СПОСОБ КАЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ БИОКОРРОЗИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ТОНКОСТЕННЫХ ГЕРМЕТИЧНЫХ ОБОЛОЧЕК ИЗ АЛЮМИНИЕВО-МАГНИЕВЫХ СПЛАВОВ ПРИ ЭКСПЛУАТАЦИИ КОСМИЧЕСКИХ АППАРАТОВ И СУСПЕНЗИЯ СПОРОВЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/18 C12N1/14 

Изобретение относится к технической микробиологии и биокоррозионным испытаниям, а именно к способам определения подверженности алюминиево-магниевых сплавов, применяемых в авиа-космической технике, к воздействиям технофильных штаммов микроорганизмов, выделенных в реальных эксплуатационных условиях с элементов конструкций Российского сегмента (PC) Международной космической станции (МКС) и депонированных во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ).

Космическая станция - зона повышенного риска с экстремальными условиями для работы оборудования. Постоянный контроль всех параметров внутренней среды, в том числе и микрофлоры станции, обеспечивает повышение надежности и безопасности ее работы.

Все материалы в процессе эксплуатации неизбежно подвергаются различным воздействиям окружающей среды, которые вызывают коррозионные процессы на их поверхности. Они могут быть вызваны как воздействием химических веществ (химическая коррозия), так и действием различных микроорганизмов (биологическая коррозия). Реальные коррозионные процессы, как правило, происходят под действием обоих факторов.

Действие микроорганизмов представляет собой один из факторов, способствующих возникновению и развитию процессов коррозии металлов (Албитская О.Н., Шапошникова Н.А. «Влияние плесеней на коррозию металлов» // Микробиология. 1960. Т. 29. С.725-730; Коваль Э.З., Касьян Д.М., Дахановский В.И. «Исследования грибной коррозии» // Биологические повреждения строительных и промышленных материалов. Киев: Наукова думка, 1978, с.59-60; Лугаускас А.Ю., Микульскене А.И., Шляужене Д.Ю. Каталог микромицетов-биодеструкторов полимерных материалов. Отв. ред. М.В.Горленко, М.: Наука, 1987, 340 с.).

В основе действия микроорганизмов на металлы лежит электрохимический механизм. Микроорганизмы могут вызывать или изменять коррозию тремя основными способами:

1. Непосредственно воздействуя на кинетику электродных реакций.

2. Образованием метаболитов, обладающих коррозионными свойствами (неорганические и органические кислоты и т.п.).

3. Изменениями на поверхности раздела металл-электролит, которые могут привести к коррозии (например, образование участков с повышенным образованием оксидов) (Costello J.A., 1969. The corrosion of metals by micro-organisms. Int. Biodent. Bull., 5, 101).

Плесневые грибы развиваются на поверхностях, контактирующих с металлами (ткань, лакокрасочное покрытие, топливо и т.д.), откуда споры гриба распространяются и при конденсации влаги начинают развиваться, образуя органические кислоты.

Коррозии способствует конденсация паров воды мицелием гриба, накопление им в процессе роста органических кислот. Кроме этого, под мицелием грибов создаются условия, благоприятные для развития других микроорганизмов.

Алюминиевые сплавы широко используются в аэрокосмической индустрии, судостроении. При длительном использовании устойчивость и надежность деталей и узлов агрегатов в значительной мере зависит от процессов коррозии, в том числе и от коррозии, вызванной микроорганизмами, - биокоррозии. В основе действия микроорганизмов на металлы лежит элекрохимический механизм. Микроорганизмы могут способствовать возникновению коррозионных повреждений и усиливать их, непосредственно воздействуя на кинетику электродных реакций.

Известен способ определения показателей биокоррозионного повреждения сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов (патент RU №1766073, 1995 г., МПК⁶: C12Q 1/02, C12Q 1/18), характеризующийся тем, что подготовленные образцы металлов высушивают в сушильном шкафу при температуре 80°С в течение 15 минут, взвешивают, заворачивают в крафт-бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу в течение 2 часов при температуре 165°С, затем выдерживают образцы на поверхности газона тест-культуры, выращенной на питательной среде сусло-агар в чашке Петри. На поверхность питательной среды сусло-агар в чашке Петри помещают одну бактериологическую петлю спор гриба Aspergillus flavus Link BKMF-3190 Д и растирают равномерно шпателем по всей поверхности питательной среды, чашки Петри заворачивают в бумагу и термостатируют при температуре 30°С. После термостатирования, когда на поверхности среды образуется сплошной рост гриба, на его поверхности стерильным пинцетом располагают простерилизованные образцы разных металлов. Количество испытанных образцов каждого металла должно быть не менее 5 шт. Контролем служат те же образцы металлов, но размещенные на поверхности стерильной питательной среды в чашках Петри, не засеянной тест-культурой. Подготовленные к испытаниям чашки Петри с металлическими образцами помещают в эксикатор, на дно которого наливают стерильную дистиллированную воду, за счет чего в эксикаторе поддерживают влажность 96-98%. Эксикаторы располагают в термостатной комнате при температуре (30±2)°С. Продолжительность экспозиции опытных и контрольных образцов 9 месяцев. После окончания испытаний чашки Петри с металлическими образцами подвергают стерилизации в автоклаве ВК-75 при давлении 2 атм и температуре 120°С 2 ч. После стерилизации металлические образцы очищают от мицелия, питательной среды и продуктов коррозии с помощью скальпеля. Продукты коррозии алюминиевых сплавов удаляют в растворе состава: хрома (VI) окись 20 г/дм³; кислота ортофосфорная (пл. 1,59) 50 см³/дм³; температура 80-95°С.

