БАКТЕРИАЛЬНЫЙ СЕКРЕТОМ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ КОЖИ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A61P17/02 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому применению бактериального секретома в области лечения повреждений кожи и, более конкретно, заживления ран. Данное изобретение также относится к косметическим или дерматологическим композициям, содержащим такой бактериальный секретом в качестве активного агента.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Заживление ран представляет собой сложный и динамичный биологический процесс, который включает взаимодействие многих местных и системных факторов при репарации нормальной ткани. Заживление прогрессирует в трех взаимозависимых фазах: гемостаз и воспаление, пролиферация и ремоделирование (General principles of wound healing. Witte MB, Barbul A. Surg Clin North Am. 1997 June; 77(3):509-28.). Пролиферация включает три явно наблюдаемых процесса: грануляция, сокращение и повторная эпителизация.

Во время грануляции наблюдается то, что клетки, участвующие в процессе репарации, пролиферируют и мигрируют к раневому ложу. Например, там находятся макрофаги, фибробласты и эндотелиальные клетки. Макрофаги постоянно высвобождают хемотаксические факторы и факторы роста. Фибробласты строят новый клеточный матрикс, необходимый для роста клеток в основании раны. Это образование каркаса поддерживает миграцию клеток. Наконец, эндотелиальные клетки запускают образование почек сосудов, которые будут основывать новые капилляры, восстанавливая, посредством этого, перфузию и обеспечивая поставку кислорода и питательных веществ, важных для метаболической активности клеток в ране.

Сокращение раны представляет собой механизм уменьшения размера раны, и фибробласты играют ведущую роль в данном сокращении.

Повторная эпителизация заключается в регенерации эпидермиса, который покрывает рану с образованием эффективного барьера против внешней среды, способного становиться пигментированным и восстанавливать его сенсорные и иммунные функции. Она, таким образом, включает клеточные процессы миграции и пролиферации кератиноцитов, но также дифференциацию этого нового эпителия и восстановление базальной мембраны, соединяющей дерму и эпидермис. Когда миграция базальных клеток к центру раны обеспечивает встречу краев раны, происходит волна клеточного митоза для заполнения пространств, оставленных миграцией, и для предоставления клеток для эпителиальной ткани в трехмерной регенерации.

Стадии пролиферации клеток кератиноцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток могут рассматриваться как одно из функциональных явлений, демонстрирующих заживляющую активность активного агента. Повышенная пролиферация фибробластов участвовала бы в заживлении глубокой раны (достигающей дермы), тогда как повышенная пролиферация кератиноцитов участвовала бы в повторной эпителизации.

Заживление также накладывает косметические проблемы при дефектах заживления или плохом заживлении, вызывает некрасивые и, главным образом, постоянные видимые отметины, такие как толстые шрамы или келоиды.

Все косметические и дерматологические хирургические процедуры, а также патологические и немедицинские травматические повреждения (царапины, порезы, отскабливания, ожоги) оставляют шрамы. Одним из главных навыков пластических хирургов является контроль образования шрамов.

Например, в течение многих лет против ожоговых рубцов использовали давление, и недавно его объединили с силиконовым полотном, укладываемым непосредственно на рубец.

Сохраняется потребность в предложении новых композиций для стимулирования заживления поврежденной кожи и для улучшения косметического вида рубцов.

Впервые и неожиданно заявитель показал полезные свойства в регенерации ткани и в заживлении повреждений кожи бактериального секретома, полученного из бактериального штамма (или бактерии) LMB64, выделенного из грунтовой воды.

Данная бактерия была описана заявителем в патентной заявке WO 2012/085182. Более конкретно, данная бактерия была описана, как таковая, за ее противовоспалительные активности. Даже более конкретно, были описаны и проиллюстрированы примерами экстракты, названные S0, Е0 и ES0, состоящие из супернатанта культуры, отделенного от биомассы - биомассы лизированных клеток, и супернатант после инкубации культуры при основном рН в течение нескольких часов соответственно. Анализировали только фармакологические активности экстрактов Е0 и ES0, и было показано то, что данные экстракты Е0 и ES0 способны индуцировать цитокины и созревание клеток Лангерганса (для Е0), а также активацию TLR2 (Толл-подобный рецептор 2)/TLR4/TLR5, антагонистов PAR, и индукцию противомикробных пептидов (для ES0). Данные результаты наводили на мысль о применении таких экстрактов в лечении воспалительных заболеваний, таких как прурит, псориаз, экзема или атопический дерматит.

Вопреки всем ожиданиям, заявитель показывает в данном документе то, что секретом, состоящий не из тех же самых компонентов, что вышеупомянутые экстракты ES0 и Е0, но, главным образом, состоящий из биомолекул, секретируемых и выводящихся наружу в супернатант культуры указанной бактерией LMB64, имеет неожиданные заживляющие свойства.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому воплощению (1) настоящее изобретение относится к бактериальному секретому непатогенной грамотрицательной бактерии, принадлежащей к классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, содержащей 16S рРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1, для применения в лечении повреждений кожи,

причем указанный секретом вероятно получают или получают способом, включающим следующие стадии:

- а) культивирование указанной бактерии в культуральной среде и при подходящих условиях для ее роста,

- б) разделение жидкости/твердого вещества и выделение жидкой фазы,

- в) получение указанного секретома, содержащего биомолекулы, секретируемые указанной бактерией в жидкую фазу.

Согласно второму воплощению настоящего изобретения бактериальный секретом для применения в лечении повреждений кожи согласно данному изобретению отличается тем, что к жидкой фазе, полученной на стадии б), добавляют основной буфер, и что полученную буферизованную жидкую фазу возможно оставляют в контакте в течение 1-7 часов предпочтительно при температуре от 1 до 6°С.

Бактерия LMB64 была охарактеризована и определена как принадлежащая к классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae и возможно новому, еще не определенному роду. Анализ последовательности гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК (рРНК), сделал возможным помещение данной бактерии близко к родам Chromobacterium, Paludimonas, Lutelia и Glubenkiana, с которыми она имеет 95%-ное сходство последовательности.

Эта непатогенная бактерия является грамотрицательной и была выделена из грунтовой воды.

Более конкретно, бактерия LMB64 является палочковидной с длиной грубо 2,3 мкм (плюс/минус 0,3) и шириной грубо 1,0 мкм (плюс/минус 0,1). Отличительным свойством данной бактерии является присутствие полярного жгутика.

Ген, кодирующий 16S рРНК, был почти полностью секвенирован (1487 п.н., соответствуя последовательности SEQ ID NO: 1). Бактерия LMB64 имеет кольцевую плазмиду из 10948 п.н. Данная плазмида была полностью секвенирована, и данная последовательность представлена в последовательности SEQ ID NO: 2.

Согласно другому воплощению бактерия, из которой происходит секретом по изобретению, содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2, или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, преимущественно по меньшей мере 85%-ную, по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную, даже по меньшей мере 97%-ную и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность с SEQ ID NO: 2.

Кроме того, бактерия, из которой происходит секретом, представляет собой непатогенную грамотрицательную бактерию, принадлежащую к классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, причем указанная бактерия содержит 16S рРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, даже по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную, по меньшей мере 97%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1, и указанная бактерия содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2, или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, преимущественно по меньшей мере 85%-ную, по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную, даже по меньшей мере 97%-ную и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2.

В качестве примера такая бактерия представлена штаммом LMB64, который был депонирован от имени заявителя в Национальную коллекцию культур микроорганизмов (CNCM), Институт Пастера, Париж, 8 апреля 2010 г. под номером I-4290.

Имея данную генотипическую информацию, объединенную с характеристиками, касающимися роста в среде, не содержащей серу, и ненитчатую природу данной бактерии, специалист в данной области не имел бы затруднений в нахождении/идентификации другой бактерии, обеспечивая получение секретома по изобретению. Такая идентификация другой бактерии, естественно, генотипически слегка отличной, но обладающей всеми фенотипическими критериями по изобретению в показателях секретома, может быть получена после селекционного исследования, которое никоим образом не является неоспоримым, и это основывается на информации, содержащейся в настоящей заявке, и которая содержится в заявке WO 2012/085182, в сочетании с общими знаниями специалиста в данной области.

