КЮВЕТА ДЛЯ ЛАЗЕРНОЙ АБЛЯЦИИ Российский патент 2018 года по МПК H01J49/04 

Область техники

Изобретение относится к кювете для лазерной абляции, к абляционному устройству и источнику ионов для индуктивно связанной плазмы (ИСП), применяющих такую кювету для лазерной абляции, и к способу использования такой кюветы для лазерной абляции, например, для визуализации биологического материала.

Уровень техники

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-MC) обеспечивает точную количественную информацию об основных, второстепенных, следовых и ультраследовых элементах промышленных, геологических, экологических и биологических проб. В процессе ИСП-МС в так называемую горелку с ИСП (ИСП-горелку) потоком газа-носителя вносится проба аэрозоля. В этой горелке газ подвергается воздействию интенсивных высокочастотных электромагнитных полей, которые приводят к образованию плазмы посредством индукции. Ионы из плазмы затем извлекают в масс-спектрометр, где они разделяются на основе отношений их масс к зарядам.

ИСП-МС можно сочетать с лазерной абляцией (ЛА) для подвергания абляции материала из твердой пробы с целью создания аэрозоля, требующегося для ИСП. Абляцию можно проводить непосредственно в ИСП-горелке, или можно размещать пробу во внешней кювете для лазерной абляции выше по течению от ИСП-горелки, а аэрозоль, создаваемый посредством лазерной абляции, транспортируется к ИСП-горелке потоком газа-носителя. Например, документ 1 продемонстрировал кювету для лазерной абляции (так называемую кювету HEAD), для которой направление выбрасывания аэрозоля параллельно направлению уноса газа-носителя. Другая конструкция кюветы для лазерной абляции, основанная на аналогичном принципе, продемонстрирована в документе 2.

С первой половины 1990-х гг. выполняли попытки использовать ИСП-МС с лазерной абляцией (ЛА-ИСП-МС) в качестве инструмента химической визуализации путем сканирования лазерным пятном поверхности пробы. Многие исследования продемонстрировали потенциальные визуализирующие возможности ЛА-ИСП-МС на основе значительного разнообразия твердых и мягких проб. Большинство этих исследований показали эффективное пространственное разрешение приблизительно 5-100 мкм. Хотя ЛА-ИСП-МС предлагает весьма усложненный количественный анализ экспрессии антигена в одиночных клетках, в настоящее время этот метод не обеспечивает разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в пределах проб тканей.

Однако некоторые применения, такие как диагностический анализ срезов тканей, требуют повышенное пространственное разрешение, например, для визуализации изменчивости от клетки к клетке. Эффективное пространственное разрешение определяется размером лазерного пятна, "размытым" дисперсией системы. В свою очередь, над дисперсией системы часто преобладает компромисс между временем вымывания аэрозоля после каждого выстрела лазера и скоростью сканирования. Чем больше время вымывания, тем большее перекрытие будет происходить между сигналами, происходящими из соседних пятен пробы, если скорость сканирования поддерживается фиксированной. Следовательно, время вымывания аэрозоля часто является одним из ключевых факторов, ограничивающих повышение разрешения без увеличения общего времени санирования.

Время наибыстрейшего вымывания может быть достигнуто посредством абляции в горелке, приводящей к длительностям сигналов одиночных выстрелов, составляющим несколько миллисекунд. Вместе с тем, абляция в горелке ограничивается очень небольшими пробами, а сканирование лазерным пятном очень трудно реализовать при абляции в горелке. Поэтому для визуализирующих применений, как правило, применяют наружные кюветы для лазерной абляции. Вместе с тем, даже в наиболее известных конструкциях кювет времена вымывания часто составляют порядка секунд, а небольших времен вымывания, менее 100 миллисекунд, достичь трудно.

Задача изобретения состоит в обеспечении дополнительных и усовершенствованных кювет для лазерной абляции и абляционных устройств, включающих такие кюветы (например, в связи с методом ИСП-МС), которые находят применение в методах визуализации биологического материала, такого как пробы тканей, монослои клеток и биопленки, и которые подходят, в частности, для внедрения ЛА-ИСП-МС для использования в качестве метода визуализации одиночных клеток.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает кювету для лазерной абляции, обладающую потенциалом достижения коротких времен вымывания аэрозолей. Такая кювета для лазерной абляции охарактеризована в п. 1. формулы изобретения. Дополнительные варианты осуществления изобретения выложены в зависимых пунктах формулы изобретения.

Соответственно, обеспечена кювета для лазерной абляции, содержащая проточный канал, имеющий вход для подачи газа-носителя в этот проточный канал и имеющий выход. На первом участке стенки проточного канала предусмотрено боковое отверстие, а на втором участке стенки проточного канала напротив этого бокового отверстия расположено боковое окно. Рядом с боковым отверстием предусмотрена камера для пробы. Камера для пробы выполнена с возможностью приема пробы так, чтобы позволить лазерному лучу попадать в камеру для пробы через боковое окно и боковое отверстие и падать на поверхность пробы так, чтобы подвергать абляции материал с поверхности пробы и создавать аэрозоль. Камера для пробы имеет вход для подачи защитного газа в камеру пробы.

Вход и выход проточного канала могут быть соединены с трубками, имеющими, по существу, такую же площадь поперечного сечения, как сам проточный канал. Таким образом, проточный канал действует, по существу, подобно одиночной детали трубки. Следовательно, абляционную кювету согласно настоящему изобретению можно считать имеющей конструкцию «трубчатой кюветы». За счет минимизации изменений площади поперечного сечения (а предпочтительно также формы поперечного сечения) проточного канала, эта конструкция «трубчатой кюветы» позволяет поддерживать режим по существу ламинарного течения, предотвращая турбулентности настолько, насколько это возможно. Помимо этого, эта конструкция обеспечивает позиционирование пробы достаточно близко к проточному каналу, так что основная доля создаваемого лазером факела аэрозоля вводится непосредственно в поток газа-носителя. Эти меры значительно уменьшают дисперсию. На практике, представленная конструкция кюветы обеспечивает уменьшение времени вымывания до менее 30 мс (полная ширина на 1% максимума) и минимизацию отходов вымывания пробы. Это усовершенствование наблюдается для элементов по всему диапазону атомных масс.

Проточный канал предпочтительно имеет площадь поперечного сечения, которая по существу неизменна или изменяется совсем слабо. В частности, площадь поперечного сечения проточного канала предпочтительно является по существу неизменной в окрестностях бокового отверстия. Площадь поперечного сечения проточного канала можно считать изменяющейся совсем слабо, если любые изменения в поперечном сечении незначительно нарушают ламинарное течение. В частности, площадь поперечного сечения можно считать изменяющейся совсем слабо, если изменение среднего диаметра проточного канала менее 1,5 мм на 1 мм длины вдоль оси трубки, предпочтительно менее 0,5 мм на 1 мм длины вдоль оси трубки, более предпочтительнее менее 0,2 мм на 1 мм длины вдоль оси трубки для любой плоскости поперечного сечения вдоль проточного канала. Предпочтительно, чтобы проточный канал не образовывал четко выраженного сужения у бокового отверстия во избежание четко выраженных эффектов всасывания, как в трубке Вентури, и чтобы проточный канал не расширялся значительно в окрестностях бокового отверстия во избежание нагнетания газа-носителя в камеру для пробы за счет получающейся положительной разности давлений.

В абсолютных цифрах площадь поперечного сечения может принимать широкий диапазон значений, в зависимости от размера лазерного пятна и энергии лазера. Средний диаметр проточного канала (вычисляемый как , где А - площадь поперечного сечения) может находиться в диапазоне, например, от 50 микрометров до 5 миллиметров, предпочтительно от 200 микрометров до 5 миллиметров.

Угол между входом и выходом проточного канала предпочтительно составляет по меньшей мере 160° (точнее между 160° и 200°), предпочтительнее по меньшей мере 170° (точнее между 170° и 190°). Иными словами, проточный канал предпочтительно является по существу прямым или изогнутым не более чем на 20°, или лучше не более чем на 10° в любом направлении. Можно выбрать произвольное направление входа защитного газа относительно направления проточного канала. Вход защитного газа предпочтительно простирается перпендикулярно поперечному направлению.

Проточный канал и камера для пробы разделены разделяющей стенкой, которая образует первый участок стенки проточного канала, на котором расположено боковое отверстие. Чтобы обеспечить позиционирование пробы достаточно близко к проточному каналу, разделяющая стенка предпочтительно имеет минимальную толщину менее 500 микрометров, предпочтительнее менее 200 микрометров. Следует отметить, что толщина разделяющей стенки может изменяться по окружности проточного канала; при этом разделяющая стенка обычно будет иметь наименьшую толщину непосредственно рядом с отверстием между трубкой и камерой для пробы, и толщина будет увеличиваться по мере отдаления от этого отверстия в плоскости, перпендикулярной оси трубки. Дополнительно толщина может изменяться вдоль длины проточного канала.

Чтобы минимизировать возмущения потока, вызванные боковым отверстием, площадь поперечного сечения этого отверстия следует поддерживать небольшой. С другой стороны, может оказаться желательным выполнить отверстие достаточно большим, чтобы предоставить возможность сканирования поверхности пробы лазерным лучом без перемещения этой пробы относительно отверстия. В качестве компромисса площадь поперечного сечения бокового отверстия предпочтительно составляет не более чем примерно 20 мм², предпочтительнее не более чем примерно 7 мм². Выраженное относительно площади поперечного сечения проточного канала отношение площадей поперечных сечений отверстия и проточного канала предпочтительно не более чем примерно 5, предпочтительнее не более чем примерно 3, наиболее предпочтительно не более, чем примерно 1. Чтобы предоставить лазерному лучу возможность прохождения через боковое отверстие, это боковое отверстие предпочтительно должно иметь площадь поперечного сечения по меньшей мере примерно 0,01 мм². Ширина бокового отверстия, поперечного проточному каналу, предпочтительно менее 80% среднего диаметра проточного канала, а предпочтительнее менее 50% среднего диаметра проточного канала. Длина бокового отверстия в направлении проточного канала предпочтительно не более, чем в пять раз превышает средний диаметр проточного канала, а предпочтительнее не более чем в три раза или даже в 1,5 раза превышает диаметр проточного канала.

Чтобы предоставить возможность легкой замены пробы, кювета для лазерной абляции предпочтительно имеет конструкцию из двух частей, содержащую первую часть кюветы (именуемую далее «верхней частью кюветы»), в которой заключен проточный канал, и вторую часть кюветы (именуемую далее «нижней частью кюветы»), которая образует камеру для пробы. Нижняя часть кюветы предпочтительно выполнена с возможностью отделения от верхней части кюветы для замены пробы. Нижняя часть кюветы предпочтительно открыта к верхней части кюветы, т.е. разделяющая стенка между камерой для пробы и проточным каналом предпочтительно образована скорее верхней частью кюветы, чем нижней частью кюветы. Термины «верхняя» и «нижняя» не следует понимать как определяющие абсолютную ориентацию этих частей; эти термины используют только для лучшего различения между разными частями кюветы, а кювету для лазерной абляции можно также использовать в перевернутой ориентации, где верхняя часть кюветы обращена к полу, а нижняя часть кюветы обращена к потолку.

