ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка испрашивает преимущество приоритета по предварительной заявке на патент США № 62/812883, поданной 1 марта 2019 г., и заявке на патент Нидерландов № 2023327, поданной 17 июня 2019 г. Полное содержание каждой из вышеупомянутых заявок включено в данный документ посредством ссылки.
Уровень техники
[0002] В процессе секвенирования путем синтеза (SBS) используют модифицированные дезоксирибонуклеотидные трифосфаты (dNTP), включая терминатор и флуоресцентный краситель, имеющий спектр излучения. Флуоресцентный краситель ковалентно соединен с dNTP. Выходные данные флуоресцентного красителя после облучения светом (т.е. флуоресценция) можно обнаружить с помощью камеры. При использовании одного флуоресцентного красителя каждое из четырех оснований добавляют в отдельный цикл синтеза ДНК и визуализации. В некоторых вариантах реализации можно использовать отдельные флуоресцентные красители для каждого из четырех оснований. В дополнительных вариантах реализации в 2-канальной и 4-канальной технологии SBS можно использовать смесь меченных красителем dNTP. Изображения каждого кластера ДНК можно получить с помощью источников света с различными диапазонами длин волн и получать выходные данные от соответствующих флуоресцентных красителей с соответствующими спектрами излучения.
Сущность изобретения
[0003] В настоящем описании описаны примеры систем или способов, которые могут обеспечивать повышенную пропускную способность визуализации в системе SBS путем одновременной визуализации пробы с использованием двух или более цветовых каналов. Применяемые красители и характеристики цветовых каналов могут способствовать низкому уровню перекрестных помех или их отсутствию между цветовыми каналами, так что мультиплексированный флуоресцентный свет можно применять для быстрой, эффективной и надежного определения нуклеотидов. Это может обеспечить существенные улучшения по сравнению с другими подходами, которые могут потребовать последовательного захвата изображений, тем самым обеспечивая более низкую пропускную способность. Можно использовать любой из множества цветовых каналов, включая, без ограничений, синие и зеленые цветовые каналы. Описаны примеры систем или методов, которые можно использовать для выполнения SBS на основе мультиплексированного флуоресцентного света. Описаны примеры красителей, которые можно использовать для мечения пробы для выполнения SBS на основе мультиплексированного флуоресцентного света.
[0004] В первом аспекте способ включает в себя получение пробы, причем проба содержит первый нуклеотид и второй нуклеотид; приведение пробы в контакт с первым флуоресцентным красителем и вторым флуоресцентным красителем, причем первый флуоресцентный краситель излучает первый излучаемый свет в первом диапазоне длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, а второй флуоресцентный краситель излучает второй излучаемый свет во втором диапазоне длин волн в ответ на второй возбуждающий свет; одновременный сбор с помощью одного или более детекторов изображения мультиплексированного флуоресцентного света, содержащего первый излучаемый свет и второй излучаемый свет, причем первый излучаемый свет представляет собой первый цветовой канал, соответствующий первому диапазону длин волн, а второй излучаемый свет представляет собой второй цветовой канал, соответствующий второму диапазону длин волн; и определение первого нуклеотида на основе первой полосы длин волн первого цветового канала и второго нуклеотида на основе второй полосы длин волн второго цветового канала.
[0005] Варианты реализации могут включать в себя любой или все из следующих признаков. Первый диапазон длин волн соответствует синему цвету, а второй диапазон длин волн соответствует зеленому цвету. Первый диапазон длин волн включен в диапазон от около 450 нм до около 525 нм, и при этом второй диапазон длин волн включен в диапазон от около 525 нм до около 650 нм. Первая средняя или пиковая длина волны определена для первого спектра излучения первого флуоресцентного красителя, а вторая средняя или пиковая длина волны определена для второго спектра излучения второго флуоресцентного красителя, причем первая и вторая средние или пиковые длины волн имеют по меньшей мере заданное разделение друг от друга. Первый диапазон длин волн имеет более короткие длины волн, чем второй диапазон длин волн, причем второй диапазон длин волн связан с первой длиной волны, и при этом разделение на длину волны излучения между первым флуоресцентным красителем и вторым флуоресцентным красителем определено так, что спектр излучения первого флуоресцентного красителя включает в себя не более заданного количества света, равного первой длине волны или превышающего ее. Одновременный сбор мультиплексированного флуоресцентного света включает в себя: обнаружение первого излучаемого света с помощью первой оптической подсистемы для первого цветового канала и обнаружение второго излучаемого света с помощью второй оптической подсистемы для второго цветового канала, причем дихроичный фильтр излучения направляет первый излучаемый свет первого цветового канала к первой оптической подсистеме и второй излучаемый свет второго цветового канала ко второй оптической подсистеме. По меньшей мере одна из первой оптической подсистемы и второй оптической подсистемы содержит наклонный оптический путь. Спектр излучения первого флуоресцентного красителя имеет пик в первом диапазоне длин волн. Проба дополнительно содержит третий нуклеотид, и способ дополнительно включает в себя: приведение пробы в контакт с третьим флуоресцентным красителем, излучающим третий излучаемый свет в первом диапазоне длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, и излучение четвертого излучаемого света в пределах второго диапазона длин волн в ответ на второе возбуждение, причем мультиплексированный флуоресцентный свет дополнительно содержит третий излучаемый свет и четвертый излучаемый свет; и определение третьего нуклеотида на основе первой полосы длин волн первого цветового канала и второй полосы длин волн второго цветового канала. Проба дополнительно содержит третий нуклеотид, и причем способ дополнительно включает в себя: приведение пробы в контакт с третьим флуоресцентным красителем, излучающим третий излучаемый свет в пределах третьего диапазона длин волн в ответ на третий возбуждающий свет, причем мультиплексированный флуоресцентный свет дополнительно содержит третий излучаемый свет; и определение третьего нуклеотида на основе третьего диапазона длин волн.
[0006] Во втором аспекте устройство содержит: проточную кювету, содержащую пробу, причем проба содержит первый нуклеотид и второй нуклеотид, при этом первый нуклеотид связан с первым флуоресцентным красителем, при том, что второй нуклеотид связан со вторым флуоресцентным красителем, первый флуоресцентный краситель излучает первый излучаемый свет в пределах первого диапазона длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, причем второй флуоресцентный краситель излучает второй излучаемый свет во втором диапазоне длин волн в ответ на второй возбуждающий свет; систему освещения, одновременно обеспечивающую подачу на проточную кювету первого света возбуждения и второго света возбуждения; и систему светосбора, одновременно собирающую мультиплексированный флуоресцентный свет, содержащий первый излучаемый свет и второй излучаемый свет, причем первый излучаемый свет представляет собой первый цветовой канал, соответствующий первому диапазону длин волн, а второй излучаемый свет представляет собой второй цветовой канал, соответствующий второму диапазону длин волн.
[0007] Варианты реализации могут включать в себя любой или все из следующих признаков. Первый диапазон длин волн соответствует синему цвету, а второй диапазон длин волн соответствует зеленому цвету. Первый диапазон длин волн включен в диапазон от около 450 нм до около 525 нм, и при этом второй диапазон длин волн включен в диапазон от около 525 нм до около 650 нм. Первая средняя или пиковая длина волны определена для первого спектра излучения первого флуоресцентного красителя, а вторая средняя или пиковая длина волны определена для второго спектра излучения второго флуоресцентного красителя, причем первая и вторая средние или пиковые длины волн имеют по меньшей мере заданное разделение друг от друга. Первый диапазон длин волн имеет более короткие длины волн, чем второй диапазон длин волн, причем второй диапазон длин волн связан с первой длиной волны, и при этом разделение на длину волны излучения между первым флуоресцентным красителем и вторым флуоресцентным красителем определено так, что спектр излучения первого флуоресцентного красителя включает в себя не более заданного количества света, равного первой длине волны или превышающего ее. Система светосбора содержит: первую оптическую подсистему для первого цветового канала, обнаруживающего первый излучаемый свет, и вторую оптическую подсистему для второго цветового канала, обнаруживающего второй излучаемый свет, причем дихроичный фильтр излучения направляет первый излучаемый свет первого цветового канала к первой оптической подсистеме и второй излучаемый свет второго цветового канала ко второй оптической подсистеме. По меньшей мере одна из первой оптической подсистемы и второй оптической подсистемы содержит наклонный оптический путь. Спектр излучения первого флуоресцентного красителя имеет пик в первом диапазоне длин волн. Проба дополнительно содержит третий нуклеотид, связанный с третьим флуоресцентным красителем, излучающим третий излучаемый свет в первом диапазоне длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, и излучение четвертого излучаемого света в пределах второго диапазона длин волн в ответ на второе возбуждение, и причем мультиплексированный флуоресцентный свет дополнительно содержит третий излучаемый свет и четвертый излучаемый свет. Проба дополнительно содержит третий нуклеотид, связанный с третьим флуоресцентным красителем, излучающим третий излучаемый свет в пределах третьего диапазона длин волн в ответ на третий возбуждающий свет, причем мультиплексированный флуоресцентный свет дополнительно содержит третий излучаемый свет.
[0008] Подробное описание одного или более примеров вариантов реализации приведено в приведенных ниже сопроводительных графических материалах и описании. Другие признаки будут понятны из описания, графических материалов и формулы изобретения.
Краткое описание графических материалов
[0009] На ФИГ. 1 представлена схема системы, включающей в себя инструмент, картридж и проточную кювету.
[0010] На ФИГ. 2 представлена схема системы освещения, содержащей проточную кювету, в соответствии с примером варианта реализации.
[0011] На ФИГ. 3 проиллюстрирована схема, на которой продемонстрированы спектры излучения красного и зеленого красителей в соответствии с примером варианта реализации.
[0012] На ФИГ. 4 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий последовательную визуализацию с использованием зеленого и красного красителей, показанных на ФИГ. 3.
[0013] На ФИГ. 5 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием зеленого и красного красителей, изображенных на ФИГ. 3.
[0014] На ФИГ. 6 представлена схема, изображающая параметры для двухканальных анализов секвенирования, изображенных на ФИГ. 4-5.
[0015] На ФИГ. 7 проиллюстрирована схема, на которой продемонстрированы спектры излучения синего и зеленого красителей в соответствии с примером варианта реализации.
[0016] На ФИГ. 8 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 7.
[0017] На ФИГ. 9 проиллюстрирована другая схема, на которой продемонстрированы спектры излучения альтернативного синего и зеленого красителей в соответствии с примером варианта реализации.
[0018] На ФИГ. 10 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 9.
[0019] На ФИГ. 11 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием другого синего и зеленого красителей.
[0020] На ФИГ. 12 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием еще одного синего и зеленого красителей.
[0021] На ФИГ. 13 проиллюстрирована другая схема, на которой продемонстрированы спектры излучения альтернативного синего и зеленого красителей и соответствующих диапазонов фильтров в соответствии с примером варианта реализации.
[0022] На ФИГ. 14 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 13, используя диапазон первого фильтра.
[0023] На ФИГ. 15 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 13, с использованием диапазона второго фильтра.
[0024] На ФИГ. 16 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 9, и диапазона второго фильтра, изображенного на ФИГ. 13.
[0025] На ФИГ. 17 представлена схема, изображающая параметры для двухканального анализа секвенирования, изображенного на ФИГ. 16.
[0026] На ФИГ. 18 представлена схема, изображающая временную шкалу примера последовательных этапов, которые могут вовлечены в получение и анализ мультиплексированных флуоресцентных изображений.
[0027] На ФИГ. 19 представлена схема, изображающая другую временную шкалу примера последовательных этапов, которые могут вовлечены в получение и анализ мультиплексированных флуоресцентных изображений.
[0028] На ФИГ. 20 представлена схема, изображающая временную шкалу событий, вовлеченных в одновременное получение изображений с использованием SIM-визуализации.
[0029] На ФИГ. 21 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ одновременной визуализации пробы в соответствии с примером варианта реализации.
[0030] На ФИГ. 22 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ выполнения операции секвенирования.
[0031] На ФИГ. 23 представлена другая блок-схема, иллюстрирующая способ выполнения операции секвенирования.
[0032] На ФИГ. 24 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая пригодность полностью функционализированного нуклеотида, меченного красителем I-4, описанным в данном документе, для применения в анализе с двухканальным секвенированием.
[0033] На ФИГ. 25 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая пригодность полностью функционализированного нуклеотида, меченного красителем I-5, описанным в данном документе, для применения в анализе с двухканальным секвенированием.
[0034] На ФИГ. 26 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая пригодность полностью функционализированного нуклеотида, меченного красителем I-6, описанным в данном документе, для применения в анализе с двухканальным секвенированием.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0035] В данном документе описаны примеры систем и методов, которые могут обеспечить надежное секвенирование путем синтеза (SBS) с использованием одновременной визуализации кластеров ДНК с использованием двух или более цветовых каналов. Такие системы/методы могут обеспечивать одно или более преимуществ по сравнению с существующими подходами, например, как описано в данном документе.
I. Общее описание
[0036] Некоторые подходы к выполнению SBS включают визуализацию каждого диапазона длин волн, излучаемого соответствующим флуоресцентным красителем света последовательно. То есть визуализацию первого диапазона длин волн излучаемого света, соответствующего первому нуклеотиду, визуализацию второго диапазона длин волн излучаемого света, соответствующего второму нуклеотиду, визуализацию третьего диапазона длин волн излучаемого света, соответствующего третьему нуклеотиду, и визуализацию четвертого диапазона длин волн излучаемого света, соответствующего четвертому нуклеотиду.
[0037] В некоторых случаях такой процесс последовательной визуализации может привести к низкой пропускной способности данных вследствие отдельной визуализации четырех различных диапазонов длин волн излучаемого света. В некоторых вариантах реализации для определения каждого нуклеотида применяют два диапазона длин волн излучаемого света путем уменьшения числа изображений для определения типа нуклеотидов на два, например, двухканальное секвенирование путем синтеза. Например, первый диапазон длин волн может быть связан с двумя нуклеотидами, такими как аденин и тимин. Второй диапазон длин волн может быть связан с одним перекрывающимся нуклеотидом и третьим нуклеотидом, таким как аденин и цитозин.
[0038] Диапазоны длин волн могут быть получены с помощью флуоресцентных красителей, которые излучают свет в пределах соответствующего диапазона длин волн в ответ на возбуждающий свет. В некоторых вариантах реализации каждый из двух красителей, один для первого диапазона длин волн и один для второго диапазона длин волн, может связываться с соответствующим участком сегмента нуклеиновой кислоты для аденина. Учитывая популяцию сегментов нуклеиновых кислот, генерированную в результате амплификации, по меньшей мере некоторые части кластера популяции сегментов нуклеиновых кислот могут связываться с красителем для первого диапазона длин волн и с красителем для второго диапазона длин волн. Таким образом, когда первый краситель подвергается воздействию первого света возбуждения, кластер излучает свет в первом диапазоне длин волн. Когда второй краситель подвергают воздействию второго света возбуждения, отличного от первого света возбуждения, кластер излучает свет во втором диапазоне длин волн. Аналогичным образом, краситель, излучающий в первом диапазоне длин волн, может связываться с соответствующим участком сегмента нуклеиновой кислоты для тимина, а краситель, излучающий во втором диапазоне длин волн, может связываться с соответствующим участком сегмента нуклеиновой кислоты для цитозина.
[0039] Когда первый диапазон длин волн визуализируют при помощи соответствующего возбуждающего света, можно получить изображение излучаемого света первого диапазона длин волн. Когда второй диапазон длин волн визуализируют при помощи соответствующего возбуждающего света, можно получить изображение излучаемого света второго диапазона длин волн. Получение этих изображений разнесено по времени так, чтобы получение изображения в первом диапазоне длин волн излучаемого света не перекрывалось со вторым диапазоном длин волн излучаемого света.
[0040] Части двух изображений, которые продемонстрированы на обоих изображениях, могут быть определены как соответствующие перекрывающемуся нуклеотиду, такому как аденин. Части двух изображений, которые продемонстрированы только на первом изображении (и не излучающие свет на втором изображении), могут быть определены как соответствующие неперекрывающемуся нуклеотиду, связанному с красителем, излучающим в первом диапазоне длин волн, таким как тимин. Части двух изображений, которые продемонстрированы только на втором изображении (и не излучающие свет на первом изображении), могут быть определены как соответствующие неперекрывающемуся нуклеотиду, связанному с красителем, излучающим во втором диапазоне длин волн, таким как цитозин. Части двух изображений, которые не излучают свет ни на первом, ни на втором изображении, могут быть определены как соответствующие четвертому нуклеотиду, такому как гуанин.
[0041] В вышеупомянутых системах для определения соответствующих нуклеотидов применяют два или более последовательных (т.е. разнесенных во времени) изображения. Как описано в данном документе, во время одного этапа визуализации можно одновременно снимать два или более различных диапазонов длин волн излучаемого света, таким образом устраняя разнесенный по времени второй набор изображений и повышая пропускную способность секвенирования за счет снижения числа этапов визуализации до одной последовательности для визуализации. Однако могут возникнуть сложности с выполнением одновременного получения изображения от двух или более каналов излучаемого света из-за перекрывающихся диапазонов длин волн излучаемого света. Например, в некоторых случаях, когда диапазоны длин волн излучаемого света находятся слишком близко друг к другу (например, синий и зеленый диапазоны), соответствующие спектры излучения различных флуоресцентных красителей могут перекрываться. В таких случаях могут возникать спектральные «перекрестные помехи», что приводит к сложностям в обработке информации для определения соответствующего нуклеотида.
[0042] В данном документе описаны системы и способы одновременного захвата двух или более длин волн излучаемого света за один этап визуализации, информацию из которого затем можно обработать для определения соответствующих нуклеотидов для процесса секвенирования путем синтеза. В частности, первый диапазон длин волн может быть связан с двумя нуклеотидами, такими как аденин и тимин. Второй диапазон длин волн может быть связан с одним нуклеотидом, перекрывающимся с двумя нуклеотидами, и третьим нуклеотидом, таким как аденин и цитозин. Первый диапазон длин волн может иметь первую меньшую длину волны и первую большую длину волны. Второй диапазон длин волн может иметь вторую меньшую длину волны и вторую большую длину волны. В некоторых вариантах реализации первая меньшая длина волны расположена по меньшей мере на 50 нм от второй большей длины волны. В некоторых вариантах реализации первую меньшую длину волны и вторую большую длину волны устанавливают таким образом, чтобы перекрестные помехи были ниже первого заданного значения, например 20%.
[0043] Разделение между красителями может быть определено одним или более другими способами. Это может быть основано на одном или более диапазонах длин волн, цветовых каналах или флуоресцентных красителях. Диапазон длин волн может включать все частоты (например, по существу непрерывный диапазон частот) между первой длиной волны и второй длиной волны. Например, первую и вторую длины волн можно выбрать таким образом, чтобы диапазон длин волн включал синий свет или свет другого цвета. Цветовой канал представляет собой частоту или частоты, обнаруживаемые детектором. Например, частоты излучаемого света, которые не находятся в цветовом канале, могут быть отфильтрованы до достижения детектора. В некоторых вариантах реализации цветовой канал может включать в себя один или более диапазонов длин волн. Флуоресцентный краситель можно охарактеризовать множеством способов, включая, без ограничений, его химическую структуру и/или его оптические свойства. В некоторых вариантах реализации флуоресцентный краситель может характеризоваться как излучающий флуоресцентный свет только в одном или более диапазонах длин волн или как имеющий среднюю или пиковую длину волны с частотой или в пределах диапазона длин волн.
[0044] В некоторых вариантах реализации разделение может быть определено на основе количества света, излучаемого соответствующим красителем, с заданной длины волны или выше. Разделение может быть определено таким образом, чтобы количество излучаемого света не превышало предварительно заданного процентного значения, которое больше или меньше заданной длины волны, связанной с диапазоном длин волн другого красителя. Например, не более чем на X процентов флуоресцентного света красителя излучается с длиной волны выше или ниже длины волны другого красителя. В некоторых вариантах реализации число X в предыдущем примере может быть любым подходящим числом, таким как диапазон значений. Например, диапазон может составлять около 0-10% от диапазона флуоресцентного света. В качестве другого примера, диапазон может составлять около 0,5-5% от флуоресцентного света. В качестве другого примера, диапазон может составлять около 0,1-1% от флуоресцентного света. В некоторых вариантах реализации можно применять среднее или пиковое разделение длин волн между красителями. Например, можно считать, что два красителя удовлетворяют показателю разделения, если их средняя или пиковая длины волн разделены по меньшей мере заданным показателем (например, расстоянием или процентным показателем любой длины волны).
[0045] Для излучения света в вышеупомянутых диапазонах длин волн можно применять один или более флуоресцентных красителей. Например, некоторые красители, описанные в данном документе, могут иметь спектр излучения, локализованный в диапазоне длин волн синего света, для излучения света для канала синего цвета. Аналогично некоторые красители, описанные в данном документе, могут иметь спектр излучения, локализованный в диапазоне длин волн зеленого света, для излучения света для канала зеленого цвета. Аналогично некоторые красители, описанные в данном документе, могут иметь спектр излучения, локализованный в диапазоне длин волн красного света, для излучения света для канала красного цвета. Например, могут быть обнаружены синий и зеленый цветовые каналы. В другом примере, могут быть обнаружены синий, зеленый и красный цветовые каналы. Спектр излучения красителей можно быть выбран таким образом, чтобы каждый из них был в достаточной степени локализован в синей спектральной области и в зеленой спектральной области соответственно так, чтобы иметь уменьшенное перекрывание длин волн излучения.
II. Пример прибора и системы освещения для мультиплексного флуоресцентного обнаружения
[0046] На ФИГ. 1 представлена схема системы 10, включающей в себя инструмент 12, картридж 14 и проточную кювету 16. Систему 10 можно применять для биологического и/или химического анализа. Систему 10 можно применять вместе или в варианте реализации одного или более других примеров, описанных в других разделах данного документа.
[0047] Картридж 14 может служить носителем для одной или более проб, например, посредством проточной кюветы 16. Картридж 14 может быть выполнен с возможностью удержания проточной кюветы 16 и транспортировки проточной кюветы 16 в непосредственное взаимодействие с инструментом 12 и из него. Например, инструмент 12 включает в себя приемный отсек 18 (например, отверстие во внешнем кожухе) для приема и размещения картриджа 14 по меньшей мере во время сбора информации из пробы. Картридж 14 может быть изготовлен из любого подходящего(-их) материала(-ов). В некоторых вариантах реализации картридж 14 содержит формованный пластик или другой прочный материал. Например, картридж 14 может образовывать раму для поддержки или удержания проточной кюветы 16.
[0048] В примерах, приведенных в данном документе, упоминаются анализируемые пробы. Такие пробы могут включать в себя генетический материал. В некоторых вариантах реализации проба содержит одну или более матричных цепей генетического материала. Например, применяя методы и/или системы, описанные в данном документе, SBS может быть выполнена на одной или более матричных цепях ДНК.
[0049] Проточная кювета 16 может включать в себя одну или более подложек, выполненных с возможностью удерживания пробы(проб) для анализа с помощью прибора 12. Для подложки можно использовать любой подходящий материал, включая, без ограничений, стекло, акриловый и/или другой пластиковый материал. Проточная кювета 14 может допускать избирательное протекание жидкостей или других жидкостей по отношению к пробе(-ам). В некоторых вариантах реализации проточная кювета 16 содержит одну или более проточных структур, которые могут удерживать пробу(-ы). В некоторых вариантах реализации проточная кювета 12 может содержать, по меньшей мере, один проточный канал. Например, проток может включать в себя один или более портов для текучей среды для облегчения потока текучей среды.
[0050] Инструмент 12 позволяет получать любую информацию или данные, относящиеся к по меньшей мере одному биологическому и/или химическому веществу. Операцией(-ами) можно управлять с помощью центрального блока или одного или более распределенных контроллеров. Здесь проиллюстрирован контроллер 20 инструмента. Например, контроллер 20 может быть эксплуатирован с использованием по меньшей мере одного процессора, по меньшей мере одного носителя данных (например, запоминающего устройства и/или привода), содержащего инструкции для операций инструмента 12, и одного или более других компонентов, например, как описано ниже. В некоторых вариантах реализации инструмент 12 может выполнять оптические операции, включая, без ограничений, освещение и/или визуализацию проб(-ы). Например, инструмент 12 может включать в себя одну или более оптических подсистем (например, подсистему освещения и/или подсистему визуализации). В некоторых вариантах реализации инструмент 12 может выполнять термическую обработку, включая, без ограничений, термическую обработку проб(-ы). Например, инструмент 12 может содержать одну или более тепловых подсистем (например, нагреватель и/или охладитель). В некоторых вариантах реализации инструмент 12 может выполнять контроль текучей среды, включая, без ограничений, добавление и/или удаление текучей среды, находящейся в контакте с пробой(-ами). Например, инструмент 12 может содержать одну или более подсистем для текучей среды (например, насос и/или резервуар).
[0051] На ФИГ. 2 представлена схема примера системы 100 освещения. Система 100 освещения содержит узел 110 источника света, дихроичный фильтр 128 возбуждающего света, линзу 134 объектива, проточную кювету 136, дихроичный фильтр 138 излучения, первую подсистему 156 оптического обнаружения и вторую подсистему 158 оптического обнаружения. Система 100 освещения обеспечивает одновременную визуализацию двух цветовых каналов. В некоторых вариантах реализации другая система освещения может быть выполнена с возможностью обеспечения одновременной визуализации более чем двух цветовых каналов, например, трех цветовых каналов, четырех цветовых каналов или более. Следует отметить, что могут существовать другие оптические конфигурации, которые могут обеспечивать аналогичную одновременную визуализацию множества цветовых каналов.
[0052] Узел источника света 110 создает возбуждающее освещение, которое падает на проточную кювету 136. Такое возбуждающее освещение, в свою очередь, будет создавать излучаемое или флуоресцирующее освещение от одного или более флуоресцентных красителей, которые будут собираться при помощи проекционных линз 142 и 148. Как проиллюстрировано на ФИГ. 2, узел источника света 110 включает в себя первый источник возбуждающего освещения 112 и соответствующую фокусирующую линзу 114, второй источник возбуждающего освещения 116 и соответствующую фокусирующую линзу 118, а также дихроичный фильтр 120.
[0053] Первый источник возбуждающего освещения 112 и второй источник возбуждающего освещения 116 представляют пример системы освещения, которая может одновременно обеспечивать соответствующие источники освещения для пробы (например, соответствующие цветовым каналам). В некоторых вариантах реализации каждый из первого источника возбуждающего освещения 112 и второго источника возбуждающего освещения 116 содержит светодиод (СИД). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из первого источника возбуждающего освещения 112 и второго источника возбуждающего освещения 116 содержит лазер. В некоторых вариантах реализации первый источник 112 возбуждающего света генерирует зеленый свет, то есть свет в узком диапазоне с пиковой или средней длиной волны, соответствующей зеленому цвету (например, около 560 нм). В некоторых вариантах реализации второй источник 116 возбуждающего света генерирует синий свет, то есть свет в узком диапазоне с пиковой или средней длиной волны, соответствующей синему цвету (например, около 490 нм).
[0054] Каждая из фокусирующих линз 114 и 118 установлена на расстоянии от соответствующих источников освещения 112 и 116 таким образом, что освещение, выходящее из каждой из фокусирующих линз 114/118, фокусируется на апертуре поля 122.
[0055] Дихроичный фильтр 120 отражает освещение от первого источника возбуждающего освещения 112 и передает освещение от второго источника возбуждающего освещения 116. В некоторых вариантах реализации, когда первый источник 112 возбуждающего освещения генерирует зеленый свет, а второй источник 116 возбуждающего освещения генерирует синий свет, дихроичный фильтр отражает зеленый свет и передает синий свет. Дихроичный фильтр 120 выводит выходные данные смешанного освещения с комбинацией двух длин волн, синего и зеленого в настоящем примере, и далее по оптическому пути для излучения линзой 134 объектива.
[0056] В некоторых вариантах реализации выходные данные смешанного освещения возбуждения из дихроичного фильтра 120 может напрямую распространяться к линзе 134 объектива. В других вариантах реализации смешанное возбуждающее освещение можно дополнительно модифицировать и/или контролировать с помощью дополнительных промежуточных оптических компонентов до излучения от линзы 134 объектива. В примере, проиллюстрированном на ФИГ. 1, смешанное возбуждающее освещение проходит через фокус в апертуре 122 поля на синий/зеленый фильтр 124, а затем на коллимирующую линзу 126 с коррекцией цвета. Коллимированное возбуждающее освещение от линзы 126 падает на зеркало 128, с которого она отражается и падает на дихроичный фильтр 130 возбуждающего света/излучения. Дихроичный фильтр 130 возбуждающего света/излучения отражает возбуждающее освещение, излучаемое узлом 110 источника света, позволяя при этом освещению излучения, которое будет дополнительно описано ниже, проходить через дихроичный фильтр 130 возбуждающего света/излучения, поступать в одну или более оптических подсистем 156, 158. Оптические подсистемы 156 и 158 иллюстрируют систему сбора света, которая может одновременно собирать мультиплексированный флуоресцентный свет. Затем возбуждающее освещение, отраженное от дихроичного фильтра 130 возбуждающего света/излучения, падает на зеркало 132, откуда он падает на линзу 134 объектива в направлении проточной кюветы 136.
[0057] Линза 134 объектива фокусирует коллимированное освещение от зеркала 132 на проточную кювету 136. В некоторых вариантах реализации линза 134 объектива является объективом микроскопа с указанным коэффициентом увеличения, составляющим, например, 1X, 2X, 4X, 5X, 6X, 8X, 10X или выше. Линза 134 объектива фокусирует возбуждающее освещение, падающее от зеркала 132 на проточную кювету 136, под углом или числовой апертурой, определяемой коэффициентом увеличения. В некоторых вариантах реализации линза 134 объектива может перемещаться по оси, перпендикулярной проточной кювете («ось z»). В некоторых вариантах реализации система 100 освещения независимо регулирует z-положение трубчатой линзы 148 и трубчатой линзы 142. Например, это может привести зеленый канал в фокус на детекторе 154, а синий канал идеально - в фокус на детекторе 146 без необходимости перемещения объектива в направлении z. Независимыми корректировками z трубчатых линз 148 и 142 могут быть «однократная корректировка», выполняемая при выравнивании инструмента впервые.
[0058] Проточная кювета 136 содержит пробу, такую как нуклеотидная последовательность для анализа. Проточная кювета 136 может содержать один или более каналов 160 (схематично проиллюстрированы на виде в поперечном сечении в увеличенном виде), выполненных с возможностью удерживания материала пробы и облегчения действий, которые необходимо предпринять в отношении материала пробы, включая, без ограничений, запуск химических реакций или добавление или удаление материала. Плоскость 162 объекта линзы 134 объектива, схематически проиллюстрированная пунктирной линией, проходит через проточную кювету 136. Например, плоскость 162 объекта может быть образована так, чтобы быть соседней с каналом(-ами) 160.
[0059] Линза 134 объектива может определять поле зрения. Поле зрения может определять область на проточной кювете 136, из которой детектор изображения захватывает излучаемый свет с помощью линзы объектива 134. Может использоваться один или более детекторов изображения, например, детекторов 146 и 154. Например, когда первый и второй источники 112 и 116 освещения генерируют соответствующее возбуждающее освещение, имеющее разные длины волн (или диапазоны разных длин волн), система 100 освещения может содержать отдельные детекторы 146 и 154 изображения для соответствующих длин волн (или диапазонов длин волн) излучаемого света. По меньшей мере один из детекторов 146 и 154 изображения может содержать устройство с зарядовой связью (ПЗС), такое как ПЗС-камера с временной задержкой, или датчик, изготовленный на основе комплементарной технологии металл-оксид-полупроводник (КМОП), такие как химически чувствительные полевые транзисторы (chemFET), ионно-селективные полевые транзисторы (ISRT) и/или полевые транзисторы на основе металлооксидного полупроводника (MOSFET).
[0060] В некоторых вариантах реализации система 100 освещения может содержать микроскоп структурированного освещения (SIM). SIM-визуализация основана на пространственно структурированном освещении и реконструкции для получения изображения с более высоким разрешением, чем изображение, созданное исключительно с использованием увеличения от линзы 134 объектива. Например, структура может содержать или включать рисунок или решетку, прерывающую свет возбуждающего освещения. В некоторых вариантах реализации структура может включать в себя интерференционные полосы. Интерференционные полосы света могут генерироваться путем направления пучка света на дифракционную решетку таким образом, чтобы происходила отражающая или пропускающая дифракция. Структурированный свет может проецироваться на пробу, освещая пробу в соответствии с соответствующими интерференционными полосами, которые могут возникать в соответствии с некоторой периодичностью. Для реконструкции изображения при помощи SIM используют два или более структурированных изображения, в которых рисунок возбуждающего освещения находится под разными фазовыми углами друг к другу. Например, изображения пробы могут быть получены на разных фазах интерференционных полос структурированного света, иногда называемых соответствующими фазами узора изображений. Это позволяет подвергать разнообразные местоположения пробы воздействию множества интенсивностей освещения. Набор получающихся изображений излучаемого света можно объединять для реконструкции изображения с более высоким разрешением.
[0061] Материал пробы в проточной кювете 136 приводят в контакт с флуоресцентными красителями, которые связываются с соответствующими нуклеотидами. Флуоресцентные красители излучают флуоресцентное освещение при облучении соответствующим освещением, падающим на проточную кювету 136 с линзы 134 объектива. Излучаемое освещение определяют диапазонами длин волн, каждый из которых можно отнести к соответствующему цветовому каналу. Например, диапазоны длин волн излучаемого света могут соответствовать синему цвету (например, 450-525 нм), зеленому цвету (например, 525-570 нм), желтому цвету (например, 570-625 нм), красному цвету (например, 625-750 нм) и т.д. В некоторых вариантах реализации диапазоны длин волн могут быть определены на основе двух или более длин волн света, присутствующих в процессе одновременного освещения. Например, если необходимо проанализировать только синий и зеленый цвета, диапазон длин волн, соответствующий синему и зеленому цветам, может определяться как диапазоны длин волн, отличные от указанных выше диапазонов. Например, диапазон длин волн синего света может быть установлен как излучаемый свет от около 450 нм до 510 нм, например 486-506 нм. В некоторых примерах диапазон длин волн синего цвета может просто иметь верхний предел, например около 500-510 нм или около 506 нм. Аналогичным образом, диапазон длин волн зеленого цвета может быть задан как излучаемый свет от около 525 нм до 650 нм, например 584-637 нм. В то время как вышеупомянутый диапазон длин волн охватывает желтый и красный цвета, указанные выше, при анализе излучаемого света, который, как ожидается, будет находиться только в диапазоне синего и зеленого цветов, верхний и/или нижний концы диапазона длин волн могут быть продлены для захвата дополнительного излучаемого света, который излучается выше или ниже длины волны для цвета. В некоторых примерах диапазон длин волн зеленого цвета может просто иметь нижний предел, например около 550-600 нм или около 584 нм.
