ТОПИЧЕСКАЯ ПРОТИВОМИКРОБНАЯ ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/08 A61K31/728 A61P31/00 A61P17/00 A61K31/722 

Настоящее изобретение относится к новой композиции, используемой в терапевтических целях, проявляющей противомикробные свойства, а точнее новой композиции на основе гиалуроновой кислоты и положительно заряженного противомикробного пептида, используемой в медицине человека и ветеринарии, в том числе и в дерматологии и офтальмологии для лечения микробных инфекций.

Кожа представляет собой одновременно и живой анатомический барьер, и зону обмена между телом и окружающим его пространством, эффективность которого обуславливает поддержание правильного гомеостатического равновесия. Кожа является органом, содержащим многочисленные встроенные прослойки, от поверхностного слоя эпидермиса до более глубоких слоев, таких как дерма или гиподерма, где каждый из этих слоев выполняет функции, которые в комбинации позволяют коже реагировать и адаптироваться к окружающему пространству.

Эпидерма, главным образом состоящая из кератиноцитов, меланоцитов и клеток Лангерганса, имеет различную толщину, варьирующую в зависимости от различных частей тела, и представляет собой внешний слой кожи для обеспечения защиты тела от его внешнего окружения. Дерма представляет собой более плотный слой, пересекаемый нервными волокнами и кровеносными сосудами, состоящими главным образом из коллагена, эластина, протеогликанов и гликозаминогликанов, в основном синтезируемых кожными фибробластами. Волокна коллагена обеспечивают механическую прочность и структуру кожи; эластин отвечает за эластичность кожи, а гликозаминогликаны и протеогликаны играют основную роль в структуризации и увлажнении кожи. Самым глубоким слоем кожи является гиподерма, содержащая адипоциты, которые производят липиды, обеспечивающие образование жирового слоя, защищающего мышцы, кости и внутренние органы от ударов.

Изменения в структуре эпидермиса, такие как увеличение влажности или появление раздражений или кожных ран различного происхождения или развитие дерматоза, способствуют заражению кожи патогенными микроорганизмами. Быстрое размножение микробов в результате приводит к изменению условий заживления раны, замедляя или блокируя их, и способствует распространению инфекции из первичной раны.

Таким образом, кожу постоянно атакуют патогенные микроорганизмы, но роговой слой эпидермиса благодаря своему показателю рН, относительно низкому содержанию воды и наличию пептидов с антибактериальным действием обладает бактерицидным действием и играет роль первичной противомикробной защиты от патогенных микроорганизмов.

Большинство бактериальных колоний превращается в биопленки - мембранные структуры для обеспечения микробной деятельности, искажающие факторы роста и заживления ран посредством создания воспалительного процесса, предотвращающего процессы эффективной противомикробной защиты. По причине широко распространенного и иногда чрезмерного использования антибиотиков бактерии развили устойчивость к антибиотикам, что снижает или сводит на нет антибактериальную эффективность антибиотиков. Бактерии из биопленок являются устойчивыми к большинству антибиотиков и антисептиков, и, следовательно, важно разрабатывать композиции, которые способны бороться с патогенными микроорганизмами, и при этом поддерживать гомеостаз, насколько это возможно, и не способствовать образованию резистентных штаммов, опасных для человека или окружающей среды.

Известно, что положительно заряженные противомикробные пептиды действуют на мембрану бактерий посредством электростатического взаимодействия между положительно заряженным пептидом и отрицательно заряженными фосфолипидами, находящимися во внешней структуре мембран Грамм-отрицательных бактерий, тогда как в случае Грамм-положительных бактерий взаимодействие происходит между пептидом и составляющими пептидогликанов в плазматической мембране бактерий. Наличие у противомикробных пептидов положительного заряда объясняет их сродство к отрицательно заряженным мембранам бактерий, и прикрепление протекает гораздо легче из-за наличия зарядов. После прикрепления пептиды изменяют проницаемость мембраны, образуя поры, которые провоцируют осмолиз, за которым следует отмирание бактерии.

Таким образом, противомикробные пептиды, в частности, положительно заряженные пептиды воздействуют на кожу, защищая ее от бактериальных инфекций и воспаления.