В контексте настоящего изобретения «процентная доля идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот относится к процентной доле идентичных нуклеотидов между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученной после наилучшего выравнивания (оптимального выравнивания), причем данная процентная доля является чисто статистической, и различия между двумя последовательностями распределяются по всей их длине случайным образом. Сравнение последовательностей между двумя последовательностями нуклеиновых кислот обычно делается сравнением данных последовательностей после их оптимального выравнивания, где указанное сравнение можно делать на отрезок или на «окно сравнения». Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться, помимо сравнения вручную, посредством алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], посредством алгоритма локальной гомологии Needleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], посредством способа поиска сходства Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] или посредством компьютерной программы, использующей данные алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном пакете Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или программой для сравнения BLAST N или BLAST Р).

Процентная доля идентичности между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты определяется сравнением этих двух оптимально выровненных последовательностей, где последовательность нуклеиновой кислоты, подлежащая сравнению, может включать вставки или делеции по сравнению с контрольной последовательностью для оптимального выравнивания между этими двумя последовательностями. Процентная доля идентичности рассчитывается определением числа положений, для которых нуклеотид является идентичным между двумя последовательностями, деля это число идентичных положений на общее число положений в окне сравнения и умножая полученный результат на 100 с получением процентной доли идентичности между двумя данными последовательностями.

Например, можно использовать программу BLAST - "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с параметрами по умолчанию (в частности, в отношении параметров «штраф за создание пробела»: 5 и «штраф за удлинение пробела»: 2; причем выбранной матрицей является, например, матрица «BLOSUM 62», предложенная программой). Процентная доля идентичности между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, рассчитывается непосредственно программой. Также можно использовать другие программы, такие как программа "ALIGN" или "Megalign" (DNASTAR).

Бактерия по изобретению включает бактерию LMB64, которая содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2, или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную или 98%-ную идентичность с указанной последовательностью SEQ ID NO: 2. Другие характеристики указанной бактерии LMB64 будут подробно описаны ниже в примерах.

Кроме того, бактерия LMB64 была депонирована от имени заявителя в Национальную коллекцию культур микроорганизмов (CNCM), Институт Пастера, Париж, 8 апреля 2010 г. под номером I-4290.

Согласно другому воплощению настоящее изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно второму воплощению, отличающемуся тем, что основной буфер выбран из Tris буфера, аргининового буфера и их смесей.

В другом воплощении данное изобретение относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что на стадии б) после разделения жидкость/твердое вещество следует стадия б') осветления жидкой фазы или буферизованной жидкой фазы посредством фильтрования перед стадией в).

В другом воплощении данное изобретение относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно предшествующему воплощению, отличающемуся тем, что фильтрование проводится с порогом отсечения 0,2 мкм.

Согласно другому воплощению данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что указанные биомолекулы состоят из пептидов, белков и вторичных метаболитов, секретируемых указанной бактерией.

Другим воплощением настоящего изобретения также является предложение бактериального секретома для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающегося тем, что бактерия содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность c SEQ ID NO: 2.

Согласно другому воплощению данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что бактерия представляет собой бактерию, депонированную в CNCM 8 апреля 2010 г. под номером I-4290.

В общем, термин «секретом» используется для описания всех биомолекул, секретируемых и выделяемых в культуральную среду, и солюбилизируемых в данной среде клеткой, тканью или организмом. В настоящем случае необходимо понимать то, что термин «секретом» относится ко всем биомолекулам, секретируемым и выводимым наружу бактерией LMB64, и это происходит без модификации, повреждения или лизиса бактериальной клетки. Более конкретно, данные биомолекулы, главным образом, состоят из белков, пептидов и вторичных метаболитов, секретируемых и выводимых наружу бактерией в культуральную среду.

Бактерии размножаются делением надвое, т.е. каждая бактерия растет и затем делится на две дочерние клетки, разделенные разделяющей перегородкой, образованной клеточной стенкой. Во время деления ДНК и другие компоненты удваиваются. В клеточном делении участвуют разные ферментативные системы синтеза и деградации.

Бактериальный рост представляет собой упорядоченное увеличение всех компонентов бактерии. Он приводит к увеличению числа бактерий. Во время роста, с одной стороны, имеется обеднение культуральной среды питательными веществами и, с другой стороны, обогащение биомолекулами, секретируемыми и выделяемыми в культуральную среду бактерией и солюбилизируемыми в данной среде, а также побочными продуктами метаболизма.

Следует понимать то, что выражение «культуральная среда» или «среда» относится к любой среде, содержащей по меньшей мере необходимые питательные вещества для бактериального роста и размножения. Бактерии могут быть выращены в жидкой, твердой или полутвердой среде. Предпочтительно культуральная среда представляет собой жидкую среду, обеспечивающую выделение супернатанта культуры, содержащего секретом.

Подходящая культуральная среда содержит питательные вещества, которые стимулируют бактериальный рост и размножение. В общем, подходящая культуральная среда будет содержать воду, источник углерода, источник азота и соли. В качестве иллюстрации конкретная типичная культуральная среда описывается ниже в примерах.

Необходимо понимать то, что выражение «вторичные метаболиты» относится к маленьким молекулам, которые продуцирует, секретирует и выделяет в культуральную среду бактерия по изобретению, в частности, бактерия LMB64. В качестве иллюстрации, такие вторичные метаболиты могут представлять собой растворимые молекулы, такие как бактериоцины, нерибосомные пептиды, сидерофоры, липопептиды или поликетиды, или такие молекулы, как терпены, пиразины, индолы или сульфидные производные. Белки, присутствующие в секретоме, имеют размеры от 10 кДа до 100 кДа, предпочтительно от 18 кДа до 98 кДа и предпочтительно преобладающий белок, размер которого грубо составляет 38 кДа.

На практике секретом бактерии по изобретению, например и в частности, бактерии LMB64, может быть получен из культуры в культуральной среде, обеспечивающей рост, развитие и размножение бактерии (например, бактерии, описанной ниже), просто выделением супернатанта культуры, содержащего секретируемые биомолекулы, составляющие секретом по изобретению. В конкретных показателях, благодаря тому факту, что данные биомолекулы секретируются и выводятся наружу бактерией и солюбилизируются в среде, нет необходимости осуществлять стадию обработки указанных бактерий (механической или химической, индуцирующей полный или частичный лизис клеток, или высвобождение белков или компонентов стенки, мембраны или периплазматического пространства). Компоненты супернатанта культуры (далее секретом) можно выделять из нерастворимых твердых клеточных компонентов любыми способами разделения жидкости/твердого вещества. Более конкретно, посредством методик, известных специалистам в данной области, следовательно, возможно выделять жидкую фракцию, содержащую солюбилизированные биомолекулы, из твердой фракции, содержащей, главным образом, целые клетки и обломки клеток, содержащие белки поверхности и/или белки, локализованные в периплазматическом пространстве бактерии.

В качестве иллюстрации, разделение жидкости/твердого вещества можно осуществлять методикой, выбранной из, например, центрифугирования, осаждения, фильтрации, ультрафильтрации, декантации, осушения.

Предпочтительно разделение жидкости/твердого вещества проводится центрифугированием бактериальной культуры для того, чтобы разделять твердую фазу, т.е. осадок, содержащий клетки и обломки клеток; и жидкую фазу, т.е. супернатант, содержащий растворимые молекулы, т.е. секретом.

Супернатант, т.е. жидкую фазу, можно использовать как таковой или после простого фильтрования для того, чтобы удалять возможно присутствующие обломки клеток и для его стерилизации. Также может рассматриваться его концентрирование, например, посредством диафильтрации. Белки, составляющие секретом, также можно выделять посредством осаждения сульфатом аммония.

Как указано выше, способ получения бактериального секретома по изобретению отличается тем, что в жидкую фазу, полученную на стадии б), добавляют основной буфер, и что полученную буферизованную жидкую фазу возможно оставляют в контакте с таким буфером в течение 1-7 ч, в частности, при низкой температуре, предпочтительно при температуре от 1 до 6°С.

Добавление основного буфера в супернатант улучшает растворимость и/или стабильность белков и пептидов в растворе.

Предпочтительно данный основной буфер представляет собой Tris буфер или аргининовый буфер, или смесь Tris-аргинин. Предпочтительно он представляет собой Tris-аргининовый буфер.

Количество основного буфера, предпочтительно Tris-аргинина, добавленного в жидкую фазу, является таким, что полученная буферизованная жидкая фаза имеет концентрацию аргинина от 100 мМ до 500 мМ и/или концентрацию Tris от 10 мМ до 90 мМ.