Изобретение дополнительно относится к комплектному абляционному устройству, содержащему абляционную кювету, описанную выше. Абляционное устройство дополнительно содержит лазер, в частности УФ-лазер, для стрельбы по поверхности пробы лазерным лучом через боковое окно и боковое отверстие, и позиционирующее устройство для изменения относительного положения пробы и лазерного луча. Позиционирующее устройство может содержать, например, любое из нижеследующего: двухкоординатный или трехкоординатный столик для перемещения всей кюветы для лазерной абляции относительно лазера; двухкоординатный или трехкоординатный столик для перемещения пробы в пределах кюветы для лазерной абляции с сохранением фиксированного относительного положения между абляционной кюветой и лазером; дефлектор луча для отклонения лазерного луча с сохранением фиксированного относительного положения между абляционной кюветой и лазером; и т.д. Позиционирующее устройство можно применять для сканирования поверхности пробы лазерным лучом. Получающийся аэрозоль можно впоследствии анализировать на предмет его элементного или изотопного состава, например, методом ИСП-МС. Таким образом можно визуализировать поверхность пробы в соответствии с ее элементным или изотопным составом. Вместе с тем настоящее изобретение не ограничивается использованием абляционной кюветы в сочетании с визуализацией методом ИСП-МС, и может применяться также в других способах, в которых требуются короткие импульсы аэрозоля.

Изобретение дополнительно обеспечивает источник ионов в виде ИСП, содержащий вышеописанную абляционную кювету. Этот источник ИСП дополнительно содержит ИСП-горелку, соединенную с выходом абляционной кюветы, и трубку, соединяющую упомянутую абляционную кювету с ИСП-горелкой. Трубка предпочтительно имеет площадь поперечного сечения, которая по существу идентична площади поперечного сечения проточного канала абляционной кюветы, или лишь слабо изменяется по сравнению с площадью поперечного сечения проточного канала так, чтобы поддерживать ламинарное течение с минимальной дисперсией по всей длине трубопровода.

Изобретение также охватывает систему для ИСП-МС (ИСП-МС-систему) содержащую такой источник ионов в виде ИСП и масс-анализатор, связанный с источником ионов. Масс-анализатор может быть, например, квадрупольным масс-анализатором, времяпролетным масс-анализатором (ВП-масс-анализатором) или масс-анализатором с секторным полем, в частности, масс-анализатором Маттауха-Герцога. Вместе с тем изобретение не ограничивается каким-либо конкретным типом масс-анализатора.

Изобретение дополнительно обеспечивает способ работы вышеописанной абляционной кюветы. Способ содержит, но не обязательно в приведенном порядке:

размещение пробы в камере для пробы таким образом, что поверхность пробы обращена к боковому отверстию;

подачу газа-носителя на вход проточного канала;

подачу защитного газа на вход камеры для пробы; и

подвергание материала абляции с поверхности посредством стрельбы лучом импульсного лазера по упомянутой поверхности через боковое окно и боковое отверстие.

Направление лазерного луча, ориентация бокового окна и бокового отверстия, а следовательно ориентация пробы в пространстве могут быть произвольными. Например, лазерный луч может быть направлен вверх, вниз, вбок и т.д., а поверхность пробы может быть ориентирована в любой ориентации, которая обеспечивает лазерному лучу возможность достигать поверхность пробы.

Каждый лазерный импульс будет вызывать квазимгновенное распределение генерируемой лазером массы аэрозоля («факела»). В данном случае, «квазимгновенное» означает временной масштаб, который значительно меньше, чем временной масштаб переноса массы потоком газа-носителя и потоком защитного газа. Распределение генерируемой лазером массы аэрозоля обуславливается действием лазерного импульса самого по себе, без учета обычного потока таких газов, как газ-носитель и защитный газ. Это распределение массы устанавливается в пределах менее 1 миллисекунды после первого взаимодействия лазерного импульса с пробой. Пробу предпочтительно позиционируют на таком расстоянии от проточного канала, что квазимгновенное распределение генерируемой лазером массы аэрозоля имеет свой центр в пределах проточного канала между боковым отверстием и боковым окном. Центр распределения массы определяют как обычно, т.е. так же, как центр масс жесткого твердого тела, проводя интегрирование по всему факелу аэрозоля. Таким образом, большая часть факела аэрозоля нагнетается непосредственно в поток газа-носителя и может быть унесено потоком газа-носителя с минимальной дисперсией.

Оптимальное расстояние между поверхностью пробы и центральной осью проточного канала будет зависеть от типа лазера, энергии лазерного луча, типа газа-носителя и защитного газа, а также расходов газов. Например, для стандартного эксимерного ArF лазера с импульсами в наносекундном диапазоне, аргоном в качестве газа-носителя с расходом 1,1 л/мин и гелием в качестве защитного газа с расходом 0,6 л/мин, оптимальным оказывается расстояние примерно 2 мм. Говоря обобщеннее, пробу предпочтительно следует позиционировать так, чтобы поверхность пробы имела расстояние от центральной оси проточного канала в диапазоне от 0,5 миллиметра до 4,5 миллиметров для лазерных импульсов в диапазоне от 50 фемтосекунд до 50 наносекунд.

Вследствие этого, оптимальное расстояние между поверхностью пробы и разделяющей стенкой, которая отделяет камеру пробы от проточного канала, будет зависеть от различных параметров. Это расстояние может находиться в диапазоне от менее 50 микрометров до 1 миллиметра или более. Расстояние должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить защитному газу возможность протекания вдоль поверхности пробы и через боковое отверстие в проточный канал.

Защитный газ выполняет по меньшей мере три задачи: он продувает аэрозоль на оси сообразно с направлением нагнетания аэрозоля, что способствует поглощению частиц аэрозоля в потоке газа-носителя; он образует «область защиты» над поверхностью пробы и гарантирует, что абляция осуществляется в управляемой атмосфере; и он увеличивает скорость течения в проточном канале. Вязкость защитного газа предпочтительно ниже, чем вязкость основного газа-носителя. Это способствует локализации аэрозоля в центре проточного канала и минимизации дисперсии аэрозоля ниже по течению от абляционной кюветы. В частности, газом-носителем предпочтительно является аргон (Ar). Аргон хорошо подходит, в частности, для прекращения распространения аэрозоля до того, как он достигает стенок проточного канала, и он также необходим для повышенной инструментальной чувствительности в большинстве случаев ИСП на основе газообразного Ar. Защитным газом предпочтительно является гелий (He). Вместе с тем этот защитный газ может быть заменен другими газами или может содержать их, например, водород, азот или водяной пар. Основная доля защитного газа, например, по меньшей мере, 50 объем. %, предпочтительно представляет собой гелий. При 25°C Ar имеет вязкость 22,6 мкПа⋅с, в то время как He имеет вязкость 19,8 мкПа⋅с.

Оптимальные расходы газа-носителя и защитного газа будут зависеть от множества факторов, прежде всего от геометрии, в частности, от площади поперечного сечения проточного канала. Во-вторых, они будут зависеть от геометрии бокового отверстия. Вместе с тем предпочтительно, чтобы объемный расход защитного газа был меньше, чем объемный расход газа-носителя, в частности, составлял от 0,3 до 1,0 объемного расхода газа-носителя. Объемный расход защитного газа можно регулировать, чтобы способствовать нагнетанию центра факела аэрозоля близко к центру проточного канала.

Способ по настоящему изобретению подходит, в частности, для химической визуализации. С этой целью вышеупомянутый способ может содержать сканирование поверхности лазерным лучом и анализ получающегося в результате аэрозоля для получения химического изображения поверхности пробы. Анализ можно осуществлять масс-спектрометрией, в частности, посредством ИСП-МС, но можно также осуществлять любым другим подходящим способом.

Данный способ хорошо подходит для исследования биологических проб, в частности проб ткани человека или ткани животного. Вместе с тем способ не ограничивается биологическими пробами и может быть применен также для проб других видов. При выполнении на биологических пробах способ по изобретению можно выполнять на субклеточном уровне, на клеточном уровне или при пониженном разрешении, при котором отдельные клетки в ткани индивидуально не разрешимы.

Краткое описание чертежей

Предпочтительные варианты осуществления описываются далее со ссылкой на чертежи, которые приводятся с целью иллюстрации представленных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, а не с целью их ограничения. На чертежах:

Фиг. 1 показывает схематический эскиз (не в масштабе) перспективного изображения кюветы для лазерной абляции в соответствии с настоящим изобретением;

Фиг. 2 показывает схематический эскиз (не в масштабе) центрального продольного сечения кюветы для лазерной абляции по фиг. 1;

Фиг. 3 показывает схематическую иллюстрацию (не в масштабе) генерируемой лазером факела в кювете для лазерной абляции;

Фиг. 4 схематически иллюстрирует результаты моделирования потока газа в проточном канале кюветы для лазерной абляции; часть (a) показывает рисунок распределения смеси He и Ar, когда полученный абляцией (уносимый) аэрозоль находится на границе раздела смеси выше бокового отверстия, причем степень смешения обозначена оттенками серого цвета, а белый цвет отображает наивысшую степень смешения; часть (b) показывает смоделированный рисунок скоростей течения газов, причем скорость течения обозначена оттенками серого цвета, а белый цвет отображает наивысшую скорость течения;

Фиг. 5 весьма схематично иллюстрирует комплектную систему для ЛА-ИСП-МС (ЛА-ИСП-МС-систему), применяющую кювету для лазерной абляции по фиг. 1;

Фиг. 6 показывает диаграммы, иллюстрирующие результаты оптимизаций рабочих характеристик кюветы для лазерной абляции при изменении: (a) величины зазора между поверхностью пробы и боковым отверстием; (b) расхода газа-носителя (Ar); и (c) расхода защитного газа (He); на всех диаграммах показана ширина пика, нормированная по площади пика на основании полной ширины по критерию 1%-го максимума;

Фиг. 7 показывает диаграммы, иллюстрирующие рабочие характеристики кюветы для лазерной абляции, как продемонстрировано интенсивностью ²⁷Al в масс-спектрометре при различных частотах повторения: (a) сигнал переходного процесса для частоты повторения приблизительно 1 Гц; (b) вид в увеличенном масштабе ограниченного участка части (a); (c) сигнал переходного процесса для частоты повторения приблизительно 10 Гц; (d) сигнал переходного процесса для частоты повторения приблизительно 30 Гц;

Фиг. 8 показывает диаграммы, иллюстрирующие характеристики кюветы для лазерной абляции для различных изотопов: (a) ширину пика; (b) относительная нормированная чувствительность, вычисленная исходя из площади пика;

Фиг. 9 показывает изображения, полученные для покрытого Pt тестового рисунка с пленкой Au в форме букв «ETH» и накрывающей пленкой Ag в форме букв «PSI»; визуализацию осуществляли (a) оптической микроскопией; (b) сканирующей электронной микроскопией; (c) и (d) ЛА-ИСП-МС в квадрупольном масс-анализаторе, применяющем кювету для лазерной абляции по фиг. 1; и

Фиг. 10 показывает изображение распределения рецептора 2 к фактору роста эпидермиса человека (HER2) на тонком срезе раковой ткани молочной железы, полученного методом ЛА-ИСП-МС в однодетекторном масс-анализаторе с секторным полем.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Кювета для лазерной абляции

Фиг. 1 и 2 схематически иллюстрируют кювету 1 для лазерной абляции, также именуемую в дальнейшем «трубчатой кюветой», в соответствии с примерным вариантом осуществления по настоящему изобретению. Абляционная кювета 1 содержит две части: первую часть или верхнюю часть 10 кюветы и вторую часть или нижнюю часть 20 кюветы. В верхней части 10 кюветы образован трубчатый проточный канал 11, простирающийся от входа 12 газа-носителя к выходу 13 смешанного газа. На участке 15 нижней стенки верхней части 10 кюветы образовано боковое отверстие 14. На участке 17 верхней стенки верхней части 10 кюветы образован поперечный проход, закрытый окном 16 из диоксида кремния, прозрачным для УФ-лучей. В нижней части 20 кюветы предусмотрена камера 21 для пробы. Вход 22 защитного газа ведет к камере 21 для пробы. Хотя вход 22 защитного газа показан как простирающийся (анти)параллельно проточному каналу 11, может быть выбрано произвольное направление входа защитного газа. Вход защитного газа предпочтительно простирается перпендикулярно поперечному направлению. В камере 21 для пробы размещают пробу 23 и устанавливают нижнюю часть 20 кюветы на верхнюю часть 10 кюветы таким образом, что верхняя поверхность 24 пробы 23 оказывается под боковым отверстием 14.