Дефензины представляют собой семейство природных противомикробных пептидов, связанных с неспецифическим или внутренним иммунитетом. Это небольшие положительно заряженные противомикробные пептиды, состоящие из цепочек от 36 до 42 аминокислот, имеющие в своем составе внутримолекулярные дисульфидные мостики. У человека они обладают большим спектром высокоэффективного антибактериального и противогрибкового действия и подразделяются на две группы, а именно α-дефензины и β-дефензины. Последние присутствуют в различных типах эпителия, а именно в кожном эпителии, слизистой оболочке рта и глаза и в многочисленных органах и играют важную роль при ответной реакции на инфекцию. β-Дефензины высвобождаются при активации специфических рецепторов - толл-подобных рецепторов (TLR).

Исследования показали, что комменсальная микрофлора и патогенная микрофлора используют различные способы активации β-дефензинов. Таким образом, кожа использует молекулярные методы для их дифференцирования и борьбы с бактериями.

Толл-подобные рецепторы (TLR) являются мембранными рецепторами, экспрессируемыми семейством генов TLR, играющими фундаментальную роль в распознавании патогенных микробов и активации внутреннего иммунитета. Они модулируют производство цитокинов, важных для эффективного иммунитета. TLR4 и TLR2 активны в процессе распознавания липополисахаридов (LPS), находящихся в Грамм-отрицательных бактериях. LPS представляет собой провоспалительный бактериальный эндотоксин. Более конкретно, TLR2 распознает пептидогликан Грамм-положительных бактерий, и TLR4 распознает LPS Грамм-отрицательных бактерий. В коже белки TLR2 и TLR4 экспрессируются кератиноцитами, и TLR2 экспрессируется в сальных железах.

Дефензины играют оригинальную роль элиситоров, то есть молекул, способных приводить в действие механизм защиты организма. Таким образом, они естественным образом присутствуют в коже и могут быть стимулированы для увеличения прочности ослабленной кожи. В окружающей среде, часто являющейся вредной, важно помогать биологическим функциям для поддержания качества и структуры красивой и здоровой кожи. Понятие элиситора подразумевает стимуляцию биологических путей, присутствующих в коже, для наилучшего противодействия внешнему воздействию.

Противомикробные свойства β-дефензина человека (HBD-3) описаны в патентной заявке WO 0192309.

Гиалуроновая кислота представляет собой природный полимер на основе дисахарида, содержащий блоки D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, соединенные гликозидной связью. Ее свойства широко варьируют в зависимости от ее молекулярной массы. Гиалуроновые кислоты с высокой молекулярной массой более 1000 кДа эффективно используют для улучшения увлажнения кожи благодаря гидрофильной углеводной сетке, из которой они состоят. Гиалуроновые кислоты с низкой молекулярной массой менее ≈50 кДа способны преодолевать барьер рогового слоя и стимулировать рецепторы CD44, ответственные за неосинтез гиалуроновой кислоты в дерме.

Как и коллаген, гиалуроновая кислота является одной из основных составляющих внеклеточной матрицы дермы и играет важную роль в клеточном росте и поддержании увлажнения. В течение старения кожи наблюдают снижение концентрации гиалуроновой кислоты в дерме. Гиалуроновая кислота представляет собой глюкозаминогликан, часто используемый в косметических и дерматологических композициях, в основном в форме гиалуроната натрия, в том числе и для улучшения увлажнения, стимуляции заживления и природной защиты кожи. Ее также используют в эстетической хирургии для заполнения морщин, в медицинском лечении артроза и в офтальмологии. Различные производные гиалуроновой кислоты, сетчатой или несетчатой структуры, которые могут обладать хорошей устойчивостью к ферментному расщеплению и могут быть использованы, в частности, в косметических композициях, описаны, например, в заявке WO 2011090450. Различные формы гиалуроновой кислоты хорошо известны и находятся в продаже.

Было предложено скомбинировать гиалуроновую кислоту или ее производные с хондроитинсульфатом, как в заявке WO 2009073437 или к ретиноиду или олигосахариду как в патенте FR 2894827. Также были предложены соли гиалуроновой кислоты с тяжелыми металлами в составе противомикробных композиций, как было описано в заявке WO 8705517. В патенте US 6180601 описана фармацевтическая композиция, в которой используют гиалуроновую кислоту с низкой молекулярной массой, а именно от 50 до 200 кДа, и образующая матрицу, включающую пептид или белок, например, гормон роста. Заявка WO 2006130987 относится к пептидам, содержащим предпочтительно от 15 до 40 аминокислот, способных связываться одной стороной с гиалуроновой кислотой и другой стороной с бактериальной капсулой, содержащей гиалуроновую кислоту, и которые можно использовать в присутствии липида для образования липосом. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид, полученный из лактоферрина и гиалуроновой кислоты, описана в заявке WO 2010081800.