рН буферизованной жидкой фазы может составлять от 8 до 12 и предпочтительно от 9 до 11.

Применение основного буфера (Tris, аргинина или Tris-аргинина) обеспечивает стабилизацию белков в растворе и избежание их агрегации на протяжении длительного периода хранения.

Предпочтительный способ культивирования бактерии по изобретению, в частности штамма LMB64, может включать три стадии.

• Первый инокулум может быть может быть получен в колбе Эрленмейера в подходящей среде, содержащей минеральные, белковые и углеводные вещества, подходящие для данной предкультуры.

• Затем получают вторую предферментационную культуру в периодическом режиме во второй среде, аналогичной или идентичной первой среде (или любой эквивалентной среде).

• Наконец, проводят ферментацию в режиме подпитки в среде, идентичной или аналогичной второй среде, для получения высокой плотности клеток.

Стадия центрифугирования затем обеспечивает удаление клеток и обломков клеток и выделение супернатанта культуры.

Данный буферизованный супернатант или буферизованную жидкую фазу можно затем осветлять фильтрованием.

Как показано выше, после стадии б) разделения жидкости/твердого вещества следует стадия б') осветления жидкой фазы или буферизованной жидкой фазы, например, фильтрованием, перед стадией в).

Фильтрование можно осуществлять любыми подходящими способами, обеспечивающими осветление жидкой фазы, или, если это применимо, буферизованной жидкой фазы. Такое осветление фильтрованием удаляет суспендированные частицы, не удаленные во время стадии разделения жидкости/твердого вещества, и направлено на получение прозрачного секретома.

Фильтрование можно проводить любыми способами фильтрации, ультрафильтрации или диафильтрации.

Преимущественно фильтрование проводится фильтрацией через фильтр или фильтр со сменным фильтрующим элементом, имеющий порог отсечения 0,4 мкм, предпочтительно 0,2 мкм. В данном случае бактериальный секретом отличается тем, что секретированные пептиды, белки и вторичные метаболиты имеют размер 0,2 мкм или меньше.

Предпочтительно можно использовать электростатически незаряженные фильтры или предфильтры для того, чтобы избежать какого-либо поглощения биомолекул, ответственных за всю или за часть активности.

Точная природа среды и разных этапов будет описана с большими подробностями в Примерах. Необходимо понимать то, что любая модификация способа, среды или последовательностей этапов, которая была бы очевидной специалисту в данной области в отношении настоящего описания, должна рассматриваться как находящаяся в пределах объема настоящей патентной заявки.

Как упомянуто выше, данное изобретение также касается, в другом воплощении, бактериального секретома для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающегося тем, что данные повреждения кожи выбраны из группы, состоящей из ссадин, ожогов, солнечных ожогов, царапин, порезов, соскобов, швов.

Данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений для применения в смягчении дефектов заживления.

Данное изобретение также касается, в другом воплощении, бактериального секретома для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что данные повреждения кожи возникают после травмы, хирургического вмешательства, дерматологической процедуры или косметической медицинской процедуры.

Преимущественно данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что он объединяется с солью меди или солью цинка.

В другом воплощении данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что лечение повреждений кожи состоит в улучшении заживления и репарации кожи.

Данное изобретение дополнительно касается, в другом воплощении, способа косметического лечения для смягчения дефектов заживления кожи, включающего нанесение эффективного количества композиции, содержащей эффективное количество бактериального секретома, как определено в одном из предшествующих воплощений, в комбинации с косметически приемлемым эксципиентом, и приготовленной в подходящей форме для местного нанесения.

Преимущественно данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении дефектов заживления согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что он объединяется с солью меди и/или солью цинка.

Следовательно, данное изобретение, кроме того, касается в другом воплощении применения бактериального секретома, как определено в одном из предшествующих воплощений, для смягчения косметического лечения дефектов заживления кожи. Согласно конкретному воплощению секретом по изобретению используется в комбинации с солью меди и/или солью цинка.

В другом воплощении данное изобретение относится к дерматологической композиции, содержащей бактериальный секретом, как определено в одном из предшествующих воплощений, и подходящий дерматологический эксципиент для местного нанесения. В преимущественном воплощении дерматологическая композиция дополнительно включает соль цинка и/или соль меди.

В другом воплощении данное изобретение дополнительно относится к дерматологической композиции по одному из предшествующих воплощений для применения в лечении повреждений кожи. В преимущественном воплощении дерматологическая композиция дополнительно включает соль цинка и/или соль меди.

В другом воплощении данное изобретение относится к косметической композиции, содержащей бактериальный секретом, как определено в одном из предшествующих воплощений, и подходящий косметический эксципиент для местного применения. Данная косметическая композиция может дополнительно включать соль цинка и/или соль меди.

Наконец, в другом воплощении настоящее изобретение относится к применению косметической композиции согласно предшествующему воплощению для смягчения косметического лечения дефектов заживления кожи.

Согласно одному воплощению данное изобретение относится к бактериальному секретому, как определено в одном из предшествующих воплощений, для местного применения для стимуляции пролиферации фибробластов.

Согласно одному воплощению данное изобретение относится к бактериальному секретому, как определено в одном из предшествующих воплощений, для местного применения для стимуляции пролиферации и/или миграции кератиноцитов.

Согласно одному воплощению данное изобретение относится к бактериальному секретому, как определено в одном из предшествующих воплощений, для местного применения для лечения повреждений кожи.

Согласно одному воплощению данное изобретение относится к бактериальному секретому, как определено в одном из предшествующих воплощений, для местного применения для улучшения заживления и восстановления кожи.

Данное изобретение также относится к композиции для ускорения репарации кожи для того, чтобы восстановить целостность и качество кожи, содержащей в качестве активного начала секретом, определенный в одном из предшествующих воплощений. Более преимущественно данная композиция может дополнительно включать соль меди и/или соль цинка.

Предпочтительно концентрация секретома в композиции по изобретению составляет от 0,05% до 10%. Более предпочтительно она составляет от 0,1% до 5%.

Композиция по изобретению дополнительно включает один или более чем один традиционный дерматологически и/или косметически совместимый эксципиент, известный специалисту в данной области, для того, чтобы получить композицию для местного нанесения, такой как эмульгаторы, загустители, гелеобразующие агенты, водосвязывающие агенты, растекатели, стабилизаторы, красители, отдушки и консерванты.

В настоящем изобретении подразумевается то, что выражение «дерматологически или косметически приемлемый» означает того, который является полезным в приготовлении дерматологической или косметической композиции, который обычно является безопасным, нетоксичным и ни биологически, ни иным образом нежелательным, и который является приемлемым для дерматологического или косметического применения, и, в частности, дерматологического или дермо-косметического применения, в частности, посредством местного нанесения.

Композиции по изобретению преимущественно предназначены для местного нанесения, в частности, на кожу.

Композиция по изобретению может быть получена в виде эмульсии, дисперсии или водного, или масляного лосьона.

В другом конкретном воплощении дерматологическая или косметическая композиция по изобретению включает по меньшей мере одно другое активное начало, более конкретно, по меньшей мере одно увлажняющее активное начало.

Это другое активное начало, таким образом, в частности, может быть выбрано из группы, состоящей из следующих:

• Хорошо известные заживляющие или восстановительные агенты: пантенол, мадекассосид, аллантоин, алоэ вера, мед;

• Противоинфекционные агенты: микроэлементы типа меди-цинка, мед

• Увлажнители и питающие средства: глицерин, масло ши, природные воска, гиалуроновая кислота, жирные кислоты

• Успокаивающие средства: аллантоин, бисаболол, пантенол, эноксолон

• Фильтры УФ (ультрафиолетовое излучение).

Предпочтительно второе активное начало будет представлять собой микроэлемент типа меди-цинка. В данном предпочтительном воплощении композиция по изобретению будет, таким образом, включать секретом и микроэлемент типа меди-цинка.

Как было упомянуто, дерматологическая или косметическая композиция по изобретению, содержащая секретом, может включать соль меди или соль цинка. Предпочтительно соль меди будет представлять собой сульфат меди. Преимущественно соль цинка будет выбрана из оксида цинка и сульфата цинка.

Количество сульфата меди в композиции по изобретению может варьировать от 0,05 до 0,5% масс. композиции, предпочтительно от 0,1 до 0,25% масс. композиции, более предпочтительно - грубо 0,2% масс. композиции.