[0062] Флуоресцентные красители химически соединены с соответствующими нуклеотидами, например, содержащими соответствующие азотистые основания. Таким образом, dNTP, меченный флуоресцентным красителем, может быть определен на основании того, что длина волны излучаемого света находится в пределах соответствующего диапазона длин волн при обнаружении детектором 146, 154 изображения. Таким образом, первый dNTP, меченный синим красителем, может быть определен в ответ на то, что детектор изображения 146, 154 принимает излучаемый свет в определенном диапазоне длин волн синего света, как обсуждалось выше. Аналогичным образом, другой нуклеотид, меченный зеленым красителем, может быть определен в ответ на то, что детектор 146, 154 изображения принимает излучаемый свет в пределах определенного диапазона длин волн зеленого цвета, как обсуждалось выше. Другие цветовые комбинации меченных красителем нуклеотидов для одновременной визуализации кластеров ДНК также могут применяться для секвенирования в сочетании с соответствующими источниками света и оптическими установками (например, синий и желтый; синий и красный; зеленый и красный; желтый и красный; синий, зеленый и красный; синий, зеленый и желтый; синий, желтый и красный; зеленый, желтый и красный; синий, зеленый, желтый и красный; и т.д.).
[0063] Состав флуоресцентных красителей более подробно описан ниже в разделе III, описывающем разнообразные красители. В некоторых вариантах реализации флуоресцентные красители сконструированы таким образом, чтобы каждый нуклеотид можно было надежно определить по цветовому каналу с помощью платформы одновременной визуализации, обеспечиваемой системой 100 освещения. Путем выбора спектра излучения красителя и фильтрации может быть реализован мультиплексированный излучаемый красителями свет. В частности, поскольку диапазоны длин волн для близких или аналогичных цветов, таких как цветовые каналы синего и зеленого цвета, могут находиться относительно близко друг к другу, выбор определенных флуоресцентных красителей с соответствующими спектрами излучения, которые имеют достаточно малую область перекрытия, может помочь снизить потенциальную ошибку определения нуклеотидов и, соответственно, ошибок при секвенировании. Кроме того, использование фильтрации волновых полос может дополнительно способствовать различению определенных флуоресцентных красителей, которые могут иметь аналогичные цвета.
[0064] В некоторых вариантах реализации четыре типа нуклеотидов могут быть определены с помощью двух цветовых каналов. В этом случае первый нуклеотид может быть связан только с первым цветовым каналом, второй нуклеотид может быть связан только со вторым цветовым каналом, третий нуклеотид может быть связан с обоими цветовыми каналами, а четвертый нуклеотид может быть не связан ни с одним цветовым каналом.
[0065] Линза 134 объектива также захватывает флуоресцентный свет, излучаемый молекулами флуоресцентного красителя в проточной кювете 136. После захвата данного излучаемого света линза 134 объектива собирает и передает коллимированный свет, который включает в себя два цветовых канала. Затем этот излучаемый свет распространяется обратно по пути, по которому от источника 110 освещения поступало первоначальное возбуждающее освещение. Следует отметить, что интерференция между излучаемым и возбуждающим освещением на этом пути практически не ожидается из-за отсутствия когерентности между излучаемым светом и возбуждающим освещением. Это означает, что излучаемый свет является результатом отдельного источника, а именно флуоресцентного красителя, находящегося в контакте с материалом пробы в проточной кювете 136.
[0066] Излучаемый зеркалом 132 свет падает на дихроичный фильтр 130 возбуждающего/излучаемого света. Фильтр 130 передает излучаемый свет на синий/зеленый дихроичный фильтр 138.
[0067] В некоторых вариантах реализации синий/зеленый дихроичный фильтр 138 передает освещение, связанное с синим цветовым каналом, и отражает освещение, связанное с зеленым цветовым каналом. В некоторых вариантах реализации синий/зеленый дихроичный фильтр 138 выбран так, что дихроичный фильтр 138 отражает излучаемое освещение в оптическую подсистему 156, которая находится в пределах определенного диапазона длин волн зеленого цвета, и передает излучаемое освещение в оптическую подсистему 158, которая находится в пределах определенного диапазона длин волн синего цвета, как описано выше. Оптическая подсистема 156 содержит трубчатую линзу 142, фильтр 144 и детектор 146 изображения. Оптическая подсистема 158 содержит трубчатую линзу 148, фильтр 150 и детектор 154 изображения.
[0068] В некоторых вариантах реализации дихроичный фильтр 138 и дихроичный фильтр 120 работают аналогично друг другу (например, оба они могут отражать свет одного цвета и передавать свет другого цвета). В других вариантах реализации синий/зеленый дихроичный фильтр 138 и дихроичный фильтр 120 эксплуатируют по-разному (например, дихроичный фильтр 138 может передавать свет цвета, который отражает дихроичный фильтр 120, и наоборот).
[0069] Предполагая, что синий/зеленый дихроичный фильтр 138 передает излучаемое освещение, включенное в синий цветовой канал, излучаемое освещение, включенное в зеленый цветовой канал, может отражаться от синего/зеленого дихроичного фильтра 138 в оптическую подсистему 156. Затем зеркало 140 отражает излучаемое освещение, включенное в канал зеленого цвета, для попадания на трубчатую линзу 142 оптической подсистемы 156. Тогда фильтр 144 оптической подсистемы 156 представляет собой зеленый фильтр, выполненный с возможностью передачи длин волн в зеленом цветовом канале излучаемого освещения и поглощения или отражения всех других длин волн. Фильтр 144 может обеспечивать дополнительную фильтрацию, недоступную для синего/зеленого дихроичного фильтра 138. Например, если синий/зеленый дихроичный фильтр 138 отражает относительно широкий диапазон длин волн зеленого света, фильтр 144 может дополнительно ограничивать данный диапазон длин волн, так что только относительно более узкий диапазон длин волн зеленого света может достигать детектора 146 изображения. Фильтр 144 может блокировать любой пропускаемый возбуждающий свет и/или определять относительно малый диапазон длин волн.
[0070] Одновременно синий/зеленый дихроичный фильтр 138 передает излучаемое освещение, включенное в синий цветовой канал, для попадания на трубчатую линзу 148 оптической подсистемы 158. Фильтр 150 оптической подсистемы 158 представляет собой синий фильтр, выполненный с возможностью передачи длин волн в синем цветовом канале излучаемого освещения и поглощения или отражения всех других длин волн. Фильтр 150 может обеспечивать дополнительную фильтрацию, недоступную для синего/зеленого дихроичного фильтра 138. Например, если синий/зеленый дихроичный фильтр 138 передает относительно широкий диапазон длин волн синего света, фильтр 150 может дополнительно ограничивать данный диапазон длин волн, так что только относительно более узкий диапазон длин волн синего света может достигать детектора 154 изображения. Фильтр 150 может блокировать любой пропускаемый возбуждающий свет и/или определять относительно малый диапазон длин волн.
[0071] В некоторых вариантах реализации и как проиллюстрировано на ФИГ. 2, излучаемое освещение, включенное в канал синего цвета, сталкивается с зеркалом 152 перед детектором 154 изображения. На проиллюстрированном примере оптический путь в оптической подсистеме 158 наклонен таким образом, чтобы система 100 освещения в целом могла удовлетворять требованиям к пространству или объему. В некоторых вариантах реализации обе такие подсистемы 156 и 158 имеют оптические пути, которые расположены под углом. В некоторых вариантах реализации ни один из оптических путей ни в подсистеме 156, ни в 158 не расположен под углом. Таким образом, одна или более из множества оптических подсистем могут иметь по меньшей мере один угловой оптический путь.
[0072] Каждая трубчатая линза 142 и 148 фокусирует падающее на нее излучаемое освещение на соответствующие детекторы 146 и 154 изображения. Каждый детектор 146 и 154 в некоторых вариантах реализации содержит матрицу устройства с зарядовой связью (ПЗС). В некоторых вариантах реализации каждый из детекторов 146 и 154 изображения содержит датчик, изготовленный на основе комплементарной технологии металл-оксид-полупроводник (КМОП).
[0073] Как указано выше, система 100 освещения не обязательно должна быть такой, как проиллюстрировано на ФИГ. 2. Например, каждое из зеркал 128, 132, 140 может быть заменено на призму или другое оптическое устройство, изменяющее направление освещения. Каждую линзу можно заменить дифракционной решеткой, дифракционной оптикой, линзой Френеля или каким-либо другим оптическим устройством, которое создает коллимированное или сфокусированное освещение от падающего освещения. Кроме того, система 100 освещения может быть выполнена с возможностью разделения различных диапазонов длин волн, отличных от синего/зеленого, например, красного/зеленого или синего/красного. Несколько синих, зеленых и красных красителей, обсуждаемых в данном документе, подробно описаны ниже в разделе III под названием «Примеры флуоресцентных красителей».
[0074] На ФИГ. 3 проиллюстрирована схема 300, на которой продемонстрированы спектры излучения красного и зеленого красителей в соответствии с примером варианта реализации. Флуоресценцию измеряют относительно вертикальной оси, и на горизонтальной оси указана длина волны. Флуоресценцию можно измерить по интенсивности излучаемого света. В некоторых вариантах реализации можно использовать один или более способов определения интенсивности света. Например, можно использовать произвольную единицу интенсивности относительно откалиброванного эталона. Спектры 302 и 304 можно охарактеризовать как спектры зеленых красителей, а спектры 306 и 308 можно охарактеризовать как спектры красных красителей. Диаграмма 300 включает в себя цветовые каналы 310 и 312. Цветовой канал 310 может быть связан с фильтром зеленого излучения. Например, цветовой канал 310 можно рассматривать как зеленый цветовой канал. Цветовой канал 312 может быть связан с фильтром красного излучения. Например, цветовой канал 312 можно рассматривать как красный цветовой канал.
[0075] Проблемой могут быть спектральные перекрестные помехи между каналами. Перекрестные помехи могут возникать, когда цветовые каналы освещают последовательно и одновременно. В некоторых вариантах реализации перекрестные помехи для канала с более низкой длиной волны в канале с более высокой длиной волны можно считать худшим сценарием. Например, это может включать в себя выхождение спектра 302 или 304 за пределы в цветовой канал 312. В данном случае спектры 302-308 могут иметь 2,4% перекрестных помех при последовательном освещении и 2,8% перекрестных помех при одновременном освещении. Например, это можно считать относительно минимальной разницей в перекрестных помехах между одновременным и последовательным получением изображения.
[0076] На ФИГ. 4 представлена диаграмма рассеяния 400, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий последовательную визуализацию с использованием зеленого и красного красителей, показанных на ФИГ. 3. Количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в красном канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 402 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в красном канале. Излучение 404 соответствует существенному излучению в красном канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 406 соответствует существенным излучениям как в зеленом, так и в красном каналах. Излучение 408 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в зеленом, так и в красном каналах. Таким образом, излучение 908 является примером излучения флуоресцентного красителя, который не излучает существенного света в пределах диапазона длин волн зеленого канала и не излучает существенного света в пределах диапазона длин волн красного канала.
[0077] Каждое из излучений 402-408 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 402 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 404 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 406 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 408 может соответствовать обнаружению гуанина. При последовательной визуализации в настоящем примере излучения 402-408 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[0078] На ФИГ. 5 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием зеленого и красного красителей, изображенных на ФИГ. 3. Количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в красном канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 502 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в красном канале. Излучение 504 соответствует существенному излучению в красном канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 506 соответствует существенным излучениям как в зеленом, так и в красном каналах. Излучение 508 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в зеленом, так и в красном каналах. Каждое из излучений 502-508 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 502 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 504 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 506 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 508 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 502-508 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[0079] На ФИГ. 6 представлена схема, изображающая параметры для двухканальных анализов секвенирования, изображенных на ФИГ. 4-5. Показатель 600 относится к последовательному освещению, а показатель 602 относится к одновременному освещению.
[0080] Таким образом, описанные выше примеры указывают на то, что уровень перекрестных помех в системе красного/зеленого цвета может быть относительно низким даже при одновременном получении изображения. Однако при использовании других цветовых каналов количество перекрестных помех может быть более сложным.
[0081] На ФИГ. 7 проиллюстрирована схема 700, на которой продемонстрированы спектры излучения синего и зеленого красителей в соответствии с примером варианта реализации. Флуоресценцию измеряют относительно вертикальной оси, и на горизонтальной оси указана длина волны. Спектры 702 и 704 можно охарактеризовать как спектры синих красителей, а спектры 706 и 708 можно охарактеризовать как спектры зеленых красителей. Например, спектр 702 может соответствовать обнаружению аденина в синем освещении. Например, спектр 704 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, спектр 706 может соответствовать обнаружению аденина в зеленом освещении. Например, спектр 708 может соответствовать обнаружению тимина.
[0082] Диаграмма 700 включает в себя цветовые каналы 710 и 712. Цветовой канал 710 может быть связан с фильтром синего излучения. Например, цветовой канал 710 можно рассматривать как синий цветовой канал. Цветовой канал 712 может быть связан с фильтром зеленого излучения. Например, цветовой канал 712 можно рассматривать как зеленый цветовой канал.
[0083] На диаграмме 700 проиллюстрировано, что спектр 704, который может соответствовать синему излучению для определения цитозинового основания, значительно выходит за пределы в цветовой канал 712. В некоторых вариантах реализации это может происходить из-за того, что разделение между длинами волн возбуждения зеленого и синего света (которое может составлять, например, около 70 нм) относительно значительно меньше разделения между длинами волн красного и зеленого света (которое может составлять, например, около 140 нм, см. ФИГ. 3). Таким образом, спектры излучения синего красителя излучают компоненты с длиной волны, которые перекрываются со спектрами излучения зеленого красителя. Следовательно, флуоресцентное излучение в голубом/зеленом сценарии (например, диаграмма 700) может быть гораздо ближе, чем в красном/зеленом сценарии (например, диаграмма 300). При последовательном освещении синим/зеленым освещением количество перекрестных помех может быть относительно минимальным или незначительным. Однако при одновременном освещении перекрестные помехи могут быть относительно значительными. Например, перекрестные помехи могут составлять около 40%.
[0084] На ФИГ. 8 представлена диаграмма рассеяния 800, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 7. Количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 802 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Таким образом, излучение 802 является примером излучения флуоресцентного красителя, который не излучает существенного света в пределах диапазона длин волн синего канала и не излучает существенного света в пределах диапазона длин волн зеленого канала. Излучение 804 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 806 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 808 распределено на диаграмме рассеяния 800 и совпадает по меньшей мере с частью излучений 802 и 806. Указан центр 808A излучения 808. Каждое из излучений 802-808 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 802 может соответствовать обнаружению гуанина. Например, излучение 804 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 806 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 808 может соответствовать обнаружению цитозина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучение 802-808 имеет относительно значительные перекрестные помехи.
[0085] На ФИГ. 9 проиллюстрирована другая схема 900, на которой продемонстрированы спектры излучения альтернативного синего и зеленого красителей в соответствии с примером варианта реализации. Флуоресценцию измеряют относительно вертикальной оси, и на горизонтальной оси указана длина волны. Спектры 902 и 904 можно охарактеризовать как спектры синих красителей, а спектр 906 можно охарактеризовать как спектр зеленого красителя. Диаграмма 900 включает в себя цветовые каналы 908 и 910. Цветовой канал 908 может быть связан с фильтром синего излучения. Например, цветовой канал 908 можно рассматривать как синий цветовой канал. Цветовой канал 910 может быть связан с фильтром зеленого излучения. Например, цветовой канал 910 можно рассматривать как зеленый цветовой канал. Каждый из спектров 902-906 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, спектр 902 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, спектр 904 может соответствовать обнаружению аденина. Например, спектр 906 может соответствовать обнаружению тимина или аденина.
[0086] Спектральное излучение на диаграмме 900 иллюстрирует краситель, который поддерживает одновременную многоцветную визуализацию. Например, в отличие от диаграммы 700 на ФИГ. 7 пик спектра 902, который соответствует синему излучению красителя для секвенирования цитозиновых оснований, сильно сдвинут в область синего цвета. В данном случае спектр 904 имеет пик в цветовом канале 908, тогда как пик спектра 902 не находится в пределах спектра 908. Пик спектра 906 расположен немного ниже нижней части цветового канала 910. Диаграмма 900 может указывать на относительно минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи при последовательном освещении. Например, диаграмма 900 может указывать на около 12% перекрестных помех при одновременном освещении.
[0087] Относительно низкий уровень перекрестных помех на диаграмме 900 может коррелировать с соответствующими красителями, которые достаточно разделены друг от друга. В некоторых вариантах реализации разделение может быть определено на основе пиков или средней длины волны спектров излучения. Пиковая длина волны может соответствовать локальному или глобальному максимуму интенсивности излучаемого света. Средняя длина волны может соответствовать средней длине волны в пределах диапазона спектра излучения. В некоторых вариантах реализации красители могут быть выбраны таким образом, чтобы их соответствующие пиковые или средние длины волн имели по меньшей мере заданное разделение друг от друга. Например, пиковая длина волны спектра 902 может иметь по меньшей мере заданное разделение от пиковой длины волны спектра 906. В качестве другого примера, пиковая длина волны спектра 904 может иметь по меньшей мере заданное разделение от пиковой длины волны спектра 906.
[0088] В некоторых вариантах реализации разделение может быть определено на основе количества света в перекрывающихся диапазонах длин волн. Левый край 910' цветового канала 910 может соответствовать конкретной длине волны диапазона длин волн цветового канала 910. Может быть желательно обеспечить незначительное распространение спектров 902 или 904 в цветовой канал 910. В некоторых вариантах реализации разделение между соответствующими флуоресцентными красителями может быть определено таким образом, чтобы спектр 902 или 904 включал в себя не более заданного количества света с длиной волны, соответствующей краю 910' или превышающей его. Заданное количество может быть определено как абсолютное число (например, в виде верхнего порога количества излучаемого света или его интенсивности) или как относительное число (например, в виде доли от общего количества флуоресцентного света, излучаемого красителем.
[0089] Синие красители и их варианты, описанные со ссылкой на ФИГ. 9-16, более подробно описаны ниже.
[0090] На ФИГ. 10 представлена диаграмма рассеяния 1000, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 9. Количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 1002 соответствует существенному излучению в синем канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 1004 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 1006 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 1008 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Каждое из излучений 1002-1008 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 1002 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 1004 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 1006 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 1008 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 1002-1008 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малое малые перекрестные помехи.
[0091] На ФИГ. 11 представлена диаграмма рассеяния 1100, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием другого синего и зеленого красителей. Количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 1102 соответствует существенному излучению в синем канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 1104 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 1106 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 1108 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Каждое из излучений 1102-1108 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 1102 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 1104 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 1106 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 1108 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 1102-1108 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[0092] На ФИГ. 12 представлена диаграмма рассеяния 1200, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием еще одного синего и зеленого красителей. Количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 1202 соответствует существенному излучению в синем канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 1204 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 1206 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 1208 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Каждое из излучений 1202-1208 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 1202 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 1204 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 1206 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 1208 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 1202-1208 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[0093] Можно использовать различные цветовые фильтры. Можно выбрать конструкцию фильтра для одновременного сбора данных. В некоторых вариантах реализации может использоваться полоса пропускания зеленого фильтра с длиной волны около 583-660 нм. Например, это может быть сдвиг по сравнению с другой зеленой полосой пропускания, такой как 550-637 нм.
[0094] На ФИГ. 13 проиллюстрирована другая схема 1300, на которой продемонстрированы спектры излучения альтернативного синего и зеленого красителей и соответствующих диапазонов фильтров в соответствии с примером варианта реализации. Флуоресценцию измеряют относительно вертикальной оси, и на горизонтальной оси указана длина волны. Спектры 1302 и 1304 можно охарактеризовать как спектры синих красителей, а спектр 1306 можно охарактеризовать как спектр зеленого красителя. Диаграмма 1300 включает в себя цветовые каналы 1308 и 1310. Цветовой канал 1308 может быть связан с фильтром синего излучения и может контрастировать с предыдущим фильтром 1308'. Например, цветовой канал 1308 можно рассматривать как синий цветовой канал. Цветовой канал 1310 может быть связан с фильтром зеленого излучения. Например, цветовой канал 1310 можно рассматривать как зеленый цветовой канал. Каждый из спектров 1302-1306 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, спектр 1302 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, спектр 1304 может соответствовать обнаружению аденина. Например, спектр 1306 может соответствовать обнаружению тимина или аденина.
[0095] На ФИГ. 14 представлена диаграмма рассеяния 1400, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 13, используя диапазон первого фильтра. Например, диапазон первого фильтра может соответствовать предыдущему фильтру 1308' на ФИГ. 13. Количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 1402 соответствует существенному излучению как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 1404 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 1406 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 1408 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Каждое из излучений 1402-1408 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 1402 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 1404 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 1406 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 1408 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 1402-1408 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[0096] На ФИГ. 15 представлена диаграмма рассеяния 1500, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 13, с использованием диапазона второго фильтра. Например, диапазон второго фильтра может соответствовать цветовому каналу 1308' на ФИГ. 13. Количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 1502 соответствует существенному излучению как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 1504 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 1506 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 1508 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Каждое из излучений 1502-1508 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 1502 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 1504 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 1506 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 1508 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 1502-1508 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[0097] Разделение может быть определено одним или более способами. В некоторых вариантах реализации разделение излучения с длиной волны может быть определено на основе количества излучаемого света из спектра 1304 ниже длины волны, связанной с цветовым каналом 1310. Разделение длин волн излучения может быть определено между флуоресцентными красителями так, что спектр излучения одного из флуоресцентных красителей включает не более заданного количества света с длиной волны (например, ближайшей граничной длиной волны или характерной длиной волны), связанной с другим флуоресцентным красителем, или выше ее. Например, это количество может указывать на то, что количество X (например, процентная доля суммарной флуоресценции) спектра 1304 находится ниже меньшей длины волны цветового канала 1310 (например, нижний предел данного цветового канала). В некоторых вариантах реализации число X в предыдущем примере может быть любым подходящим числом, таким как диапазон значений. Например, диапазон может составлять около 0-10% от диапазона флуоресцентного света. В качестве другого примера, диапазон может составлять около 0,5-5% от флуоресцентного света. В качестве другого примера, диапазон может составлять около 0,1-1% от флуоресцентного света. В некоторых вариантах реализации разделение может быть определено на основе разделения средней или пиковой длины волны между спектром 1306 и любым из спектров 1302 или 1304. Например, спектры 1304 и 1306 могут рассматриваться раздельно, если средняя длина волны спектра 1304 (например, средняя длина волны флуоресцентного излучения) или пиковая длина волны спектра 1304 (например, длина волны, при которой интенсивность флуоресцентного света является наибольшей) разделена со средней или пиковой длины волны спектра 1306 более чем на заданную величину. Заданная величина может иметь абсолютное значение. Например, средние или пиковые длины волн могут быть разделены по меньшей мере на около 50-100 нм, например, около 70 нм. Заданная величина может иметь относительное значение. Например, средние или пиковые длины волн могут быть разделены по меньшей мере на около 5-20 процентов от средней или пиковой длины волны, например на около 13 процентов от меньшей или большей средней или пиковой длины волны.
[0098] В заключение можно сделать вывод о том, что с помощью улучшений, описанных в данном документе, можно добиться получения многоцветных изображений, что ранее считалось чрезвычайно сложным и с очень небольшим шансом на успех. Ниже будут описаны некоторые дополнительные примеры улучшений.
[0099] На ФИГ. 16 представлена диаграмма рассеяния 1600, иллюстрирующая анализ с двухканальным секвенированием, имеющий одновременную мультиплексную визуализацию с использованием синего и зеленого красителей, изображенных на ФИГ. 9, и диапазона второго фильтра, изображенного на ФИГ. 13. Количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 1602 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 1604 соответствует существенному излучению в синем канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 1606 соответствует существенным излучениям как в зеленом, так и в синем каналах. Излучение 1608 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в зеленом, так и в синем каналах. Каждое из излучений 1602-1608 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 1602 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 1604 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 1606 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 1608 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 1602-1608 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[00100] Каждое из вышеуказанных излучений 1602-1608 представляет собой распределение интенсивностей, собранных на одном из двух детекторов 146 и 154 (ФИГ. 2) с течением времени. Как проиллюстрировано на графиках спектров излучения на ФИГ. 13, азотистое основание «C» связано с синим красителем и, следовательно, излучение 1604 имеет высокий уровень синего освещения и низкий уровень зеленого освещения. Это представляет собой способ определения азотистого основания «C». Азотистое основание «Т» определено посредством излучения 1602, имеющего большой уровень зеленого освещения и низкий уровень синего освещения; это представляет собой способ определения азотистого основания «Т».
[00101] Азотистое основание «A», определяемое по излучению 1606, имеет смесь высоких уровней освещения синего и зеленого цвета. Следует отметить, что оба спектра 1304 и 1306 (ФИГ. 13) соответствуют азотистому основанию «A». Аналогичным образом, азотистое основание «G» определяют по излучению 1608, имеющему низкие уровни синего и зеленого освещения.
[00102] Излучения 1602-1608, имея распределения относительно соответствующих средних значений со значительным объемом распространения, в основном не демонстрируют значительного количества перекрестных помех. Таким образом, каждое из азотистых оснований может быть легко определено.
[00103] На ФИГ. 17 представлена схема, изображающая параметры для двухканального анализа секвенирования, изображенного на ФИГ. 16. Показатель 1700 относится к сводке прогона. Показатель 1702 относится к первому чтению, а показатель 1704 относится ко второму чтению.
[00104] На ФИГ. 18 представлена схема, изображающая временную шкалу 1800 примера последовательных этапов, которые могут вовлечены в получение и анализ мультиплексированных флуоресцентных изображений как часть улучшенных методов, описанных в данном документе. Временная шкала 1800 может использоваться с одним или более примерами, описанными в других разделах данного документа. Ход времени измеряют относительно горизонтальной оси, а соответствующие операции указывают вдоль вертикальной оси.
[00105] Как схематически проиллюстрировано, многоцветное изображение 1802 может включать в себя один или более временных блоков 1804 визуализации, и один или более временных блоков 1806, относящихся к камере. В некоторых вариантах реализации временной блок 1804 визуализации может соответствовать времени, необходимому для выполнения системой разогревания лазерного диода, размещению для одного или более воздействий и времени экспозиции для воздействия(-ий). После временного блока 1804 визуализации может следовать временной блок 1806, относящийся к камере. Например, временной блок 1806, относящийся к камере, может включать в себя служебные данные, время отклика камеры, относящееся к отдельному(-ым) снимку(ам) камеры, и время передачи данных. После временного блока 1806, относящегося к камере, может следовать еще один из временных блоков 1804 визуализации. Таким образом, многоцветный захват изображения 1802 может включать в себя последовательность, чередующуюся между временным блоком 1804 изображения и временным блоком 1806, относящимся к камере. Например, это может включать введение красителя, время экспозиции и снимок изображения камерой.
[00106] На ФИГ. 19 представлена схема, изображающая временную шкалу 1900 примера последовательных этапов, которые могут вовлечены в получение и анализ мультиплексированных флуоресцентных изображений как часть улучшенных методов, описанных в данном документе. Как проиллюстрировано на ФИГ. 19, временная шкала 1900 включает в себя процесс 1910 автофокусировки, процесс 1920 получения многоцветного набора изображений, а также этап и процесса 1930 установления. Горизонтальная ось представляет собой прошедшее время. Некоторые примеры ниже также будут приведены только в качестве иллюстрации на ФИГ. 2.
[00107] Процесс автофокусировки 1910 запускает временную шкалу 1900. Во-первых, лазерные диоды разогревают и генерируют воздействие автофокусировки. На основании служебных данных камеры (т.е. детектора), времени отклика и времени передачи данных определяют, что линза 134 объектива перемещается вдоль ее оси (т.е. направления z) для установления положения линзы 134 объектива, в котором сфокусированный пучок освещения попадает в требуемую плоскость объекта относительно проточной кюветы 136.
[00108] После установки данного положения линзы 134 объектива может начаться процесс получения набора многоцветных изображений 520. Например, это может включать захват изображения(изображений) с помощью синего и зеленого цветовых каналов, или красного и зеленого цветовых каналов, или другого выбора цветовых каналов. Для каждого из детекторов синего и зеленого цвета 146 и 154 после разогревания лазерных диодов пробу освещают в течение заданного времени для флуоресцирования одного или более красителей.
[00109] Детекторы 146 и 154 изображений получают мультиплексированное флуоресцентное изображение, и полученные данные могут передаваться в систему обработки данных. Как изображено на ФИГ. 19, данный процесс повторяют шесть раз для обоих детекторов для получения шести изображений на каждом детекторе. В некоторых вариантах реализации процесс получения набора изображений может повторяться несколько раз, например, два, три, четыре, пять, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать и выше, в зависимости от варианта реализации. Переданные данные можно использовать при реконструкции ДНК последовательности. Реконструкция и/или определение генетической последовательности (например, ДНК последовательности) может происходить после захвата всех изображений и после того, когда нуклеотидные основания были названы.
[00110] После получения многоцветных (например, синего и зеленого) изображений и их данных другая часть проточной кюветы 136 перемещается в положение для визуализации. В данном случае, когда проточная кювета 136 находится на одном этапе, этап перемещается по чипу, который может быть определен подразделением проточной кюветы 136, а затем происходит этап и процесс 1930 установления, благодаря чему проточная кювета 136 и любые другие механические составляющие становятся по существу неподвижными перед выполнением следующего процесса визуализации. То есть проточную кювету 136 продвигают (ступенчато) на определенном этапе, и после перемещения проточной кюветы 136 некоторое время оставляют для установления жидкости в проточной кювете 136.
[00111] На ФИГ. 20 представлена схема, изображающая временную шкалу 2000 примера последовательных этапов, которые могут вовлечены в получение и анализ мультиплексированных флуоресцентных изображений как часть улучшенных методов, описанных в данном документе. Как проиллюстрировано на ФИГ. 20, временная шкала 2000 включает в себя процесс 2010 автофокусировки, процесс 2020 получения многоцветного (например, синего и зеленого) набора изображений, а также этап и процесс 2030 установления. Горизонтальная ось представляет собой прошедшее время. Некоторые примеры ниже также будут приведены только в качестве иллюстрации на ФИГ. 2.
[00112] Процесс автофокусировки 2010 запускает временную шкалу 2000. Во-первых, лазерные диоды разогревают и генерируют воздействие автофокусировки. На основании служебных данных камеры (т.е. детектора), времени отклика и времени передачи данных определяют, что линза 134 объектива перемещается вдоль ее оси (т.е. направления z) для установления положения линзы 134 объектива, в котором сфокусированный пучок освещения попадает в требуемую плоскость объекта относительно проточной кюветы 136.
[00113] После установки данного положения линзы 134 объектива может начаться процесс получения набора многоцветных изображений 2020. Для каждого из детекторов синего и зеленого цвета 146 и 154 после разогревания лазерных диодов пробу освещают в течение заданного времени для флуоресцирования одного или более красителей. В вариантах реализации, в которых применяют микроскопию структурированного освещения (SIM), для изменения фазы одной или более интерференционных полос на этапе 2040 можно перемещать решетку или другой компонент SIM. Одна или более интерференционных полос могут происходить в соответствии с некоторой периодичностью. Эти интерференционные полосы перемещают, чтобы обеспечить освещение другой части пробы при одновременном блокировании освещения других. Детекторы 146 и 154 изображений получают мультиплексированное флуоресцентное изображение, и полученные данные могут передаваться в систему обработки данных. Как изображено на ФИГ. 20, данный процесс повторяют шесть раз для обоих детекторов для получения шести изображений на каждом детекторе. В некоторых вариантах реализации процесс получения набора изображений может повторяться несколько раз, например, два, три, четыре, пять, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать и выше, в зависимости от варианта реализации. В процессе этих воздействий и захвата переданные данные используют в реконструкции последовательности ДНК.
[00114] После получения многоцветных изображений и их данных другая часть проточной кюветы 136 перемещается в положение для визуализации. В данном случае, когда проточная кювета 136 находится на одном этапе, этап перемещается по чипу, который может быть определен подразделением проточной кюветы 136, а затем происходит этап и процесс 2030 установления, благодаря чему проточная кювета 136 и любые другие механические составляющие становятся по существу неподвижными перед выполнением следующего процесса визуализации. То есть проточную кювету 136 продвигают (ступенчато) на определенном этапе, и после перемещения проточной кюветы 136 некоторое время оставляют для установления жидкости в проточной кювете 136.
[00115] На ФИГ. 21 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ 2100 выполнения операции секвенирования в соответствии с методами, описанными в данном документе. Способ 2100 может быть выполнен с применением описанной в данном документе системы 100 освещения. Способ 2100 может включать большее или меньшее количество операций, чем проиллюстрировано. Две или более операций способа 2100 могут выполняться в другом порядке, если не указано иное. Некоторые аспекты других примеров, описанных в данном документе, будут приведены в иллюстративных целях.
[00116] На этапе 2102 получают пробу, содержащую первый нуклеотид и второй нуклеотид. Например, такие нуклеотиды могут быть частью материала пробы в проточной кювете 136, изображенной на ФИГ. 2.
[00117] На этапе 2104 пробу приводят в контакт с первым флуоресцентным красителем и вторым флуоресцентным красителем. Первый флуоресцентный краситель излучает первый излучаемый свет в первом диапазоне длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, а второй флуоресцентный краситель излучает второй излучаемый свет во втором диапазоне длин волн в ответ на второй возбуждающий свет. Например, первый флуоресцентный краситель может включать синий краситель со спектром 1304, проиллюстрированным на ФИГ. 13, а второй краситель может представлять собой зеленый краситель со спектром 1306, проиллюстрированным на ФИГ. 13.
