СИНЕРГЕТИЧЕСКАЯ КОМБИНАЦИЯ АЛАНИН-ГЛУТАМИНА, ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЭКСТРАКТА ОВСА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН И ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ КОЖИ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/05 A61K36/899 A61K31/728 A61P17/02 

Настоящее изобретение касается синергетической комбинации, содержащей дипептид L-аланил-L-глутамин, гиалуроновую кислоту или одну из ее солей, и экстракт овса, которая преимущественно предназначена для заживления ран и восстановления повреждений кожи.

Заживление - это последовательность явлений местной защиты, которые происходят после повреждения: травмы, ожога, дерматологической операции, хирургического вмешательства. В процессе этих явлений из крови и тканей выделяются многочисленные активные продукты: ферменты, различные белки, гистамин и др. Заживление включает в себя несколько стадий, первой из которых является коагуляция крови, остановка кровотечения. Лейкоциты из крови уничтожают мертвые клетки. Затем выжившие клетки пролиферируют и приводят к образованию новой ткани, появление которой зависит от локализации поражения.

Заживление зависит от нескольких факторов, в частности от факторов питания, метаболизма, эндокринных или лекарственных факторов; задержка заживления наблюдается у истощенных и пожилых субъектов, или в случае длительного принятия кортикоидов. С возрастом процесс улучшения заживления и восстановления повреждений кожи фактически становится менее эффективным, он является более медленным.

До сих пор существует необходимость предложения новых композиций для быстрого и эстетического восстановления повреждений кожи.

Фармакологические свойства дипептида L-аланил-L-глутамина, вводимого перорально, описанные в литературе, являются многочисленными.

Среди прочего, дипептид L-аланил-L-глутамин используется перорально как добавка для людей, занимающихся спортом, чтобы облегчить восстановление после нагрузок, и после хирургического вмешательства, чтобы уменьшить время госпитализации.

Этот дипептид также рекомендуется для парентерального питания в качестве дополнения к стандартному раствору аминокислот или к другим смесям, используемым для парентерального питания пациентов в реанимации, которым необходимо потребление глутамина.

Авторы настоящего изобретения показали удивительным образом, что дипептид L-аланил-L-глутамин, вводимый местно, обладает на коже биологической активностью, основанной на его регенеративных свойствах: действием на миграцию кератиноцитов.

Кроме того, авторы настоящего изобретения также показали, что эта активность значительно усиливается, когда этот дипептид комбинируют с экстрактом овса и гиалуроновой кислотой.

В частности, авторы изобретения показали, что существует синергетический эффект между тремя компонентами, которыми являются экстракт овса и, более конкретно, экстракт проростков овса, гиалуроновая кислота или одна из ее солей, и L-аланил-L-глутамин, на миграцию кератиноцитов. Этот эффект является особенно интересным для регенерации тканей и заживления повреждений кожи.

Фактически, миграция эпителиальных клеток является важным шагом в развитии и процессе восстановления тканей, таком как эмбриогенез и заживление.

Механизмы инициации, координации и остановки миграции клеток полностью не выяснены, однако жизненно важная роль миграции клеток хорошо известна. Было охарактеризовано несколько агентов, способных стимулировать этот клеточный процесс, например, некоторые матричные или цитоплазматические белки (SANTORO MM., GAUDINO G., Cellular and molecular facets of keratinocyte reepithelization during wound healing. EXP. CELL. RES. 304 (1): 274-286, 2005) (WERNER S., GROSE R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. PHYSIOL. REV. 83 (3): 835-870, 2003) (STEFFENSEN В., AKKINEN L, LARIAVA H. Proteolytic events of wound healing-coordinated interactions among matrix metallopteinases (MMPs), integrins, and extracellular matrix molecules. CRIT. REV. ORAL BIOL. MED. 12 (5): 373-398, 2001).

Во время заживления кожи и при хронических дерматологических воспалительных поражениях кератиноциты "активируются", чтобы начать процесс миграции. Затем клетки видят их фенотип, на который повлияли, с одной стороны, взаимодействие с внеклеточным матриксом и, с другой стороны, межклеточные взаимодействия (MCMILLAN J.R., AKIYAMA М., SHIMIZU Н. Epidermal basement membrane zone component: ultrastructural distribution and molecular interactions. J DERM SC. 31: 169-177, 2003). Кератиноциты базального слоя краев раны мигрируют на рану и покрывают ее. Фактически, кератиноциты активируются при контакте с фибронектином, интерстициальным коллагеном дермы (тип 1), коллагеном IV и ламинином 5 базальной мембраны. Они также регулируются определенными полипептидными факторами роста, такими как TGFβ, TGFα и EGF. Кроме того, цитокины (IL1, TNFα) и хемокины (RANTES и IL8) также способствуют увеличению скорости реэпителизации раны после активации кератиноцитов (SZABO I., WETZEL М.А., ROGERS TJ. Cell-Density-Regulated Chemotactic Responsiveness of Keratinocytes In Vitro. J INVEST DERMATOL 117: 1083-1090, 2001).

