VH. В еще одном аспекте одна или несколько из каркасных последовательностей тяжелой цепи являются следующими

В еще одном аспекте каркасные последовательности легкой цепи происходят от последовательности каппа подгруппы I, II или III по Kabat. В еще одном аспекте каркасные последовательности легкой цепи составляют консенсусный каркас каппа I VL. В еще одном аспекте одна или несколько из каркасных последовательностей легкой цепи являются следующими

В следующем конкретном аспекте антитело дополнительно содержит человеческую или мышиную константную область. В еще одном аспекте человеческая константная область выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В следующем конкретном аспекте человеческая константная область представляет собой IgG1. В еще одном аспекте мышиная константная область выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В еще одном аспекте мышиная константная область представляет собой IgG2A. В следующем конкретном аспекте антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В следующем конкретном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом продуцирования в прокариотических клетках. В следующем конкретном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом «безэффекторной Fc-мутации» или агликозилирования. В следующем аспекте безэффекторная Fc-мутация представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

В еще одном аспекте нуклеиновая кислота дополнительно содержит вектор, приемлемый для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей какое-либо из вышеописываемых антител против PD-L1. В следующем конкретном аспекте вектор дополнительно содержит клетку-хозяина, приемлемую для экспрессии нуклеиновой кислоты. В следующем конкретном аспекте клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку. В следующем конкретном аспекте эукариотической клеткой является клетка млекопитающего, такая как из яичника китайского хомячка (СНО).

Антитело против PD-L1 или его связывающий антиген фрагмент могут быть получены с использованием известных в уровне техники способов, например, с помощью способа, включающего культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеописываемых антител против PD-L1 или связывающий антиген фрагмент, в приемлемой для экспрессии форме, при условиях, приемлемых для продуцирования такого антитела или фрагмента, и извлечение антитела или фрагмента. Согласно следующему варианту осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело против PD-L1 или его связывающий антиген фрагмент, представленные в настоящем документе, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

А. Антитела

1. Аффинность антитела

Согласно определенным вариантам осуществления представленное в настоящем документе антитело характеризуется константой диссоциации (Kd)≤1 мкМ. Согласно одному варианту осуществления Kd измеряют анализом связывания радиомеченного антигена (RIA), выполняемым с Fab-вариантом представляющего интерес антитела и его антигена, как описано в следующем анализе. Аффинность связывания Fab с антигеном в растворе измеряют путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (¹²⁵I)-меченного антигена в присутствии серий титрований немеченого антигена, а затем захвата связанного антигена покрытым антителом Fab планшетом (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Для создания условий анализа многолуночные планшеты MICROTITER^® (Thermo Scientific) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл захватывающим антителом против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбоната натрия (рН 9,6), а затем блокируют 2% (вес/объем) альбумином бычьей сыворотки в PBS в течение двух - пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°С). В неадсорбентном планшете (Nunc #269620) 100 пМ или 26 пМ [¹²⁵I]-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с оцениванием антитела против VEGF, Fab-12 в Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Представляющий интерес Fab затем инкубируют в течение ночи; однако, инкубация может продолжаться в течение более длительного периода (например, приблизительно 65 часов) для гарантии достижения равновесия. После этого смеси переносят в планшет для захвата для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% полисорбатом 20 (TWEEN-20^®) в PBS. После высыхания планшетов добавляют по 150 мкл/лунка сцинтиллятор (MICROSCINT-20™; Packard) и планшеты считывают на счетчике гамма-излучения TOPCOUNT™ (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, который дает 20% или меньше максимального связывания, выбирают для применения в анализах конкурентного связывания.

Согласно другому варианту осуществления Kd измеряют с использованием анализов поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с чипами CM5, на которых иммобилизован антиген, при -10 единицах ответа (RU). Вкратце, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, BIACORE, Inc.) активируют с помощью N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/минута для достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции антигена вводят 1 М этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений двухкратные серийные разведения Fab (0,78 нМ - 500 нМ) вводят в PBS с 0,05% полисорбата 20 (TWEEN-20™) в качестве поверхностно-активного средства (PBST) при 25°С при скорости потока приблизительно 25 мкл/минута. Степени ассоциации (k_on) и степени диссоциации (k_off) рассчитывают с использованием простой один к одному модели связывания Лангмюра (BIACORE^® Оценивание Software версия 3.2), одновременно выравнивая сенсограммы ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение k_off/k_on См, например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Если on-скорость превышает 10⁶M^-1c^-1 при определении с помощью вышеупомянутого поверхностного плазмонного резонансного анализа, то on-скорость можно определять с использованием методики флуоресцентного гашения, которой измеряют увеличение или уменьшение интенсивности флуоресценции (возбуждение = 295 нм; эмиссия = 340 нм, 16 нм полоса пропускания) при 25°С 20 нМ антитела против антигена (форма Fab) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, как измерено спектрометром, таким как спектрофотометр, оснащенный остановленным потоком (Aviv Instruments), или 8000-серийный SLM-AMINCO™ спектрофотометр (ThermoSpectronic) со смесительной кюветой.

2. Фрагменты антитела

Согласно определенным вариантам осуществления представленным в настоящем документе антителом является фрагмент антитела. Фрагменты антитела включают в себя без ограничения фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv и scFv, a также другие описанные ниже фрагменты. Для обзора определенных фрагментов антитела см. Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Для обзора фрагментов scFv см., например, Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. также WO 93/16185 и патенты США №№5571894 и 5587458. Для обсуждения фрагментов Fab и F(ab')₂, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и характеризующихся увеличенным in vivo временем полужизни, см. патент США №5869046.

Диатела являются фрагментами антитела с двумя сайтами связывания антигена, которые могут быть двухвалентными или биспецифичными. См., например, европейский патент №404097; WO 1993/01161; Hudson et at, Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описываются в Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Однодоменные антитела являются фрагментами антитела, содержащими весь вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. Согласно определенным вариантам осуществления однодоменным антителом является однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, патент США №6248516 В1).

Фрагменты антитела могут быть получены различными методиками, в том числе без ограничения протеолитическим расщеплением интактного антитела, а также могут продуцироваться рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фагом), как описано в настоящем документе.

3. Химерные и гуманизированные антитела

Согласно определенным вариантам осуществления представленным в настоящем документе антителом является химерное антитело. Некоторые химерные антитела описываются, например, в патенте США № 4816567; и в Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Согласно одному примеру химерное антитело содержит не являющийся человеческим вариабельный участок (например, вариабельный участок, полученный от мыши, крысы, хомячка, кролика или отличного от человека примата, такого как обезьяна) и человеческий константный участок. Согласно следующему примеру химерным антителом является антитело с мутацией в механизме переключения синтеза классов, в котором класс или подкласс был изменен по сравнению с исходным антителом. Химерные антитела включают в себя их антиген-связывающие фрагменты.

Согласно определенным вариантам осуществления химерным антителом является гуманизированное антитело. Как правило, не являющееся человеческим антитело гуманизировано для снижения иммуногенности у людей при сохранении специфичности и аффинности исходного не являющегося человеческим антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или нескольких вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части), происходят от не являющегося человеческим антитела, a FR (или их части) происходят от последовательностей антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно будет содержать по меньшей мере часть человеческого константного участка. Согласно некоторым вариантам осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе замещены соответствующими остатками от не являющегося человеческим антитела (например, антитела, от которого произошли остатки HVR), например, с целью восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Гуманизированные антитела и способы их создания рассматриваются, например, в Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), а также дополнительно рассматриваются, например, в Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); в патентах США №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (описывается соединение SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (описывается изменение поверхности); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (описывается «перестановка FR»); Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005), и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (описывается подход «направленного отбора» для перестановки FR).

Человеческие каркасные участки, которые могут быть использованы для гуманизации, включают в себя без ограничения каркасные участки, выбранные с использованием способа «наилучшего подбора» (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); каркасные участки, полученные от консенсусной последовательности антител человека конкретной подгруппы вариабельных участков легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol, 151:2623 (1993)); человеческие зрелые (соматически мутировавшие) каркасные участки или человеческие зародышевые каркасные участки (см., например, Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)) и каркасные участки, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997), и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

4. Антитела человека

Согласно определенным вариантам осуществления представленным в настоящем документе антителом является антитело человека. Антитела человека могут быть получены с использованием различных известных в уровне техники методик. Антитела человека в целом описаны в van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001), и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Антитела человека могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано с продуцированием интактных антител человека или интактных антител с человеческими вариабельными участками в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные, как правило, содержат все человеческие иммуноглобулиновые локусы или их часть, которые замещают эндогенные иммуноглобулиновые локусы или которые находятся вне хромосомы или произвольно встраиваются в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные иммуноглобулиновые локусы, как правило, были инактивированы. Для обзора способов получения антител человека от трансгенных животных см. Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Также см., например, патенты США №№6075181 и 6150584, описывающие технологию XENOMOUSE™; патент США №5770429, описывающий технологию HuMab®; патент США №7041870, описывающий технологию K-М MOUSE®, и заявку на выдачу патента США №2007/0061900, описывающую технологию VelociMouse®). Человеческие вариабельные участки от интактных антител, произведенных такими животными, далее могут быть модифицированы, например, путем объединения с другим человеческим константным участком.

Антитела человека также могут быть получены гибридомными способами. Были описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для продуцирования человеческих моноклональных антител. См., например, Kozbor J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); а также Boerner et al., J. Immunol, 147: 86 (1991). Также описаны антитела человека, созданные посредством технологии гибридомы с В-клетками человека, в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают в себя описанные, например, в патенте США №7189826 (описывающем продуцирование моноклональных человеческих антитела IgM линиями гибридомных клеток) и в Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (описывающем гибридомы типа «человек-человек»). Технология гибридомы человека (технология Trioma) также описана в Vollmers and Brandlein, Histol. Histopathol, 20(3):927-937 (2005), а также в Vollmers and Brandlein, Methods Find Exp. Clin. Pharmacol, 27(3):185-91 (2005).

Антитела человека также могут быть созданы путем выделения последовательностей клональных вариабельных доменов Fv, выбранных из библиотек фагового дисплея, полученных от человека. Такие последовательности вариабельных доменов затем можно комбинировать с желаемым константным доменом человека. Ниже описаны методики для отбора антител человека из библиотек антител.

5. Полученные из библиотек антитела

Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек по антителам с желаемой активностью или активностями. Например, в уровне техники известен ряд способов создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек по антителам, обладающим желаемыми характеристиками связывания. Такие способы рассматриваются, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), и дополнительно описаны, например, в McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); а также в Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).

Согласно определенным способам с использованием фагового дисплея репертуары генов VH и VL отдельно клонируют с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) и произвольно рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем можно скринировать по антиген-связывающему фагу, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994). Фаг, как правило, отображает фрагменты антител, либо как одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), либо как фрагменты Fab. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают антитела с высокой аффинностью к иммуногену без потребности в конструировании гибридом. В качестве альтернативы, наивный репертуар может быть клонирован (например, от человека) для обеспечения одного источника антител против широкого диапазона не своих, а также своих антигенов без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки также могут быть получены синтетически путем клонирования нереаранжированных сегментов V-гена от стволовых клеток и с использованием PCR-праймеров, содержащих произвольную последовательность, для кодирования высоко вариабельных участков CDR3 и для выполнения реаранжировки in vitro, как описано в Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки антител человека, включают в себя, например, патент США №5750373 и патентные публикации США №№2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

Антителами или фрагментами антител, выделенными из библиотек антител человека, в настоящем документе считаются антитела человека или фрагменты антител человека.

6. Мультиспецифичные антитела

Согласно определенным вариантам осуществления представленным в настоящем документе антителом является мультиспецифичное антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифичными антителами являются моноклональные антитела, которые обладают специфичностями связывания для по меньшей мере двух различных сайтов. Согласно определенным вариантам осуществления одна из специфичностей связывания относится к PD-L1, а другая - к какому-либо другому антигену. Согласно определенным вариантам осуществления биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами PD-L1. Биспецифичные антитела также могут быть использованы для локализации цитотоксических средств в клетках, которые экспрессируют PD-L1. Биспецифичные антитела могут быть получены как непроцессированные антитела или фрагменты антител.

Методики для создания мультиспецифичных антител включают в себя без ограничения рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, обладающих различными специфичностями (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO 93/08829 и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), и конструирование «выступ-во-впадину» (см., например, патент США №5731168). Мультиспецифичные антитела также могут быть получены путем конструирования эффектов электростатического регулирования для создания Fc-гетеродимерных молекул антитела (WO 2009/089004 А1); путем сшивания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США №4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); путем использования лейциновых застежек для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); путем использования технологи «диатело» для получения фрагментов биспецифичных антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); путем использования одноцепочечных димеров Fv (sFv) (см., например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); а также путем подлучения триспецифичных антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Конструированные антитела с тремя или более функциональными сайтами связывания антигена, в том числе антитела «Octopus», также охватываются настоящим документом (см., например, заявку на выдачу патента США №2006/0025576 А1).

Антитело или фрагмент в настоящем документе также включает в себя «FAb с двойным действием» или «DAF», содержащий сайт связывания антигена, который связывается с PD-L1, а также с другим отличным антигеном (см., например, заявку на выдачу патента США №2008/0069820).

7. Варианты антител

а) Гликозилированные варианты

Согласно определенным вариантам осуществления представленное в настоящем документе антитело является измененным с повышением или понижением степени, с которой антитело гликозилируется. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антителе можно удобно выполнять путем изменения аминокислотной последовательности так, что создаются или удаляются один или несколько сайтов гликозилирования.

Если антитело содержит Fc-участок, то присоединенный к нему углевод может быть изменен. Нативные антитела, произведенные клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный, биантенарный олигосахарид, который обычно присоединяется с помощью N-соединения к Asn297 домена СН2 Fc-участка, см., например, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может включать в себя различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенные к GlcNAc в «стволе» биантенарной олигосахаридной структуры. Согласно некоторым вариантам осуществления могут быть выполнены модификации олигосахарида в антителе в соответствии с настоящим изобретением для создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.

Согласно одному варианту осуществления представлены варианты антитела, имеющие углеводную структуру, в которой недостаточно фукозы, присоединенной (непосредственно или опосредованно) к Fc-участку. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют путем вычисления среднего количества фукозы в сахарной цепи при Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn297 (например, комплексных, гибридных структур и с высоким содержанием маннозы), измеренной с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF, как описано в WO 2008/077546, например. Asn297 означает аспарагиновый остаток, расположенный около позиции 297 в Fc-участке (нумерация остатков Fc-участка по Ей); однако, Asn297 также может быть расположен на расстоянии приблизительно ±3 аминокислоты в 3'-5'-направлении или в 5'-3'-направлении относительно позиции 297, т.е. между позициями 294 и 300, из-за минорных вариаций последовательности в антителах. Такие фукозилированные варианты могут обладать улучшенной функцией ADCC. См., например, патентные публикации США №№2003/0157108 (Presta, L.) и 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, касающихся «дефукозилированных» или «дефицитных по фукозе» вариантов антител включают в себя заявку на выдачу патента США №2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; заявки на выдачу патента США №№2003/0115614; 2002/0164328; 2004/0093621; 2004/0132140; 2004/0110704; 2004/0110282; 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры клеточных линий, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают в себя клетки СНО Lec13, дефицитные по фукозилированным белкам (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявку на выдачу патента США №2003/0157108 Al, Presta, L; и WO 2004/056312 Al, Adams et al., особенно пример 11), и линии нокаутных клеток, таких как клетки СНО, нокаутные по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, knockout (см., например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO 2003/085107).

Варианты антител дополнительно обеспечиваются разделенными пополам олигосахаридами, например, в которых биантенарный олигосахарид, присоединенный к Fc-участку антитела, является разделенным пополам с помощью GlcNAc. Такие варианты антител могут характеризоваться пониженным фукозилированием и/или улучшенной функцией ADCC. Примеры таких вариантов антитела описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); патенте США № 6602684 (Umana et al.) и заявке на выдачу патента США №2005/0123546 (Umana et al.). Также представлены варианты антитела по меньшей мере с одним галактозным остатком в олигосахариде, присоединенном к Fc-участку. Такие варианты антитела могут обладать улучшенной функцией CDC. Такие варианты антитела описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.) и WO 1999/22764 (Raju, S.).

b) Варианты Fc-участка

Согласно определенным вариантам осуществления одна или несколько аминокислотных модификаций могут быть введены в Fc-участок представленного в настоящем документе антитела с созданием посредством этого варианта Fc-участка. Вариант Fc-участка может содержать человеческую последовательность Fc-участка (например, Fc-участка человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одной или нескольких аминокислотных позициях.