Количество сульфата цинка в композиции по изобретению может варьировать от 0,05 до 0,5% масс. композиции, предпочтительно от 0,1 до 0,4% масс. композиции, более предпочтительно от 0,1 до 0,2% масс. композиции.

Количество оксида цинка в композиции по изобретению может варьировать от 0,5 до 10% масс. композиции, предпочтительно от 1 до 5% масс. композиции, более конкретно грубо от 2 до 4% масс. композиции.

В одном воплощении данного изобретения рассматривается композиция по любому из предшествующих воплощений, отличающаяся тем, что она дополнительно включает по меньшей мере одно другое активное начало, выбранное из заживляющих средств, противоинфекционных средств, увлажнителей, успокаивающих средств и их смесей. Согласно другому конкретному воплощению по меньшей мере одно другое активное начало будет выбрано из увлажнителей, заживляющих средств, успокаивающих средств и их смесей, предпочтительно увлажнителей. Такое активное начало предпочтительно будет использоваться в дерматологических композициях.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения и заживления повреждений кожи, включающему введение, предпочтительно местное, эффективного количества композиции, содержащей в качестве активного начала секретом по изобретению.

Композиции по изобретению, в частности, предназначены для ухода за кожей, имеющей устойчивые повреждения.

Повреждения кожи могут появляться после травмы или медицинских, или хирургических процедур, независимо от того, являются ли они инвазивными или неинвазивными, куративными или предназначенными для косметических целей.

Инвазивные медицинские или хирургические процедуры включают, например: хирургические процедуры (иссечение, сбривание) со швами или без, криотерапию, лазерную абляцию, умеренный или сильный химический пилинг, швы, мезотерапию или выскабливание.

Посттравматические повреждения кожи, например, после легкого наружного повреждения кожи, включают, например, порезы, царапины, отскабливания и поверхностные ожоги или солнечный ожог.

Поверхностные неинвазивные медицинские процедуры, требующие заживляющего продукта, который ускоряет восстановление кожи и подходит для долговременного применения (пока кожа полностью не восстанавливается), включают, например, легкий химический пилинг, удаление волос лазером и лечения поверхностных сосудов (розовые угри).

Лечение повреждений кожи и слизистых оболочек по изобретению может, в частности, включать лечение порезов, швов, ссадин, соскобов, царапин, шрамов после хирургического вмешательства или косметической дерматологической процедуры, поверхностных ожогов, солнечного ожога.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению косметической композиции по изобретению для улучшения заживления и репарации кожи и, в частности, для смягчения дефектов заживления.

Данное изобретение будет понятнее посредством прочтения приведенных ниже примеров, которые иллюстрируют изобретение без ограничения его объема.

Данные примеры относятся к следующим Фиг.

ФИГ. 1: гель SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) белков секретома.

Полоса 1 (М - маркеры молекулярной массы, лазурный).

Полосы 2-5: (Sec - секретом перед добавлением аргининового буфера) - загрузки 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл и 30 мкл соответственно.

Полосы 6-9: (Sec + Arg - секретом после добавления аргининового буфера) - загрузки 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл и 30 мкл соответственно.

ФИГ. 2: % стимуляции пролиферации (среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего)) нормальных человеческих фибробластов, обработанных разными продуктами, по сравнению с контрольными клетками (n равно 3 группы доноров).

ФИГ. 3: % стимуляции (среднее плюс/минус SEM) миграции линии клеток кератиноцитов НаСаТ, обработанных разными соединениями, по сравнению с контрольными клетками (n равно 2).

ФИГ. 4: повторная эпителизация раны (среднее плюс/минус SEM) после нанесения в течение 48 ч на экспланты свиных ушей разных продуктов по сравнению с контрольным восстанавливающим кремом (n равно 10 независимых доноров).

Пример 1: культура бактерии LMB64

В качестве неограничивающего примера, предпочтительная культуральная среда содержит хлорид аммония, сульфат магния и дрожжевой экстракт. Также следует отметить, что, как проистекает из заявки WO 2012/085182, среди прочих, можно использовать другие аналогичные среды, и они, таким образом, должны рассматриваться как неотъемлемая часть настоящего описания. Любая адаптация специалистами в данной области также должна рассматриваться как часть данного изобретения.

Типичный способ культивирования описывается ниже. Здесь следует напомнить то, что данный пример служит лишь для иллюстративных целей и ни в коей мере не должен рассматриваться как ограничивающий.

Штамм LMB64 выращивается в три этапа, а именно: исходная инокуляция, предкультивирование (или предферментация) в периодическом режиме и, наконец, культивирование, но в режиме подпитки (добавление глюкозы).

Инокулум: для инокуляции колбы Эрленмейера, содержащей 1000 мл стерильной среды, используется пробирка с WCB (рабочий банк клеток) LMB64. Данную колбу Эрленмейера затем помещают в шейкер-инкубатор и встряхивают. При достижении достаточной плотности клеток бульона, культуру прекращают. Клетки затем охлаждают перед переносом в предферментер.

Предкультивирование: предферментер затем заполняют грубо 16 л среды и затем полностью стерилизуют.

Две сателлитные колбы соединяются с предферментером после стерилизации емкости и затем со следующими дополнительными блоками:

• колба, содержащая стерильный 50%-ный раствор глюкозы. Данный раствор (периодическое предкультивирование с глюкозой) немедленно переносят в культуральную среду для достижения исходной концентрации глюкозы 20 г/л.

• колбу Эрленмейера, содержащую инокулум, описанный выше на стадии Инокулум, инокулируют в предферментере.

Запускают предкультивирование и затем автоматически регулируют. В качестве примера можно упомянуть следующие параметры: температура, скорость встряхивания, давление, скорость тока воздуха или PO₂.

Рост клеток отслеживается измерением оптической плотности при 620 нм. Предкультивирование останавливают охлаждением при достижении ей достаточной плотности.

Культивирование: ферментер затем заполняют 127 л среды, доведенной до рН 7,0, и затем полностью стерилизуют. Три сателлитные колбы используются следующим образом:

• колба, содержащая стерильный раствор глюкозы. Данный раствор немедленно переносится в культуральную среду для достижения исходной концентрации глюкозы 20 г/л.

• колба, содержащая пеногаситель. Данный пеногаситель будет автоматически добавляться на протяжении культивирования для контроля уровня пены в емкости.

• колба с глюкозой для подпитки. Данный раствор будет добавляться на протяжении культивирования для стимулирования роста клеток.

Культура запускается и затем регулируется автоматически. В качестве примера также можно упомянуть следующие параметры: температура, рН, встряхивание, давление, скорость тока воздуха, PO₂.

После истощения глюкозы, исходно присутствующей в среде (увеличение уровня PO₂), запускается добавление подпиточного раствора глюкозы, обеспечивая, таким образом, рост клеток в высокой плотности. Ферментацию прекращают после полного потребления глюкозы. На данной стадии ферментация должна автоматически охлаждаться. На протяжении всего культивирования рост клеток отслеживается измерением оптической плотности при 620 нм. Количество сухой биомассы (г/л), полученной в конце культивирования, определяется с использованием способа взвешивания.

Пример 2: экстракция секретома

Пример ниже приводится в качестве иллюстрации предпочтительного воплощения, но не должен рассматриваться как ограничивающий.

Секретом, в общем, получают после центрифугирования результата стадии культивирования для того, чтобы удалять клетки, поверхностные белки и белки, расположенные в периплазматическом пространстве бактерии. После данной стадии центрифугирования следует добавление в супернатант Tris-аргининового основного буфера. Также возможна последняя стадия фильтрования супернатанта. Любая адаптация специалистами в данной области также должна рассматриваться как часть данного изобретения.

Центрифугирование: линия переноса из ферментера в центрифугу стерилизуется. Ферментационное сусло затем разделяется непрерывным центрифугированием на центрифуге. Центрифугирование проводится со скоростью 150 л/ч (плюс/минус 30 л/ч) со скоростью вращения сосуда 10900 плюс/минус 1000 об./мин. Супернатант отбирается в контейнер, оснащенный одноразовым мешком. Масса супернатанта измеряется на платформе весов.

