ШТАММ STREPTOMYCES FLAVOGRISEUS - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, СОДЕРЖАЩЕГО ГЕКСАЕНОВЫЙ АНТИБИОТИК ПОДГРУППЫ МЕДИОЦИДИНА И НЕПОЛИЕНОВЫЙ АНТИБИОТИК ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A01N63/02 A01P1/00 C12R1/465 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения препаратов, подавляющих рост микроорганизмов, применяемых для защиты органических и неорганических материалов от биоповреждений в сельском хозяйстве, пищевой, микробиологической и текстильной промышленности.

Известен штамм Streptomyces olivaceoviridis шт. 30 [И.Л. Кузикова, В.И. Сухаревич, Ю.Д. Шенин, Н.Г. Медведева / Известия РАН. Сер. биологическая, 2010, №2, с. 238-247], выбранный в качестве ближайшего аналога. Указанный штамм является продуцентом антибиотического комплекса, содержащего два основных компонента полиеновой и неполиеновой структуры, что обеспечивает широкий спектр его действия.

Недостатками указанного штамма являются нестабильность популяции, недостаточно высокий выход целевого продукта, а также недостаточная эффективность продуцируемого им антибиотического комплекса в отношении грибов и невысокое содержание в нем гексаеновой составляющей (1-3,5%).

Задачей заявляемого изобретения является создание нового более эффективного штамма - продуцента антибиотического комплекса.

Сущность изобретения заключается в создании штамма Streptomyces flavogriseus, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номером АС-1947 - продуцента антибиотического комплекса, содержащего гексаеновый антибиотик подгруппы медиоцидина и неполиеновый антибиотик гетероциклической структуры.

Родовое и видовое название культуры - Streptomyces flavogriseus

Номер или наименование штамма - №30

Способ получения штамма - выделен из окультуренной почвы в лаборатории биологических методов экологической безопасности НИЦЭБ РАН.

Где идентифицирована культура - Культура идентифицирована в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика (договор №635/12 от 19 декабря 2012 г.). По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм наиболее близок к виду Streptomyces flavogriseus (99%).

Культурально-морфологические особенности штамма - на минеральном агаре №1 изолят образует обильно-разветвленный воздушный мицелий (диаметр гиф 0.5-2.0 мкм). На воздушном мицелии образуются спороносцы со спорами. Спороносцы имеют спиральную форму с числом завитков от 4 до 6. Споры слегка продолговатые с гладкой поверхностью. Склероции и спорангиум не выявлены. Окраска воздушного мицелия в зависимости от состава диагностических сред варьирует от голубовато-серой до темно-серой, а субстратного от оливковой до темно-табачной. На агаризованной среде Чапека с крахмалом изолят образует округлые, выпуклые колонии диаметром от 0.5 до 0.8 см, голубовато-серого или темно-серого цвета. Изолят не образует меланоидные и растворимые пигменты.

Область применения штамма - может быть использован в сельском хозяйстве, в пищевой промышленности, для профилактики и защиты от биоповреждений промышленных материалов.

Продукт, синтезируемый штаммом - антибиотический комплекс, содержащий гексаеновый антибиотик подгруппы медиоцидина и неполиеновый антибиотик гетероциклической структуры.

Способ определения активности штамма с указанием метода - спектрофотометрический метод.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма - на агаризованной среде Чапека с 2% крахмала, pH 7.2-7.4, при +4°C, под вазелиновым маслом и лиофилизация в ампулах.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма - агаризованная среда Чапека с 2% крахмала, pH 7.2-7.4, оптимальная температура культивирования - +28°C, в течение 10 суток.

Оптимальные условия и состав среды для ферментации: (г/л) крахмал - 15,0; глюкоза - 25,0; дрожжевой экстракт - 10,0; глицерин - 3,0; пептон - 2,0; натрия хлорид - 5,0; кальция карбонат - 2,0, pH 6,8-7,0. Ферментацию осуществляли в колбах вместимостью 250 мл на качалке со скоростью вращения 230 об/мин и при t +28°C. Объем питательной среды в колбе - 50 мл. Продолжительность ферментации - 120 часов.