[00118] На этапе 2106 одновременно собирают мультиплексированный флуоресцентный свет. Мультиплексный флуоресцентный свет содержит по меньшей мере первый излучаемый свет и второй излучаемый свет. Первый излучаемый свет может представлять собой первый цветовой канал, соответствующий первому диапазону длин волн, а второй излучаемый свет может представлять собой второй цветовой канал, соответствующий второму диапазону длин волн. Например, могут быть использованы синий и зеленый цветовые каналы. В другом примере, могут быть использованы синий, зеленый и красный цветовые каналы. Пиковое излучение одного красителя (например, аналогичное синему красителю) должно иметь достаточное разделение в световом спектре от пика другого излучения красителя (например, зеленого красителя), чтобы излучаемый свет с меньшей длиной волны (например, синий) не выходил за пределы в другой канал обнаружения излучения (например, зеленый). Это может привести к тому, что иногда называют перекрестными помехами, когда излучаемый свет (например, хвост спектра) обнаруживается детектором другого цветового канала. В случаях, когда спектр имеет относительно длинный хвост, начальная точка другого фильтра излучения может быть перемещена для устранения или уменьшения величины перекрестных помех.
[00119] На этапе 2108 можно определить первый и второй нуклеотиды. Первый нуклеотид может быть определен на основе первой полосы длин волн первого цветового канала, а второй нуклеотид может быть определен на основе второй полосы длин волн второго цветового канала.
[00120] На ФИГ. 22 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ 2200 выполнения операции секвенирования в соответствии с методами, описанными в данном документе. Способ 2200 может быть выполнен с применением описанной в данном документе системы 100 освещения. Способ 2200 может включать большее или меньшее количество операций, чем проиллюстрировано. Две или более операций способа 2200 могут выполняться в другом порядке, если не указано иное. Некоторые аспекты других примеров, описанных в данном документе, будут приведены в иллюстративных целях.
[00121] На этапе 2202 может быть захвачено мультиплексированное флуоресцентное изображение. В некоторых вариантах реализации это можно сделать на основе одновременного освещения окрашенной пробы с множеством типов освещающего света и захвата изображений от излучаемого света более чем в одном цветном канале (включая, без ограничений, синие и зеленые цветовые каналы). Например, временной(-ые) блок(-и) 1804 визуализации на ФИГ. 18 может (могут) соответствовать текущей(-ым) операции(-ям).
[00122] На этапе 2204 может выполняться одна или более операций, связанных с захватом изображения. В некоторых вариантах реализации сюда могут входить время отклика камеры, передача данных и/или служебные операции. Например, относящийся к камере временной блок 1806 может соответствовать настоящей(-ым) операции(-ям).
[00123] На этапе 2206 могут выполняться ноль или более повторений операций на этапах 2202 и 2204. В некоторых вариантах реализации операции на этапах 2202 и 2204 могут выполнять попеременно во множестве циклов. Например, для получения шести изображений на каждом детекторе можно выполнить шесть раз (см., например, ФИГ. 18).
[00124] На этапе 2208 нуклеотиды можно определить на основе мультиплексированного(-ых) флуоресцентного(-ых) изображения(-й). Например, каждый нуклеотид может быть определен на основании соответствующего цветового канала.
[00125] На ФИГ. 23 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ 2300 выполнения операции секвенирования в соответствии с методами, описанными в данном документе. Способ 2300 может быть выполнен с применением описанной в данном документе системы 100 освещения. Способ 2300 может включать большее или меньшее количество операций, чем проиллюстрировано. Две или более операций способа 2300 могут выполняться в другом порядке, если не указано иное. Некоторые аспекты других примеров, описанных в данном документе, будут приведены в иллюстративных целях.
[00126] На этапе 2302 можно инициировать процесс автофокусировки. В некоторых вариантах реализации инициируют процесс 2010 автофокусировки (ФИГ. 20).
[00127] На этапе 2304 может быть разогрет один или более лазерных диодов. В некоторых вариантах реализации это представляет собой часть процесса автофокусировки.
[00128] На этапе 2306 может быть выполнено воздействие автофокусировки. В некоторых вариантах реализации это представляет собой часть процесса автофокусировки.
[00129] На этапе 2308 может быть вычислено положение. В ряде вариантов реализации для определения необходимости перемещения линзы объектива может использоваться определение. Например, может быть определено, насколько следует перемещать линзу объектива вдоль направления z. Это может быть частью процесса автофокусировки.
[00130] На этапе 2310 линза объектива могут перемещать. В некоторых вариантах реализации это может представлять собой часть процесса автофокусировки.
[00131] На этапе 2312 может быть начато получение многоцветных изображений. В ряде вариантов реализации для этого могут применять получение более чем одного мультиплексного флуоресцентного изображения.
[00132] На этапе 2314 может быть разогрет один или более лазерных диодов. В некоторых вариантах реализации это представляет собой часть процесса получения многоцветного изображения.
[00133] На этапе 2316 можно определить количество воздействий. В некоторых вариантах реализации это представляет собой часть процесса получения многоцветного изображения.
[00134] На этапе 2318 воздействие(-я) может(могут) быть захвачено(-ы). В некоторых вариантах реализации это может быть выполнено с использованием отдельных детекторов для каждого из множества цветовых каналов. Например, это представляет собой часть процесса получения многоцветных изображений.
[00135] На этапе 2320 можно перемещать одну или более интерференционных полос. В некоторых реализациях применяют SIM, а решетка или другой компонент SIM могут перемещать. Например, перемещение может быть выполнено в соответствии с некоторой периодичностью. Это может быть частью процесса получения многоцветного изображения. Эта операция может быть опущена в варианте реализации, не включающем SIM.
[00136] На этапе 2322 может быть инициирован этап и процесс установления.
[00137] На этапе 2324 можно осуществить точное перемещение в направлении z. Это может быть частью этапа и процесса установления.
[00138] На этапе 2326 можно осуществить точное перемещение в направлении y. Это может включать в себя индивидуальные операции ступенчатого изменения (например, перемещение картриджа или другого держателя пробы) и установление (например, что позволяет носителю и его содержимому оставаться таким, чтобы исключить или свести к минимуму воздействие движения на следующий захват).
[00139] На этапе 2328 может быть выполнена передача данных. В некоторых вариантах реализации для анализа может быть передано одно или более мультиплексированных флуоресцентных изображений. Например, анализ может быть выполнен для определения нуклеотидов в пробе.
[00140] На ФИГ. 24 представлена диаграмма рассеяния 2400, иллюстрирующая пригодность полностью функционализированного нуклеотида, меченного красителем I-4, описанным в данном документе, для применения в анализе с двухканальным секвенированием. Количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на горизонтальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на вертикальной оси. Излучение 2402 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 2404 соответствует существенному излучению в синем канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 2406 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 2408 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Каждое из излучений 2402-2408 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 2402 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 2404 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 2406 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 2408 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 2402-2408 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[00141] На ФИГ. 25 представлена диаграмма рассеяния 2500, иллюстрирующая пригодность полностью функционализированного нуклеотида, меченного красителем I-5, описанным в данном документе, для применения в анализе с двухканальным секвенированием. Количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на горизонтальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на вертикальной оси. Излучение 2502 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 2504 соответствует существенному излучению в синем канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 2506 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 2508 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Каждое из излучений 2502-2508 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 2502 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 2504 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 2506 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 2508 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 2502-2508 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
[00142] На ФИГ. 26 представлена диаграмма рассеяния 2600, иллюстрирующая пригодность полностью функционализированного нуклеотида, меченного красителем I-6, описанным в данном документе, для применения в анализе с двухканальным секвенированием. Количество излучаемого света, обнаруженного в зеленом канале, указано на вертикальной оси, а количество излучаемого света, обнаруженного в синем канале, указано на горизонтальной оси. Излучение 2602 соответствует существенному излучению в зеленом канале и небольшому излучению или его отсутствию в синем канале. Излучение 2604 соответствует существенному излучению в синем канале и небольшому излучению или его отсутствию в зеленом канале. Излучение 2606 соответствует существенным излучениям как в синем, так и в зеленом каналах. Излучение 2608 соответствует небольшому излучению или его отсутствию как в синем, так и в зеленом каналах. Каждое из излучений 2602-2608 может соответствовать обнаружению соответствующего нуклеотида. Например, излучение 2602 может соответствовать обнаружению тимина. Например, излучение 2604 может соответствовать обнаружению цитозина. Например, излучение 2606 может соответствовать обнаружению аденина. Например, излучение 2608 может соответствовать обнаружению гуанина. При одновременной визуализации в настоящем примере излучения 2602-2608 относительно разделены друг с другом и имеют минимальное или пренебрежимо малые перекрестные помехи.
III. Примеры флуоресцентных красителей
A. Примеры синих красителей
[00143] Молекулы флуоресцентного красителя с улучшенными флуоресцентными свойствами, такими как подходящая интенсивность, форма и максимум длины волны флуоресценции, могут повышать скорость и точность секвенирования нуклеиновых кислот. Сильные сигналы флуоресценции особенно важны при проведении измерений в биологических буферах на водной основе и при более высоких температурах, поскольку в таких условиях интенсивность флуоресценции большинства красителей значительно ниже. Более того, природа основания, к которому прикреплен краситель, также влияет на максимум флуоресценции, интенсивность флуоресценции и другие спектральные свойства красителя. Специфичные для последовательности взаимодействия между азотистыми основаниями и флуоресцентными красителями могут быть оптимизированы посредством специфического конструирования флуоресцентных красителей. Оптимизация структуры флуоресцентных красителей может повысить эффективность включения нуклеотидов, снизить уровень ошибок секвенирования и снизить использование реагентов и, следовательно, затраты на секвенирование нуклеиновых кислот.
[00144] Некоторые оптические и технические разработки уже привели к значительному улучшению качества изображения, но в конечном счете были ограничены низким оптическим разрешением. По существу оптическое разрешение световой микроскопии ограничено объектами, расположенными на расстоянии около половины длины волны используемого света. С практической точки зрения световая микроскопия может разрешить только находящиеся на достаточно большом расстоянии друг от друга объекты (по меньшей мере от 200 до 350 нм). Одним из способов улучшения разрешения изображения и увеличения числа разрешаемых объектов на единицу площади поверхности является применение возбуждающего света меньшей длины волны. Например, если укоротить длину волны света на Δλ~ 100 нм с помощью той же оптики, разрешение будет лучше (около Δ 50 нм / (около 15%)), будет зафиксировано менее искаженное изображение, а плотность объектов на распознаваемой области будет увеличена около на 35%.
[00145] В определенных способах секвенирования нуклеиновых кислот используют лазерное излучение для возбуждения и обнаружения меченных красителем нуклеотидов. В этих инструментах используют свет с большей длиной волны, например красные лазеры, вместе с соответствующими красителями, которые возбуждаются при 660 нм. Для обнаружения более плотно упакованных кластеров секвенирования нуклеиновых кислот с сохранением подходящего разрешения можно применять источник синего света с более короткой длиной волны (450-460 нм). В этом случае оптическое разрешение может быть ограничено не длиной волны излучения более длинноволновых красных флуоресцентных красителей, а скорее излучением красителей, возбуждаемых источником света с самой длинной длиной волны, например, зеленым лазерным светом с длиной волны при 532 нм.
Кумариновые красители, замещенные экзоциклическим амином
[00146] Ниже приведены примеры кумариновых производных, замещенных экзоциклическим амином. Соединения могут быть пригодны в качестве флуоресцентных меток, в частности, для мечения нуклеотидов в областях применения секвенирования нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах красители поглощают свет с короткой длиной волны, оптимально на длине волны 450-460 нм и, в частности имеют преимущества в ситуациях, когда используются источники возбуждения с синей длиной волны, имеющие длину волны, равную 450-460 нм. Возбуждение на синей длине волны позволяет обнаруживать и разрешать более высокую плотность элементов на единицу площади из-за более короткой длины волны излучения флуоресценции. При применении таких красителей в конъюгатах с нуклеотидами можно наблюдать улучшения по длине, интенсивности, точности и качеству прочтений секвенирования, полученных в ходе способов секвенирования нуклеиновых кислот.
[00147] Некоторые примеры, приведенные в данном документе, относятся кумариновым соединениям, замещенным экзоциклическим амином, особенно пригодным для способов обнаружения флуоресценции и секвенирования путем синтеза. В данном документе описаны красители и их производные структуры формулы (I), а также их соли.
(I)
[00148] В некоторых аспектах X представляет собой O. В некоторых аспектах X представляет собой S. В некоторых аспектах X представляет собой Se. В некоторых аспектах X представляет собой NRn, где Rn представляет собой H, C1-6 алкил или C6-10 арил, и в одном аспекте, Rn представляет собой H. В некоторых дополнительных вариантах реализации, когда m равно 1; R5 представляет собой -CO2H; каждый из R, R1, R2, R4 представляет собой H; кольцо A представляет собой ; затем X представляет собой O, Se или NRn. В некоторых дополнительных вариантах реализации, когда n равно 0; кольцо A представляет собой , или ; каждый из R, R1, R2, R4 представляет собой H; X представляет собой O; тогда m равно 1, 2, 3 или 4. В некоторых аспектах, когда n равно 0, тогда m равно 1, 2, 3 или 4, и по меньшей мере один R5 представляет собой -CO2H. В некоторых других аспектах, когда n равно 1 и R3 представляет собой -CO2H, тогда m равно 0 или R5 не представляет собой -CO2H.
[00149] В некоторых аспектах R представляет собой H, галоген, -CO2H, амино, -OH, C-амидо, N-амидо, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. В одном аспекте R представляет собой H. В другом аспекте R представляет собой галоген. В некоторых аспектах R представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил. В некоторых аспектах R представляет собой -CO2H. В некоторых аспектах R представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R представляет собой -SO2NRaRb, где Ra и Rb независимо представляет собой H или необязательно замещенный C1-6 алкил. В одном аспекте R представляет собой -SO2NH2. В некотором аспекте, R не представляет собой -CN.
[00150] В некоторых аспектах R1 представляет собой H. В некоторых аспектах R1 представляет собой галоген. В некоторых аспектах R1 представляет собой -CN. В некоторых аспектах R1 представляет собой C1-6 алкил. В некоторых аспектах R1 представляет собой -SO2NRaRb, где Ra и Rb независимо представляет собой H или необязательно замещенный C1-6 алкил. В одном аспекте R1 представляет собой -SO2NH2. В некотором аспекте, R1 не представляет собой -CN.
[00151] В некоторых аспектах R2 представляет собой H. В некоторых аспектах R2 представляет собой галоген. В некотором аспекте, R2 представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R2 представляет собой необязательно замещенный алкил, например C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, R2 представляет собой C1-4 алкил, необязательно замещенный -CO2H или -SO3H.
[00152] В некоторых аспектах R4 представляет собой H. В некоторых аспектах R4 представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R4 представляет собой необязательно замещенный алкил, например C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, R4 представляет собой C1-4 алкил, необязательно замещенный -CO2H или -SO3H.
[00153] В некоторых аспектах кольцо A представляет собой 3-7-членное единичное гетероциклическое кольцо. В некоторых дополнительных вариантах реализации, 3-7-членное единичное гетероциклическое кольцо содержит один атом азота. В некоторых аспектах кольцо A представляет собой . В одном таком варианте реализации кольцо A представляет собой . В некоторых аспектах кольцо A представляет собой . В одном таком варианте реализации кольцо A представляет собой . В некоторых аспектах кольцо A представляет собой . В одном таком варианте реализации кольцо A представляет собой . В некоторых аспектах кольца A, описанного в данном документе, n равно 0. В некоторых аспектах кольца A, описанного в данном документе, n равно 1. В некоторых аспектах кольца A, описанного в данном документе, n равно 2 или 3. В некоторых аспектах каждый R3 независимо представляет собой -CO2H, -SO3H, C1-4 алкил, необязательно замещенный -CO2H или -SO3H, -(CH2)p-CO2Rc или необязательно замещенный C1-6 алкил. В некоторых аспектах R3 представляет собой метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил или гексил. В других аспектах R3 представляет собой замещенный С1-4 алкил. В некоторых аспектах R3 представляет собой C1-4 алкил или C2-6 алкил, замещенный -CO2H или -SO3H. В некоторых дополнительных вариантах реализации, n равно 1, и R3 представляет собой -CO2H или -(CH2)p-CO2Rc. В некоторых дополнительных вариантах реализации, Rc представляет собой H или C1-4 алкил.
[00154] Бензольное кольцо фрагмента формулы (I) необязательно замещено в любом одном, двух, трех или четырех положениях заместителем, показанным как R5. Когда m равно нулю, бензольное кольцо не замещено. Когда m равно более чем 1, каждый R5 могут быть одними и теми же или разными. В некоторых аспектах m равно 0. В других аспектах m равно 1. В других аспектах m равно 2. В некоторых аспектах m равно 1, 2 или 3, и каждый R5 независимо представляет собой галоген, -CN, -CO2Rf, амино, -OH, -SO3H, -SO2NRaRb или необязательно замещенный C1-6 алкил, где Rf представляет собой H или C1-4 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, R5 представляет собой -CO2H, -SO3H, -SO2NH2 или C1-6 алкил, замещенный -CO2H, -SO3H или -SO2NH2. В некоторых дополнительных вариантах реализации, R5 представляет собой -(CH2)xCOOH, где x равно 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах реализации, когда каждый из R, R1, R2, R4 представляет собой H; n равно 0; m равно 1; тогда замещен в следующем положении: или . В одном варианте реализации R5 представляет собой -CO2H.
[00155] Конкретные примеры соединения формулы (I) включают такие, где X представляет собой O, S или NH; каждый R, R1, R2 и R4 представляет собой H; кольцо A представляет собой или ; n равно 0 или 1; R3 представляет собой -CO2H или -(CH2)p-CO2Rc; p равно 1, 2, 3 или 4; Rc представляет собой H или C1-6 алкил; m равно 0 или 1; и R5 представляет собой галоген, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb или C1-6 алкил, замещенный -SO3H или -SO2NRaRb. В некоторых вариантах реализации, хотя бы один или оба Ra и Rb представляет собой H или C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, Rf представляет собой H или C1-4 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, когда m равно 0, тогда n равно 1; или когда n равно 0, тогда m равно 1. В одном варианте реализации оба m и n равны 1.
[00156] Конкретные примеры соединения формулы (I) включают такие, где X представляет собой O, S или NH; каждый R, R1, R2 и R4 представляет собой H; кольцо A представляет собой или ; n равно 0 или 1; R3 представляет собой -CO2H или -(CH2)p-CO2Rc; p равно 1, 2, 3 или 4; Rc представляет собой H или C1-6 алкил; m равно 0 или 1; и R5 представляет собой галоген, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb или C1-6 алкил, замещенный -SO3H или -SO2NRaRb. В некоторых вариантах реализации, хотя бы один или оба Ra и Rb представляет собой H или C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, Rf представляет собой H или C1-4 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, когда m равно 0, тогда n равно 1; или когда n равно 0, тогда m равно 1. В одном варианте реализации оба m и n равны 1.
[00157] Конкретные примеры соединения формулы (I) включают такие, где X представляет собой O, S или NH; каждый R, R1, R2 и R4 представляет собой H; кольцо A представляет собой или ; n равно 0 или 1; R3 представляет собой -CO2H или -(CH2)p-CO2Rc; p равно 1, 2, 3 или 4; Rc представляет собой H или C1-6 алкил; m равно 0 или 1; и R5 представляет собой галоген, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb или C1-6 алкил, замещенный -SO3H или -SO2NRaRb. В некоторых вариантах реализации, хотя бы один или оба Ra и Rb представляет собой H или C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, Rf представляет собой H или C1-4 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, когда m равно 0, тогда n равно 1; или когда n равно 0, тогда m равно 1. В одном варианте реализации оба m и n равны 1.
[00158] Конкретные примеры кумариновых красителей, замещенных экзоциклическим амином, включают в себя:
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, и их соли.
[00159] Особенно пригодным соединением является нуклеотид или олигонуклеотид, меченый красителем, как описано в данном документе. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может быть присоединен к соединению красителя, описанному в данном документе, посредством карбоксильной или алкилкарбоксильной группы с образованием амида или алкил-амида. Например, соединение красителя, описанное в данном документе, присоединено к нуклеотиду или олигонуклеотиду посредством R3 или R5 формулы (I). В некоторых вариантах реализации R3 формулы (I) представляет собой -CO2H или -(CH2)p-CO2H, а присоединение образует амид с помощью группы - CO2H. В некоторых вариантах реализации R5 формулы (I) представляет собой -CO2H, а присоединение образует амид с помощью группы - CO2H. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к C5-положению пиримидинового основания или C7-положению 7-деазпуринового основания посредством линкерного фрагмента.
[00160] Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может также иметь блокирующую группу, ковалентно присоединенную к сахару рибозы или дезоксирибозы нуклеотида. Блокирующая группа может быть присоединена в любом положении на сахаре рибозе или дезоксирибозе. В конкретных вариантах реализации блокирующая группа находится в положении 3'OH сахара рибозы или дезоксирибозы нуклеотида.
Кумариновые красители, замещенные третичным амином
[00161] В данном документе также описаны соединения кумаринов, замещенных третичным амином, особенно пригодные для способов обнаружения флуоресценции и секвенирования путем синтеза. Варианты реализации кумариновых красителей, замещенных третичным амином, имеют отличную растворимость в воде, одновременно демонстрируя сильную флуоресценцию в воде или полярных растворителях/буферных растворах, таким образом, они пригодны для мечения нуклеотидов и применения секвенирования в водной среде. Описанные в данном документе варианты реализации относятся к красителям и их производным структуры формулы (II), и их солям.
(II)
[00162] В некоторых аспектах X представляет собой O. В некоторых аспектах X представляет собой S. В некоторых аспектах X представляет собой Se. В некоторых аспектах X представляет собой NRn, где Rn представляет собой H, C1-6 алкил или C6-10 арил, и в одном аспекте, Rn представляет собой H или фенил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, когда m равно 1, 2, 3 или 4, а один из R6 представляет собой -CO2H; каждый из R, R1, R2, R5 представляет собой H; тогда каждый из R3 и R4 независимо представляет собой C1-6 алкил, -(CH2)p-CO2Rc, -(CH2)q-C(O)NRdRe, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)t-SO2NRaRb, где Rc представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. Другими словами, когда R6 представляет собой -CO2H, ни R3 , ни R4 не содержит фрагмент -CO2H. В некоторых других вариантах реализации, когда m равно 0 или R6 не представляет собой -CO2H; каждый из R, R1, R2, R5 представляет собой H; тогда по меньшей мере один из R3 или R4 содержит -CO2H.
[00163] В некоторых аспектах R представляет собой H, галоген, -CO2H, амино, -OH, C-амидо, N-амидо, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил или необязательно замещенный гетероарил. В одном аспекте R представляет собой H. В другом аспекте R представляет собой галоген. В некоторых аспектах R представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил. В некоторых аспектах R представляет собой -CO2H. В некоторых аспектах R представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R представляет собой -SO2NRaRb, где Ra и Rb независимо представляет собой H или необязательно замещенный C1-6 алкил. В одном аспекте R представляет собой -SO2NH2. В некотором аспекте, R не представляет собой -CN.
[00164] В некоторых аспектах R1 представляет собой H. В некоторых аспектах R1 представляет собой галоген. В некоторых аспектах R1 представляет собой -CN. В некоторых аспектах R1 представляет собой C1-6 алкил. В некоторых аспектах R1 представляет собой -SO2NRaRb, где Ra и Rb независимо представляет собой H или необязательно замещенный C1-6 алкил. В одном аспекте R1 представляет собой -SO2NH2. В некотором аспекте, R1 не представляет собой -CN.
[00165] В некоторых аспектах R2 представляет собой H. В некоторых аспектах R2 представляет собой галоген. В некотором аспекте, R2 представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R2 представляет собой необязательно замещенный алкил, например C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, R2 представляет собой C1-4 алкил, необязательно замещенный -CO2H или -SO3H.
[00166] В некоторых аспектах R5 представляет собой H. В некоторых аспектах R5 представляет собой галоген. В некотором аспекте, R5 представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R2 представляет собой необязательно замещенный алкил, например C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, R5 представляет собой C1-4 алкил, необязательно замещенный -CO2H или -SO3H.
[00167] В некоторых аспектах R3 представляет собой -(CH2)p-CO2Rc. В дополнительных вариантах реализации p равно 2, 3, 4 или 5. Rc представляет собой H или C1-6 алкил, например, метил, этил, изопропил или трет-бутил. В некоторых аспектах R3 представляет собой C1-6 алкил.
[00168] В некоторых аспектах R4 представляет собой -(CH2)n-SO3H. В дополнительных вариантах реализации n равно 2, 3, 4 или 5. В некоторых аспектах R4 представляет собой C1-6 алкил.
[00169] В некоторых аспектах по меньшей мере один из R3 и R4 представляет собой C1-6 алкил. В некоторых аспектах оба R3 и R4 представляют собой C1-6 алкил. В некоторых аспектах когда R3 представляет собой -(CH2)p-CO2Rc, тогда R4 представляет собой -(CH2)n-SO3H. В некоторых аспектах оба R3 и R4 представляют собой -(CH2)p-CO2Rc.
[00170] Бензольное кольцо фрагмента формулы (II) необязательно замещено в любом одном, двух, трех или четырех положениях заместителем, изображенном как R6. Когда m равно нулю, бензольное кольцо не замещено. Когда m равно более чем 1, каждый R6 могут быть одними и теми же или разными. В некоторых аспектах m равно 0. В других аспектах m равно 1. В других аспектах m равно 2. В некоторых аспектах m равно 1, 2 или 3, и каждый R6 независимо представляет собой галоген, -CN, -CO2Rf, амино, -OH, -SO3H, -SO2NRaRb или необязательно замещенный C1-6 алкил, где Rf представляет собой H или C1-4 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, R6 представляет собой -CO2H, -SO3H, -SO2NH2 или C1-6 алкил, замещенный -CO2H, -SO3H или -SO2NH2. В некоторых дополнительных вариантах реализации, R6 представляет собой -(CH2)xCOOH, где x равно 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах реализации, когда каждый из R, R1, R2, R5 представляет собой H; R3 и R4 независимо представляет собой C1-6 алкил, -(CH2)p-CO2Rc, -(CH2)q-C(O)NRdRe, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)t-SO2NRaRb, где Rc представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил (т. e., ни R3, ни R4 не содержит -CO2H); m равно 1; тогда замещен в следующем положении: или . В одном варианте реализации R6 представляет собой -CO2H. В другом варианте реализации R6 представляет собой галоген, такой как -Cl. В еще одном варианте реализации R6 представляет собой -SO2NRaRb , где хотя бы один или оба Ra и Rb представляет собой H или C1-6 алкил.
[00171] Конкретные примеры соединения формулы (II) включают такие, где X представляет собой O, S или NH; каждый R, R1, R2 и R5 представляет собой H; R3 представляет собой -(CH2)p-CO2Rc или C1-6алкил; R4 представляет собой C1-6 алкил или -(CH2)n-SO3H; m равно 0 или 1; и R6 представляет собой -SO3H, -SO2NRaRb, галоген, -CO2H или C1-6 алкил, замещенный -CO2H, -SO3H или -SO2NRaRb. В некоторых вариантах реализации, хотя бы один или оба Ra и Rb представляет собой H или C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, когда R3 представляет собой -(CH2)p-CO2Rc, тогда R4 представляет собой -(CH2)n-SO3H или C1-6 алкил. В некоторых дополнительных вариантах реализации, оба R3 и R4 представляют собой C1-6 алкил. Когда m равно 1, тогда замещен в следующем положении: или . В одном варианте реализации R6 представляет собой -CO2H. В другом варианте реализации R6 представляет собой галоген, такой как хлор. В еще одном варианте реализации R6 представляет собой -SO2NRaRb , где хотя бы один или оба Ra и Rb представляет собой H или C1-6 алкил.
[00172] Конкретные примеры кумариновых красителей, замещенных третичным амином, включают в себя:
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, , и , и их соли.
[00173] Дополнительные кумариновые красители с замещением вторичным амином включают в себя:
, ,
, и , и их соли.
[00174] Особенно пригодным соединением является нуклеотид или олигонуклеотид, меченый красителем, как описано в данном документе. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может быть присоединен к соединению красителя, описанному в данном документе, посредством карбоксильной или алкилкарбоксильной группы с образованием амида или алкил-амида. Например, соединение красителя, описанное в данном документе, присоединено к нуклеотиду или олигонуклеотиду посредством R3, R4 или R6 формулы (II). В некоторых вариантах реализации R3 или R4 формулы (II) представляет собой -CO2H или -(CH2)p-CO2H, а присоединение образует амид с помощью группы - CO2H. В некоторых вариантах реализации R6 формулы (II) представляет собой -CO2H, а присоединение образует амид с помощью группы -CO2H. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к C5-положению пиримидинового основания или C7-положению 7-деазпуринового основания посредством линкерного фрагмента.
[00175] Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может также иметь блокирующую группу, ковалентно присоединенную к сахару рибозы или дезоксирибозы нуклеотида. Блокирующая группа может быть присоединена в любом положении на сахаре рибозе или дезоксирибозе. В конкретных вариантах реализации блокирующая группа находится в положении 3'OH сахара рибозы или дезоксирибозы нуклеотида.
[00176] Соединения, описанные в данном документе, обычно поглощают свет в области ниже 500 нм. Изложенные в данном документе соединения или нуклеотиды можно применять для обнаружения, измерения или определения биологической системы (включая, например, их процессы или компоненты). Некоторые методы, в которых можно применять соединения или нуклеотиды, включают в себя секвенирование, анализ экспрессии, анализ гибридизации, генетический анализ, анализ РНК, клеточный анализ (например, анализ связывания с клетками или анализ функции клеток) или анализ белка (например, анализ связывания с белками или анализ активности белков). Данное применение может осуществляться на автоматическом приборе для выполнения конкретного метода, таком как автоматический прибор для секвенирования. Прибор для секвенирования может содержать два лазера, работающих на различных длинах волн.
[00177] В данном документе раскрыты методы синтеза соединений по данному описанию. Красители в соответствии с настоящим описанием можно синтезировать из множества различных подходящих исходных материалов. Способы получения кумариновых красителей хорошо известны в данной области.
[00178] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники. В контексте данного документа термин «ковалентно присоединенный» или «ковалентно связанный» относится к образованию химической связи, которая характеризуется обобществленными электронными парами между атомами. Например, ковалентно присоединенное полимерное покрытие относится к полимерному покрытию, которое образует химические связи с функционализированной поверхностью подложки по сравнению с прикреплением к поверхности другими способами, например, адгезией или электростатическим взаимодействием. Следует понимать, что помимо ковалентного присоединения полимеры, которые ковалентно присоединены к поверхности, также могут быть связаны посредством средств ковалентного присоединения.
[00179] В контексте данного документа термин «галоген» означает любой из радиостабильных атомов 7 столбца периодической таблицы элементов, например, фтор, хлор, бром или иод, причем предпочтительными являются фтор и хлор.
[00180] В контексте данного документа термин «алкил» относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, которая является полностью насыщенной (т.е. не содержит двойных или тройных связей). Алкильная группа может иметь от 1 до 20 атомов углерода (при упоминании в данном документе числовой диапазон, такой как «от 1 до 20», относится к каждому целому числу в заданном диапазоне; например, «от 1 до 20 атомов углерода» означает, что алкильная группа может состоять из 1 атома углерода, 2 атомов углерода, 3 атомов углерода, и т.д. до 20 атомов углерода включительно, хотя настоящее определение также охватывает упоминание термина «алкил», в котором числовой диапазон не задан). Алкильная группа также может представлять собой алкил среднего размера, имеющий от 1 до 9 атомов углерода. Алкильная группа может также представлять собой низший алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода. Алкильная группа может быть обозначена как «C1-4 алкил» или аналогичными обозначениями. Только в качестве примера, «C1-6 алкил» указывает, что в алкильной цепи присутствует от одного до шести атомов углерода, т.е. алкильную цепь выбирают из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Типичные алкильные группы включают, без ограничений, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пентил, гексил и т.п.
[00181] В контексте данного документа термин «алкокси» относится к формуле - OR, где R представляет собой алкил, как определено выше, например «C1-9 алкокси», включая, без ограничений, метокси, этокси, н-пропокси, 1-метилэтокси (изопропокси), н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси и трет-бутокси и т.п.
[00182] В контексте данного документа термин «алкенил» относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или более двойных связей. Алкенильная группа может иметь от 2 до 20 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает случай термина «алкенил», для которого числовой диапазон не задан. Алкенильная группа также может представлять собой алкенил среднего размера, имеющий от 2 до 9 атомов углерода. Алкенильная группа также могла бы представлять собой низший алкенил, имеющий от 2 до 6 атомов углерода. Алкенильная группа может быть обозначена как «C2-6 алкенил» или аналогичными обозначениями. Только в качестве примера, «C2-6 алкенил» указывает, что в алкенильной цепи содержится от двух до шести атомов углерода, т.е. алкенильная цепь выбрана из группы, состоящей из этенила, пропен-1-ила, пропен-2-ила, пропен-3-ила, бутен-1-ила, бутен-2-ила, бутен-3-ила, бутен-4-ила, 1-метилпропен-1-ила, 2-метилпропен-1-ила, 1-этилэтен-1-ила, 2-метилпропен-3-ила, бута-1,3-диенила, бута-1,2,-диенила и бута-1,2-диен-4-ила. Типичные алкенильные группы включают, без ограничений, этенил, пропенил, бутенил, пентенил и гексенил и т.п.