При удалении продуктов коррозии образцы пинцетом в вертикальном положении опускают в раствор и выдерживают 1 мин. Затем образцы вынимают из раствора, промывают сначала в воде, затем в ацетоне, просушивают и взвешивают.

Потерю массы образцов определяют по формуле

$$K\begin{array}{c}\frac{{\displaystyle \sum _1^5\Delta m}}{{\displaystyle \sum _1^5{m}_o}}•100\%\\ \end{array}$$

где Δ_m - потеря массы испытуемого образца;

Δ_m, m_o, m, где m_o - масса образца до испытаний, г;

m - масса образца после испытаний и удаления продуктов коррозии, г.

Недостатком способа-прототипа является невозможность оценить начальные этапы биокоррозионного повреждения из-за низкой чувствительности предложенного метода. Поэтому стандартно используемое для оценки степени коррозии взвешивание образцов, как в прототипе, не дает четких результатов на начальных этапах процесса биокоррозии, когда потери веса незначительны. Кроме того, при взвешивании нельзя судить о характере повреждений, вызываемых используемыми микроорганизмами.

Известен шгамм Penicillium chrysogenum BKMF-3068D, используемый в качестве тест-культуры для испытаний алюминиевых сплавов на грибостойкость (авторское свидетельство SU №1606530, 15.11.1990, МПК⁵: C12N 1/14, C12Q 1/02).

Известен штамм гриба Aspergillus flavus Link как тест-культура для определения грибостойскости сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов (патент RU №1766073, 1995 г., МПК⁶: C12Q 1/02, C12Q 1/18), взятый за прототип.

Недостатками этих штаммов является их низкая активность по отношению к алюминиево-магниевым сплавам, используемым в гермозамкнутых объемах, особенностью которых является присутствие в них вредных микропримесей (ВМП), которые являются специфической питательной средой, формирующей биологическую агрессивность (органические соединения с высокой биокоррозионной активностью) в отношении различных материалов и в том числе алюминиево-магниевых сплавов.

Использование грибов из коллекции ВКМ в соответствии с ГОСТом 9.048-89, как правило, не дает ожидаемых результатов, так как культуры грибов при хранении и многочисленных пересевах теряют активность. Использование метода частоты встречаемости видов для оценки биоповреждения материалов более показательно, чем традиционный метод оценки в баллах. Грибы, рекомендуемые ГОСТом 9.048-89 для испытания на грибостойкость, не соответствуют фактической пораженности материалов. Поэтому целесообразнее пользоваться тем набором грибов, которые имеют достаточно большую частоту встречаемости непосредственно на используемом материале (Журнал «Микология и фитопатология», том 31, выпуск 2, г.Санкт-Петербург, 1997 г., с.85).

Таким образом, известные коллекционные штаммы микроорганизмов не могут быть использованы для качественной оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов.

Задачей изобретения является качественная оценка начальных этапов биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов толщиной не более 2 мм с различным видом обработки поверхности (механически обработанной, химически полированной, анодированной), смоделированных в зависимости от эксплуатационных условий (от места нахождения материала в эксплуатационном гермообъеме), и выделение консорциума штаммов микроорганизмов, естественно сформированного в зависимости от конкретного местоположения элементов конструкции в условиях гермозамкнутого объема.

Техническим результатом изобретения является:

- обнаружение инициации процесса биокоррозии, определение биокоррозионных эффектов (оценка внешнего вида пораженной поверхности - определение типа коррозии, распределения коррозионного поражения и характеристика его формы, отличия от химической коррозии; зависимость биокоррозионного процесса от времени);

- возможность увеличения надежности и ресурса эксплуатации конструкционных материалов в присутствии технофильных микроорганизмов в эксплуатационных условиях гермозамкнутого объема.

Заявленная суспензия споровых материалов, включающая смесь споровых материалов отдельных культур грибов Paecilomyces variotii Bainier ВКМ F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4034D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D, является перспективным тестом при проверке авиационно-конструкторских материалов на биокоррозионную стойкость.