Добавление аргинина: Tris-аргининовый экстракционный буфер стерилизуют и затем переносят в одноразовый мешок, содержащий супернатант культуры. Необходимо контактное время от 1 до 7 часов. Целевая концентрация Tris и аргинина после добавления в одноразовый мешок грубо составляет 0,3 М L-аргинина и 20 мМ Tris.

Общий объем после добавления экстракционного буфера грубо составляет 240 л.

Фильтрование: проводят два последовательных этапа фильтрования для того, чтобы осветлить супернатант и получить прозрачный, не содержащий микробов секретом. Фильтрование контролируется системой фильтрования/распределения. Одноразовый картридж для глубинного фильтрования помещают в корпус его фильтра. Весь отфильтрованный продукт стерильно выделяют в контейнер, оснащенный одноразовым мешком. Мешок с отфильтрованным продуктом взвешивают на платформе весов и затем хранят при +5°С до распределения.

Гель-электрофорез белков секретома: см. Фиг. 1.

Использовали Bis-Tris SDS-PAGE в геле (4-12%) при денатурирующих и восстанавливающих условиях, выявление кумасси голубым загрузок разных объемов супернатантов культуры (10, 15, 20, 30 мкл соответственно) до и после добавления аргининового буфера. В обоих случаях наблюдаются разные полосы белков размером от 14 до 100 кДа, включая главную полосу грубо 38 кДа.

Пример 3: влияние секретома на пролиферацию нормальных человеческих фибробластов

Использованной методикой является методика включения нуклеотида - 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) - аналога тимидина - в ДНК клеток S-фазы при 37°С. Данная методика обеспечивает количественное измерение клеток, прогрессирование которых в клеточном цикле является характерным для пролиферирующей клетки (фаза S или синтеза ДНК).

Фибробласты высевают в 96-луночный планшет и затем инкубируют в течение 72 ч в присутствии соединений, подлежащих анализу, EGF (эпидермальный фактор роста) в качестве позитивного контроля и 0,4; 0,6 и 1% секретома. Включение BrdU осуществляется на протяжении последних 24 ч и количественно измеряется с использованием набора для ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) BrdU (№ товара 11647229001, Roche Diagnostics).

% от контроля рассчитывается согласно следующей формуле:

(Значение / среднее контроля) × 100

Стимуляция в % рассчитывается согласно следующей формуле:

Средняя стимуляция в % = (Среднее (Значение / среднее контроля) × 100) - 100

SEM = стандартное отклонение / √n

Статистические анализы проводятся с использованием t-критерия Стьюдента. Данные исследования проводили на 3 группах доноров.

Позитивный контроль - EGF - сильно, значимо и воспроизводимо стимулировал пролиферацию фибробластов на 3 группах доноров (95%-ная стимуляция). Это подтверждает эксперименты. Данные результаты показывают то, что секретом, проанализированный при содержании 0,4%, 0,6% и 1%, значимо стимулировал пролиферацию нормальных человеческих фибробластов. В Таблице 1 ниже обобщаются результаты включения BrdU (среднее плюс/минус SEM) нормальными человеческими фибробластами (посредством ELISA) после 72 ч инкубации в присутствии проанализированных соединений (n равно 3 группы доноров). Результаты показаны на Фиг. 2.

Пример 4: влияние секретома на миграцию линии клеток кератиноцитов НаСаТ

Данные исследования проводили с использованием анализа миграции клеток Oris (Platypus Technologies) согласно стандартному протоколу, рекомендованному изготовителем. Предпочтительно клетки НаСаТ (линия клеток кератиноцитов человека) высевают в 96-луночный планшет. Пробки Oris™ удаляют, и соединения, подлежащие оценке, добавляют в культуральную среду. Инкубация продолжается в течение 24 ч с обеспечением миграции клеток. Затем добавляют проницаемую в клетку флуоресцентную метку для обеспечения визуализации клеток в зоне, ограниченной пробками.

Миграция клеток оценивается фотографированием лунок и измерением площади поверхности миграции в мм².

% контроля рассчитывается согласно следующей формуле:

(Значение / среднее контроля) × 100

Стимуляция в % рассчитывается согласно следующей формуле:

Средняя стимуляция в % = (Среднее (Значение / среднее контроля) × 100) - 100

SEM = стандартное отклонение / √n

Статистические анализы проводятся с использованием t-критерия Стьюдента.

Данные исследования проводятся на 6 технических повторностях и в n равно 2 независимых экспериментах.

Позитивные контроли - TGF-b и фетальная телячья сыворотка (FCS) - сильно, значимо и воспроизводимо стимулировали миграцию клеток (51% и 176% стимуляции соответственно). Это подтверждает эксперименты. Результаты показывают то, что секретом, проанализированный в содержании 0,4%, 0,6% и 1%, значимо стимулировал миграцию кератиноцитов НаСаТ. В Таблице 2 ниже обобщаются результаты миграции клеток НаСаТ после 24 ч инкубации с разными соединениями (n равно 2). Данные результаты показаны на Фиг. 3.

Пример 5: влияние секретома на закрытие ран на модели заживления ex vivo

Экспланты кожи свиных ушей поддерживаются в условиях для выживания. В центре осуществляются шестимиллиметровые биопсии, в которых делается 3 мм кольцевая рана. Данная рана повреждает весь эпидермис и верхнюю часть дермы. Продукты, подлежащие оценке, наносятся местно. Через 48 ч биопсии замораживают, и на срезах осуществляется окрашивание гематоксилином-эозином. Кинетика повторной эпителизации оценивается согласно следующему способу:

1) Приписывание балла, определенного от 0 до 3, согласно протоколу, разработанному J. Brandner (Pollok et al., 2010, J Cell Mol Med).

Точное измерение в мкм степени зоны повторной эпителизации из края раны. Для определения значимости применяется ^критерий Стьюдента.

2) Также оценивается морфологический вид на краю раны для того, чтобы оценить качество сохранности ткани.

Препараты продуктов, подлежащих нанесению: секретом добавляли в содержании 0,4; 0,6 и 1% масс. в тот же самый базовый препарат, что и препарат контрольного восстанавливающего крема (крем Cicalfate®), анализируемый параллельно. Повторная эпителизация оценивается по сравнению с данным контрольным кремом.

Результаты показывают эффект дозы с использованием секретома на прогрессирование повторной эпителизации раны. Препарат, содержащий 1% секретома, значимо ускоряет прогрессирование закрытия раны по сравнению с контрольным восстанавливающим кремом (p равно 0,043). Кроме того, морфологический анализ тканей показывает превосходную толерантность препаратов, содержащих секретом. Результаты показаны на Фиг. 4.

Типичная композиция: эмульсия типа «масло в воде»

секретом согласно примеру 2: 0,1-5% глицерин: 1-30% гексиленгликоль: 0,1-7% цетеарилглюкозид: 0,1-1% цетеариловый спирт: 0,9-4% стеариновая кислота: 0,5-4% глицерилстеарат: 0,1-4% растительное масло: 0,1-10% вода qs (сколько потребуется до) 100%

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ПЬЕР ФАБР ДЕРМО-КОСМЕТИК

<120> Бактериальный секретом для применения в лечении повреждений кожи

<130> B373870PCT D37050

<140> PCT/EP2018/058929

<141> 2018 - 04 - 06

<150> FR1753012

<151> 2017 - 04 - 06

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1487

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Новая бактерия LMB64, класс бета-протеобактерия, происходящая из грунтовых вод

<400> 1

agtttgatca tggctcagat tgaacgcggg cggcatgctt tacacatgca agtcgaacgg 60

cagcacgggc ttcggcctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt cggaacgcgc 120

cgagtagtgg gggataacgc agcgaaagct gtgctaatac cgcatacgta ctgaggtaga 180

aagtggggga ccttcgggcc tcacgctatt cgagcggccg acgtctgatt agctagttgg 240

tggggtaaag gcccaccaag gcgacgatca gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca 300

ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat 360

gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtctgaagaa ggccttcggg ttgtaaagga 420

cttttgtccg ggagcaaagc ctgcttgtta ataccgagtg gggatgagag taccggaaga 480

ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttaat 540

cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttgtgca agtctgatgt gaaagccccg 600

ggctcaacct gggaacggca ttggagactg cacggctaga gtgcgtcaga ggggggtaga 660

attccacgtg tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc 720

cccctgggat gacactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780

cctggtagtc cacgccctaa acgatgtcaa ttagctgttg ggggtttgaa tccttggtag 840

cgaagctaac gcgtgaaatt gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaag 900

gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa 960

aaccttacct gctcttgaca tgtaccgaag cctgaagaga tttgggtgtg cccgaaaggg 1020

agcggtaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080

tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcattag ttgccatcat ttggttgggc actctaatga 1140

gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg 1200

agcagggctt cacacgtcat acaatggtcg gtacagaggg tcgccaagcc gcgaggtgga 1260

gccaatctca gaaagccgat cgtagtccgg atcgcactct gcaactcgag tgcgtgaagt 1320

cggaatcgct agtaatcgca gatcagcatg ctgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1380

acaccgcccg tcacaccatg ggagtggggg ataccagaag tgggtaggct aaccgcaagg 1440

gaggccgctt accacggtat gcttcatgac tggggtgaag tcgtaac 1487

<210> 2

<211> 10948

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Новая бактерия LMB64, класс бета-протеобактерия, происходящая из грунтовых вод