[00183] В контексте данного документа термин «алкинил» относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или более тройных связей. Алкинильная группа может иметь от 2 до 20 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает случай термина «алкинил», для которого числовой диапазон не задан. Алкинильная группа также может представлять собой алкинил среднего размера, имеющий от 2 до 9 атомов углерода. Алкинильная группа также могла бы представлять собой низший алкинил, имеющий от 2 до 6 атомов углерода. Алкинильная группа может быть обозначена как «C2-6 алкинил» или аналогичными обозначениями. Только в качестве примера, «C2-6алкинил» указывает, что в алкинильной цепи содержится от двух до шести атомов углерода, т.е. алкинильная цепь выбрана из группы, состоящей из этинила, пропин-1-ила, пропин-2-ила, бутин-1-ила, бутин-3-ила, бутин-4-ила и 2-бутинила. Типичные алкинильные группы включают, без ограничений, этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил и т.п.
[00184] В контексте данного документа термин «гетероалкил» относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей один или более гетероатомов, т.е. к элементу, отличному от углерода, включая, без ограничений, азот, кислород и серу, в основной цепи. Гетероалкильная группа может иметь от 1 до 20 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает случай термина «гетероалкил», в котором числовой диапазон не задан. Гетероалкильная группа также может представлять собой гетероалкил среднего размера, имеющий от 1 до 9 атомов углерода. Гетероалкильная группа также могла бы представлять собой низший гетероалкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода. Гетероалкильная группа может быть обозначена как «C1-6гетероалкил» или аналогичными обозначениями. Гетероалкильная группа может содержать один или более гетероатомов. Только в качестве примера, «C4-6гетероалкил» указывает, что в гетероалкильной цепи присутствуют от четырех до шести атомов углерода и, кроме того, один или более гетероатомов в основной цепи.
[00185] Термин «ароматический» относится к кольцу или кольцевой системе, имеющей сопряженную пи электронную систему, и включает как карбоциклические ароматические (например, фенил), так и гетероциклические ароматические группы (например, пиридин). Данный термин включает моноциклические или конденсированные кольцевые полициклические (т.е. кольца, имеющие общие соседние пары атомов) группы, при условии что вся кольцевая система является ароматической.
[00186] В контексте данного документа термин «арил» относится к ароматическому кольцу или кольцевой системе (т.е. к двум или более конденсированным кольцам, имеющим два общих соседних атома углерода), содержащей в основной цепи кольца только углерод. Если арил представляет собой кольцевую систему, каждое кольцо в системе является ароматическим. Арильная группа может иметь от 6 до 18 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает случай термина «арил», в котором числовой диапазон не задан. В некоторых вариантах реализации арильная группа имеет от 6 до 10 атомов углерода. Арильная группа может быть обозначена как «C6-10 арил»,«C6 или C10 арил» или аналогичными обозначениями. Примеры арильных групп включают, без ограничений, фенил, нафтил, азуленил и антраценил.
[00187] «Аралкил» или «арилалкил» представляет собой арильную группу, присоединенную в качестве заместителя посредством алкиленовой группы, такой как «C7-14 аралкил» и т.п., включая, без ограничений, бензил, 2-фенилэтил, 3-фенилпропил и нафтилалкил. В некоторых случаях алкиленовая группа является низшей алкиленовой группой (т.е. C1-6 алкиленовая группа).
[00188] В контексте данного документа термин «гетероарил» относится к ароматическому кольцу или кольцевой системе (т.е. двум или более конденсированным кольцам, имеющим два общих соседних атома), которые содержат один или более гетероатомов, т. е. элемент, отличный от углерода, включая, без ограничений, азот, кислород и серу, в основной цепи кольца. Если гетероарил представляет собой кольцевую систему, каждое кольцо в системе является ароматическим. Гетероарильная группа может содержать 5-18 членов кольца (т.е. число атомов, составляющих основную цепь кольца, включая атомы углерода и гетероатомы), хотя настоящее определение также охватывает случай термина «гетероарил», в котором числовой диапазон не задан. В некоторых вариантах реализации гетероарильная группа имеет от 5 до 10 членов кольца или от 5 до 7 членов кольца. Гетероарильная группа может быть обозначена как «5-7-членный гетероарил», «5-10-членный гетероарил» или аналогичными обозначениями. Примеры гетероарильных колец включают, без ограничений, фурил, тиенил, фталазинил, пирролил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, триазолил, тиадиазолил, пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензотиазолил, индолил, изоиндолил и бензотиенил.
[00189] «Гетероаралкил» или «гетероарилалкил» представляет собой гетероарильную группу, присоединенную в качестве заместителя посредством алкиленовой группы. Примеры включают, без ограничений, 2-тиенилметил, 3-тиенилметил, фурилметил, тиенилэтил, пирролилалкил, пиридилалкил, изоксазолилалкил и имидазолилалкил. В некоторых случаях алкиленовая группа является низшей алкиленовой группой (т.е. C1-6 алкиленовая группа).
[00190] В настоящем документе термин «карбоциклил» означает неароматическое циклическое кольцо или кольцевую систему, содержащую только атомы углерода в основной цепи кольцевой системы. Когда карбоциклил представляет собой кольцевую систему, два или более кольца могут быть соединены друг с другом по типу конденсирования, образования мостика или спиросоединения. Карбоциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе не является ароматическим. Таким образом, к карбоциклилам относятся циклоалкилы, циклоалкенилы и циклоалкинилы. Карбоциклильная группа может иметь от 3 до 20 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает случай термина «карбоциклил», в котором числовой диапазон не задан. Карбоциклильная группа может также быть карбоциклилом среднего размера, имеющим от 3 до 10 атомов углерода. Карбоциклильная группа также может представлять собой карбоциклил, имеющий от 3 до 6 атомов углерода. Карбоциклильная группа может быть обозначена как «C3-6 карбоциклил» или аналогичными обозначениями. Примеры карбоциклильных колец включают, без ограничений, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, 2,3-дигидроинден, бицикл[2.2.2]октанил, адамантил и спиро[4.4]нонанил.
[00191] В контексте данного документа термин «циклоалкил» означает полностью насыщенное карбоциклильное кольцо или кольцевую систему. Примеры включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.
[00192] В контексте данного документа термин «гетероциклил» означает неароматическое циклическое кольцо или кольцевую систему, содержащую по меньшей мере один гетероатом в основной цепи кольца. Гетероциклы могут быть соединены друг с другом по типу конденсации, образования мостика или спиросоединения. Гетероциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе не является ароматическим. Гетероатом(-ы) может (могут) присутствовать либо в неароматическом, либо в ароматическом кольце в кольцевой системе. Гетероциклильная группа может содержать от 3 до 20 членов кольца (т.е. число атомов, составляющих основную цепь кольца, включая атомы углерода и гетероатомы), хотя настоящее определение также охватывает случай термина «гетероциклил», в котором числовой диапазон не задан. Гетероциклильная группа также может представлять собой гетероциклил среднего размера, имеющий от 3 до 10 членов кольца. Гетероциклильная группа также может представлять собой гетероциклил, имеющий от 3 до 6 членов кольца. Гетероциклильная группа может быть обозначена как «3-6-членный гетероциклил» или аналогичными обозначениями. В предпочтительных шестичленных моноциклических гетероциклилах гетероатом(-ы) выбран(-ы) из от одного до трех из O, N или S, и в предпочтительных пятичленных моноциклических гетероциклилах гетероатом(-ы) выбран(-ы) из одного или двух гетероатомов, выбранных из O, N или S. Примеры гетероциклических колец включают, без ограничений, азепинил, акридинил, карбазолил, циннолинил, диоксоланил, имидазолинил, имидазолидинил, морфолинил, оксиранил, оксепанил, тиепанил, пиперидинил, пиперазинил, диоксопиперазинил, пирролидинил, пирролидонил, пирролидионил, 4-пиперидонил, пиразолинил, пиразолидинил, 1,3-диоксинил, 1,3-диоксанил, 1,4-диоксинил, 1,4-диоксанил, 1,3-оксатианил, 1,4-оксатиинил, 1,4-оксатианил, 2H-1,2-оксазинил, триоксанил, гексагидро-1,3,5-триазинил, 1,3-диоксолил, 1,3-диоксоланил, 1,3-дитиолил, 1,3-дитиоланил, изоксазолинил, изоксазолидинил, оксазолинил, оксазолидинил, оксазолидинонил, тиазолинил, тиазолидинил, 1,3-оксатиоланил, индолинил, изоиндолинил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидро-1,4-тиазинил, тиаморфолинил, дигидробензофуранил, бензимидазолидинил и тетрагидрохинолин.
[00193] Термин группа «O-карбокси» относится к группе «-OC(=O)R», в которой R выбран из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10 членного гетероарила и 3-10 членного гетероциклила, как определено в данном документе.
[00194] Термин группа «С-карбокси» относится к группе «-OC(=O)R», в которой R выбран из группы, состоящей из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10 членного гетероарила и 3-10 членного гетероциклила, как определено в данном документе. Не имеющий ограничительного характера пример включает карбоксил (т.е. -C(=O)OH).
[00195] Термин «сульфонильная» группа относится к группе «-SO2R», в которой R выбран из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10 членного гетероарила и 3-10 членного гетероциклила, как определено в данном документе.
[00196] Термин «сульфино» группа относится к группе «-S(=O)OH».
[00197] Термин группа «S-сульфонамидо» относится к группе «-SO2NRARB», в которой RA и RB, каждый независимо, выбраны из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10 членного гетероарила и 3-10 членного гетероциклила, как определено в данном документе.
[00198] Термин группа «N-сульфонамидо» относится к группе «-N(RA)SO2RB», в которой RA и Rb, каждый независимо, выбраны из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10 членного гетероарила и 3-10 членного гетероциклила, как определено в данном документе.
[00199] Термин группа «C-амидо» относится к группе «-C(=O)NRARB», в которой RA и RB, каждый независимо, выбраны из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10 членного гетероарила и 3-10 членного гетероциклила, как определено в данном документе.
[00200] Термин группа «N-амидо» относится к группе «-N(RA)C(=O)RB», в которой RA и RB, каждый независимо, выбраны из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10 членного гетероарила и 3-10 членного гетероциклила, как определено в данном документе.
[00201] Термин группа «амино» относится к группе «-NRARB», в которой RA и RB, каждый независимо, выбраны из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10 членного гетероарила и 3-10 членного гетероциклила, как определено в данном документе. Не имеющий ограничительного характера пример включает свободную аминогруппу (т.е. -NH2).
[00202] Термин «аминоалкильная» группа относится к аминогруппе, связанной посредством алкиленовой группы.
[00203] Термин «алкоксиалкильная» группа относится к алкоксигруппе, соединенной посредством алкиленовой группы, такой как «C2-8 алкоксиалкил» и т.п.
[00204] В контексте данного документе замещенная группа получена из незамещенной исходной группы, в которой один или более атомов водорода были замещены другим атомом или группой. Если не указано иное, когда группа считается «замещенной», это означает, что группа замещена одним или более заместителями, независимо выбранными из C1-C6 алкила, C1-C6 алкенила, C1-C6 алкинила, C1-C6 гетероалкила, C3-C7 карбоциклила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), C3-C7-карбоциклил-C1-C6-алкила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), 3-10 членного гетероциклила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), 3-10 членного гетероциклил-C1-C6-алкила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), арила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), арил(C1-C6)алкила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), 5-10 членного гетероарила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), 5-10 членного гетероарил(C1-C6)алкила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), галогена, -CN, гидрокси, C1-C6 алкокси, C1-C6 алкокси(C1-C6)алкила (т. e. эфир), арилокси, сульфгидрила (меркапто), галоген(C1-C6)алкила (например, -CF3), галоген(C1-C6)алкокси (например, -OCF3), C1-C6 алкилтио, арилтио, амино, амино(C1-C6)алкила, нитро, O-карбамила, N-карбамила, O-тиокарбамила, N-тиокарбамила, C-амидо, N-амидо, S-сульфонамидо, N-сульфонамидо, C-карбокси, O-карбокси, ацила, цианато, изоцианато, тиоцианато, изотиоцианато, сульфинила, сульфонила, -SO3H, сульфино, -OSO2C1-4алкила и оксо (=O). Там, где указано, что группа «необязательно замещена», эта группа может быть замещена вышеуказанными заместителями.
[00205] В некоторых вариантах реализации, замещенные алкильные, алкенильные или алкинильные группы замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, -CN, SO3-, -SO3H, -SRA, -ORA, -NRBRC, оксо, -CONRBRC, -SO2NRBRC, -COOH и -COORB, где RA, RB и RC , каждый независимо, выбран из H, алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила.
[00206] Соединения, описанные в данном документе, могут быть представлены в виде нескольких мезомерных форм. Если изображена одна структура, подразумевается любая из соответствующих мезомерных форм. Кумариновые соединения, описанные в данном документе, представлены одной структурой, но в равной степени могут быть проиллюстрированы в виде любой из родственных мезомерных форм. Некоторые мезомерные структуры проиллюстрированы ниже для формулы (I):
Некоторые мезомерные структуры проиллюстрированы ниже для формулы (II):
[00207] В каждом случае, когда проиллюстрирована одна мезомерная форма соединения, описанного в данном документе, в равной степени предусмотрены альтернативные мезомерные формы.
[00208] Специалисту в данной области будет понятно, что соединение, описанное в данном документе, может существовать в ионизированной форме, например, -CO2- или -SO3-. Если соединение содержит положительно или отрицательно заряженную группу заместителя, например, SO3-, оно также может содержать отрицательно или положительно заряженный противоион, так что соединение в целом является нейтральным. В других аспектах соединение может существовать в форме соли, причем противоион обеспечивается конъюгатной кислотой или основанием.
[00209] Следует понимать, что определенные условные обозначения радикалов могут включать в себя либо монорадикал, либо бирадикал, в зависимости от контекста. Например, если заместитель требует двух точек присоединения к остальной части молекулы, следует понимать, что заместитель представляет собой бирадикал. Например, заместитель, определенный как алкил, который требует двух точек присоединения, включает в себя дирадикалы, такие как -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- и т.п. Другие условные обозначения радикалов четко указывают на то, что радикал представляет собой бирадикал, такой как «алкилен» или «алкенилен».
[00210] Если говорить, что две «соседние» группы R образуют кольцо «вместе с атомом, к которому они присоединены», это означает, что упомянутое кольцо представляет собой объединенное звено атомов, промежуточные связи и две группы R. Например, при наличии следующей подструктуры:
и R1 и R2 определяются как выбираемые из группы, состоящей из водорода и алкила, или R1 и R2 вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют арил или карбоциклил, и это означает, что R1 и R2 могут быть выбраны из водорода или алкила, или, в альтернативном варианте, подструктура имеет следующую структуру:
где A представляет собой арильное кольцо или карбоциклил, содержащий изображенную двойную связь.
Меченые нуклеотиды
[00211] В соответствии с одним аспектом данного описания предложены соединения красителей, пригодные для присоединения к фрагментам субстрата, в частности, содержащие линкерные группы для обеспечения присоединения к фрагментам субстрата. Фрагментами субстрата могут быть практически любые молекулы или вещества, с которыми могут конъюгироваться красители по данному изобретению, и, в качестве не имеющего ограничительного характера примера, могут включать в себя нуклеозиды, нуклеотиды, полинуклеотиды, углеводы, лиганды, частицы, твердые поверхности, органические и неорганические полимеры, хромосомы, ядра, живые клетки и их комбинации или сборки. Красители могут быть конъюгированы с помощью необязательного линкера разнообразными способами, включая гидрофобное притяжение, ионное притяжение и ковалентное присоединение. В некоторых аспектах красители конъюгированы с субстратом посредством ковалентного присоединения. Более конкретно, ковалентное присоединение осуществляется с помощью линкерной группы. В некоторых случаях такие меченые нуклеотиды также называются «модифицированными нуклеотидами».
[00212] В настоящем описании дополнительно предложены конъюгаты нуклеозидов и нуклеотидов, меченных одним или более красителями, изложенными в данном документе (модифицированные нуклеотиды). Меченые нуклеозиды и нуклеотиды пригодны для мечения полинуклеотидов, образованных ферментативным синтезом, таким как, в качестве не имеющего ограничительного характера примера, при ПЦР-амплификации, изотермической амплификации, твердофазной амплификации, полинуклеотидном секвенировании (например, твердофазном секвенировании), реакциях ник-трансляции и т.п.
[00213] Присоединение к биомолекулам может осуществляться через положение R, R1, R2, R3, R4, R5, или X соединения формулы (I). В некоторых аспектах соединение осуществляется посредством группы R3 или R5 формулы (I). Присоединение к биомолекулам может осуществляться через положение R, R1, R2, R3, R4, R5, R6 или X соединения формулы (II). В некоторых аспектах соединение осуществляется посредством группы R3, R4 или R6 формулы (II). В некоторых вариантах реализации группа заместителя представляет собой карбоксил или замещенный алкил, например алкил, замещенный -CO2H или активированную форму карбоксильной группы, например амид или сложный эфир, которые можно использовать для присоединения к амино или гидроксильной группе биомолекул. В контексте данного документа термин «активированный сложный эфир» относится к производному карбоксильной группы, которое способно вступать в реакцию в мягких условиях, например с соединением, содержащим аминогруппу. Не имеющие ограничительного характера примеры активированных сложных эфиров включают, без ограничений, п-нитрофенил, пентафторфенил и сложные сукцинимидные эфиры.
[00214] В некоторых вариантах реализации соединения красителей могут быть ковалентно присоединены к олигонуклеотидам или нуклеотидам посредством нуклеотидного основания. Например, меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к C5-положению пиримидинового основания или C7-положению 7-деазпуринового основания посредством линкерного фрагмента. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может также иметь 3'-OH блокирующую группу, ковалентно присоединенную к сахару рибозы или дезоксирибозы нуклеотида.
[00215] Конкретное применение флуоресцентных красителей, как описано в данном документе, предназначено для мечения биомолекул, например нуклеотидов или олигонуклеотидов. Некоторые варианты реализации по настоящей заявке нацелены на нуклеотид или олигонуклеотид, меченный флуоресцентными соединениями, как описано в данном документе.
Линкеры
[00216] Соединения красителей, описанные в данном документе, могут содержать реакционноспособную линкерную группу в одном из положений заместителей для ковалентного присоединения соединения к субстрату или другой молекуле. Реакционноспособные связывающие группы представляют собой фрагменты, способные образовывать связь (например, ковалентную или нековалентную связь), в частности ковалентную связь. В конкретном варианте реализации линкер может представлять собой расщепляемый линкер. Использование термина «расщепляемый линкер» не подразумевает необходимость удаления всего линкера. Сайт расщепления может быть размещен в положении на линкере, обеспечивающем, чтобы часть линкера оставалась присоединенной к красителю и/или фрагменту субстрата после расщепления. Расщепляемые линкеры могут представлять собой, в качестве не имеющего ограничительного характера примера, электрофильнорасщепляемые линкеры, нуклеофильнорасщепляемые линкеры, фоторасщепляемые линкеры, расщепляемые в восстановительных условиях (например, дисульфидные или азидсодержащие линкеры), в окислительных условиях, расщепляемые посредством применения сшивающих агентов, обеспечивающих безопасность, и расщепляемые механизмами элиминирования. Применение расщепляемого линкера для присоединения соединения красителя к фрагменту субстрата при необходимости обеспечивает возможность удаления метки после обнаружения без какого-либо мешающего сигнала на последующих этапах.
[00217] Подходящие линкерные группы можно найти в публикации PCT № WO 2004/018493 (включенной в данный документ посредством ссылки), примеры которых включают в себя линкеры, которые могут быть расщеплены с использованием водорастворимых фосфинов или водорастворимых катализаторов переходного металла, образованных из переходного металла и по меньшей мере частично водорастворимых лигандов. В водном растворе последние образуют по меньшей мере частично водорастворимые комплексы переходных металлов. Такие расщепляемые линкеры можно использовать для соединения оснований нуклеотидов с метками, такими как красители, изложенные в данном документе.
[00218] Конкретные линкеры включают в себя линкеры, описанные в публикации PCT № WO 2004/018493 (включенной в данный документ посредством ссылки), например, такие, которые содержат фрагменты формул:
(где X выбран из группы, содержащей O, S, NH и NQ, где Q представляет собой C1-10 замещенную или незамещенную алкильную группу, Y выбран из группы, содержащей O, S, NH и N(аллил), T представляет собой водород или C1-C10 замещенную или незамещенную алкильную группу, и * указывает на место, где фрагмент связан с остатком нуклеотида или нуклеозида). В некоторых аспектах линкеры соединяют основания нуклеотидов с метками, такими как, например, соединения красителей, описанные в данном документе.
[00219] Дополнительные примеры линкеров включают описанные в публикации патента США № 2016/0040225 (включенной в данный документ посредством ссылки), например, такие, которые содержат фрагменты формул:
(где * указывает, где фрагмент соединен с остатком нуклеотида или нуклеозида). Проиллюстрированные в данном документе линкерные фрагменты могут содержать полную или частичную линкерную структуру между нуклеотидами/нуклеозидами и метками.
[00220] В конкретных вариантах реализации длину линкера между флуоресцентным красителем (флуорофором) и гуаниновым основанием можно изменять, например, посредством введения полиэтиленгликолевой спейсерной группы, таким образом повышая интенсивность флуоресценции по сравнению с одним тем же флуорофором, присоединенным к гуаниновому основанию посредством других связей, известных в данной области. Некоторые линкеры и их свойства изложены в публикации PCT № WO 2007/020457 (включенной в данный документ посредством ссылки). Конфигурация линкеров, и в частности их увеличенная длина, может позволить улучшить яркость флуорофоров, присоединенных к гуаниновым основаниям гуанозиновых нуклеотидов, при введении в полинуклеотиды, такие как ДНК. Таким образом, когда краситель предназначен для применения в любом способе анализа, который требует обнаружения метки флуоресцентного красителя, присоединенной к гуанинсодержащему нуклеотиду, предпочтительно, чтобы линкер содержал спейсерную группу формулы -((CH2)2O)n-, где n равно целому числу от 2 до 50, как описано в публикации PCT № WO 2007/020457.
[00221] Нуклеозиды и нуклеотиды могут быть помечены в сайтах на сахаре или азотистом основании. Как известно в данной области, «нуклеотид» состоит из азотистого основания, сахара и одной или более фосфатных групп. В РНК сахар представляет собой рибозу, а в ДНК представляет собой дезоксирибозу, т. е. сахар, не содержащий гидроксильной группы, присутствующей в рибозе. Азотистое основание является производным пурина или пиримидина. Пурины представляют собой аденин (A) и гуанин (G), пиримидины представляют собой цитозин (C) и тимин (T) или в контексте РНК, урацил (U). Атом C-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидина или N-9 пурина. Нуклеотид также представляет собой сложный эфир фосфорной кислоты и нуклеозида, причем эстерификация происходит у гидроксильной группы, присоединенной к C-3 или C-5 сахара. Нуклеотиды обычно представляют собой моно-, ди- или трифосфаты.
[00222] «Нуклеозид» структурно аналогичен нуклеотиду, но не имеет фосфатных фрагментов. Примером нуклеозидного аналога является аналог, в котором метка связана с основанием, а фосфатная группа не присоединена к молекуле сахара.
[00223] Хотя основание обычно называют пурином или пиримидином, специалисту в данной области будет понятно, что имеются производные и аналоги, которые не изменяют способность нуклеотида или нуклеозида к спариванию оснований по Уотсону-Крику. Термин «производное» или «аналог» означает соединение или молекулу, основная структура которой является одной и той же или близка основной структуре исходного соединения, но имеет химическую или физическую модификацию, такую как, например, другая или дополнительная боковая группа, которая позволяет связать производное нуклеотида или нуклеозида с другой молекулой. Например, основание может представлять собой дезазапурин. В конкретных вариантах реализации производные должны быть способны вступать в спаривание по Уотсону-Крику. Термин «производное» и «аналог» также включает, например, синтетический нуклеотид или производное нуклеозида, имеющее фрагменты модифицированного основания и/или фрагменты модифицированного сахара. Такие производные и аналоги обсуждаются, например, в Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) и Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Нуклеотидные аналоги также могут содержать модифицированные фосфодиэфирные связи, включая фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, алкилфосфонатные, фосфоранилидатные, фосфорамидатные связи и т.п.
[00224] Краситель может быть присоединен в любом положении на нуклеотидном основании, например, посредством линкера. В конкретных вариантах реализации для полученного аналога по-прежнему можно выполнить спаривание оснований по Уотсону-Крику. Конкретные сайты маркировки азотистых оснований включают C5 положение пиримидинового основания или C7 положение 7-дезазапуринового основания. Как описано выше, для ковалентного присоединения красителя к нуклеозиду или нуклеотиду можно использовать линкерную группу.
[00225] В конкретных вариантах реализации меченый нуклеозид или нуклеотид может быть ферментативно внедряемым и может быть ферментативно удлиняемым. Соответственно, линкерный фрагмент может иметь достаточную длину, чтобы соединять нуклеотид с соединением так, чтобы соединение не препятствовало общему связыванию и распознаванию нуклеотида путем репликации нуклеиновой кислоты ферментом. Таким образом, линкер может также содержать спейсерное звено. Спейсер отстоит, например, на нуклеотидное основание от сайта расщепления или метки.
[00226] Нуклеозиды или нуклеотиды, меченные красителями, описанными в данном документе, могут иметь формулу:
где краситель представляет собой соединение красителя; B представляет собой азотистое основание, такое как, например, урацил, тимин, цитозин, аденин, гуанин и т.п.; L представляет собой необязательную линкерную группу, которая может присутствовать или отсутствовать; R' может представлять собой H, монофосфат, дифосфат, трифосфат, тиофосфат, аналог сложного эфира фосфорной кислоты, -O-, присоединенный к реакционноспособной фосфорсодержащей группе или -O-, защищенный блокирующей группой; R'' может представлять собой H, OH, фосфорамидит или блокирующую группу 3'-OH, а R''' представляет собой H или OH. Где R'' представляет собой фосфорамидит, R' представляет собой расщепляемую кислотой гидроксильную защитную группу, которая обеспечивает последующее связывание мономеров в условиях автоматического синтеза.
[00227] В конкретном варианте реализации блокирующая группа является отдельной и независимой от соединения красителя, т. е. не присоединенной к ней. В альтернативном варианте реализации краситель может содержать всю или часть блокирующей группы 3'-OH. Таким образом, R'' может представлять собой блокирующую группу 3'-OH, которая может содержать или не содержать соединение красителя.
[00228] В еще одном альтернативном варианте реализации на углероде 3' пентозного сахара нет блокирующей группы, а краситель (или краситель и линкерная конструкция) присоединен к основанию, например, может иметь размер или структуру, достаточные для функционирования в качестве блока при встраивании дополнительного нуклеотида. Таким образом, блок может быть связан со стерическими препятствиями или может быть связан с комбинацией размера, заряда и структуры независимо от того, присоединен ли краситель к положению 3' сахара.
[00229] В еще одном альтернативном варианте реализации блокирующая группа присутствует на углероде 2' или 4' пентозного сахара и может иметь размер или структуру, достаточные для функционирования в качестве блока для введения дополнительного нуклеотида.
[00230] Применение блокирующей группы позволяет контролировать полимеризацию, например, путем остановки удлинения при встраивании модифицированного нуклеотида. Если эффект блокирования является обратимым, например, в качестве не имеющего ограничительного характера примера, путем изменения химических условий или путем удаления химического блока, расширение можно остановить в определенных точках, а затем продолжить.
[00231] В другом конкретном варианте реализации блокирующая группа 3'-OH будет содержать фрагмент, описанный в публикации PCT № WO 2004/018497 и WO 2014/139596, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Например, блокирующая группа может представлять собой азидометил (-CH2N3) или замещенный азидометил (например, -CH(CHF2)N3 или CH(CH2F)N3) или аллил.
[00232] В конкретном варианте реализации и линкер (между красителем и нуклеотидом), и блокирующая группа присутствуют и представляют собой отдельные фрагменты. В конкретных вариантах реализации и линкер, и блокирующая группа способны расщепляться в по существу аналогичных условиях. Таким образом, способы снятия защиты и деблокирования могут быть более эффективными, поскольку для удаления как соединения красителя, так и блокирующей группы потребуется только одна обработка. Однако в некоторых вариантах реализации линкер и блокирующая группа не обязательно должны быть способными расщепляться в аналогичных условиях, вместо этого могут быть способны расщепляться по отдельности в различных условиях.
[00233] Данное описание также охватывает полинуклеотиды, содержащие соединения красителей. Такие полинуклеотиды могут представлять собой ДНК или РНК, состоящие соответственно из дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, соединенных фосфодиэфирной связью. Полинуклеотиды могут содержать нуклеотиды природного происхождения, нуклеотиды неприродного происхождения (или модифицированные), отличные от меченых нуклеотидов, описанных в данном документе, или любую их комбинацию, в комбинации с по меньшей мере одним модифицированным нуклеотидом (например, меченым соединением красителя), как изложено в данном документе. Полинуклеотиды в соответствии с данным описанием также могут содержать каркасные связи неприродного происхождения и/или ненуклеотидные химические модификации. Также предусмотрены химерные структуры, состоящие из смесей рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, содержащих по меньшей мере один меченый нуклеотид.
[00234] Не имеющие ограничительного характера меченые нуклеотиды, описанные в данном документе, включают в себя:
где L представляет собой линкер, а R представляет собой остаток сахара, как описано выше.
[00235] В некоторых вариантах реализации не имеющие ограничительного характера флуоресцентные конъюгаты красителя проиллюстрированы ниже:
.
Наборы
[00236] В настоящем описании также предложены наборы, включающие в себя модифицированные нуклеозиды и/или нуклеотиды, меченные красителями. Такие наборы по существу содержат по меньшей мере один модифицированный нуклеотид или нуклеозид, меченный красителем, изложенным в данном документе, вместе по меньшей мере с одним дополнительным компонентом. Дополнительный(-ые) компонент(-ы) может(могут) представлять собой один или более компонентов, определенных в способе, изложенном в данном документе, или в разделе «Примеры» ниже. Некоторые не имеющие ограничительного характера примеры компонентов, которые можно комбинировать в наборе по настоящему описанию, изложены ниже.
[00237] В конкретном варианте реализации набор может включать в себя по меньшей мере один модифицированный нуклеотид или нуклеозид, меченный любым из красителей, изложенных в настоящем документе, вместе с модифицированными или немодифицированными нуклеотидами или нуклеозидами. Например, модифицированные нуклеотиды, меченные красителями в соответствии с данным описанием, могут поставляться в комбинации с немечеными или нативными нуклеотидами и/или флуоресцентно мечеными нуклеотидами или любой их комбинацией. Соответственно, наборы могут содержать модифицированные нуклеотиды, меченные красителями в соответствии с данным описанием, и модифицированные нуклеотиды, меченные другими соединениями, например, соединениями красителей предшествующего уровня техники. Комбинации нуклеотидов могут быть предложены в виде отдельных компонентов (например, один тип нуклеотидов на сосуд или пробирку) или в виде смесей нуклеотидов (например, два или более нуклеотидов могут быть смешаны в одном и том же сосуде или пробирке).
[00238] Если наборы содержат множество, в частности два, три, или более конкретно четыре модифицированных нуклеотида, меченных соединением красителя, различные нуклеотиды могут быть помечены различными соединениями красителей, или один может быть темным без соединений красителей. Если различные нуклеотиды помечены различными соединениями красителей, признаком наборов является то, что соединения красителей представляют собой спектрально различимые флуоресцентные красители. В контексте данного документа термин «спектрально различимые флуоресцентные красители» относится к флуоресцентным красителям, излучающим флуоресцентную энергию с длиной волны, которую можно различать с помощью оборудования для флуоресцентного обнаружения (например, коммерческой платформы для секвенирования ДНК на основе капилляров), когда в одной пробе присутствуют два или более таких красителей. Когда два модифицированных нуклеотида, меченных флуоресцентными красителями, поставляются в виде набора, признаком некоторых вариантов реализации является то, что спектрально различимые флуоресцентные красители могут возбуждаться при одной и той же длине волны, такой как, например, одним и тем же лазером. Когда четыре модифицированных нуклеотида, меченных флуоресцентными красителями, поставляются в виде набора, признаком некоторых вариантов реализации является то, что два из спектрально различимых флуоресцентных красителей могут возбуждаться на одной и той же длине волны, а два других спектрально различимых красителя могут возбуждаться на другой длине волны. Конкретные длины волн возбуждения могут составлять 488 нм и 532 нм.
[00239] В одном варианте реализации набор содержит модифицированный нуклеотид, меченный соединением по настоящему описанию, и второй модифицированный нуклеотид, меченный вторым красителем, причем красители имеют разницу в максимуме поглощения, равную по меньшей мере 10 нм, в частности от 20 нм до 50 нм. Более конкретно, два соединения красителей имеют Стоксов сдвиг в диапазоне 15-40 нм, где «Стоксов сдвиг» представляет собой расстояние между длинами волн пикового поглощения и пикового излучения.
[00240] В дополнительном варианте реализации набор может дополнительно содержать два других модифицированных нуклеотида, меченных флуоресцентными красителями, причем красители возбуждаются одним и тем же лазером при 532 нм. Красители могут иметь разницу в максимуме поглощения, равную по меньшей мере 10 нм, в частности от 20 нм до 50 нм. Более конкретно, два соединения красителей могут иметь Стоксов сдвиг, равный между 20-40 нм. Конкретными красителями, спектрально отличимыми от красителей по настоящему описанию и соответствующими приведенным выше критериям, являются аналоги полиметинов, описанные в патенте США № 5268486 (например, Cy3) или публикации PCT № WO 2002/026891 (Alexa 532; Molecular Probes A20106), или несимметричные полиметины, описанные в патенте США № 6924372, описание каждого из которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Альтернативные красители включают аналоги родамина, например тетраметилродамин и его аналоги.
[00241] В альтернативном варианте реализации наборы по данному описанию могут содержать нуклеотиды, в которых одно и то же основание помечено двумя различными соединениями. Первый нуклеотид может быть помечен соединением по данному описанию. Второй нуклеотид может быть помечен спектрально отличающимся соединением, например «зеленым» красителем, поглощающим при менее 600 нм. Третий нуклеотид может быть помечен как смесь соединения по данному описанию и спектрально отличающегося соединения, а четвертый нуклеотид может быть «темным» и не содержать метки. Проще говоря, таким образом, нуклеотиды 1-4 могут быть помечены как «синие», «зеленые», «синие/зеленые» и темные. Для дальнейшего упрощения оборудования четыре нуклеотида могут быть помечены двумя красителями, возбуждающимися одним лазером, и, таким образом, метка нуклеотидов 1-4 может быть «синей 1», «синей 2», «синей 1/синей 2» и темной.