Краткое описание графических материалов

Единственная прилагаемая фигура иллюстрирует эффект экстракта проростков овса/гиалуроновой кислоты и L-аланил-L-глутанмина, и их комбинаций на миграцию кератиноцитов.

Предметом настоящего изобретения является комбинация, содержащая L-аланил-L-глутамин, гиалуроновую кислоту или одну из ее солей, и экстракт овса.

Термин "L-аланин" относится к (S)-2-аминопропановой кислоте, называемой также альфа-аминопропионовая кислота. L-аланин является нейтральной аминокислотой со слабыми неполярными и гидрофобными свойствами.

Термин "L-глутамин" относится к полуамиду 2-аминоглутаровой кислоты. L-глутамин является заменимой аминокислотой, которая является полярной, незаряженной и гидрофильной.

В конкретном варианте осуществления изобретения комбинация содержит гиалуроновую кислоту или одну из ее солей с высокой молекулярной массой. Предпочтительно молекулярная масса будет составлять от 50000 до 750000 Да, предпочтительно между 250000 и 450000 Да.

Соль гиалуроновой кислоты предпочтительно будет представлять собой гиалуронат натрия.

Согласно варианту осуществления изобретения соль гиалуроновой кислоты будет иметь молекулярную массу в диапазоне от 50000 до 750000 Да, предпочтительно между 250000 и 450000 Да.

В одном варианте осуществления изобретения экстракт овса получают из проростков овса, предпочтительно как описано в WO 2010/054879.

Понятие "проростки овса" в смысле настоящего изобретения означает овес до колошения, то есть на стадии после появления всходов (приблизительно от 2 недель до 2 месяцев после прорастания), стадии от выхода в трубку до колошения не включены. Понятие "выход в трубку" означает фазу роста, которая соответствует удлинению стебля и возникновению колоса, перед цветением. В качестве компонентов экстракта проростков овса в заявке на патент WO 2010/054879 описаны вторичные метаболиты: флавоноиды и сапонины из типа авенакозидов. Указанный экстракт характеризуется содержанием от 2 до 15% флавоноидов и от 0,2 до 2% авенакозидов А и В.

Способ получения экстракта овса может быть следующим:

- сушка и перемалывание частей овса, предпочтительно проростков овса,

- экстрагирование в органическом растворителе, выбранном из группы, состоящей из кетонов, сложных эфиров, С1-С4-спиртов и их смесей в любом смешиваемом соотношении этих растворителей, и

- центрифугирование или фильтрация.

Предпочтительно органический растворитель в способе согласно изобретению выбирают из группы, состоящей из ацетона, метилэтилкетона, метилизобутилкетона, этилацетата, С1-С4 спирта и смеси в любом смешиваемом соотношении этих растворителей.

Жмых, полученный на стадии экстракции, затем отделяют от экстракта путем центрифугирования или фильтрации, и раствор может быть более или менее концентрированным, пока не будет получен сухой экстракт.

Согласно варианту осуществления изобретения на стадии сушки можно добавить носитель в массовом соотношении от 1 до 75% в расчете на сухое вещество экстрагируемого материала. Носитель может представлять собой сахар, такой как мальтодекстрин, лактоза, диоксид кремния или любой другой косметологически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения раствор концентрируют с получением сусла, содержащего от 60 до 80% сухого вещества, предпочтительно 70% сухого вещества.

В конкретном варианте осуществления изобретения комбинация согласно изобретению характеризуется тем, что массовое соотношение гиалуроновая кислота/экстракт овса/L-аланил-L-глутамин составляет, соответственно, от 2/1/3 до 2/1/5.

В другом варианте осуществления массовое соотношение гиалуроновая кислота/экстракт овса/L-аланил-L-глутамин составляет, соответственно, 2/1/4.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиция согласно изобретению имеет массовое соотношение гиалуроновая кислота/экстракт овса/L-аланил-L-глутамин, соответственно, 2/1/4.

Другим предметом настоящего изобретения является новая дерматологическая или косметическая композиция, предназначенная для ускорения восстановления кожи для восстановления целостности и качества кожи.

Композиция согласно изобретению содержит в качестве дерматологического или косметического активного ингредиента описанную выше комбинацию гиалуроновой кислоты, экстракта овса и L-аланил-L-глутамина, и дополнительно содержит по меньшей мере один дерматологически или косметически приемлемый эксципиент.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция предназначена для местного применения.

Дерматологически (фармацевтически) или косметически приемлемыми эксципиентами могут быть любые эксципиенты, известные специалистам в данной области для получения композиции для местного применения в форме молочка, крема, бальзама, масла, лосьона, геля, пенного геля, мази, спрея, и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция будет в форме крема, мази.