Согласно определенным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к варианту антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желаемым кандидатом для применений, при которых важно время полужизни антитела in vivo, а некоторые эффекторные функции (такие как комплемент и ADCC) являются ненужными или вредными. Могут быть выполнены анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения снижения/истощения активностей CDC и/или ADCC. Например, могут быть выполнены анализы связывания с Fc-рецептором (FcR) для гарантии того, что антитело не способно связываться с FcγR (вероятно, в результате отсутствия активности ADCC), но сохраняется способность связывания FcRn. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только Fc(RII, тогда как моноциты экспрессируют Fc(RI, Fc(RII и Fc(RIII. Экспрессия FcR в гематопоэтических клетках приводится в таблице 3 на стр. 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Неограничивающие примеры in vitro анализов для оценки активности ADCC представляющей интерес молекула описаны в патенте США №5500362 (см., например, Hellstrom, I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986), Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); патент США №5821337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). В качестве альтернативы, могут быть использованы способы нерадиоактивных анализов (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96^® (Promega, Madison, WI). Применимые для таких анализов эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-килеры (NK). В качестве альтернативы или в дополнение, активность ADCC представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на животной модели, такой как описанная в Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Также могут быть выполнены анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не способно связывать C1q и, следовательно, не обладает активностью CDC. См., например, ELISA в отношении связывания C1q и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Кровь 101:1045-1052 (2003); а также Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Кровь 103:2738-2743 (2004)). Также могут быть выполнены определения связывания FcRn и in vivo клиренса/времени полужизни с использованием известных в уровне техники способов (см., например, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Антитела с пониженной эффекторной функцией включают в себя таковые с заменой одного или нескольких остатков Fc-участка 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (патент США №6737056). Такие мутанты Fc включают в себя мутантов Fc с заменами в двух или более аминокислотных позициях 265, 269, 270, 297 и 327, в том числе так называемый мутант Fc «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США №7332581).

Описаны определенные варианты антитела с улучшенным или пониженным связыванием с FcR (см., например, патент США №6737056; WO 2004/056312 и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)). Согласно определенным вариантам осуществления вариант антитела содержит Fc-участок с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC, например, с заменами в позициях 298, 333 и/или 334 Fc-участка (нумерация остатков по EU). Согласно некоторым вариантам осуществления изменения выполняют в Fc-участке, что приводит к изменению (т.е. улучшению или снижению) связывания C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в патенте США №6194551, WO 99/51642 и в Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Антитела с продленным временем полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976), и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в заявке на выдачу патента США 2005/0014934 Al (Hinton et al). Такие антитела содержат Fc-участок с одной или несколькими заменами в нем, что улучшает связывание Fc-участка с FcRn. Такие Fc-варианты включают в себя таковые с заменами в одном или нескольких остатках Fc-участка: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой остатка 434 Fc-участка (патент США №7371826). См. также Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США №5648260; патент США №5624821 и WO 94/29351, касающиеся других примеров вариантов Fc-участка.

с) Конструированные с цистеином варианты антитела

Согласно определенным вариантам осуществления может быть желательным создание конструированных с цистеином антител, например, «thioMAb», в которых один или нескольких остатков антитела замещены цистеиновыми остатками. Согласно конкретным вариантам осуществления замещенные остатки встречаются в неэкранированных сайтах антитела. Путем замещения таких остатков цистеином реакционноспособные тиоловые группы, тем самым, размещаются в неэкранированных сайтах антитела и могут быть использованы для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты лекарственного средства или фрагменты линкер-лекарственное средство, с созданием иммуноконъюгата, как описано далее в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления любой один или несколько из следующих остатков могут быть замещены цистеином: Fc-участки V205 (нумерация по Kabat) легкой цепи, А118 (нумерация по EU) тяжелой цепи и S400 (нумерация по EU) тяжелой цепи. Конструированные с цистеином антитела могут быть образованы, как описано, например, в патенте США №7521541.

d) Иммуноконъюгаты

Кроме того, настоящий документ относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитело против PD-L1, в соответствии с настоящим документом конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими средствами, такими как химиотерапевтические средства или лекарственные средства, ингибирующие рост средства, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.

Согласно одному варианту осуществления иммуноконъюгатом является конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгируется с одним или несколькими лекарственными средствами, в том числе без ограничения с майтанзиноидом (см. патенты США №№5208020, 5416064 и европейский патент №0425235 В1); ауристатином, таким как фрагменты лекарственного средства монометилауристатин DE и DF (ММАЕ и MMAF) (см. патенты США №№5635483, 5780588 и 7498298); доластатином; калихеамицином или их производными (см. патенты США №№5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; Hinman et al, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); and Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); антрациклином, таким как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); и патент США №6630579); метотрексатом; виндезином; таксаном, таким как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотеценом и СС1065.

Согласно другому варианту осуществления иммуноконъюгат содержит описанное в настоящем документе антитело, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, в том числе без ограничения с дифтерийной цепью А, несвязывающим активным фрагментом дифтерийного токсина, цепью экзотоксина А (от Pseudomonas aeruginosa), цепью рицина А, цепью абрина А, цепью модессина А, альфа-сарцином, белками Aleurites fordii, диантиновыми белками, белками Phytolaca americana (PAPI, РАРП и PAP-S), ингибитором Momordica charantia, курцином, кротином, ингибитором Sapaonaria officinalis, гелонином, митогеллином, рестриктоцином, феномицином, эномицином и трихотецинами.

Согласно другому варианту осуществления иммуноконъюгат содержит описанное в настоящем документе антитело, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Для получения радиоконъюгатов доступен ряд радиоактивных изотопов. Примеры включают в себя At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Если для выявления используют радиоконъюгат, то он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Тс⁹⁹ или I¹²³, или спиновую метку для визуализации при ядерном магнитном резонансе (NMR) (также известном как магнитно-резонансная визуализация, MRI), такую как опять-таки йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Конъюгаты антитела и цитотоксического средства могут быть получены с использованием ряда бифункциональных соединяющихся с белком средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (таких как диметиладипимидата HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является типичным хелатирующим средством для конъюгации радионуклеотида с антителом, см. WO94/11026. Линкером может быть «отщепляемый линкер», облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Можно использовать, например, кислото-неустойчивый линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фото-нейстойчивый линкер, диметиловый линкер или содержащий дисульфид линкер (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); патент США №5208020).

Иммуноконъюгаты или ADC в соответствии с настоящим документом определенно включают без ограничения конъюгаты, полученные со сшивающими реагентами, в том числе без ограничения BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые коммерчески доступны (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).

С. Связывающиеся полипептиды

Связывающимися полипептидами являются полипептиды, которые связываются, предпочтительно в частности, с PD-L1, как описано в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления связывающимися полипептидами являются антагонисты, связывающиеся с компонентом сигнального пути PD-L1. Связывающиеся полипептиды могут быть химически синтезированы с использованием известного метода полипептидного синтеза или могут быть получены и очищены с использованием рекомбинантной технологии. Связывающиеся полипептиды обычно составляют в длину по меньшей мере приблизительно 5 аминокислот, в качестве альтернативы, по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот или более, при этом такие связывающиеся полипептиды способны связываться, предпочтительно специфично, с целевым PD-L1, как описано в настоящем документе. Связывающиеся полипептиды могут быть идентифицированы без излишнего эксперимента с использованием хорошо известных методик. В этом отношении следует отметить, что в уровне техники хорошо известны методики для скрининга полипептидных библиотек по связывающимся полипептидам, которые способны специфично связываться с целью полипептида (см., например, патенты США №№5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; международные публикации согласно РСТ №№ WO 84/03506 и WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J.D. et al. (1991), J. Mol. Biol, 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, а также Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol, 2:668).

В этом отношении бактериофаговый (фаговый) дисплей является хорошо известной методикой, которая позволяет скринировать большие полипептидные библиотеки для идентификации член(ов) этих библиотек, которые способны специфично связываться с целевым полипептидом PD-L1. Фаговый дисплей является методикой, с помощью которой варианты полипептида отображаются как слитые белки с белком оболочки на поверхности бактериофаговых частиц (Scott, J.K. and Smith, G.P. (1990) Science, 249: 386). Применимость фагового дисплея заключается в том, что большие библиотеки селективно рандомизированных белковых вариантов (или произвольно клонированных cDNA) можно быстро и эффективно сортировать по тем последовательностям, которые связываются с целевой молекулой с высокой аффинностью. Дисплей пептидных (Cwirla, S.Е. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) или белковых (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J.D. et al. (1991), J. Mol. Biol, 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363) библиотек на фаге использовали для скрининга миллионов полипептидов или олигопептидов по таковым со свойствами специфичного связывания (Smith, G.Р. (1991) Current Opin. Biotechnol, 2:668). Для сортировки фаговых библиотек произвольных мутантов требуется стратегия конструирования и распространения большого числа вариантов, процедура для аффинной очистки с использованием целевого рецептора и средств оценки результатов насыщений связывания, см. патенты США №№5223409, 5403484, 5571689 и 5663143.

Хотя в большинстве способов фагового дисплея использовали нитчатый фаг, также известны системы дисплея лямбдовидного фага (WO 95/34683; патент США №5627024), системы дисплея фага Т4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Иммунитет, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) и системы дисплея фага Т7 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); патент США №5766905).

Дополнительные улучшения усиливают способность систем дисплея скринировать пептидные библиотеки по связыванию с отобранными целевыми молекулами и обнаруживать функциональные белки с потенциальным скринингом этих белков по желаемым свойствам. Было разработано устройство для комбинаторной реакции для реакций фагового дисплея (WO 98/14277) и библиотеки фагового дисплея использовались для анализа и контроля бимолекулярных взаимодействий (WO 98/20169; WO 98/20159) и свойств зажатых спиральных пептидов (WO 98/20036). В WO 97/35196 описывается способ выделения аффинного лиганда, при котором библиотека фагового контроля контактирует с одним раствором, в котором лиганд будет связываться с целевой молекулой, и вторым раствором, в котором аффинный лиганд не будет связываться с целевой молекулой, для селективного выделения связывающих лигандов. В WO 97/46251 описывается способ биопэннинга произвольной библиотеки фагового контроля с аффинным очищенным антителом, а затем выделения связывающего фага с последующим процессом микропэннинга с использованием лунок микропланшета для выделения высоко аффинного связывающего фага. Сообщалось о применении белка A Staphlylococcus aureus в качестве аффинной метки (Li et al. (1998) Mol Biotech, 9:187). В WO 97/47314 описывается применение субстратных субстракционных библиотек для распознавания ферментных специфичностей с использованием комбинаторной библиотеки, которой может быть библиотека фагового контроля. Способ отбора ферментов, приемлемых для применения в детергентах, с использованием фагового дисплея описывается в WO 97/09446. Дополнительные способы отбора специфичных связывающих белков описываются в патентах США №№5498538, 5432018 и в WO 98/15833.

Способы создания пептидной библиотеки и скрининга этих библиотек также раскрываются в патентах США №№5723286, 5432018, 5580717, 5427908, 5498530, 5770434, 5734018, 5698426, 5763192 и 5723323.

D. Связывающие малые молекулы

Настоящий документ относится к связывающим малым молекулам для применения в качестве низкомолекулярного антагониста PD-L1.

Связывающими малыми молекулами предпочтительно являются органические молекулы, отличные от связывающих полипептидов или антител, определенных в настоящем документе, которые связываются, предпочтительно в частности, с PD-L1, как описано в настоящем документе. Связывающие органические малые молекулы могут быть идентифицированы и химически синтезированы с использованием известного метода (см., например, международные публикации согласно РСТ №№ WO 00/00823 и WO 00/39585). Связывающие органические малые молекулы, как правило, имеют размер менее приблизительно 2000 дальтон, в качестве альтернативы, менее приблизительно 1500, 750, 500, 250 или 200 дальтон, при этом такие органические малые молекулы, которые способны связываться, предпочтительно в частности, с полипептидом, как описано в настоящем документе, могут быть идентифицированы без излишнего эксперимента с использованием хорошо известных методик. В этом отношении следует отметить, что методики для скрининга библиотек органических малых молекул по молекулам, которые способны связываться с полипептидной целью, хорошо известны в уровне техники (см., например, международные публикации согласно РСТ №№ WO00/00823 и WO00/39585). Связывающими органическими малыми молекулами могут быть, например, альдегиды, кетоны, оксимы, гидразоны, семикарбазоны, карбазиды, первичные амины, вторичные амины, третичные амины, N-замещенные гадразины, гидразиды, спирты, эфиры, тиолы, тиоэфиры, дисульфиды, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, мочевины, карбаматы, карбонаты, кетали, тиокетали, ацетали, тиоацетали, арилгалогениды, арилсульфонаты, алкилгалогениды, алкилсульфонаты, ароматические соединения, гетероциклические соединения, анилины, алкены, алкины, диолы, аминоспирты, оксазолидины, оксазолины, тиазолидины, тиазолины, энамины, сульфонамиды, эпоксиды, азиридины, изоцианаты, сульфонилхлориды, диазосоединения, хлорангидриды или подобные.

Е. Антагонистические полинуклеотиды

Настоящий документ относится к полинуклеотидным антагонистам. Полинуклеотид может быть антисмысловой нуклеиновой кислотой и/или рибозимом. Антисмысловые нуклеиновые кислоты содержат последовательность, комплементарную по меньшей мере части транскрипта РНК гена PD-L1. Однако абсолютная комплементарность не требуется, хотя и предпочтительна.

Последовательность, «комплементарная по меньшей мере части РНК» в настоящем документе означает последовательность, обладающую достаточной комплементарностью, чтобы быть в состоянии гибридизироваться с РНК с образованием стабильного дуплекса; в случае двухнитевых антисмысловых нуклеиновых кислот PD-L1 можно, таким образом, тестировать одну нить в дуплексной ДНК или можно анализировать триплексное образование. Способность к гибридизации будет зависеть как от степени комплементарности, так и от длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Как правило, чем длиннее гибридизирующаяся нуклеиновая кислота, тем больше ошибок спаривания оснований с РНК PD-L1 она может содержать, но все еще формирует стабильный дуплекс (или триплекс, в зависимости от конкретного случая). Специалист в данной области может установить допустимую степень ошибок спаривания с использованием стандартных процедур для определения точки плавления гибридизированного комплекса.

Полинуклеотиды, которые комплементарны 5'-концу транскрипта, например, 5'-нетранслируемой последовательности до кодона инициации AUG включительно, должны работать наиболее эффективно в ингибировании трансляции. Однако было показано, что последовательности, комплементарные 3'-нетранслируемым последовательностям mRNA, эффективны в ингибировании трансляции mRNA с таким же успехом. См., как правило, Wagner, R., 1994. Nature 372:333-335. Таким образом, олигонуклеотиды, комплементарные либо 5'-, либо 3'-нетранслируемым, некодирующим участкам гена PD-L1, могут быть использованы в качестве антисмыслового подхода к ингибированию трансляции эндогенной mRNA PD-L1. Полинуклеотиды, комплементарные 5'-нетранслируемому участку mRNA, должны включать комплементарную последовательность стартового кодона AUG. Антисмысловые полинуклеотиды, комплементарные кодирующим участкам mRNA, являются менее эффективными ингибиторами трансляции, но могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Независимо от того, предназначены для гибридизации с 5'-, 3'- или кодирующим участком mRNA PD-L1, антисмысловые нуклеиновые кислоты должны составлять в длину по меньшей мере шесть нуклеотидов и предпочтительно являться олигонуклеотидами длиной от 6 до приблизительно 50 нуклеотидов. Определенные аспекты относятся к олигонуклеотиду длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 17 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов или по меньшей мере 50 нуклеотидов.

Согласно одному варианту осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота PD-L1 в соответствии с настоящим изобретением продуцируется внутриклеточно посредством транскрипции по экзогенной последовательности. Например, вектор или его часть транскрибируется с продуцированием антисмысловой нуклеиновой кислоты (РНК) гена PD-L1. Такой вектор будет содержать последовательность, кодирующую антисмысловую нуклеиновую кислоту PD-L1. Такой вектор может оставаться эписомным или становиться хромосомно интегрированным до тех пор, пока он может быть транскрибирован с продуцированием желаемой антисмысловой РНК. Такие векторы могут быть сконструированы с помощью способов технологии рекомбинантных ДНК, стандартных в данной области. Векторы могут быть плазмидными, вирусными или другими, известными в уровне техники, используемыми для репликации и экспрессии в клетках позвоночных. Экспрессия кодирующей PD-L1 последовательности или ее фрагментов может производиться любым промотором, известным в уровне техники, для воздействия на клетки позвоночных, предпочтительно человека. Такие промоторы могут быть индуцируемыми или конститутивными. Такие промоторы включают без ограничения ранний промоторный участок SV40 (Bernoist and Chambon, Nature 29:304-310 (1981), промотор, находящийся на длинном 3'-концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), промотор тимидина вируса герпеса (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA. 78:1441-1445 (1981), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Brinster, et al., Nature 296:39-42 (1982)) и т.п.