[00242] Нуклеотиды могут содержать два красителя по настоящему описанию. Набор может содержать два или более нуклеотидов, меченных красителями по данному описанию. Наборы могут содержать дополнительный нуклеотид, где нуклеотид помечен красителем, который поглощает в области от 520 нм до 560 нм. Наборы могут дополнительно содержать немеченый нуклеотид.
[00243] Хотя в данном документе приведены примеры наборов в отношении конфигураций, имеющих различные нуклеотиды, которые помечены различными соединениями красителей, следует понимать, что наборы могут содержать 2, 3, 4 или более различных нуклеотидов, которые имеют одно и то же соединение красителя.
[00244] В конкретных вариантах реализации набор может содержать фермент полимеразы, способный катализировать встраивание модифицированных нуклеотидов в полинуклеотид. Другие компоненты, которые будут содержаться в таких наборах, могут включать в себя буферы и т.п. Модифицированные нуклеотиды, меченные красителями в соответствии с данным описанием, и любые другие нуклеотидные компоненты, включая смеси различных нуклеотидов, могут быть предложены в наборе в концентрированной форме для разведения перед применением. В таких вариантах реализации также может содержаться подходящий буфер для разбавления. Опять же один или более компонентов, определенных в способе, изложенном в данном документе, могут содержаться в наборе по данному описанию.
Способы секвенирования
[00245] Модифицированные нуклеотиды (или нуклеозиды), содержащие соединение красителя в соответствии с настоящим изобретением, можно применять в любом способе анализа, таком как способ, который включает в себя обнаружение флуоресцентной метки, прикрепленной к нуклеотиду или нуклеозиду, как его индивидуально, так и его встроенного в или связанного с более крупной молекулярной структурой или конъюгатом. В данном контексте термин «включенный в полинуклеотид» может означать, что 5' фосфат присоединен по фосфодиэфирной связи к 3' гидроксильной группе второго (модифицированного или немодифицированного) нуклеотида, который сам по себе может образовывать часть более длинной полинуклеотидной цепи. Конец 3' модифицированного нуклеотида, изложенного в данном документе, может быть или не быть присоединен в фосфодиэфирной связи к 5' фосфату дополнительного (модифицированного или немодифицированного) нуклеотида. Таким образом, в одном не имеющем ограничительного характера варианте реализации в данном описании предложен способ обнаружения модифицированного нуклеотида, включенного в полинуклеотид, который включает: (a) включение по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида по данному описанию в полинуклеотид и (b) обнаружение модифицированного(-ых) нуклеотида(-ов), включенного(-ых) в полинуклеотид, путем обнаружения флуоресцентного сигнала от соединения красителя, присоединенного (-ых) к указанному(-ым) модифицированному(-ым) нуклеотиду(-ам).
[00246] Данный способ может включать: этап синтеза (a), в котором один или более модифицированных нуклеотидов в соответствии с данным описанием включают в полинуклеотид, и этап обнаружения (b), в котором один или более модифицированных нуклеотидов, включенных в полинуклеотид, обнаруживают путем обнаружения или количественного измерения их флуоресценции.
[00247] Некоторые варианты реализации по настоящей заявке нацелены на способы секвенирования, включая: (a) включение по меньшей мере одного меченого нуклеотида, как описано в данном документе, в полинуклеотид; и (b) обнаружение меченого(-ых) нуклеотида(-ов), включенного(-ых) в полинуклеотид, посредством обнаружения флуоресцентного сигнала от флуоресцентного красителя, присоединенного(-ых) к указанному(-ым) модифицированному(-ым) нуклеотиду(-ам).
[00248] В одном варианте реализации по меньшей мере один модифицированный нуклеотид включают в полинуклеотид на этапе синтеза под действием фермента полимеразы. Однако можно использовать и другие способы соединения модифицированных нуклеотидов с полинуклеотидами, такие как, например, химический синтез олигонуклеотидов или лигирование меченых олигонуклеотидов с немечеными олигонуклеотидами. Следовательно, термин «включение» при использовании в отношении нуклеотида и полинуклеотида может охватывать синтез полинуклеотида химическими способами, а также ферментативными способами.
[00249] В конкретном варианте реализации проводят этап синтеза, и он может необязательно включать инкубацию цепи матричного полинуклеотида с реакционной смесью, содержащей флуоресцентно-меченые модифицированные нуклеотиды по данному описанию. Полимераза также может быть предоставлена в условиях, которые позволяют образовать фосфодиэфирную связь между свободной 3' гидроксильной группой на полинуклеотидной цепи, ренатурированной с цепью матричного полинуклеотида, и 5' фосфатной группой на модифицированном нуклеотиде. Таким образом, этап синтеза может включать образование полинуклеотидной цепи в соответствии с направлением путем комплементарного объединения в пары оснований нуклеотидов с цепью матрицы.
[00250] Во всех вариантах реализации способов этап обнаружения можно проводить, когда полинуклеотидную цепь, в которую включены меченые нуклеотиды, ренатурируют с матричной цепью, или после этапа денатурации, в котором разделены две цепи. Между этапом синтеза и этапом обнаружения могут быть включены дополнительные этапы, например этапы химической или ферментативной реакции, или этапы очистки. В частности, целевая цепь, включающая в себя меченый(-ые) нуклеотид(-ы), может быть выделена (-ы) или очищена, а затем подвергнута дальнейшему процессингу или использована в последующем анализе. В качестве примера целевые полинуклеотиды, меченные модифицированным(-и) нуклеотидом(-ами), как описано в данном документе, на этапе синтеза можно впоследствии применять в качестве меченых зондов или праймеров. В других вариантах реализации продукт этапа синтеза, изложенный в данном документе, может быть подвергнут дополнительным этапам реакции и при необходимости продукт этих последующих этапов очищен или выделен.
[00251] Подходящие условия для этапа синтеза хорошо известны специалистам со стандартными методиками молекулярной биологии. В одном варианте реализации этап синтеза может быть аналогичен стандартной реакции достройки праймера с использованием нуклеотидных предшественников, включая модифицированные нуклеотиды, как описано в данном документе, с образованием удлиненной целевой цепи, комплементарной цепи матрицы, при наличии подходящего фермента полимеразы. В других вариантах реализации этап синтеза может сам по себе образовывать часть реакции амплификации, производящей меченый двухцепочечный продукт амплификации, содержащий ренатурированные комплементарные цепи, полученные в результате копирования целевых и матричных полинуклеотидных цепей. Другие этапы синтеза включают ник-трансляцию, полимеризацию с замещением цепи, случайное праймированное мечение ДНК и т.д. Особенно пригодным полимеразным ферментом для этапа синтеза является полимеразный фермент, способный катализировать введение модифицированных нуклеотидов, как изложено в данном документе. Можно применять разнообразные встречающиеся в природе или модифицированные полимеразы. В качестве примера термостабильную полимеразу можно применять для синтетической реакции, которую проводят в условиях термоциклирования, тогда как термостабильная полимераза может быть нежелательна для реакций изотермической достройки праймера. Подходящие термостабильные полимеразы, которые способны встраивать модифицированные нуклеотиды в соответствии с данным описанием, включают в себя полимеры, описанные в PCT публикации № WO 2005/024010 или WO 2006/120433, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. В реакциях синтеза, которые проводят при более низких температурах, таких как 37 °C, полимеразные ферменты не обязательно должны представлять собой термостабильные полимеразы, поэтому выбор полимеразы будет зависеть от ряда факторов, таких как температура реакции, pH, нить-замещающая активность и т.п.
[00252] В конкретных не имеющих ограничительного характера вариантах реализации данное описание включает в себя способы секвенирования нуклеиновых кислот, повторного секвенирования, секвенирования целого генома, оценки однонуклеотидных полиморфизмов, любое другое применение, включающее обнаружение модифицированных нуклеотидов или нуклеозидов, меченных красителями, изложенными в данном документе, при включении в полинуклеотид. В любом из множества других применений, в которых имеется преимущество от использование полинуклеотидов, меченных модифицированными нуклеотидами, содержащими флуоресцентные красители, можно использовать модифицированные нуклеотиды или нуклеозиды с красителями, изложенными в данном документе.
[00253] В конкретном варианте реализации данного описания предложено применение модифицированных нуклеотидов, содержащих соединения красителей в соответствии с данным описанием, в реакции полинуклеотидного секвенирования путем синтеза. Секвенирование путем синтеза по существу включает последовательное добавление одного или более нуклеотидов или олигонуклеотидов к растущей полинуклеотидной цепи в направлении от 5' к 3' с применением полимеразы или лигазы для образования удлиненной полинуклеотидной цепи, комплементарной матричной нуклеиновой кислоте, подлежащей секвенированию. Идентичность основания, присутствующего в одном или более из добавленных нуклеотидов, можно определить на этапе обнаружения или «визуализации», как описано в данном документе. Идентичность добавленного основания можно определить после каждого этапа включения нуклеотидов. Затем последовательность матрицы может быть выведена с помощью стандартных правил спаривания оснований по Уотсону-Крику. Применение модифицированных нуклеотидов, меченных красителями, изложенными в данном документе, для определения идентичности одного основания может быть пригодно, например, при оценке однонуклеотидных полиморфизмов, и такие реакции удлинения на одно основание входят в объем данного описания.
[00254] В одном варианте реализации по настоящему описанию последовательность матричного полинуклеотида определяют путем обнаружения включения одного или более нуклеотидов в зарождающуюся цепь, комплементарную матричному полинуклеотиду, подлежащему секвенированию, путем обнаружения флуоресцентной(-ых) метки(-ей), присоединенной(-ых) к включенному(-ым) нуклеотиду(-ам). Секвенирование матричного полинуклеотида можно праймировать подходящим праймером (или получить в виде шпилечного конструкта, который будет содержать праймер в составе шпильки), и зарождающуюся цепь удлиняют поэтапно путем добавления нуклеотидов к 3' концу праймера в катализируемой полимеразой реакции.
[00255] В конкретных вариантах реализации каждый из различных нуклеотидных трифосфатов (A, T, G и C) может быть помечен уникальным флуорофором, а также содержит блокирующую группу в положении 3' для предотвращения неконтролируемой полимеризации. Альтернативно один из четырех нуклеотидов может быть немеченым (темным). Полимеразный фермент включает нуклеотид в зарождающуюся цепь, комплементарную матричному полинуклеотиду, а блокирующая группа предотвращает дальнейшее включение нуклеотидов. Любые невключенные нуклеотиды можно отмывать, а флуоресцентный сигнал от каждого включенного нуклеотида можно «оптически считывать» подходящими способами, такими как устройство с зарядовой связью с использованием лазерного возбуждения и подходящих фильтров излучения. Затем 3'-блокирующую группу и соединения флуоресцентных красителей можно удалить (снять защиту) (одновременно или последовательно) для открытия исходной цепи для дополнительного включения нуклеотидов. Как правило, идентичность включенного нуклеотида определяют после каждой этапе включения, но это не является строго обязательным. Аналогичным образом, в патенте США № 5302509, описание которого включено в полном объеме в данный документ посредством ссылки, описан способ секвенирования полинуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке.
[00256] В способе, приведенном в качестве примера выше, применяют включение флуоресцентно меченых 3' блокированных нуклеотидов A, G, C и T в растущую цепь, комплементарную иммобилизованному полинуклеотиду, в присутствии ДНК-полимеразы. Полимераза включает основание, комплементарное целевому полинуклеотиду, но дальнейшее добавление 3'-блокирующей группы предотвращается. Затем можно определить метку включенного нуклеотида и удалить блокирующую группу путем химического расщепления для обеспечения дальнейшей полимеризации. Матрица нуклеиновой кислоты, подлежащая секвенированию в реакции «секвенирования путем синтеза», может представлять собой любой полинуклеотид, который желательно секвенировать. Матрица нуклеиновой кислоты для реакции секвенирования, как правило, содержит двухцепочечную область, имеющую свободную 3' гидроксильную группу, которая служит в качестве праймера или точки инициации для добавления дополнительных нуклеотидов в реакцию секвенирования. Область матрицы, подлежащая секвенированию, будет нависать над данной свободной 3' гидроксильной группой комплементарной цепи. Нависающая область матрицы, подлежащей секвенированию, может быть одноцепочечной, но может быть двухцепочечной при условии наличия «наличия ника» на цепи, комплементарной матрице, подлежащей секвенированию, для получения свободной группы 3' OH для инициирования реакции секвенирования. В таких вариантах реализации секвенирование может продолжаться путем замещения цепи. В определенных вариантах реализации праймер, несущий свободную 3'-гидроксильную группу, можно добавить в виде отдельного компонента (например, короткого олигонуклеотида), который гибридизуется с одноцепочечным участком матрицы, подлежащей секвенированию. Альтернативно каждый из праймера и матричной цепи, подлежащих секвенированию, может образовывать часть частично самокомплементарной цепи нуклеиновой кислоты, способной к образованию внутримолекулярного дуплекса, такой как, например, структура шпилечной петли. Шпилечные полинуклеотиды и способы их прикрепления к твердым носителям описаны в публикации PCT № WO 2001/057248 и WO 2005/047301, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Нуклеотиды можно последовательно добавлять к растущему праймеру, что приводит к синтезу полинуклеотидной цепи в направлении от 5' к 3'. Характер добавленного основания можно определить, в частности, но не обязательно, после добавления каждого нуклеотида, таким образом обеспечивая информацию о последовательности для матрицы нуклеиновой кислоты. Таким образом, нуклеотид включают в цепь нуклеиновой кислоты (или полинуклеотид) путем присоединения нуклеотида к свободной 3' гидроксильной группой цепи нуклеиновой кислоты посредством образования фосфодиэфирной связи с 5' фосфатной группой нуклеотида.
[00257] Подлежащая секвенированию нуклеиновой кислоты матрица может представлять собой ДНК, или РНК, или даже гибридную молекулу, состоящую из дезоксинуклеотидов и рибонуклеотидов. Матрица нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотиды природного происхождения и/или не встречающиеся в природе нуклеотиды и природные или неприродные каркасные связи, при условии что они не предотвращают копирование матрицы в реакции секвенирования.
[00258] В определенных вариантах реализации подлежащую секвенированию матрицу нуклеиновой кислоты можно присоединить к твердой подложке посредством любого подходящего способа образования связи, известного в данной области, например, посредством ковалентного присоединения. В определенных вариантах реализации матричные полинуклеотиды могут прикрепляться непосредственно к твердой подложке (например, к подложке на основе диоксида кремния). Однако в других вариантах реализации данного описания поверхность твердой подложки можно модифицировать таким образом, чтобы она обеспечивала либо непосредственное ковалентное прикрепление матричных полинуклеотидов, либо иммобилизацию матричных полинуклеотидов посредством гидрогеля или полиэлектролитного мультислоя, который сам по себе может быть нековалентно присоединен к твердой подложке.
[00259] Чипы, в которых полинуклеотиды непосредственно прикреплены к подложкам на основе диоксида кремния, представляют собой, например, описанные в публикации PCT № WO 2000/006770, описание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки, причем полинуклеотиды иммобилизованы на стеклянной подложке путем реакции между боковой эпоксидной группой на стекле с внутренней аминогруппой на полинуклеотиде. Кроме того, полинуклеотиды могут быть присоединены к твердой подложке посредством реакции нуклеофила на основе серы с твердой подложкой, например, как описано в публикации PCT № WO 2005/047301, описание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Другим дополнительным примером матричных полинуклеотидов на твердой подложке является вариант, в котором матричные полинуклеотиды прикреплены к гидрогелю, нанесенному на диоксид кремния, или другие твердые подложки, например, как описано в публикации PCT №№ WO 2000/31148, WO 2001/01143, WO 2002/12566, WO 2003/014392 и WO 2000/53812 и патенте США № 6465178, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
[00260] Конкретной поверхностью, на которой могут быть иммобилизованы матричные полинуклеотиды, является полиакриламидный гидрогель. Полиакриламидные гидрогели описаны в приведенных выше ссылках и в публикации PCT № WO 2005/065814, описание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Конкретные гидрогели, которые можно использовать, включают в себя гидрогели, описанные в PCT. публикации № WO 2005/065814 и публикации США № 2014/0079923, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. В одном варианте реализации гидрогель представляет собой PAZAM (поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид-со-акриламид)).
[00261] Молекулы ДНК-матрицы можно прикрепить к гранулам или микрочастицам, например, как описано в патенте США № 6172218, описание которого в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Прикрепление к гранулам или микрочастицам может быть пригодно для применения при секвенировании. Можно получить библиотеки гранул, в которых каждая гранула содержит разные последовательности ДНК. Некоторые библиотеки и способы их создания описаны в Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005), описания каждой из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Секвенирование чипов таких гранул с использованием нуклеотидов, изложенных в данном документе, находится в рамках объема данного описания.
[00262] Матрица(-ы), подлежащая(-ие) секвенированию, может(могут) образовывать часть «чипа» на твердом носителе, и в этом случае чип может принимать любую удобную форму. Таким образом, способ по данному описанию применим ко всем типам чипов высокой плотности, включая чипы с одиночными молекулами, кластерные чипы и гранулированные чипы. Модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями красителей по настоящему описанию, могут применяться для секвенирования матриц по существу на любом типе чипа, включая, без ограничений, те, которые образованы путем иммобилизации молекул нуклеиновых кислот на твердой подложке.
[00263] Однако модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями красителей по настоящему описанию, особенно предпочтительны в контексте секвенирования кластеризованных чипов. В кластеризованных чипах отдельные области чипа (часто называемые сайтами или категориями) содержат множество полинуклеотидных матричных молекул. Как правило, множество полинуклеотидных молекул по отдельности не поддаются разделению оптическими средствами, а вместо этого обнаруживаются как ансамбль. В зависимости от способа образования чипа каждый сайт чипа может содержать множество копий одной отдельной полинуклеотидной молекулы (например, сайт является гомогенным для конкретного вида одно- или двухцепочечной нуклеиновых кислот) или даже множество копий небольшого числа различных полинуклеотидных молекул (например, множество копий двух различных видов нуклеиновых кислот). Кластеризованные чипы молекул нуклеиновых кислот могут быть получены с использованием методов, общеизвестных в данной области. В качестве примера, публикации PCT №№ WO 1998/44151 и WO 2000/18957, описания каждого из которых включены в полном объеме в данный документ посредством ссылки, описывают способы амплификации нуклеиновых кислот, причем как матрица, так и продукты амплификации остаются иммобилизованными на твердой подложке для формирования чипов, состоящих из кластеров или «колоний» молекул иммобилизованных нуклеиновых кислот. Молекулы нуклеиновых кислот, присутствующие на кластеризованных чипах, полученных в соответствии с данными способами, являются матрицами, пригодными для секвенирования с применением модифицированных нуклеотидов, меченных соединениями красителей по данному описанию.
[00264] Модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями красителей по настоящему описанию, также можно применять при секвенировании матриц на одномолекулярных чипах. Термин «одномолекулярный чип» или «SMA» в контексте данного документа относится к популяции полинуклеотидных молекул, распределенных (или упорядоченных) по твердой подложке, причем расстояние от любого отдельного полинуклеотида до всех остальных в популяции таково, что отдельные полинуклеотидные молекулы можно по отдельности разделить. Таким образом, в некоторых вариантах реализации молекулы-мишени нуклеиновых кислот, иммобилизованные на поверхности твердой подложки, могут быть способны быть разделены оптическими средствами. Это означает, что один или более отдельных сигналов, каждый из которых представляет собой один полинуклеотид, будут находиться в пределах разделяемой области конкретного используемого устройства визуализации.
[00265] Можно достичь обнаружения отдельных молекул, причем расстояние между соседними полинуклеотидными молекулами на чипе составляет по меньшей мере 100 нм, более конкретно по меньшей мере 250 нм, еще более конкретно по меньшей мере 300 нм, даже еще более конкретно по меньшей мере 350 нм. Таким образом, каждая молекула способна индивидуально быть разрешена и обнаружена в качестве отдельной молекулы флуоресцентной точки, и флуоресценция указанной отдельной молекулы также демонстрирует одноэтапное фотоотбеливание.
[00266] Термины «индивидуально разрешен» и «индивидуальное разрешение» используют в контексте данного документа для указания того, что при визуализации можно отличить одну молекулу на чипе от соседних молекул. Разделение между индивидуальными молекулами на чипе будет частично определяться конкретной методикой, применяемой для разделения индивидуальных молекул. Общие признаки единичных молекулярных чипов будут понятны со ссылкой на публикации PCT № WO 2000/06770 и WO 2001/57248, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.. Хотя одно применение модифицированных нуклеотидов по данному описанию осуществляется в реакциях секвенирования путем синтеза, применение модифицированных нуклеотидов не ограничено такими способами. Фактически нуклеотиды можно применять преимущественно в любой методике секвенирования, которая требует обнаружения флуоресцентных меток, присоединенных к нуклеотидам, включенным в полинуклеотид.
[00267] В частности, модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями красителей по данному описанию, можно применять в автоматических протоколах флуоресцентного секвенирования, в частности, циклическое секвенирование методом терминаторов с флуоресцентным красителем на основе способа секвенирования с обрывом цепи, предложенного Сэнгером и соавторами. В таких способах по существу применяют ферменты и циклическое секвенирование для включения флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов в реакцию секвенирования достройки праймера. Так называемые способы секвенирования по Сэнгеру и связанные протоколы (типа Сэнгера) используют рандомизированную терминацию цепи мечеными дидезоксинуклеотидами.
[00268] Таким образом, настоящее описание также охватывает модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями красителей, которые являются дидезоксинуклеотидами, не имеющими гидроксильных групп в обоих положениях 3' и 2', причем такие модифицированные дидезоксинуклеотиды пригодны для применения в способах секвенирования по Сэнгеру и т.п.
[00269] Модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями красителей по настоящему описанию, содержащими 3' блокирующие группы, также будут признаны пригодными в способах Сэнгера и связанных протоколах, поскольку такой же эффект, достигаемый с применением модифицированных дидезоксинуклеотидов, может быть достигнут с применением модифицированных нуклеотидов, имеющих 3'-OH блокирующие группы: обе предотвращают встраивание последующих нуклеотидов. Там, где нуклеотиды в соответствии с настоящим описанием и имеющие блокирующую 3' группу, следует использовать в способах секвенирования по типу Сэнгера, следует понимать, что соединения красителей или обнаруживаемые метки, присоединенные к нуклеотидам, не обязательно должны быть соединены посредством расщепляемых линкеров, так как в каждом случае, в который внедрен меченый нуклеотид по данному описанию; не нужно последовательно включать нуклеотиды, и, таким образом, метку не нужно удалять с нуклеотида.
Примеры
[00270] В следующих примерах более подробно описаны дополнительные варианты реализации, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема формулы изобретения.
Пример 1: Соединение I-1: 7-(3-Карбоксиазетидинил-1)-3-(5-хлор-бензоксазол-2-ил)кумарин
[00271] 3-(5-Хлор-бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,32 г, 1 ммоль) и 3-карбоксиазетидин (0,2 г, 2 ммоль) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). После перемешивания в течение 7 ч при 120 °C, и выдерживании при комнатной температуре в течение 1 ч, смесь разбавляли водой (15 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,25 г (63%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 396,05. Найдено m/z: (+) 397 (M+1)+; (-) 395 (M-1)-.
Пример 2. Соединение I-2: 7-(3-Карбоксиазетидин-1-ил)-3-(бензоксазол-2-ил)кумарин
[00272] 3-(Бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,56 г, 2 ммоль) и 3-карбоксиазетидин (0,3 г, 3 ммоль) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). После перемешивания в течение 9 ч при 125 °C и выдерживании при комнатной температуре в течение 1 ч, реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,41 г (56%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 362,09. Найдено m/z: (+) 363 (M+1)+.
Пример 3. Соединение I-3: 7-(3-Карбоксиазетидин-1-ил)-3-(бензимидазол-2-ил)кумарин
[00273] 3-(Бензимидазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (FC-2, 0,56 г, 2 ммоль, 1 экв.) и 3-карбоксиазетидин (AC-C4, 0,3 г, 3 ммоль, 1,5 экв.) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). Смесь перемешивали в течение 9 ч при 120 °C. Добавляли дополнительные порции 3-карбоксиазетидина (0,3 г, 3 ммоль) и DIPEA (0,26 г, 2 ммоль). После перемешивания при 120 °C в течение дополнительных 3 ч, и выдерживании при комнатной температуре в течение 1 ч, реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,26 г (36%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 361,11. Найдено m/z: (+) 362 (M+1)+; (-) 360 (M-1)-.
Пример 4. Соединение I-4: 7-(3-Карбоксиазетидин-1-ил)-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин
[00274] 3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,30 г, 1 ммоль) и 3-карбоксиазетидин (0,2 г, 2 ммоль) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). После перемешивания в течение 8 ч при 120 °C и выдерживании при комнатной температуре в течение 1 ч реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирают фильтрацией под вакуумом. Выход 0,28 г (75%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 378,07. Найдено m/z: (+) 379 (M+1)+; (-) 377 (M-1)-.
Пример 5. Соединение I-5: 7-(3-Карбоксипирролидин-ил-1)-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин
[00275] 3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,30 г, 1 ммоль) и 3-карбоксипирролидин (0,23 г, 2 ммоль) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). После перемешивания в течение 6 ч при 120 °C и выдерживании при комнатной температуре в течение 1 ч, реакционную смесь разбавляли водой (20 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,31 г (80%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 392,08. Найдено m/z: (+) 393 (M+1)+; (-) 391 (M-1)-.
Пример 6. Соединение I-6: 7-(4-Карбоксипиперидин-1-ил)-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин
[00276] 3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,30 г, 1 ммоль) и изонипекотиновая кислота (0,26 г, 2 ммоль) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). После перемешивания в течение 6 ч при 120 °C и выдерживании при комнатной температуре в течение 1 ч, реакционную смесь разбавляли водой (20 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,34 г (83%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 406,10 Найдено m/z: (+) 407 (M+1)+; (-) 405 (M-1)-.
Пример 7. Соединение I-7: 7-(3-Карбоксиазетидин-1-ил)-3-(6-сульфо-бензотиазол-2-ил)кумарин
[00277] 7-(3-Карбоксиазетидин-1-ил)-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин (0,38 г, 1 ммоль) добавляли при температуре около -5°C в 20% дымящую серную кислоту (0,5 мл). Смесь перемешивали при охлаждении в течение нескольких часов, а затем при комнатной температуре в течение 3 ч. После перемешивания в течение 1 ч при 80 °C и выдерживании при комнатной температуре в течение 1 ч, реакционную смесь разбавляли безводным диэтиловым эфиром (10 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирают фильтрацией под вакуумом. Продукт очищали с помощью ВЭЖХ. Выход 0,1 г (22%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 458,02. Найдено m/z: (+) 459 (M+1)+.
Пример 8. Соединение I-8: 7-(3-Карбоксиазетидин-1-ил)-3-(6-сульфамидо-бензоксазол-2-ил)кумарин
[00278] 3-(6-Сульфамидо-бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,36 г, 1 ммоль) и 3-карбоксиазетидин (0,3 г, 3 ммоль) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). После перемешивания в течение 9 ч при 125 °C и выдерживании при комнатной температуре в течение 1 ч, реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,26 г (60%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 441,06. Найдено m/z: (+) 442 (M+1)+.
Пример 9. Сравнение интенсивностей флуоресценции
[00279] Интенсивности флуоресценции некоторых растворов красителей (при максимальной длине волны возбуждения 450 нм) сравнивали со стандартным красителем для одной той же области спектра. Результаты проиллюстрированы в Таблице 1 и демонстрируют существенные преимущества красителей для применения в флуоресцентных аналитических устройствах.
Таблица 1. Спектральные свойства флуоресцентных красителей, описанных в данном документе в примерах.
в EtOH-воде 1:1
Пример 10. Общий метод синтеза полностью функционализированных нуклеотидных конъюгатов
[00280] Флуоресцентные красители кумарина, описанные в данном документе, связывали с соответствующими аминозамещенными адениновыми (А) и цитозиновыми (С) нуклеотидными производными A-LN3-NH2 или C-LN3-NH2:
[00281] После активации карбоксильной группы красителя соответствующими реагентами в соответствии со следующей схемой для аденина:
[00282] Общий продукт связывания аденина проиллюстрирован ниже:
ffA-LN3-краситель относится к полностью функционализированному нуклеотиду с линкером LN3 и меченному кумариновым красителем, описанным в данном документе. Группа R в каждой из структур относится к фрагменту кумаринового красителя после конъюгации.
[00283] Краситель (10 мкмоль) высушивают, помещая его в круглодонную колбу объемом 5 мл, и растворяют в безводном диметилформамиде (ДМФА, 1 мл), а затем отгоняют растворитель в вакууме. Эту методику повторяют дважды. Высушенный краситель растворяют в безводном N, N-диметилацетамиде (DMA, 0,2 мл) при комнатной температуре. N, N,N',N'-Тетраметил-O- (N-сукцинимидил)урония тетрафторборат (TSTU, 1,5 экв., 15 мкмоль, 4,5 мг) добавляют к раствору красителя, затем к данному раствору микропипеткой добавляют DIPEA (3 экв., 30 мкмоль, 3,8 мг, 5,2 мкл). Реакционную колбу герметично закрывают в атмосфере азота. За ходом реакции следят с помощью ТСХ (элюент ацетонитрил-вода 1:9) и ВЭЖХ. Между тем раствор соответствующего амино-замещенного нуклеотидного производного (A-LN3-NH2, 20 мМ, 1,5 экв., 15 мкмоль, 0,75 мл) концентрируют в вакууме, затем повторно растворяют в воде (20 мкл). Раствор активированного красителя в DMA переносят в колбу, содержащую раствор N-LN3-NH2. Еще добавляют DIPEA (3 экв., 30 мкмоль, 3, 8 мг, 5,2 мкл) вместе с триэтиламином (1 мкл). За ходом связывания ежечасно следят с помощью ТСХ, ВЭЖХ и ЖХ-МС. По завершении реакции к реакционной смеси с помощью пипетки добавляют буфер триэтиламина гидрокарбоната (TEAB, 0,05 M ~3 мл). Исходную очистку полностью функционализированного нуклеотида выполняют путем пропускания гашеной реакционной смеси через колонку DEAE-Sephadex® для удаления большей части оставшегося непрореагировавшего красителя. Например, Sephadex выливают в пустой картридж Biotage весом 25 г, систему растворителей TEAB/MeCN. Раствор из колонки Sephadex концентрируют в вакууме. Оставшийся материал повторно растворяют в минимальном объеме воды и ацетонитрила перед фильтрацией через нейлоновый фильтр 20 мкм. Отфильтрованный раствор очищают препаративной ВЭЖХ. Состав полученных соединений подтвержден ЖХ-МС.
[00284] Общий продукт для связывания цитозина соответствует приведенному ниже с последующей методикой, аналогичной описанной выше.
ffC-LN3-Краситель относится к полностью функционализированному С нуклеотиду с линкером LN3 и меченному кумариновым красителем, описанным в данном документе. Группа R в каждой из структур относится к фрагменту кумаринового красителя после конъюгации.
Пример 11. Получение амидных производных соединений формулы (I)
[00285] Некоторые дополнительные варианты реализации, описанные в данном документе, относятся к амидным производным соединений формулы (I) и способам их получения, причем способы включают превращение соединения формулы (Ia) в соединение формулы (Ia') путем активации карбоновой кислоты:
и введение соединения формулы (Ia') в реакцию с первичным или вторичным амином формулы (Am) с получением амидного производного формулы (Ib):
где переменные X, R, R1, R2, R3, R4 и n определены в данном документе; R' представляет собой фрагмент остатка карбоксил-активирующего агента (такого как N-гидроксисукцинимид, нитрофенол, пентафторфенол, HOBt, BOP, PyBOP, DCC, и т.д.); каждый из RA и RB независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C2-6 алкенил, C2-6 алкинил, C3-7 карбоциклил, C6-10 арил, 5-10 членный гетероарил, 3-10 членный гетероциклил, аралкил, гетероаралкил или (гетероциклил)алкил.
Общий метод получения соединений формулы (Ib)
[00286] Соответствующий краситель формулы (Ia) (0,001 моль) растворяют в подходящем безводном органическом растворителе (ДМФА, 1,5 мл). К данному раствору добавляют карбоксил-активирующий реагент, такой как TSTU, BOP или PyBOP. Данную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение около 20 мин, затем добавляют соответствующие производные амина. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, фильтруют и избыток активирующего реагента гасят 0,1 М раствором TEAB в воде. Растворители выпаривают в вакууме, остаток повторно растворяют в растворе TEAB и очищают с помощью ВЭЖХ.
Пример 12. Способы применения двухканального секвенирования
[00287] Эффективность нуклеотидов A, меченных красителями, описанными в данном документе, при применении в секвенировании была продемонстрирована в двухканальном способе обнаружения, как описано в данном документе. В отношении двухканальных способов, описанных в данном документе, нуклеиновые кислоты можно секвенировать с применением способов и систем, описанных в данном документе и/или в публикации патента США № 2013/0079232, описание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
[00288] При двухканальном обнаружении нуклеиновая кислота может быть секвенирована путем обеспечения первого типа нуклеотидов, который обнаруживают в первом канале, второго типа нуклеотидов, который обнаруживают во втором канале, третьего типа нуклеотидов, который обнаруживают как в первом, так и во втором канале, и четвертого типа нуклеотидов, в котором отсутствует метка, которую не обнаруживают или минимально обнаруживают в любом канале. Диаграммы рассеяния генерировали с помощью анализа RTA2.0.93 эксперимента. Диаграммы рассеяния, проиллюстрированные на ФИГ. 23-25, находились в цикле 5 каждого из 26 циклов прогонки.
[00289] На ФИГ. 23 проиллюстрирована диаграмма рассеяния смеси полностью функционализированных нуклеотидов (FN), содержащей: A-I-4 (0,5 мкМ), A-NR550S0 (1,5 мкМ), C-NR440 (2 мкМ), темный G (2 мкМ) и T-AF550POPOS0 (2 мкМ) в буфере включения с Pol812. Воздействие синего цвета (Канал 1) 500 мс, воздействие зеленого цвета (Канал 2) 1000 мс; Сканировали в сканирующей смеси).