Технический результат достигается тем, что способ качественной оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов при эксплуатации космических аппаратов характеризуется тем, что изготавливают испытательные и контрольные образцы из алюминиево-магниевых сплавов, подготовленные образцы высушивают, стерилизуют, для выращивания спор культуры грибов засевают в пробирки со скошенной агаризованной средой Чапека-Докса, термостатируют пробирки при температуре (29±2)°С в течение 14-28 суток до появления зрелого спороношения, готовят суспензию спорового материала, которую наносят на простерилизованные испытательные образцы, затем их высушивают и помещают по одному образцу в чашки Петри на поверхность агаризованной среды Чапека-Докса, контрольные образцы, не обработанные споровым материалом, также располагают на поверхности агаризованной среды Чапека-Докса в чашках Петри, чашки Петри с испытательными и контрольными образцами помещают в разные эксикаторы, на дно которых наливают воду для поддержания влажности более 90%, эксикаторы закрывают и выдерживают в термостате при температуре (29±2)°С, проводят экспозицию испытательных и контрольных образцов, затем образцы извлекают из чашек Петри, удаляют продукты коррозии и мицелий с поверхности образцов, промывая их в проточной воде, определяют показатели биокоррозионных поражений, на среде Чапека-Докса готовят суспензии споровых материалов отдельных культур грибов - штаммов микроорганизмов Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4034D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D, которые затем смешивают в равных соотношениях, причем концентрация спор каждого вида гриба в суспензии должна быть в пределах 1-2 млн/см³, полученную суспензию с помощью распылителя наносят на испытательные образцы алюминиево-магниевых сплавов с различным видом обработки поверхности - механически обработанной, химически полированной, анодированной, после промывания образцов в проточной воде их выдерживают в 70%-ном этиловом спирте в течение 30 минут, после этого промывают детергентом и высушивают, затем с помощью сканирующего электронного микроскопа проводят качественную оценку биокоррозионных поражений: по изменению внешнего вида поверхности образцов оценивают начальные этапы биокоррозии и ее тип, распределение коррозионного поражения на поверхности образцов, а также определяют зависимость биокоррозионного процесса от времени, при этом экспозицию испытательных и контрольных образцов проводят в течение 40, 120 и 180 суток.

Технический результат достигается с помощью суспензии споровых материалов, включающей смесь споровых материалов отдельных культур грибов Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4034D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D в равных соотношениях, для оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов при эксплуатации космических аппаратов.

Штамм микроорганизма Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D.

Свойство микроорганизма. Способность вызывать повреждения конструкционных материалов, используемых в авиа-космической технике (алюминиево-магниевые сплавы, полимерные материалы), происхождение - из гермозамкнутого объема космического аппарата.

Родословная штамма (место выделения, источник выделения и другая информация о движении штамма). Штамм выделен из пыли, собранной воздушным фильтром на Российском Сегменте Международной Космической Станции (PC MKC) в период работы станции МКС-9, 24 октября 2004 г.

Способ получения штамма. Посев проводили на твердую питательную среду методом отпечатка фрагмента фильтра.

Метод идентификации, определитель, по которому проводилась идентификация. Идентификация по морфологическим признакам. Определитель: Samson R.A.: Paecilomyces and some allied Hyphomycetes. // Studies in Mycology. 1974. No. 6. 119 pp.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма. Колонии на среде сусло-агар (malt-agar) растут очень быстро и достигают диаметра 8 см за 7 дней при температуре 25°С. Бархатисто паутинистые плоские, иногда пушистые и тогда довольно высокие войлочные, сильно порошащие. Состоят из плотного слоя конидиеносных структур. Мицелий бесцветный. Спороношение от темно-охряного до оливково-бежево-коричневатого цвета. Экссудат отсутствует или незаметен. Реверс колонии желтоватый до желто-коричневого и практически черного, при обильном образовании хламидоспор. Конидиеносцы гладкие, слегка шероховатые или с инкрустацией, несут довольно плотную кисточку, состоящую из неупорядоченных веточек, несущих метула с 2-7 фиалидами. В основном 35-90×3.5-7.0 µm, но иногда до 150 µm в длину. Фиалиды в пучках или одиночные, вариабельные по форме и размеру, 12-20(35)×2.5-5.0 µm, имеют цилиндрическое брюшко и длинную тонкую шейку. Конидии полушаровидные, булавовидные, эллиптические, гладкостенные, 3.2-15.0×2.0-5.0 µm. Хламидоспоры обычно присутствуют одиночные или в коротких цепочках, округлые, толстостенные, темноокрашенные, гладкие или слегка шероховатые 4.0-8.0 (10) µm в диаметре.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма (состав среды, температура, срок выращивания и т.д.). Условия культивирования штамма особенностей не имеют и стандартные для большинства мицелиальных грибов.

Среды:

- среда Чапека с 3%-ным содержанием сахарозы (сахароза - 30 г; NaNO₃ - 2 г; KH₂PO₄ - 1 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄ 7Н₂О - 0,5 г; FeSO₄ 7H₂O - 0,001 г; агар - 20 г; водопроводная вода - 1 литр);

- сусло-агар (16 - баллинговое неохмеленное пивное сусло - 150 мл; агар - 20 г; водопроводная вода - 800 мл); температура 22-25°С; срок выращивания 7-10 дней.

Оптимум рН среды культивирования: 6-6,5.

Описание режима хранения штамма (среды, условия, предельный срок и т.д). Для хранения подходят все методы. Штамм сохранялся методом периодических пересевов на среде сусло-агар.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Штамм микроорганизма Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D.

Свойство микроорганизма. Способность вызывать повреждения конструкционных материалов, используемых в авиа-космической технике (алюминиево-магниевые сплавы, полимерные материалы), и происхождение - из гермозамкнутого объема космического аппарата.

Родословная штамма (место выделения, источник выделения и другая информация о движении штамма). Штамм выделен из пыли, собранной воздушным фильтром на Российском Сегменте Международной Космической Станции (PC MKC) в период работы станции МКС-8, 30 апреля 2004 г.

Способ получения штамма. Посев проводили на твердую питательную среду методом отпечатка фрагмента фильтра.