F. Варианты антитела и связывающего полипептида

Согласно определенным вариантам осуществления в настоящем документе рассматриваются варианты аминокислотной последовательности антител и/или связывающих полипептидов. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или другие биологические свойства антитела и/или связывающего полипептида. Варианты аминокислотной последовательности антитела и/или связывающих полипептидов могут быть получены путем внесения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело и/или связывающий полипептид, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела и/или связывающего полипептида. Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть сделана для достижения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками, например, связывается с целью.

Согласно определенным вариантам осуществления включаются варианты антитела и/или варианты связывающего полипептида, содержащие одну или несколько аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для заместительного мутагенеза, включают в себя HVR и FR. Консервативные замены показаны в таблице 1 под заголовком «Консервативные замены». Более существенные изменения приведены в таблице 1 под заголовком «Типичные замены» и, как дополнительно описано ниже, в ссылке на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющие интерес антитело и/или связывающий полипептид, а продукты скринированы по желаемой активности, например, сохраненному/улучшенному связыванию антигена, сниженной иммуногенности или улучшенным ADCC или CDC.

Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии с общими свойствами боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены повлекут замену члена одного из этих классов на член из другого класса.

Один тип варианта замены включает в себя замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный в результате варианты), отобранный для дальнейшего исследования, будет иметь модификации (например, улучшения) в определенных биологических свойствах (например, усиленную аффинность, пониженную иммуногенность) по отношению к исходному антителу и/или будет главным образом сохранять определенные биологические свойства исходного антитела. Типичным вариантом замены является антитело с созревшей аффинностью, которое можно легко создать, например, с использованием методов на основе фагового дисплея созревания аффинности, таких как описанные в настоящем документе. Вкратце, один или несколько остатков HVR мутируют, и вариантные антитела отображаются на фаге и скринируются по конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).

В HVR могут быть выполнены изменения (например, замены), например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть выполнены в «горячих точках» HVR, то есть в остатках, кодируемых кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой в ходе процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или в SDR (a-CDR) с получением в результате вариантных VH или VL, тестируемых на аффинность связывания. Созревание аффинности посредством конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Согласно некоторым вариантам осуществления созревание аффинности разнообразие вводят в вариабельные гены, выбранные для созревания, с помощью любого из ряда способов (например, из PCR сниженной точности, перестановки цепей или направленного на олигонуклеотид мутагенеза). После этого создают вторичную библиотеку. Затем эту библиотеку скринируют для идентификации любых вариантов антитела с желаемой аффинностью. Другой способ внесения разнообразия включает направленные на HVR подходы, в которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за один раз). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, могут быть специфично идентифицированы, например, с использованием сканирующего аланин мутагенеза или моделирования. CDR-H3 и CDR-L3, в частности, нередко становятся целевыми.

Согласно определенным вариантам осуществления замены, вставки или делеции могут возникать в одном или нескольких HVR, при условии, что такие изменения не оказывают существенного снижения способности антитела связывать антиген. Например, в HVR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, как это предусмотрено в настоящем документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут находиться за пределами «горячих точек» HVR или SDR. Согласно определенным вариантам осуществления приведенных выше вариантных последовательностей VH и VL каждый HVR либо не изменяется, либо содержит не более чем одну, две или три аминокислотные замены.

Применимый способ идентификации остатков или участков антитела и/или связывающего полипептида, которые могут быть нацелены на мутагенез, называют «аланиновый сканирующий мутагенез», как описано в Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Согласно этому способу остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы определить, влияет ли это на взаимодействие. Последующие замены могут быть введены в месторасположения аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к первоначальным заменам. В качестве альтернативы или в дополнение, образуется кристаллическая структура комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут быть нацелены или элиминированы в качестве кандидатов на замену. Варианты могут быть скринированы для определения наличия у них желаемых свойств.

Вставки аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, длина которых варьирует от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или нескольких остатков аминокислоты. Примеры концевых вставок включают в себя антитела с N-концевым остатком метионина. Другие варианты вставок молекулы антитела включают в себя слияние с N- или С-концом антитела к ферменту (например, для ADEPT) или полипептидом, который увеличивает время полужизни антитела в сыворотке крови.

G. Производные антитела и связывающего полипептида

Согласно определенным вариантам осуществления антитело и/или связывающий полипептид, представленные в данном документе, могут быть дополнительно модифицированы с содержанием дополнительных небелковых фрагментов, которые известны в уровне техники и легкодоступны. Фрагменты, приемлемые для получения производных антитела и/или связывающего полипептида, включают в себя без ограничения водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают в себя без ограничения полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимеры этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры оксида полипропилена и оксида этилена, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропионовый альдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества в производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу и/или связывающему полипептиду, может варьировать, и если присоединен более чем один полимер, они могут быть одинаковыми или различными молекулами. Как правило, количество и/или тип полимеров, используемых для получения производных, может быть определен на основе соображений, учитывающих без ограничения определенные свойства или функции антитела и/или связывающего полипептида, подлежащего улучшению, при условии, что производное антитела и/или производное связывающего полипептида будут использовать в терапии при определенных состояниях и т.д.

Согласно другому варианту осуществления обеспечиваются конъюгаты антитела и/или связывающего полипептида с небелковым фрагментом, которые могут быть селективно нагреты воздействием радиации. Согласно одному варианту осуществления небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может быть любой длины волны и характеризуется без ограничения длинами волн, которые не наносят вреда обычным клеткам, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой ближайшие к небелковому фрагменту антитела и/или связывающего полипептида клетки погибают.

Согласно некоторым вариантам осуществления образцом является образец ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом ткани является образец опухолевой ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления образец опухолевой ткани содержит клетки опухоли, инфильтрующиеся в опухоль иммунные клетки, внутриопухолевые иммунные клетки, перитуморальные иммунные клетки или какие-либо их комбинации, опухолевые стромальные клетки (например, фибробласты). Согласно некоторым вариантам осуществления образец получают от больного злокачественным заболеванием. Согласно некоторым вариантам осуществления образец получают до лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления образец фиксируют в формалине и заливают парафином.

Согласно некоторым вариантам осуществления заболеванием или нарушением является пролиферативное заболевание или нарушение. Согласно некоторым вариантам осуществления заболеванием или нарушением является связанное с иммунной системой заболевание или нарушение. Согласно некоторым вариантам осуществления заболеванием или нарушением является злокачественное заболевание. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественным заболеванием является немелкоклеточный рак легкого, почечноклеточное злокачественное заболевание, злокачественное заболевание яичника, злокачественное заболевание поджелудочной железы, карцинома желудка, злокачественное заболевание мочевого пузыря, злокачественное заболевание пищевода, мезотелиома, меланома, злокачественное заболевание молочной железы, злокачественное заболевание щитовидной железы, злокачественное заболевание толстой и прямой кишки, злокачественное заболевание головы и шеи, остеосаркома, злокачественное заболевание предстательной железы или глиобластома. Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественным заболеванием является немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). Согласно некоторым вариантам осуществления NSCLC является местно распространенный или метастатический NSCLC второй линии или третьей линии терапии. Согласно некоторым вариантам осуществления NSCLC является аденокарциномой. Согласно некоторым вариантам осуществления NSCLC сквамозноклеточной карциномой.

Согласно некоторым вариантам осуществления каких-либо из способов индивидуумом согласно любому из вышеприведенных вариантов осуществления может быть человек.

Согласно следующему варианту осуществления настоящий документ относится к способам лечения злокачественного заболевания. Согласно одному варианту осуществления способ включает введение индивидууму, страдающему таким злокачественным заболеванием, эффективного количества антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1. Согласно одному такому варианту осуществления способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства. Согласно некоторым вариантам осуществления индивидуумом может быть человек.

Антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, описываемый в настоящем документе, при лечении может быть применен либо отдельно, либо в комбинации с другими средствами. Например, антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, описываемый в настоящем документе, может быть введен совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительным терапевтическим средством является химиотерапевтическое средство.

Такие комбинационные виды терапии, как отмечалось выше, охватывают комбинированное введение (при котором два или более терапевтических средств содержатся в одних и тех же или в отдельных составах) и раздельное введение, в случае которого введение антагониста может происходить до введения, одновременно с введением и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или вспомогательного средства. Антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, описываемый в настоящем документе, также может быть применен в комбинации с лучевой терапией.

Описанный в настоящем документе антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитело, связывающий полипептид и/или малая молекула) (и какое-либо дополнительное терапевтическое средство) может быть введен любым приемлемым средством, в том числе парентеральным, внутрилегочным и внутриносовым и, если нужно для местного лечения, внутриочаговым введением. Парентеральные инфузии включают в себя внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутриперитонеальное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым приемлемым путем, например, инъекциями, такими как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости отчасти от того, является ли введение краткосрочным или хроническим. В настоящем документе включаются различные режимы дозирование, в том числе без ограничения однократные или многократные введения в различные моменты времени, болюсное введение и импульсная инфузия.

Описанные в настоящем документе антагонисты, связывающиеся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитело, связывающий полипептид и/или малая молекула) могут быть составлены, дозированы и введены путем, соответствующим надлежащей медицинской практике. Рассматриваемые в настоящем контексте факторы включают в себя конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, участок доставки средства, способ введения, режим введения и другие факторы, известные практикующим медицинским работникам. Антагонист сигнального пути PD-L1 необязательно должен быть составлен с одним или несколькими средствами, используемыми в настоящее время для предотвращения или лечения представляющего интерес нарушения. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, присутствующего в составе, типа нарушения или лечения и других обсуждаемых выше факторов. Его, как правило, используют в одних и тех же дозировках и путями введения, описанными в настоящем документе, или оно соответствует приблизительно 1-99% описанных в настоящем документе дозировок, или в какой-либо дозировке и каким-либо путем, которые эмпирически/клинически определены как соответствующие.

Для предотвращения или лечения заболевания соответствующая дозировка описанного в настоящем документе антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, (при использовании отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами) будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, для профилактических или терапевтических целей, предшествующей терапии, клинической истории пациента и ответа на антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, а также от мнения лечащего врача. Антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, надлежащим образом вводят пациенту за один раз или серией обработок. Одна типичная ежесуточная дозировка может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше в зависимости от вышеупомянутых факторов. В случае многократных введений в течение нескольких суток или дольше в зависимости от состояния, как правило, лечение будет длиться до желаемого подавления симптомов заболевания. Такие дозы могут вводиться периодически, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент получает от приблизительно двух до приблизительно двадцати или, например, приблизительно шесть доз антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, описанного в настоящем документе). Сначала может быть введена начальная более высокая ударная доза, а затем одна или несколько более низких доз. Типичный режим дозирования включает введение. Однако могут быть применены другие режимы дозировок. Достижением этой терапии является легкий контроль традиционными методиками и анализами.

Согласно некоторым вариантам осуществления какого-либо из способов антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитело против PD-L1) вводят при дозировке приблизительно 0,3-30 мг/кг. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитело против PD-L1) вводят при какой-либо дозировке из приблизительно 0,3 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 4 мг/кг, 8 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг или 30 мг/кг. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитело против PD-L1) вводят при какой-либо дозировке из приблизительно 2 мг/кг, 4 мг/кг, 8 мг/кг, 15 мг/кг или 30 мг/кг 21-дневными циклами. Следует понимать, что любой из вышеупомянутых составов или терапевтических способов могут быть осуществлены с использованием иммуноконъюгата вместо антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, или в дополнение к нему.

Фармацевтические составы антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, описанного в настоящем документе, получают путем смешивания такого антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форму лиофилизированных составов или водных растворов. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, является связывающая малая молекула, антитело, связывающий полипептид и/или полинуклеотид. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают в себя без ограничения буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, в том числе аскорбиновая кислота и метионин; консерванты (такие как окстадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (из менее приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкоза, манноза или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; образующие соли противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Типичные фармацевтически приемлемые носители в настоящем документе, кроме того, включают в себя средства диспергирования лекарственных средств в интерстициальном пространстве, такие как растворимые нейтрально активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы человека РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX^®, Baxter International, Inc.). Некоторые типичные sHASEGP и способы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в патентных публикациях США №№2005/0260186 и 2006/0104968. Один аспект относится к sHASEGP, комбинированным с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Типичные лиофилизированные составы описаны в патенте США №6267958. Водные составы включают в себя описанные в патенте США №6171586 и в WO2006/044908, последние составы включают в себя гистидин-ацетатный буфер.

Состав в соответствии с настоящим документом также может содержать при необходимости более чем один активный ингредиент для конкретного показания лечения, предпочтительно с дополняющими активностями, которые не влияют неблагоприятно друг на друга. Такие активные ингредиенты надлежащим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для назначенных целей.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или путем межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы), или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Могут быть получены препараты замедленного высвобождения. Приемлемые примеры препаратов замедленного высвобождения включают в себя полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащее антитело и/или связывающий полипептид, при этом матрицы находятся в форме сформованных изделий, например, пленки или микрокапсулы.

Следует понимать, что любое из вышеупомянутых изделий промышленного производства может включать в себя иммуноконъюгат, описываемый в настоящем документе, вместо антагониста PD-L1 или в дополнение к нему.

Идентификация и способы применения биомаркеров

Настоящий документ относится к способам идентификации реагирующих на лечение биомаркеров.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармакодинамические биомаркеры могут быть идентифицированы на соновании корреляции или определяемой взаимосвязи между анализируемыми уровнями экспрессии и положительными или отрицательными изменениями в ответе субъекта относительно одного или нескольких исходных ответов до лечения. Согласно некоторым вариантам осуществления анализируемые уровни экспрессии могут быть измерены в образцах, собранных от субъекта до, в ходе и после лечения или терапевтического вмешательства.

Фармакодинамические биомаркеры могут быть использованы без ограничения для наблюдения при лечении и для оценивания эффективности лечения. Например, уровни фармакодинамических биомаркеров могут быть предоставлены врачу для применения в организации или изменении курса лечения субъекта. Когда лечение выбрано и начато, субъекта можно наблюдать периодически путем сбора биологических образцов с двумя или более интервалами, определения клинического ответа, соответствующего данному временному интервалу до, в ходе и после лечения, и сравнения клинического ответа в течение времени. На основании этих ответов и любых тенденций, наблюдаемых в отношении усиления, снижения или стабилизации клинических ответов или изменений в уровнях фармакодинамических биомаркеров, врач-клиницист, терапевт или другой специалист здравоохранения может выбирать продолжение лечения без изменения, остановку лечения или корректировать план лечения с целью достижения улучшения с течением времени.

Следовательно, настоящий документ относится к способам оценивания ответа на лечение индивидуума антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает (а) определение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце, полученном от индивидуума в момент времени при введении или после введения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1; и (b) поддерживание, регулирование или прекращение лечения индивидуума на основании сравнения уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце с эталонными уровнями, при этом изменение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями является признаком ответа на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Кроме того, настоящий документ относится к способам наблюдения ответа индивидуума, получающего лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом указанный способ включает (а) определение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце, полученном от индивидуума в момент времени при введении или после введения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1; и (b) сравнение уровня(ей) одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце с эталонными уровнями с целью наблюдения за ответом у индивидуумов, получающих лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления эталонные уровни одного или нескольких биомаркеров выбирают из группы, состоящей из (1) уровня одного или нескольких биомаркеров от индивидуума до введения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1; (2) уровня одного или нескольких биомаркеров от эталонной группы; (3) предварительно определенного уровня одного или нескольких биомаркеров и (4) уровня одного или нескольких биомаркеров от индивидуума во второй момент времени до первого момента времени.

Для корреляции и сравнения биологического образца индивидуума с эталонной группой необходимо получить данные о клинических ответах, демонстрируемых группой индивидуумов, которые получали лечение, т.е. клинической группы, до и/или после лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1. Такие клинические данные могут быть получены с помощью ретроспективного анализа результатов клинического испытания(ий). В качестве альтернативы, клинические данные могут быть получены путем разработки и выполнения одного или нескольких новых клинических испытаний. Анализ данных клинической группы применяется с целью определения стандартной эталонной группы, которую, в свою очередь, используют для классификации субъектов с целью выбора терапевтического лечения, и/или для классификации субъектов как демонстрирующих положительный ответ на лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления изменение уровня одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями представляет собой повышение уровней.