Сведения о безопасности использования штамма - штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик, штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным и не представляет опасность по каким либо другим причинам.

Выделенный штамм продуцирует антибиотический комплекс, содержащий полиеновый компонент - гексаен (подгруппы медиоцидина) с максимумами поглощения при 340, 358 и 379 нм, отличающийся новизной по сравнению с известными гексаеновыми антибиотиками - медиоцидином, гексафунгином, эндомицином, гексином - 80, гексаеном - 85 (Ciftci Т., Borkman Т.А., McDaniel L.E., Schaffner С.Р. Comparative analysis of hexaene antibiotics // J. Antibiotics. 1984. V. 37. №8. P. 876-884)) и неполиеновый компонент с максимумами поглощения от 190 до 230 нм (фиг. 1).

Получаемый антибиотический комплекс (АБК) для использования предварительно растворяют в спирте, а затем спиртовый раствор разводят водой до заданной концентрации.

Определение спектра антимикробного действия антибиотического комплекса показало (табл. 3), что антибиотическая активность спиртовых (этанольных) экстрактов биомассы проявляется в отношении всех используемых грибов-деструкторов промышленных материалов, а также фитопатогенных грибов, дрожжей, грамположительных бактерий, что позволяет считать спектр его противомикробного действия достаточно широким.

Сопоставление свойств заявляемого штамма и ближайшего аналога приведено в таблице 1.

Полученный в результате культивирования препарат с повышенным содержанием гексаена обладает более выраженными фунгицидными свойствами по сравнению с аналогом. Сопоставление проводили определением минимальных фунгицидных концентраций антибиотических комплексов в жидкой среде Мюллер-Хинтона методом последовательных разведений. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Как показали проведенные исследования, полученный препарат обладает широким спектром биоцидного действия (таблица 3).

Исходя из вышеизложенного, новый антибиотический комплекс может быть использован для профилактики и защиты от биоповреждений промышленных материалов, а также в сельском хозяйстве для защиты от фитопатогенов. Применение препарата осуществляется, как правило, в смеси со вспомогательными веществами - водно-спиртовым раствором - для пропитки защищаемого материала или орошения раствором, содержащим антибиотический комплекс (АБК) или иными биоцидными добавками, повышающими его эффективность, например хлоргексидин биглюконатом (ХГБ).

Таким образом, техническим результатом заявляемого изобретения является создание штамма - продуцента антибиотического комплекса, обеспечивающего высокую антибиотическую активность в отношении широкого спектра культур микроорганизмов.

Изобретение характеризуется следующими иллюстрирующими материалами.

На фиг. 1 показан УФ-спектр поглощения этанольного экстракта из биомассы Streptomyces flavogriseus шт. 30.

На фиг. 2 показано влияние антибиотического комплекса на всхожесть зерен пшеницы, зараженных фитопатогенным грибом Fusarium oxysporum.

На фиг. 3 показано влияние антибиотического комплекса на длину проростков пшеницы, а на фиг. 4 - влияние антибиотического комплекса на длину корней пшеницы.

Пример 1. Выделение антибиотического комплекса из биомассы продуцента

Культивирование продуцента проводили в жидкой среде следующего состава: (г/л) крахмал - 15,0; глюкоза - 25,0; дрожжевой экстракт - 10,0; глицерин - 3,0; пептон - 2,0; натрия хлорид - 5,0; кальция карбонат - 2,0, pH 6,8-7,0. Ферментацию осуществляли в колбах вместимостью 250 мл на качалке со скоростью вращения 230 об/мин и при t +28°C. Объем питательной среды в колбе - 50 мл. Продолжительность ферментации - 120 часов. Объем посевного материала составлял 10%. Состав среды для получения посевного материала - (г/л): соевая мука - 15,0; глюкоза - 15,0; крахмал - 10,0; глицерин - 3 мл; NaCl - 5,0; СаСО₃ - 1,0; pH 6,5-7,2. Продолжительность выращивания посевного материала - 3 суток на качалке со скоростью вращения 230 об/мин и при t +28°C.