Благодаря исследованиям, проведенным заявителем, было показано, что можно получить эффективное противомикробное действие, аналогичное действию антисептиков и местных антибиотиков, при объединении положительно заряженного противомикробного пептида с гиалуроновой кислотой средней молекулярной массы. Также было показано, что противомикробная активность положительно заряженного пептида усиливается при объединении с гиалуроновой кислотой, стимулирующей производство β-дефензинов. Под противомикробной активностью подразумевается антибактериальное и/или противовирусное и/или противогрибковое действие.

Целью настоящего изобретения является предложение новой топической композиции, проявляющей противомикробные свойства, позволяющей эффективно лечить кожные микробные инфекции и укреплять натуральную защиту кожи без обращения к антибиотикам или химическим антисептикам.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является дерматологическая композиция, содержащая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида и гиалуроновой кислоты со средней молекулярной массой или одной из ее солей.

Также объектом настоящего изобретения является топическая противомикробная дерматологическая композиция, содержащая комбинацию по меньшей мере одного противомикробного положительно заряженного пептида, соединенного с липидом и гиалуроновой кислотой или одной из ее солей, с молекулярной массой от 100 до 800 кДа.

Наконец, объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом и гиалуроновой кислотой со средней молекулярной массой или одной из ее солей, для применения в лечении микробных инфекций кожи, кожного защитного покрова или слизистых.

Благодаря своим противомикробным свойствам такая композиция необходима в дерматологии человека для лечения кожных ран.

Также она необходима в дерматологии и офтальмологии, а именно при лечении инфекций, связанных с хроническими глубокими ранами, фолликулитами, вторичными инфекциями при воспалительных дерматологических заболеваниях, блефаритами, мейбомитами и конъюнктивитами.

Согласно настоящему изобретению противомикробный положительно заряженный пептид предпочтительно является пептидом, включающим по меньшей мере 50 аминокислот, более предпочтительно от 3 до 30 аминокислот, и обладающим широким противомикробным спектром против Грамм-положительных и Грамм-отрицательных бактерий.

Например, можно использовать противомикробный положительно заряженный пептид, выбранный среди линейных пептидов со спиральной структурой, пептидов, содержащих один или более дисульфидных мостиков, и линейных пептидов с высоким содержанием аминокислот.

Противомикробный положительно заряженный пептид по изобретению, содержащий по меньшей мере 50, предпочтительно, менее 30 аминокислот, может быть выбран из, например, производных маганина, протегрина, индолицидина и гистатина. Так можно использовать синтетический положительно заряженный пептид, такой как пентахлоргидрат омиганана, аналог индолицина, хлогидрат исеганана, синтетический протегрин и ацетат пексиганана, аналог магаинина. Эти пептиды объединены посредством ковалентной связи с липидом, и предпочтительно, с жирной кислотой, такой как пальмитиновая кислота. В частности, эта ковалентная связь не является липосомной. Также можно использовать коммерчески доступный пептид, такой как Oligopeptide-10 (Grant Industries) или Shield Bact Peptide (Infinitec), который является гексапептидом, объединенным с пальмитиновой кислотой и содержащим дисульфидный мостик.

Противомикробное действие композиций по изобретению было обнаружено при проведении исследований in vitro и ex vivo, как указано далее, продемонстрировавших тройное действие, состоящее из нейтрализации микробных эндотоксинов для минимизации действия толл-подобных рецепторов, имитации действия β-дефензинов для обеспечения быстрого противоинфекционного эффекта и модуляции воспалительной реакции.

Противомикробный пептид предпочтительно должен быть амфифильным. Этот амфифильный характер усиливается при объединении положительно заряженного пептида с липидом и особенно с линейной или разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислотой, содержащей предпочтительно от 6 до 22 атомов углерода, такой как олеиновая, линолевая, лауриновая, сапиеновая, стеариновая и пальмитиновая кислоты. Объединение жирной кислоты с пептидом происходит предпочтительно посредством образования ковалентной связи с по меньшей мере одной из аминокислот, составляющих пептид. Ковалентная связь может быть, например, амидной связью на N-терминальном конце пептида. Проведенные исследования показали, что усиленный таким образом амфифильный характер способствует фиксации положительно заряженного пептида на поверхности бактерий, и имеет следующие эффекты

- структурные нарушения во внешнем слое бактериальной мембраны;

- накопление жирной кислоты в форме мицелл на границе раздела мембран;

- перфорацию данной двойной мембраны при образовании ионных каналов.

