Способ определения агрессивности микроорганизмов-биодеструкторов полимерных материалов Российский патент 2018 года по МПК C12Q1/18 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к исследованию степени деструкции полимерных материалов микроорганизмами.

Биологическая деструкция, протекающая под действием микроорганизмов, представляет собой сложный физико-химический и медико-биологический процесс, включающий их диффузию в полимерный материал с последующими реакциями превращения химически нестойких связей, изменениями основных эксплуатационных или функциональных свойств полимеров. Повреждения полимерных материалов чаще всего вызываются грибами из родов Penicillium, Aspergillus, Chaetomium, Fusarium, Alternaria, Trichoderma, Rhizopus и т.п.

Микроорганизмы и метаболиты также вызывают изменения физико-химических и электрофизических свойств полимерных материалов в результате набухания или растрескивания. В частности в результате биообрастания - появление пятен плесени ухудшаются и различные внешние качества полимерных материалов, при этом работоспособность изделия может сохраняться. Развитие на поверхности полимера культуры плесневых грибов вызывает конденсацию из атмосферы паров воды, скопление влаги, что может в дальнейшем повлиять на изменение свойств полимерного материала.

Деструкция пластмасс зависит не только от вида и рода воздействующих микроорганизмов. На степень повреждения пластмасс оказывает влияние и химическое строение полимерного материала, его физическая структура, молекулярная масса, молекулярно-массовое распределение фракций, наличие и состав пластификаторов, наполнителей, стабилизаторов, а также других добавок.

Кроме того повреждения полимерного материала зависит и от его физической структуры. Мицелий грибов может использовать для своего развития очень тонкие трещины, поры материала, образующиеся на границе раздела фаз и поверхностей в материале.

Все это в конечном итоге может приводить к изменению физико-механических свойств полимерного материала, например, уменьшение прочности, гибкости, диэлектрических характеристик, снижению электроизоляционных свойств.

В этой связи определение агрессивности микроорганизмов-биодеструкторов полимерных материалов в процессе их эксплуатации имеет важное значение.

Тем более что на современном этапе развития меняется подход к разработке полимерных материалов, диаметрально противоположный традиционному, так как его целью является получение полимеров, которые сохраняют эксплуатационные характеристики только в течение периода эксплуатации, а затем претерпевают физико-химические и биологические превращения под действием факторов окружающей среды и легко включаются в процессы метаболизма природных биосистем.

На сегодняшний день существует большое количество стандартов по определению агрессивности микроорганизмов-биодеструкторов полимерных материалов, в которых проводят определение методом визуальной оценки степени обрастания материалов; кроме того, ряд стандартов рекомендует осуществлять проверку некоторых физико-технических параметров исследуемых изделий (убыль веса, прочность на разрыв и сжатие, удельное объемное и поверхностное сопротивление, tg угла диэлектрических потерь, диэлектрическая проницаемость и т.п.), которые изменяются при биологических повреждениях (Родионова М.С., Березниковская Л.В., Веприцкая А.В. О методах испытания изделий на грибостойкость // Микология и фитопатология. 1990. Т. 24. Вып. 1. С. 87-88).