Метод идентификации, определитель, по которому проводилась идентификация. Идентификация по морфологическим признакам. Определитель: Ellis M.В. More Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycologigical institute Kew., Kew: Surrey, 1976. Simmons E.G. Typification of Altemaria, Stemphylium and Ulocladium // Mycologia. 1967. Vol.59. P.67-92.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма. Колонии на картофельно-декстрозном и сусло-агаре быстрорастущие, достигают 5-6 см в диаметре за 7 дней. Бархатистые, слегка порошащие, мучнистые, могут быть слегка пушистыми. Оливково-коричневого до черного цвета. На среде Чапека колонии более ограниченные. Конидиеносцы прямостоячие или распростертые, короткие, сильно ветвящиеся, коленчато-изогнутые, с конидиями, образующимися в узлах. Окраска от практически неокрашенных до коричневых, конидиальный рубец, остающийся вокруг поры бесцветный. Размеры конидиеносцев до 50×4.5 µm. Конидии муральные (многоклеточные с продольными и поперечными септами) образуются одиночно, очень редко в коротких цепочках, яйцевидной формы без носика, вначале светло-коричневые, оливковые, быстро темнеющие до практически черных, поверхность грубо бородавчатая до бугорчатой. Размеры варьируют в пределах 19-25×7-12 µm, с (1-)2-3 поперечными и 0-2 косыми или продольными септами. Вторичные конидиеносцы образуются крайне редко.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма (состав среды, температура, срок выращивания и т.д.). Условия культивирования штамма особенностей не имеют и стандартные для большинства мицелиальных грибов.

Среды:

- среда Чапека с 3% содержанием сахарозы (сахароза - 30 г; NaNO₃ - 2 г; KH₂PO₄ - 1 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄ 7H₂O - 0,5 г; FeSO₄ 7Н₂О - 0,001 г; агар - 20 г; водопроводная вода - 1 литр);

- сусло-агар (16-баллинговое не охмеленное пивное сусло - 150 мл; агар - 20 г; водопроводная вода - 800 мл); температура 22-25°С; срок выращивания 7-10 дней.

Оптимум рН среды культивирования: 6-6,5.

Описание режима хранения штамма (среды, условия, предельный срок и т.д.). Для хранения подходят все методы. Штамм сохранялся методом периодических пересевов на среде сусло-агар.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Штамм микроорганизма Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4034D.

Свойство микроорганизма. Способность вызывать повреждения конструкционных материалов, используемых в авиа-космической технике (алюминиево-магниевые сплавы, полимерные материалы), и происхождение - из гермозамкнутого объема космического аппарата.

Родословная штамма (место выделения, источник выделения и другая информация о движении штамма). Штамм выделен из пыли, собранной пылесборником на Российском Сегменте Международной Космической Станции (PC MKC) в период работы станции МКС-9, 24 октября 2004 г.

Способ получения штамма (мутанта). Посев на твердую питательную среду из суспензии пыли.

Метод идентификации, определитель, по которому проводилась идентификация. Идентификация по морфологическим признакам. Определитель: Raper K.B., Thom С.A Manual of the Penicillia. New York: Heftier Publishing Co. 1968. 875 p. Ramirez C. Manual and Atlas of the Penicillia. Amsterdam; New York; Oxford: Elsiveier Biomedical Press, 1982. 874 p. Pitt G.I. A laboratory guide to common Penicillium species (sec. ed.). North Ryde, U.S.W., Australia: CSIRO, Division of Food Processing, 1991. 188 p.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма. Колонии быстрорастущие на среде Чапека с 3% содержанием сахарозы, на 7 сутки роста, при температуре 25°С, достигают 35-50 мм в диаметре. Поверхность бархатистая, колония радиально складчатая, тускло-зеленая, массы конидий формируют характерные корочки, экссудат обычно образуется, мицелий бесцветный. Обратная сторона неокрашенная, кремовая или желто-коричневая. На сусло-агаре колонии более быстрорастущие, бархатистые. Конидиеносцы агрегированы в плотные пучки на субстратном мицелии, грубо шероховатые, 200-400 µm в длину. Кисточки обычно трехъярусные с прижатой веточкой, компактные, метулы по 3-5 в мутовке 10-15×3-3,5 µm, несут по 5-8 бутылевидных фиалид 9-12×2.5-3 µm. Конидии практически шаровидные 3.5-4.0 µm.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма (состав среды, температура, срок выращивания и т.д.). Условия культивирования штамма особенностей не имеют и стандартные для большинства мицелиальных грибов.

Среды:

- среда Чапека с 3% содержанием сахарозы (сахароза - 30 г; NaNO₃ - 2 г; KH₂PO₄ - 1 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄ 7Н₂О - 0,5 г; FeSO₄ 7H₂O - 0,001 г; агар - 20 г; водопроводная вода - 1 литр);

- сусло-агар (16-баллинговое не охмеленное пивное сусло - 150 мл; агар - 20 г; водопроводная вода - 800 мл); температура 22-25°С; срок выращивания 7-10 дней.

Оптимум рН среды культивирования: 6-6,5.

Описание режима хранения штамма (среды, условия, предельный срок и т.д.). Для хранения подходят все методы. Штамм сохранялся методом периодических пересевов на среде сусло-агар.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Штамм микроорганизма Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKMF-4037D.