Для работы абляционной кюветы на вход 12 проточного канала 11 подают газ-носитель G1, а на вход 22 камеры 21 для пробы подают защитный газ G2. Луч 41 УФ-лазера попадает в окно 16, пересекает проточный канал 11 выходит из проточного канала 11 через боковое отверстие 14 и падает на верхнюю поверхность 24 пробы 23.

Каждый лазерный импульс генерирует аэрозольный факел 25, схематически изображенный на фиг. 3. Этот факел является непосредственным результатом действия лазерного импульса; первоначальное распределение массы в факеле сразу же после окончания лазерного импульса подвергается лишь весьма небольшому влиянию потоков газа-носителя G1 и защитного газа G2. Конструкция кюветы 1 для лазерной абляции обеспечивает возможность размещения центра распределения генерируемой лазером массы аэрозоля точно в проточном канале без необходимости сначала переносить аэрозоль в проточный канал посредством потока защитного газа. Затем газ-носитель G1 и защитный газ G2 уносят аэрозоль к выходу 13, где они выходят из абляционной кюветы в виде потока G3 смешанного газа.

В качестве газа-носителя G1 предпочтителен аргон (Ar). В качестве защитного газа предпочтительно выбирают гелий (He). Ar выгоден для остановки распространения аэрозоля, которое, как правило, происходит в атмосферах чистого He. Добавление He из контейнера для пробы имеет три преимущества: a) такая компоновка обеспечивает продувку аэрозоля сообразно с направлением нагнетания аэрозоля, что способствует поглощению частиц; b) газообразный He образует область «защиты» над поверхностью пробы и гарантирует, что абляция проводится в атмосфере He; c) смешивание Ar и He уже в трубчатой кювете не только предотвращает необходимость дисперсионного адаптера газа (резервуара для смешивания Ar и He), но также увеличивает скорость течения и вязкость газа по сравнению с обычной компоновкой, использующей в качестве газа-носителя только He, вследствие чего уменьшается дисперсия аэрозоля.

Фиг. 4 показывает результаты расчетных моделирований динамики текучей среды, осуществленных с помощью пакета программного обеспечения ANSYS CFX 12 (ANSYS Inc., Berlin, Germany). При моделировании рассматривали модель переноса напряжения сдвига для турбулентности. Моделирования осуществляли для следующих параметров: длина бокового отверстия: L=4,5 мм; ширина бокового отверстия: 1,5 мм; минимальная толщина нижнего участка стенки: w=50 микрометров; общая длина проточного канала: 50 мм; диаметр цилиндрической камеры пробы: 23 мм; расстояние между верней поверхностью 24 пробы 23 и участком 15 нижней стенки: d=350 микрометров. Потоку Ar на входе придавали постоянную скорость 2,6 м/с (1,1 л/мин), в то время как He моделировали, используя 1,4 м/с (0,6 л/мин).

Распределение смеси обоих газов на входе показано на фиг. 4 (a). Смешивание обоих газов обозначено оттенками серого цвета, а белый цвет отображает наивысшую степень смешения. У бокового отверстия 14 образуется резкая граница раздела при попадании потока He в поток Ar. В области отверстия гелий в значительной степени доминирует и образует вместе с аргоном граничный слой. Благодаря наименьшей степени смешения этих двух газов в боковом отверстии 14 и предыдущим результатам, указывающим, что полученный абляцией лазером аэрозоль легко проникает в He, но не в Ar, можно допустить, что аэрозоль не диффундирует в атмосферу аргона, вследствие чего не достигает всего поперечного сечения проточного канала и остается очень плотным. Первоначально очень резкая граница раздела расширяется в пределах нескольких миллиметров ниже по течению от отверстия. Изменяя комбинацию потоков газов на входе, можно управлять высотой граничного слоя и соответственно высотой получаемого абляцией аэрозоля.

Смоделированное распределение скоростей потока газов показано на фиг. 4 (b). Поток Ar на входе выше по течению от бокового отверстия 14 представляет типичное распределение ламинарного течения в проточном канале, являясь самым быстрым в центре трубки и постепенно замедляясь в направлении стенки трубки. Моделирование выхода обоих газов не показало значимо турбулентного течения. Как бы то ни было, расчетное число Рейнольдса (~2000) близко к перехода от ламинарного к турбулентному течению (2300~4000). Вместе с тем, использование турбулентной модели указало на четкое ламинарное течение. Поэтому можно сделать вывод, что благодаря отсутствию турбулентностей и определенному расстоянию остановки генерируемого лазером аэрозоля близко к центру трубчатой кюветы, которое согласовано с наивысшей скоростью газа, должна быть достигнута низкая дисперсия аэрозоля.

Фиг. 5 схематически иллюстрирует комплектную ЛА-ИСП-МС-систему. Лазерный луч генерируется лазером 40. Кювету 1 для лазерной абляции устанавливают на трехкоординатном столике 5, чтобы сделать возможным изменение положения пробы относительно лазерного луча. Выход 13 кюветы 1 для лазерной абляции соединен с ИСП-горелкой 6 трубкой 61. Трубка 61 имеет по существу такой же внутренний диаметр, как проточный канал 11 кюветы 1 для лазерной абляции, чтобы гарантировать ламинарное течение газа G3 на выходе. ИСП-горелка генерирует источник плазмы за счет работы радиочастотной катушки (РЧ-катушки) 62; горелки сконструирована обычным образом. ИСП-горелки хорошо известны в данной области техники и не требуют дальнейших пояснений. ИСП-горелка соединена с масс-анализатором 7 посредством источника 71 ИСП. Масс-анализатор может быть квадрупольным масс-анализатором, времяпролетным масс-анализатором (ВП-масс-анализатором), масс-анализатором с секторным полем и т.д.

Конечно, без отклонения от объема настоящего изобретения возможны многие модификации кюветы для лазерной абляции и установки для ЛА-ИСП-МС. В частности, настоящее изобретение не ограничивается конкретным выбором материалов кюветы для лазерной абляции, конкретными геометрией или размером камеры для пробы, конкретными геометрией, длиной и диаметром проточного канала в абляционной кювете, конкретными геометрией и размером бокового отверстия в абляционной кювете, конкретными размером окна или материалом, конкретным типом лазера для абляции, конкретными типами газов, вводимых в абляционную кювету, и т.д.

ЛА-ИСП-МС и масс-цитометрия

Изобретение относится к кювете для лазерной абляции, которая может быть связана с масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (ЛА-ИСП-МС), находящей применение при визуализации биологических проб. Таким образом, изобретение обеспечивает ЛА-ИСП-МС, содержащую (i) кювету для лазерной абляции в соответствии с изобретением и (ii) масс-анализатор. В одном применении разные молекулы-мишени в пробе могут быть помечены разными метящими атомами, и тогда ЛА-ИСП-МС используют по всем множественным клеткам меченой биологической пробы. За счет сопоставления обнаруживаемых сигналов с известными положениями лазерных абляций в кювете для лазерной абляции, которые стали источниками тех сигналов, способ позволяет соотносить меченую молекулу-мишень с конкретными местами на пробе и, таким образом, конструкцию изображение пробы.

ЛА-ИСП-МС включает в себя воздействие на пробу ткани лазерными импульсами, которые генерируют факелы абляционного (уносимого) материала из пробы, и эти факелы переносятся в виде аэрозоли в прибор для ИСП-MС с целью анализа. Метящие атомы в пробе можно различить посредством МС и поэтому их обнаружение выявляет присутствие или отсутствие множественных мишеней в факеле.

Пространственное разрешение сигналов, генерируемых таким образом, зависит от двух основных факторов: (i) размера пятна лазера, поскольку сигнал интегрируется по всей площади, которая подвергается абляции; и (ii) скорости, при которой можно анализировать факел, по отношению к скорости, с которой факелы генерируются, чтобы избежать перекрытия сигнала от последовательных факелов.

Таким образом, чтобы проанализировать отдельные клетки, следует использовать размер лазерного пятна, который не больше, чем у этих клеток, а конкретнее размер лазерного пятна, который может подвергать материал абляции при субклеточном разрешении. Этот размер будет зависеть от конкретных клеток в пробе, но в общем случае лазерное пятно будет иметь диаметр менее 4 мкм, например, в диапазоне 0,2-4 мкм, 0,25-3 мкм или 0,4-2 мкм. Таким образом лазерное пятно может иметь диаметр примерно 3 мкм, 2 мкм, 1 мкм или 0,5 мкм. В предпочтительном варианте осуществления диаметр лазерного пятна находится в пределах диапазона 0,5-1,5 мкм или примерно 1 мкм. Небольших размеров пятен можно достичь с помощью размагничивания расширенных лазерный лучей и использования оптики ближнего поля. Диаметр 1 мкм лазерного пятна соответствует фокальной точке лазера 1 мкм, но фокальная точка лазера может изменяться на +/-20% из-за числовой апертуры объектива, который переносит лазерный луч на поверхность пробы.

Для быстрого анализа пробы ткани необходима высокая частота абляции, например, 10 Гц или более (т.е. 10 абляций в секунду, что дает 10 факелов в секунду). В предпочтительном вариантом осуществления частота абляции находится в пределах диапазона 10-200 Гц, в пределах диапазона 15-100 Гц или в пределах диапазона 20-50 Гц. Частота абляции по меньшей мере 20 Гц обеспечивает возможность визуализации проб типичных тканей, достигнутой за приемлемое время. Как отмечено выше, на этих частотах приборы должны быть способны анализировать абляционный материал достаточно быстро во избежание существенного перекрытия сигналов между последовательными абляциями. Предпочтительно, чтобы перекрытие между сигналами, происходящими из последовательных факелов, составляло по интенсивности <10%, предпочтительнее <5%, а в идеальном случае <1%. Время, необходимое для анализа факела будет зависеть от времени вымывания абляционной кюветы, времени процесса перехода факельного аэрозоля в и сквозь ИСП и времени, затрачиваемого на анализ ионизированного материала.

Кювета с длительным временем вымывания либо будет ограничивать скорость, с которой можно генерировать изображение, либо будет приводить к перекрытию между сигналами, происходящими из последовательных пятен пробы (см., например, ссылку 3, в которой указана длительность сигнала более 10 секунд). Следовательно, время вымывания аэрозоля является ключевым ограничивающим фактором для достижения разрешения без увеличения общего времени сканирования. С помощью данного изобретения можно достичь времени, приходящегося на пространственно различимый пиксель в конечном изображении, менее 100 мс.