Согласно некоторым вариантам осуществления изменение уровня одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями представляет собой снижение уровней.

Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько биомаркеров выбирают из группы, состоящей из PD-L1, PD-1, PD-L2 и каких-либо их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления повышение одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из PD-L1, PD-1, PD-L2 и каких-либо их комбинаций, в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем указывает на положительный ответ на лечение.

Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является связанный с иммунной системой маркер.

Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является связанный с Т-клеткой маркер.

Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является маркер Т-клеточной активации.

Согласно некоторым вариантам осуществления уровень маркера Т-клеточной активации является повышенным в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем.

Согласно некоторым вариантам осуществления маркер Т-клеточной активации выбирают из группы, состоящей из CD8, IFN-g, гранзима-А, TNF-a, перфорина и каких-либо их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления повышение уровня маркера Т-клеточной активации выбранного из группы, состоящей из CD8, IFN-g, гранзима-А, TNF-a, перфорина и каких-либо их комбинаций, в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем указывает на положительный ответ на лечение.

Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является активированная пролиферирующая Т-клетка.

Согласно некоторым вариантам осуществления уровень активированной пролиферирующей Т-клетки является повышенным в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем.

Согласно некоторым вариантам осуществления активированной пролиферирующей Т-клеткой является CD8+/Ki67+ клетка, CD8+/HLA-DR+/Ki67+ клетка и какие-либо их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления одним или несколькими биомаркерами является IL-6.

Согласно некоторым вариантам осуществления уровень IL-6 снижается в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение уровня IL-6 в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями указывает на положительный ответ на лечение. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень IL-6 повышается в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями. Согласно некоторым вариантам осуществления повышение уровня IL-6 в биологическом образце по сравнению с эталонными уровнями указывает на то, что ответ на лечение отсутствует.

Согласно некоторым вариантам осуществления биологический образец, полученный от индивидуума, выбирают из группы, состоящей из клетки, ткани, культуры ткани, опухоли, биологической жидкости и их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления биологическую жидкость выбирают из группы, состоящей из плазмы, сыворотки крови, цельной крови, РВМС и их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления тканью является опухолевая ткань.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухолевую ткань выбирают из группы, состоящей из опухолевых клеток, инфильтрующихся в опухоль клеток, стромальных клеток и каких-либо их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам осуществления клеткой является циркулирующая опухолевая клетка (СТС).

Согласно некоторым вариантам осуществления индивидуум страдает от пролиферативного заболевания или нарушения.

Согласно некоторым вариантам осуществления индивидуум страдает от злокачественного заболевания или злокачественного новообразования.

Согласно некоторым вариантам осуществления злокачественное заболевание или злокачественное новообразование выбрано из не мелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, почечноклеточного злокачественного заболевания, злокачественного заболевания толстой и прямой кишки, злокачественного заболевания яичника, злокачественного заболевания молочной железы, злокачественного заболевания поджелудочной железы, карциномы желудка, злокачественного заболевания мочевого пузыря, злокачественного заболевания пищевода, мезотелиомы, меланомы, злокачественного заболевания головы и шеи, злокачественного заболевания щитовидной железы, саркомы, злокачественного заболевания предстательной железы, глиобластомы, злокачественного заболевания шейки матки, карциномы вилочковой железы, лейкоза, лимфом, миелом, грибовидных гранулем, злокачественного заболевания клеток Меркеля и других гематологических злокачественных новообразований.

Согласно некоторым вариантам осуществления индивидуум страдает от связанного с иммунной системой заболевания или нарушения.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по лигандному связыванию.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с PD-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с В7-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 и с PD-1, и с В7-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с PD-L1, является антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антителом является моноклональное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антителом является человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, является антагонист, связывающийся с PD-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по лигандному связыванию.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L2.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 и с PD-L1, и с PD-L2.

Согласно некоторым вариантам осуществления антагонистом, связывающимся с PD-1, является антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антителом является моноклональное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антителом является человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

Способы предложения

Кроме того, настоящий документ относится к способам предложения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, включающим продвижение среди целевой аудитории применения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, для лечения индивидуума с заболеванием или нарушением на основании наличия и/или уровней биомаркера PD-L1. Согласно некоторым вариантам осуществления применение антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, основывается на повышенных уровнях биомаркера PD-L1.

Предложение, как правило, представляет собой платную коммуникацию через неличную коммуникацию, при этом спонсор идентифицируется, а сообщение контролируется. Предложение для целей настоящего документа включает в себя рекламу, связи с общественностью, размещение продукта, спонсорство, андеррайтинг и стимулирование сбыта. Этот термин также включает спонсорские информационные общественные уведомления, появляющиеся в любом из средств массовой информации, рассчитанном на массовую аудиторию, чтобы убедить, информировать, поощрять, мотивировать или иным образом изменять поведение по отношению к благоприятному паттерну приобретения, поддержки или одобрения продукта в соответствии с представленным в настоящем документе настоящим изобретением.

Предложение и продвижение диагностического способа в настоящем документе могут быть выполнены любыми средствами. Примеры носителя для предложения, используемого для доставки этих сообщений, включают в себя телевидение, радио, фильмы, журналы, газеты, Интернет и рекламные щиты, в том числе рекламные ролики, которые представляют собой сообщения, появляющиеся в вещательных средствах массовой информации. Реклама также включает в себя рекламу на сиденьях продуктовых тележек, на стенах в проходе аэропорта и по бокам автобусов, или звучащую в сообщениях при удерживании телефонного звонка или в системах громкой связи в магазине, или может быть размещена где-либо как визуальная или звуковая связь.

Боле конкретные примеры средств продвижения или предложения включают в себя телевидение, радио, фильмы, Интернет, такие как веб-трансляции и вебинары, интерактивные компьютерные сети, предназначенные для достижения одновременно работающих пользователей, фиксированные или электронные рекламные щиты, а также другие общественные знаки, плакаты, традиционная или электронная литература, такая как журналы и газеты, другие средства массовой информации, презентации или отдельные контакты, например, по электронной почте, телефону, мгновенному сообщению, почте, посредством курьера, массовой рассылки или почтальона, персональных визитов и т.д.

Используемый тип предложения будет зависеть от многих факторов, например, от природы целевой аудитории, в которой предстоит распространение, например, больницы, страховые компании, клиники, врачи, медсестры и больные, а также от торговых издержек и соответствующих юрисдикционных законов и правил, регулирующих предложение медицинских и диагностических средств. Предложение может быть индивидуализировано или выполнено с учетом потребностей заказчика на основе характеристик потребителя, определенных путем взаимодействия услуг и/или других данных, таких как демографические показатели и географическое расположение потребителя.

Диагностические наборы, анализы и изделия промышленного производства

Настоящий документ относится к диагностическому набору, содержащему один или несколько реагентов для определения наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума с заболеванием или нарушением, где наличие биомаркера PD-L1 означает более высокую вероятность эффективности лечения индивидуума антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, и где отсутствие биомаркера PD-L1 означает меньшую вероятность эффективности лечения индивидуума с заболеванием антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1. Необязательно набор дополнительно содержит инструкции по применению набора для выбора медицинского препарата (например, антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, такого как антитело против PD-L1) для лечения заболевания или нарушения, если у индивидуума экспрессируется биомаркер PD-L1. Согласно другому варианту осуществления инструкции касаются применения набора для выбора медицинского препарата, отличного от антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, если у индивидуума не экспрессируется биомаркер PD-L1.

Настоящий документ также относится к анализу для идентификации индивидуума с заболеванием или нарушением для получения антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, при этом способ включает определение наличия биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума и рекомендацию антагониста, связывающегося с компонентом сигнального пути PD-L1, на основании наличия биомаркера PD-L1.

Настоящий документ также относится к изделиям промышленного производства, содержащим упакованные вместе антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитела против PD-L1) в фармацевтически приемлемом носителе и информационный вкладыш в упаковке, указывающий на то, что антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитела против PD-L1) предназначен для лечения больного с заболеванием или нарушением на основании экспрессии биомаркера PD-L1. Способы лечения включают любые способы лечения, раскрываемые в настоящем документе. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу изготовления изделия промышленного производства, содержащего объединение в упаковке фармацевтической композиции, содержащей антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитела против PD-L1) и информационный вкладыш в упаковке, указывающий на то, что фармацевтическая композиция предназначена для лечения больного с заболеванием или нарушением на основании экспрессии биомаркера PD-L1.

Изделие промышленного производства содержит контейнер и этикетку или инструкцию по применению препарата, находящуюся в контейнере или связанную с контейнером. Приемлемые контейнеры включают в себя, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.п. Контейнеры могут быть сформованы из ряда материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер вмещает или содержит композицию, содержащую противораковый медицинский препарат в качестве активного средства, и может содержать отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции).

Изделие промышленного производства может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическую воду для инъекции (BWFI), фосфатно-буферный солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно содержать другие материалы, желаемые с коммерческой и потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Изделие промышленного производства в соответствии с настоящим изобретением также включает в себя информацию, например, в форме инструкции по применению препарата, указывающей на то, что композиция используется для лечения злокачественное заболевание на основании уровня экспрессии биомаркера(ов) в настоящем документе. Инструкция по применению препарата или этикетка может быть любой формы, например, бумага или электронный носитель, такой как магнитный регистрирующий материал (например, гибкий диск) или CD-ROM. Этикетка или инструкция по применению препарата также может включать в себя другую информацию, касающуюся фармацевтических композиций и дозированных форм в готовом наборе или изделии.

Настоящее изобретение также относится к способу изготовления изделия промышленного производства, содержащего объединение в упаковке фармацевтической композиции, содержащей антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-L1, (например, антитело против PD-L1) и информационный вкладыш в упаковке, указывающий на то, что фармацевтическая композиция предназначена для лечения больного злокачественным заболеванием (таким как NSCLC) на основании экспрессии биомаркера PD-L1.

Кроме того, изделие промышленного производства может включать в себя дополнительный контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавляющий буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекции (BWFI), фосфатно-буферный солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Готовое изделие может дополнительно включать в себя другие материалы, желаемые с коммерческой и потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Примеры

Далее следуют примеры способов и композиций в соответствии с настоящим изобретением. Следует понимать, что могут быть выполнены различные другие варианты осуществления, приведенные в вышеизложенном общем описании.

Материалы и способы для примеров

Образцы. Анализировали фиксированные в формалине, залитые парафином (FFPE) срезы образца опухоли или линию раковых клеток.

Иммуногистохимия (IHC). Фиксированные в формалине, залитые парафином тканевые срезы депарафинировали перед демаскировкой, блокированием и инкубацией антигена с первичными антителами против PD-L1. После инкубации со вторичным антителом и ферментативного проявления цвета срезы докрашивали и дегидратировали сериями спиртов и ксиленов перед накрыванием покровным стеклом.

Для IHC применяли следующий протокол. Использовали систему Ventana Benchmark XT или Benchmark Ultra для выполнения IHC окрашивания PD-L1 с использованием следующих реагентов и материалов:

первичное антитело: моноклональное первичное антитело против PD-L1 кролика,

тип образца: фиксированный в формалине, залитый парафином (FFPE) срез образцов ткани и дебрисы контрольных клеток с варьирующими интенсивностями окрашивания,

вид для процедуры: человек,

инструмент: BenchMark XT или Benchmark Ultra,

условия извлечения эпитопа: кондиционирование клеток, стандарт 1 (СС1, Ventana, №по каталогу 950-124),

условия первичного антитела: 1/100, 6,5 мкг/мл /16 минут при 36°С,

разбавитель: буфер для разбавления антитела (Tris-буферный солевой раствор, содержащий белок-носитель и Brig-35),

отрицательный контроль: наивный IgG кролика при 6,5 мкг/мл (клеточная передача сигнала) или только разбавитель,

выявление: использовали набор для выявления Optiview или Ultraview Universal DAB (Ventana) и набор для амплификации (если амплифицировали) согласно инструкциям изготовителя (Ventana),

докрашивание: Ventana Hematoxylin II (№ по каталогу 790-2208) / с реагентом Bluing (№по каталогу 760-2037) (4 минуты и 4 минуты соответственно).

Протокол Benchmark представлял собой следующее:

1. парафин (по выбору),

2. депарафинирование (по выбору),

3. кондиционирование клеток (по выбору),

4. кондиционер №1 (по выбору),

5. стандарт СС1 (по выбору),

6. температуры инкубации Ab (по выбору),

7. 36С Ab Inc. (по выбору),

8. титрование (по выбору),

9. автодозирование (первичное антитело) и инкубация (в течение 16 минут),

10. докрашивание (по выбору),

11. внесение одной капли (Hematoxylin II) (докрашивание), применение покровного стекла и инкубация (в течение 4 минут),

12. постдокрашивание (по выбору),

13. внесение одной капли (реагента BLUING) (постдокрашивание), применение покровного стекла и инкубация (в течение 4 минут),

14. промывка предметных стекол в мыльной воде для удаления масла,

15. ополаскивание предметных стекол водой,

16. дегидратация предметных стекол с помощью 95% этанола, 100% этанола -ксилена (программа Leica Autostainer №9),

17. покровное стекло.

Пример 1. Оценка экспрессии PD-L1 с помощью IHC

Наличие или отсутствие экспрессии PD-L1 в образцах опухоли оценивали с использованием специфичного антитела против PD-L1, которое может выявлять PD-L1 в фиксированных в формалине, залитых парафином (FFPE) тканях человека с помощью INC. Для измерения и количественного определения экспрессии PD L1 в образцах опухоли разрабатывали систему оценок PD L1 с помощью IHC для измерения специфичного сигнала PD L1 в опухолевых клетках и инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках. Иммунные клетки определяли как клетки с лимфоидной и/или макрофаговой/гистиоцитной морфологией.

Окрашивание опухолевых клеток выражали как процент всех опухолевых клеток, демонстрирующих мембранное окрашивание любой интенсивности. Окрашивание инфильтрующихся иммунных клеток определяли как процент общей площади опухоли, занимаемой иммунными клетками, которые демонстрировали окрашивание любой интенсивности. Общая площадь опухоли охватывает раковые клетки, а также ассоциированную с опухолью строму, в том числе участки иммунных инфильтратов, непосредственно соседствующие с основной опухолевой массой и прилегающие к ней. Кроме того, окрашивание инфильтрующихся иммунных клеток определяли как процент всех инфильтрующихся в опухоль иммунных клеток.

Наблюдали широкий динамический диапазон интенсивностей окрашивания PD-L1 в опухолевых тканях. Независимо от субклеточной локализации сигнал также классифицировали как сильное, умеренное, слабое или отрицательное окрашивание. Как показано на фиг. 1, отрицательная по компоненту сигнала интенсивность характеризуется отсутствием какого-либо выявляемого сигнала, как проиллюстрировано с использованием клеток HEK-293. Наоборот, положительная по компоненту сигнала интенсивность сигнала характеризуется мембранным окрашиванием от золотого до темно-коричневого, как проиллюстрировано с использованием клеток HEK-293, трансфицированных рекомбинантным человеческим PD-L1. Наконец, положительная по компоненту сигнала интенсивность также иллюстрируется окрашиванием плацентарных трофобластов и сильным окрашиванием на участке криптов миндалевидной железы и зачастую в мембранном паттерне, что характеризуется окрашиванием от золотого до темно-коричневого. В опухолевых тканях отрицательные по PD L1 образцы характеризовали количественно, как не проявляющие выявляемого сигнала или проявляющие только лишь слабое цитоплазматическое фоновое окрашивание, при оценивании с использованием 20х объектива. Наоборот, положительные по PD-L1 образцы демонстрировали, главным образом, мембранное окрашивание в опухолевых клетках и/или инфильтрующихся иммунных клетках. Окрашивание PD-L1 наблюдали с переменной интенсивностью от слабого с тонкими, светло-коричневыми мембранами до сильного с темно-коричневыми, толстыми мембранами, легко различимыми при низком увеличении. Как показано на фиг. 2, три типичных положительных по PD-L1 образца опухоли демонстрировали (А) трижды негативное злокачественное заболевание молочной железы, при котором большинство опухолевых клеток являются сильно положительными по PD-L1, показывающее комбинацию мембранного и цитоплазматического окрашивания (100х увеличение); (В) злокачественную меланому, демонстрирующую кластер иммунных клетки, некоторые из которых с мембранным окрашиванием по PD-L1, редкие опухолевые клетки (стрелки) с мембранным окрашиванием по PD-L1 (400х увеличение); (С) NSCLC, аденокарциному, в которой показан кластер иммунных клеток с сильным окрашиванием по PD-L1, некоторые опухолевые клетки (стрелки) с мембранным и/или цитоплазматическим окрашиванием по PD-L1 (400х увеличение).