В одном варианте осуществления изобретения композиция включает по меньшей мере один другой активный ингредиент.

"Активный ингредиент" в соответствии с настоящим изобретением означает любое вещество, обладающее дерматологическими или косметическими свойствами.

Этот другой активный ингредиент может быть, в частности, выбран из группы, включающей заживляющие, успокаивающие, противозудные агенты, агенты против старения, против морщин, против радикалов, против УФ излучения, агенты, стимулирующие синтез дермальных макромолекул или энергетический метаболизм, увлажняющие, антибактериальные, противогрибковые, противовоспалительные, анестезирующие агенты.

Предпочтительно будут использоваться заживляющие и/или успокаивающие агенты.

Наконец, еще одним предметом настоящего изобретения является применение композиций на основе комбинации гиалуроновой кислоты, экстракта овса и L-аланил-L-глутамина для лечения и заживления повреждений кожи.

Настоящее изобретение относится, кроме того, к комбинации гиалуроновой кислоты, экстракта проростков овса и L-аланил-L-глутамина в соответствии с изобретением для получения композиции, предназначенной для улучшения миграции кератиноцитов.

Композиция согласно настоящему изобретению предназначена для лечения поврежденной кожи:

- после инвазивных операций/лечения: хирургических вмешательств (иссечение, срезание) со швами или без швов, после криотерапии, удаления лазером, умеренных или сильных пилингов, мезотерапии, кюретажа;

- после травм при поверхностных порезах или ожогах.

- после поверхностных (неинвазивных) операций, требующих применения заживляющего продукта, который ускоряет восстановление кожи и может быть использован длительное время (вплоть до полного восстановления кожи).

- после небольшого изменения поверхности: поверхностных ссадин, солнечных ожогов.

Лечение повреждений кожи и слизистых оболочек в соответствии с изобретением может, в частности, включать лечение порезов, ссадин, швов, царапин, потертостей, послеоперационных рубцов или пост-эстетических дерматологических вмешательств, поверхностных ожогов, солнечных ожогов.

Настоящее изобретение относится, кроме того, к применению косметической композиции в соответствии с изобретением для улучшения заживления и восстановления кожи.

Изобретение будет лучше понято после рассмотрения результатов, представленных ниже, которые иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.

Фармакологическая оценка влияния на миграцию кератиноцитов

Цель этого испытания заключалась в оценке влияния гиалуроновой кислоты, экстракта проростков овса, L-аланил-L-глутамина и их комбинаций на миграцию кератиноцитов с использованием набора для анализа миграции клеток (Oris Cell Migration Assay kit, Platypus Technologies).

Биологический материал

Была использована клеточная линия НаСаТ спонтанно иммортализованных кератиноцитов человека, которую часто приводят в качестве эталонной модели в литературе.

Протокол миграции клеток

Протокол, используемый для изучения миграции клеток, основан на использовании 96-луночного набора Oris Cell Migration Assay (Platypus technologies - TEBU), обеспечивающего миниатюризацию и количественное определение этого клеточного процесса.

Принцип этого испытания состоит в изучении миграции клеток к центру лунки 96-луночного планшета. Он заключается в размещении в лунках стопора для создания зоны обнаружения диаметром 2 мм. Затем стопор удаляют после того, как клетки должным приклеились к поверхности вокруг них, и таким образом обеспечивается миграция клеток к зоне обнаружения. Пластины без стопоров и с активными ингредиентами инкубируют при 37°С в течение 24 часов в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко) 0% FCS (фетальной сыворотки теленка). Количество клеток, расположенных в зоне, где находился стопор, анализировали с целью оценки миграции клеток. Маска позволяет визуализировать и однозначно подсчитать клетки, расположенные в этой зоне. Для каждого состояния определяли среднее значение для 6-8 лунок.

Клетки инкубировали в среде, не содержащей FCS.

Протестированные продукты:

- EGF (эпидермальный фактор роста): 33 нг/мл,

- экстракт проростков овса: 10 или 30 мкг/мл,

Приготовление экстракта:

Экстрагируют 10 г измельченных проростков в 100 мл растворителя для экстракции ацетон/вода (80/20) (объем/объем).

Фильтруют и промывают жмых растворителем для экстракции.

Выпаривают ацетон и отбирают водную фазу.

Фильтруют. Концентрируют путем сушки до получения сухого экстракта.

- Гиалуронат натрия (молекулярная масса 250-450 кДа): 20 или 60 мкг/мл,

- L-аланил-L-глутамин: 40 или 90 мкг/мл.

Анализ результатов

Результаты выражены:

- в виде интенсивности флуоресценции (FI), пропорциональной количеству мигрировавших клеток.

