КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ, НЕРВНОЙ И КОСТНОЙ ТКАНЕЙ Российский патент 2019 года по МПК A61K31/704 A61K31/513 A61P17/02 A61P19/00 A61P25/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается фармацевтической композиции, включающей в себя 1,3-диметил-5-карбоксиурацил и глицир-ризиновую кислоту при мольном соотношении компонентов 1,3-диметил-5-карбоксиурацил: глицирризиновая кислота равном 1:2, в качестве лекарственного сред-ства с выраженным стимулирующим действием на репаративную регенерацию эпители-альной, нервной и костной тканей. Изобретение может найти широкое использование в качестве лекарственного средства в медицинской и ветеринарной практике.

В клинической медицине отсутствуют общепризнанные лекарственные средства стимулирующие процессы постгравматической регенерации тканей, поэтому поиск эффективных соединений, обладающих таким свойством, является актуальной задачей.

Производные пиримидина как стимуляторы иммунобиологических свойств организма представляют интерес в первую очередь потому, что, обладая весьма низкой токсичностью, оказывают положительное поливалентное воздействие на организм. Они являются неспецифическими стимуляторами, которые оказывают влияние на различные системы, участвующие в регенерации [1].

В настоящее время в медицинской практике для репаративной регенерации используются метилурацил, оксиметацил, ксимедон. Метилурацил активирует пролиферацию различных клеток, отражающую его стимулирующее влияние на регенераторный процесс [2, 3].

5-Гидрокси-6-метилурацил, (оксиметацил, оксиметилурацил, иммурег) - является иммуномодулятором и обладает противовоспалительной активностью, повышает резистентность к инфекциям и эффективность антибактериальной терапии, улучшает репаративную регенерацию эпителиальной ткани [4, 5].

Метилурацил и оксиметацил оказывают поливалентное положительное воздействие на организм человека. Однако они являются слабыми стимуляторами репаративных процессов.

Эффективным препаратом пиримидинового ряда является ксимедон. Репаративная активность ксимедона при повреждениях желудка и двенадцатиперстной кишки превосходит аналогичное действие метилурацила. Отмечено стимулирующее влияние ксимедона на репаративную регенерацию миелиновых волокон периферического нерва [6].

Известно, что глицирризиновая кислота обладает противовирусным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием [7]. Самостоятельного терапевтического значения для процессов репаративной регенерации тканей не имеет.

Данных об использовании 1,3-диметил-5-карбоксиметилурацила в фармакологической и медицинской практике не выявлено.

Задача, на решение которой направлено заявленное техническое решение, заключается в создании эффективного лекарственного средства для репаративной регенерации эпителиальной, нервной и костной тканей, следовательно, расширении спектра используемых в клинике лекарственных средств.

Поставленная задача решается созданием фармацевтической композиции на основе 1,3-диметил-5-карбоксиурацила и глицирризиновой кислоты, обладающей стимулирующим действием на репаративную регенерацию эпителиальной, нервной и костной тканей.

Сущность предлагаемого технического решения заключается в составе фармацевтической композиции, включающей 1,3-диметил-5-карбоксиурацил и глицирризиновую кислоту при мольном соотношении компонентов: 1,3-диметил-5-карбоксиурацил: глициризиновая кислота равном 1:2 (далее заявляемая композиция).

Изучение влияния заявляемой композиции на репаративную регенерацию эпителиальной ткани (эпидермиса) проводили на белых крысах-самцах, массой 180-200 г, разделенных на 4 группы по 9 животных в каждой. Была использована модель ожоговой травмы кожи. Ожог моделировали нагретой до 800°С металлической пластиной диаметром 1 см. Продолжительность аппликации составляла 30 секунд, что приводило к ожогу 3 степени. Животным опытных групп исследуемые соединения наносили в виде 1% мази (доза 15 мг/кг). Для приготовления мази исследуемые соединения растворяли в ДМСО со спиртом (в отношении 1:1), в качестве основы использовали вазелин. Животным контрольной группы на раневую поверхность наносили вазелин с ДМСО и спиртом.

* - Р<0,05 при сравнении с контролем

Оценка размеров повреждения эпителиальной ткани показала (табл. 1), что под влиянием 1,3-диметил-5-карбоксиурацила площадь поврежденного эпидермиса достоверно не отличается от контрольных значений. Заявляемая композиция оказывает выраженный стимулирующий эффект на репаративную регенерацию кожи. Под влиянием заявляемой композиции по сравнению с контролем площадь повреждения уменьшается на 63,9%. Известно, что другие препараты из группы производных пиримидина также стимулируют репаративную регенерацию кожи. Под действием 10% мази с метилурацилом наблюдается ускорение (до 20%) заживления ран у крыс [8], оксиметацил на 40% уменьшает зону ожога при аналогичных условиях эксперимента [9]. При клинических испытаниях новой лекарственной формы, содержащей ксимедон показано, что скорость заживления ожогов возрастает на 40% [10]. Таким образом, стимулирующий эффект заявляемой композиции на репаративную регенерацию кожи значительно превосходит таковой для известных производных пиримидина.