Это тройное действие приводит впоследствии к разрушению бактерий, связанному с потерей непроницаемости их мембран и действием положительно заряженного пептида на внутрицитоплазматические анионные клетки-мишени.

Кроме того, противомикробный положительно заряженный пептид по изобретению показывает:

- широкий спектр действия, охватывающий Грамм-отрицательные и Грамм-положительные бактерии, инфекции слизистых, вирусные и паразитарные инфекции,

- высокую скорость действия, связанную с многочисленными клетками-мишенями в бактерии, поврежденными жирной кислотой,

- незначительный риск возникновения резистентности по сравнению с риском, отмеченным в случае традиционных антибиотиков.

Проведенные исследования также показали, что положительно заряженный антибактериальный пептид, использованный в изобретении, способен нейтрализовать отклик клеток хозяина на бактериальные эндотоксины независимо от типа бактерий (Грамм-положительных или Грамм-отрицательных), их производящих. Пептид также модулирует внутренний иммунный отклик посредством ограничения действия TLR и производства TNF α, сдерживающего воспалительный каскад и проистекающую из него цитокиновую бурю (IL-6, IL-1b, IL-1a).

Пептид также проявляет другие свойства, связанные с внутренним иммунитетом, посредством хемотаксического действия на моноциты и полиядерные нейтрофилы, посредством высвобождения гистамина моноцитами и ингибированием протеаз, ограничивающих разрушения тканей и стимулирующих их восстановление.

Проведенные исследования показали, что механизм защиты внутреннего иммунитета в присутствии бактериальной атаки может быть оптимизирован при объединении противомикробного положительно заряженного пептида, предпочтительно связанного с жирной кислотой, с гиалуроновой кислотой средней молекулярной массы. Немедленное действие на микробы завершается нейтрализацией эндотоксинов, которые они вырабатывают.

В результате того, что снижается высвобождение провоспалительных цитокинов, и правильное действие гиалуроновой кислоты может в таком случае в полной мере выражаться в ускоренной фиксации на толл-подобных рецепторах и увеличенной секреции β-дефензинов, создается вторая линия противомикробной защиты. Параллельно стимулируются механизмы восстановления для быстрого возобновления эффекта барьера эпидермиса.

Согласно настоящему описанию под гиалуроновой кислотой подразумевают гиалуроновую кислоту в свободной форме или одну из ее солей с щелочными или щелочноземельными металлами, например, гиалуронат натрия, калия, кальция или магния, со средней молекулярной массой, то есть предпочтительно от 100 до 800 кДа, более предпочтительно от 200 до 600 кДа.

Гиалуроновая кислота, используемая в изобретении, является коммерчески доступной в различных формах, модифицированных в соответствии с планируемым использованием. Ее можно производить в промышленном масштабе в необходимых количествах посредством экстракции, исходя из животных тканей, таких как гребни петуха, или посредством бактериальной ферментации, а также посредством биотехнологических процессов, начиная с растительных веществ, например, пшеницы.

Можно использовать, например, гидролизованную гиалуроновую кислоту или натриевую соль гиалуроновой кислоты с молекулярной массой от 200 до 600 кДа, такие как коммерчески доступные продукты марки PrimalHyal 300 (Soliance) с молекулярной массой 300 кДа или PrimaHyal 450 с молекулярной массой, близкой к 450 кДа.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать эффективное количество каждого из описанных выше активных веществ, например, от 0,05 до 2% по массе гиалуроновой кислоты и от 0,001 до 1% по массе положительно заряженного противомикробного пептида, по отношению к общей массе композиции.

Композиции по изобретению могут включать одно или несколько дополнительных усиливающих действий, выгодно дополняющих действие комбинации гиалуроновой кислоты и противомикробного пептида, являющихся совместимыми, то есть неспособных реагировать с одним или другим компонентом или маскировать или ограничивать их соответствующие эффекты.

Например, они могут содержать хитозан или хитин, которые в комбинации с гиалуроновой кислотой вызывают эффект защиты поперечно сшитой сетки, что благоприятствует внутреннему производству факторов роста кератиноцитов, вызывающих фибробластическую активность, увеличение производства коллагена и ускорение дифференцирования фибробластов и миофибробластов. Они могут также содержать сфингоидное основание, такое как сфинганин или фитосфингозин, которые оптимизируют антибактериальный эффект и усиливают противовоспалительный эффект пептида.