Временем процесса перехода факельного аэрозоля в и сквозь ИСП можно легко управлять, просто позиционируя абляционную кювету около ИСП и гарантируя поток газа, достаточный для переноса аэрозоля с надлежащей скоростью непосредственно в ИСП. Перенос с помощью аргона и гелия обеспечивает хорошие результаты.

Время, затрачиваемое на анализ ионизированного материала, будет зависеть от типа масс-анализатора, который используется для обнаружения ионов. Например, измерительные приборы, предусматривающие использование цилиндров Фарадея, обычно слишком медленны для анализа быстрых сигналов. В общем-то, желаемая скорость визуализации (а значит, и частота абляции), разрешение (а значит, и размеры лазерного пятна, и абляционной кюветы) и степень мультиплексирования будут диктовать тип(ы) масс-анализатора, который следует использовать (или, наоборот, выбор масс-анализатора будет определять скорость, разрешение и мультиплексирование, которые можно достичь).

Измерительные приборы для масс-спектрометрии, которые обнаруживают ионы лишь при одном отношении массы к заряду (m/Q, которое в МС обычно указывают как m/z) во времени, например, с помощью точечного детектора ионов, будут давать плохие результаты при визуализации одиночных клеток с помощью множественных меток. Во-первых, время, затрачиваемое на переключение между отношениями масс к зарядам, ограничивает скорость, с которой можно определять множественные сигналы, а во-вторых, если относительное содержание ионов является низким, то возможен пропуск сигналов, когда измерительный прибор настроен на другие отношения масс к зарядам. Таким образом, хотя он и чувствителен, детектор на базе квадрупольного средства не является в должной мере пригодным для визуализации с помощью множественных меток, потому что из-за конструкции ионы с разными отношениями масс к зарядам проходят через упомянуты детектор последовательно, так что сбор данных для множественных меток происходит медленно. Аналогичным образом, другие упоминаемые измерительные приборы, такие как Thermo Fisher ElementXR и Element2, анализируют только одно m/Q за раз и имеют большое время успокоения для скачков магнитного поля при измерении множественных значений m/Q по диапазону, превышающему диапазон скачка электростатического поля.

Таким образом, предпочтительно использовать метод, который предлагает по существу одновременное определение ионов, имеющих разные значения m/Q. Например, вместо использования точечного детектора ионов, можно использовать матричный детектор (см., например, главу 29 ссылки 4). Можно использовать многоколлекторые ИСП-МС-приборы с секторным полем (например, системы Thermo Scientific Neptune Plus, Nu Plasma II и Nu Plasma 1700), а в частности те, которые имеют геометрию Маттауха-Герцога (например, SPECTRO MS, который может одновременно регистрировать все элементы от лития до урана за одно-единственное измерение с помощью полупроводникового детектора зарядов для непосредственного обнаружения). Эти измерительные приборы могут измерять множественные сигналы m/Q по существу одновременно. Их чувствительность можно увеличить, включая электронные умножители в состав детекторов. Вместе с тем, матричные приборы с секторным полем не идеальны, поскольку, хотя они и полезны для обнаружения нарастающих сигналов, они менее полезны, когда уровни сигналов уменьшаются, и поэтому они не являются хорошо подходящими в ситуациях, где метки присутствуют в сильно изменяющихся концентрациях.

Способ МС, наиболее предпочтительный для использования с изобретением, основан на времяпролетном (ВП) механизме обнаружения, который может квазиодновременно регистрировать множественные массы в одной-единственной пробе. Теоретически, ВП-методы не являются идеально подходящими для источников ионов в виде ИСП из-за своих характеристик пространственного заряда, но изобретатели показали, что ВП-измерительные приборы могут анализировать аэрозоль ионов в виде ИСП достаточно быстро и достаточно чувствительно, чтобы дать возможность подходящей визуализации одиночных клеток. Несмотря на то, что ВП-масс-анализаторы обычно непопулярны для атомного анализа из-за компромиссов, требуемых, чтобы справиться с эффектами пространственного заряда в ВП-ускорителе и пролетной трубке, способы визуализации тканей по данному изобретению могут быть эффективными при обнаружении только метящих атомов и поэтому другие атомы (например, те, которые имеют атомную массу ниже 100) можно исключить. Это приводит к менее плотному пучку ионов, богатому массами (например) в области 100-250 дальтонов, которым можно манипулировать и который можно фокусировать эффективнее, тем самым облегчая ВП-обнаружение и получая преимущество высокой спектральной скорости сканирования по ВП-методу. Таким образом, быстрая визуализация может быть достигнута при сочетании ВП-механизма обнаружения с выбором метящих атомов, которые не являются обычными в пробе и в идеальном случае имеют массы, превышающие массы, наблюдаемые в немеченой пробе, например, при использовании переходных элементов более высокой массы. Таким образом, использование суженного окна масс меток означает, что для эффективной визуализации можно использовать ВП-механизм обнаружения.

Подходящие ВП-измерительные приборы поставляют фирмы Tofwerk, GBC Scientific Equipment (например, времяпролетный масс-спектрометр Optimass 9500 с ИСП) и Fluidigm Canada (например, измерительные приборы CyTOF™ и CyTOF™2). Эти измерительные приборы CyTOF™ имеют более высокую чувствительность, чем измерительные приборы фирм Tofwerk и GBC, и известны как используемые в масс-цитометрии, потому что они способны быстро и чувствительно обнаруживать ионы в диапазоне масс редкоземельных металлов (конкретно, в диапазоне m/Q от 100 до 200) [5]. Таким образом, эти измерительные приборы предпочтительны для использования с изобретением, и они могут быть использованы для визуализации с установками измерительных приборов, уже известными в данной области техники. Их масс-анализаторы могут обнаруживать большое число маркеров квазиодновременно на высокой частоте сбора данных масс-спектров в масштабе времени, характерном для высокочастотной лазерной абляции. Они могут измерять относительное содержание метящих атомов с пределом обнаружения примерно 100 на клетку, допуская чувствительное построение изображения пробы ткани. Ввиду этих особенностей, масс-цитометрию теперь можно использовать для удовлетворения потребностей в чувствительности и мультиплексировании для визуализации тканей с субклеточным разрешением. Раньше масс-цитометрию использовали только для анализа клеток в суспензии, а информация о взаимодействиях «клетка - клетка» в пределах микросред тканей или опухолей раньше терялась. При сочетании измерительного прибора для масс-цитометрии с высокоразрешающей системой для лазерной абляции и абляционной камерой для быстрого переноса с низкой дисперсией появилась возможность, допускающая построение изображения пробы ткани с высокой степенью мультиплексирования в реальном масштабе времени. Дополнительные сведения о масс-цитометрии можно найти в ссылке 6.

Выбор длины волны и мощности лазера, используемого для абляции пробы, может быть основан на обычном применении в клеточном анализе методом ИСП-МС. Лазер должен иметь поток энергии, достаточный для того, чтобы вызвать абляцию до желаемой глубины, по существу без подвергания абляции несущего пробу держателя. В типичном случае, подходящим оказывается поток энергии лазера 2-5 Дж/см² на частоте 20 Гц, например 3-4 Дж/см² или примерно 3,5 Дж/см². В идеальном случае, одиночного лазерного импульса будет достаточно для абляции клеточного материала с целью анализа, так что частота лазерных импульсов совпадает с частотой генерирования факелов при абляции. Лазеры обычно будут эксимерными или эксиплексными лазерами. Приемлемые результаты могут быть получены с помощью лазера на фтористом аргоне (λ=193 нм). Используя апертуру 25 мкм, этот лазер можно отображать при 25-кратном уменьшении на пробах тканей, давая размер пятна диаметром 1 мкм. Длительности импульсов 10-15 нс с помощью этих лазеров позволяют достичь отвечающей требованиям абляции. Можно также использовать фемтосекундные лазеры (т.е. с длительностями импульсов <1 пс), и это оказалось бы выгодным благодаря пониженному теплопереносу в пробу, но они очень дороги, а достичь хороших результатов визуализации можно и без них.

Вообще-то, частоту и мощность лазерного импульса выбирают в сочетании с характеристиками отклика МС-детектора, чтобы можно было различить отдельные факелы лазерной абляции. В сочетании с использованием небольшого лазерного пятна и абляционной кюветы, имеющей короткое время вымывания, теперь осуществимо быстрая визуализация с высоким разрешением.

Построение изображения

ЛА-ИСП-МС может обеспечивать сигналы для множественных метящих атомов в факелах. Обнаружение метки в факеле, полученном с помощью кюветы для лазерной абляции по изобретению, выявляет присутствие сходной с этой меткой мишени в положении жертвы. При генерировании серии факелов в известных пространственных местах на поверхности пробы, МС-сигналы выявляют местонахождение меток на пробе, и поэтому такие сигналы можно использовать для построения изображения пробы. За счет мечения множественных мишеней различимыми метками, можно связывать местонахождение метящих атомов с местонахождением сходных мишеней, чтобы строить сложные изображения, достигая уровней мультиплексирования, значительно превышающие те, которые достижимы с помощью существующих методов. Изобретатели показали, что генерируемые изображения могут воспроизводить рисунки окрашивания и долю клеток, отображающих заданный маркер, как определено посредством мгновенного измерения частоты, тем самым подтверждая пригодность изобретения для визуализации.

В идеальном случае, изображение будет построено при осуществлении растрового сканирования пробы ткани лазером. Разнесение последовательных абляций в растровой сканограмме (размер шага) и между соседними линиями в растровой сканограмме является в идеальном случае таким же, как размер лазерного пятна, который используется (например, разнесение 1 мкм для размера лазерного пятна 1 мкм), чтобы достичь полного покрытия представляющей интерес области. Вместе с тем, в некоторых вариантах осуществления способы могут использовать размер шага, который меньше, чем размер лазерного пятна (например, по меньшей мере в 2 раза, 4 раза или 5 раз меньше), поскольку это может привести к меньшим площадям абляции и таким образом улучшить разрешение визуализации. Для достижения сканирования можно перемещать лазер, но обычно удобнее перемещать абляционную кювету (или содержимое кюветы). Скорость перемещения будет зависеть от частоты абляции и растрового разнесения; например, при растровом разнесении 1 мкм и частоте абляции 20 Гц абляционная кювета будет иметь скорость поступательного перемещения 20 мкм/с. Доступны предметные столики, которые могут достигать размеров шага 1 мкм или менее, например, с размерами шага 500 нм или 200 нм (или даже меньше).

В общем случае генерируются двумерные (2D) изображения пробы, основанные на содержимом подвергаемого абляции поверхностного слоя. Путем сборки пакетов 2D-изображений (в плоскости x, y) из сечений одиночной пробы, которые являются смежными в направлении оси z, можно подготавливать 3D-изображения ткани. Вместе с тем, в качестве альтернативы сборке 2D-изображений таким образом, можно проводить непосредственную 3D-визуализацию. Этого можно достичь различными способами. Например, если абляция вызывает испарение по существу с постоянной глубиной, то повторяющаяся абляция в единственной точке x, y выявляет информацию на постепенно увеличивающейся глубине в направлении оси z. Если абляция не имеет по существу постоянной глубины, то можно измерять объем абляционного материала (например, по отношению к норме известного объема), и этот объем можно легко преобразовать в глубину в направлении оси z. Когда выполняется 3D-визуализация, можно выполнять множественные абляции по оси z, сохраняя неизменным место x, y («сверление») или подвергать пробу послойной абляции (т.е., выполнять абляции площадки x, y до перехода к более глубокому слою в направлении оси z). Послойная абляция предпочтительна. Точность 3D-визуализации ограничивается такими факторами, как повторное осаждение абляционного материала, способность поддерживать постоянную глубину абляции и способность меток проникать в пробу, но в пределах границ этих ограничений все же могут быть достигнуты полезные результаты.