Из биомассы продуцента, отделенной от нативного раствора и промытой дистиллированной водой, антибиотический комплекс дважды экстрагировали этанолом в соотношении 1:3 и 1:2 соответственно в течение 2-х часов при встряхивании.

Объединенный, отфильтрованный экстракт упаривали в роторном испарителе ИР-1М3 (Россия) при температуре 40°C, прибавляли н-гексан из расчета 50 мл на 10 г концентрированного экстракта. При интенсивном перемешивании в н-гексан переходит не содержащая антибиотика фракция; нерастворимый в н-гексане антибиотик выпадает в осадок. После отстаивания надосадочную жидкость удаляли, из осадка под вакуумом при t - 40°C удаляли гексан и подвергали его повторной очистке по вышеприведенному способу, в результате чего получали сухой сырец I. Полученный сырец растворяли в 96% этаноле, охлаждали в холодильной камере до 4-5°C, при этом в осадок выпадали примеси, а антибиотический комплекс оставался в растворе. После фильтрования и выпаривания под вакуумом спирта из фильтрата и сушки получали конечный продукт - сухой сырец антибиотического комплекса. Продуктивность биомассы по сырцу антибиотического комплекса - 64 мг на грамм абсолютно сухой биомассы. Содержание гексаена в сырце - 6%.

Пример 2.

Сопоставление противомикробной активности полученного антибиотического комплекса (далее АБК) с известными антибиотиками проводили методом диффузии в агар [Поляк М.С. Определение чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам методом дисков. Спб.: Изд-во НИЦФ, 1997. 20 с.] на среде АГВ с использованием дисков производства НИЦФ (Санкт-Петербург), содержащих определенное количество высокоочищенных медицинских противогрибковых (амфотерицина, нистатина, клотримазола, кетоконазола, итраконазола, флуконазола) и противобактериальных (бензилпенициллина, оксациллина и неомицина) препаратов. Эти диски использовали в качестве контрольных вариантов, а в качестве опытных - диски, пропитанные раствором исследуемого заявляемого антибиотического комплекса с таким расчетом, чтобы количество антибиотического комплекса в диске (мкг) полностью соответствовало количественному содержанию антибиотиков контрольных дисков.

По противогрибковой активности в отношении условно-патогенных грибов рода Aspergillus и Penicillium, возбудителей биоповреждений АБК превосходит известные азольные антибиотики - кетоконазол, флуконазол, итраконазол, клотримазол, полиеновый антибиотик амфотерицин и не уступает по активности полиеновому антибиотику - нистатину.

По противобактериальной активности в отношении граммположительных бактерий рода Bacillus и Staphylococcus заявляемый антибиотический комплекс превосходит оксациклин, неомицин и обладает более широким спектром действия по сравнению с пенициллином.

Пример 3. Использование заявляемого антибиотического комплекса для защиты бумаги и ткани от грибов-деструкторов этих материалов (путем пропитки).

Определение грибостойкости материалов проводили в соответствии с ГОСТ 9.048-89 и ГОСТ 9.802-84. ГОСТ 9.048.-89 «Единая система защиты от коррозии и старения. Изделия технические. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов» и ГОСТ 9.802-84 «Единая система защиты от коррозии и старения. Ткани и изделия из натуральных, исскуственных, синтетических волокон и их смесей. Метод испытания на грибостойкость».

В качестве опытных использовали образцы сульфитной бумаги или хлопчатобумажной ткани, пропитанные водно-спиртовым раствором антибиотического комплекса в концентрации от 0,5 мг/мл до 20 мг/мл и высушенные в естественных условиях; в качестве контрольных - образцы, не содержащие антибиотического комплекса. Среду Чапека без источников углерода разливали в чашки Петри, после застывания на поверхности среды в каждой чашке размещали 5 образцов бумаги размером 20×20 мм или ткани: 5 опытных и 5 контрольных вариантов.