Различные вторичные действия могут быть выгодны при добавлении к композиции, и они могут быть выбраны из, например, зарубцовывающего, противовоспалительного, противоинфекционного средства и витамина A или Е. Зарубцовывающим средством может быть, например, соль цинка, экстракт зерен плода рожкового дерева богатых олигогалактоманнанами. Противовоспалительным средством может быть полисахарид, такой как Rhamnosoft® или Teflose® (Solabia), который ингибируют клеточную адгезию и ограничивает воспалительные реакции, или экстракт смолы Босвеллии серрата (Soothex®), которая действует посредством ферментного ингибирования синтеза лейкотриенов. Дополнительное противоинфекционное средство можно выбрать из силанола и средства, активирующего образование противомикробного пептида, такого как метил капроил тирозинат (Defensamide®).

Композиции по настоящему изобретению могут быть представлены во всех формах галеновых препаратов типичных для топического нанесения, особенно для наружного топического нанесения. Например, они могут быть представлены в форме водных или спиртовых растворов, мицеллярных лосьонов, растворов для распыления, шампуней, дисперсий, сывороток, гигиенических салфеток, пластырей, тюлей или повязок с контролируемым выделением, гелей (водных, безводных или липофильных), олеогелей (липидный гель), мазей, суспензий, пористых ионных или неионных дисперсий, жидких или полужидких эмульсий (например, молока), твердого или полутвердого вещества. Эмульсии могут быть эмульсиями типа «масло в воде» (М-В) или «вода в масле» (В-М), например, гелями или кремами.

Эксципиентами или основами, используемыми для получения композиций согласно настоящему изобретению, являются вещества, часто используемые в препаратах для дерматологического использования, и выбранные в зависимости от выбранной формы введения.

В качестве примера можно привести эмульгаторы, загустители, смягчители, гелеобразующие средства, стабилизаторы, солюбилизаторы, суспендирующие агенты, такие как моющие основы и эфирные масла.

Эмульгаторы можно выбрать, например, из карбоксивиниловых полимеров с высокой молекулярной массой, полисорбатов, таких как Polysorbate 20® или Tween 60®, сложных эфиров сорбитана и, в частности, стеарата, пальмитата или лаурата сорбитана, такого как Arlacel®. Также в качестве эмульгатора можно использовать производное стеариновой или пальмитиновой кислоты, например, стеарат полиэтиленгликоля, стеарат глицерола, стеарат PEG 100® (например, Arlacel 165®), стеарет или цетеарет, жирный спирт, такой как стеариловый, каприловый, цетеариловый спирт, например Montanov 68®, а также эмульсионный силикон.

Гелеобразующие средства и загустители можно включить в композицию для улучшения текучести. Они могут быть выбраны из полиакриламидов типа Carbopol, кополимеров акрилата/акриловой кислоты, таких как Aculyn®, поперечно сшитых акрилатов, таких как Carbopol Ultrez®, производных целлюлозы, таких как гидроксипропил целлюлоза, или натуральной смолы, такой как ксантановая камедь и драгантовая камедь.

Увлажняющие средства и смягчители, используемые в композиции, могут быть выбраны из, например, пропиленгликоля, глицерина, бутиленгликоля и масла карите, а также жирных спиртов. Подходящим суспендирующим агентом является, например, глина, такая как бетонит или смектит.

Можно также с успехом добавить средство, облегчающее проникновение через эпидермис, такое как Cosmoperine.

Композиции, соответствующие настоящему изобретению можно получить с помощью обычных методов, в зависимости от выбранной формы введения препарата, желаемого количества гиалуроновой кислоты или ее солей, смешанных с противомикробным пептидом, и в случае необходимости с хитином или хитозаном, основами и вспомогательными веществами в физиологически приемлемой среде.

Под физиологически приемлемыми веществами согласно настоящему изобретению подразумеваются основы и вспомогательные вещества, часто используемые в дерматологических композициях в медицине человека, нейтральные по отношению к используемым активным веществам, не проявляющие токсических эффектов и никаких вторичных эффектов, пагубно влияющих на кожу.

Например, крем можно получить посредством дисперсии жирной фазы в водной фазе для получения эмульсии «масло в воде» или, наоборот, для получения эмульсии «вода в масле», в таком случае активное действие будет в одной или в другой фазе.

Композицию по изобретению, например, наносят в форме крема, предпочтительно два-три раза в день на зону кожи, нуждающуюся в лечении, в течение периода времени, который может длиться от нескольких дней до четырех недель в зависимости от серьезности заболевания.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение более подробно без ограничения его области применения. Во всех последующих примерах композиций части выражены в массе, если не указано иное.