Свойство микроорганизма. Способность вызывать повреждения конструкционных материалов, используемых в авиа-космической технике (алюминиево-магниевые сплавы, полимерные материалы), и происхождение - из гермозамкнутого объема космического аппарата.

Родословная штамма (место выделения, источник выделения и другая информация о движении штамма). Штамм выделен из пыли, собранной пылесборником на Российском Сегменте Международной Космической Станции (PC MKC) в период работы станции МКС-9, 24 октября 2004 г.

Способ получения штамма (мутанта). Посев на твердую питательную среду из суспензии пыли.

Метод идентификации, определитель, по которому проводилась идентификация. Идентификация по морфологическим признакам. Определитель: Raper K.B., Fennel D.I. The genus Aspergillus. Baltimore: Williams & Wilkins, 1965. 686 p. Klich M.A. Identification of common Aspergillus species. CBS 2002. 116 р.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма. Колонии на среде Чапека при 25°С растут хорошо, достигая 3-4 см в диаметре за 10 дней, складчатые, в центре приподнятые. Структура колонии плотная бархатистая, мицелий белый, цвет спороношения сине-зеленый, экссудат обычно обильный, соломенно-желтый до темно-красно-коричневого. Обратная сторона колонии от бесцветной до коралово-розовой, темно-бордовой или красновато-черной при старении. На среде сусло-агар колонии более быстрорастущие плоские бархатистые. Конидиальные головки радиальные до 100-150 µm в диаметре. Конидиеносцы бесцветные, толстостенные, гладкие, до 500 µm в длину. От воздушного мицелия отходят короткие конидиеносцы с частично редуцированными конидиогенными структурами. Пузырь округлый до 20 µm в диаметре. Головки двурядные, метулы 6-7×2-3 µm, фиалиды 7-10 х 2-2.5 µm. Конидии сферические, заметно шиповатые, 2.5-3(3.5) µm. Иногда образуются стекловидные клетки округлой формы.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма (состав среды, температура, срок выращивания и т.д.). Условия культивирования штамма особенностей не имеют и стандартные для большинства мицелиальных грибов.

Среды:

- среда Чапека с 3% содержанием сахарозы (сахароза - 30 г; NaNO₃ - 2 г; KH₂PO₄ - 1 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄ 7H₂O - 0,5 г; FeSO₄ 7H₂O - 0,001 г; агар - 20 г; водопроводная вода - 1 литр);

- сусло-агар (16-баллинговое не охмеленное пивное сусло - 150 мл; агар - 20 г; водопроводная вода - 800 мл); температура 22-25°С; срок выращивания 7-10 дней.

Оптимум рН среды культивирования: 6-6,5.

Описание режима хранения штамма (среды, условия, предельный срок и т.д). Для хранения подходят все методы. Штамм сохранялся методом периодических пересевов на среде сусло-агар.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Штамм микроорганизма Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D.

Свойство микроорганизма. Способность вызывать повреждения конструкционных материалов, используемых в авиа-космической технике (алюминиево-магниевые сплавы, полимерные материалы), и происхождение - из гермозамкнутого объема космического аппарата.

Родословная штамма (место выделения, источник выделения и другая информация о движении штамма). Штамм выделен из пыли, собранной пылесборником на Российском Сегменте Международной Космической Станции (PC MKC) в период работы станции МКС-11, 15 октября 2005 г.

Способ получения штамма (мутанта). Посев на твердую питательную среду из суспензии пыли.

Метод идентификации, определитель, по которому проводилась идентификация. Определитель: Ellis М.В. Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycologigical institute Kew., Kew: Surrey, 1971. 609 p. Zalar P, Hoog GS de, Schroers H-J, Crous PW, Groenewald JZ, Gunde-Cimerman N (2007). Phylogeny and ecology of the ubiquitous saprobe Cladosporium sphaerospermum, with descriptions of seven new species from hypersaline environments. Studies in Mycology 58:157-183.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма. Колонии на картофельно-декстрозном агаре при 25°С на 7 сутки достигают 21-44 мм в диаметре. Бархатистые, ровные или складчатые, темно-оливково-коричнево-черные. Экссудат не образуется, реверс коричнево-черный. Мицелий плотный темноокрашенный, воздушный мицелий обычно отсутствует. Конидиеносцы слабо ветвящиеся прямостоячие, оливково-коричневые гладкостенные или нежно шероховатые, с несколько расширенной верхушкой с темными рубчиками от конидий, длина сильно варьирует (10-)45-130(-300)×(2.5-)3-4(-6) µm. Конидиальные цепочки древовидно разветвленные. Рамоконидии с 2-3 септами, конидии следующих порядков с 1-0 септами, терминальные конидии яйцевидные или почти сферические, гладкие или нежно бородавчатые, приостренные к обоим концам с заметными рубчиками. Размер терминальных конидий (2.5-)3-4(-7)×(2-)3-3.5(-4.5) µm. Рамоконидии второго порядка цилиндрические (4-)9-17.5(-48.5)×(2-)3-3.5(-8.5) µm.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма (состав среды, температура, срок выращивания и т.д.). Условия культивирования штамма особенностей не имеют и стандартные для большинства мицелиальных грибов.