Сборка сигналов в изображение будет использовать компьютер и может быть достигнута с помощью известных методов и пакетов программного обеспечения. Например, можно использовать пакет GRAPHIS от фирмы Kylebank Software, но также можно использовать другие пакеты, такие как TERAPLOT. В данной области техники известна визуализация с помощью данных масс-спектрометрии (МС-данных) из методов, таких как матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация - магнитография (МАЛДИ-М (MALDI-МСI)), например, ссылка 7 раскрывает интерфейс «MSiReader» для просмотра и анализа файлов визуализации с помощью МС на платформе Matlab, а ссылка 8 раскрывает два программных инструмента для быстрого просмотра данных и визуализации наборов МС-данных как 2D-данных, так и 3D-данных, с полным пространственным и спектральным разрешением, например, программа «Datacube Explorer».

Изображения, полученные с помощью данного изобретения, можно дополнительно анализировать, например, таким же образом, как анализируют результаты иммуногистохимии (ИГХ). Например, изображения могут быть использованы для определения границ субпопуляций клеток в пределах пробы и могут обеспечить информацию, полезную для клинической диагностики. Аналогичным образом, можно использовать анализ посредством портативной контрольно-проверочной и диагностической аппаратуры (ПКПДА (SPADE)) для выделения клеточной иерархии из данных цитометрии большой размерности, которые обеспечивает изобретение [9].

Мечение пробы ткани

Можно получать изображения проб, которые помечены единственным метящим атомом или множеством разных метящих атомов, причем метящие атомы обнаруживаются в полученных лазерной абляцией факелах методом ИСП-МС. Ссылка на множеcтво разных атомов означает, что для мечения пробы используют более одного вида атомов. Эти виды атомов можно различать с помощью ИСП-МС (например, они могут иметь разные отношения m/Q), так что присутствие двух разных метящих атомов в пределах факела приводит к двум разным МС-сигналам.

Изобретение можно использовать для одновременного обнаружения намного больше, чем два разных метящих атомов, давая возможность обнаружения многочисленных меток, например, по меньшей мере 3, 4, 5, 10, 20, 30, 32, 40, 50 или даже 100 разных метящих атомов. Также возможно комбинаторное использование метящих атомов для еще большего увеличения числа различимых меток. Примеры демонстрируют использование 32-х разных метящих атомов в способе визуализации, но метод ЛА-ИСП-МС по природе своей подходит для параллельного обнаружения большего числа разных атомов, например, даже более 100 разных видов атомов [5]. За счет мечения разных мишеней разными метящими атомами можно определять клеточное местонахождение множественных мишеней в одном-единственном изображении (см., например, ссылку 10).

Метящие атомы, которые можно использовать в изобретении, включают в себя любые виды, которые обнаружимы методом ЛА-ИСП-МС и которые из немеченой пробы ткани по существу отсутствуют. Таким образом, например, атомы ¹²C были бы неподходящими в качестве метящих атомов, потому что они естественно имеются в изобилии, тогда как ¹¹C теоретически можно было бы использовать, потому что это искусственный изотоп, который в природе не встречается. Вместе с тем, в предпочтительных вариантах осуществления метящие атомы являются атомами переходных металлов, таких как редкоземельные металлы (15 лантаноидов плюс скандий и иттрий). Эти 17 элементов обеспечивают много разных изотопов, которые можно легко различить методом ИСП-МС. Широкое многообразие этих элементов доступно в форме обогащенных изотопов, например, самарий имеет 6 стабильных изотопов, а неодим имеет 7 стабильных изотопов, причем все они доступны в обогащенной форме. 15 лантаноидов обеспечивают по меньшей мере 37 изотопов, которые имеют не избыточные, отличающиеся от других массы. Примеры элементов, которые подходят для использования в качестве метящих атомов, включают в себя лантан (La), церий (Ce), празеодим (Pr), неодим (Nd), прометий (Pm), самарий (Sm), европий (Eu), гадолиний (Gd), тербий (Tb), диспрозий (Dy), гольмий (Ho), эрбий (Er), тулий (Tm), иттербий (Yb), лютеций (Lu), скандий (Sc) и иттрий (Y). Помимо редкоземельных металлов, для обнаружения методом ИСП-МС подходят атомы других металлов, например, золота (Au), палладия (Pt), иридия (Ir), родия (Rh), висмута (Bi) и т.д. Использование радиоактивных изотопов не является предпочтительным, поскольку они менее удобны в обращении и нестабильны; например, Pm не обладает предпочтительным метящим атомом среди лантаноидов.

Чтобы облегчить ВП-анализ (см. выше), полезно использовать метящие атомы с атомной массой в пределах диапазона 80-250, например, в пределах диапазона 80-210 или в пределах диапазона 100-200. Этот диапазон включает в себя все лантаноиды, за исключением Sc и Y. Диапазон 100-200 допускает теоретический 101-плексный анализ при использовании разных метящих атомов, давая возможность изобретению получать преимущество высокой спектральной частоты сканирования по методу ВП-МС. Как упомянуто выше, за счет выбора метящих атомов, массы которых лежат в пределах окна, выше которого они встречаются в немеченой пробе (например, в пределах диапазона 100-200), можно использовать ВП-обнаружение для обеспечения быстрой визуализации на биологически значимых уровнях.

Мечение пробы ткани в общем случае требует, чтобы метящие атомы были присоединены к одному элементу специфической связывающей пары (ССП). Эта меченая ССП контактирует с пробой ткани таким образом, что проба может взаимодействовать с другим элементом ССП (элементом ССП, являющимся мишенью), если он присутствует, тем самым соотнося метящий атом с конкретным местоположением в пробе. ССП, которая предоставляет метку молекуле-мишени, также именуется здесь специфически меченой структурой. Присутствие меченого атома в этом конкретном местоположении может быть обнаружено, и эту информацию можно перевести в изображение, на котором присутствует элемент ССП, являющийся мишенью, в том местоположении. Метящие атомы из редкоземельных металлов и других элементов можно конъюгировать с элементами ССП известными методами, например, ссылка 11 описывает присоединение атомов лантаноидов к олигонуклеотидным зондам для обнаружения методом ИСП-МС, ссылка 12 описывает использование рутения для мечения олигонуклеотидов, а фирма Fluidigm Canada продает наборы MaxPar™ для мечения металлами, которые можно использовать для конъюгации свыше 30 разных метящих атомов с белками (включая антитела).

К одиночному элементу ССП можно присоединять различное число метящих атомов, а большей чувствительности можно достичь, когда больше метящих атомов присоединяют к какому-либо элементу ССП. Например, к элементу ССП можно присоединять более 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 метящих атомов. Например, можно использовать монодисперсные полимеры, содержащие множественные мономерные звенья, каждое из которых содержит хелатор, такой как диэтилтриаминпентауксусная кислота (ДТПК). ДТПК связывает, например, 3⁺-ионы лантаноидов с константой диссоциации примерно 10^-6 M. Эти полимеры могут оканчиваться тиолореактивной группой (например, малеимидом), которую можно использовать для присоединения к элементу ССП. Например, можно связывать тиолореактивную группу с Fc-областью антитела. Для конъюгации этих полимеров можно также использовать другие функциональные группы, например, аминореактивные группы, такие как сложные N-гидроксисукцинимидные эфиры или группы, противодействующие карбоксилам или гликолизации антитела. С каждым элементом ССП может быть связано любое число полимеров. Конкретные примеры примеров, которые можно использовать, включают полимеры с прямой цепью («X8») или дендритные полимеры третьего поколения («DN3»), причем оба доступны как «реагенты MaxPar™». Для увеличения числа атомов в метке можно также предусмотреть использование металлических наночастиц.

Как упомянуто выше, метящие атомы присоединяют к элементу ССП, а этот меченый элемент ССП контактирует с пробой ткани, где он может находить элемент ССП, являющийся мишенью (если тот присутствует), тем самым образуя меченую ССП. Меченый элемент ССП может содержать любую химическую структуру, которая пригодна для присоединения к метящему атому и для последующей визуализации с помощью данного изобретения.

Вообще говоря, изобретение можно использовать с любой ССП, использование которой при определении местонахождения молекул-мишеней в пробах тканей уже известно (например, как использовано в ИГХ или флуоресцентной гибридизации на месте (FISH)), но элемент ССП, который контактирует с пробой, будет нести метящий атом, обнаруживаемый методом ИСП-МС. Таким образом, изобретение может быть легко воплощено с помощью доступных реактивов для ИГХ и FISH, просто путем модификации меток, использовавшихся ранее, например, для модификации FISH-зонда, чтобы он нес метку, которая может быть подвергнута лазерной абляции и обнаружена методом ИСП-МС.

ССП может содержать любое из следующего: дуплекс нуклеиновых кислот; комплекс антитело-антиген; пару рецептор-лиганд; или пару аптамер-мишень. Таким образом, метящий атом может быть прикреплен к нуклеинокислотному зонду, который затем контактирует с пробой ткани, вследствие чего оказывается возможной гибридизация зонда с присутствующей в нем комплементарной нуклеиновой кислотой(ами), например, с образованием дуплекса ДНК-ДНК, дуплекса ДНК-РНК или дуплекса РНК-РНК. Аналогичным образом, метящий атом может быть прикреплен к антителу, которое затем контактирует с пробой ткани таким образом, что оно может быть связано со своим антигеном. Метящий атом может быть прикреплен к лиганду, который затем контактирует с пробой ткани таким образом, что он может быть связан со своим рецептором. Метящий атом может быть прикреплен к аптамерному лиганду, который затем контактирует с пробой ткани таким образом, что он может быть связан со своей мишенью. Меченые таким образом элементы ССП можно использовать для обнаружения множества мишеней в пробе, включая последовательности ДНК, последовательности РНК, белки, сахара, липиды или метаболиты.

В типичном использовании изобретения меченым элементом ССП является антитело. Мечение антитела может быть достигнуто посредством конъюгации одного или более метящих атомов, связывающих молекулы с антителом, например, с помощью набора MaxPar™ для конъюгации, как описано выше. Антитела, распознающие клеточные белки, которые полезны для визуализации, уже широко доступны для использования в ИГХ, и за счет использования метящих атомов вместо современных методов мечения (например, флуоресценции) эти известные антитела можно легко адаптировать для использования в данном изобретении, но с выгодой увеличения мультиплексирующей способности. Антитела, используемые с данным изобретением, могут распознавать мишени на поверхности клетки или мишени в пределах клетки. Антитела могут распознавать множество мишеней, например, они могут распознавать, в частности, отдельные белки, или могут распознавать множественные соответствующие белки, которые совместно используют общие эпитопы, или могут распознавать специфические посттрансляционные модификации на белках (например, для различения между тирозином и фосфотирозином на представляющем интерес белке, для различения между лизином и ацетиллизином, для обнаружения убиквитинирования, и т.д.). После связывания со своей мишенью, можно обнаруживать метящий атом(ы), конъюгированный с антителом, для выявления местоположения этой мишени в пробе.