В соответствии с ГОСТ 9.048-75 … 9.053-75 и ГОСТ 20.57.406-81 известны два метода испытаний на грибостойкость. По первому методу испытуемые образцы, тщательно очищают от загрязнений этиловым спиртом. По второму методу выборку изделий делят на две равные части (число изделий в выборке должно быть четным). Для выявления причин поражения изделий грибами подвергают очистке от загрязнений этиловым спиртом только первую группу образцов. Таким образом, первый метод устанавливает, содержат ли изделие и материалы источники питания для развития и роста грибов, а второй метод устанавливает наличие фунгицидных свойств и влияние внешних загрязнений на грибоустойчивость образца. Готовят суспензию спор грибов в воде для каждого вида грибов с концентрацией 1-2 млн. спор/мл. Приспособления с испытываемыми образцами переносят в испытательный бокс, после чего доступные поверхности образцов заражают водной суспензией спор грибов. Вся поверхность изделий должна быть равномерно опрыснута из пульверизатора. На питательную среду контрольных чашек Петри наносится несколько капель суспензии. Образцы просушивают. После высыхания капель суспензии образцы и контрольные чашки Петри помещают в камеру грибообразования. Расстояние между образцами должно быть не менее 20 мм. Камеру закрывают. Продолжительность испытаний составляет 28 суток. По истечении 5 суток из камеры извлекают контрольные чашки Петри. Если на питательной среде чашек Петри рост грибов не наблюдается, то испытания повторяют на новых образцах с вновь приготовленной суспензией из новых партий грибов. По окончании испытаний образцы извлекают из камеры и сразу осматривают сначала невооруженным глазом в рассеянном свете при освещенности от 2000 до 3000 лк, а затем при увеличении в 56-60 раз. Оценку грибоустойчивости изделий производят по росту грибов на образцах по шестибалльной системе: при осмотре под микроскопом рост плесневых грибов не виден - 0; при осмотре под микроскопом видны проросшие споры и незначительно развитый мицелий в виде неветвящихся гиф - 1; при осмотре под микроскопом виден мицелий в виде ветвящихся гиф, возможно наличие спор - 2; при осмотре невооруженным глазом рост грибов едва виден, но отчетливо виден под микроскопом - 3; при осмотре невооруженным глазом отчетливо виден рост грибов, покрывающих менее 25% испытываемой поверхности - 4; при осмотре невооруженным глазом отчетливо виден рост грибов, покрывающих более 25% испытываемой поверхности - 5. Для повышения точности оценки грибоустойчивости рекомендуется воспользоваться фотообразцами, приведенными в приложении к ГОСТу 9.048-75. Изделия считают выдержавшими испытание по первому методу, если рост грибов на них не превышает 2 балла. Результаты испытания изделий на грибоустойчивость по второму методу оценивают по обеим группам образцов. Результаты испытаний считают положительными, если оценка роста грибов на образцах первой группы не превышает 2 балла, а у второй группы - 3 балла. Затем составляют протокол испытаний, куда заносят результаты. Однако эти методы имеют ряд весьма существенных недостатков. При испытании материалов с одинаковым целевым назначением используются различные тест-организмы. В ряде указанных стандартов учитывается присутствие внешних загрязнений на испытуемых материалах, в ряде других - не учитывается. Это приводит к неадекватности оценки при учетах результатов испытаний одних и тех же материалов.

Известен также способ определения стойкости образцов материалов к воздействию микроорганизмов путем оценки интенсивности роста тест-культур при этом в состав тест-организмов вводят культуры денитрифицирующих, десульфатирующих, углеводород-окисляющих и аммонифицирующих бактерий, выделенных из почв и подвергают образцы в том числе и полимерные материалы физико-механическим испытаниям (SU 245433 А1, 04.06.1969). Недостатками способа являются длительность исследования.

Известна группа хроматографических методов (газовые, газожидкостные, тонкослойные, ионообменные) определения деструкции полимеров. Эти методики разработаны и используются рядом авторов. Ермилова И.А. с сотрудниками при определении особенностей воздействия химических волокон на бактерии использовали газохроматографический метод определения углекислого газа для выявления активности декарбоксилаз микроорганизмов. (Ермилова И.А, Вершинина Н.П., Зубко И.К. Газохроматографические методы определения особенностей воздействия химических волокон на микроорганизмы // В сб.: Биохимические основы защиты промышленных материалов от повреждений. Горький: Б.И., 1987. С. 34-38). Способ трудоемок и длителен в исследовании.

Известен хроматографический экспресс-способ определения устойчивости полимеров на основе искусственных каучуков к разрушающему воздействию микроскопических грибов. Он заключается в сравнительном анализе хроматограмм экстрактов материала до и после воздействия на него микодеструкторов, а также в сравнении хроматограмм газовой фазы продуктов жизнедеятельности грибов, культивируемых на питательной среде и в присутствии изучаемого объекта (Feldman M.S., Kirsh S.I., Pozhidaev V.M. Extraction of organic compounds, formed in the cource of polymer biodestruction // Abstr. International conference on solutions extraction of organic compounds ISECOS 92, Voronezh, Rissia, Sertember 22-25, 1992. V. 11. P. 65-69). Недостатками способа является его трудоемкость. Данный источник информации рассмотрен в качестве ближайшего аналога.

Технический результат заявленного способа заключается в расширении арсенала технических средств для оценки агрессивности микроорганизмов-биодеструкторов полимерных материалов с высокой точностью и значительным сокращением трудозатрат и временем исследования.