Каждый образец пропитывали водной суспензией спор тест-микроорганизмов. В качестве тест-культур использовали грибы-деструкторы, рекомендованные ГОСТ 9.802-84 и ГОСТ 9.048.-89 (Aspergillus. niger, А. terreus, Penicillium ochrochloron, P. funiculosum. Trichoderma viride, Scopulariopsis brevicaulis). Для испытаний использовали суспензию с концентрацией спор каждого вида гриба 1-2 млн/см³. Суспензию спор каждого вида гриба смешивали в равных объемах и использовали для заражения. Чашки выдерживали в термостате при 27-28°C в течение 30 суток и влажности не менее 90%, после чего образцы извлекали и осматривали при освещенности 2000-3000 лк невооруженным глазом, затем под микроскопом при увеличении 56-60.

В качестве фунгицидов сравнения были выбраны метацид (гуанидиновое основание) и нистатин (медицинский полиеновый антибиотик), применяемые на практике для защиты материалов от биоповреждений. Способ обработки бумаги и ткани этими фунгицидами был аналогичен способу обработки их антибиотическим комплексом. Концентрации пропитывающих водных растворов метацида и водно-спиртовых растворов нистатина составляли от 0,5 до 20 мг/мл.

Для получения препарата навеску сухого АБК в количестве 2 г растворяли в 10 мл 96% этанола и доводили объем до 100 мл водой.

В таблице 8 представлены минимальные концентрации антибиотического комплекса, обеспечивающие полную грибостойкость бумаги и ткани и сравнение их с концентрациями метацида и нистатина (время наблюдений - 30 суток).

Таким образом, антибиотический комплекс значительно отличается от фунгицидов сравнения повышенной эффективностью защитного действия от грибов. Полученные результаты показали, что минимальная концентрация антибиотического комплекса, обеспечивающая полную грибостойкость бумаги и ткани, в 4 раза ниже концентрации нистатина и в 20 раз ниже метацида.

Преимуществом антибиотического комплекса также является природность его происхождения, отсутствие резистентности грибов к нему (в результате длительного пассирования (в течение полугода) грибов-деструкторов на средах, содержащих антибиотический комплекс в возрастающих концентрациях, не образовались устойчивые к нему формы грибов) - есть неопубликованные данные.

Пример 4. Использование заявляемого антибиотического комплекса для защиты бумаги от грибов-деструкторов этих материалов (путем тампонирования).

Для обработки контаминированных микромицетами книг использовали водно-спиртовый раствор антибиотического комплекса в концентрации 1,0 мг/мл. Книги обрабатывали методом тампонирования биоповрежденных листов, а затем в соответствии с технологическими инструкциями высушивали и через 7 суток проводили микологический контроль. При проведении микологического контроля с биоповрежденных листов, обработанных антибиотическим комплексом, сухим стерильным тампоном были отобраны пробы с целью выявления жизнеспособной микобиоты. Посев грибов проводили штрихом на чашки Петри с плотной питательной средой Чапека с глюкозой. Инкубирование посевов проводили при 27°C в термостате в течение 7 сут. Результаты микологического контроля представлены в таблице 8.

По результатам исследований показано, что обработка биоповрежденных книг антибиотическим комплексом оказалась эффективной. В биопробах, взятых после обработки антибиотическим комплексом, количество выросших колоний грибов соответствует условно-принятым нормативным показателям (не более 5 колоний вдоль штриха).

Пример 5. Использование АБК совместно с хлоргексидином для защиты бумаги и ткани от грибов-деструкторов этих материалов.

Для повышения эффективности действия антибиотического комплекса применяли его в комплексе с веществами, повышающими чувствительность грибов к нему, в частности с хлоргексидин биглюконатом (ХГБ) в концентрации 0,5 мг/мл.

Первоначально бумагу и ткань пропитывали водным раствором хлоргексидина в концентрации 0,5 мг/мл, высушивали на воздухе и определяли грибостойкость бумаги вышеописанным способом. Пропитка бумаги и ткани только водным раствором ХГБ в концентрации 0,5 мг/мл не обеспечивала полную грибостойкость материалов. Затем образцы бумаги и ткани, пропитанные раствором ХГБ, пропитывали водно-спиртовыми растворами антибиотического комплекса в концентрациях от 0,1 до 0,5 мг/мл.