Меченый ССП элемент обычно будет взаимодействовать непосредственно с элементом ССП, являющимся мишенью, в пробе. Вместе с тем, в некоторых вариантах осуществления меченый ССП элемент имеет возможность взаимодействовать с элементом ССП, являющимся мишенью, косвенно, например, первичное антитело можно связать с элементом ССП, являющимся мишенью, а потом меченое вторичное антитело можно связать с первичным антителом так, как это делается в сэндвич-анализе. Вместе с тем, обычно все основано на непосредственных взаимодействиях, поскольку это может быть достигнуто проще и дает возможность повышенного мультиплексирования. Вместе с тем, в обоих случаях проба контактирует с элементом ССП, который можно связать с элементом ССП, являющимся мишенью, в пробе, а на более поздней стадии обнаруживают метку, прикрепленную к элементу ССП, являющемуся мишенью.

Одной особенностью изобретения является его способность обнаруживать множественные (например, 10 или более и даже до 100 или более) разные элементы ССП, являющиеся мишенями, в пробе, например, обнаруживать множественные разные белки и/или множественные разные последовательности нуклеиновых кислот. Чтобы сделать возможным дифференциальное обнаружение этих элементов ССП, являющихся мишенями, соответствующие им элементы ССП должны нести разные метящие атомы так, чтобы их сигналы можно было различать методом ИСП-МС. Например, если обнаруживают десять разных белков, можно использовать десять разных антител (каждое специально для отличающегося белка-мишени), каждое из которых несет особую метку, так что сигналы от разных антител можно различать.

В некоторых вариантах осуществления желательно использовать множественные разные антитела против единственной мишени, например, те, которые распознают разные эпитопы на одном и том же белке. Таким образом, способ может использовать больше антител, чем мишеней, благодаря избыточности этого варианта. Вместе с тем, однако, изобретение будет использовать множеcтво разных метящих атомов для обнаружения множеcтва разных мишеней.

Если используют больше одного меченого антитела, то антитела предпочтительно должны иметь подобные сродства с соответствующими им антигенам, поскольку это позволяет гарантировать, что зависимость между количеством метящих атомом, обнаруживаемых методом ЛА-ИСП-МС, и относительным количеством антигена-мишени в пробе ткани будет более сопоставимой по разным ССП (в частности при высоких скоростях сканирования).

Если элемент ССП, являющийся мишенью, расположен внутриклеточно, ему в типичном случае придется пермеабилизировать мембраны клеток до или во время контакта пробы с метками. Например, когда мишенью является последовательность ДНК, а меченый элемент ССП не может проникнуть сквозь мембраны живых клеток, клетки пробы ткани могут быть зафиксированы и пермеабилизированы. Тогда меченый элемент ССП сможет попасть в клетку и образовать ССП с элементом ССП, являющимся мишенью. В связи с этим, можно воспользоваться известными протоколами ИГХ и FISH.

Обычно способом по данному изобретению можно будет обнаружить по меньшей мере одну внутриклеточную мишень и по меньшей мере одну мишень на поверхности клетки. Вместе с тем, в некоторых вариантах осуществления изобретение можно будет использовать для обнаружения множеcтва мишеней на поверхностях клеток, игнорируя внутриклеточные мишени. В общем-то, выбор мишеней будет определяться информацией, которая желательна от способа, поскольку изобретение будет обеспечивать изображение местоположений выбранных мишеней в пробе.

Биологические пробы

Изобретение обеспечивает способ визуализации биологической пробы. В некоторых случаях эта проба является пробой ткани. Пробы ткани содержат множество взаимодействующих клеток, и согласно способу множеcтво этих клеток подвергают лазерной абляции, чтобы обеспечить изображение этих клеток в пробе ткани. В общем случае изобретение можно использовать для анализа проб тканей, которые сейчас исследуют методами ИГХ, но с помощью меток, которые подходят для обнаружения методом ЛА-ИСП-МС.

С помощью описываемых здесь кюветы для лазерной абляции, источника ионов и устройства ЛА-ИСП-МС-системы можно анализировать любую подходящую пробу ткани. Например, ткань может быть эпителиальной тканью, мышечной тканью, нервной тканью и т.д., и их комбинации. В целях диагностики и прогнозирования, ткань может быть из опухоли. В некоторых вариантах осуществления проба может быть из известной ткани, но может быть и неизвестно, содержит ли проба клетки опухоли. Визуализация может выявлять присутствие мишеней, которые указывают на присутствие опухоли, тем самым облегчая диагностику. Проба ткани может содержать раковую ткань молочной железы, например, раковую ткань молочной железы человека или клетки эпителия молочной железы (КЭМЖ). Проба ткани может содержать ткань, зафиксированную в формалине и залитую в парафин (ФФЗП). Ткани можно получать из любого живого многоклеточного организма, но обычно они будут человеческими.

Проба ткани обычно будет срезом, имеющим, например, толщину в диапазоне 2-10 мкм, такую как 4-6 мкм. Методы подготовки таких срезов хорошо известны из области ИГХ, например, с использованием микротомов, включая этапы дегидратации, включая внедрение и т.д. Таким образом, ткань можно химически фиксировать, а потом можно приготавливать срезы в желаемой плоскости. Для приготовления проб тканей можно также использовать изготовление срезов из замороженных тканей или лазерную захватывающую микродиссекцию. Пробы можно пермеабилизировать, например, чтобы дать реагентам возможность метить внутриклеточные мишени (см. выше).

Размер пробы ткани, подвергаемой анализу, будет аналогичен достигаемому современными способами ИГХ, хотя максимальный размер будет диктоваться устройством для лазерной абляции, а в частности размером пробы, которую можно уместить в его абляционную кювету. Типичным является размер вплоть до 5 мм × 5 мм, но используют и меньшие пробы (например, 1 мм × 1 мм) (эти размеры относятся к размеру среза в плане, а не к его толщине).

Помимо того, что оно полезно для визуализации проб тканей, изобретение, вместо этого, можно использовать для визуализации клеточных проб, таких как монослои прилипающих клеток или клеток, которые иммобилизированы на твердой поверхности (как в традиционной иммутоцитохимии). Эти варианты осуществления особенно полезны для анализа прилипающих клеток, которые не могут быть легко солюбилизированы для масс-цитометрии суспензий клеток. Таким образом, так же, как при использовании для усовершенствования современного иммуногистохимического анализа, данное изобретение можно использовать для усовершенствования иммуноцитохимии. Данное изобретение также можно использовать для визуализации биопленок. Анализ биопленок важен в медицинских учреждениях, потому что биопленки инфекционных реагентов могут образовываться на секретирующих слизь мембранах в организме или, например, на вживленных катетерах.

После приготовления пробу поместят в кювету для лазерной абляции, а затем подвергнут анализу в соответствии с данным изобретением.

Пример

A. Экспериментальная часть

Изготовление кюветы для лазерной абляции

Верхнюю часть 10 кюветы изготавливали из прямоугольного параллелепипеда из акрилового стекла (поли(метилметакрилата), ПММА). Сквозь прямоугольный параллелепипед сверлили продольный проход внутренним диаметром 3 мм вдоль длинной оси, формируя проточный канал 11. На участке 17 верхней стенки верхней части 10 кюветы формировали поперечный проход слегка эллиптической формы длиной L=4,5 мм и шириной 1,5 мм и закрывали его окном 16 из диоксида кремния, прозрачным для УФ-лучей. На участке 15 нижней стенки верхней части 10 кюветы формировали боковое отверстие 14 с аналогичными размерами как у прохода на верхней стороне. Затем участок 15 нижней стенки подвергали механической обработке для уменьшения минимальной толщины w этого участка нижней стенки в области проточного канала 11 до приблизительно 50 микрометров. Общая длина проточного канала 11 составляла примерно 50 мм.

Нижнюю часть 20 кюветы изготавливали из другого прямоугольного параллелепипеда из ПММА. В этом прямоугольном параллелепипеде фрезеровали цилиндрическую камеру 21 для пробы, имевшую диаметр приблизительно 23 мм. В нижней части кюветы сверлили радиально простирающийся проход с образованием входа 22 защитного газа. Вход 22 защитного газа простирался под углом 10° относительно проточного канала 11. В камеру 21 для пробы помещали пробу 23. Нижнюю часть 20 кюветы устанавливали на верхнюю часть 10 кюветы с помощью четырех винтов (не показаны на чертежах). Ни прокладка, ни уплотнение не требовались, но, необязательно, может быть обеспечена прокладка или уплотнение для обеспечения лучшего уплотнения области контакта между верхней частью 10 кюветы и нижней частью 20 кюветы. Верхняя поверхность 24 пробы 23 была обращена к боковому отверстию 14. Расстояние d между верхней поверхностью 24 пробы 23 и участком 15 нижней стенки составляло примерно 350 микрометров. Таким образом, суммарное расстояние между поверхностью 24 пробы и центральной осью проточного канала 11 составляло приблизительно 1,9 миллиметра (радиус проточного канала = 1,50 мм, толщина w стенки = 0,05 мм, расстояние d=0,35 мм).

Экспериментальная установка для эксплуатации, оптимизации и описания характеристик трубчатой кюветы

Систему эксимерного ArF лазера (Lambda Physik, Göttingen, Germany) с гомогенизированным профилем лазерного луча подключали к измерительному прибору Agilent 7500cs, представляющему собой квадрупольный масс-спектрометр с ИСП (ИСП-К-МС, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Плотность энергии лазера составляла 17,3 Дж/см². Чтобы повысить доверительный уровень, все точки данных брали из матрицы размером 3×3 результатов однократного сканирования (если не указано иное) с размером лазерного пятна 10 мкм и промежутком 15 мкм между соседними выстрелами. Трубка для переноса к ИСП-горелке состояла из политетрафторэтиленовой (ПТФЭ) трубки внутренним диаметром 3 мм, подсоединенной к выходу 13 смешанного газа. Аналогичную трубку использовали в качестве трубки для подачи на вход 12 Ar. Расход газа-носителя, Ar, регулировали на 1,1 л/мин. Трубка для переноса, длина которой 50 см, подсоединяли непосредственно к ИСП-горелке без изменения диаметра. Поток защитного газа, He, обеспечиваемый через камеру пробы, регулировали на 0,6 л/мин. Измерения рабочих параметров трубчатой кюветы осуществляли, используя время выдержки 10 мс. Чтобы описать вымывание кюветы, выполняли сбор и обработку единственного изотопа ²⁷Al в процессе лазерных абляций с частотой 1 Гц, 10 Гц и 30 Гц на эталонном стекле NIST 610. ИСП работала при 1470 Вт, а квадрупольный масс-спектрометр настраивали на 1 точку на пик в режиме скачков по пикам.

Осуществляли оптимизацию различных рабочих параметров, включая: расстояние зазора между отверстием трубки-носителя и поверхности пробы; расход газа-носителя Ar; и расход защитного газа He. Когда оптимизировали один параметр, другие два устанавливали соответствующими «заранее оптимизированным» условиям, основанным на предварительной оптимизации, например, расстояние зазора на 350 мкм, расход Ar на 1,1 л/мин, расход He на 0,6 л/мин. Данные оценивали на основе нормализованной ширины пика, которая представляет собой ширину пика, деленную на общее число отсчетов, собранных в пределах каждого пика (площади пика). Для каждого пика для определения ширины пика использовали полную ширину на 1% от максимума (ПШ0,01М). В случае, если положение, соответствующее 1% от максимума, не совпадало ни с какой точкой данных, применяли линейную интерполяцию по ближайшим двум точкам. Для площади пика проводили интегрирование по всем точкам данных, и интерполяция не требовалась, поскольку хвосты пиков вносили менее 1% общих счетов.