Технический результат достигается тем, что определение агрессивности микроорганизмов-биодеструкторов полимерных материалов, проводят путем газохроматографического определения метаболической активности микроорганизмов по эмиссии диоксида углерода, при этом образцы полимерных материалов с исследуемой площадью, незараженные -контрольный образец и зараженные с поверхности суспензией спор микроорганизмов - опытный образец помещают в отдельные чашки Петри или на решетчатое дно эксикатора на расстоянии 1,5-2 см друг от друга, закрывают и инкубируют при оптимальных для развития микроорганизмов условиях - при влажности 80-85% и температуре 24-28°С, один-два раза в неделю сдвигая в сторону крышку для обеспечения циркуляции воздуха, затем по истечении 28-96 суток инкубации при свободном газообмене образцы переносят во флаконы объемом 15 см³, герметично закрывают и инкубируют 24-48 часов при температуре 24-28°С, затем отбирают шприцом аликвоты газовой пробы из флаконов с контрольными и опытными образцами в количестве 0,5-1,0 см³ и определяют в них хроматографически концентрацию диоксида углерода, рассчитывая удельную эмиссию диоксида углерода (мкмоль/см² /час) в опытной Vo и контрольной Vк пробе по формуле: Vo или Vк=(So или Sк*0.002124*Mr*v)/(t*s), где So или Sк -средняя площадь пика опытной и контрольной пробы на хроматографе при умножении на коэффициент 0,002124 и Mr показывающая концентрацию СО₂ в мкмолях; Mr - молярная масса углекислого газа (равна 44,01 г/моль); v - объем аликвоты газовой пробы из флакона (см³); t - время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе, час; s - площадь поверхности опытного или контрольного образца, см², затем рассчитывают отношение удельной эмиссии диоксида углерода в опытном образце к контрольному в %(об), определяя кратность превышения концентрации диоксида углерода

(k) в опытном образце по формуле: k=Vo/Vк и при значении k<10 определяют отсутствие агрессивности микроорганизма и отсутствии деструкции опытного образца, при значении 10<k<30 - его слабую агрессивность и отсутствие деструкцию опытного образца, при значении 30<k<50 - среднюю агрессивность и химическую деструкцию опытного образца метаболитами микроорганизмов и при значении k>50 - его сильную агрессивность и химическую и механическую деструкцию опытного образца полимерного материала с изменением его физико-химических и электрофизических свойств.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно проводят подготовку водной суспензии спор Aspergillus niger (и также других видов микроорганизмов по отдельности), используя для этого дистиллированную воду и культуру гриба на агаризованной среде Чапека в возрасте 14-28 суток. Концентрацию спор подсчитывают методом прямого счета в камере Горяева. Для исследования концентрация спор в суспензии должна быть равна 1-2 млн. спор/см³; - в суспензию также добавляют ПАВ Твин-80 (1 капля в 10 мл суспензии).

Затем надевают медицинскую маску, резиновые перчатки и проводят обработку исследуемого полимерного материала суспензией спор Aspergillus niger или другим видом микроорганизма из пульверизатора, аккуратно распыляя определенный объем на исследуемую площадь, не допуская слияния капель споровой суспензии. Для работы со спорами используют металлическую кювету или поднос, покрытый алюминиевой фольгой. Работы выполняются при соблюдении стерильных условий в ламинарном боксе.

Далее образцы полимерных материалов с исследуемой площадью, незараженные (контрольный образец) и зараженные с поверхности суспензией спор микроорганизма (опытный образец) помещают в отдельные чашки Петри и/или на решетчатое дно эксикатора на расстоянии 1,5-2 см друг от друга и инкубируют при оптимальных для развития микроорганизмов условиях - при влажности 80-85% и температуре 24-28°С, один-два раза в неделю сдвигая в сторону крышку эксикатора или чашек Петри на 5-10 секунд. Ее открывают и закрывают для обеспечения циркуляции воздуха. Затем по истечении 28-96 суток инкубации при свободном газообмене образцы переносят в пенициллиновые флаконы объемом 15 см³. Далее их герметично закрывают и инкубируют 24-48 часов при температуре 24-28°С. Затем производят отбор шприцом аликвоты газовой пробы из флаконов с контрольными и опытными образцами в количестве 0,5-1,0 см³. Определяют в них хроматографически концентрацию диоксида углерода, рассчитывая удельную эмиссию диоксида углерода (мкмоль/см²/час) в опытной пробе Vo и контрольной пробе Vк по формуле: Vo или Vк=(So или Sк*0.002124*Mr*v)/(t*s), где