Изучение влияния заявляемой композиции на репаративную регенерацию нервной ткани проводили на белых крысых-самцах массой 180-200 г, разделенных на 2 группы по 8 животных в каждой, выделяя участок седалищного нерва, на который накладывали кровоостанавливающий зажим типа «москит» на 30 секунд по стандартной методике [11]. На следующий день после операции животным опытной группы ежедневно в течение 15 суток внутрибрюшинно вводили раствор заявляемой композиции в апирогенной воде для инъекций, доза 30 мг/кг. Животным контрольной группы в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. У животных для оценки восстановления функций нерва определяли двигательную [12] и чувствительную активность конечности [13] и количество регенерирующих миелиновых волокон [14]. Исследования показали (табл. 2), что под влиянием заявляемой композиции восстановление двигательной функции нерва начинается на 2 суток раньше по сравнению с контролем.

Чувствительную функцию нерва на сроках 1, 4, 7, 10, 13 и 15 суток оценивали по стандартной методике [13]. Под влиянием заявляемой композиции животные с полностью восстановленной чувствительной функцией нерва появились на 3 суток раньше, чем в контроле (табл. 3).

Для определения количества регенерирующих миелиновых волокон использовали 3 группы животных по 8 в каждой. На 15 сутки эксперимента у всех животных выделяли фрагмент нерва на 5 мм дистальнее от места травмы. Фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, постфиксировали в 2% растворе осмия и заливали в эпонаралдит. На полутонких срезах подсчитывали количество регенерирующих миелиновых волокон. Результаты исследования приведены в таблице 4.

* - Р<0,05 при сравнении с контролем

Под влиянием заявляемой композиции количество регенерирующих миелиновых волокон увеличилось на 63,2% по сравнению с контролем. Известно, что препарат ксимедон в аналогичных условиях стимулирует восстановление двигательной и чувствительной функций седалищного нерва, при этом количество регенерирующих миелиновых волокон к 15-м суткам после передавливания нерва увеличивалось на 44,9% [14].

Таким образом, заявляемая композиция оказывает стимулирующий эффект на репаративную регенерацию нервной ткани.

Изучение влияния заявляемой композиции на репаративную регенерацию костной ткани проводили на кроликах массой 2,8-3,0 кг, разделенных на 2 группы по 10 животных в каждой. Под наркозом по переднемедиальной поверхности нижней трети бедра животным производили разрез кожи длиной 3 см. Стоматологическим бором, с головкой диаметром 2 мм, делали отверстие в выбранном участке до погружения верхней кромки бора в кость. Рану послойно ушивали. Накладывалась асептическая повязка. Начиная со следующего дня после операции и на протяжении 30 суток 10 кроликам (опытная группа) ежедневно внутримышечно вводили раствор заявляемой композиции в апирогенной воде для инъекций, доза 30 мг/кг. Кроликам контрольной группы в аналогичных условиях вводили физиологический раствор. На 10, 20 и 30 сутки животным выполняли рентгенологическое исследование области травмы. У всех животных в области дистальной трети бедра визуализировалось просветление, соответствующее выполненному дефекту кости. Анализ рентгенограмм не выявил значимых изменений рентгенологической плотности дефекта на различных сроках тестирования и между экспериментальными группами. Морфометрическая оценка заполнения дефекта зрелой костной тканью на 30 сутки после операции показала, что у всех животных хорошо визуализировалась круглая область дефекта, окруженная зрелой костной тканью. У животных контрольной группы по краям дефекта начала образовываться костная ткань, которая занимала 8,4% от площади дефекта. У животных опытной группы, получавших заявляемую композицию, балки вновь образованного матрикса образовывали сеть, охватывавшую весь дефект и занимавшую 21,3% от площади дефекта, что достоверно больше чем в контроле в 2,5 раза.

Следует отметить, что в настоящее время для стимуляции заживления костей используют соли кальция, витамин Д и гормон кальцитонин, которые увеличивают минерализацию костного матрикса и его прочность. Но эти препараты не влияют на образование костного матрикса и поэтому на ранних этапах остеогенеза бесполезны. Применяя заявляемую композицию впервые получены данные о возможности фармакологической стимуляции образования костного матрикса.