Описание характеристик кюветы для регулярного анализа осуществляли с помощью таких же параметров, как описанные выше. Вместе с тем, на разных прогонах регистрировали множественные изотопы от низкого к среднему и до высокого m/Q. Чувствительности по площадям пиков корректировали относительно пиков.

Приготовление проб для визуализации «твердого» вещества

Пробу для демонстрации возможностей визуализации получали прямым лазерно-индуцированным способом переноса. Для приготовления подложки-донора, высококачественное стекло из плавленого диоксида кремния покрывали слоем триазенового полимера (ТП), поглощающего УФ-свет, в качестве жертвенного, динамически высвобождаемого слоя (ДВС), на котором осаждали пленочные материалы разной толщины. В процедуре переноса, луч эксимерного XeCl лазера с длиной волны 308 нм отображали на полой маске с рисунком «ETH» (или «PSI»)) и 4-х кратно уменьшали до оказания ударного воздействия на обратную сторону подложки-донора. Подвергали абляции динамически высвобождаемый слой триазенового полимера (ТП-ДВС), а генерируемая ударная волна продвигала тонкую пленку к стеклянной подложке-приемнику, покрытому поли(3,4-этилендиокситиофеном), смешанным с поли(стиролсульфонатом) (ПЭДОТ:ПСС). Пробу приготавливали с помощью тонкого, толщиной 60 нм, слоя Au с «ETH» снизу и 80 нм слоя Ag с «PSI» сверху (Au/Ag). Для управления осаждением двух логотипов посредством сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), на подложку-приемник после осаждения рисунка равномерно наносили тонкую, 5 нм, пленку Pt.

Приготовление проб ткани

Раковую ткань молочной железы, обогащенную рецептором 2 к фактору роста эпидермиса человека (HER2), зафиксированную в формалине и внедренную в парафин, нарезали на части толщиной 6 мкм. Пробу обрабатывали на платформе Discovery XT (Ventana Medical Systems) в условиях восстановления эпитопа CC1m. После этого пробу блокировали в течение 30 минут фосфатно-буферным солевым раствором (ФБСР)/1%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА)/0,1%-ным Triton X, и инкубировали с 200 мкл ¹⁶⁵Ho, тегированного анти-HER2 в концентрации 5 мкг/мл в течение 50 минут. Пробу промывали три раза в ФРФБ/0,1%-ном Triton X и сушили при комнатной температуре. Для конъюгации антитела с ¹⁶⁵Ho применяли коммерческий набор MAXPAR для мечения антител (DVS Sciences).

Измерительный прибор и рабочие условия для визуализации «твердого» вещества

Для экспериментов использовали конфигурацию, аналогичную описанной для описания характеристик трубчатой кюветы. Площадь 852×408 мкм² покрывали проходами сканера с частотой повторения 10 Гц. Расстояние между последовательными выстрелами лазера и горизонтальное расстояние между проходами сканера составляли по 4 мкм на основе лазерной лунки 4 мкм. Фактический размер лазерного луча составлял 1~2 мкм. Вместе с тем, наблюдали увеличенную площадь воздействия, что можно объяснить увеличенным объемом проникновения тепла (высокой термодиффузией в тонких металлических пленках и временем взаимодействия «свет - материал» в наносекундном диапазоне). Три изотопа, ¹⁰⁷Ag, ¹⁹⁵Pt и ¹⁹⁷Au измеряли в режиме скачков по пикам со временем выдержки 600 мкс для каждого изотопа. Вместе с тем, из-за времени успокоения квадруполя измерительного прибора в несколько миллисекунд для каждого изотопа, считывание данных всего набора изотопов нельзя завершить менее чем за 10 мс. Очевидно, что такая большая головная фракция (малый рабочий цикл) ограничивает качество сигнала, получаемого во время быстрых визуализирующих экспериментов с высоким разрешением (интегрирование методом трапеций). Анализ данных основывали на интеграции каждого сигнала одиночного выстрела.

Измерительный прибор и рабочие условия для визуализации ткани

Визуализацию ткани проводили в ИСП-МС-системе Element2 (Thermo Fisher Scientific), связанной с эксимерным ArF лазером с пространственным разрешением ~1 мкм. Рабочие условия оптимизировали для максимальной чувствительности сигналов быстрого переходного процесса. Поэтому регистрировали только ¹⁶⁵Ho. Для анализа изображений проводили построчное сканирование пробы на частоте лазера 20 Гц и с размером пикселей изображения 1×1 мкм². Время выдержки при МС задавали равным 50 мс в соответствии с применяемой скоростью лазерной абляции.

B. Результаты и обсуждение

Оптимизация трубчатой кюветы

Зависимость дисперсии от зазора между нижней частью трубчатой кюветы и поверхностью пробы изображена на фиг. 6(a). Отраженные на графике значения ширины пиков были нормализованными к общему числу отсчетов, собранному в пределах ПШ0,01М. Наблюдали минимальную ширину пика на ширине зазора ~350 мкм. Используя это оптимизированное расстояние зазора, осуществляли оптимизации расходов газов, Ar и He. Соответствующие результаты показаны на фиг. 6(b) и (c) на основе нормализованных ширин пиков. Все три оптимизации дают очевидный минимум ~10^-3 мс/число отсчетов для нормализованной ширины пика. Все измерения, о которых сообщается в следующих разделах, проводили, пользуясь оптимизированными значениями зазора пробы и расходов газов. Такие значения оптимизации могут меняться в зависимости от разных установок.

Экспериментальная оценка трубчатой кюветы

Характеристики трубчатой кюветы определяли, используя частоту лазера ~1 Гц. Сводка типичных сигналов переходных процессов (показанных в логарифмическом масштабе) приведена на фиг. 7(a). Одиночный сигнал вымывания основного элемента длился примерно 30 мс для ПШ0,01М. Пик переходного процесса по-прежнему имеет слегка асимметричную форму, оказываясь немного размытым, что обуславливается задержанным вымыванием аэрозоля. После максимума пика сигналы падают более чем на 2 порядка величины в пределах 20 мс, что представляет более 99,98% общего интегрируемого сигнала. Остаточная доля общего сигнала (0,02% площади интегрируемого сигнала) обнаружена в хвосте пика, который достиг фонового уровня по истечении 40-50 мс. Крутизна затухания второго сигнала отличается от присущей быстрому вымыванию, указывая на иной процесс, который предположительно связан с поглощением повторно осажденного материала с поверхности. Это, с наибольшей вероятностью, происходит из-за потока защитного газа, He, в отверстие нижней части трубчатой кюветы, который параллелен инжекции факела лазером, который продувает площадь вокруг лунки наиболее эффективно. Разнесение одиночных выстрелов на интервал 1 с указывает, что никаких дополнительных удалений пробы не происходит.

Фиг. 7(b) показывает сигнал переходного процесса, получаемый на частоте лазера 10 Гц. Ширина и форма пиков были аналогичными тем сигналам, которые измерены при 1 Гц. Дополнительное увеличение частоты лазера с помощью линейного сканирования частотой 30 Гц показано на фиг. 7(c). Ширина и форма пиков были аналогичными сигналам, измеренным при 1 Гц и 10 Гц. Структура сигналов указывает на то, что два соседних пика нельзя разделить относительно фона друг от друга. Вместе с тем, перекрытие между двумя последовательными пиками по интенсивности меньше 1%. Поэтому можно сделать вывод, что даже частота 30 Гц позволяла бы выявить различия в концентрации на изображениях на уровне двух порядков величины, что делает эту абляционную кювету весьма привлекательной для визуализации с помощью лазерной абляции. Общая оценка демонстрирует, что вымывание в диапазоне времени 30-50 мс значительно улучшается.

Определение характеристик трубчатой кюветы для широкого диапазона изотопов

Дополнительное определение характеристик трубчатой кюветы документально отражено на фиг. 8. Ширины и чувствительности пиков, вычисленные из площадей пиков, показаны для разных изотопов от низкого m/Q (⁷Li) до высокого (²³⁸U). Как видно из фиг. 8(a), средние арифметические ширины пиков по всем измерениям изотопов попадают в узкий диапазон 30-35 мс. Приводимые длительности сигналов были рассчитаны на основе ПШ0,01М. Стандартные отклонения по диапазону m/Q наиболее вероятно являются результатом полученной абляцией массы, эффектами наложения спектров и флуктуациями из-за различий в динамике потоков газов. Фиг. 8(b) показывает, кроме того, нормализованные чувствительности для площади пика, которые были определены с помощью лунок размером 10 мкм в режиме абляции однократным выстрелом. По сравнению с обычными установками с кюветами для абляции, используемыми в режиме однократного выстрела, чувствительности, определенные по площадям пиков, увеличились с коэффициентом 10. Это не связано с повышенной эффективностью переноса пробы или усовершенствованной ионизацией, а основано исключительно на плотности пробы, сохраненной от места абляции до ИСП.

Быстрая визуализация посредством квадрупольного масс-спектрометра (К-МС) последовательного действия

Исследовали «твердую» пробу различными методами визуализации. Результаты иллюстрируются на фиг. 9. Характерные подробности рисунка изображали сначала посредством оптической микроскопии (фиг. 9(a)) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ, фиг. 9(b)). Эти изображения использовали для оценки качества высокой чувствительности, высокого пространственного разрешения ЛА-ИСП-МС для ¹⁹⁷Au (фиг. 9(c)) и ¹⁰⁷Ag (фиг. 9(d)). Изображения, полученные посредством оптической микроскопии и СЭМ, указывают на то, что рисунки на тонких пленках были несовершенными по однородности, форме и геометрии. Вместе с тем, пробу сочли хорошо подходящей для анализа посредством масс-спектрометра с лазерной абляцией и индуктивно связанной плазмой (ЛА-ИСП-МС). ЛА-ИСП-МС давал весьма сопоставимые изображения с резкими границами рисунка. Быстрое изменение сигнала от тонкой пленки к фону (или наоборот) учитывали как показатель для высокого пространственного разрешения примерно 1 мкм. Левое плечо буквы «Т» царапали во время транспортировки пробы из одной лаборатории в другую, и даже это было отображено с помощью ЛА-ИСП-МС на фиг. 9(c) и согласуется с изображением в оптическом микроскопе на фиг. 9(a), взятом в качестве контрольной картинки.

Быстрая визуализация посредством квадрупольного масс-спектрометра Маттауха-Герцога одновременного действия

Серьезным ограничением стандартных квадрупольных масс-спектрометров является их последовательный режим анализа m/Q. Короткая длительность импульсов сигналов, возникающая вследствие трубчатой кюветы с низкой дисперсией, ограничивает регистрацию множественных изотопов, за исключением случаев, если к ЛА-ИСП-масс-спектрометру подключены масс-спектрометры квазиодновременного или одновременного действия. Примеры таких усовершенствованных МС включают в себя МС Маттауха-Герцога (МГ-МС) и времяпролетный МС (ВП-МС). Чтобы проиллюстрировать возможности визуализации множественных элементов, присущие такому измерительному прибору типа МГ-МС, подключали такую же ЛА-ИСП-систему, как описанная для квадрупольного ИСП-МС. Изображения, полученные с помощью этой системы, были подобного качества и разрешения, как в случае квадрупольного МС. Здесь следует упомянуть, что подключение ЛА-ИСП-ВП-МС с тем же успехом подошло бы для таких применений быстрой химической визуализации.