So или Sк - средняя площадь пика опытной и контрольной пробы на хроматографе при умножении на коэффициент 0,002124 и Mr, показывающий концентрацию СО₂ в мкмолях;

Mr - молярная масса углекислого газа (равна 44,01 г/моль); v - объем аликвоты газовой пробы из флакона (см³);

t - время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе, час; s - площадь поверхности опытного или контрольного образца, см. Затем рассчитывают отношение удельной эмиссии диоксида углерода в опытном образце к контрольному в %(об), определяя кратность превышения концентрации диоксида углерода (k) в опытном образце по формуле: к=Vo/Vк. При значении k<10 определяют отсутствие агрессивности микроорганизма и отсутствии деструкции опытного образца, при значении 10<k<30 - его слабую агрессивность и отсутствие деструкцию опытного образца, при значении 30<k<50 - среднюю агрессивность и химическую деструкцию опытного образца метаболитами микроорганизмов и при значении k>50 - его сильную агрессивность и химическую и

механическую деструкцию опытного образца полимерного материала с изменением его физико-химических и электрофизических свойств.

Примеры осуществления способа.

Пример 1

Для исследования использовали пластины полимерного материала в виде высушенного тонкого силиконового герметика (Penosil + 1500°С Sealant жаростойкий).

Образцы материала очищали от внешних загрязнений, погружая на 1 минуту в этиловый спирт, и высушивали. Расход спирта составлял от 0,05 до 0,1 дм³/м². Предварительно осуществляли подготовку суспензии спор Aspergillus niger как описано выше. Готовили суспензию спор грибов в воде по ГОСТ 9.048. (п. 1.3).

Под ламинарным боксом при соблюдении условий стерильности пластины полимерного материала в количестве 3 контрольных и 3 опытных выкладывали на дно металлической кюветы и обрабатывали из пульверизатора суспензией спор Aspergillus niger, не допуская слияния капель на поверхности.

Образцы полимерных материалов с исследуемой площадью поверхности (s) равной 8 см², незараженные (контрольный образец) и зараженные с поверхности суспензией спор Aspergillus niger (опытный образец) размещали на расстоянии 1,5 см друг от друга в чашках Петри, на дно которых налита вода, и инкубировали 28 суток при температуре 28°С и влажности 85%. Один-два раза в неделю сдвигали в сторону крышку чашек Петри на 5-10 секунд.

Затем эти образцы полимерных материалов контрольные и опытные помещали в пенициллиновые флаконы объемом 15 см³. Герметично закрывали и инкубировали 48 часа при температуре 28°С. Из пенициллиновых флаконов с контрольным и опытным образцами отобрали шприцом аликвоты газовой пробы (v) в количестве 1,0 см³. Далее определяли в ней концентрацию диоксида углерода с помощью газового хроматографа (М 3700-4).

Было проведено три измерения при этом площадь пика контрольной пробы на хроматографе трех измерений равнялась 113,55; 178,15; 107,67. Рассчитанная средняя площадь пика пробы на хроматографе (So) при этом равнялась 133,12. Молярная масса углекислого газа (Mr) составляет 44,01 г/моль. Объем аликвоты газовой пробы из флакона (v) составил 1 см³. Время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (t) составляла 48 часов. Удельную эмиссию диоксида углерода (мкмоль/см²/час, в контрольной пробе) рассчитывали по формуле: Vк=(133,12*0,002124*44,01*1)/(48*8)=0,033

Также было проведено три измерения площади пика опытной пробы на хроматографе, которые равнялись 205,4; 191,85, 178,31. Рассчитанная средняя площадь пика пробы на хроматографе (Sк) при этом равнялась 191,85. Молярная масса углекислого газа (Mr) составляет 44,01 г/моль. Объем аликвоты газовой пробы из флакона (v) составил 1 см³. Время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (t) составляла 48 часов. Удельную эмиссию диоксида углерода (мкмоль/см²/час, в контрольной пробе) рассчитывали по формуле: Vo=(191,85*0,002124*44,01*1)/(48*8)=0,047

Затем рассчитывали отношение удельной эмиссии диоксида углерода в опытном образце к контрольному в % (об), определяя кратность превышения концентрации диоксида углерода (k) в опытном образце по формуле: k=0,047/0,033=1,4.