Окрашивание в положительных случаях, как правило, является фокальным по отношению к пространственному распространению и интенсивности. Процентные отношения опухолевых или иммунных клеток, демонстрирующих окрашивание любой интенсивности, оценивали визуально и использовали для определения статуса PD-L1. Изотипный отрицательный контроль использовали для оценивания наличия фона в тестируемых образцах.

Для окрашивания требовались один серийный тканевый срез для Н&Е, второй серийный тканевый срез для антитела против PD-L1 и третий серийный тканевый срез для изотипного отрицательного контроля. Контроль линии PD-L1-трансфицированных клеток HEK-293 или предметные стекла с препаратом миндалевидной железы использовали в качестве серийных контролей и эталона для специфичности анализа.

Критерий статуса PDL-1

В некоторых случаях положительный статус PD-L1 может включать наличие заметного окрашивания PD-L1 любой интенсивности либо в опухолевых клетках, либо в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, занимающих до 50% площади опухоли, занимаемой опухолевыми клетками, ассоциированной внутриопухолевой и прилегающей перитуморальной десмопластической стромой. Таким образом, положительное окрашивание PD-L1 включает в себя вплоть до 50% опухолевых клеток или инфильтрующихся в опухоль иммунных клеток, демонстрирующих окрашивание любой интенсивности.

Оцениваемые препараты, окрашенные антитело против PD-L1, оценивали, как описано выше. Отрицательная интенсивность окрашивания характеризовалась отсутствием какого-либо выявляемого сигнала или сигнала, который характеризовался как бледно-серый - голубой (а не коричневый или рыжевато-коричневый) с отсутствием четкости мембраны. Случай считали отрицательным, если не наблюдалось (например, отсутствовало) окрашивание мембраны.

Пример 2. Лечения с использованием антитела против PD-L1

Согласно плану исследования фазы I специально оценивали корреляцию между статусом PD-L1 опухоли по оценке (а) IHC реагента антитела против PD-L1, (b) экспрессии гена PD-L1, измеренной с помощью реагента PD-L1 qPCR, (с) сигнатуры гена иммунного ответа, измеренной с помощью «иммуночипа» для мультиплексной qPCR, и клинической пользы монотерапевтического ингибирования пути PD-L1/PD-1, измеряемого с помощью (i) основанных на RECIST 1.1 ответов, (ii) критерия ответов, связанных с иммунной системой, (iii) PFS, (iv) OS, (v) частоты полного ответа, (vi) продолжительности ответа, (vii) PD за 6 недель. Больные расширенных групп должны были предоставить опухолевую ткань для оценивания статуса PD-L1 опухоли и либо зачислялись в расширенные группы независимо от статуса PD-L1 опухоли, либо зачислялись в расширенные группы, в которые больных отбирали проспективно на основании статуса PD-L1 опухоли, измеренного IHC анализом по PD-L1. Типы опухолей зачисленных специально включали в себя NSCLC (сквамозной и несквамозной гистологии), меланому, RCC, CRC, злокачественное заболевание желудка, злокачественное заболевание молочной железы, SCCHN, злокачественное заболевание поджелудочной железы, злокачественное заболевание мочевого пузыря и гематологические злокачественные новообразования. Кроме того, также были зачислены больные лимфомой, миеломой, саркомой, злокачественным заболеванием яичника, злокачественным заболеванием предстательной железы, злокачественным заболеванием пищевода, мелкоклеточным раком легкого, грибовидной гранулемой, злокачественным заболеванием клеток Меркеля, злокачественным заболеванием шейки матки, HPV или EBV+SCCHN и карциномой вилочковой железы.

Кроме того, с целью оценивания корреляции исходного статуса PD-L1 опухоли с клинической пользой от монотерапевтического ингибирования пути PD-L1/PD-1 в ходе исследования также оценивали пользу от (а) измерения статуса PD-L1 в архивных образцах опухоли по сравнению со свежими или последними образцами биоптата опухоли, (b) оценивания инфильтрации CD8+ Т-клеток в опухоли с помощью IHC реагента антитела против CD8, (с) оценивания окрашивания по PD-L1 в различных типах клеток %, компартментов или силы окрашивания, (d) влияния перитуморального по сравнению внутриопухолевым окрашиванием PD-L1 или CD8, (е) влияния амплификации с окрашиванием PD-L1, (f) влияния макроскопического препарирования опухоли перед qPCR или оцениванием с помощью иммуночипа, (g) влияния возраста и фиксации образца ткани на оценивание статуса PD-L1 и корреляции с пользой, (h) значения биопатата опухоли, взятого в ходе лечения, для оценивания клинической пользы или токсичности с использованием вышеописываемых способов определения характеристик опухоли, (i) значения PET визуализации FDG и контрастного усиления с помощью СТ для оценивания пользы в ходе лечения или для отбора больных, Q значения мутационного/онкогенного статуса опухоли (например, мутационный статус путей KRAS, bRAF, PI3K, статус Met, статус Her2neu, статус PTEN) в прогнозировании пользы для вышеописанного лечения, (k) числа СТС и определения характеристик PD-L1, (l) типа, подтипа и числа циркулирующих клеток, (m) циркулирующих в плазме/сыворотке крови биомаркеров, (n) этнических различий, (о) статуса курильщика, (р) статуса полиморфизма FcgRIII, (q) связанного с иммунной системой статуса полиморфизма.

План исследования. Данное исследование представляло собой многоцентровое исследование фазы I, разработанное для оценивания предварительной активности и безопасности лечения путем ингибирования пути PD-L1/PD-1 с использованием антитела против PD-L1 (MPDL3280A) для солидных и жидких опухолей. Было привлечено более 250 больных в более чем 17 международных центрах. Лечение с помощью MPDL3280A продолжали до прогрессирования заболевания, развития непереносимой токсичности в зависимости от клинического состояния больного (т.е. больным с признаком прогрессирования заболевания позволяли продолжить лечение в рамках исследования, если у них сохранялся ECOG PS, и был потенциал для клинической пользы по оценке исследователя). Промежуточный анализ данных этого исследования выполняли в несколько моментов времени после начала исследования, в том числе 10 января 2013 г. для больных, зачисленных в исследование, в том числе для больных, которые были зачислены до 1 июля 2012 г. (n=122). Эти данные подтверждают, что больные, опухоли которых экспрессировали более низкий уровень PD-L1, получали минимальную пользу от ингибирования пути PD-L1/PD-1, а те больные, у которых наблюдался более высокий уровень PD-L1 в их опухоли, в частности, как измерено в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, получали больше пользы, как измерялось с помощью длительности ответов, в ходе исследования.

В ходе исследования собирали данные по размеру опухоли и статусу выживаемости для оценивания PFS, общей выживаемости (OS), общей частоте ответа (ORR) и другим критериям, отмеченным выше. Сканы СТ получали в начальный момент и приблизительно каждые 6 недель. Визуализация некоторых больных включала в себя визуализацию с помощью FDG-PET. Биомаркеры крови оценивали в начальный момент и при исследовании по биомаркерам на основе крови и на основе подтипа клеток. Корреляция этих и других опухолевых биомаркеров с клиническими исходами способствовала идентификации прогностических биомаркеров, например, маркеров в кровотоке, которые могут отражать активность лекарственного средства или ответ на терапию. Кровь на сыворотку крови и плазму отбирали с согласия больных в предварительно определенные моменты времени и оценивали уровни этих исследуемых маркеров.

Пример 3. Оценка с помощью IHC образцов от индивидуумов, получающих лечение антителом против PD-L1. Показана корреляция между экспрессией PD-L1 и ответом на лечение

Как показано на фиг. 3А, образцы опухоли анализировали на предмет экспрессии PD-L1 у больных фазы I, получающих лечение антителом против PD-L1 MPDL3280A. Совокупность данных включает в себя больных, зачисленных до 1 июля 2012 г. Окрашивание по статусу PD-L1 в образцах опухоли выполняли с использованием протокола IHC, описываемого выше.

Предварительное результаты демонстрировали, что существует корреляция между экспрессией PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль клетках (IC), и клиническим ответом больных на лечение антителом PD-L1. В частности, у больных, которые демонстрировали либо частичный ответ (PR), либо полный ответ (CR) на лечение антителом PD-L1, наблюдалась корреляция с окрашиванием экспрессирующих PD-L1 инфильтрующихся в опухоль клеток по площади образца опухоли, выявляемых с помощью IHC. Площадь образца опухоли охватывает злокачественные клетки, а также ассоциированную с опухолью строму, в том числе площади иммунных инфильтратов, непосредственно соседствующие с основной массой опухоли и прилегающей к ней. Наоборот, опухоли больных, которые не показывали клинический ответ на лечение антителом PD-L1 (например, у которых наблюдалось прогрессирующее заболевание (PD)), демонстрировали более низкую экспрессию PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках по площади образца опухоли, р<0,0001.

Также наблюдали корреляцию между клиническим ответом больных на лечение антителом PD-L1 и окрашиванием экспрессирующих PD-L1 инфильтрующихся в опухоль иммунных клеток (IC) среди всех иммунных клеток. Как показано на фиг. 3В, больные демонстрировали отвечаемость на лечение с помощью антитела против PD-L1, которая коррелировала с окрашиванием экспрессирующих PD-L1 инфильтрующихся в опухоль клеток среди всех иммунных инфильтратов в образце опухоли. Общее число иммунных инфильтратов в образце опухоли определяли путем окрашивания Н&Е. Больные демонстрировали либо частичный ответ (PR), либо полный ответ (CR) на лечение антителом PD-L1, коррелирующий с окрашиванием экспрессирующих PD-L1 инфильтрующихся в опухоль клеток среди всех иммунных инфильтратов. Наоборот, опухоли больных, которые не показывали клинический ответ на лечение антителом PD-L1 (например, у которых наблюдалось прогрессирующее заболевание (PD)), демонстрировали более низкую экспрессию PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках на площади образца опухоли, р<0,0005.

Предварительные данные подтверждают, что статус PD-L1 опухоли может быть прогностическим маркером для идентификации больных, которые с большей вероятностью будут отвечать на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием лечения антителом против PD-L1. Наблюдаемая вначале клиническая польза по-прежнему включает в себя PR и/или CR, но продолжающееся наблюдение может отражать дополнительную пользу, в том числе продолжительность ответа, оценивание PFS, общую выживаемость (OS) и общую частоту ответа (ORR). Эти предварительные данные подтверждают, что экспрессия PD-L1 в образцах опухоли, в том числе экспрессия неинфильтрующихся в опухоль иммунных клеток (1С), может прогнозировать отвечаемость больного на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием лечения антителом против PD-L1. Кроме того, данные подтверждают, что статус PD-L1 опухоли может определять вероятность того, что больной будет получать пользу от лечения антителом против PD-L1.

Пример 4. Оценка с помощью qPCR образцов от индивидуумов, получающих лечение антителом против PD-L1. Показана корреляция между экспрессией PD-L1 и ответом на лечение

Для оценивания того, будет ли статус экспрессии гена PD-L1 коррелировать с ответом больного на лечение антителом PD-L1, с помощью qPCR определяли уровень экспрессии гена PD-L1 в образцах опухоли. Ткань от больных фазы 1 макроскопически препарировали для увеличения содержимого опухоли. Выделяли РНК из срезов FFPE и измеряли экспрессию гена PD-L1 с использованием методики на основе PCR (Fluidigm). Экспрессию PD-L1 нормализовали по конститутивному гену (GusB).

Выделение РНК с помощью FFPE

Н&Е боковые стороны FFPE образцов опухоли проверялись патологом на предмет диагностики ткани и оценивания содержимого опухоли. Если общее содержимое опухоли было меньше 70-75%, выделяли РНК из макроскопически препарированной ткани для увеличения содержимого опухоли.

FFPE тканевый срез депарафинировали с использованием реагента Envirene (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA, USA) перед получением тканевого лизата. Выделение РНК выполняли с использованием набора LC Pertuzumab FFPET RNA (Roche Diagnostic part #06474969001). Концентрацию РНК и отношение 260/280 определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop® ND-2000/8000 UV-Vis. Для каждого образца использовали 20 нг 200 нг РНК (в объеме 2 мкл) для анализа экспрессии гена с использованием BioMark Real-Time PCR Platform (панель Immune Fluidigm). Для анализа PDL1 с помощью qPCR использовали 110 нг 115 нг РНК.

Анализ PD-L1 с помощью qPCR

Выполняли qPCR для PD-L1 с использованием анализа mRNA PDL1 с помощью qRT-PCR, разработанного фирмой Roche Molecular Science (RMS). mRNA PDL1 и эталонных генов (GusB или TMEM55B) обратно транскрибировали, амплифицировали и выявляли с использованием реакционной смеси и Oligo Mix, предоставленной фирмой RMS, согласно инструкциям изготовителя. Условия термического циклирования были следующими: 1 цикл 50°С в течение 5 минут, 1 цикл 95°С в течение 1 минуты, 1 цикл 61°С в течение 30 минут, затем 2 цикла 95°С в течение 15 секунд и 61°С в течение 30 секунд, затем 53 циклов 92°С в течение 15 секунд и 61°С в течение 30 секунд, а затем 1 цикл 40°С в течение 30 секунд и 25°С в течение 10 секунд. Реакцию выполняли в Cobas z480 Analyzer (Roche). Уровни экспрессии PD-L1 определяли с использованием следующего способа дельта Ct (dCt): Ct(PD-L1) - Ct(эталонный ген). Совокупность данных включает в себя больных с образцами, имеющимися до 1 ноября 2012 г.

Как показано на фиг. 4, предварительные результаты демонстрировали, что существует корреляция между повышенной экспрессией гена PD-L1 в образцах опухоли и клиническим ответом больных на лечение антителом PD-L1. У больных, которые демонстрировали либо частичный ответ (PR), либо полный ответ (CR) на лечение антителом PD-L1, наблюдалась корреляция с экспрессией гена PD-L1 в образце опухоли. Наоборот, опухоли больных, которые не показывали клинической ответ на лечение антителом PD-L1 (например, у которых наблюдалось прогрессирующее заболевание (PD)), демонстрировали более низкую экспрессию гена PD-L1 в образце опухоли, р=0,0037.

Эти данные подтверждают, что статус экспрессии PD-L1 опухоли может быть применимым биомаркером для прогнозирования отвечаемости больного на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием антитела против PD-L1. Профиль экспрессии гена PD-L1 опухоли может быть получен из опухолевых клеток, инфильтрующихся в опухоль клеток или их комбинации.

Пример 5. Оценка с помощью qPCR образцов от индивидуумов, получающих лечение антителом против PD-L1. Показана корреляция между экспрессией PD-1 и ответом на лечение

Кроме корреляции, наблюдаемой между экспрессией гена PD-L1 в образцах опухоли и клиническим ответом больного, статус экспрессии гена PD-1 также демонстрировал корреляцию с клиническим ответом. Как показано на фиг. 5, наблюдали корреляцию между экспрессией гена PD-1 в образцах опухоли и клиническим ответом больных на лечение антителом PD-L1. У больных, которые демонстрировали частичный ответ (PR) на лечение антителом PD-L1, наблюдали корреляцию с экспрессией гена PD-1 в образце опухоли. Наоборот, корреляция была меньше со статусом экспрессии гена PD-1 у больных, которые не демонстрировали клинический ответ на лечение антителом PD-L1 (например, PD). р=0,0206. Совокупность данных включает в себя больных с образцами, имеющимися до 1 ноября 2012 г.

Эти предварительные данные подтверждают, что статус экспрессии PD-L1 опухоли может быть еще одним прогностическим маркером для идентификации больных, которые с большей вероятностью будут отвечать на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием лечения антителом против PD-L1. Экспрессия гена PD-1 в образцах опухоли, в том числе экспрессия в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках (IC), опухолевых клетках или их комбинации, может прогнозировать отвечаемость больного на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием лечения антителом против PD-L1.

Эти предварительные данные подтверждают, что статус PD-1 опухоли может быть еще одним прогностическим маркером для идентификации больных, которые с большей вероятностью будут отвечать на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием лечения антителом против PD-L1. Экспрессия гена PD-1 в образцах опухоли, в том числе экспрессия в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках (IC), опухолевых клетках или их комбинации, может прогнозировать отвечаемость больного на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием лечения антителом против PD-L1.