Визуализация ткани

Среди многих возможных применений раскрытой здесь ЛА-ИСП-МС-системы для элементной визуализации, было решено продемонстрировать ее потенциал путем исследования распределений биомаркеров в тонком срезе биологической ткани. Такие анализы требуют, во-первых, небольшого, выражаемого в мкм, разрешения для различения морфологии и для локализации биомаркеров в пределах наименьшей биологической единицы, клетки. Эта информацию является решающей в изучении биологических процессов и в целях исчерпывающей диагностики. Во-вторых, такие анализы требуют короткого времени измерения, приходящегося на пиксель, которое достижимо с помощью раскрытой здесь абляционной кюветы; для статистических целей в биологических и биохимических анализах, как правило, нужно анализировать большое число проб и большие площади ткани (500×500 мкм²). Поэтому анализировали срез раковой ткани молочной железы, чтобы исследовать статусы рецептора 2 к фактору роста эпидермиса человека (HER2) отдельных клеток, изображенных на фиг. 6. Изображение показало белок HER2, сильно выраженный на мембране клеток. HER2 является основным определителем времени безрецидивной выживаемости, времени до метастаза и времени общей выживаемости после первоначального диагноза рака молочной железы. В анализе было достигнуто пространственное разрешение ~1 мкм. Такое высокое пространственное разрешение и химическая чувствительность обеспечили высокоточное определение HER2 в раковой ткани молочной железы. Это субклеточное разрешение важного биомаркера для анализа на предмет рака молочной железы может оказаться подходящим для того, чтобы патологи руководствовались им в своих рекомендациях по различным вариантам лечения.

Следует понять, что изобретение описано выше лишь посредством примера, и могут быть выполнены модификации, остающиеся в рамках объема и сущности данного изобретения.

Литература

[1] Pisonero et al. (2006) J. Anal. At. Spectrom. 21:922-931.

[2] Asogan et al. (2009), J. Anal. At. Spectrom. 24:917-923.

[3] Kindness et al. (2003) Clin Chem 49:1916-23.

[4] Herbert && Johnstone, Mass Spectrometry Basics, CRC Press 2002.

[5] Bandura et al. (2009) Anal. Chem., 81:6813-22.

[6] Патент США 7479630.

[7] Robichaud et al. (2013) J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 24(5):718-21.

[8] Klinkert et al. (2014) Int. J. Mass. Spectrom. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.012.

[9] Qiu et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:886-91.

[10] Giesen et al. (2014) Nature Methods. Published online March 2nd 2014-doi:10.1038/nmeth.2869.

[11] Brückner et al. (2013) Anal. Chem. 86:585-91.

[12] Gao && Yu (2007) Biosensor Bioelectronics 22:933-40.

Изобретение относится к кювете для лазерной абляции и способу ее работы. Кювета содержит проточный канал (11), имеющий по существу постоянную площадь поперечного сечения для обеспечения строго ламинарного течения в проточном канале (11). Рядом с боковым отверстием (14) проточного канала предусмотрена камера (21) для пробы. Лазерный луч (41) попадает в камеру (21) для пробы через боковое окно (16) и падает на поверхность (24) пробы (23), подвергая материал абляции из пробы. Проба может быть позиционирована на таком расстоянии от проточного канала, что распределение генерируемой лазером массы аэрозоля имеет свой центр в пределах проточного канала, что приводит к коротким временам вымывания аэрозоля. Техническим результатом является повышение разрешения без увеличения общего времени санирования. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 10 ил.

1. Способ работы абляционной кюветы (1) для лазерной абляции материала пробы, причем абляционная кювета содержит:

проточный канал (11), имеющий вход (12) для подачи газа-носителя (G1) в этот проточный канал (11) и имеющий выход (13);

боковое отверстие (14) на первом участке (15) стенки упомянутого проточного канала (11);

боковое окно (16), расположенное на втором участке (17) стенки упомянутого проточного канала (11) напротив упомянутого бокового отверстия (14); и

камеру (21) для пробы рядом с упомянутым боковым отверстием (14), выполненную с возможностью приема пробы (23) таким образом, чтобы позволить лазерному лучу (41) попадать в камеру (21) для пробы через упомянутое боковое окно (16) и упомянутое боковое отверстие (14) и падать на поверхность (24) упомянутой пробы (23), при этом камера (21) для пробы имеет вход (22) для подачи защитного газа (G2) в камеру для пробы, при этом способ включает, не обязательно в данном порядке:

размещение пробы (23) в камере (21) для пробы таким образом, что поверхность (24) пробы была обращена к боковому отверстию (14);

подачу газа-носителя (G1) на вход (12) проточного канала (11);

подачу защитного газа (G2) на вход (22) камеры (21) для пробы;

подвергание материала абляции с упомянутой поверхности (24) при облучении упомянутой поверхности (24) лучом (41) импульсного лазера через боковое окно (16) и боковое отверстие (14);

сканирование лазерного луча (41) по поверхности (24); и

анализ получающегося в результате аэрозоля с получением химического изображения поверхности (24),

при этом проба (23) является биологической пробой.

2. Способ по п. 1, при этом проба является пробой ткани человека или ткани животного, монослоем иммобилизированных клеток или биопленкой.

3. Способ по п. 1 или 2, при этом каждый импульс упомянутого луча (41) импульсного лазера вызывает квазимгновенное распределение (25) генерируемой лазером массы аэрозоля, и при этом пробу (23) позиционируют на таком расстоянии от проточного канала (11), что распределение (25) генерируемой лазером массы имеет свой центр в пределах проточного канала (11) между боковым отверстием (14) и боковым окном (16).

4. Способ по п. 1 или 2, при этом пробу (23) позиционируют таким образом, что поверхность (24) пробы (23) имеет расстояние от центра проточного канала (11) в диапазоне от 0,5 миллиметра до 4,5 миллиметров.

5. Способ по п. 3, при этом пробу (23) позиционируют таким образом, что поверхность (24) пробы (23) имеет расстояние от центра проточного канала (11) в диапазоне от 0,5 миллиметра до 4,5 миллиметров.

6. Способ по п. 1 или 2, при этом газ-носитель (G1) имеет первую вязкость, и при этом защитный газ (G2) имеет вторую вязкость, которая ниже, чем упомянутая первая вязкость.

7. Способ по п. 1 или 2, при этом основным газом-носителем (G1) является аргон, а вспомогательным газом-носителем (G2) является газ, который содержит по меньшей мере 50% гелия.

8. Способ по п. 1 или 2,

при этом основной газ (G1) подают на вход (12) проточного канала (11) при первом объемном расходе,

при этом вспомогательный газ (G2) подают на вход (22) камеры (21) для пробы при втором объемном расходе, и

при этом второй объемный расход составляет от 0,3 до 1,0 от упомянутого первого объемного расхода.

9. Абляционная кювета (1) для лазерной абляции материала пробы, содержащая:

проточный канал (11), имеющий вход (12) для подачи газа-носителя (G1) в этот проточный канал (11) и имеющий выход (13);

боковое отверстие (14) на первом участке (15) стенки упомянутого проточного канала (11);

боковое окно (16), расположенное на втором участке (17) стенки упомянутого проточного канала (11) напротив упомянутого бокового отверстия (14); и

камеру (21) для пробы рядом с упомянутым боковым отверстием (14), выполненную с возможностью приема пробы (23) таким образом, чтобы позволить лазерному лучу (41) попадать в камеру (21) для пробы через упомянутое боковое окно (16) и упомянутое боковое отверстие (14) и падать на поверхность (24) упомянутой пробы (23), при этом камера (21) для пробы имеет вход (22) для подачи защитного газа (G2) в камеру для пробы,

при этом площадь поперечного сечения бокового отверстия составляет не более чем 20 мм².

10. Абляционная кювета по п. 9, в которой проточный канал имеет площадь поперечного сечения, которая по существу постоянна или изменяется лишь так слабо, что любые изменения в поперечном сечении незначительно нарушают ламинарное течение через проточный канал.

11. Абляционная кювета по п. 9, в которой вход (12) и выход (13) проточного канала ориентированы имеющими угол между 160° и 200°.

12. Абляционная кювета по п. 10, в которой вход (12) и выход (13) проточного канала ориентированы имеющими угол между 160° и 200°.

13. Абляционная кювета по п. 9, в которой проточный канал (11) и камера (21) для пробы разделены разделяющей стенкой, которая образует первый участок (15) стенки проточного канала (11), причем разделяющая стенка имеет минимальную толщину (w) менее 500 микрометров, предпочтительно менее 200 микрометров.

14. Абляционная кювета по п. 10, в которой проточный канал (11) и камера (21) для пробы разделены разделяющей стенкой, которая образует первый участок (15) стенки проточного канала (11), причем разделяющая стенка имеет минимальную толщину (w) менее 500 микрометров, предпочтительно менее 200 микрометров.

15. Абляционная кювета по п. 11, в которой проточный канал (11) и камера (21) для пробы разделены разделяющей стенкой, которая образует первый участок (15) стенки проточного канала (11), причем разделяющая стенка имеет минимальную толщину (w) менее 500 микрометров, предпочтительно менее 200 микрометров.

16. Абляционная кювета по п. 12, в которой проточный канал (11) и камера (21) для пробы разделены разделяющей стенкой, которая образует первый участок (15) стенки проточного канала (11), причем разделяющая стенка имеет минимальную толщину (w) менее 500 микрометров, предпочтительно менее 200 микрометров.

17. Абляционная кювета по любому из пп. 9-16, в которой боковое отверстие (14) имеет площадь поперечного сечения, которая не более чем в пять раз превышает площадь поперечного сечения проточного канала (11).

18. Абляционная кювета по любому из пп. 9-16, при этом абляционная кювета содержит верхнюю часть (10) кюветы, которая заключает проточный канал (11), и нижнюю часть (20) кюветы, которая образует камеру (21) для пробы, причем нижняя часть (20) кюветы отделяема от верхней части (10) кюветы для замены пробы (23).

19. Абляционное устройство, содержащее:

абляционную кювету (1) по любому из пп. 9-18;

лазер (4) для стрельбы лазерным лучом (41) по пробе (23) через боковое окно (16) и боковое отверстие (14); и

позиционирующее устройство (5) для изменения относительного положения пробы (23) и лазерного луча (41).

20. Источник ионов в виде индуктивно связанной плазмы (ИСП), содержащий:

абляционную кювету (1) для лазерной абляции материала пробы, содержащую:

проточный канал (11), имеющий вход (12) для подачи газа-носителя (G1) в этот проточный канал (11) и имеющий выход (13);

боковое отверстие (14) на первом участке (15) стенки упомянутого проточного канала (11);

боковое окно (16), расположенное на втором участке (17) стенки упомянутого проточного канала (11) напротив упомянутого бокового отверстия (14); и

камеру (21) для пробы рядом с упомянутым боковым отверстием (14), выполненную с возможностью приема пробы (23) таким образом, чтобы позволить лазерному лучу (41) попадать в камеру (21) для пробы через упомянутое боковое окно (16) и упомянутое боковое отверстие (14) и падать на поверхность (24) упомянутой пробы (23), при этом камера (21) для пробы имеет вход (22) для подачи защитного газа (G2) в камеру для пробы;

ИСП-горелку (6); и

трубку (61), соединяющую упомянутую абляционную кювету с упомянутой ИСП-горелкой (6), причем трубка (61) имеет площадь поперечного сечения, которая по существу идентична или лишь слабо изменяется относительно упомянутой площади поперечного сечения проточного канала (11) абляционной кюветы (1), при этом любые изменения в поперечном сечении незначительно нарушают ламинарное течение через проточный канал и трубку.