Таким образом, деструкция у данного опытного полимерного материала отсутствует. А k - кратность превышения значения содержания диоксида углерода (в объемных процентах) в опытном варианте над контрольным составила 1,4, что является меньше 10 (см. рис. 1 и 2). Как на рисунке 1 (контрольный образец) так и на рисунке 2 (опытный образец) отсутствуют какие-либо факторы присутствия мицелия и деградации полимерного материала.

Было проведено исследование степени деструкции полимерного материала силиконовый герметик и путем оценки в баллах по ГОСТ 9.048-89. Агрессивность микроорганизма также отсутствовала и была равна 0. Соответственно отсутствовала и деградация опытного образца.

Пример 2

Для исследования использовали полимерный материал в виде высушенной пластины тонкого полиуретанового герметика Makroflex.

Образцы материала очищали от внешних загрязнений, погружая на 1 минуту в этиловый спирт, и высушивали. Расход спирта составлял от 0,05 до 0,1 дм³/м². Предварительно осуществляли подготовку суспензии спор Aspergillus niger как описано выше. Готовили суспензию спор грибов в воде по ГОСТ 9.048. (п. 1.3).

Под ламинарным боксом при соблюдении условий стерильности пластины полимерного материала в количестве 3 контрольных и 3 опытных выкладывали на решетчатое дно эксикатора и обрабатывали из пульверизатора суспензией спор Aspergillus niger, не допуская слияния капель на поверхности.

Образцы полимерных материалов с исследуемой площадью поверхности (s) равной 9 см², незараженные (контрольный образец) и зараженные с поверхности суспензией спор Aspergillus niger (опытный образец) размещали в эксикаторах, на дно которых налита вода, и инкубировали 68 суток при температуре 29°С и влажности 80%.

Затем эти образцы полимерных материалов контрольные и опытные помещали в пенициллиновые флаконы объемом 15 см³. Герметично закрывали и инкубировали 24 часа при температуре 28°С. Из пенициллиновых флаконов с контрольным и опытным образцами отобрали шприцом аликвоты газовой пробы (v) в количестве 1,0 см³. Далее определяли в ней концентрацию диоксида углерода с помощью газового хроматографа (М 3700-4).

Было проведено три измерения при этом площадь пика контрольной пробы на хроматографе трех измерений равнялась 19,58; 15,66; 23,50. Рассчитанная средняя площадь пика пробы на хроматографе (So) при этом равнялась 19,58. Молярная масса углекислого газа (Mr) составляет 44,01 г/моль. Объем аликвоты газовой пробы из флакона (v) составил 1 см³. Время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (t) составляла 24 часа. Удельная эмиссия диоксида углерода (мкмоль/см²/час, в контрольной пробе) рассчитывали по формуле: Vк=(19,58*0,002124*44,01*1)/(24*9)=0,0084

Также было проведено три измерения площади пика опытной пробы на хроматографе, которые равнялись 344,56; 172,28, 904,46. Рассчитанная средняя площадь пика пробы на хроматографе (Sк) при этом равнялась 473,77. Молярная масса углекислого газа (Mr) составляет 44,01 г/моль. Объем аликвоты газовой пробы из флакона (v) составил 1 см³. Время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (t) составляла 24 часа. Удельная эмиссия диоксида углерода (мкмоль/см²/час, в контрольной пробе) рассчитывали по формуле: Vo=(473,77*0,002124*44,01*1)/(24*9)=0,205

Затем рассчитывали отношение удельной эмиссии диоксида углерода в опытном образце к контрольному в % (об), определяя кратность превышения концентрации диоксида углерода (k) в опытном образце по формуле: k=0,205/0,0084=24,4.

Таким образом, деструкция у данного опытного полимерного материала отсутствует. А k - кратность превышения значения содержания диоксида углерода (в объемных процентах) опытного над контрольным составила 24,4, что является больше 10, но меньше 30 (см. рис. 3 и 4). Как на рисунке 3 (контрольный образец) так и на рисунке 4 (опытный образец), несмотря на слабую агрессивность микроорганизмов опытного образца, отсутствуют какие-либо факторы деградации полимерного материала. На поверхности мицелия визуально не обнаружено.