- в процентах активности в сравнении с контролем 0% FCS.

Статистический анализ

Статистический анализ с помощью теста Даннета проводили на грубых значениях миграции. Этот тест дает значения "р", характеризующие значимость полученных результатов для различных условий. Степень значимости была установлена как:

p<0,05 (* значительная)

Р<0,01 (** очень значительная)

Р<0,001 (*** весьма значительная)

Р>0,05 (незначительная).

Результаты

Результаты при различных концентрациях влияния экстракта проростков овса, гиалуроновой кислоты и L-аланил-L-глутамина, по отдельности или в комбинации, на миграцию кератиноцитов приведены в таблицах 1 и 2, и представлены на единственной фигуре. Значения интенсивности флуоресценции, представленные на этой кривой, соответствуют среднему значению для 6-8 измерений, проведенных во время эксперимента, представляющего 3 независимых манипуляции.

В присутствии DMEM и 0% FCS в экспериментах с положительным контролем EGF действительно вызывает миграцию кератиноцитов. В этих экспериментальных условиях экстракт проростков овса (10 или 30 мкг/мл), используемый отдельно, и гиалуронат, используемый отдельно, (20 или 60 мкг/мл) не оказывали существенного влияния на миграцию кератиноцитов. С другой стороны, их комбинация показала тенденцию к увеличению миграции: +45% или +27% в сравнении с контролем в зависимости от испытанных концентраций (таблицы 1 и 2).

L-аланил-L-глутамин, используемый отдельно, индуцирует миграцию кератиноцитов в зависимости от концентрации. Эта индукция еще более значительна по сравнению с положительным контролем EGF. Комбинации 3 активных ингредиентов - экстракта проростков овса, гиалуроновой кислоты и L-аланил-L-глютамина - вызывает миграцию кератиноцитов очень значительным и статистически значимым образом. В таблицах 1 и 2, и на фиг. 1 показано, что эта индукция является статистически значимой по сравнению с контролем, но также она является статистически значимой по сравнению с индукцией экстракта проростков овса и гиалуроновой кислоты, используемых по отдельности, или по сравнению с их комбинацией.

На приложенной фиг.1 показано влияние сухого экстракта проростков овса (ES), гиалуроновой кислоты (АН), L-аланил-L-глутамина (Ala-Glu) и их комбинации на миграцию кератиноцитов. Проценты соответствуют процентам дополнительной активности по сравнению с контролем.

Следовательно, комбинация экстракта проростков овса, гиалуроновой кислоты или одной из ее солей, и L-аланил-L-глутамина синергетическим образом повышает миграцию кератиноцитов. Эти результаты подтверждают значимость использования такой комбинации в дерматологической или косметической заживляющей композиции.

Пример композиции: эмульсия «масло в воде»

Настоящее изобретение относится к комбинации, повышающей миграцию кератиноцитов. Комбинация, содержащая L-аланил-L-глутамин, гиалуроновую кислоту или одну из ее солей, проростков экстракт овса, полученный определенным образом. Дерматологическая композиция для заживления ран и восстановления повреждений кожи. Косметическая композиция, повышающая миграцию кератиноцитов. Вышеописанные комбинация и композиции эффективны для повышения миграции кератиноцитов. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Комбинация, повышающая миграцию кератиноцитов, содержащая L-аланил-L-глутамин, гиалуроновую кислоту или одну из ее солей, и экстракт проростков овса, полученный путем экстракции проростков органическим растворителем, выбранным из кетонов, сложных эфиров, С1-С4 спиртов или их смесей, где массовое соотношение гиалуроновая кислота/экстракт проростков овса/L-аланил-L-глутамин составляет, соответственно, от 2/1/3 до 2/1/4.

2. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что гиалуроновая кислота находится в форме фрагментов гиалуроната натрия.

3. Комбинация по п. 2, отличающаяся тем, что молекулярная масса фрагментов гиалуроната составляет от 50000 до 750000 Да.

4. Комбинация по любому из пп. 1-3, предназначенная для местного применения для лечения повреждений кожи.

5. Комбинация по любому из пп. 1-3, предназначенная для местного применения для улучшения заживления и восстановления кожи.

6. Дерматологическая композиция для заживления ран и восстановления повреждений кожи, содержащая в качестве активного ингредиента комбинацию по любому из пп. 1-3 и по меньшей мере один дерматологически приемлемый эксципиент.

7. Композиция по п. 6, предназначенная для применения в лечении порезов, ссадин, царапин, потертостей, послеоперационных рубцов или постэстетических дерматологических вмешательств, поверхностных ожогов, солнечных ожогов.

8. Косметическая композиция, повышающая миграцию кератиноцитов, содержащая в качестве активного ингредиента комбинацию по любому из пп. 1-3 и по меньшей мере один косметически приемлемый эксципиент.