<400> 2

gggcgcagca ccatcgccca ggccaaaagc cacccgtgcc gattcggcgg cctgttgctc 60

gcgctcaatg cgctgcgcct ggtcggccaa gtcggcggct tgctgctcgg ccttgcccgc 120

cagggtgtca cgctcgcggg tcagttccgc cacctgctcg gctagggcat cgcgctcggc 180

ctcgatcacc tcaccagcgg ccgccagctc ggcggcttcg ctctgcgcct ggaccaagcg 240

gccctcgacc tcggcgcggg cctgggcggc tgcgcgctcg atctcggcgg caatggcggc 300

ggtcaatgcc tggggcagtt ccggcgcagc agcagcggcc accggccggg cctctcgcca 360

ggcagttaga tgcttgtgaa cggtattcgg gctgccggtg cccaaacgct cgcggatcgc 420

gcggatagtc ggctgctgcc cttcgccgac cagcgcatca gcggcggcgg cgaacgggtg 480

gcccgtgcag aggcccgcgt cgagcagatc gagcagcagg ccgccaaggc ggcacaggcc 540

cacgaagaag cccgcgccgc cgccacgcag gaagcccggc aagtgcaagc cgaacgcgac 600

gaagcccgca aggtggccgc cgaggcgcgc gagcagaccg cgcgcctggc tgggcaactc 660

gaagccctca ccgcgaagga gcgaaaagcc gatgaaagac cgtgaccaca acgaagcgat 720

ggccggcatg tttcaggccg acccccgatt tgccgccgac tatctgcgcc aggtgttggc 780

cgatggcgag cctaccgacg tgcgcgccgg cttgcggcaa atggcggatg tgctgcgcgt 840

cagtcaggcc gccgcgccga ccgattctgc gccttcggcg ggcctctttg accgggccgg 900

cgtgcgctac gaagtggcgt gcgatgtgat cggggcgttg attgcccatt acgccgaaat 960

catgggacgg gaacgcgagc aggcgcagcc gaatgaggcg gttttgcgcg tggccggagc 1020

catgaaggcg gcgctggccg gggagcggga tgatctcgat ccgcgcgata gcgccggcat 1080

cgaggcggcg atttcgcgct atgcgccact ggcgcgccgg ctgtatggcc aggctgaaaa 1140

cgaccacgcc cgccaggaac agcgtcgcgc cgatttcgac caggtgcatg cttcgctggc 1200

cttggagggg ctggccatga gcgcggacga tttggcggtt caggcgctgc tgatccgggg 1260

cgacattacc cacgatgagg cggtgcagtg ctaccgcatc ctgcatcgcc atgcgcggta 1320

aaaccgactg gccgcccgag gtggccggtg tgctgggttt gctcgaatcg cagccgccag 1380

aggcggcgat gctggtgggc tgttttctgg cggcggtagc ccatcccgat catgcggccg 1440

aattggcgat gttcgacaaa ttgccgccag cggcccggat ggtcgtcggg cgatttttcc 1500

tcgtttttct ggcgggcggc ctggacgatg ccgggcgcga aaaactgcat tcgcacatgc 1560

aggcatggtt tgtccgtcag cgccgttttc ggtgaatggc ttgcctcatc cactagggcc 1620

gggcaagggg tgaacagcgg gcgatgctgg cttgcgggac gaccccgcac ccccggaaaa 1680

cttgtcacac accacgcaac tcccgttgct tcgctaaaag ccttgtgccg caaggctttt 1740

agcgaggcga caccgaagac acatcgcggc gacaccgaaa gggccgaacc ggcctaaaac 1800

ccttgctgcg caaggagaac agccgcgctt tcgcgcgcga aagtgcttca aatgcctgtc 1860

ggcatcagca gggtatggat cggcacgccg aaggcgttgg cgatgcgctc caggttgtcc 1920

aaggagatgt ttctgacttg gcgctcgcag tgcgcaacga aggtgcgatg taggccgcac 1980

tcaaaggcga gcgcttcttg tgaccagcct ctttcccggc gtaatcggat catgttggcc 2040

gcgagcacgg cccgcgcgga atgcgcggtt ggtgcgggag gttgagcggc gggagacatg 2100

caaaccagtc tcctgatatg ccgcttttac gtcagccgtg tttaagtcac aatatggttt 2160

tctcatagag aaagacggcg tgacgatggg cagaaaaaca gcaatcaggc gagggggtgc 2220

cgtgttggcc agcctgttga tttgcgcaat tgaaccggtc ggcgcggcct ccctggtcgg 2280

cggtcaaacc gatgattccg tgtgcgacct gggcagcgcg ccacagaacg cccggaagct 2340

gtcggcagcg ggcgacttca tccgcgcgca gtgcaaaaac ggtcaaatgt tggtgggttc 2400

cggcatcgtg cctgccggcg ggtttgactc ggaagtggtg cgcctggcgc gcaccttctg 2460

ccgcatggcg gacattcaga ctcggcgcac gcagggcaac atggccggcc tcgtcatgga 2520

gatcgacgag gtacggtgca tcatcgggaa gttgccgaca tgagaaaagc gatgttggct 2580

ggctttctgg ccgttgtggt ggccaacgtg gttgccgctg agggcggtgc gcccttgcgc 2640

ggcggtgttt gcatcggacc gttccgtggc gctgattccg tcgtgcactg cgagcacatc 2700

ggcaaggtga cgatccgcca gatttacgaa aagggctttc gggtcgttca catgcaggac 2760

gacaagaaca cagccagcta cgttgtgctg gttatcgagg agcaggcgcg atgagggcga 2820

aagcgtggcg gatgctgttt gccgggcggc gctgggtgct ctggcttccc gtgccggcgt 2880

cggtatggct ggcactgccc gaatggcagc acattcccgc catgttgttg ggcggcctga 2940

tcgtgtggat tcccttctgg ctcgcgtggt ggctcagtga tggcttcgcg ggcatgtcca 3000

ggtggccagg aaccggcgca cctgcggtat ctggcggggt gaacccgcac accggcaagc 3060

catgcacggt gtatcaccag ccgtggggag ataccttcgt gggtggagac tgattatttg 3120

attgaggaac gatgacaagg gccagcaaca agctggccct tgtcgttttc tggactgttt 3180

tacccacaac atccgctctg ctgctgaatt ggcggacatg gcaccgagcc gaacgaacag 3240

aacacgcagc aatcccccgg cttggggcgc agcagcgtat ggcaggccgg gcactcgtag 3300

tagaactggc aggcgtccgt gggcatggtt tcctgctgtg cgtggccgca gtgcgggcag 3360

gtcagcacgg attcgagaat gacggcgctc atcgtggcgt tacctctgca cggtggacgg 3420

atagcctgcg ttcgtcgttg ccgaggtcaa cgcttccggc ttggccttgt cggcgtcata 3480

ggtgacggtg gccgttttct tgtcgaaatc gaccttgacg gcgctcacac cgggcacttt 3540

ctccagcgac ttcttgactg tgatcgggca tagctcgcag gtcatgttct gaacggccag 3600

cgtgacggtt ttcggggtgg cggccagcac ggcgagcggc acggcagcca gcagagcaat 3660

cagcagtttg cgcatgggag tctcctttca atagaacagc ggggcgaacc acggcacggc 3720

caacagggca agcaacagca cagtgacgat ccagaacgtc aggcgctgcc gctggcgtgt 3780

gcgcggatca gcgcatggcg tgccgggcgt gcagacctgc ggcaccagat agagcttgcg 3840

gaaggccagt ccgagaaaga gcagcgtcat gccgatgaaa aagggccggt acggctccat 3900

cgcggtcagg ctgccaaccc atgagccacc aatgccaagc accagcagga caagcggccc 3960

gacacagcac accgacgcgc cgatggcggt cagtacgctc acgatcaacg agcttttttc 4020

agtgagtcgt gccatgtcgc tttccttgta cctgtttgcc caagtgttac tctaaatccc 4080

gtacctaagt acggagtcaa gggggtgtga tgggaacaga actgaccatc ggcaagctgg 4140

ctgacgctgc cggggtgaat atcgagacga ttcgctacta ccagcggcgc ggcctgctgg 4200

atgagccgcc taaaccgcca ggggggcatc ggcgctatgc gcctgagcag gcaaaacgtg 4260

tgcgatttat caagcgggca caggcgcttg gtttcacgct ggacgaggta ggcgcgctac 4320

tgaccctgga tgcggcctgc gcctgcggtg agacgcgagc gctggctgtg cgcaagctgg 4380

gtctgatcga gcagaagatg gctgacctcg cggccatgcg gcaggcgctg ggtggattgg 4440

tgcagcagtg tgatgcgggc gacggtggag ccagctgtcc catcatcgac gtgctggcag 4500

gtaattagat gtgttcaaaa aatggtggtt ttctggacac atgccggttt gccctgtcct 4560

gagttgtcct gatgcgttaa agtgttcatt tattcgttca gctttcaatg tggcggaact 4620

gttcatgaat caacgcatcg gctatgcccg cgtttcgacc gacgaccaaa acctagacct 4680

gcaacgggac gcactccggc aggctggatg ctcaaccatt tacgaggaag cagccagcgg 4740

aaagagcgca gcaaggcccg agcttgagca gtgtcggaag gctctccggc ccggcgacac 4800

gcttgtggtg tggcggcttg atcgccttgg gcgcagcctg cccgacctgg tgcagatcgt 4860

ggctgatctt gaacagcgcg gcgtgcattt cgagagcctg accgagaaga tcgagacggg 4920

gagcgcagcg ggtaagctgc aattccatgt tttcgctgca ctcgccgagt tcgagcgcgg 4980

cctgatccgg gagcgaaccc gggcagggct ggatgcagct cgcgcccgtg gccgatccgg 5040

tggacgcaaa ccgaagctgg acgccaagca gatacgccac attaaggcgc tactacgtga 5100

cccgaatacc tgtgttgctg aactcgcccg tgactacggc gtgtcgagaa caactatcta 5160

taaacactgc ggtgtggttc tgccgcgtac agccgatgaa ggggcaatat gacaaaaaag 5220

acaacagcat tcgatgtatt cgagaaatgc gtccaagcag ttcaggctgg tgaactgatc 5280

gaatccgttt ctgcgaagga caaggaattc catttccaga actggtttca gaagcgcctc 5340

cagagcctgt cgatgcactt cgaggggtcg ggtcgcaaca cctacccgga cttctgcttg 5400

gtagagcaca ccgagggcta cgagatcaag ggtttggcat ggcctggccg cgagcgcgac 5460

tacgactcga acagccaagt gccgactggc tatcacaacg gccgtcaaat cttctacgtg 5520

ttcgggcgct accccgcaga cctgtctggc tatgccgatc agggcaacgg ccgcaggcag 5580

tacccggtgg ttgacctcgt ggtctgccac ggcgacttcc tcaacgccga tcacaactac 5640

gtccataaga acaagagcgt aaagggcttt ggcacctacg gcgacatcat gatccgcgac 5700

cggaagatgt acgtcgcgcc gacgccattt gcgctgaccg aaggcaccac tggcctgatg 5760

actttgatcc tgccggagaa cttcggcacc gatgaccgtt accaggtggt cggtaacctc 5820

actcgcgtcg aggcggaaac gctggtggtt ggctacaact ttgacctgcg cacgaacgag 5880

ctgagcgcag agcgcgtgcc caatcccaac gcaggcaccc agcaccgatt cgtggcctac 5940

cggctcaagg atcaagcgag caagcctgtc tccatgactg gcacccaggt gcagcccgac 6000

gagaacaacc tgccggacga cgaatgaaca ccatcaccga caagatcggg ttcgcttacc 6060

cggttgcagc gaccgcgctg gagtgcgact tcccgctggt cgaaatcagc cagatcgccg 6120

agcaggaaag ttggcgaaag gagatcaaca ggccgatcta ccacatccac aagtggtggg 6180

cgaccagact tgggtcggtg tttcgtggca ttacccttgg tgctttgagt cagcctggta 6240

ctgacctctg ggcgcagttc tacaaaacgc acgacctggc cggtaaggta gtgctcgatc 6300

ccttcatggg cagtggcacg acgcttggcg aggccgtcaa gctgggtgcc aaggccatcg 6360

gctgcgacat caacccagtc agtaccttcc tcgtacgtca ggcgttcacg ccggcgtccg 6420

aggcagagct gcgtgccgct ttcgagcggc tggaacgtga cgtggcaccg gagattcggc 6480

gctactacca gacgcgcgat cctaagacgg gcgagctgat tcaggtcttg tactacttct 6540

gggtcaagac ggtgacgacg cccgagggcg aggtaatccc cttgctgtcg cgctacgtgt 6600

tttcacaaga cgcctacccg aagaagaagc cgcgagcgca gatcgtgtgc cctggctgct 6660

ggagtgtgct ggaggatcgc tacgatgcga ctgacctgca ctgccagcac tgcggccacc 6720

agttcaatcc gcaggaaggc ccggccgctg gtcagtacgt caaaaccaag ggcggtcacc 6780