Таким образом, заявляемая композиция, включающая в себя 1,3-диметил-5-карбоксиурацил и глицирризиновую кислоту при мольном соотношении компонентов 1,3-диметил-5-карбоксиурацил : глицирризиновая кислота равном 1 : 2, оказывает выраженное стимулирующее действие на репаративную регенерацию эпителиальной, нервной и костной тканей.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Изучение влияния заявляемой композиции на репаративную регенерацию эпителиальной ткани.

Оценку влияния заявляемой композиции на репаративную регенерацию эпителиальной ткани проводили на 18 белых крысах-самцах, массой 180-200 г, разделенных на 4 группы по 9 животных в каждой. Была использована модель ожоговой травмы кожи. Ожог моделировали нагретой до 800°С металлической пластиной диаметром 1 см. Продолжительность аппликации составляла 30 секунд, что приводило к ожогу 3 степени. Животным опытных групп исследуемые соединения наносили в виде 1% мази (доза 15 мг/кг). Для приготовления мази исследуемые соединения растворяли в ДМСО со спиртом (в отношении 1:1), в качестве основы использовали вазелин. Животным контрольной группы на раневую поверхность наносили вазелин с ДМСО и спиртом. Лечение раневой поверхности животных заявляемой композицией проводили в течение 15 суток. На 15 сутки у животных под наркозом выделяли ожоговую поверхность с прилегающей здоровой кожей, которую фиксировали в формалине и заключали в парафин по стандартной методике. На тотальных срезах через центральную часть ожога, окрашенных гематоксилин-эозином, оценивали степень эпителизации и размеры повреждения при помощи программы ImageJ. Полученные данные приведены в таблице 1. Заявляемая композиция оказывала стимулирующий эффект на регенерацию кожи. Под действием заявляемой композиции площадь повреждения уменьшилась на 63,9%, что лучше, чем при использовании метилурацила, оксиметацила и ксимедона [8-10].

Таким образом, заявляемая композиция оказывает стимулирующий эффект на репаративную регенерацию эпителиальной ткани.

Пример 2. Изучение влияния заявляемой композиции на репаративную регенерацию нервной ткани.

Эксперименты по изучению влияния заявляемой композиции на репаративную регенерацию нервной ткани проводили на 16 белых крысах-самцах, массой 180-200 г, разделенных на 2 группы по 8 животных в каждой. У всех животных под наркозом на левой конечности, на уровне середины бедра, выделяли участок седалищного нерва, на который накладывали кровоостанавливающий зажим типа «москит» на 30 секунд по стандартной методике [11], что приводило к формированию передавленной области нерва протяженностью 2 мм. На следующий день после операции животным опытной группы внутрибрюшинно ежедневно в течение 15 суток вводили раствор заявляемой композиции в апирогенной воде для инъекций, доза 30 мг/кг. Животным контрольной группы в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. У всех животных для оценки восстановления функций нерва определяли двигательную, чувствительную активность конечности и количество регенерирующих миелиновых молекул. Для оценки восстановления двигательной функции на сроках 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15 суток проводили вестибулярную реакцию [12]: при резком опускании животного на здоровой конечности разводятся все пальцы стопы, а после повреждения пальцы конечностей сомкнуты. По мере восстановления двигательной функции нерва вначале начинает отводиться мизинец (1 балл), далее безымянный (2 балла), средний (3 балла), указательный (4 балла). 5 баллов выставлялось, когда реакция поврежденной конечности не отличалась от здоровой (табл. 2). Анализ полученных данных показал (табл. 2), что под влиянием заявляемой композиции на 2 суток раньше начиналось восстановление двигательной функции нерва по сравнению с контролем.

Чувствительную функцию седалищного нерва на сроках 1, 4, 7, 10, 13 и 15 суток оценивали по стандартной методике [13]. Проводили пощипывание пинцетом: пятка (первая точка); середина подошвы (2 точка); от основания мизинца до основания большого пальца (3, 4, 5, 6, 7 точки); кончики пальцев от мизинца до большого (8, 9, 10, 11, 12 точки). Начинали тестировать с последней точки (12 точка - кончик большого пальца) закачивали первой (пятка). Позитивной реакцией считалось отдергивание лапки на щипок пинцетом. Под влиянием заявляемой композиции на 3 суток раньше, чем в контроле, появились животные с полностью восстановленной чувствительной функцией нерва (табл. 3).