Было проведено исследование степени деструкции полимерного материала полиуретанового герметика путем оценки в баллах по ГОСТ 9.048-89. Агрессивность микроорганизма также отсутствовала и была равна 0. Соответственно отсутствовала и деградация опытного образца.

Пример 3

Для исследования использовали полимерный материал в виде силиконовой резины. Образцы материала очищали от внешних загрязнений, погружая на 1 минуту в этиловый спирт, и высушивали. Расход спирта составлял от 0,05 до 0,1 дм³/м². Предварительно осуществляли подготовку суспензии спор Chaetomium globosum как описано выше. Готовили суспензию спор грибов в воде по ГОСТ 9.048. (п. 1.3).

Под ламинарным боксом при соблюдении условий стерильности пластины полимерного материала в количестве 3 контрольных и 3 опытных выкладывали на решетчатое дно эксикатора и обрабатывали из пулевизатора суспензией спор Chaetomium globosum, не допуская слияния капель на поверхности.

Образцы полимерных материалов с исследуемой площадью поверхности (s) равной 4,4 см², незараженные (контрольный образец) и зараженные с поверхности суспензией спор Chaetomium globosum (опытный образец) размещали в эксикаторах, на дно которых налита вода, и инкубировали 96 суток при температуре 24°С и влажности 80%.

Затем эти образцы полимерных материалов контрольные и опытные помещали в пенициллиновые флаконы объемом 15 см³. Герметично закрывали и инкубировали 24 часа при температуре 28°С. Из пенициллиновых флаконов с контрольным и опытным образцами отобрали шприцом аликвоты газовой пробы (v) в количестве 0,5 см³. Далее определяли в ней концентрацию диоксида углерода с помощью газового хроматографа (М 3700-4).

Было проведено три измерения при этом площадь пика контрольной пробы на хроматографе трех измерений равнялась 17,01; 16,58; 14,0. Рассчитанная средняя площадь пика пробы на хроматографе (So) при этом равнялась 15,86. Молярная масса углекислого газа (Mr) составляет 44,01 г/моль. Объем аликвоты газовой пробы из флакона (v) составил 0,5 см³. Время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (t) составляла 24 часа. Удельная эмиссия диоксида углерода (мкмоль/см²/час, в контрольной пробе) рассчитывали по формуле: Vк=(15,86*0,002124*44,01*0,5)/(24*4,4)=0,007

Также было проведено три измерения площади пика опытной пробы на хроматографе, которые равнялись 681,22; 814,4, 630,38. Рассчитанная средняя площадь пика пробы на хроматографе (Sк) при этом равнялась 708,66. Молярная масса углекислого газа (Mr) составляет 44,01 г/моль. Объем аликвоты газовой пробы из флакона (v) составил 0,5 см³. Время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (t) составляла 24 часа. Удельная эмиссия диоксида углерода (мкмоль/см²/час, в контрольной пробе) рассчитывали по формуле: Vo=(708,66*0,002124*44,01 *0,5)/(24*4,4)=0,313.

Затем рассчитывали отношение удельной эмиссии диоксида углерода в опытном образце к контрольному в % (об), определяя кратность превышения концентрации диоксида углерода (k) в опытном образце по формуле: k=0,313/0,007=44,7.

В соответствии с данными к у данного опытного полимерного материала имеет средняя степень деструкции - химическая метаболитами микроорганизмов. То есть кратность превышения значения содержания диоксида углерода (в объемных процентах) в опытном варианте над контрольным составила 44,7, что является больше 30, но меньше 50 (см. рис.5 и 6). На рисунках 5 и 6 (опытный образец) имеется деградация полимерного материала, глубина которой составила 0,167 мм. Поверхность образца резины покрыта мицелием менее чем на 25%.

Было проведено исследование степени деструкции полимерного материала силиконовой резины путем оценки в баллах по ГОСТ 9.048-89. Средняя агрессивность микроорганизма была равна 3-4 баллам.

Пример 4

Для исследования использовали полимерный материал в виде твердой резины: смеси содержащей до 47 частей серы на 100 частей каучука. Образцы материала очищали от внешних загрязнений, погружая на 1 минуту в этиловый спирт, и высушивали. Расход спирта составлял от 0,05 до 0,1 дм³/м². Предварительно осуществляли подготовку суспензии спор Chaetomium globosum как описано выше. Готовили суспензию спор грибов в воде по ГОСТ 9.048. (п. 1.3).