gttaccgcat caaggaacta ctgccaaagg acggtacgcc gccctctcat cgaatgtacg 6840

cgatgatggc cttgcgagcg gatggatcga aggtctatct gccggtgcgg aatgaggact 6900

tggccctcta cgaggaagcc caagaacgcc ttgctacaga ggcactgccg ctgccgaaaa 6960

cctctgttcg acctggccac aacaccgacc aggcgcgcgg ctacaactac acccaatggc 7020

gcgacttctt caatgcgcgc caactgctgt gccttggcct gctgctgcgg gaaatcctga 7080

ccatcgacga cctggcagtg caagagcaga tgctgtgctt gttctccagc accttggagt 7140

tcaacaacct gttttgcagc ttcaagggtg agggaacagg ggccgtgcgg catatgttct 7200

cgaaccacat cctcaagcca gagcgcaccc cgctggagaa ctccgtgtgg ggcactggca 7260

agagcagcgg tacgtttagc acgttgttcg agtctcgcct gctacgtgcg aagcgctacc 7320

tcgatgagcc gttcgagatc gcgttcgagc atgaccagga cggtaaccgc gcaggctcgc 7380

gcaagacggt ggctagccat ccgatccgcg cccgtcgcgt cgaaacctgg ccggaattgg 7440

aggccgcaga tcatggcctg ctgatcctca acggtgacag ctcgaagctg ccggtgcccg 7500

ctggttcggt ggatgccgtg gtgactgatc cgccctactt cgacttcgtt cattactcgg 7560

agttgagcga cttctttttt gcttggctca cccctgtgct gcgccagcgc tatccgtgga 7620

tggcccgcga ggactcgtct gaccaagggg aggtgcagca caaagaccct cgtgtgttcg 7680

cccgtcagct tgcgtcggtg ttcacggagg cgtgccgcgt gcttaaggac gatggagtgt 7740

tggcgttcag cttccaccac tcgcgtgccg agggctgggc ggccatctat gaagcgatca 7800

acaaggcggg cctggccgta gttgcggctc accctgtcca tgccgagctg cgcgcggcaa 7860

gtcccaagac tgcggccaaa gacccgatca gccttgatgc gattctggtg tgtcgcaaaa 7920

aggcgtttgc cctgcaccag tcgcctgcta tccaggatgt ccgccaggct gttgatgcgc 7980

tggcatcacg gctgcaagct gctggccttc gcatctcggc gggtgaccgc ttcgtgatcg 8040

gcgcagcgca aaccttgatt gcacgcgctg ctgatgacat gggcttcgac gagatcaagg 8100

ttgatcttga ggcaattcgg ctggccgtgg ggccaagggc tgcaacatca aaggctgcga 8160

gtgcgtggga tgacgatgtg cccttctgat tggctgcacg gccttgtcgg cgcatgcgtt 8220

ttgatggcag ccgctgcacg caagccgcgt ccctccgcgt aaagttcatt tatacgcaaa 8280

tacgtatttg cgtgatacaa taacgccata ttaatggagg tgcgtaaatg cggactattg 8340

ttgtggctag ccaaaaaggt ggcgtcggca agacaacgat tgcaggtcac ttgggtgtca 8400

tggccgagca gagcaaagag gggccagtgg cgctgatcga cacagaccca caaggctcgc 8460

tcgcgtcctg gtggaatgag cgaaccaatg aggcaccgct gtttgcacgg gtggaaatcg 8520

gcaagctgac cgagcacctt caggcattgt ccaagggtgg catcaagctg gccatcatcg 8580

acaccccgcc ctctgttacg gaaatgattc agcaggtgct ccgcaccgcc gacttggtac 8640

tgatccccac caggccgagt ccgcatgact tgcgcgcggt cggatctacc gtcgaactgg 8700

tggagaacgc aggcaagcga atgatcttcg tcatcaatgg ggcggcacct cgcgcgcgga 8760

tcgcgggtga ggctgccgtg gcgctttcgc agcatggcac ggttgccccc gtgacgctgt 8820

accagcgcac cgacttcgcc agctcgatga tcgacggccg caccgtccag gaaatcgacc 8880

ccaaggggcg gtcggccgaa gaaatcgggc agttgtggaa atacgtatct acacaactgc 8940

gtaaaatttg atataatacg tacatgcgta ttaatggaga tacgtaaatg gctaaaactg 9000

catctttgac tgccggcctg gtggccaaga aaggggaggc gtcccctgct acggttgtcg 9060

cggcacccca ggttcaacct atcgaagtga aggcatcggc gactggcggc ggccgggatt 9120

actacaaggc gttgaccgtc aagttggatc gtgaccgcta cgagagtctg aaaagcatgg 9180

gcgtgaagct ggacaagaag agccaggaaa tctttgtcga ggccctggat ttgtggatga 9240

agtcggccgc tggccagcaa cacgcctaag aggcccctat gcgttcagtg cgctctgccg 9300

tcgaactcgc caaggagttg gccgaaaaag ccaaggcccg ccgcctagcg gcggaaaaga 9360

acgagctggg acttgaaggc ccggcgcagg gcaacgccgg caccactccc agcccggtga 9420

aggttgcggc cgaagtggtg ggcgagcagc cggcacgacg caagggagcg ccgaaagggc 9480

cgcgtggcct gatgccggtg catcatccaa accgcgattt cttcttgtgc gatctgtttg 9540

actacgccct aaaggatgac ggcgtgagca tggaggcccc catcttcacc ttggcaacca 9600

ggccggacac ctctgtttgg cattgggaaa gcaaggatgg gacacgcgcc atcaccgtca 9660

cgccaagcgt gaaggggagg gccacgcagt ttgataagga tttacttatt tacgtagtta 9720

gccagatgac cgaggctatc aatcgcggtc ggcctgatgc gaacaatcga accgtgcgct 9780

ttcgcgtcta tgactacttg gtctcaacca acaagccgac tggcggcaag gagtaccagc 9840

gactggagga tgccctagac aggctgcggg gtacatcgat caagacgaac atcaagacgg 9900

gtggccagcg tgtgaaggaa ggcttcggca tcgtcgatag ctggacgatc atcgagaagg 9960

cccccgacga tgaccgcatg attgccgtcg aggtcacgct ctccaagtgg cttttcaatg 10020

cagtgcaggc ccacgaggtt ctgaccatca acccggacta tttccggctg cgtaagccaa 10080

ttgagcgccg tttgtacgag ctggccagga agcactgtgg cgaccaggcc ttttttgtga 10140

ttgggctgga actgttgcag gacaagtgcg gcagcaagtc ggcactgttc gagttccgcc 10200

gtgccttgcg cgagatcatc aaggccgaca ccttgccaga ctaccgcatg acgcttgatg 10260

acgagaaaga ccaggtgatt ttctacaccc gcgacacgaa gaagctagcg gcgtctaccg 10320

ctctggcccg gcgcttccag tgacgcccaa agtattgacg gtcaatactt cgttatttca 10380

cccatgcggt gttaccgctg cgtgttggac gttcccttga cctagcggcc gaggcagggc 10440

tttcgcgctt tgcattgagc caccaagtgc gtctcgctcc ttcgagcatc aagccctaac 10500

gcgtttcatg tcactttcgc gcacgaaagt cgaggcaaga ggcttgatcg tgtctatcgt 10560

tacatcaccc atgcctgtgg atggacacgt tacatcaccc atgttttctg tggatgggca 10620

cgttacatca cccatacctc acttcgttac atcgcccatg cagcgatttg tggaagcctt 10680

gagcagcaag gctttacgag cgttatccac agccgtaaca cgcgcgcgcg attttttaac 10740

tttataaatc tttaacgcgg ttgcggacaa agcccgcgcc gcctcttggg ggctacgccc 10800

ccgccggctc ctacgggccg caagcggccc tccgcccgcg cttcgcgctc cctcccggca 10860

tccccgaggg gtttcgcttc gctgcacccc tcgcgcttcg cgctcacccg catatcgagg 10920

cccccaaagg gggccggatg gtgccccc 10948

Изобретение относится к применению бактериального секретома бактерии, депонированной в CNCM под номером I-4290, в лечении повреждений кожи. Указанный секретом получают способом, включающим культивирование указанной бактерии в культуральной среде и при подходящих условиях для ее роста, разделение жидкости/твердого вещества и выделение жидкой фазы, где указанная жидкая фаза содержит секретом. К полученной жидкой фазе добавляют основной буфер, выбранный из Tris буфера, аргининового буфера и их смесей, инкубируют полученную буферизованную жидкую фазу в течение 1-7 ч при температуре от 1 до 6°С с получением указанного секретома. Также предложена дерматологическая композиция для применения в лечении повреждений кожи, содержащая эффективное количество указанного бактериального секретома и дерматологический эксципиент, подходящий для местного нанесения. Изобретение эффективно в лечении повреждений кожи. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Применение бактериального секретома бактерии, депонированной в CNCM (Национальная коллекция культур микроорганизмов) 8 апреля 2010 г. под номером I-4290, в лечении повреждений кожи,

причем указанный секретом получают способом, включающим следующие стадии:

а) культивирование указанной бактерии в культуральной среде и при подходящих условиях для ее роста,

б) разделение жидкости/твердого вещества и выделение жидкой фазы, где указанная жидкая фаза содержит секретом,

в) добавление основного буфера, выбранного из Tris буфера, аргининового буфера и их смесей, к жидкой фазе, полученной на стадии б), и инкубирование полученной буферизованной жидкой фазы в течение 1-7 ч при температуре от 1 до 6°С, и получение указанного секретома, содержащего биомолекулы, секретируемые указанной бактерией в жидкую фазу.

2. Применение по п. 1, где после стадии б) разделения жидкости/твердого вещества следует стадия б') осветления жидкой фазы или буферизованной жидкой фазы посредством фильтрования.

3. Применение по п. 1, где фильтрование проводится с порогом отсечения 0,2 мкм.

4. Применение по одному из пп. 1-3, где указанные биомолекулы состоят из пептидов, белков и вторичных метаболитов, секретируемых указанной бактерией.

5. Применение по одному из пп. 1-4, где бактерия содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2.

6. Применение по одному из пп. 1-5, где повреждения кожи выбраны из группы, состоящей из ссадин, ожогов, солнечных ожогов, царапин, порезов, соскобов, швов.

7. Применение по одному из пп. 1-6, где повреждения кожи происходят после травмы, хирургического вмешательства, дерматологической процедуры или косметической медицинской процедуры.

8. Применение по одному из пп. 1-7, где лечение повреждений кожи заключается в улучшении заживления и репарации кожи.

9. Дерматологическая композиция для применения в лечении повреждений кожи,

содержащая эффективное количество бактериального секретома, как определено в одном из пп. 1-5, и дерматологический эксципиент, подходящий для местного нанесения.

10. Дерматологическая композиция по п. 9, дополнительно содержащая соль меди и/или соль цинка.