Среды:

- среда Чапека с 3% содержанием сахарозы (сахароза - 30 г; NaNO₃ - 2 г; КH₂PO₄ - 1 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄ 7H₂O - 0,5 г; FeSO₄ 7H₂O - 0,001 г; агар - 20 г; водопроводная вода - 1 литр);

- сусло-агар (16-баллинговое не охмеленное пивное сусло - 150 мл; агар - 20 г; водопроводная вода - 800 мл); температура 22-25°С; срок выращивания 7-10 дней.

Оптимум рН среды культивирования: 6-6,5.

Описание режима хранения штамма (среды, условия, предельный срок и т.д.). Для хранения подходят все методы. Штамм сохранялся методом периодических пересевов на среде сусло-агар.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Вышеприведенные штаммы микроорганизмов: Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4032D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D депонированы Всероссийской коллекцией микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К.Скрябина (142290 г. Пущино Московской области, проспект Науки, 5).

Сущность изобретения заключается в следующем.

За основу метода проведения испытаний и нанесения суспензии спор грибов на поверхность образцов алюминиево-магниевых сплавов взяты методы, описанные в ГОСТах 9.048-89 и 9.049-91. Испытания по биокоррозионным поражениям проводят в ускоренном режиме, который характеризуется повышенными температурами (29±2)°С и влажностью более 90%, в течение 40, 120, 180 суток, при воздействии этих факторов. Испытания проводят во влажной камере (эксикаторе).

Для испытаний используют две выборки образцов: испытательную и контрольную. Испытательная выборка предназначена для определения интенсивности развития грибов и их действия на параметры изделий, контрольная выборка - для определения действия на параметры изделий повышенной влажности и повышенной температуры воздуха без действия грибов, с целью сопоставления с результатами испытаний с испытательной выборки. Испытательные и контрольные образцы изготавливают из цилиндрических заготовок конструкционного материала - алюминиево-магниевого сплава толщиной 5 мм и диаметром 16 мм (ГОСТ/ТУ - 1-90395-91, плавка партии №89606) с различным видом обработки поверхности: механически обработанной, химически полированной, анодированной.

Подготовленные образцы высушивают и стерилизуют при температуре 165°С в течение 2 часов.

Для выращивания спор культуры грибов - штаммов микроорганизмов Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4034D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D - засевают в пробирки со скошенной агаризованной средой Чапека-Докса, затем термостатируют пробирки при температуре (29±2)°С в течение 14-28 суток до появления зрелого спороношения. Культуры грибов поддерживаются на среде сусло-агар.

Для приготовления суспензии спор используют полученные 14-28-суточные культуры грибов. Суспензию спор готовят отдельно для каждого вида гриба с использованием среды Чапека-Докса. Для этого в пробирку или колбу, содержащую 25 см³ среды Чапека-Докса, переносят споры с поверхности выросшей культуры с помощью петли. В качестве жидкой дисперсионной среды используют воду. Суспензию каждого штамма гриба готовят отдельно: Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4034D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D. Суспензию тщательно встряхивают и отфильтровывают через 4 слоя стерильной марли. Концентрацию спор каждого вида гриба подсчитывают отдельно в камере Горяева или на фотоэлектрическом колориметре. Для определения концентрации спор с помощью фотоэлектрического колориметра используют светофильтр, создающий длину волны λ=400 нм, и кювету (50±0,5) мм. Оптическая плотность, соответствующая концентрации 1-2×10⁶/см³ для Paecilomyces variotii, 0,28-0,55. Плотность суспензий других штаммов оценивают с помощью камеры Горяева, ввиду особенностей спороношения этих видов.

Суспензию спор каждого вида гриба смешивают в равных объемах и используют для заражения образцов металла. Суспензию наносят на стерильные испытательные образцы равномерно с помощью распылителя (например, пульверизатора). Обработанные таким образом образцы выдерживают в ламинарном боксе при температуре 25°С до высыхания. Суспензия наносится с двух сторон, которые последовательно высушиваются в ламинарном боксе. Контрольные образцы обрабатывают стерильными средами и так же, как и испытательные, помещают на поверхность стерильной агаризованной среды Чапека-Докса в чашки Петри, которые затем ставят в эксикаторы.

Затем образцы зараженного металла (испытательные образцы) помещают в центр чашки Петри (по одному образцу на чашку), предварительно залитой агаризованной средой Чапека-Докса. Чашки Петри с испытательными и контрольными образцами помещают в разные эксикаторы, на дно которых налита вода для создания 90%-ной влажности, и выдерживают при температуре (29±2)°С для наблюдения за начальными этапами биокоррозионного повреждения. Каждые 7 суток эксикаторы приоткрывают на 3 минуты для доступа воздуха. Сроки инкубации 40, 120 и 180 суток.

После окончания сроков инкубации образцы извлекают из чашек Петри, а образовавшийся мицелий и продукты коррозии удаляют с поверхности образцов (в соответствии со стандартом ИСО 8407) путем легкой механической очистки при помощи мягкой щетки с последующим интенсивным промыванием в проточной воде. Затем образцы выдерживают в 70%-ном этиловом спирте в течение 30 минут, после чего промывают детергентом (например, «Fairy Plus», Procter & Gamble) и снова проточной водопроводной водой с последующей промывкой в дистиллированной воде. После этого образцы высушивают в боксе. Контрольные образцы подвергают точно такой же обработке. Эксперименты проводят в трехкратной повторности.