Параллельно готовили растворы комплексного препарата, содержащие в своем составе ХГБ в концентрации 0,5 мг/мл и антибиотический комплекс в концентрациях от 0,1 до 0,5 мг/мл. Полученными растворами пропитывали образцы бумаги и ткани, высушивали на воздухе и определяли грибостойкость материалов по вышеописанной процедуре.

Как показали результаты, в обоих вариантах использования коплексного препарата минимальная концентрация антибиотического комплекса, обеспечивающая полную грибостойкость бумаги и ткани, составляет 0,5 мг/мл, т.е. в комплексном препарате минимальная концентрация антибиотического комплекса, обеспечивающая полную грибостойкость материалов, сокращается в 2 раза.

Следует отметить, что образцы бумаги и ткани, пропитанные растворами антибиотического комплекса, а также растворами комплексного препарата, после хранения их в течение полугода сохраняют полную грибоустойчивость.

Пример 6. Использование антибиотического комплекса для защиты растений от фитопатогенных грибов.

Как показали ранее приведенные данные, АБК проявляет высокую антифунгальную активность в отношении ряда фитопатогенных грибов p.p. Fusarium, Alternaria. В связи с этим были проведены исследования по оценке воздействия АБК на всхожесть зерен пшеницы, зараженных Fusarium oxysporum).

Оценку эффективности антибиотического комплекса в отношении фитопатогенов растений (на примере Fusarium oxysporum) проводили с использованием семян пшеницы, искусственно зараженных Fusarium oxysporum. Заражение проводили суспензией конидий гриба (10⁶ конидий/мл) путем опрыскивания зерен пшеницы. Обработку антибиотическим комплексом зерен пшеницы проводили замачиванием их в растворах в концентрациях от 50 до 500 мкг/мл за 24 часа до заражения.

Следует отметить, что при искусственном заражении зерен фитопатогенным грибом Fusarium oxysporum всхожесть семян, обработанных антибиотическим комплексом в концентрациях 50-500 мкг/мл, увеличивается по сравнению с контрольным вариантом (не обработанным антибиотиком) на 20-35% в зависимости от концентрации АБК (фиг. 2).

Пример 7. Влияние антибиотического комплекса на жизнедеятельность растений, зараженных фитопатогенными грибами.

Семена пшеницы (2 г) замачивали в 3 мл раствора антибиотического комплекса с концентрацией 50, 100, 300, 500 мкг/мл в течение 2-х часов, затем подсушивали на воздухе и помещали на увлажненную землю в чашки Петри по 20 штук. Проращивали в термостате при 25°C. На 6-е сутки измеряли длину корешка и проростка. Контролем служили семена, замоченные в воде.

Диаграммы, построенные по экспериментальным данным, демонстрируют, что антибиотический комплекс в исследуемых концентрациях оказывает положительное влияние на рост проростков пшеницы. Иными словами, антибиотический комплекс оказывает ростстимулирующий эффект, причем с увеличением его концентрации от 50 мкг/мл до 500 мкг/мл длина проростков увеличивается на 20-60% (фиг. 3). Кроме того, антибиотический комплекс не влияет на длину корней, во всех опытных вариантах она находится на уровне контроля (фиг. 4).

Анализ вышеприведенных данных показал, что при использовании заявляемого изобретения удается получить новый биоцидный препарат, обладающий широким спектром действия и перспективный для использования в промышленности и сельском хозяйстве для защиты материалов и растений от микробиологического загрязнения.

Предложен штамм Streptomyces flavogriseus, способный продуцировать антибиотический комплекс, содержащий гексаеновый антибиотик подгруппы медиоцидина и неполиеновый антибиотик гетероциклической структуры. Штамм депонирован в ВКПМ под номером АС-1947. Продуцируемый штаммом антибиотический комплекс обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грибов-деструкторов промышленных материалов, фитопатогенных грибов, дрожжей, грамположительных бактерий и может быть использован в промышленности и сельском хозяйстве для защиты материалов и растений от микробиологического загрязнения. 4 ил., 8 табл., 7 пр.

Штамм Streptomyces flavogriseus, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номером АС-1947 - продуцент антибиотического комплекса, содержащего гексаеновый антибиотик подгруппы медиоцидина и неполиеновый антибиотик гетероциклической структуры.