Пример 1

Изготавливают водный гель посредством смешивания компонентов при комнатной температуре в порядке, указанном ниже.

Обессоленная вода 78,60 Carbopol Ultrez 20 0,80 Сода (водный раствор 32%) 0,50 Глицерин 2,00 Shield Bact Peptide® (0,1% раствор) 5,00 Обессоленная вода 10,00 Гиалуроновая кислота (PrimaHyal 450®) 0,10 Обессоленная вода 2,00 Пентиленгликоль 1,00

Приготовленным таким образом водный гель можно обычно использовать два-три раза в день в течение нескольких последовательных дней в зависимости от серьезности заболевания, подвергающегося лечению.

Пример 2

С помощью обычного метода изготавливают лосьон, имеющий композицию, описанную ниже.

Обессоленная вода 82,65 Carbopol Ultrez 20 0,45 Сода (водный раствор 32%) 0,30 Обессоленная вода 7,00 Гиалуроновая кислота (PrimaHyal 450®) 0,10 Глицерин 2,00 Teflose® (Solabia) 2,00 Оливковое масло PEG-7 эфир 2,00 Полисорбат 20 0,50 Shield Bact Peptide® (0,1% раствор) 3,00

Данный лосьон можно использовать один-два раза в день в течение нескольких дней для лечения офтальмологических заболеваний, таких как блефарит.

Пример 3

С помощью обычного метода изготавливают противомикробный крем посредством успешного смешивания фаз, содержащих компоненты, описанные ниже. Фазы А и B смешивают горячими (65-70°С), затем при тщательном перемешивании добавляют фазу С при 50°С, и затем добавляют фазу D.

Фаза А

Неионная эмульсия (Montanov 68) 4,00 Миристиловый спирт 2,00 Стеариловый спирт 0,50 Cetiol RLF® 3,00 Глицерил стеарат 3,00 Подсолнечное масло 4,00

Фаза B

Обессоленная вода 67,90 Carbopol Ultrez 21® 0,45 Пропандиол 2,00

Фаза С

Глицерин 2,00 Shield Bact Peptide® (0,1% раствор) 6,00

Фаза D

Сода (водный раствор 32%) 0,05 Обессоленная вода 5,00 Гиалуроновая кислота (PrimaHyal 300®) 0,10

Водородный показатель композиции pH был доведен до 6,5 посредством добавления 32% соды.

Данный крем можно использовать для нанесения на зоны кожи, нуждающиеся в лечении, один-два раза в день в течение некоторого периода времени, который определяет врач, и который может длиться от одной до трех недель в зависимости от природы и серьезности заболевания, нуждающегося в лечении.

Пример 4

Действие различных гиалуроновых кислот на производство β-дефензинов и разрастание кератиноцитов было измерено следующим образом.

β-дефензины Разрастание кератиноцитов AH hpm 0 NS AH pmm 1 ++++ S AH bpm 2 + NS AH tbpm 3 (+) NS

В таблице, приведенной выше, знак (+) обозначает эффективность, от слабой (+) до очень высокой (++++). NS обозначает «незначительный».

Использованная в примере гиалуроновая кислота (AH) имеет высокую молекулярную массу (hpm), среднюю молекулярную массу по изобретению (pmm - около 450 кДа), низкую молекулярную массу (bpm) или очень низкую молекулярную массу (tbpm).

Производство β-дефензинов:

Культуры кератиноцитов в конфлюентном состоянии обрабатывали в течение 18 ч 0,2%-ной АН ppm или положительным контролем (липополисахаридами из Escherichia coli 5 мг/мл) или:

с одной стороны, гиалуроновой кислотой с высокой молекулярной массой (AH hpm)

c другой стороны, гиалуроновыми кислотами с низкими молекулярными массами (AH 20кДа и AH 10кДа).

Высвобождение HBD2 оценивали в поверхностном слое при помощи набора ELISA. Представленные значения являются усредненными результатами.

Контроль LPS AH pmm AH bpm AH tbpm пг/мл 11 43 105 20 18

Разрастание кератиноцитов:

В J0 совершали повреждение монослоя кератиноцитов (HaCaT) в конфлюентном состоянии. Далее клетки обрабатывали 2,5% SVF (фетальная бычья сыворотка) при 37°С без гиалуроновой кислоты (условия для сравнения) или с гиалуроновыми кислотами c возрастающими средними молекулярными массами (AH50, AH 300, AH 1,000).