Испытательные и контрольные образцы хранят в стерильных чашках Петри до исследования в сканирующем электронном микроскопе.

В результате проведенных экспериментов наблюдалось полное обрастание образцов мицелием в присутствии минеральной среды с сахарозой, являющейся источником углерода для роста грибов и способствующей образованию кислых продуктов их жизнедеятельности. Таким образом, создается возможность исследования направления и характера повреждения алюминиево-магниевых сплавов при воздействии такого фактора, как обрастание, которое может возникнуть в условиях нарушений температурно-влажностного режима (повышения температуры и влажности) в системе жизнеобеспечения в гермозамкнутых объемах.

Высушенные образцы исследуют с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), используемого для наблюдения микрорельефа различных поверхностей.

Микроскопическое исследование образцов было проведено на сканирующем электронном микроскопе САМ SCAN фирмы CAMBRIG (ускоряющее напряжение 20 киловольт, режим регистрации - secondary electron image). Образцы сплава, на которых не могло остаться остатков органических соединений, помещали в микроскоп без предварительной обработки, а на образцы с остатками микроорганизмов предварительно напыляли сплав золота и палладия методом ионного распыления металла в атмосфере аргона (толщина слоя 25 нанометров).

Сущность изобретения поясняется таблицами.

В таблицах 1, 5, 9 «Анодированная поверхность образцов» представлены сделанные с помощью сканирующего электронного микроскопа фотографии с различной степенью увеличения фрагментов анодированных поверхностей испытательных образцов: с биокоррозионным повреждением, с химической коррозией и контрольных образцов с экспозицией 40 суток (таблица 1), 120 суток (таблица 5) и 180 суток (таблица 9).

В таблицах 2, 6, 8 «Химически полированная поверхность образцов» представлены фотографии с различной степенью увеличения фрагментов химически полированных поверхностей испытательных образцов: с биокоррозионным повреждением, с химической коррозией и контрольных образцов с экспозицией 40 суток (таблица 2), 120 суток (таблица 6) и 180 суток (таблица 8).

В таблицах 3, 4, 7 «Поверхность образцов после механической обработки (экспозиция 40 суток)» представлены фотографии с различной степенью увеличения фрагментов поверхностей испытательных образцов после механической обработки: с биокоррозионным повреждением, с химической коррозией и контрольных образцов с экспозицией 40 суток (таблица 3), 120 суток (таблица 4) и 180 суток (таблица 7).

В результате проведенных испытаний показано, что на поверхности алюминиево-магниевого сплава в результате биологической коррозии происходят заметные изменения поверхности, нарастающие с увеличением срока воздействия консорциума микроорганизмов.

Оценку биокоррозии образцов: определение типа биокоррозии, а также распределение коррозионного поражения на поверхности образцов, проводят согласно ГОСТу 9.908-85.

Так, на анодированной поверхности испытательного образца видны пятна овальной формы, трещинки, крупные и мелкие углубления (таблица 1); заметны глубокие трещины и отслаивающаяся корка (таблица 5); пятна, рыхлая корка (таблица 9); поверхность контрольного образца: покрыта мелкими порами, равномерно распределенными по всей поверхности образца (таблица 1), стала чешуйчатой (таблица 5), покрыта сетью трещинок (таблица 9).

На химически полированной поверхности испытательного образца видны: тонкая растрескивающаяся, частично отслаивающаяся корка и небольшие изъязвления овальной формы (таблица 2); толстая растрескивающаяся корка и следы мицелия консорциума (таблица 6); вытянутые и слипшиеся хлопья (таблица 8); на контрольном образце видны: поверхностные изъязвления (таблица 2), крупные и мелкие углубления (таблица 6) и округлые плоские пятна (таблица 8).

На поверхности испытательного образца после механической обработки видны подповерхностные язвы округлой формы (таблица 3); образовалась растрескивающаяся корка, местами переходящая в зернистую, следы исходного рельефа поверхности видны с трудом (таблица 4), на поверхности видны округлые чешуйки (таблица 7); на контрольном образце видны дефекты в виде борозд (таблица 3), заметны нарушения рельефа поверхности (таблица 4), поверхность покрыта растрескивающейся коркой (таблица 7).

При исследовании испытательных образцов алюминиево-магниевого сплава, подвергшихся более длительным испытаниям (180 суток) на биологическую коррозию, выявлены заметные изменения поверхности по сравнению с контрольными образцами.

При сопоставлении внешнего вида образцов металла, подвергшихся биокоррозии, заметно, что наибольшие изменения претерпели поверхности образцов после механической обработки.

Сравнение поражения биологической и химической коррозии позволило заключить, что эти процессы различны по внешним проявлениям. Химическая коррозия не вызывает глубоких изменений алюминиево-магниевого сплава. Процессы биокоррозии имеют свои особенности, а именно, повышенную неоднородность воздействия на поверхность металла и его глубокое подповерхностное поражение продуктами метаболизма грибов. Коррозионное распределение поражения по поверхности испытательных образцов происходит неравномерно.