[00290] На ФИГ. 24 проиллюстрирована диаграмма рассеяния смеси полностью функционализированных нуклеотидов (FN), содержащей: A-I-5 (1 мкМ), A-NR550S0 (1 мкМ), C-NR440 (2 мкМ), темный G (2 мкМ) и T-AF550POPOS0 (2 мкМ) в буфере включения с Pol812. Воздействие синего цвета (Канал 1) 500 мс, воздействие зеленого цвета (Канал 2) 1000 мс; Сканировали в сканирующей смеси.
[00291] На ФИГ. 25 проиллюстрирована диаграмма рассеяния смеси полностью функционализированных нуклеотидов (FN), содержащей: A-I-6 (1 мкМ), A-NR550S0 (1 мкМ), C-NR440 (2 мкМ), темный G (2 мкМ) и T-AF550POPOS0 (2 мкМ) в буфере включения с Pol812. Воздействие синего цвета (Канал 1) 500 мс, воздействие зеленого цвета (Канал 2) 1000 мс; Сканировали в сканирующей смеси.
[00292] На каждой из ФИГ. 23-25, нуклеотид «G» не помечен и проиллюстрирован в виде нижнего левого облака («темный G»). Сигнал от смеси нуклеотида «A», меченного красителями, описанными в данном документе, и зеленого красителя (NR550S0) проиллюстрирован в виде верхнего правого облака на ФИГ. 23-25, соответственно. Сигнал от нуклеотида «T», меченного красителем AF550POPOS0, обозначен верхним левым облаком, а сигнал от нуклеотида «С», меченного красителем NR440, обозначен нижним правым облаком. По оси X проиллюстрирована интенсивность сигнала для одного (синего) канала, а по оси y проиллюстрирована интенсивность сигнала для другого (зеленого) канала. Химические структуры NR440, AF550POPOS0 и NR550S0 описаны в публикациях PCT №№ WO 2018/060482, WO 2017/051201 и WO 2014/135221, соответственно, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
[00293] На каждой из ФИГ. 23-25 проиллюстрировано, что полностью функционализированные А-нуклеотидные конъюгаты, меченные красителем, описанным в данном документе, обеспечивают достаточную интенсивность сигнала и большее разделение облаков.
Пример 13. Соединение II-1: 7-Бис(2-карбоксиэтил)амино-3-(5-хлор-бензоксазол-2-ил)кумарин
[00294] 3-(5-Хлор-бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,32 г, 1 ммоль) и бисиминопропионовую кислоту (0,32 г, 2 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (5 мл). Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре и добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 6 часов при 130 °C. После выдерживания при комнатной температуре в течение ~1 ч, бледно-желтую реакционную смесь разбавляли водой (15 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход: 0,40 г (88%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 456,07. Найдено m/z: (+) 427 (M+1).
Пример 14. Соединение II-2: 7-Диэтиламино-3-(5-карбокси-бензоксазол-2-ил)кумарин
[00295] 3-(5-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,33 г, 1 ммоль) и диэтиламин (0,29 г, 4 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (15 мл). Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре и добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали с холодильником в течение 12 ч при 115 °C. Дополнительные порции диэтиламина (0,14 г, 2 ммоль) и DIPEA (0,26 г, 2 ммоль) добавляли, и перемешивание при 115 °C продолжали в течение 5 ч. Затем половину объема растворителя отгоняли под вакуумом, и полученную смесь оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 ч. Полученную смесь разбавляли водой (15 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом и промывали водой. Выход 0,24 г (62%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 378,12. Найдено m/z: (+) 379 (M+1)+; (-) 377 (M-1)-.
Альтернативный синтез
[00296] Этил(5-карбоксибензоксазол-2-ил)ацетат (0,25 г, 1 ммоль), диэтиламиносалициловый альдегид (0,19 г, 1 ммоль), пиперидин (3 капли) и уксусную кислоту (3 капли) добавляли в безводный этанол (EtOH, 5 мл) в круглодонной колбе. Полученную смесь перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре, а затем при 60-65 °C в течение 12 ч. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом и промывали водой. Выход: 0,27 г (72%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 378,12. Найдено m/z: (+) 379 (M+1)+; (-) 377 (M-1)-.
Пример 15. Соединение II-3: 7-Диэтиламино-3-(5-карбокси-бензимидазол-2-ил)кумарин
[00297] 3-(5-Карбоксибензимидазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,32 г, 1 ммоль) и диэтиламин (0,29 г, 4 ммоль) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 15 мл) в круглодонной колбе. После завершения прибавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали с холодильником в течение 12 ч при 115 °C. Дополнительные порции диэтиламина (0,14 г, 2 ммоль) и DIPEA) 0,26 г, 2 ммоль) добавляли, и смесь нагревали при 115 °C в течение дополнительных 8 ч. Половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 ч, смесь разбавляли водой (15 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом и промывали водой. Выход: 0,17 г (44%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 377,14. Найдено m/z: (+) 378 (M+1)+; (-) 376 (M-1)-.
Альтернативный синтез
[00298] Этил(5-карбоксибензимидазол-2-ил)ацетат (0,25 г, 1 ммоль), диэтиламиносалициловый альдегид (0,19 г, 1 ммоль), пиперидин (3 капли) и уксусную кислоту (3 капли) добавляли в безводный этанол (EtOH, 5 мл) в круглодонной колбе. Полученную смесь перемешивали в течение ночи при 75 °C. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом и промывали водой. Выход: 0,26 г (70%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 377,14. Найдено m/z: (+) 378 (M+1)+; (-) 376 (M-1)-.
Пример 16. Соединение II-4: 7-[N-(3-Карбоксипропил)-N-метил]амино-3-(бензтиазол-2-ил)кумарин
[00299] 3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,30 г, 1 ммоль) и 4-(метиламино)бутановую кислоту (0,23 г, 2 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (5 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 8 ч при ~ 120 °C, а затем при комнатной температуре в течение около 1 ч. Бледно-желтую смесь разбавляли водой (15 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход: 0,19 г (48%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 456,07. Найдено m/z: (+) 427 (M+1).
Пример 17. Соединение II-5: 7-[N-(3-Карбоксипропил)-N-(3-сульфопропил)амино]-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин (триэтиламмониевая соль)
Стадия 1: Получение 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-(3-сульфопропил]}амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарина (Соединение II-5tBu)
[00300] 3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,3 г, 1 ммоль) и трет-бутил-4-[N-(3-сульфо)пропил]-аминобутаноат (0,56 г, 2 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (3 мл) в круглодонной колбе. Смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем DIPEA (0,65 г, 5 ммоль) добавляли к данной смеси. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при 120 °C. Половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. Смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение 1 ч, и полученную смесь разбавляли водой (10 мл) и продукт соединения II-5tBu выделяли в виде триэтиламмониевой соли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. Выход 0,5 г (76%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 558,15. Найдено m/z: (+) 559 (M+1).
[00301] Стадия 2: Трифторуксусную кислоту (3 мл) добавляли к смеси триэтиламмонио 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-[(3-сульфонатопропил]}амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарина (0,66 г, 1 ммоль) в безводном дихлорметане (25 мл), и смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Растворители были удалены перегонкой. Остаток растворяли в смеси ацетонитрил-вода (1: 1,10 мл), и продукт выделяли в виде триэтиламмониевой соли соединения II-5 препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. Выход: 0,6 г (97%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 502,09. Найдено m/z: (+) 503 (M+1)+; (-), 501 (M-1)-.
Пример 18. Соединение II-6: 7-[N-(3-Карбоксипропил)-N-(3-сульфопропил)амино]-3-(5-хлор-бензоксазол-2-ил)кумарин (триэтиламмониевая соль)
[00302] Стадия 1. Получение 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-(3-сульфопропил]}амино-3-[5-хлорбензоксазол-2-ил)кумарина (Соединение II-6tBu)
[00303] 3-(5-Хлор-бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,32 г, 1 ммоль) и трет-бутил-4-[N-(3-сульфо)пропил]-аминобутаноат (0,56 г, 2 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (5 мл) в круглодонной колбе. Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем DIPEA (0,65 г, 5 ммоль) добавляли к данной смеси. После перемешивания в течение 5 часов при 125 °C половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. Смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение 1 ч, затем разбавляли смесью вода-ацетонитрил 1:1 (10 мл), и продукт соединения II-6tBu выделяли в виде триэтиламмониевой соли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. Выход: 0,38 г (56%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 576,13. Найдено m/z: (+) 577 (M+1).
[00304] Стадия 2. Смесь триэтиламмонио 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-[(3-сульфонатопропил]}амино-3-(5-хлор-бензоксазол-2-ил)кумарина (0,68 г, 1 ммоль) в безводном дихлорметане (25 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (3 мл), и полученную смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Растворители отогнали, остаток растворяли в смеси ацетонитрил - вода 1:1 (10 мл), и продукт выделяли в виде триэтиламмониевой соли соединения II-6 препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. Выход: 0,6 г (96%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 520,07. Найдено m/z: (+) 521 (M+1)+; (-), 519 (M-1)-.
Пример 18. Соединение II-7: 7-[N-(3-Карбоксипропил)-N-(3-сульфопропил)амино]-3-(бензоксазол-2-ил)кумарин (выделяли в виде триэтиламмониевой соли)
[00305] Стадия 1. Получение 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-(3-сульфопропил]}амино-3-(бензоксазол-2-ил)кумарина (Соединение II-7tBu)
[00306] 3-(Бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,28 г, 1 ммоль) и трет-бутил-4-[N-(3-сульфо)пропил]-аминобутаноат (0,56 г, 2 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (5 мл) в круглодонной колбе. Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем DIPEA (0,65 г, 5 ммоль) добавляли к данной смеси. После перемешивания в течение 8 часов при 120 °C половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. Смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение 1 ч, затем разбавляли смесью вода-ацетонитрил 1:1 (10 мл), и продукт соединения II-7tBu выделяли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. Выход: 0,15 г (27%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 542,17. Найдено m/z: (+) 543 (M+1).
[00307] Стадия 2. Смесь 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-[(3-сульфонатопропил]}амино-3-(бензоксазол-2-ил)кумарина (0,27 г, 0,5 ммоль) в безводном дихлорметане (15 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (2 мл), и полученную смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Растворители отогнали, остаток растворяли в смеси ацетонитрил - вода 1:1 (10 мл), и продукт выделяли в виде триэтиламмониевой соли с помощью препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. Выход: 87%.
Пример 19. Соединение II-8: 7-[N-(3-Карбоксипропил)-N-(3-сульфопропил)амино]-3-[6-(аминосульфонил)бензоксазол-2-ил]кумарин
[00308] Стадия 1. Получение 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-(3-сульфопропил]}амино-3-[6-(аминосульфонил)бензоксазол-2-ил]кумарина (Соединение II-8tBu)
[00309] 3-[6-(Аминосульфонил)бензоксазол-2-ил]-7-фтор-кумарин (0,18 г, 0,5 ммоль) и трет-бутил-4-[N-(3-сульфо)пропил]-аминобутаноат (0,28 г, 1 ммоль) смешивали с безводным ДМСО (3 мл) в круглодонной колбе. Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,65 г, 5 ммоль). После перемешивания в течение 7 часов при 120 °C половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. Смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение одного часа, затем разбавляли смесью вода-ацетонитрил 1:1 (10 мл), и продукт соединения II-8tBu выделяли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. После упаривания растворителей желтый осадок отфильтровывали. Выход: 0,31 г (50%). Чистота, структура и состав красителя подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 621,15. Найдено m/z: (+) 622 (M+1).
[00310] Стадия 2. К смеси 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-[(3-сульфонатопропил]}амино-3-[6-(аминосульфонил)бензоксазол-2-ил]кумарина (0,31 г, 0,5 ммоль) в безводном дихлорметане (15 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (2 мл) , и полученный раствор перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Растворители отогнали, остаток растворяли в смеси ацетонитрил - вода 1:1 (10 мл), и растворители отогнали снова. Соединение II-8 отфильтровали и промыли ацетонитрилом. Выход: 0,25 г (87%).
Пример 20. Соединение II-9: 7-[N-(3-Карбоксипропил)-N-(3-сульфопропил)амино]-3-(5-хлор-бензимидазолил-2-ил)кумарин
[00311] Стадия 1. Получение 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-(3-сульфопропил]}амино-3-[(5-хлорбензимидазолил-2-ил)кумарина (Соединение II-9tBu)
[00312] 3-(5-Хлорбензимидазолил-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,32 г, 1 ммоль) и трет-бутил-4-(N-3-сульфопропил)аминобутаноат (0,56 г, 2 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (5 мл) в круглодонной колбе. Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем DIPEA (0,65 г, 5 ммоль) добавляли к данной смеси. После перемешивания в течение 15 часов при 120 °C половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. Смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение 1 ч, затем разбавляли смесью вода-ацетонитрил 1:1 (10 мл), и продукт соединения II-9tBu выделяли в виде триэтиламмониевой соли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента.
[00313] Стадия 2. Триэтиламмонио 7-{N-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]-N-(3-сульфонатопропил)}амино-3-(5-хлорбензимидазолил-2-ил)кумарин из предыдущей стадии растворяли в безводном дихлорметане (25 мл) и добавляли трифторуксусную кислоту (5 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Растворители отогнали, остаток растворяли в смеси ацетонитрил - вода 1:1 (10 мл), и продукт выделяли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. Выход: 0,2 г (35%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 519,09. Найдено m/z: (+) 520 (M+1)+; (-), 518 (M-1)-.
Пример 21. Соединение II-10tBu: 7-[N-(3-Карбоксипропил)-N-(3-сульфопропил)амино]-3-(5-карбоксибензоксазол-2-ил)кумарин
[00314] 3-(5-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,17 г, 0,5 ммоль) и трет-бутил-4-(N-3-сульфопропил)аминобутаноат (0,28 г, 1 ммоль) смешивали с безводным ДМСО (5 мл) в круглодонной колбе. Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,65 г, 5 ммоль). После перемешивания в течение 17 часов при 110 °C половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. Смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение одного часа, затем разбавляли смесью вода-ацетонитрил 1:1 (10 мл), и продукт соединения II-10tBu выделяли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. После упаривания растворителей желтый осадок отфильтровывали. Выход: 0,23 г (80%). Чистота, структура и состав красителя подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 586,16. Найдено m/z: (+) 587 (M+1).
Пример 21. Соединение II-11tBu: 7-[N-(3-Карбоксипропил)-N-(3-сульфопропил)амино]-3-(6-карбоксибензоксазол-2-ил)кумарин
[00315] 3-(6-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,65 г, 2 ммоль) и трет-бутил-4-(N-3-сульфопропил)аминобутаноат (1,13 г, 4 ммоль) и безводный ДМСО (15 мл) перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (1,3 г, 10 ммоль). После перемешивания в течение 15 часов при 120 °C половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. Смесь оставили перемешиваться при комнатной температуре в течение одного часа, затем разбавляли смесью вода-ацетонитрил 1:1 (10 мл), и продукт соединения II-11tBu выделяли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. После упаривания растворителей желтый осадок отфильтровывали. Выход: 0,66 г (56%). Чистота, структура и состав красителя подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 586,16. Найдено m/z: (+) 587 (M+1).
Пример 22. Соединение II-12: 7-Диэтиламино-3-(5-карбокси-бензотиазол-2-ил)кумарин
[00316] Этил-(5-карбоксибензтиазол-2-ил)ацетат (0,27 г, 1 ммоль), диэтиламиносалициловый альдегид (0,21 г, 1,1 ммоль), пиперидин (5 капель) и уксусную кислоту (5 капель) добавляли в безводный этанол (5 мл), и полученную смесь перемешивали 7 ч при 60-65 °C, а затем оставляли при комнатной температуре на ночь. Полученный оранжевый осадок собирали фильтрацией под вакуумом и промывали водой. Выход: 0,28 г (72%).
Альтернативный синтез
[00317] 7-Диэтиламино-3-(5-карбоксибензоксазол-2-ил)кумарин (0,84 г, 2 ммоль) и концентрированную серную кислоту (5 мл) перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем раствор нагревали в течение 2 часов при 150 °C. Смесь оставили перемешиваться при комнатной температуре в течение одного часа, затем разбавляли ледяной водой (50 г), и реакционную смесь оставили перемешиваться в течение ночи. Желтый осадок отфильтровывали. Выход: 0,51 г (65%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 394,10. Найдено m/z: (+) 395 (M+1)+; (-) 393 (M-1)-.
Пример 23. Соединение II-13: 7-Диэтиламино-3-(5-карбокси-1-фенилбенимидазол-2-ил)кумарин
[00318] Этил-(5-карбокси-1-фенилбенимидазол-2-ил)ацетат (0,16 г, 1 ммоль) и диэтиламиносалициловый альдегид (0,21 г, 1,1 ммоль) растворяли в безводном этаноле (7 мл). Добавляли пиперидин (5 капель) и уксусную кислоту (5 капель), и полученную смесь перемешивали 5 ч при 80 °C, а затем оставляли при комнатной температуре на ночь. Полученный оранжевый осадок собирали фильтрацией под вакуумом и промывали водой. Выход: 0,16 г (70%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 453,17. Найдено m/z: (+) 454 (M+1)+; (-) 452 (M-1)-.
Пример 24. Соединение II-14: 3-(5-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-[3-(этилоксикарбонил)пропил]амино-кумарин.
[00319] 3-(5-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,65 г, 2 ммоль) и этил-4-аминобутаноата гидрохлорид (0,5 г, 3 ммоль) добавлялии в безводный ДМСО (5 мл). После завершения прибавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли диизопропилэтиламин (0,65 г, 5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при температуре 110 °C. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа желтую полутвердую реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и оставляли перемешиваться на ночь. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,5 г (58%). Чистота, структура и состав красителя подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 436,13. Найдено m/z: (+) 437 (M+1)+; (-) , 435 (M-1)-.
Пример 25. Соединение II-15: 3-(6-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-[3-(этилоксикарбонил)пропил]амино-кумарин
[00320] 3-(5-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,32 г, 1 ммоль) и этил-4-аминобутаноата гидрохлорид (0,5 г, 3 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (5 мл). После завершения прибавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли диизопропилэтиламин (0,39 г, 3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при температуре 120 °C. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа желтую полутвердую реакционную смесь разбавляли водой (10 мл), подкисляли уксусной кислотой (1 мл) и оставляли перемешиваться на ночь. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,21 г (48%). Чистота, структура и состав красителя подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 436,13. Найдено m/z: (+) 437 (M+1)+; (-) , 435 (M-1)-.
Пример 26. Соединение II-16: 7-(3-Карбоксипропил)амино-3-(5-хлорбензоксазол-2-ил)кумарин
[00321] 3-(5-Хлорбензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,32 г, 1 ммоль) и 4-аминобутановую кислоту (0,21 г, 2 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (5 мл) в круглодонной колбе. После завершения прибавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли диизопропилэтиламин (0,52 г, 4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 7 часов при температуре 135 °C. Дополнительные порции 4-аминобутановой кислоты (0,1 г, 1 ммоль) и диизопропилэтиламина (0,26 г, 2 ммоль) добавляли и нагревание продолжали при 135 °C в течение 5 часов. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа, бледно-желтую реакционную смесь разбавляли водой (15 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,12 г (30%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 398,07. Найдено m/z: (+) 399 (M+1)+.
Пример 27. Соединение II-17: 7-(3-Карбоксипропил)амино-3-(5-бензоксазол-2-ил)кумарин.
[00322] 3-(Бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,28 г, 1 ммоль) и 4-аминобутановую кислоту (0,21 г, 2 ммоль) растворяли в безводном ДМСО (5 мл), затем смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре и добавляли диизопропилэтиламин (0,26 г, 2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 7 часов при температуре 125 °C. Дополнительные порции 4-аминобутановой кислоты (0,1 г, 1 ммоль) и диизопропилэтиламина (0,13 г, 1 ммоль) добавляли и нагревание продолжали при 125 °C в течение 3 часов. Бледно-желтую реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,08 г (23%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 364,11. Найдено m/z: (+) 365 (M+1)+.
Пример 28. Соединение II-18: 3-(5-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-(3-сульфопропил)амино-кумарин
[00323] 3-(5-Карбоксибензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (0,33 г, 1 ммоль) и 3-аминопропансульфоновую кислоту (0,42 г, 3 ммоль) добавляли в безводный ДМСО (5 мл). После завершения прибавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли диизопропилэтиламин (0,39 г, 3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 7 часов при температуре 125 °C. Половину объема растворителя отгоняли под вакуумом. Смесь оставили перемешиваться при комнатной температуре в течение одного часа, затем разбавляли смесью вода-ацетонитрил 1:1 (10 мл), и продукт выделяли препаративной ВЭЖХ со смесью ацетонитрил-TEAB в качестве элюента. После упаривания растворителей желтый осадок растирали с ацетонитрилом (3 мл) и отфильтровывали. Выход: 0,06 г (14%). Чистота, структура и состав красителя подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 444,06. Найдено m/z: (+) 445 (M+1).
Пример 29. Сравнение интенсивностей флуоресценции
[00324] Интенсивности флуоресценции растворов красителя (EtOH-вода 1:1; при максимальной длине волны возбуждения 450 нм) сравнивали со стандартным красителем для одной той же области спектра. Результаты проиллюстрированы в Таблице 2 и демонстрируют существенные преимущества красителей для применения в флуоресцентных аналитических устройствах.
Таблица 2. Спектральные свойства флуоресцентных красителей, описанных в примерах.
Пример 30. Общий метод синтеза полностью функционализированных нуклеотидных конъюгатов
[00325] Флуоресцентные красители кумарина, описанные в данном документе, связывали с соответствующими аминозамещенными адениновыми (А) и цитозиновыми (С) нуклеотидными производными A-LN3-NH2 или C-LN3-NH2:
[00326] После активации карбоксильной группы красителя соответствующими реагентами в соответствии со следующей схемой для аденина:
[00327] Общий продукт связывания аденина проиллюстрирован ниже:
ffA-LN3-краситель относится к полностью функционализированному нуклеотиду с линкером LN3 и меченному кумариновым красителем, описанным в данном документе. Группа R в каждой из структур относится к фрагменту кумаринового красителя после конъюгации.
[00328] Краситель (10 мкмоль) высушивают, помещая его в круглодонную колбу объемом 5 мл, и растворяют в безводном диметилформамиде (ДМФА, 1 мл), а затем отгоняют растворитель в вакууме. Эту методику повторяют дважды. Высушенный краситель растворяют в безводном N, N-диметилацетамиде (DMA, 0,2 мл) при комнатной температуре. N, N,N',N'-Тетраметил-O- (N-сукцинимидил)урония тетрафторборат (TSTU, 1,5 экв., 15 мкмоль, 4,5 мг) добавляют к раствору красителя, затем к данному раствору микропипеткой добавляют DIPEA (3 экв., 30 мкмоль, 3,8 мг, 5,2 мкл). Реакционную колбу герметично закрывают в атмосфере азота. За ходом реакции следят с помощью ТСХ (элюент ацетонитрил-вода 1:9) и ВЭЖХ. Между тем, раствор соответствующего амино-замещенного нуклеотидного производного (A-LN3-NH2, 20 мМ, 1,5 экв., 15 мкмоль, 0,75 мл) концентрируют в вакууме, затем повторно растворяют в воде (20 мкл). Раствор активированного красителя в DMA переносят в колбу, содержащую раствор N-LN3-NH2. Еще добавляют DIPEA (3 экв., 30 мкмоль, 3, 8 мг, 5,2 мкл) вместе с триэтиламином (1 мкл). За ходом связывания ежечасно следят с помощью ТСХ, ВЭЖХ и ЖХ-МС. По завершении реакции к реакционной смеси с помощью пипетки добавляют буфер триэтиламина гидрокарбоната (TEAB, 0,05 M ~ 3 мл). Исходную очистку полностью функционализированного нуклеотида выполняют путем пропускания гашеной реакционной смеси через колонку DEAE-Sephadex® для удаления большей части оставшегося непрореагировавшего красителя. Например, Sephadex выливают в пустой картридж Biotage весом 25 г, систему растворителей TEAB/MeCN. Раствор из колонки Sephadex концентрируют в вакууме. Оставшийся материал повторно растворяют в минимальном объеме воды и ацетонитрила перед фильтрацией через нейлоновый фильтр 20 мкм. Отфильтрованный раствор очищают препаративной ВЭЖХ. Состав полученных соединений подтвержден ЖХ-МС.
[00329] Общий продукт для связывания цитозина соответствует приведенному ниже с последующей методикой, аналогичной описанной выше.
ffC-LN3-Краситель относится к полностью функционализированному С нуклеотиду с линкером LN3 и меченному кумариновым красителем, описанным в данном документе. Группа R в каждой из структур относится к фрагменту кумаринового красителя после конъюгации.
Пример 31. Получение амидных производных соединений формулы (II)
[00330] Некоторые дополнительные варианты реализации, описанные в данном документе, относятся к амидным производным соединений формулы (II) и способам их получения, причем способы включают превращение соединения формулы (IIa) в соединение формулы (IIa') путем активации карбоновой кислоты:
и введение соединения формулы (IIa') в реакцию с первичным или вторичным амином формулы (Am) с получением амидного производного формулы (IIb):
где переменные X, R, R1, R2, R3, R4 и R5 определены в данном документе; R' представляет собой фрагмент остатка карбоксил-активирующего агента (такого как N-гидроксисукцинимид, нитрофенол, пентафторфенол, HOBt, BOP, PyBOP, DCC, и т.д.); каждый из RA и RB независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C2-6 алкенил, C2-6 алкинил, C3-7 карбоциклил, C6-10 арил, 5-10 членный гетероарил, 3-10 членный гетероциклил, аралкил, гетероаралкил или (гетероциклил)алкил.
Общий метод получения соединений формулы (IIb)
[00331] Соответствующий краситель формулы (IIa) (0,001 моль) растворяют в подходящем безводном органическом растворителе (ДМФА, 1,5 мл). К данному раствору добавляют карбоксил-активирующий реагент, такой как TSTU, BOP или PyBOP. Данную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение около 20 мин, затем добавляют соответствующие производные амина. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, фильтруют и избыток активирующего реагента гасят 0,1 М раствором TEAB в воде. Растворители выпаривают в вакууме, остаток повторно растворяют в растворе TEAB и очищают с помощью ВЭЖХ.
[00332] Например, были получены первичные и вторичные амидные производные соединения II-2:
Пример 32. Способы применения двухканального секвенирования
[00333] Эффективность нуклеотидов A, меченных красителями, описанными в данном документе, при применении в секвенировании была продемонстрирована в двухканальном способе обнаружения. Что касается двухканальных способов, описанных в данном документе, нуклеиновые кислоты могут быть секвенированы с применением способов и систем, описанных в заявке на патент США № 2013/0079232, описание которой включено в полном объеме в данный документ посредством ссылки.
[00334] При двухканальном обнаружении нуклеиновая кислота может быть секвенирована путем обеспечения первого типа нуклеотидов, который обнаруживают в первом канале, второго типа нуклеотидов, который обнаруживают во втором канале, третьего типа нуклеотидов, который обнаруживают как в первом, так и во втором канале, и четвертого типа нуклеотидов, в котором отсутствует метка, которую не обнаруживают или минимально обнаруживают в любом канале. Диаграммы рассеяния генерировали с помощью анализа RTA2.0.93 эксперимента. Диаграмма рассеяния, проиллюстрированная на фигуре ниже, находилась в цикле 5 каждого из 26 циклов прогонки.
[00335] Условия секвенирования:
[00336] Сканирование при 60C, Pol1671, на CCL FC (кластерная химическая линеаризация), PhiX
[00337] Зеленый краситель, описанный ниже, за исключением набора 3: fffA-BL-NR550S0 /ffT-AF550POPOS0
Диаграмма рассеяния
[00338] В некоторых вариантах реализации соединения замещенных вторичным амином кумаринов могут быть конкретно пригодными для способов обнаружения флуоресценции и секвенирования путем синтеза. Описанные в данном документе варианты реализации относятся к красителям и их производным структуры формулы (III) или их солям.
(III)
где:
X представляет собой O, S, Se или NRn, где Rn представляет собой H или C1-6алкил;
R и R1 , каждый независимо, представляют собой H, галоген, -CN, -CO2H, амино, -OH, C-амидо, N-амидо, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил;
R2 и R4 , каждый независимо, представляют собой H, галоген, -CN, -CO2H, амино, -OH, C-амидо, N-амидо, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил; или один из R2 и R4 соединен с R3 с образованием необязательно замещенного гетероциклического кольца;
R3 представляет собой H, C1-6алкил, замещенный C2-6алкил, необязательно замещенный C2-6алкенил, необязательно замещенный C2-6алкинил или необязательно замещенный карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил или R3 соединен с R2 или R4 с образованием необязательно замещенного кольца;
причем когда R представляет собой -CN, R3 не представляет собой C1-6алкил;
каждый R5 независимо представляет собой галоген, -CN, -CO2H, амино, -OH, C-амидо, N-амидо, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил; и
m равно 0, 1, 2, 3 или 4.
[00339] В некоторых аспектах R не представляет собой -CN, такой, когда R представляет собой H, галоген, -CO2H, амино, -OH, C-амидо, N-амидо, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил.
[00340] В другом аспекте представлено соединение формулы (IV) или его фармацевтически приемлемая соль:
(IV)
где:
X' выбран из O, S и NRp, где Rp представляет собой H или C1-6алкил;
R6 представляет собой H или C1-4алкил;
R7 представляет собой H, галоген, -CN, -OH, необязательно замещенный C1-4алкил, необязательно замещенный C1-4алкенил, необязательно замещенный C2-4алкинил, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил), -SO2N(C1-4алкил)2 и необязательно замещенный C1-4алкокси;
R8 и R10, каждый независимо, представляют собой H, галоген, -CN, -CO2H, амино, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил), -SO2N(C1-4алкил)2, необязательно замещенный C1-6алкил, необязательно замещенный C1-6алкенил, необязательно замещенный C2-6алкинил или необязательно замещенный C1-6алкокси; или
один из R8 и R10 представляет собой H, галоген, -CN, -CO2H, амино, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил), -SO2N(C1-4алкил)2, необязательно замещенный C1-6алкил, необязательно замещенный C1-6алкенил, необязательно замещенный C2-6алкинил или необязательно замещенный C1-6алкокси, а другой из R8 и R10 взят с R9 с образованием необязательно замещенного 4-7-членного гетероциклического кольца;
R9 представляет собой C2-6алкил или C1-6алкил, замещенный -CO2H, -CO2C1-4алкил, -CONH2, -CONH(C1-4алкил), -CON(C1-4алкил)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил) или -SO2N(C1-4алкил)2;
каждый R11 независимо представляет собой галоген, -CN, карбокси, амино, -OH, C-амидо, N-амидо, нитро, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил), -SO2N(C1-4алкил)2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил и необязательно замещенный C1-6алкокси; и
q равно 0, 1 или 2.
[00341] Что касается соединений формулы (III) или их солей, конкретные варианты реализации разнообразных заместителей проиллюстрированы ниже. Каждая отдельная группа может быть объединена с любым другим индивидуальным ограничением, если не указано иное.
[00342] Для улучшения флуоресцентных свойств биомаркеров и особенно их биоконъюгатов в растворах на водной основе соединение формулы (III) представляет собой соединение, в котором:
i) R2 представляет собой -SO3H; и/или
ii) R4 представляет собой -SO3H; и/или
iii) R5 представляет собой -SO3H или -SO2NH2.
[00343] В некоторых аспектах X представляет собой O или S. В некоторых аспектах X представляет собой O. В некоторых аспектах X представляет собой S. В некоторых аспектах X представляет собой NRn, где Rn представляет собой H или C1-6алкил, и в некоторых аспектах, Rn представляет собой H.
[00344] В некоторых аспектах R3 представляет собой H. В некоторых аспектах R3 представляет собой метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил или гексил. В других аспектах R3 представляет собой этил. В других аспектах R3 представляет собой замещенный С2-6алкил. В других аспектах R3 представляет собой C2-6алкил, замещенный -CO2H. В других аспектах R3 представляет собой необязательно замещенный C2-6алкенил или необязательно замещенный C2-6алкинил. В некоторых аспектах R3 соединен с R2 или R4 с образованием необязательно замещенного кольца.
[00345] Если связывание с линкером или нуклеотидом осуществляется через R3, R3 должен быть достаточной длины, чтобы обеспечить соединение с присоединенной к нему функциональной группой. В некоторых аспектах R3 не представляет собой -CH2COOH или -CH2COO-.
[00346] Необязательно R3 представляет собой -(CH2)nCOOH, где n равно 2-6. В некоторых аспектах n равно 2, 3, 4, 5 или 6. В других аспектах n равно 2 или 5. В некоторых аспектах n равно 2. В некоторых аспектах n равно 5.
[00347] Необязательно R3 представляет собой -(CH2)nSO3H, где n равно 2-6. В некоторых аспектах n равно 2, 3, 4, 5 или 6. В других аспектах n равно 2 или 5. В некоторых аспектах n равно 2. В некоторых аспектах n равно 5.
[00348] Бензольное кольцо индольного фрагмента необязательно замещено в любом одном, двух, трех или четырех положениях заместителем, показанным как R5. Когда m равно нулю, бензольное кольцо не замещено. Когда m равно более чем 1, каждый R5 могут быть одними и теми же или разными. В некоторых аспектах m равно 0. В других аспектах m равно 1. В других аспектах m равно 2. В некоторых аспектах m равно 1, 2 или 3, и каждый R5 независимо представляет собой галоген, -CN, -CO2H, амино, -OH, -SO3H или -SO2NH2. В некоторых аспектах R5 представляет собой -(CH2)xCOOH, где x равно 2-6. В некоторых аспектах x равно 2, 3, 4, 5 или 6. В других аспектах x равно 2 или 5. В некоторых аспектах x равно 2. В некоторых аспектах x равно 5.