Расстояние между двумя краями раны измеряли на 3 различных участках на одной и той же фотографии после каждой обработки J0 и J1. Каждый эксперимент проводили 5 раз независимо друг от друга. Средние значения были получены статистически (дисперсионный анализ фактора с последующим тестом Даннета (SigmaStat).

Только AH ppm (AH 300) позволяет ускорить процесс заживления кожи посредством разрастании кератиноцитов (HaCat).

Стимулирование бактериальных защитных механизмов:

приготовили 3 раствора:

Раствор А: АН pmm 0,10%

Раствор B: гексапептид 0,05%

Раствор С: гексапептид 0,05% + АН pmm 0,10%

Гексапептид, использованный в данном эксперименте, - это коммерчески доступный Shield Bact Peptide® (Infinitec). Гиалуроновая кислота (AH pmm) имеет среднюю молекулярную массу 300 кДа.

Белки из биопсии кожи человека, подвергшейся лечению (растворы А В С или только среда) экстрагировали при слабом перемешивании в течение 2 часов в растворе, содержащем 5%-ную уксусную кислоту и ингибиторы протеаз (0,02 мМ PMSF, 2 нг/мл пепстатина и 2 нг/мл лейпептина).

Растворенные в супернатанте белки высушивали под вакуумом и гомогенизировали в растворе 0,01% уксусной кислоты.

10⁴ бактерий/мл E. Coli (ATCC 4157) выдерживали в инкубаторе в среде логарифмического роста в фосфатном буфере (pH 7,4) и в конечном объеме 100 мкл.

Данную суспензию E. Coli перемешивали с 30 мкг белковых экстрактов и 10 мкл раствора 0,01% уксусной кислоты, содержащей ингибиторы протеаз (отрицательный контроль), и смеси выдерживали в инкубаторе в течение 120 минут при 37°С.

В конце выдерживания в инкубаторе отбирали 10 мкл раствора и разбавляли в соотношениях 1/10 и 1/100, далее образцы засевали в трех экземплярах в чашки Петри, содержащие казеин-соевый бульон, и выдерживали в инкубаторе в течение ночи при 37°С.

После посева в чашку Петри и выдерживания в инкубаторе в течение ночи при 37°С для каждого образца определяли число UFC.

Таблица с результатами, приведенная ниже, показывает, что комбинация противомикробного гексапептида, соединенного с пальмитиновой кислотой, с гиалуроновой кислотой со средней молекулярной массой по изобретению (Раствор С), показала наибольшую эффективность, и процент ингибирования образования UFC был равен 100%.

Контроль Раствор А Раствор В Раствор С % ингибирования 40 55 77 100

Пример 5

Клинические исследования проводили на собаках различных пород, и одно клиническое исследование проводили на пациентах в дерматологии человека.

Первое исследование на собаках:

Пять собак различных пород от 3 до 10 лет с инфекционным блефароконъюнктивитом двух глаз лечили растворами, приготовленными как описано ниже.

- раствор А: мицеллярный раствор, содержащий в своем составе 0,10% AH pmm и 0,03% гексапептида, соответствующий изобретению, наносили на правый глаз

- раствор В: раствор, содержащий в своем составе 0,03% гексапептида, соответствующий изобретению, наносили на левый глаз

Средняя молекулярная масса гиалуроновой кислоты в композиции равна 450 кДа, и гексапептид - это Shield Bact Peptide (Infinitec).

Клиническую эволюцию контролировали после 4, 8, 12, 24 и 48 ч. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.

Эволюция Собака Правый глаз Левый глаз 4 ч 1 + + 8 ч 2 ++ +(+) 12 ч 3 +++ ++ 24 ч 4 +++ ++ 48 ч 5 ++++ +++

Результаты показывают более быстрое улучшение инфекционной симптоматологии при применении раствора А по изобретению, которое проявляется после 8 часов и закрепляется во временном промежутке между 12 и 24 часами.

Второе исследование на собаках:

Случай номер 1: Собака эрдельтерьер (10 лет) с сухим кератоконъюнктивитом, который развивался в течение многих лет, и который безуспешно лечили циклоспорином. Глаз сухой с вторичным конъюнктивитом и с суженной глазной щелью. Нанесение лосьона А, описанного ниже, один раз в день в течение 8 дней вызвало значительное улучшение (глаз чистый, открытый, исчезновение боли).