Пример 6. Сигнатура гена иммунного ответа опухоли в образцах от индивидуумов, получающих лечение антителом против PD-L1. Показана корреляция с ответом на лечение

Следующий протокол выполняли Для определения наличия корреляции между сигнатурами определенных генов иммунного ответа и отвечаемостью больных на лечение антителом против PD-L1.

Анализ экспрессии гена с помощью Fluidigm

Анализ экспрессии гена выполняли с использованием BioMark Real-Time PCR Platform (Immune Fluidigm). 2 мкл общей РНК обратно транскрибировали с cDNA и предварительно амплифицировали в одной реакции с использованием Superscript III/Platinum Taq и реакционной смеси 2Х (Invitrogen). Включали 96 серий праймеров/зондов Taqman в реакцию предварительной амплификации при конечном разбавлении 0,2Х аналитической концентрации Taqman (Applied Biosystems). Условия термического циклирования были следующими: 1 цикл 50°С в течение 15 минут, 1 цикл 70°С в течение 2 минут, затем 18 циклов 95°С в течение 15 секунд и 60°С в течение 4 минут.

Предварительно амплифицированную cDNA разбавляли в 1,94 раза, а затем амплифицировали с использованием Taqman Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) на платформе BioMark BMK-M-96.96 (Fluidigm) согласно инструкциям изготовителя. Все образцы анализировали в трех повторностях. Все анализы Taqman на панеле экспрессии представляли собой FAM-MGB и регулировались через Life Technologies либо были выполнены по заказу или разработаны по требованиям заказчика, в том числе пять эталонных генов GusB, SDHA, SP2, ТМЕМ55 В и VPS-33B. Для каждого образца вычисляли медиану значений Ct для эталонных генов, а уровни экспрессии определяли с использованием следующего способа дельта Ct(dCt): Ct(целевой ген) - медиана Ct(эталонные гены). В качестве альтернативы, во всех случаях, когда указано, уровни экспрессии определяли после нормализации значений Ct каждого целевого гена к среднему значению Ct всех генов.

Как показано на фиг. 6, существует корреляция между сигнатурами определенных генов иммунного ответа и ответом больного на лечение антителом против PD-L1. Результаты демонстрировали, что экспрессия определенных генов иммунного ответа коррелировала с ответом больного на лечение антителом против PD-L1. Например, выявляли, что гены иммунного ответа активации Т-клеток, в том числе IFN-g, CD8A, EOMES, гранзим А и CXCL9, коррелируют с частичным ответом больного на лечение антителом против PD-L1. Совокупность данных включает в себя больных с образцами, имеющимися до 1 ноября 2012 г.

Эти предварительные данные подтверждают, что были идентифицированы дополнительные прогностические биомаркеры, которые могут помочь в идентификации больных, которые с большей вероятностью будут отвечать на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием лечения антителом против PD-L1. Сигнатура гена иммунного ответа включает в себя без ограничения IFN-g, CD8A, EOMES, гранзим А и CXCL9 и является ассоциированной с активацией иммунных клеток.

Пример 7. Корреляция экспрессии PD-L1 и PD-L2 с ответом на лечение антителом против PD-L1

Определяли клиническую активность, безопасность и биомаркеры больных с местно распространенными или метастатическими опухолями, получающих лечение антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, таким как антитело против PD-L1.

Сообщалось, что PD-L1 и PD-L2 регулируют иммунные ответы Th1 и Th2. Экспрессируемый в опухоли PD-L1 при связывании с PD-1 или В7.1 в активированных Т-клетках может опосредовать ускользание злокачественного заболевания от иммунологических механизмов. Ингибирование связывания PD-L1 с его рецепторами представляет привлекательную стратегию для нарушения опухоль-специфичного Т-клеточного иммунитета. Однако PD-L2, экспрессируемый в микроокружении опухоли, также может связываться с экспрессирующими PD-1 Т-клетками, ослабляя их функцию. MPDL3280A (антитело против PD-L1), человеческое моноклональное антитело, содержащее сконструированный Fc-домен, разработанное для обеспечения Th1-контролируемого ответа для оптимизации эффективности и безопасности, описывается в настоящем документе вместе с результатами фазы I.

Материалы и способы. Исследование проводили с MPDL3280A, вводимым IV q3w, среди больных с местно распространенными или метастатическими солидными опухолями, в том числе с 3+3 группами повышения дозы и расширенной. ORR оценивали с помощью RECIST v1.1 и включали u/cCR и u/cPR. PD-L1 измеряли с помощью IHC (положительное сравнивали с отрицательным), a PD-L2 измеряли с помощью qPCR (высокое сравнивали с низким) в архивных образцах опухоли.

Результаты. Начиная с 1 февраля 2013 г. оценили 171 больного на безопасность. Введенные дозы включали в себя ≤ 1 (n=9), 3 (n=3), 10 (n=35), 15 (n=57) и 20 мг/кг (n=67). Больные в группах повышения дозы не испытывали ограничивающих дозу токсичностей (DLT). Максимально переносимую дозу (MTD) не выявляли. Больные получали MPDL3280A средней продолжительностью 147 дней (диапазон 1-450). У 41% больных регистрировали АЕ G3/4, независимо от атрибуции. Острый пневмонит не наблюдали. 122 больных, зачисленных до 1 июля 2012 г., оценивали на эффективность. Ответы RECIST наблюдали во многих типах опухолей, в том числе в NSCLC (9/37), RCC (5/39), меланоме (9/35), CRC (1/4) и злокачественном заболевании желудка (1/1). 21% ORR (25/122) наблюдали в невыбранных солидных опухолях с продолжительностью ответа в диапазоне от 1+до 253+дней. Другие больные демонстрировали замедленные ответы после выявленного рентгенографически прогрессирования (не включены в ORR). 24-недельная PFS составляла 42%. 94 больных с опухолями оценивали по статусу PD-L1, а 81 больного с опухолями оценивали по PD-L2. Средняя экспрессия PD-L2 была ≈2х выше в положительных по PD-L1 опухолях по сравнению с отрицательными по PD-L1 опухолями. ORR составляла 39% (13/33) для больных с положительными по PD-L1 опухолями по сравнению с 13% (8/61) для больных с отрицательными по PD-L1 опухолями. Больные с опухолями высокого уровня PD-L2 демонстрировали 27% ORR (11/41) по сравнению с 13% (5/40) для больных с опухолями низкого уровня PD-L2.

MPDL3280A было хорошо переносимым с отсутствием связанных с пневмонитом смертей. Наблюдали длительные ответы в ряде опухолей. Выявили, что статус PD-L1 и PD-L2 коррелирует с ответами на MPDL3280A. Эти предварительные данные дополнительно подтверждают, что экспрессия PD-L1, а также PD-L2 в образцах опухоли, в том числе экспрессия в опухолевых клетках, инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках (IC) и/или в микроокружении опухоли, таком как стромальная клетка, и каких-либо их комбинациях, может прогнозировать отвечаемость больного на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1. Данные, кроме того, подтверждают, что по статусу PD-L1 и PD-L2 опухоли можно определять вероятности того, что больной будет получать пользу от лечения антагонистом, связывающимся с компонентом сигнального пути PD-L1, таким как антитело против PD-L1.

Пример 8. Лечение антителом против PD-L1 ведет к повышенном активации Т-клеток у PD-L1+ больных, отвечающих на лечение

Определяли значение взятого в ходе лечения опухолевого биоптата для оценивания клинической пользы для больных, отвечающих на антитело против PD-L1 и идентификации фармакодинамических (PD) биомаркеров, ассоциированных с эффективностью лечения.

Как показано на фиг. 7, оценивали серийные опухолевые биоптаты, взятые до/в ходе лечения от больных, получающих лечение антителом против PD-L1, в ходе исследования фазы I. Парные исходные (которые включают в себя либо взятую до лечения, либо архивную опухолевую ткань) и взятые в ходе лечения опухолевые биоптаты от больных, получающих лечение антителом против PD-L1 (n=26), страдающих от различных симптомов, в том числе от меланомы, RCC, NSCLC, H&N, CRC, злокачественных заболеваний желудка и молочной железы, анализировали по инфильтрации CD8+ Т-клеток с использованием IHC реагента антитела против CD8, а также по фармакодинамическим биомаркерам посредством анализа экспрессии гена.

Как показано на фиг. 8(a), повышение инфильтрации CD8+ Т-клеток соотносили с повышением уровня экспрессии PD-L1 в образцах опухоли от больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1. При исходных условиях Т-клетки и PD-L1+ опухолевые клетки могут локализоваться совместно, и фокальная экспрессия PD-L1 может представлять собой область контакта между раковыми клетками и иммунными клетками (атака противоопухолевых Т-клеток может контролироваться экспрессией PD-L1 в опухоли или в иммунной клетке). На неделю 4 после дня 1 цикла 1 (C1D1) лечения антителом против PD-L1 выявляли повышение экспрессии PD-L1 в образце опухоли вместе с плотной лимфоцитарной инфильтрацией, в частности, инфильтрацией CD8+ Т-клеток. Такое повышение в CD8+ Т-клетках может приводить к опосредованному Т-клетками уничтожению опухолевых клеток, что в свою очередь может приводить к Т-клеточной пролиферации и активации. Такие активированные Т-клетки могут высвобождать IFN-g, а также могут индуцировать экспрессию PD-L1 в соседних опухолевых клетках и/или иммунных клетках.

Как показано на фиг. 8(b), выявили, что уровни маркеров Т-клеточной активации повышались у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1. Выявили, что уровни экспрессии гена маркеров активации Т-клеток, в том числе гранзима-А, перфорина, IFN-g, TNFa и CD8, повышались после лечения антителом против PD-L1 у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1, по сравнению с исходными уровнями до лечения.

Эти данные подтверждают, что повышение инфильтрации CD8+ Т-клеток коррелировало с повышением экспрессии PDL-1 в образцах опухоли от больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1. Кроме того, выявили, что экспрессия ряда маркеров активации Т-клеток, в том числе без ограничения гранзима-А, перфорина, IFN-g, TNFa и CD8, повышалась в образцах опухоли от больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1. Эти маркеры могут быть применимыми фармакодинамическими биомаркерами для оценивания клинической пользы и эффективности терапии, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1, что включает в себя использование антитела против PD-L1.

Пример 9. Адаптивное повышение экспрессии PD-L1, выраженное у больных, отвечающих на лечение

Кроме повышения инфильтрации CD8+ Т-клеток и экспрессии маркеров активации Т-клеток в образцах опухоли от больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1, также наблюдали повышение экспрессии PD-L1 в опухоли у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1.

Как показано на фиг. 9, представлено краткое изложение ответов на антитело против PD-L1 в парных опухолевых биоптатах. Во всех случаях (4/4 больных; 100%), при которых наблюдали >30% снижение в сумме самого длинного диаметра целевых очагов (SLD) у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1, также наблюдали повышение экспрессия PD-L1 в опухоли при измерении с помощью IHC PD-L1. Даже при 0-30% снижении SLD среди больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1, 33% из больных (2/6 больных) демонстрировали повышение экспрессии PD-L1 в опухоли после лечения.

Наоборот, среди больных, которые не отвечали на лечение антителом против PD-L1 и которые демонстрировали 0-20% повышение SLD, только 1/10 больных демонстрировал повышение экспрессии PD-L1 в опухоли. Кроме того, среди больных, которые демонстрировали >20% повышение SLD, ни один (0/4 больных) не демонстрировал какое-либо измеримое повышение экспрессии PD-L1 в опухоли.

Эти предварительные данные подтверждают, что экспрессия PD-L1 в опухолях может повышаться у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1, и что такое повышение может быть адаптивным повышением, что может служить фармакодинамическими биомаркерами, индикатором локально инфильтрующихся в опухоль лейкоцитов (TIL), атакующих опухоль, а также маркером для оценивания клинической пользы и эффективности терапии, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1, включающее использование антитела против PD-L1.

Пример 10. Лечение антителом против PD-L1 ведет к повышенной частоте активированных Т-клеток в крови

Также оценивали идентификацию фармакодинамических (PD) биомаркеров лечения антителом против PD-L1 в крови.

Анализ проточной цитометрии (FACS)

Цельную кровь собирали в покрытые гепарином натрия (NaHep) пробирки для сбора крови. Кровь перемешивали путем медленного переворачивания пробирки для сбора. Клетки окрашивали соответствующими комбинациями антител и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. После инкубации во все пробирки добавляли FACSLyse. Пробирки вращали на вортексе и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут. Клетки промывали с помощью PBS с 1% BSA. После промывания во все пробирки добавляли FACSPerm2 и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут. После инкубации клетки промывали с помощью PBS с 1% BSA и инкубировали с антителом, при необходимости. После инкубации клетки промывали с помощью PBS с 1% BSA и повторно суспендировали в 1% параформальдегиде. Пробирки хранили при 2-8°С до передачи их на проточный цитометр FACSCantoII.

Как показано на фиг. 10(a), пролиферирующие Т-клетки в крови, идентифицированные как являющиеся CD8+/Ki67+, повышают длительность курса лечения антителом против PD-L1 с ~2-кратным повышением в C2D1 (день 1 цикла 2) по сравнению с C1D1 (день 1 цикла 1). Кроме того, как показано на фиг. 10(b) пролиферирующие Т-клетки, которые также являются активированными в крови, идентифицированные как являющиеся CD8+/HLA-DR+/Ki67+, повышают длительность курса лечения антителом против PD-L1 и встречаются чаще в C2D1 (~2-кратное повышение).

Эти предварительные данные подтверждают, что пролиферация активированных Т-клеток в крови может повышать длительность курса лечения антителом против PD-L1 и может служить фармакодинамическим биомаркером терапии, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1, которое включает в себя использование антитела против PD-L1.

Пример 11. Снижение экспрессии IL-6 в плазме может быть ассоциировано с больными, отвечающими на лечение

Также оценивали идентификацию фармакодинамических (PD) биомаркеров лечения антителом против PD-L1 в плазме.

Анализ плазмы

Кровь собирали в покрытые гепарином натрия пробирки для сбора. Содержимое пробирки тщательно перемешивали путем медленного переворачивания пробирки для сбора. Затем пробирки для сбора центрифугировали в рефрижераторной центрифуге минимум при 1500-2000 х g в течение 15 минут. Плазму переносили в полиэтиленовые криопробирки и держали замороженными до анализа. Плазму анализировали на предмет IL-6 и других цитокинов с использованием модифицированного ELISA согласно рекомендациям изготовителя.

Как показано на фиг. 11, снижение уровня IL-6 в плазме соотносили с больными, отвечающими на лечение антителом против PD-L1. Конкретно, больные, которые демонстрировали эффективные ответы PR/CR (частичный ответ/полный ответ), в курсе лечения также демонстрировали измеримое снижение уровня IL-6.

Наоборот, больных, которые не получали пользу от лечения антителом против PD-L1, соотносили с повышением уровня IL-6 в плазме в курсе лечения. Как показано на фиг. 11, больные, которые демонстрировали ответы PD (прогрессирующее заболевание) в курсе лечения, показывали измеримое повышение уровня IL-6.

Эти предварительные данные подтверждают, что уровень IL-6 в плазме может служить фармакодинамическим биомаркером для оценивания клинической пользы и эффективности терапии, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1, которое включает в себя использование антитела против PD-L1.

Пример 12. Экспрессия гена иммунного ответа опухоли в образцах от индивидуумов, получающих лечение антителом против PD-L1. Показана корреляция с ответом на лечение

Для дальнейшего оценивания дополнительных сигнатур генов иммунного ответа и отвечаемости больных на лечение с протоколом, выполняли анализ экспрессии гена, как описывается выше в примере 6, с использованием анализа экспрессии гена с помощью Fluidigm.

Как показано на фиг. 12, существует корреляция между числом дополнительных связанных с иммунной системой генов и ответом больных на лечение антителом против PD-L1. Конкретно, наблюдали, что уровни экспрессии гена CTLA4 и CD45RO были более высокими у больных, которые демонстрировали либо частичный ответ (PR), либо полный ответ (CR) после лечения антителом против PD-L1, по сравнению с больными с прогрессирующим заболеванием (PD). На фиг. 12 также показано, что уровни экспрессии гена CX3CL1 (хемокина), LGLS9 (галектина-9), MIC-A и MIC-B, как наблюдали, были ниже у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1 (PR/CR), по сравнению с больными с PD. HK. Эти данные представляют объединенные уровни экспрессии гена от образцов, собранных от больных, страдающих симптомами следующих злокачественных заболеваний: меланома, RCC, NSCLC, CRC, злокачественное заболевание желудка, злокачественное заболевание мочевого пузыря, злокачественное заболевание яичника, злокачественное заболевание молочной железы, злокачественное заболевание головы и шеи, злокачественное заболевание поджелудочной железы, саркома, злокачественное заболевание пищевода, SCLC, множественная миелома, NHL и злокачественное заболевание эндометрия.