[00349] В некоторых аспектах R5 представляет собой галоген, -CN, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2 или необязательно замещенный C1-6алкил. В некоторых аспектах R5 представляет собой галоген, -CO2H, -SO3H или -SO2NH2. В некоторых аспектах R5 представляет собой C2-6алкил, замещенный -CO2H, -SO3H или -SO2NH2. В некоторых аспектах каждый R5 независимо представляет собой необязательно замещенный C1-6алкил, галоген, -CN, -CO2H, амино, -OH, -SO3H или -SO2NH2.
[00350] В некоторых аспектах R1 представляет собой H. В некоторых аспектах R1 представляет собой галоген. В некоторых аспектах R1 представляет собой Cl. В некоторых аспектах R1 представляет собой C1-6алкил. В некоторых аспектах R1 представляет собой метил.
[00351] В некоторых аспектах R представляет собой H. В некоторых аспектах R представляет собой галоген. В некоторых аспектах R представляет собой Cl. В некоторых аспектах R представляет собой C1-6алкил. В некоторых аспектах R представляет собой метил. В некоторых аспектах R не представляет собой -CN. В некоторых аспектах R представляет собой H, галоген, -CO2H, амино, -OH, C-амидо, N-амидо, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил.
[00352] В некоторых аспектах R2 представляет собой H. В некоторых аспектах R2 представляет собой необязательно замещенный алкил. В некоторых аспектах R2 представляет собой C1-4алкил, необязательно замещенный -CO2H или -SO3H. В некоторых аспектах R2 представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R2 соединен с R3 с образованием необязательно замещенного гетероциклического кольца, такого как пирролидин или пиперидин, необязательно замещенный одной или более алкильными группами. В некоторых аспектах R2 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, C1-4алкил, необязательно замещенный -CO2H или -SO3H или -SO3H. В некоторых аспектах R2 представляет собой H или -SO3H.
[00353] В некоторых аспектах R4 представляет собой H. В некоторых аспектах R4 представляет собой необязательно замещенный алкил. В некоторых аспектах R4 представляет собой C1-4алкил, необязательно замещенный -CO2H или -SO3H. В некоторых аспектах R4 представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R4 соединен с R3 с образованием необязательно замещенного гетероциклического кольца, такого как пирролидин или пиперидин, необязательно замещенный одной или более алкильными группами.
[00354] Конкретные примеры соединения формулы (III) включают такие, где X представляет собой O или S; R представляет собой H; R1 представляет собой H; R3 представляет собой -(CH2)nCOOH, где n равно 2-6; R5 представляет собой H, -SO3H или -SO2NH2; R2 представляет собой H или -SO3H; и R4 представляет собой H или -SO3H.
[00355] Конкретные примеры соединения формулы (III) включают такие, где X представляет собой O или S; R представляет собой H; R1 представляет собой H; R3 представляет собой -(CH2)2COOH; R5 представляет собой H, -SO3H или -SO2NH2; R2 представляет собой H или -SO3H; и R4 представляет собой H или -SO3H.
[00356] Конкретные примеры соединения формулы (III) включают такие, где X представляет собой O или S; R представляет собой H; R1 представляет собой H; R3 представляет собой -(CH2)5COOH; R5 представляет собой H, -SO3H или -SO2NH2; R2 представляет собой H или -SO3H; и R4 представляет собой H или -SO3H.
[00357] В некоторых аспектах формулы (IV), X' представляет собой O. В некоторых аспектах X' представляет собой S. В некоторых аспектах X' представляет собой NRp, где Rp представляет собой H или C1-6алкил. В некоторых аспектах X' представляет собой NRp, где Rp представляет собой H.
[00358] В некоторых аспектах R6 представляет собой H. В некоторых аспектах R6 представляет собой C1-4алкил.
[00359] В некоторых аспектах R7 представляет собой H. В некоторых аспектах R7 представляет собой необязательно замещенный C1-4алкил, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил) или -SO2N(C1-4алкил)2. В некоторых аспектах R7 представляет собой C1-4алкил, необязательно замещенный -CO2H.
[00360] В некоторых аспектах R8 представляет собой H. В некоторых аспектах R8 представляет собой -CO2H, -SO3H или -SO2NH2. В некоторых аспектах R8 представляет собой -SO3H.
[00361] В некоторых аспектах R10 представляет собой H. В некоторых аспектах R10 представляет собой -CO2H, -SO3H или -SO2NH2. В некоторых аспектах R10 представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R8 представляет собой H, и R10 представляет собой -SO3H. В некоторых аспектах R8 представляет собой -SO3H и R10 представляет собой H.
[00362] В некоторых аспектах один из R8 и R10 представляет собой H, галоген, -CN, -CO2H, амино, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил), -SO2N(C1-4алкил)2, необязательно замещенный C1-6алкил, необязательно замещенный C1-6алкенил, необязательно замещенный C2-6алкинил или необязательно замещенный C1-6алкокси, а другой из R8 и R10 взят с R9 с образованием необязательно замещенного 4-7-членного гетероциклического кольца.
[00363] В некоторых аспектах R9 представляет собой C2-6алкил. В некоторых аспектах R9 представляет собой C1-6алкил, замещенный -CO2H, -CO2C1-4алкил, -CONH2, -CONH(C1-4алкил), -CON(C1-4алкил)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил) или -SO2N(C1-4алкил)2. В некоторых аспектах R9 представляет собой C1-6алкил, замещенный -CO2H. В некоторых аспектах R9 представляет собой -(CH2)y-CO2H, где y равно 2, 3, 4 или 5.
[00364] В некоторых аспектах каждый R11 независимо представляет собой галоген, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4алкил), -SO2N(C1-4алкил)2 или необязательно замещенный алкил. В других аспектах каждый R11 независимо представляет собой галоген, -CO2H, -SO3H или -SO2NH2.
[00365] В некоторых аспектах q равно 0. В других аспектах q равно 1. В еще одних аспектах q равно 2.
[00366] Конкретные примеры кумариновых красителей, замещенных вторичным амином, включают в себя:
и их соли.
[00367] Особенно пригодным соединением является нуклеотид или олигонуклеотид, меченый красителем, как описано в данном документе. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к атому азота молекулы кумарина через алкилкарбоксильную группу, с образованием алкиламида. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к C5-положению пиримидинового основания или C7-положению 7-деазпуринового основания посредством линкерного фрагмента.
[00368] Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может также иметь блокирующую группу, ковалентно присоединенную к сахару рибозы или дезоксирибозы нуклеотида. Блокирующая группа может быть присоединена в любом положении на сахаре рибозе или дезоксирибозе. В конкретных вариантах реализации блокирующая группа находится в положении 3'OH сахара рибозы или дезоксирибозы нуклеотида.
[00369] В данном документе предложены наборы, содержащие два или более нуклеотидов, причем по меньшей мере один нуклеотид представляет собой нуклеотид, меченный соединением по настоящему описанию. Набор может содержать два или более меченых нуклеотидов. Нуклеотиды могут быть помечены двумя или более флуоресцентными метками. Две или более меток могут быть возбуждены с использованием одного источника возбуждения, который может представлять собой лазер. Например, длины волн возбуждения для двух или более меток могут по меньшей мере частично перекрываться, так что возбуждение в области перекрытия спектра заставляет обе метки излучать флуоресценцию. В конкретных вариантах реализации излучение от двух или более меток будет происходить в разных областях спектра таким образом, что наличие по меньшей мере одной из меток можно определить путем оптического различения излучения.
[00370] Набор может содержать четыре меченых нуклеотида, где первый из четырех нуклеотидов помечен соединением, описанным в данном документе. В таком наборе каждый из четырех нуклеотидов может быть помечен соединением, которое является одним и тем же или отличным от метки на трех других нуклеотидах. Таким образом, одно или более соединений могут иметь отчетливый максимум поглощения и/или максимум излучения, так что соединение(-я) отличается(-ются) от других соединений. Например, каждое соединение может иметь определенный максимум поглощения и/или максимум излучения, так что каждое из соединений отличается от трех других соединений. Следует понимать, что части спектра поглощения и/или спектра излучения, отличные от максимумов, могут отличаться, и данные различия можно применять для различения соединений. Набор может быть таким, чтобы два или более соединений имели отчетливый максимум поглощения. Соединения могут поглощать свет в области ниже 500 нм.
[00371] Изложенные в данном документе соединения, нуклеотиды или наборы можно применять для обнаружения, измерения или определения биологической системы (включая, например, их процессы или компоненты). Некоторые методы, в которых можно применять соединения, нуклеотиды или наборы, включают в себя секвенирование, анализ экспрессии, анализ гибридизации, генетический анализ, анализ РНК, клеточный анализ (например, анализ связывания с клетками или анализ функции клеток) или анализ белка (например, анализ связывания с белками или анализ активности белков). Данное применение может осуществляться на автоматическом приборе для выполнения конкретного метода, таком как автоматический прибор для секвенирования. Прибор для секвенирования может содержать два лазера, работающих на различных длинах волн.
[00372] В данном документе раскрыты методы синтеза соединений по данному описанию. Красители в соответствии с настоящим описанием можно синтезировать из множества различных подходящих исходных материалов. Способы получения кумариновых красителей хорошо известны в данной области.
[00373] Соединения, описанные в данном документе, могут быть представлены в виде нескольких мезомерных форм. Если изображена одна структура, подразумевается любая из соответствующих мезомерных форм. Кумариновые соединения, описанные в данном документе, представлены одной структурой, но в равной степени могут быть проиллюстрированы в виде любой из родственных мезомерных форм. Некоторые мезомерные структуры проиллюстрированы ниже для формулы (III):
(III)
[00374] В каждом случае, когда проиллюстрирована одна мезомерная форма соединения, описанного в данном документе, в равной степени предусмотрены альтернативные мезомерные формы.
[00375] Присоединение к биомолекулам может осуществляться через положение R, R1, R2, R3, R4, R5, или X соединения формулы (III). В некоторых аспектах соединение осуществляется посредством группы R3 или R5 формулы (III). Для формулы (IV) прикрепление может находиться в любом положении R6-11 или X'. В некоторых вариантах реализации группа заместителя представляет собой замещенный алкил, например алкил, замещенный -CO2H или активированную форму карбоксильной группы, например амид или сложный эфир, которые можно использовать для присоединения к амино или гидроксильной группе биомолекул. В одном варианте реализации группа R, R1, R2, R3, R4, R5 или X формулы (III) или группа R6-11 или X' формулы (IV) может содержать активированный сложноэфирный или амидный остаток, наиболее подходящий для дополнительного образования амидной/пептидной связи. В контексте данного документа термин «активированный сложный эфир» относится к производному карбоксильной группы, которое способно вступать в реакцию в мягких условиях, например с соединением, содержащим аминогруппу. Не имеющие ограничительного характера примеры активированных сложных эфиров включают, без ограничений, п-нитрофенил, пентафторфенил и сложные сукцинимидные эфиры.
[00376] В некоторых вариантах реализации соединения красителей могут быть ковалентно присоединены к олигонуклеотидам или нуклеотидам посредством нуклеотидного основания. Например, меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к C5-положению пиримидинового основания или C7-положению 7-деазпуринового основания посредством линкерного фрагмента. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может также иметь 3'-OH блокирующую группу, ковалентно присоединенную к сахару рибозы или дезоксирибозы нуклеотида.
[00377] Конкретное применение флуоресцентных красителей, как описано в данном документе, предназначено для мечения биомолекул, например нуклеотидов или олигонуклеотидов. Некоторые варианты реализации по настоящей заявке нацелены на нуклеотид или олигонуклеотид, меченный флуоресцентными соединениями, как описано в данном документе.
[00378] В следующих примерах более подробно описаны дополнительные варианты реализации, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема формулы изобретения.
[00379] В следующих примерах более подробно описаны дополнительные варианты реализации, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема формулы изобретения. В Таблице 3 обобщены спектральные свойства кумариновых флуоресцентных красителей, описанных в примерах. В Таблице 4 обобщена структура и спектральные свойства разнообразных нуклеотидов, меченных красителями, описанными в данном документе.
Пример 33: Соединение III-1-1: 7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин
[00380] Производное 3-(бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарина (FC-1, 0,4 г, 1,345 ммоль, 1 экв.) и 6-аминогексановую кислоту (AC-C5, 0,25 г, 1,906 ммоль, 1,417 экв.) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 3 мл). После завершения прибавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем N, N-диизопропил-N-этиламин (DIPEA, 0,25 г, 2 ммоль, 2 экв.) добавляли к данной смеси. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при 120 °C. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа желтую полутвердую реакционную смесь разбавляли водой (5 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,36 г (65,5%). MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 408,47. Найдено m/z: (+) 409 (M+1)+; (-) , 407 (M-1)-. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 12,03 (м, 2H), 9,00 (с, 1H), 8,12 (д, J=7,9 Гц, 1H), 7,99 (д, J=8,1 Гц, 1H), 6,73 (дд, J=8,8, 2,1 Гц, 1H), 6,54 (д, J=2,0 Гц, 1H), 3,18 (к, J=6,5 Гц, 2H), 2,23 (т, J=7,3 Гц, 2H), 1,57 (дп, J=14,7, 7,2 Гц, 4H), 1,39 (дк, J=9,2, 4,5, 3,5 Гц, 2H).
Пример 34: Соединение III-1-2: 7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(бензимидазол-2-ил)кумарин
[00381] 3-(Бензимидазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (FC-2, 0,28 г, 1 ммоль, 1 экв.) и 6-аминогексановую кислоту (AC-C5, 0,13 г, 1 ммоль, 1 экв.) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 2 мл). Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,25 г, 2 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при температуре 130 °C. Дополнительные порции 6-аминогексановой кислоты (AC-1, 0,13 г, 1 ммоль, 1 экв.) и DIPEA (0,26 г, 2 ммоль, 2 экв.) добавляли к реакционной смеси, и нагревание продолжали при 130 °C продолжали в течение 5 часов. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа, бледно-желтую реакционную смесь разбавляли водой (5 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,26 г (68,5%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 391,15. Найдено m/z: (+) 392 (M+1)+; (-) 390 (M-1)-, 781 (2M-1) -.
Пример 35: Соединение III-1-3: 7-(2-Карбоксиэтил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин
[00382] Стадия А: 7-[2-(трет-Бутилоксикарбонил)этил]амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин.
[00383] 3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (FC-1, 0,3 г, 1,01 ммоль, 1 экв.) и трет-бутил-3-аминопропионата гидрохлорид (AC-C2, 0,2 г, 1,1 ммоль, 1,09 экв.) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 2 мл), и полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,26 г, 2 ммоль, 2 экв.). Полученную смесь перемешивали в течение 2 часов при 100 °C. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа желтую реакционную смесь разбавляли водой (7 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,38 г (69%). MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 422,13. Найдено m/z: (+) 423 (M+1)+; (-) , 421 (M-1)-. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 9,28 (с, 1H), 9,01 (с, 1H), 8,27-8,16 (м, 1H), 8,10 (тт, J=8,3, 0,9 Гц, 2H), 8,05-7,92 (м, 1H), 7,72 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,66-7,55 (м, 1H), 7,51 (дддд, J=11,4, 8,2, 7,1, 1,3 Гц, 2H), 7,46-7,32 (м, 2H), 6,74 (дд, J=8,7, 2,1 Гц, 1H), 6,58 (д, J=2,1 Гц, 1H), 3,41 (к, J=6,3 Гц, 2H), 2,55 (т, J=6,4 Гц, 2H), 1,41 (с, 9H).
[00384] Стадия B.
[00385] Раствор 7-[2-(трет-бутилоксикарбонил)этил]амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарина (III-1-3tBu, 0,2 г, 0,473 ммоль) в безводном дихлорметане (20 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (0,5 мл), и полученную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Растворители отогнали, а остаток растирали с водой (10 мл). Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,15 г (86%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 366,39. Найдено m/z: (+) 367 (M+1)+; (-) , 365 (M-1)-.
Пример 36: Соединение III-1-4: 7-(3-Карбоксипропил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин
[00386] Стадия А: 7-[3-(трет-Бутилоксикарбонил)пропил]амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин.
[00387] 3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (FC-1, 0,6 г, 2,02 ммоль, 1 экв.) и трет-бутил-4-аминобутаноата гидрохлорид (AC-C3, 0,5 г, 2,56 ммоль, 1,27 экв.) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл). После завершения прибавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,65 г, 5 ммоль, 4 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при температуре 100 °C. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа желтую полутвердую реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и оставляли перемешиваться на ночь. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,7 г (79%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 436,53. Найдено m/z: (+) 437 (M+1)+; (-) , 435 (M-1)-.
[00388] Стадия B.
[00389] Раствор 7-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарина (III-1-4tBu, 0,7 г, 1,604 ммоль) в безводном дихлорметане (25 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (1 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Растворители отогнали, а остаток растирали с водой (10 мл). Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,59 г (97%). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 366,39. Найдено m/z: (+) 381 (M+1)+; (-) , 379 (M-1)-. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 12,17 (с, 1H), 9,01 (с, 1H), 8,12 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,99 (д, J=8,1 Гц, 1H), 7,71 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,48-7,30 (м, 2H), 6,73 (дд, J=8,8, 2,1 Гц, 1H), 6,57 (д, J=2,1 Гц, 1H), 3,21 (к, J=6,6 Гц, 2H), 2,36 (д, J=7,3 Гц, 2H), 1,80 (п, J=7,3 Гц, 2H).
Пример 37: Соединение III-1-5: 7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(5-хлор-бензоксазол-2-ил)кумарин
[00390] 3-(5-Хлор-бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (FC-3, 0,32 г, 1 ммоль, 1 экв.) и 6-аминогексановую кислоту (AC-C5, 0,26 г, 2 ммоль, 2 экв.) добавляли в безводный диметилсульфоксид (ДМСО, 5 мл) в круглодонной колбе. После завершения прибавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, а затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 7 часов при температуре 135 °C. Дополнительные порции 6-аминогексановой кислоты (AC-1, 0,13 г, 1 ммоль, 1 экв.) и DIPEA (0,26 г, 2 ммоль, 2 экв.) добавляли, и нагревание продолжали при 135 °C в течение 5 часов. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа, бледно-желтую реакционную смесь разбавляли водой (15 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 0,09 г (21%). Чистота, структура и состав продукта подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 426,10. Найдено m/z: (+) 427 (M+1)+; (-) 425 (M-1)-, 851 (2M-1)-.
Пример 38: Соединение III-2A 7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин-6-сульфоновая кислота и Соединение III-2B 7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин-8-сульфоновая кислота
[00391] Соединение III-1-1 (0,1 г, 0,245 ммоль) добавляли небольшими порциями при перемешивании к 20% дымящей серной кислоте (1 мл), которую охлаждали на бане сухой лед/ацетон. После завершения прибавления смесь перемешивали в течение 1 часа при 0 °C, нагревали до комнатной температуры, затем перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Раствор выливали в безводный эфир (25 мл). После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа, образовавшийся осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 78 мг (65%). 1H ЯМР (d6 -ДМСО) показал соединение 2A плюс небольшое количество (~ 4%) соединения 2B.
[00392] Пример соединения III-2A, натриевая соль: Указанный выше осадок ресуспендировали в воде (2 мл) и доводили pH суспензии до ~5 добавлением 5 М раствора NaOH. Полученную смесь выливали в 10 мл метанола, и суспензию фильтровали. Фильтрат упаривали досуха с получением красителя в виде натриевой соли (III-2A-Na). Чистота, структура и состав подтверждены методами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 488,07. Найдено m/z: (+) 489 (M+1)+; (-) 243 (M-1)2-, 487 (M-1)-.
[00393] Получение триэтиламмониевых солей соединений III-2A и III-2B: Соединение III-1-1 (0,41 г, 1 ммоль) добавляли небольшими порциями при перемешивании к 20% дымящей серной кислоте (5 мл), которую охлаждали на бане сухой лед/ацетон. После завершения прибавления смесь перемешивали в течение 1 часа при 0 °C, нагревали до комнатной температуры, затем перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Раствор выливали в безводный эфир (50 мл). После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа слой органического растворителя декантируют, а нижний полутвердый слой растворяют в смеси ацетонитрил-вода (1:1, 10 мл). pH раствора доводили до ~7,0 добавлением 2 М раствора TEAB в воде. Полученный раствор фильтровали через нейлоновый фильтр 20 мкм, и изомеры разделяли препаративной ВЭЖХ. Раствор изомеров концентрировали в вакууме, затем повторно растворяли в воде (20 мкл), и растворитель удаляли в вакууме досуха с получением красителей в виде триэтиламмониевых солей. Чистота и состав подтверждены методами ВЭЖХ и ЖХ-МС.
Пример 39: Соединение III-3 7-(5-карбоксипентил)амино-3-[5-сульфонато(бензотиазол-2-ил)-кумарин-6-сульфоната триэтиламмониевая соль
[00394] Соединение III-1-1 (0,08 г, 0,2 ммоль) добавляли небольшими порциями при перемешивании к 20% дымящей серной кислоте (2 мл), которую охлаждали на бане сухой лед/ацетон. После завершения прибавления смесь перемешивали в течение 1 часа при 0 °C, нагревали до комнатной температуры, затем перемешивали в течение 2 часов при 70 °C. Затем смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Раствор выливали в безводный эфир (30 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 часа, образовавшийся осадок собирали фильтрацией под вакуумом. Выход 43 мг (38%).
[00395] Осадок ресуспендировали в воде (2 мл) и доводили pH суспензии до ~7,5 добавлением 2 М раствора TEAB в воде. Полученную смесь фильтровали через нейлоновый фильтр 20 мкм и очищали препаративной ВЭЖХ. Фракцию красителя концентрировали в вакууме, затем повторно растворяли в воде (20 мкл), и растворитель удаляли в вакууме досуха с получением красителя в виде бис-триэтиламмониевой соли. Чистота и состав подтверждены методами ВЭЖХ и ЖХ-МС. MC (DUIS): Рассчитанная молекулярная масса 568,03. Найдено m/z: (+) 569 (M+1)+.
[00396] Интенсивности флуоресценции растворов красителей сравнивали с коммерческими красителями для одной и той же спектральной области. Результаты проиллюстрированы в Таблице 3 и демонстрируют существенные преимущества красителей для применения в флуоресцентных аналитических устройствах.
Таблица 3. Спектральные свойства флуоресцентных красителей, описанных в примерах.
в EtOH-воде 1:1
%
*Возбуждение флуоресценции при 460 нм.
Пример 40: Общий метод синтеза полностью функционализированных нуклеотидных конъюгатов с флуоресцентными красителями
[00397] Флуоресцентные красители кумарина, описанные в данном документе, связывали с соответствующими аминозамещенными адениновыми (А) и цитозиновыми (С) нуклеотидными производными A-LN3-NH2 или C-LN3-NH2:
после активации карбоксильной группы красителя соответствующими реагентами в соответствии со следующей схемой для аденина:
[00398] Общий продукт связывания аденина проиллюстрирован ниже:
ffA-LN3-краситель относится к полностью функционализированному нуклеотиду с линкером LN3 и меченному кумариновым красителем, описанным в данном документе. Группа R в каждой из структур относится к фрагменту кумаринового красителя после конъюгации.
[00399] Краситель (10 мкмоль) высушивают, помещая его в круглодонную колбу объемом 5 мл, и растворяют в безводном диметилформамиде (ДМФА, 1 мл), а затем отгоняют растворитель в вакууме. Эту методику повторяют дважды. Высушенный краситель растворяют в безводном N,N-диметилацетамиде (DMA, 0,2 мл) при комнатной температуре. N,N,N′,N′-Тетраметил-O- (N-сукцинимидил)урония тетрафторборат (TSTU, 1,5 экв., 15 мкмоль, 4,5 мг) добавляют к раствору красителя, затем к данному раствору микропипеткой добавляют DIPEA (3 экв., 30 мкмоль, 3,8 мг, 5,2 мкл). Реакционную колбу герметично закрывают в атмосфере азота. За ходом реакции следят с помощью ТСХ (элюент ацетонитрил-вода 1:9) и ВЭЖХ. Между тем, раствор соответствующего амино-замещенного нуклеотидного производного (A-LN3-NH2, 20 мМ, 1,5 экв., 15 мкмоль, 0,75 мл) концентрируют в вакууме, затем повторно растворяют в воде (20 мкл). Раствор активированного красителя в DMA переносят в колбу, содержащую раствор N-LN3-NH2. Еще добавляют DIPEA (3 экв., 30 мкмоль, 3, 8 мг, 5,2 мкл) вместе с триэтиламином (1 мкл). За ходом связывания ежечасно следят с помощью ТСХ, ВЭЖХ и ЖХ-МС. По завершении реакции к реакционной смеси с помощью пипетки добавляют буфер триэтиламина гидрокарбоната (TEAB, 0,05 M ~3 мл). Исходную очистку полностью функционализированного нуклеотида выполняют путем пропускания гашеной реакционной смеси через колонку DEAE-Sephadex® для удаления большей части оставшегося непрореагировавшего красителя. Например, Sephadex выливают в пустой картридж Biotage весом 25 г, систему растворителей TEAB/MeCN. Раствор из колонки Sephadex концентрируют в вакууме. Оставшийся материал повторно растворяют в минимальном объеме воды и ацетонитрила перед фильтрацией через нейлоновый фильтр 20 мкм. Отфильтрованный раствор очищают препаративной ВЭЖХ. Состав полученных соединений подтверждали ЖХ-МС.
Таблица 4. Структура и спектральные свойства разнообразных нуклеотидов, меченных красителями на основе кумарина, описанными в данном документе.
в SRE
[00400] Сравнение интенсивностей флуоресценции в растворе нуклеотидов, меченых красителями, описанными в данном документе, с соответствующими данными для нуклеотидов, меченых коммерческим красителем, для одной той же спектральной области (Atto465 от AttoTec GmbH) демонстрирует преимущество красителей, описанных в данном документе, в отношении мечения биомолекул для применения в флуоресцентных аналитических приложениях.
A. Пример красителей красного и зеленого цвета
[00401] Некоторые аспекты данного описания предусматривают соединения формулы (V) или их мезомерные формы:
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
p равно целому числу 1-2;
q равно целому числу 1-5;
alk представляет собой цепь из 1-5 атомов углерода, необязательно содержащую одну или более двойных или тройных связей;
Y представляет собой S, O или CH2;
Z представляет собой OH;
n равно целому числу 0-3;
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат;
каждый из Ra1 и Ra2 независимо представляет собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода; и
каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил.
[00402] В некоторых аспектах каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил, причем по меньшей мере один из Ra1 или Ra2 представляет собой SO3- или Ra1 или Ra2 представляет собой дополнительное кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода, при этом дополнительное кольцо имеет SO3-, или Rc1 или Rc2 представляет собой группу алкилсульфоновой кислоты. В некоторых аспектах каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил, где, когда n равно 0, Y представляет собой S или O. В некоторых аспектах каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил, причем по меньшей мере один из Ra1 или Ra2 представляет собой SO3- или Ra1 или Ra2 представляет собой дополнительное кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода, при этом дополнительное кольцо имеет SO3- или Rc1 или Rc2 представляет собой группу алкилсульфоновой кислоты и при том, что, когда n равно 0, Y представляет собой S или O.
[00403] Молекулы могут содержать один или более сульфонамидных или SO3- фрагментов в положении Ra. Ra1 и/или Ra2 может представлять собой SO3- или сульфонамид. Другой Ra (Ra1 или Ra2) может независимо представлять собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода. Ra1 или Ra2 может представлять собой H. Ra1 или Ra2 может представлять собой SO3-. Ra1 может отличаться от Ra2, например, структура может иметь одну сульфонамидную группу при Ra1, и H в виде Ra2. Ra1 и Ra2 оба могут представлять собой сульфонамид. Сульфонамид может представлять собой SO2NH2 или SO2NHR, где R представляет собой алкил, замещенный алкил, арил или замещенную арильную группу. Где ни Ra1, ни Ra2 не представляет собой SO3- или дополнительное кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода, тогда Rc1 или Rc2 должен представлять собой группу алкилсульфоновой кислоты.
[00404] Ra1 или Ra2 может представлять собой еще одно алифатическое, ароматическое или гетероциклическое кольцо, конденсированное с соседними атомоми углерода индольного кольца. Например, в таких случаях, когда ароматическое кольцо конденсировано, концевая группа красителя может представлять собой структуру типа:
где Rd может представлять собой H, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, галоген, карбокси, сульфонамид или сульфоновую кислоту.
[00405] Таким образом, некоторые красители по данному описанию могут быть описаны формулой (VC) или (VD) или их мезомерными формами:
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
p равно целому числу 1-2;
q равно целому числу 1-5;
alk представляет собой цепь из 1-5 атомов углерода, необязательно содержащую одну или более двойных или тройных связей;
Y представляет собой S, O или CH2;
Z представляет собой OH;
n равно целому числу 0-3;
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат;
каждый из Ra1 и Ra2 независимо представляет собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода;
каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил; и
Rd представляет собой H, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, галоген, карбокси, сульфонамид или сульфоновая кислота.
[00406] В некоторых аспектах Rd представляет собой H, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, галоген, карбокси, сульфонамид или сульфоновая кислота, причем по меньшей мере один из Ra1 или Ra2 представляет собой SO3- или Rd представляет собой SO3- или Rc1 или Rc2 представляет собой группу алкилсульфоновой кислоты. В некоторых аспектах Rd представляет собой H, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, галоген, карбокси, сульфонамид или сульфоновую кислоту, где, когда n равно 0, Y представляет собой S или O. В некоторых аспектах Rd представляет собой H, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, галоген, карбокси, сульфонамид или сульфоновую кислоту, причем по меньшей мере один из Ra1 или Ra2 представляет собой SO3- или Rd представляет собой SO3- или Rc1 или Rc2 представляет собой группу алкилсульфоновой кислоты и, при этом, когда n равно 0, Y представляет собой S или O.
[00407] В формулах (VC) или (VD) дополнительные кольца, конденсированные с соседними атомами углерода индольного кольца, могут быть необязательно замещены, например, сульфоновой кислотой или сульфонамидом.
[00408] C(=O)-X карбокси группа или ее производные присоединены к индольному атому азота с помощью алкильной цепи длиной q, где q равно 1-5 атомов углерода или гетероатомов. Цепь может представлять собой (CH2)q, где q равно 1-5. Группа может представлять собой (CH2)5COOH.
[00409] Молекулы могут содержать один или более алкил-сульфонатных фрагментов в положении Rc. Как Rc1, так и/или Rc2 может представлять собой алкил-SO3-. Другая Rc (Rc1 или Rc2) может независимо представлять собой алкил или замещенный алкил. Rc1 и Rc2 может независимо представлять собой метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил или (CH2)tSO3H, где t равно 1-6. t может быть равно 1-4. t может быть равно 4. Rc1 и Rc2 могут представлять собой замещенную алкильную группу. Rc1 и Rc2 могут содержать фрагмент COOH или -SO3H или его сложный эфир или амидные производные.
[00410] В определенных вариантах реализации, когда один из Ra1 или Ra2 представляет собой SO3-, а другой из Ra1 или Ra2 представляет собой H или SO3-, как Rc1, так и Rc2 также может представлять собой группу алкилсульфоновой кислоты.
[00411] Группа COOH, проиллюстрированная как C(=O)-X может действовать как связывающий фрагмент для дальнейшего прикрепления или связана с дополнительной молекулой. После конъюгации COOH или COO- превращается в амид или сложный эфир.
[00412] Примеры соединений включают структуры согласно формуле (VI) или (VIa) или их мезомерные формы:
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
p равно целому числу 1-2;
q равно целому числу 1-5;
alk представляет собой цепь из 1-5 атомов углерода, необязательно содержащую одну или более двойных или тройных связей;
Y представляет собой S, O или CH2;
Z представляет собой OH;
n равно целому числу 0-3;
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат;
каждый из Ra1 и Ra2 независимо представляет собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода; и
каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил.
[00413] В некоторых аспектах каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил, где, когда n равно 0, Y представляет собой S или O.
[00414] Дополнительные примеры соединений включают структуры в соответствии с формулой (VIIa) или (VIIb):
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
p равно целому числу 1-2;
q равно целому числу 1-5;
alk представляет собой цепь из 1-5 атомов углерода, необязательно содержащую одну или более двойных или тройных связей;
t равно целому числу 1-6;
Y представляет собой S, O или CH2;
Z представляет собой OH;
n равно целому числу 0-3;
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат;
каждый из Ra1 и Ra2 независимо представляет собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода; и
каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил.
[00415] В некоторых аспектах каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил, где, когда n равно 0, Y представляет собой S или O.
[00416] Дополнительные примеры соединений включают структуры в соответствии с формулой от (VIIIa) до (VIIId):
(VIIIa)
(VIIIb)
(VIIIc)
(VIIId)
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
q равно целому числу 1-5;
alk представляет собой цепь из 1-5 атомов углерода, необязательно содержащую одну или более двойных или тройных связей;
Y представляет собой S, O или CH2;
Z представляет собой OH;
n равно целому числу 0-3;
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат;
Ra1 представляет собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода;
Rc1 представляет собой алкил или замещенный алкил; и
Rd представляет собой H, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, галоген, карбокси, сульфонамид или сульфоновая кислота.
[00417] Дополнительные примеры соединений включают структуры в соответствии с формулой от (IXa) до (IXd):
(IXa)
(IXb)
(IXc)
(IXd)
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
q равно целому числу 1-5;
alk представляет собой цепь из 1-5 атомов углерода, необязательно содержащую одну или более двойных или тройных связей;
Y представляет собой S, O или CH2;
Z представляет собой OH;
n равно целому числу 0-3; и
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат.
[00418] Дополнительные примеры соединений включают структуры в соответствии с формулой от (Xa) до (Xd):
(Xa)
(Xb)
(Xc)
(Xd)
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
q равно целому числу 1-5;
alk представляет собой цепь из 1-5 атомов углерода, необязательно содержащую одну или более двойных или тройных связей;
t равно целому числу 1-6;
Y представляет собой S, O или CH2;
Z представляет собой OH;
n равно целому числу 0-3; и
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат.