Случай номер 2: Собака мальтийская болонка (15 лет) с серьезным изъязвлением роговицы в результате длительной анестезии без улучшения в случае традиционного лечения. Глаз остается сухим, изъязвление значительное, острая боль. Нанесение лосьона А по изобретению два раза в день в течение 8 дней вызвало заживление и исчезновение боли.

Случай номер 3: Собака немецкий боксер (7 лет) с язвой роговицы с грануляционной тканью 8 мм. Нанесение лосьона А два раза в день в течение 8 дней привело к выздоровлению.

Случай номер 4: Собака Ши-Тцу с сухим кератоконъюнктивитом, изъязвлением роговицы и болями. Традиционное лечение в течение 3 недель не дало эффекта. Нанесение лосьона А по изобретению 2 раза в день в течение 8 дней вызвало заметное снижение болей без отчетливого изменения изъязвления. Переход на циклоспорин вызвал клиническое улучшение изъязвления в течение 8 дней.

Случай номер 5: котенок с острым ринитом, осложненным перфорацией глазного яблока. Лечение антибиотиками не дало улучшения. Отказ от терапевтической глазной окклюзии. В этом случае использовали лосьон А по изобретению 3 раза в день, что привело к быстрому улучшению.

Исследования на людях:

Атопический дерматит характеризуется особенной чувствительностью к золотистому стафилококку. Подчеркивают его роль во вспышках экземы, и для улучшения симптоматологии необходим контроль ее разрастания на поверхности кожи.

Четыре взрослых пациента, 2 мужчины и 2 женщины, возрастом от 18 до 31 года со вторичной экземой, расположенной на уровне крупных складок (складки локтя, в подколенной ямке), подвергались лечению двумя жидкими эмульсиями.

- эмульсия А, содержащая только 0,05% гексапептида, нанесенная на правую сторону;

- эмульсия В, содержащая гексапептид (0,05%) и AH pmm (0,20%), нанесенная на левую сторону.

Средняя молекулярная масса гиалуроновой кислоты равна 300 кДа. Гексапептид - это Shield Bact Peptide (Infinitec).

Критерии Зуд, Подтекание, Вторичная инфекция были пронумерованы от 0 до 4 для определения оценки улучшения.

Симптомы T0 T12 T24 T48 А В А В А В А В Результаты Зуд 4 4 3 2 2 1 2 1 В>A Подтекание 4 4 2 1 1 0 (1) 0 В>A Втор. Инфекция 4 4 2 1 1 0 0 0 В>A

Результаты показывают, что два крема показывают эффективность, но крем В имеет более быстрое действие на симптоматологию, проявляющееся после 12 часов.

Вторичная инфекция подавляется после 24 ч.

Общее улучшение более явно выражено при применении крема В по изобретению.

Изобретение относится к дерматологии. Предложено применение топической противомикробной дерматологической композиции в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающей комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики. Технический результат состоит в улучшении инфекционной симптоматики в ситуации, когда лечение антибиотиками не принесло улучшения, или в более быстром действии комбинации заявленного пептида с гиалуроновой кислотой. 10 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Применение топической противомикробной дерматологической композиции в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающей комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики.

2. Применение композиции по п.1, отличающееся тем, что гиалуроновая кислота имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа.

3. Применение композиции по п.1, отличающееся тем, что соль гиалуроновой кислоты выбирают из солей щелочных и щелочноземельных металлов.

4. Применение композиции по п.3, отличающееся тем, что соль гиалуроновой кислоты представляет собой гиалуронат натрия, калия, кальция или магния.

5. Применение композиции по п.1, отличающееся тем, что противомикробный пептид соединен с липидом ковалентной связью.

6. Применение композиции по п.5, отличающееся тем, что противомикробный пептид связан ковалентной связью с жирной кислотой от 6 до 22 атомов углерода.

7. Применение композиции по п.1, отличающееся тем, что она дополнительно содержит хитин или хитозан.

8. Применение композиции по п.1, отличающееся тем, что она содержит от 0,005 до 2% по массе гиалуроновой кислоты и от 0,001 до 1% по массе противомикробного положительно заряженного пептида, по отношению к общей массе композиции.

9. Применение композиции по п.1, отличающееся тем, что она представлена в форме, пригодной для наружного топического нанесения.

10. Применение композиции по п.1, отличающееся тем, что она также содержит одно или более вторичных активных средств, выбранных из зарубцовывающего, противовоспалительного, противоинфекционного средства и витамина, такого как витамин A или Е.

11. Применение композиции по любому из пп. 1-10 в офтальмологической области.