Интересно, что некоторые связанные с иммунной системой гены демонстрируют различные корреляционные паттерны с ответом больных на лечение антителом против PD-L1 в зависимости от симптома заболевания. Как показано на фиг. 13, уровень экспрессии гена IDO1 (индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы) был более высоким у больных меланомой, которые демонстрировали либо частичный ответ (PR), либо полный ответ (CR) после лечения антителом против PD-L1, по сравнению с больными с прогрессирующим заболеванием (PD). Однако у больных NSCLC уровень экспрессии гена IDO1 был ниже больных, которые демонстрировали либо PR, либо CR после лечения антителом против PD-L1, по сравнению с больными с PD. Таким образом, возможно, что эти биомаркеры могут демонстрировать различающиеся корреляционные профили в зависимости от симптома заболевания.

Эти результаты подтверждают, что были идентифицированы дополнительные прогностические биомаркеры, которые могут помочь в идентификации больных, которые с большей вероятностью будут отвечать на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1, такое как использование антитела против PD-L1.

Пример 13. Экспрессия PD-L1 в циркулирующих Т-клетках в крови коррелирует с ответом на лечение антителом против PD-L1

Для оценки того, будет ли экспрессия PD-L1 в циркулирующих Т-клетках коррелировать с ответом больных на лечение антителом против PD-L1, собирали образцы крови за 60 дней до лечения и выполняли анализ FAC для определения уровня экспрессии PD-L1 в Т-клетках образца.

Вкратце, образцы крови от больных до лечения собирали в пробирки, содержащие антикоагулянт (например, гепарин натрия, EDTA или цитрат). Собранную кровь тщательно перемешивали в пробирках для сбора путем медленного переворачивания пробирки для сбора по меньшей мере 3 раза. Приблизительно 100 мкл антикоагулированной цельной крови пипеткой переносили в соответственно меченые тестовые пробирки. Кровь окрашивали следующими первичными антителами и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте: антитело против CD3, антитело против CD8 и антитело против PD-L1. После окрашивания первичным антителом красные кровяные клетки лизировали с использованием, например, лизирующего раствора хлорида аммония, а затем клетки промывали 2 мл PBS с 1% BSA. Затем кровяные клетки окрашивали вторичным антителом или соответствующим количеством стрептавидина (красителя) (если использовали биотинилированное первичное антитело) в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре. Затем клетки снова промывали с помощью PBS, содержащего 1% BSA, повторно суспендировали в 1% параформальдегиде и хранили при 2-8°С до передачи их на проточный цитометр.

Как показано на фиг. 14, наблюдается корреляция между повышенной экспрессией PD-L1 в циркулирующих Т-клетках (CD3+/CD8+) и клиническим ответом больных на лечение антителом PD-L1. У больных, которые демонстрировали либо частичный ответ (PR), либо полный ответ (CR) после лечения антителом против PD-L1, наблюдалась корреляция с повышенными уровнями экспрессии PD-L1 в их циркулирующих Т-клетках. Наоборот, больные, которые не показывали клинический ответ на лечение антителом PD-L1 (например, у которых наблюдалось прогрессирующее заболевание (PD)), демонстрировали более низкую экспрессию PD-L1 в их циркулирующих Т-клетках.

Эти результаты подтверждают, что экспрессия PD-L1 в циркулирующих Т-клетках может быть ценным и применимым биомаркером прогнозирования отвечаемости больного на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1 с использованием, например, антитела против PD-L1.

Пример 14. Исследование фазы Ia индивидуумов, получающих лечение антителом против PD-L1, и корреляция с ответом на лечение у диагностически выбранных индивидуумов

Исследование PCD4989g является продолжающимся испытанием фазы 1а у больных с распространенными солидными опухолями и гематологическими злокачественными новообразованиями для оценивания безопасности и переносимости антитела против PD-L1 (MPDL3280A), вводимого внутривенной инфузией каждые 3 недели. Исследование включало большую группу больных NSCLC (n=79, в том числе 53 минимум с 6 месяцами последующего врачебного наблюдения).

Эти предварительные результаты исследования PCD4989g подтверждают, что экспрессия PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках ассоциируется с ответом на MPDL3280A. Положительность по PD-L1 у больных с NSCLC определяли как заметное окрашивание PD-L1 любой интенсивности в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, покрывающих ≥5% площади опухоли, занимаемой опухолевыми клетками, ассоциированными с внутриопухолевой и прилегающей перитуморальной десмопластической стромой. Ниже представлен предлагаемый критерий для диагностического оценивания PD-L1 у больных NSCLC.

На момент окончания сбора данных 30 апреля 2013 г. имелось 53 больных с местно распространенным или метастатическим NSCLC, принимавших дозу терапевтического средства до 1 октября 2012 г., с минимум 6-месячным последующим врачебным наблюдением. Средний возраст этой группы составлял 62 года (диапазон 24-84 года), и группа представляла собой в большой степени группу получающих предварительное лечение больных: 84,9% получали ≥2 предварительных системных терапевтических средства, а 52,8% получали ≥4 предварительных системных терапевтических средства. Существенные ответы наблюдали при NSCLC, в том числе у больных с неудовлетворительными результатами приема нескольких системных терапевтических средств и/или с клиническими проявлениями до начала лечения. Среднее время до ответа составляло 11,7 недели, при этом приблизительно 90% ответов наблюдали в течение 24 недель (6 месяцев). Объективная частота ответа (ORR) у всех больных NSCLC с минимумом 6-месячным последующим врачебным наблюдением составляла 22,6% (95% CI: 12,3%-35,1%).

Положительность по PD-L1 инфильтрующихся в опухоль иммунных клеток, по-видимому, прогнозирует более высокий ответ у больных NSCLC, получающих лечение с помощью MPDL3280A. Больные NSCLC с ≥5% положительных по PD-L1 инфильтрующихся в опухоль иммунных клеток (ШС 2/3) имели ORR 46,2% (95% CI: 22,4%-74,0%) по сравнению 18,2% (95% CI: 8,2%-33,8%) у больных с диагностическими профилями IHC 0/1. При использовании более высокого диагностического порога ≥10% положительных по PD-L1 инфильтрующихся в опухоль иммунных клеток (IHC 3) 83,3% положительных по PD-L1 больных имели ORR (95% CI: 40,2%-99,1%) по сравнению с 17,5% (95% CI: 7,8%-31,5%) больных с диагностическими профилями IHC 0/1. Предварительный опыт показывает, что диагностическое пороговое значение IHC 2/3 ассоциируется со значительной клинической пользой для больных NSCLC, получающих лечение с помощью MPDL3280A. У больных, которые отвечают, по-видимому, развивается длительный противоопухолевый иммунитет, при этом все ответы NSCLC длились от 170 до 534 дней при исследовании на момент окончания сбора данных.

Пример 15. Сигнатура гена иммунного ответа опухоли образцов от индивидуумов, получающих лечение антителом против PD-L1. Показана корреляция с ответом на лечение

Оценивали иммунологические фармакодинамические эффекты в опухолях и в крови больных, получающих лечение с помощью MPDL3280A. В ходе лечения отвечающие опухоли, демонстрировали повышение экспрессии PD-L1 опухолевых клеток и инфильтрующихся в опухоль иммунных клеток, инфильтрацию CD8+ Т-клеток и Th1-доминантный иммунный инфильтрат, обеспечивая доказательство адаптивной повышающей регуляции PD-L1. Больные, не отвечающие на лечение, демонстрировали минимальную инфильтрацию в опухоль CD8+ Т-клеток и отсутствие Т-клеточной активации (как измерено с помощью экспрессии гранзимов, перфорина и EOMES).

Как показано на фиг. 15, противоопухолевый ответ на MPDL3280A соотносили с маркерами, связанными с биологией Т-клетки. В частности, выявляли более высокую экспрессию гена цитотоксических Th1-клеток, IFN-g и маркеров миграции Т-клеток в опухолевой ткани в начальный момент и соотносили ее с активностью MPDL3280A. Например, выявили, что гены иммунной Т-клеточной активации, в том числе IFN-g, CD8A, гранзим В и CXCL9, коррелируют с частичным ответом/полным ответом больного на лечение с помощью MPDL3280A. Совокупность данных включает в себя больных с образцами, имеющимися до 1 июня 2013 г.

Как показано на фиг. 16, MPDL3280A ведет к повышенной Т-клеточной активации у больного с меланомой, отвечающего на лечение. В частности, выявили, что ряд маркеров Т-клеточной активации повышался у больных, отвечающих на MPDL3280A, в том числе гранзим-А, гранзим-В, перфорин, EOMES, IFN-g, TNF, CXCL9, CXCL10, CD8A и ICOS.

Наоборот, у больного с меланомой, неотвечающей на MPDL3280A, наблюдалась низкая частота внутриопухолевых Т-клеток и отсутствие Т-клеточной активации, как показано на фиг. 17.

Также оценивали циркулирующие биомаркеры по их связи с клиническими исходами. Частота CD8+HLA-DR+Ki67+Т- клеток в крови повышалась вскоре после первой дозы MPDL3280A и возвращалась к исходным уровням к концу цикла 2 при оценивании у всех больных, представляющем временное фармакодинамическое измерение ингибирования PD-L1. Как показано на фиг. 18, MPDL3280A ведет к временному повышению частоты активированных Т-клеток в крови и подтверждает то, что CD8+HLA-DR+Ki67+ Т-клетки могут быть потенциальным фармакодинамическим биомаркером лечения с помощью MPDL3280A.

Наблюдали значительные флуктуации в CD4+/ICOS+ Т-клетках с замедленными повышениями этой популяции Т-клеток, что коррелирует с ответом и снижает прогрессирование заболевания (возникающее после цикла 3), как показано на фиг. 19. Повышение CD4+/ICOS+ Т-клеток может отражать дополнительную активацию ответов Т-хелперных клеток у больных, у которых повышались сильные CD8+ противоопухолевые Т-клеточные ответы после лечения с помощью MPDL3280A.

Кроме того, адаптивное повышение экспрессии PD-L1 было выражено у больных, отвечающих на MPDL3280A. Как показано на фиг. 20, представлено краткое изложение ответов на MPDL3280A в парных опухолевых биоптатах. У больных, отвечающих на MPDL3280A, наблюдали повышение экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках, а также повышение экспрессии PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, как измерено IHC анализом PD-L1.

Пример 16. Корреляция экспрессии CTLA4 и фракталкина с ответом или прогрессированием после лечения антителом против PD-L1

Среди нескольких типов злокачественных заболеваний опухоли с предварительным лечением, характеризующиеся наличием экспрессии связанного с Th1 гена, CTLA4, и отсутствием фракталкина/CX3CL1, были ассоциированы с активностью. В частности, экспрессия CTLA4 сильно коррелировала с ответом на MPDL3280A. Тогда как экспрессия фракталкина/CX3CL1 в опухолях с предварительным лечением сильно коррелировала с прогрессированием в ответ на MPDL3280A, как показано на фиг. 21. Хорошо известна роль CTLA4 как фактора, экспрессированного Т-клетками, что может приводить к ингибированию дополнительной Т-клеточной активации. Корреляция более высокой экспрессии CTLA4 с предварительным лечением у больных, которые отвечали на MPDL3280A, среди различных типов опухолей, подтверждает, что CTLA4 служит важным механизмом обратной связи с противораковым иммунным ответом и представляет маркер связанного с активными Т-клетками иммунитета и воспаления. На периферии, однако, функциональная роль CTLA4 как отрицательного регулятора является менее важной, чем роль PD-L1.

Также была неожиданной корреляция более высокой экспрессии фракталкина (CX3CL1) с предварительным лечением у больных, которые испытывали прогрессирование заболевания в ответ на MPDL3280A, поскольку этот хемокин, как правило, ассоциируется с управлением Т-клеточной инфильтрации. Однако в своей нерасщепленной форме фракталкин индуцирует адгезию лимфоцитов с эндотелиальными клетками и поэтому может действительно ограничивать попадание Т-клеток в ложе опухоли. Связь экспрессии фракталкина в опухолях и прогрессирование заболевания у больных, получающих лечение с помощью MPDL3280A, подтверждает то, что экспрессия фракталкина также может представлять механизм обратной связи для опухолей с отсутствием активного иммунного ответа или может представлять подавляющий фактор активного иммунного ответа в опухоли.

Эти результаты подтверждают, что CTLA4 и фракталкин могут быть ценными прогностическими биомаркерами, помогающими идентифицировать больных, которые с большей вероятностью будут отвечать на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1, такое как с использованием антитела против PD-L1.

Пример 17. Сигнатуры инфильтрующихся в опухоль лимфоцитов среди шести типов злокачественных заболеваний и их связь с прогностическими факторами заболевания

Для дополнительного оценивания и понимания сложности факторов, которые могут модулировать или ингибировать противоопухолевый иммунитет и, таким образом, способствовать ответу или устойчивости по отношению к иммунномодулирующей терапии, применяли ряд высоко чувствительных анализов экспрессии генов иммунного ответа (iCHIP) с использованием платформы Fluidigm Biomark для исследования качества иммунного ответа при симптомах шести злокачественных заболеваний, в том числе CRC (n=48), ВС (n=126), NSCLC (n=51), меланомы (n=35), RCC (n=48) и злокачественного заболевания мочевого пузыря (n=42). Платформа iCHIP состоит из 96 генов, которые представляют сигнатуры, ассоциированные с путем IFNg, цитотоксическими Т-клетками, Th2-клетками, Т-эффекторными клетками, Т-эффекторными клетками, Т-регуляторными клетками, Th17-клетками, миелоидными клетками, дендритными клетками, NK-клетками, В-клетками и маркерами иммунных контрольных точек.

Экстрагировали РНК из фиксированных в формалине, залитых парафином архивных тканей, которые получали из клинических коллекций или собирали в ходе исследования фазы I MPDL3280A (антитела против PD-L1). Информированное согласие подходящих больных получали от институциональных наблюдательных советов на исследовательское оценивание биомаркеров.

Как показано на фиг. 22, представлены генные сигнатуры, ассоциированные с Teff (Т-эффекторными клетками), Treg (Т-регуляторными клетками) и Th17. Teff-клетки характеризуются генным кластером: CD8A, GZMB, IFNg, EOMES, GZMA, перфорин; Treg-клетки характеризуются генным кластером: FOXP3; и Th17-клетки характеризуются генным кластером: RORC, IL17F, IL17A.

Анализ экспрессии генов иммунного ответа демонстрировал уникальный паттерн иммуносупрессивных и иммунореактивных факторов и типов клеток среди симптомов. Тогда как симптомы, в том числе трижды негативное злокачественное заболевание молочной железы (TNBC), NSCLC и злокачественное заболевание мочевого пузыря, представляют максимальное преобладание сигнатур IFN-g, CRC и гормон-рецептор-положительное злокачественное заболевание молочной железы представляют собой заболевания с самой низкой экспрессией. Вдобавок к высокой сигнатуре IFN-g при TNBC этот подтип злокачественного заболевания молочной железы также характеризуется высокой сигнатурой Treg по сравнению с меланомой, которая представляет самое высокое отношение экспрессии гена IFN-g:Treg. Сигнатуры гена Th17 больше всего преобладают при CRC по сравнению со всеми другими симптомами. В настоящее время продолжается связывание этих генных сигнатур со стадией заболевания, исходами (если такие данные имеются) и другими известными специфичными прогностическими факторами заболевания, в том числе с молекулярными подтипами и мутациями в KRAS, BRAF, PIK3CA и EGFR.

В частности, в группе больных RCC наблюдали тенденцию к более высокой экспрессии гена IL17F в опухоли у больных, которые не отвечают на лечение антителом PD-L1, как показано на фиг. 23, несмотря на экспрессию в опухоли гена PD-L1 (CD274), являющуюся более высокой у больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1.

Кроме того, экспрессия в опухоли гена IL-17F является более высокой у больных с поздним ответом на антитело против PD-L1 (ответ через 6 месяцев терапии) среди симптомов (меланомы, злокачественного заболевания легкого, RCC), как показано на фиг. 24.

Таким образом, возможно, что определенные биомаркеры могут демонстрировать различные корреляционные профили в зависимости от стадии заболевания и времени терапии, включающей ингибирование пути PD-L1/PD-1.