[00419] В вышеуказанных вариантах реализациях alk представляет собой алкильную, алкенильную или алкинильную цепь из 1-5 атомов углерода, необязательно содержащую одну или более двойных или тройных связей. Alk может представлять собой группу (CH2)r, где r равно 1-5. Alk может представлять собой (CH2)3. Альтернативно углеродная цепь может содержать одну или более двойных или тройных связей. Цепь может содержать связь -CH2-CH=CH-CH2-, необязательно с дополнительными группами CH2. Цепь может содержать связь -CH2-C≡C-CH2-, необязательно с дополнительными группами CH2.
[00420] В любом из примеров, приведенных в формуле от V до XII; q может быть равно 5. В любом из примеров, приведенных в формуле VII, формуле X или формуле XI; t может быть равно 4. В любом из примеров, приведенных в формуле от V до X; n может быть равно 1-3. В любом из примеров, приведенных в формуле от V до X; n может быть равно 1. В любом из примеров, приведенных в формуле от V до X; n может быть равно целому числу 0-1. Где n равно 1, группа OH может находиться в любом положении в кольце. Группа OH может находиться в положении 4. Где n равно 2 или 3, группы OH может находиться в любых положениях в кольце. В любом из примеров, приведенных в формуле от V до X; когда n равно нулю, Y может представлять собой O или S, но не CH2. В любом из примеров, приведенных в формуле от V до X; Y может представлять собой O. В любом из примеров, приведенных в формуле от V до X; Y может представлять собой O. Где Y представляет собой O, n может быть равно 0-3. Где Y представляет собой CH2, n может быть равно 1-3.
[00421] Дополнительные примеры соединений включают структуры в соответствии с формулой от (XIa) до (XId):
(XIa)
(XIb)
(XIc)
(XId)
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
q равно целому числу 1-5;
r равно целому числу 1-5;
t равно целому числу 1-6; и
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат.
[00422] Дополнительные примеры соединений включают структуры в соответствии с формулой от (XIIa) до (XIId):
(XIIa)
(XIIb)
(XIIc)
(XIId)
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
q равно целому числу 1-5;
r равно целому числу 1-5; и
X представляет собой OH или O- или его амидный или сложноэфирный конъюгат.
[00423] В любом из примеров, приведенных в формуле от XI до XII; r может быть равно 3.
[00424] Особенно пригодным соединением является нуклеотид или олигонуклеотид, меченый красителем, как описано в данном документе. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к атому азота индола через алкилкарбоксильную группу, с образованием амида. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к C5-положению пиримидинового основания или C7-положению 7-деазпуринового основания посредством линкерного фрагмента.
[00425] Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может также иметь блокирующую группу, ковалентно присоединенную к сахару рибозы или дезоксирибозы нуклеотида. Блокирующая группа может быть присоединена в любом положении на сахаре рибозе или дезоксирибозе. В конкретных вариантах реализации блокирующая группа находится в положении 3'OH сахара рибозы или дезоксирибозы нуклеотида.
[00426] В данном документе предложены наборы, содержащие два или более нуклеотидов, причем по меньшей мере один нуклеотид представляет собой нуклеотид, меченный соединением по настоящему описанию. Набор может содержать два или более меченых нуклеотидов. Нуклеотиды могут быть помечены двумя или более флуоресцентными метками. Две или более меток могут быть возбуждены с использованием одного источника возбуждения, который может представлять собой лазер. Например, длины волн возбуждения для двух или более меток могут по меньшей мере частично перекрываться, так что возбуждение в области перекрытия спектра заставляет обе метки излучать флуоресценцию. В конкретных вариантах реализации излучение от двух или более меток будет происходить в разных областях спектра таким образом, что наличие по меньшей мере одной из меток можно определить путем оптического различения излучения.
[00427] Набор может содержать четыре меченых нуклеотида, где первый из четырех нуклеотидов помечен соединением, описанным в данном документе. В таком наборе каждый из второго, третьего и четвертого нуклеотидов может быть помечен соединением, которое необязательно отличается от метки на первом нуклеотиде и необязательно отличается от меток на каждом другом нуклеотиде. Таким образом, одно или более соединений могут иметь отчетливый максимум поглощения и/или максимум излучения, так что соединение(-я) отличается(-ются) от других соединений. Например, каждое соединение может иметь определенный максимум поглощения и/или максимум излучения, так что каждое из соединений отличается от трех других соединений. Следует понимать, что части спектра поглощения и/или спектра излучения, отличные от максимумов, могут отличаться, и данные различия можно применять для различения соединений. Набор может быть таким, чтобы два или более соединений имели отчетливый максимум поглощения выше 600 нм. Соединения могут поглощать свет в области выше 640 нм. Набор может содержать любое из соединений, излучающих свет с длиной волны красного, зеленого или синего света, описанных в данном документе.
[00428] Соединения, нуклеотиды или наборы, изложенные в данном документе, можно применять для обнаружения, измерения или определения биологической системы (включая, например, ее процессы или компоненты). Некоторые методы, в которых можно применять соединения, нуклеотиды или наборы, включают в себя секвенирование, анализ экспрессии, анализ гибридизации, генетический анализ, анализ РНК, клеточный анализ (например, анализ связывания с клетками или анализ функции клеток) или анализ белка (например, анализ связывания с белками или анализ активности белков). Данное применение может осуществляться на автоматическом приборе для выполнения конкретного метода, таком как автоматический прибор для секвенирования. Прибор для секвенирования может содержать два лазера, работающих на различных длинах волн.
[00429] В данном документе описан метод синтеза соединений по данному описанию. Соединение формулы (XIII) и/или (XIII-1), (XIII-2) (XIII-3) или (XIII-4) или его соль можно использовать в качестве исходного материала для синтеза симметричных или несимметричных полиметиновых красителей:
(XIII)
(XIII-1) (XIII-2)
(XIII-3) (XIII-4)
или его соль, где Ra1 представляет собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода; Rc1 представляет собой алкил или замещенный алкил; Ar представляет собой ароматическую группу и R представляет собой алкильную группу. Там, где проиллюстрированы конкретные примеры 4-гидроксифенила, дополнительные гидроксильные группы также могут быть замещены в кольце в случаях, где n равно больше единицы. r может быть равно 3.
[00430] В данном документе описан метод синтеза соединений по данному описанию. Соединение формулы (XIII-5) или его соль можно использовать в качестве исходного материала для синтеза симметричных или несимметричных полиметиновых красителей:
(XIII-5)
[00431] Дополнительные аспекты данного описания предусматривают соединения полиметиновых красителей формулы (XIV) или их мезомерные формы:
(XIV)
где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион и
m равно целому числу 0-3;
каждый из Ra1 и Ra2 независимо представляет собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода;
Rb представляет собой необязательно замещенный арил или необязательно замещенный алкил;
каждый из Rc1 и Rc2 независимо представляет собой алкил или замещенный алкил; и
как Rb, так и один из Rc1 или Rc2 содержит линкерный фрагмент для дополнительного присоединения, или соединен с дополнительной молекулой.
[00432] Каждый Ra1 или Ra2 может независимо представлять собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или еще одно кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода. Ra1 или Ra2 может представлять собой H. Ra1 или Ra2 может представлять собой SO3-. Ra1 может отличаться от Ra2, например, структура может иметь одну группу сульфоновой кислоты при Ra1, и H в виде Ra2. Ra1 или Ra2 может представлять собой сульфонамид. Сульфонамид может представлять собой SO2NH2 или SO2NHR, где R представляет собой алкил, замещенный алкил, арил или замещенную арильную группу.
[00433] Ra1 или Ra2 может представлять собой еще одно алифатическое, ароматическое или гетероциклическое кольцо, конденсированное с соседним атомом углерода индольного кольца. Например, в таких случаях, когда ароматическое кольцо конденсировано, концевая группа красителя может представлять собой структуру типа:
.
[00434] Таким образом, красители по данному описанию могут быть описаны формулой (XIVA), (XIVB) или (XIVC):
(XIVA)
(XIVB)
(XIVC)
[00435] В формулах (XIVA), (XIVB) и (XIVC) одно или оба дополнительных кольца, конденсированных с соседними атомами углерода индольного кольца, могут быть необязательно замещены, например, сульфоновой кислотой или сульфонамидом.
[00436] Соединение может представлять собой соединение, в котором одна из групп Ra представляет собой дополнительно конденсированное кольцо, образующее структуру формулы (XV):
(XV)
где Ra3 представляет собой H, SO3-, сульфонамид или галоген; и
Rc1 представляет собой алкил или замещенный алкил.
[00437] Rb может представлять собой необязательно замещенный арил или необязательно замещенный алкил. Rb может представлять собой алкил. Rb может представлять собой метил, этил, пропил, бутил, пентил или гексил. Алкильная цепь может быть дополнительно замещена, например, карбоксильными или сульфоновыми группами. Rb можно использовать для дополнительной конъюгации. Например, если Rb содержит фрагмент COOH, он может быть конъюгирован с дополнительными молекулами для присоединения метки. В случае биомолекулы, белка, мечения ДНК и иному подобному конъюгацию можно осуществлять посредством Rb. Rb может образовывать амидные или сложноэфирные производные после осуществления конъюгации. Соединение может быть присоединено к нуклеотиду или олигонуклеотиду посредством Rb.
[00438] Rb может представлять собой арил или замещенный арил. Rb может представлять собой фенил.
[00439] Каждый Rc1 и Rc2 может независимо представлять собой алкил или замещенный алкил. Rc1 и Rc2 может представлять собой метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил или (CH2)qSO3H, где q равно 1-6. q может быть равно 1-3. Rc1 и Rc2 могут представлять собой замещенную алкильную группу. Rc1 и Rc2 могут содержать фрагмент COOH или -SO3H или его сложный эфир или амидные производные.
[00440] Как Rb, так и Rc1 или Rc2 содержит линкерный фрагмент для дополнительного присоединения, или соединен с дополнительной молекулой. Rb или Rc1 или Rc2 может содержать карбокси или карбоксилатный (COOH или COO-) фрагмент. После конъюгации, Rb или Rc1 или Rc2 могут содержать амид или сложный эфир.
[00441] Примеры соединений включают:
или их соли.
[00442] В данном документе описан метод синтеза соединений по данному описанию. Соединение формулы (XVI) и/или (XVI1), (XVI2), или его соль можно использовать в качестве исходного материала для синтеза симметричных или несимметричных полиметиновых красителей:
(XVI) (XVI1)
(XVI2)
где Ra представляет собой H, SO3-, сульфонамид, галоген или дополнительное кольцо, конденсированное с соседними атомами углерода;
Rb представляет собой необязательно замещенный арил или необязательно замещенный алкил; и
Rc представляет собой алкил или замещенный алкил.
[00443] Конкретные длины волн возбуждения могут составлять от 532 нм, 630 нм до 700 нм, и в частности 660 нм.
Пример 41: Соединение XVII 2,3,3-Триметил-1-фенил-3H-индолия-5-сульфонат
[00444] 2-Метилен-3,3-триметил-1-фенил-2,3-дигидро-1H-индол (1 г, 4,25 ммоль) растворяли в 1 мл серной кислоты при температуре < 5 °C и 1 мл дымящейся серной кислоты (20%) добавляли при перемешивании. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем нагревали при 60 °C в течение 3 часов. Продукт осаждали диэтиловым эфиром, промывали ацетоном и этанолом. Выход 0,7 г (52%). Структура подтверждена ЯМР.
Пример 42: Соединение XVIII 2-(2-Анилиновинил-1)-3,3-триметил-1-фенил-3H-индолия-5-сульфонат
[00445] Реакционная схема:
[00446] Смесь 2,3,3-триметил-1-фенил-3H-индолия-5-сульфонат (0,63 г) и этил-N-фенилформимидат (0,5 г) нагревали при 70 °C в течение 30 мин. Образовался оранжевый расплав. Продукт растирали с диэтиловым эфиром и отфильтровывали. Выход 0,7 г (84%).
Пример 43: Соединение XIX 2-(2-Ацетанилидовинил-1)-3,3-триметил-1-фенил-3H-индолия-5-сульфонат
[00447] Реакционная схема:
[00448] Смесь 2,3,3-триметил-1-фенил-3H-индолия-5-сульфонат (0,63 г), N, N'-дифенилформимидин (0,5 г), уксусную кислоту (1 мл) и уксусный ангидрид (2 мл) нагревали при 70 °C в течение 3 часов, а затем при 50 °C в течение ночи. Образовался желтый раствор. Продукт отфильтровывали и промывали диэтиловым эфиром. Выход 0,69 г (75%).
Пример 44: Соединение XX 1,2-диметил-1-(4-сульфонатобутил)-3-фенил-1H-бензо[e]индолия
[00449] Реакционная схема:
[00450] N-(2-Нафтил),N-фенилгидразин гидрохлорид (19,51 ммоль, 5,28 г), 5-метил-6-оксогептансульфоновую кислоту (17,18 ммоль, 3,70 г) и безводный ZnCl2 (17,18 ммоль, 2,34 г) в абсолютном этаноле (30 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем при 80 °C в течение 2 ч. Ход реакции контролировали методом ТСХ (10% H2O в CH3CN). После завершения реакционную смесь охлаждали, и растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в ДХМ и очищали флэш-колонкой на силикагеле. Выход: 3,06 г, 42%.
[00451] Протонный ЯМР: (MeOH-D4) : 8,28 (0,5H, д, J=8Гц); 8,05-8,02 (1H, м); 7,89 (0,5H, д, J=8Гц); 7,75-7,66 (3H, м); 7,65-7,60 (1H, м); 1,49-1,43 (1,5H, м); 7,31-7,25 (2H, м); 7,16 (,5H, д, J=9Гц); 7,07 (,5H, кажущ. т, J=7,4Гц); 6,61 (0,5H, д, J=8Гц); 2,85-2,35 (4H, м); 1,88 (3H, кажущ. д, J=9Гц); 1,75-1,4 (5H, м); 1,35-1,25 (0,5H, м); 1,1-0,95 (0,5H, м); 0,8-0,65 (0,5H, м); 0,58-0,45 (0,5H, м).
Пример 45: Соединение XXI 1,2-Диметил-1-(3-сульфонатопропил)-3-фенил-1H-бензо[e]индолия
[00452] Реакционная схема:
[00453] Указанное в заголовке соединение получали, как и предыдущее соединение, из N-(2-нафтил)-N-фенилгидразина гидрохлорида и 4-метил-5-оксопентансульфоновой кислоты. Продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле. Выход: 40%. Структура подтверждена спектром ЯМР.
Пример 46: Соединение XXII 2,3-Диметил-3-(4-сульфонатобутил)-1-фенил-3H-индолия
[00454] Реакционная схема:
[00455] N, N-Дифенилгидразин гидрохлорид (0,01 моль, 2,2 г), 5-метил-6-оксогептансульфоновую кислоту (0,017 моль, 3,0 г) в ледяной уксусной кислоте (20 мл) перемешивали при комнатной температуре (~20 °C) в течение часа, затем при 100 °C в течение 3 часов (контроль ТСХ). Реакционную смесь охлаждали, и растворитель удаляли под вакуумом. Остаток промывали диэтиловым эфиром и очищали на флэш-колонке с силикагелем. Выход: 2 г (56%). Структура подтверждена спектром ЯМР.
Пример 47: Соединение XXIII
Индокарбоцианин
[00456] Химическое название: 2-{(5-[1-фенил-3,3-диметил)-1,2-дигидро-3H-индол-2-илиден]-1-пропен-1-ил}-3,3-диметил-1-(5-карбоксипентил)-индолия-5-сульфонат.
[00457] Реакционная схема:
[00458] 3,3-Диметил-1-(5-карбоксипентил-2-(4-анилиновинил)-3H-индолия-5-сульфонат (0,46 г) и 2,3,3-триметил-1-фенил-3H-индолия перхлорат (0,34 г) в смеси уксусного ангидрида (2 мл) и уксусной кислоты (1 мл) перемешивали при комнатной температуре (~25 °C) в течение 0,5 часа. Затем к данному раствору добавляли пиридин (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при 80 °C в течение 3 ч. Завершение реакции контролировали с помощью ТСХ (20% H2O в CH3CN) и УФ-измерения. По окончании реакции окрашенную в красный цвет смесь охлаждали, и растворители удаляли под вакуумом. Остаток очищали флэш-колонкой C18 (TEAB 0,1 M в воде и ацетонитриле). Выход: 0,33 г (55%).
Пример 48: Соединение XXIV
Индокарбоцианин
[00459] Химическое название: Триэтиламмония 2-{(5-[(4-сульфонатобутил)-1-фенил-3-метил)-1,2-дигидро-3H-индол-2-илиден]-1-пропен-1-ил}-3,3-диметил-1-(5-карбоксипентил)-индолия-5-сульфонат.
[00460] Реакционная схема:
[00461] 3,3-Диметил-1-(5-карбоксипентил-2-(4-анилиновинил)-3H-индолия-5-сульфонат (0,46 г) и 2,3-диметил-3-(4-сульфонатобутил)-1-фенил-3H-индолия (0,36 г) в смеси уксусного ангидрида (2 мл) и уксусной кислоты (1 мл) перемешивали при комнатной температуре (~25 °C) в течение 0,5 часа. Затем к данному раствору добавляли пиридин (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при 80 °C в течение 3 ч /завершение реакции контролировали с помощью ТСХ (20% H2O в CH3CN)/ и УФ-измерения). По окончании реакции окрашенную в красный цвет реакционную смесь охлаждали, и большую часть растворителей удаляли под вакуумом. Остаток очищали флэш-колонкой C18 (TEAB 0,1 M в воде и ацетонитриле). Выход: 0,29 г (35%).
Пример 49: Соединение XXV Индокарбоцианин
[00462] Химическое название: 2-{(5-[(3-фенил-1,1-диметил)-2,3-дигидро-1H-бензо[e]индол-2-илиден]-1-пропен-1-ил}-3,3-диметил-1-(5-карбоксипентил)-индолия-5-сульфонат.
[00463] Реакционная схема:
[00464] 3,3-Диметил-1-(5-карбоксипентил-2-(4-анилидовинил)-3H-индолия-5-сульфонат (0,46 г) и 1,1,2-триметил-3-фенил-3H-индолия перхлорат (0,39 г) в смеси уксусного ангидрида (1 мл) и уксусной кислоты (1 мл) перемешивали при комнатной температуре (~25 °C) в течение 0,5 часа. Затем к данному раствору добавляли пиридин (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при 60 °C в течение 3 ч/за ходом реакции следили с помощью ТСХ (20% H2O в CH3CN)/ и УФ-измерения. По окончании реакции окрашенную в красный цвет реакционную смесь охлаждали, и большую часть растворителей удаляли под вакуумом. Остаток очищали флэш-колонкой C18 (TEAB 0,1 M в воде и ацетонитриле). Выход: 0,38 г (54%).
Пример 50: Соединение XXVI
Конъюгат красителя pppT-I-2
[00465] Реакционная схема:
[00466] Получение: К высушенной пробе красителя (Соединение XXIII) (60 мг) добавляли безводный DMA (5 мл) и основание Хюнига (0,06 мл). Затем к нему добавляли раствор TSTU (0,25 г) в 5 мл сухого DMA. Появился красный цвет активированного эфира. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Согласно ТСХ (20% H2O в CH3CN) активация завершилась. После завершения активации данный раствор добавляли к раствору pppT-LN3 (0,23 г) в воде (7 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 3 ч. Процесс связывания контролировали с помощью ТСХ (20% H2O в ацетонитриле). Реакционную смесь охлаждали до ~4 °C на ледяной бане, затем добавляли раствор 0,1 M TEAB (5 мл) в воде, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Реакционную смесь наносили на колонку с ~50 г суспензии смолы DEAE Sephadex в 0,05 М растворе TEAB в воде и промывали TEAB (градиент концентрации от 0,1 М до 0,5 M). Цветные фракции собирали и упаривали, затем снова упаривали совместно с водой для удаления большего количества TEAB и вакуумировали досуха. Затем остаток повторно растворяли в TEAB 0,1 М. Данный раствор фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0,2 нм в колбу для грануляции и хранили в морозильной камере. Продукт очищали с помощью ВЭЖХ, используя колонку с обращенной фазой C18 с ацетонитрилом-0,1 М TEAB. Выход 67%.
Пример 51: Соединение XXVII
Конъюгат красителя pppT-I-4
[00467] Реакционная схема:
[00468] Получение: К высушенной пробе красителя (Соединение XXIII) (82 мг) добавляли безводный DMA (5 мл) и основание Хюнига (0,06 мл). Затем к нему добавляли раствор TSTU (0,25 г) в 5 мл сухого DMA. Скоро появился красный цвет активированного эфира. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. После завершения активации (ТСХ: 15% H2O в CH3CN) данный раствор добавляли к раствору pppT-LN3 (0,23 г) в воде (7 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 3 часов. Реакционную смесь охлаждали до ~4 °C на ледяной бане, затем добавляли раствор 0,1 M TEAB (5 мл) в воде, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Реакционную смесь наносили на колонку с ~75 г суспензии смолы DEAE Sephadex в 0,05 М растворе TEAB в воде и промывали TEAB (градиент концентрации от 0,10 М до 0,75 M). Окрашенные в красный цвет фракции собирали, растворитель упаривали, а затем остаток снова упаривали совместно с водой для удаления большего количества TEAB и вакуумировали досуха. Затем краситель повторно растворяли в TEAB 0,1 M. Данный раствор фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0,2 нм, и продукт очищали методом ВЭЖХ с использованием обращенно-фазовой колонки C18 с ацетонитрилом-0,1 M TEAB. Выход 70%.
[00469] Термины «по существу» и «около», используемые в данном описании, используются для описания и учета небольших колебаний, например, из-за вариаций при обработке. Например, они могут относиться к меньшим или равным ± 5%, например, меньшим или равным ± 2%, например, меньшим или равным ± 1%, например, меньшим или равным ± 0,5%, например, меньшим или равным ± 0,2%, например, меньшим или равным ± 0,1%, например, меньшим или равным ± 0,05%. Кроме того, в контексте данного документа употребление единственного числа означает «по меньшей мере один».
[00470] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть объекта изобретения, описанного в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце данного описания, считаются частью объекта изобретения, описанного в данном документе.
[00471] Описан ряд вариантов реализации. Тем не менее будет очевидно, что могут быть сделаны различные модификации без отклонения от сущности и объема данного описания.
[00472] Кроме того, логические потоки, изображенные на фигурах, не требуют показанного определенного или последовательного порядка для достижения желаемых результатов. Кроме того, могут быть предусмотрены другие процессы, или же процессы могут быть исключены из описанных потоков, и в описанные системы могут быть добавлены или удалены из них другие компоненты. Соответственно, нижеследующая формула изобретения охватывает другие варианты реализации.
[00473] Хотя определенные признаки описанных вариантов реализации проиллюстрированы так, как описано в данном документе, специалистам в данной области будет очевидно множество модификаций, замен, изменений и эквивалентов. Таким образом, следует понимать, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие модификации и изменения, которые входят в объем вариантов реализации. Следует понимать, что они представлены только в качестве примера, но не ограничения, и могут быть внесены разнообразные изменения в форму и детали. Любую часть устройства и/или способов, описанных в данном документе, можно комбинировать в любой комбинации, за исключением взаимоисключающих комбинаций. Варианты реализации, описанные в данном документе, могут включать в себя разнообразные комбинации и/или подкомбинации функций, компонентов и/или признаков различных описанных вариантов реализации.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
КУМАРИНЫ, ЗАМЕЩЕННЫЕ ВТОРИЧНЫМИ АМИНАМИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТОК | 2018 |
|
RU2756272C2 |
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ ЛИНКЕРЫ | 2015 |
|
RU2699993C2 |
ПОЛИМЕТИНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТОК | 2016 |
|
RU2696562C1 |
ПРОТОЧНЫЕ ЯЧЕЙКИ И НАБОРЫ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ | 2019 |
|
RU2823075C2 |
НУКЛЕОЗИДЫ И НУКЛЕОТИДЫ С 3’-ГИДРОКСИ БЛОКИРУЮЩИМИ ГРУППАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В СПОСОБАХ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ | 2019 |
|
RU2818762C2 |
НОВЫЕ КОМБИНАЦИИ ГАСИТЕЛЯ И РЕПОРТЕРНОГО КРАСИТЕЛЯ | 2019 |
|
RU2795062C2 |
УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ОЦЕНКИ ЗНАЧЕНИЙ ПО ИЗОБРАЖЕНИЯМ | 2020 |
|
RU2825348C1 |
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ХИМИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ И СНЯТИЯ ЗАЩИТЫ ДЛЯ СВЯЗАННЫХ С ПОВЕРХНОСТЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ | 2019 |
|
RU2766688C2 |
СМОЛЯНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРОТОЧНЫЕ ЯЧЕЙКИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ДАННУЮ СМОЛЯНУЮ КОМПОЗИЦИЮ | 2019 |
|
RU2778014C1 |
ПРОТОЧНЫЕ КЮВЕТЫ С ЛИНЕЙНЫМИ ВОЛНОВОДАМИ | 2020 |
|
RU2809293C2 |
Группа изобретений относится к способу и устройству секвенирования путем синтеза (SBS) с использованием одновременной визуализации кластеров ДНК с использованием двух или более цветовых каналов. Способ включает получение пробы, содержащей первый и второй нуклеотид; приведение пробы в контакт с первым флуоресцентным красителем, связанным с первым нуклеотидом, комплементарным к первому нуклеотиду, и вторым флуоресцентным красителем, связанным со вторым нуклеотидом, комплементарным ко второму нуклеотиду. Первый и второй флуоресцентный краситель излучают соответственно первый излучаемый свет в первом диапазоне длин волн в ответ на первый возбуждающий свет и второй излучаемый свет во втором диапазоне длин волн в ответ на второй возбуждающий свет. Первая средняя длина волны, определенная для первого спектра излучения первого флуоресцентного красителя, и вторая средняя длина волны, определенная для второго спектра излучения второго флуоресцентного красителя, имеют, по меньшей мере, заданное разделение друг от друга между 50 нм и 100 нм. Осуществляют одновременный сбор мультиплексированного флуоресцентного света и проводят определение первого нуклеотида на основе первой полосы длин волн первого цветового канала и второго нуклеотида на основе второй полосы длин волн второго цветового канала. Устройство для секвенирования содержит проточную кювету, содержащую пробу с первым и вторым нуклеотидом; систему освещения и систему светосбора. Группа изобретений обеспечивает повышение пропускной способности секвенирования, уменьшение времени визуализации. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 26 ил., 4 табл., 51 пр.
1. Способ секвенирования путем синтеза (SBS) с использованием одновременной визуализации кластеров ДНК с использованием двух или более цветовых каналов, включающий:
получение пробы, причем проба содержит первый нуклеотид и второй нуклеотид;
приведение пробы в контакт с первым флуоресцентным красителем, связанным с первым нуклеотидом, комплементарным к первому нуклеотиду и вторым флуоресцентным красителем, связанным со вторым нуклеотидом, комплементарным ко второму нуклеотиду, причем первый флуоресцентный краситель излучает первый излучаемый свет в первом диапазоне длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, а второй флуоресцентный краситель излучает второй излучаемый свет во втором диапазоне длин волн в ответ на второй возбуждающий свет, где первая средняя длина волны определена для первого спектра излучения первого флуоресцентного красителя, а вторая средняя длина волны определена для второго спектра излучения второго флуоресцентного красителя, причем первая и вторая средние длины волн имеют по меньшей мере заданное разделение друг от друга между 50 нм и 100 нм;
одновременный сбор с помощью одного или более детекторов изображения мультиплексированного флуоресцентного света, содержащего первый излучаемый свет и второй излучаемый свет, причем первый излучаемый свет представляет собой первый цветовой канал, соответствующий первому диапазону длин волн, а второй излучаемый свет представляет собой второй цветовой канал, соответствующий второму диапазону длин волн; и
определение первого нуклеотида на основе первой полосы длин волн первого цветового канала и второго нуклеотида на основе второй полосы длин волн второго цветового канала.
2. Способ по п. 1, в котором первый диапазон длин волн соответствует синему цвету, а второй диапазон длин волн соответствует зеленому цвету.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором первый диапазон длин волн включен в диапазон от 450 нм до 525 нм, и причем второй диапазон длин волн включен в диапазон от 525 нм до 650 нм.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором первый диапазон длин волн имеет более короткие длины волн, чем второй диапазон длин волн, причем второй диапазон длин волн связан с первой длиной волны, и при этом разделение на длину волны излучения между первым флуоресцентным красителем и вторым флуоресцентным красителем определено так, что спектр излучения первого флуоресцентного красителя включает в себя не более заданного количества света, равного первой длине волны или превышающего ее.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором одновременный сбор мультиплексированного флуоресцентного излучения включает в себя:
обнаружение первого излучаемого света с помощью первой оптической подсистемы для первого цветового канала, и
обнаружение второго излучаемого света с помощью второй оптической подсистемы для второго цветового канала,
причем дихроичный фильтр излучения направляет первый излучаемый свет первого цветового канала к первой оптической подсистеме и второй излучаемый свет второго цветового канала - ко второй оптической подсистеме.
6. Способ по п. 5, в котором по меньшей мере одна из первой оптической подсистемы и второй оптической подсистемы содержит наклонный оптический путь.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором спектр излучения первого флуоресцентного красителя имеет пик в первом диапазоне длин волн.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором проба дополнительно содержит третий нуклеотид, и
причем способ дополнительно включает:
приведение пробы в контакт с третьим флуоресцентным красителем, излучающим третий излучаемый свет в первом диапазоне длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, и излучение четвертого излучаемого света в пределах второго диапазона длин волн в ответ на второе возбуждение, причем мультиплексированный флуоресцентный свет дополнительно содержит третий излучаемый свет и четвертый излучаемый свет; и
определение третьего нуклеотида на основе первой полосы длин волн первого цветового канала и второй полосы длин волн второго цветового канала.
9. Способ по любому из пп. 1-7, в котором проба дополнительно содержит третий нуклеотид, и
причем способ дополнительно включает:
приведение пробы в контакт с третьим флуоресцентным красителем, излучающим третий излучаемый свет в пределах третьего диапазона длин волн в ответ на третий возбуждающий свет, причем мультиплексированный флуоресцентный свет дополнительно содержит третий излучаемый свет; и
определение третьего нуклеотида на основе третьего диапазона длин волн.
10. Устройство для секвенирования путем синтеза (SBS) с использованием одновременной визуализации кластеров ДНК с использованием двух или более цветовых каналов, содержащее:
проточную кювету, содержащую пробу, причем проба содержит первый нуклеотид и второй нуклеотид, при этом первый нуклеотид связан с первым флуоресцентным красителем, при том, что второй нуклеотид связан со вторым флуоресцентным красителем, причем первый флуоресцентный краситель излучает первый излучаемый свет в пределах первого диапазона длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, а второй флуоресцентный краситель излучает второй излучаемый свет во втором диапазоне длин волн в ответ на второй возбуждающий свет;
систему освещения, одновременно обеспечивающую подачу на проточную кювету первого света возбуждения и второго света возбуждения; и
систему светосбора, одновременно собирающую мультиплексированный флуоресцентный свет, содержащий первый излучаемый свет и второй излучаемый свет, причем первый излучаемый свет представляет собой первый цветовой канал, соответствующий первому диапазону длин волн, а второй излучаемый свет представляет собой второй цветовой канал, соответствующий второму диапазону длин волн, где первая средняя длина волны определена для первого спектра излучения первого флуоресцентного красителя, а вторая средняя длина волны определена для второго спектра излучения второго флуоресцентного красителя, причем первая и вторая средние длины волн имеют по меньшей мере заданное разделение друг от друга между 50 нм и 100 нм.
11. Устройство по п. 10, в котором первый диапазон длин волн соответствует синему цвету, а второй диапазон длин волн соответствует зеленому цвету.
12. Устройство по п. 10 или 11, в котором первый диапазон длин волн включен в диапазон от 450 нм до 525 нм, и при этом второй диапазон длин волн включен в диапазон от 525 нм до 650 нм.
13. Устройство по любому из пп. 10-12, в котором первый диапазон длин волн имеет более короткие длины волн, чем второй диапазон длин волн, причем второй диапазон длин волн связан с первой длиной волны, и при этом разделение на длину волны излучения между первым флуоресцентным красителем и вторым флуоресцентным красителем определено так, что спектр излучения первого флуоресцентного красителя включает в себя не более заданного количества света, равного первой длине волны или превышающего ее.
14. Устройство по любому из пп. 10-13, в котором система сбора света содержит:
первую оптическую подсистему для первого цветового канала, обнаруживающего первый излучаемый свет, и
вторую оптическую подсистему для второго цветового канала, обнаруживающего второй излучаемый свет,
причем дихроичный фильтр излучения направляет первый излучаемый свет первого цветового канала к первой оптической подсистеме и второй излучаемый свет второго цветового канала - ко второй оптической подсистеме.
15. Устройство по п. 14, в котором по меньшей мере одна из первой оптической подсистемы и второй оптической подсистемы содержит наклонный оптический путь.
16. Устройство по любому из пп. 10-15, в котором спектр излучения первого флуоресцентного красителя имеет пик в первом диапазоне длин волн.
17. Устройство по любому из пп. 10-16, в котором проба дополнительно содержит третий нуклеотид, связанный с третьим флуоресцентным красителем, излучающим третий излучаемый свет в первом диапазоне длин волн в ответ на первый возбуждающий свет, и излучение четвертого излучаемого света в пределах второго диапазона длин волн в ответ на второе возбуждение, и причем мультиплексированный флуоресцентный свет дополнительно содержит третий излучаемый свет и четвертый излучаемый свет.
18. Устройство по любому из пп. 10-16, в котором проба дополнительно содержит третий нуклеотид, связанный с третьим флуоресцентным красителем, излучающим третий излучаемый свет в пределах третьего диапазона длин волн в ответ на третий возбуждающий свет, причем мультиплексированный флуоресцентный свет дополнительно содержит третий излучаемый свет.
WO 2018114710 A1, 28.06.2018 | |||
Anonymus, "NovaSeq 6000 - Sequencing System Guide", February 2019, Найдено в интернет:URL:https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/novaseq/novaseq-6000-system-guide-1000000019358-11.pdf | |||
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК С ПОВТОРНЫМ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕАГЕНТОВ НА ПРОВОЛОЧНОЙ СЕТКЕ | 2013 |
|
RU2611207C2 |
Авторы
Даты
2024-04-01—Публикация
2020-03-02—Подача