Под ламинарным боксом при соблюдении условий стерильности пластины полимерного материала в количестве 3 контрольных и 3 опытных выкладывали на дно чашки Петри и обрабатывали из пулверизатора суспензией спор Chaetomium globosum, не допуская слияния капель на поверхности.

Образцы полимерных материалов с исследуемой площадью поверхности (s) равной 4,4 см, незараженные (контрольный образец) и зараженные с поверхности суспензией спор Chaetomium globosum (опытный образец) размещали в чашках Петри, на дно которых налита вода, и инкубировали 56 суток при температуре 24°С и влажности 80%.

Затем эти образцы полимерных материалов контрольные и опытные помещали в пенициллиновые флаконы объемом 15 см³. Герметично закрывали и инкубировали 38 часов при температуре 28°С. Из пенициллиновых флаконов с контрольным и опытным образцами отобрали шприцом аликвоты газовой пробы (v) в количестве 0,5 см³. Далее определяли в ней концентрацию диоксида углерода с помощью газового хроматографа (М 3700-4).

Было проведено три измерения при этом площадь пика контрольной пробы на хроматографе трех измерений равнялась 37,01; 29,58; 38,3. Рассчитанная средняя площадь пика пробы на хроматографе (So) при этом равнялась 34,96. Молярная масса углекислого газа (Mr) составляет 44,01 г/моль. Объем аликвоты газовой пробы из флакона (v) составил 0,5 см³. Время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (t) составляла 38 часа. Удельная эмиссия диоксида углерода (мкмоль/см²/час, в контрольной пробе) рассчитывали по формуле: Vк=(34,96*0,002124*44,01*0,5)/(38*4,4)=0,0097

Также было проведено три измерения площади пика опытной пробы на хроматографе, которые равнялись 3280,09; 3506,24, 3400,1. Рассчитанная средняя площадь пика пробы на хроматографе (Sк) при этом равнялась 3395,5. Молярная масса углекислого газа (Mr) составляет 44,01 г/моль. Объем аликвоты газовой пробы из флакона (v) составил 0,5 см³. Время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (t) составляла 38 часов. Удельная эмиссия диоксида углерода (мкмоль/см²/час, в контрольной пробе) рассчитывали по формуле: Vo=(3395,5*0,002124*44,01*0,5)/(38*4,4)=0,94.

Затем рассчитывали отношение удельной эмиссии диоксида углерода в опытном образце к контрольному в % (об), определяя кратность превышения концентрации диоксида углерода (k) в опытном образце по формуле: k=0,94/0,0097=96,9.

В соответствии с данными к у этого опытного полимерного материала имеется сильная степень деструкции, с изменением его физико-химических и электрофизических свойств, поскольку кратность превышения значения содержания диоксида углерода (в объемных процентах) в опытном варианте над контрольным составила 96,9, что является больше 50 (см. рис. 7). По результатам оценки деградации данного опытного образца полимера с помощью томографа глубина деградации составила 0,325 мм. Образец резины более, чем на 25% покрыт мицелием.

Было также проведено исследование степени деструкции полимерного материала твердой резины путем оценки в баллах по ГОСТ 9.048-89. Агрессивность микроорганизмов была сильной и составила 5 баллов.

Были проведены исследования также образцов твердой резины как описано выше с другими микроорганизмами. Расчет производился по формулам: Vo или Vк=(So или Sк*0.002124*Mr*v)/(t*s) и k=Vo/Vк. Результаты представлены в таблице 1.

Высокая агрессивность Penicillium glabrum и Cladosporium cladosporioides прослеживается и при осмотре невооруженным глазом образцов резины. В опытных вариантах отчетливо виден мицелий грибов, покрывающий более 25% испытываемой поверхности и дающий обильное спороношение. Вид С.cladosporioides широко распространен на различных полимерных материалах, способен к разложению целлюлозы, пектина, кератина, а также доминирует на поверхности широкого круга полимерных материалов.