Пример 18. Ингибирование PD-L1 с помощью MPDL3280A ведет к клинической активности у больных с метастатическим уротелиальным злокачественным заболеванием мочевого пузыря (UBC)

Метастатическое UBC ассоциируется с плохим прогнозом и ограниченными вариантами лечения. При этом заболевании преобладает экспрессия PD-L1 и может защищать раковые клетки от опосредованного иммунной системой разрушения путем связывания PD-1 и В7.1 с их рецепторами.

При исследовании фазы I больные UBC получали MPDL3280A по 15 мг/кг IV q3w сроком до 1 года. Объективную частоту ответа (ORR; в том числе неподтвержденных ответов) оценивали с помощью RECIST v1.1. Параллельно оценивали опухолевые и циркулирующие биомаркеры для исследования иммунных коррелятов MPDL3280A.

Начиная с 19 сентября 2013 г. 31 PD-L1+ больной UBC получал лечение с помощью MPDL3280A. Среди больных 84% составляли мужчины со средним возрастом 66 лет (42-86), 57% были ECOG PS 1, а 68% имели висцеральные метастазы. 71% ранее получали ≥ 2 терапевтических средств; 97% ранее получали химиотерапию на основе платины. Больные получали MPDL3280A средней продолжительностью 43 дня (1-153), на момент окончания сбора данных. Связанными с лечением G1-4 АЕ, наблюдающимися у ≥ 2 больных, были лихорадка, анемия, пониженный аппетит, утомление и тошнота. Связанные с G3-4 АЕ возникали у 3,2% больных. Не наблюдали АЕ, связанные с иммунной системой. У 20 больных оценивали эффективность в момент анализа со средним периодом наблюдения 2,8 месяца (1,4-5). ORR составлял 50% (1 CR и 9 PR) со средним временем ответа 43 дня (39-82) в соответствии с первым рентгенографическим оцениванием, в том числе у больных с метастазами в ЦНС, легком и кости в начальный момент.У всех больных, отвечающих на лечение, на момент клинического порогового значения все еще наблюдался ответ.

Наблюдали связи между статусом PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках и ответом на лечение антителом PD-L1 и продолжали дальнейшие оценивания для определения связи статуса PD-L1 в опухолевых клетках и ответа на лечение антителом PD-L1.

Лечение приводило к временным повышениям циркулирующих Ki-67+CD8+ Т-клеток, представляющих собой потенциальный фармакодинамический (PD) биомаркер активности, в ответ на терапию ингибитором пути PD-1/PD-L1 у больных с UBC. Как показано на фиг. 25, циркулирующие Ki-67+CD8+ Т-клетки демонстрировали временное повышение в ходе лечения с помощью MPDL3280A.

Лечения также приводило к временному повышению белков в плазме, таких как IL-18, который действует в противоположном направлении передачи сигнала IFN-g, представляющих другие PD биомаркеры активности, как показано на фиг. 26. Кроме того, исходный МСР-1 в плазме был ниже у больных с частичным ответом/полным ответом (PR7CR). Компоненты миелоидных клеток IL-18 и МСР-1 также были экспрессированы преимущественно в моноцитах (см. фиг. 26).

Данные экспрессии гена данные опухолей с предварительным лечением демонстрировали, что больные с прогрессированием имели пропорционально более высокую миелоидную генную сигнатуру. Как показано на фиг. 27, больные с прогрессирующим заболеванием (PD) демонстрировали повышенные уровни IL-8, CCL2 и IL1B, и их связывали с преимущественным присутствием в клетках миелоидного типа (например, в моноцитах, дендритных клетках).

MPDL3280A хорошо переносился этой группой с PD-L1+ UBC, получающей предварительное лечение. 50% получающих лечение больных отвечали на лечение. Ответы были быстрыми и постоянными. Анализ биомаркеров выявил PD маркеры, а также маркеры потенциальных механизмов устойчивости к терапии.

Пример 19. Повышенные уровни растворимого PD-L1 являются выраженными у больных, отвечающих на лечение

Повышенные исходные урони в плазме растворимого PD-L1 также наблюдали в образцах крови от больных, отвечающих на лечение антителом против PD-L1, в продолжающемся исследовании фазы I.

Кровь собирали в покрытые гепарином натрия пробирки для сбора. Содержимое пробирки тщательно перемешивали путем медленного переворачивания пробирки для сбора. Затем пробирки для сбора центрифугировали в рефрижераторной центрифуге минимум при 1500-2000 х g в течение 15 минут. Плазму переносили в полиэтиленовые криопробирки и держали замороженными до анализа. Плазму анализировали на предмет IL-6 и других цитокинов с использованием модифицированного ELISA согласно рекомендациям изготовителя.

Как показано на фиг. 28, у больных с RCC, которые отвечали на лечение антителом против PD-L1 с >=30% снижением в сумме самого большого диаметра целевых очагов (SLD), была выявлена корреляция с более высоким уровнем растворимого PD-L1 (sPDL1) в их образцах плазмы, чем у больных, которые демонстрировали только >=20% снижение SLD.

Эти предварительные данные подтверждают, что экспрессия растворимого PD-L1 в плазме может быть ценным и применимым биомаркером прогнозирования отвечаемости больного на противораковую терапию, которая включает ингибирование пути PD-L1/PD-1.

Пример 20. Связь экспрессии PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках и в опухолевой клетке с ответом на лечение антителом против PD-L1

В продолжающемся исследовании фазы I наблюдали очевидную связь ответа на лечение антителом PD-L1 с экспрессией PD-L1 и в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках (IC), и в опухолевых клетках. Как показано на фиг. 29, наблюдали связь между экспрессией PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках (IC) и ответом на лечение антителом PD-L1 у больных с NSCLC (фиг. 29(a)), а также у всех больных (фиг. 29(b)). Подобным образом, связь между экспрессией PD-L1 в опухолевых клетках (ТС) и ответом на лечение антителом PD-L1 наблюдали у больных с NSCLC (фиг. 30(a)), а также у всех больных (фиг. 30(b)).

Хотя вышеупомянутое настоящее изобретение с целью ясности понимания описано в некоторых подробностях с помощью иллюстраций и примеров, описание и примеры не следует расценивать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Раскрытия всей патентной и научной литературы, процитированные в настоящем документе, определенно включены посредством ссылки во всей своей полноте.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДЖЕНЕНТЕК, ИНК. И ДР.

<120> БИОМАРКЕРЫ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С PD-1 И PD-L1 СОСТОЯНИЙ

<130> P5574R1-WO

<140>

<141>

<150> 61/883,186

<151> 2013-09-26

<150> 61/829,236

<151> 2013-05-30

<150> 61/812,678

<151> 2013-04-16

<150> 61/802,296

<151> 2013-03-15

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /replace="Gly"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(10)

<223> /note="Variant residues given in the sequence have no

preference with respect to those in the annotations

for variant positions"

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> /replace="Leu"

<220>

<221> VARIANT

<222> (10)..(10)

<223> /replace="Ser"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> /note="Variant residues given in the sequence have no

preference with respect to those in the annotations

for variant positions"

<400> 2

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 3

Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 5

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

1 5 10

<210> 6

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 6

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(5)

<223> /replace="Val"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /replace="Ile"

<220>

<221> VARIANT

<222> (7)..(7)

<223> /replace="Asn"

<220>

<221> VARIANT

<222> (9)..(9)

<223> /replace="Phe"

<220>

<221> VARIANT

<222> (10)..(10)

<223> /replace="Leu"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

<223> /note="Variant residues given in the sequence have no

preference with respect to those in the annotations

for variant positions"

<400> 8

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> /replace="Thr"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /replace="Ala"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> /note="Variant residues given in the sequence have no

preference with respect to those in the annotations

for variant positions"

<400> 9

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<220>

<221> VARIANT

<222> (3)..(3)

<223> /replace="Gly" or "Phe" or "Ser"

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> /replace="Tyr" or "Phe" or "Trp"

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(5)

<223> /replace="Asn" or "Ala" or "Thr" or "Gly" or "Phe" or "Ile"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /replace="Val" or "Pro" or "Thr" or "Ile"

<220>

<221> VARIANT

<222> (8)..(8)

<223> /replace="Trp" or "Arg" or "Pro" or "Thr"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(9)

<223> /note="Variant residues given in the sequence have no

preference with respect to those in the annotations

for variant positions"

<400> 10

Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr

1 5

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 12

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 13

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 14

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 15

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 16

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 17

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 18

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 19

Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr

1 5

<210> 20

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 21

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<---

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к биомаркерам для лечения патологических состояний, таких как злокачественное заболевание, и к способу применения антагонистов пути PD-1/PD-L1. В частности, представлены биомаркеры для отбора больных и прогнозирования злокачественного заболевания, а также способы терапевтического лечения, изделия промышленного производства и способы их получения, диагностические наборы, способы выявления и способы предложения, связанные с ними. Изобретение предлагает улучшенные способы лечения злокачественных новообразований. 2 н. и 28 з.п. ф-лы, 30 ил., 1 табл., 20 пр.

1. Способ лечения индивидуума со злокачественным заболеванием, включающий

(a) определение уровня белка PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках в образце опухолевой ткани, полученной от индивидуума до лечения антителом против PD-L1, и

(b) введение индивидууму эффективного количества антитела против PD-L1, основанное на выявляемом уровне экспрессии белка PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, покрывающих ≥ 10% площади опухоли в образце опухолевой ткани от индивидуума, и где антитело против PD-L1 представляет собой MPDL3280A.

2. Способ лечения индивидуума со злокачественным заболеванием, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела против PD-L1, при этом

индивидуум был определен как имеющий выявляемый уровень экспрессии белка PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, покрывающих ≥ 10% площади опухоли в образце опухолевой ткани, полученной от индивидуума до лечения антителом против PD- L1, и где антитело против PD-L1 представляет собой MPDL3280A.

3. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий определение наличия или уровня PD-1, PD-L2 или как PD-1, так и PD-L2.

4. Способ по любому из пп. 1-3, дополнительно включающий определение наличия или уровня одного или нескольких связанных с Т-клеткой маркеров.

5. Способ по п. 4, где один или несколько связанных с Т-клеткой маркеров представляют собой CD8A, IFN-g, EOMES, гранзим-A, гранзим-B, CXCL9 или их комбинацию.

6. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий определение наличия или уровня одного или нескольких связанных с иммунной системой маркеров.

7. Способ по п. 6, в котором связанный с иммунной системой маркер представляет собой CX3CL1, CD45RO, IDO1, галектин 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 или их комбинацию.

8. Способ по любому из пп. 1-7, при котором злокачественное заболевание представляет рак легкого, рак почки, злокачественное заболевание толстой и прямой кишки, злокачественное заболевание яичника, злокачественное заболевание молочной железы, злокачественное заболевание поджелудочной железы, злокачественное заболевание желудка, злокачественное заболевание мочевого пузыря, злокачественное заболевание пищевода, злокачественное заболевание кожи, злокачественное заболевание головы и шеи, саркому, злокачественное заболевание предстательной железы, злокачественное заболевание шейки матки, карциному вилочковой железы или гематологическое злокачественное новообразование.

9. Способ по п. 8, в котором:

(a) рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) или мелкоклеточный рак легкого;

(b) рак почки представляет собой почечно-клеточную карциному;

(c) злокачественное заболевание кожи представляет собой меланому или злокачественное заболевание клеток Меркеля;

(d) злокачественное заболевание молочной железы представляет собой трижды негативное злокачественное заболевание молочной железы;

(e) гематологическое злокачественное заболевание представляет собой лимфому, миелому или грибовидную гранулему;

(f) злокачественное заболевание толстой и прямой кишки представляет собой местнораспространенное или метастатическое злокачественное заболевание;

(g) злокачественное заболевание желудка представляет собой местнораспространенное или метастатическое злокачественное заболевание желудка; или

(h) злокачественное заболевание мочевого пузыря представляет собой уротелиальное злокачественное заболевание мочевого пузыря.

10. Способ по п. 9, в котором:

(a) NSCLC представляет собой местнораспространенное или метастатическое NSCLC;

(b) почечно-клеточная карцинома представляет собой местнораспространенную или метастатическую почечно-клеточную карциному;

(c) меланома представляет собой местнораспространенную или метастатическую меланому; или

(d) уротелиальное злокачественное заболевание мочевого пузыря представляет собой метастатическое уротелиальное злокачественное заболевание мочевого пузыря.

11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором образец опухолевой ткани дополнительно включает опухолевые клетки, стромальные клетки или их комбинации.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором образец опухолевой ткани фиксируется в формалине и заливается парафином, архивируется, является свежим или замороженным.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где белок PD-L1 выявляется в образце опухолевой ткани с использованием клеточной сортировки с активацией флуоресценции (FACS), вестерн-блоттинга, иммуноферментного анализа (ELISA), иммунопреципитации, иммуногистохимии (IHC), иммунофлуоресценции, радиоиммуноанализа, дот-блоттинга, иммунологических анализов, высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), поверхностного плазмонного резонанса, оптической спектроскопии, масс-спектрометрии или их комбинаций.

14. Способ по п. 13, где уровень белка PD-L1 определяется с помощью IHC.

15. Способ по п. 14, где белок PD-L1 выявляют с использованием диагностического антитела против PD-L1.

16. Способ по п. 14 или 15, где белок PD-L1 выявляется как слабая интенсивность окрашивания с помощью IHC.

17. Способ по п. 14 или 15, где белок PD-L1 выявляется как умеренная интенсивность окрашивания с помощью IHC.

18. Способ по п. 14 или 15, где белок PD-L1 выявляется как сильная интенсивность окрашивания с помощью IHC.

19. Способ по любому из пп. 14-18, где IHC выполняется с использованием Ventana Benchmark XT или Benchmark Ultra.

20. Способ по любому из пп. 14-19, где окрашиванием является мембранное окрашивание, цитоплазматическое окрашивание или как мембранное, так и цитоплазматическое окрашивание.

21. Способ по любому из пп. 1-20, в котором уровень белка PD-L1 в инфильтрующихся в опухоль иммунных клетках, покрывающих ≥ 10% площади опухоли в образце опухолевой ткани, указывает на то, что индивидуум характеризуется вероятностью получения повышенной клинической пользы, когда индивидуума лечат антителом против PD-L1.

22. Способ по любому из пп. 3-21, где наличие или уровень PD-1, PD-L2 или как PD-1, так и PD-L2 выявляется в образце опухолевой ткани с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты.

23. Способ по любому из пп. 5-22, где наличие или уровень CD8A, IFN-g, EOMES, гранзима-A, гранзима-B, TNF-a, CXCL9, перфорина или их комбинации выявляется в образце опухолевой ткани с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты.

24. Способ по любому из пп. 7-23, где наличие или уровень CX3CL1, CD45RO, IDO1, галектина 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 или их комбинации выявляется в образце опухолевой ткани с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты.

25. Способ по любому из пп. 22-24, где повышение уровня PD-1, PD-L2, CD8A, EOMES, гранзима-A, гранзима-B, CXCL9, CX3CL1, CD45RO, IDO1, галектина 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 или их комбинации в образец опухолевой ткани по сравнению с уровнем PD-1, PD-L2, CD8A, EOMES, гранзима-A, гранзима-B, CXCL9, CX3CL1, CD45RO, IDO1, галектина 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 или их комбинации в эталонном образце указывает на то, что индивидуум, вероятно, будет характеризоваться повышенной клинической пользой от лечения антителом против PD-L1.

26. Способ по любому из пп. 22-25, в котором PD-1, PD-L2, CD8A, EOMES, гранзим-A, гранзим-B, CXCL9, CX3CL1, CD45RO, IDO1, галектин 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 или их комбинацию выявляют в образце опухолевой ткани с помощью RT-qPCR или RNA-Seq.

27. Способ по п. 21 или 25, в котором повышенная клиническая польза включает относительное повышение одного или нескольких из следующих показателей: общая выживаемость (OS), выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR) или их комбинации.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что повышенная клиническая польза включает относительное повышение OS, PFS или как OS, так и PFS.

29. Способ по п. 25, в котором эталонный образец представляет собой:

(a) образец, полученный от одного или нескольких индивидуумов со злокачественным заболеванием, которые не являются индивидуумами, получающими лечение;

(b) образец, полученный от одного или нескольких здоровых индивидуумов, которые не являются индивидуумами, получающими лечение; или

(c) образец, полученный от индивидуума, получающего лечение.

30. Способ по п. 25 или 29, в котором эталонный образец представляет собой образец ткани, образец плазмы или образец сыворотки.