Таким образом, биокоррозионные повреждения имеют сложную структуру и не могут быть отнесены к какому-нибудь одному типу коррозии, а также представляют собой сочетание нескольких типов коррозионного повреждения: местная коррозия и коррозия пятнами, характеризующаяся мелкими коррозионными поражениями неправильной формы (преимущественно, для анодированной поверхности испытательных образцов), межкристаллитная коррозия, характеризующаяся наличием прокорродировавшей зоны вдоль границ зерен металла, затрагивая границы всех зерен или только отдельных зерен (преимущественно, для химически полированной поверхности испытательных образцов), подповерхностная коррозия, характеризующаяся тем, что коррозионное поражение занимает на поверхности небольшую площадь и преимущественно сосредоточена под поверхностью металла (преимущественно, для поверхности испытательных образцов после механической обработки).

Группа изобретений относится к микробиологии. Предложены способ качественной оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов при эксплуатации космических аппаратов и суспензия споровых материалов грибов для осуществления указанного способа. Изготавливают испытательные и контрольные образцы из алюминиево-магниевых сплавов. Подготовленные образцы высушивают, стерилизуют. Культуры грибов - штаммов микроорганизмов Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4034D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D засевают для выращивания спор в пробирки со скошенной агаризованной средой Чапека-Докса. Термостатируют пробирки при температуре (29±2)°С в течение 14-28 суток до появления зрелого спороношения. Готовят суспензии споровых материалов отдельных культур указанных грибов, которые затем смешивают в равных соотношениях, причем концентрация спор каждого вида гриба в суспензии должна быть в пределах 1-2 млн/см³. Полученную суспензию наносят на простерилизованные испытательные образцы. Затем их высушивают и помещают по одному образцу в чашки Петри на поверхность агаризованной среды Чапека-Докса. Контрольные образцы, не обработанные споровым материалом, также располагают на поверхности агаризованной среды Чапека-Докса в чашках Петри. Чашки Петри с испытательными и контрольными образцами помещают в разные эксикаторы, на дно которых наливают воду для поддержания влажности более 90%. Эксикаторы закрывают и выдерживают в термостате при температуре (29±2)°С. Проводят экспозицию испытательных и контрольных образцов в течение 40, 120 и 180 суток. Затем образцы извлекают из чашек Петри, удаляют продукты коррозии и мицелий с поверхности образцов, промывая их в проточной воде. Выдерживают образцы в 70%-ном этиловом спирте в течение 30 минут, после этого промывают детергентом и высушивают. Затем с помощью сканирующего электронного микроскопа проводят качественную оценку биокоррозионных поражений. По изменению внешнего вида поверхности образцов оценивают начальные этапы биокоррозии и ее тип, распределение коррозионного поражения на поверхности образцов, а также определяют зависимость биокоррозионного процесса от времени. Изобретения позволяют осуществлять качественную оценку начальных этапов биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов толщиной не более 2 мм. 2 н.п. ф-лы, 9 табл.

1. Способ качественной оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов при эксплуатации космических аппаратов, характеризующийся тем, что изготавливают испытательные и контрольные образцы из алюминиево-магниевых сплавов, подготовленные образцы высушивают, стерилизуют, для выращивания спор культуры грибов засевают в пробирки со скошенной агаризованной средой Чапека-Докса, термостатируют пробирки при температуре (29±2)°С в течение 14-28 суток до появления зрелого спороношения, готовят суспензию спорового материала, которую наносят на простерилизованные испытательные образцы, затем их высушивают и помещают по одному образцу в чашки Петри на поверхность агаризованной среды Чапека-Докса, контрольные образцы, не обработанные споровым материалом, также располагают на поверхности агаризованной среды Чапека-Докса в чашках Петри, чашки Петри с испытательными и контрольными образцами помещают в разные эксикаторы, на дно которых наливают воду для поддержания влажности более 90%, эксикаторы закрывают и выдерживают в термостате при температуре (29±2)°С, проводят экспозицию испытательных и контрольных образцов, затем образцы извлекают из чашек Петри, удаляют продукты коррозии и мицелий с поверхности образцов, промывая их в проточной воде, определяют показатели биокоррозионных поражений, отличающийся тем, что на среде Чапека-Докса готовят суспензии споровых материалов отдельных культур грибов - штаммов микроорганизмов Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thorn BKM F-4034D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D, которые затем смешивают в равных соотношениях, причем концентрация спор каждого вида гриба в суспензии должна быть в пределах 1-2 млн/см³, полученную суспензию с помощью распылителя наносят на испытательные образцы алюминиево-магниевых сплавов с различным видом обработки поверхности - механически обработанной, химически полированной, анодированной, после промывания образцов в проточной воде их выдерживают в 70%-ном этиловом спирте в течение 30 мин, после этого промывают детергентом и высушивают, затем с помощью сканирующего электронного микроскопа проводят качественную оценку биокоррозионных поражений: по изменению внешнего вида поверхности образцов оценивают начальные этапы биокоррозии и ее тип, распределение коррозионного поражения на поверхности образцов, а также определяют зависимость биокоррозионного процесса от времени, при этом экспозицию испытательных и контрольных образцов проводят в течение 40, 120 и 180 суток.

2. Суспензия споровых материалов, включающая смесь споровых материалов отдельных культур грибов Paecilomyces variotii Bainier BKM F-4039D, Ulocladiurn botrytis Preuss BKM F-4032D, Penicillium chrysogenum Thorn BKM F-4034D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D в равных соотношениях, для оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов при эксплуатации космических аппаратов.