Для подтверждения заявленного способа и выявления особенностей роста и степени воздействия на резину этих видов микромицетов использовали сканирующую электронную микроскопию (см. рис. 8). Электронная микроскопия резины 203Б показана на рис. 8а - наличие мицелия Cladosporium cladosporioides на поверхности резины; на рис. 8 6, в - резина

после удаления С.cladosporioides на разном увеличении; на рис. 8 г - мицелий и спороношение Penicillium glabrum на поверхности резины; на рис. 8д, 8е - резина после удаления P.glabrum на разном увеличении; на рис. 8ж - чистая резина. В качестве контроля представлена микрофотография резины, которая не была засеяна микромицетами (рис. 8ж). При сравнении с контролем заметно, что на поверхности материала после удаления грибов образуются разнообразные трещины и даже каверны. Причем резина после контакта с С.cladosporioides характеризуется большей рыхлостью.

Таким образом, заявленный способ расширяет арсенал технических средств для оценки деструкции полимерных материалов микроорганизмами и обладает высокой точностью определения деструкции полимерного материала микроорганизмами и значительным сокращением трудозатрат и временем исследования.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ определения агрессивности микроорганизмов-биодеструкторов полимерных материалов, заключающийся в газохроматографическом определении метаболической активности микроорганизмов по эмиссии диоксида углерода. Рассчитывают удельную эмиссию диоксида углерода (мкмоль/см²/ч) в опытной Vo и контрольной Vк пробе по формуле Vo или Vк=(So или Sк*0.002124*Mr*v)/(t*s), где So или Sк - средняя площадь пика опытной и контрольной проб на хроматографе, Mr - молярная масса углекислого газа, v - объем аликвоты газовой пробы из флакона (см³), t - время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе (час), s - площадь поверхности опытного или контрольного образца (см²). Затем рассчитывают отношение удельной эмиссии диоксида углерода в опытном образце к контрольному в %(об.) по формуле к=Vo/Vк и определяют отсутствие или наличие агрессивности микроорганизма и деструкции опытного образца. Способ обеспечивает расширение арсенала технических средств оценки агрессивности микроорганизмов-биодеструкторов полимерных материалов и повышение точности определения. 8 ил., 1 табл., 4 пр.

Способ определения агрессивности микроорганизмов-биодеструкторов полимерных материалов, заключающийся в газохроматографическом определении метаболической активности микроорганизмов по эмиссии диоксида углерода, отличающийся тем, что образцы полимерных материалов с исследуемой площадью незараженные - контрольный образец - и зараженные с поверхности суспензией спор микроорганизмов - опытный образец - помещают в отдельные чашки Петри и/или на решетчатое дно эксикатора на расстоянии 1,5-2 см друг от друга, закрывают и инкубируют при оптимальных для развития микроорганизмов условиях: влажности 80-85% и температуре 24-28°С, один-два раза в неделю, сдвигая в сторону крышку для обеспечения циркуляции воздуха, затем по истечении 28-96 суток инкубации при свободном газообмене образцы переносят во флаконы объемом 15 см³, герметично закрывают и инкубируют 24-48 ч при температуре 24-28°С, затем отбирают шприцем аликвоты газовой пробы из флаконов с контрольными и опытными образцами в количестве 0,5-1,0 см³ и определяют в них хроматографически концентрацию диоксида углерода, рассчитывая удельную эмиссию диоксида углерода (мкмоль/см²/ч) в опытной Vo и контрольной Vк пробах по формуле Vo или Vк=(So или Sк*0.002124*Mr*v)/(t*s), где So или Sк - средняя площадь пика опытной и контрольной проб на хроматографе при умножении на коэффициент 0,002124 и Mr, показывающая концентрацию СО₂ в мкмолях, Mr - молярная масса углекислого газа (равна 44,01 г/моль), v - объем аликвоты газовой пробы из флакона (см³), t - время экспозиции инкубации пробы в закрытом флаконе, ч, s - площадь поверхности опытного или контрольного образца, см², затем рассчитывают отношение удельной эмиссии диоксида углерода в опытном образце к контрольному в % (об.), определяя кратность превышения концентрации диоксида углерода (к) в опытном образце по формуле к=Vo/Vк, и при значении k<10 определяют отсутствие агрессивности микроорганизма и отсутствие деструкции опытного образца, при значении 10<k<30 - его слабую агрессивность и отсутствие деструкции опытного образца, при значении 30<k<50 - среднюю агрессивность и химическую деструкцию опытного образца метаболитами микроорганизмов и при значении k>50 - его сильную агрессивность и химическую и механическую деструкции опытного образца полимерного материала с изменением его физико-химических и электрофизических свойств.