Для определения количества регенерирующих миелиновых волокон использовали 3 группы животных по 8 в каждой. На 15 сутки эксперимента у всех животных выделяли фрагмент нерва на 5 мм дистальнее от места травмы. Фиксировали в 2,5% растворе глута-ральдегида, постфиксировали в 2% растворе осмия и заливали в эпонаралдит. На полутонких срезах подсчитывали количество регенерирующих миелиновых волокон. Количество регенерирующих миелиновых волокон под влиянием заявляемой композиции по сравнению с контролем возросло на 63,2% (табл. 4). Известный препарат ксимедон стимулирует восстановление двигательной и чувствительной функций нерва, при этом количество регенерирующих миелиновых волокон к 15-м суткам после передавливания нерва увеличивалось на 44,9% [14].

Таким образом, заявляемая композиция оказывает стимулирующий эффект на репаративную регенерацию нервной ткани.

Пример 3. Влияние заявляемой композиции на регенерацию костной ткани.

Экспериментальное исследование проводили на 20 кроликах, массой 2,8-3,0 кг, разделенных на 2 группы по 10 животных в каждой. Под наркозом, после обработки операционного поля 70% спиртовым раствором, по переднемедиальной поверхности нижней трети бедра животным производили разрез кожи длиной 3 см. Мышцы и сухожилия отводили тупым способом и фиксировали. Стоматологическим бором, с головкой диаметром 2 мм, делали отверстие в выбранном участке до погружения верхней кромки бора в кость. Рану послойно ушивали. Кожные швы обрабатывали 5% спиртовым раствором йода. Накладывалась асептическая повязка. В послеоперационном периоде осуществляли динамическое наблюдение за состоянием животных (аппетит, двигательная активность, состояние оперированных конечностей). Начиная со следующего дня после операции и на протяжении 30 суток 10 кроликам (опытная группа) ежедневно внутримышечно вводили раствор заявляемой композиции в апирогенной воде для инъекций, доза 30 мг/кг. Кроликам контрольной группы в аналогичных условиях вводили физиологический раствор. На 10, 20 и 30 сутки животным выполняли рентгенологическое исследование области травмы. У всех животных в области дистальной трети бедра визуализировалось просветление, соответствующее выполненному дефекту кости. Анализ рентгенограмм не выявил значимых изменений рентгенологической плотности дефекта на различных сроках тестирования и между экспериментальными группами.

Для морфометрической оценки заполнения дефекта зрелой костной тканью на 30 сутки после операции у всех животных, после передозировки наркоза, выделяли фрагмент кости с дефектом и фиксировали в 10% формалине. После декальцинации материал заливали в парафин по стандартной методике. Продольные срезы кости с областью дефекта окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. Срезы фотографировали и обрабатывали при помощи программы ImageJ. У всех животных хорошо визуализировалась круглая область дефекта, окруженная зрелой костной тканью. У животных контрольной группы по краям дефекта начала образовываться костная ткань, которая занимала 8,4% от площади дефекта. У животных опытной группы, получавших заявляемую композицию, балки вновь образованного матрикса образовывали сеть, охватывавшую весь дефект и занимающую 21,3% от площади дефекта, что достоверно больше чем в контроле в 2,5 раза.

Следует отметить, что нами впервые получены данные о возможности фармакологической стимуляции образования костного матрикса.

Таким образом, заявляемая композиция, включающая в себя 1,3-диметил-5-карбоксиурацил и глицирризиновую кислоту при мольном соотношении компонентов 1,3-диметил-5-карбоксиурацил: глицирризиновая кислота равном 1: 2, обладает выраженным стимулирующим действием на репаративную регенерацию эпителиальной, нервной и костной тканей.

Литература.

1. Билич Г.Л., Назарова Л.В. Морфо-функциональные аспекты проблемы регуляции регенерации. //Вестник НовГУ. - 1998. - №7.

2. Белоусова Т.А. Фармакологические свойства метилурацила. Обзор литературы, сб. Ретиноиды, М.: ЗАО «Ретиноиды» 2009 - вып. 28. - с. 11-43. ISBN - 978-5-93118-039-7.

3. Ноздрин В.И., Гузев К.С., Яцковский А.Н., Архапчев Ю.П., Поляченко Л.Н., Альбанова В.И., Архапчева Л.Д., Володин П.В. Патент 2135180 (РФ) от 27 августа 1999 г.

4. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., Плечев В.В. Оксиметилурацил (иммурег) - стимулятор иммунитета. // Медицинский вестник Башкортостана. - 2007. - Т.2. - №6. - С. 70-75.

5. Plecheva D. V., Alekhin Е. К. Oxymethyluracil stimulates reparative regeneration of skin in rats. // Eksp. Klin. Farmakol. - 2004. - Vol. 67. - №5. - P. 63-66.

6. Измайлова A.X., Шакирова Д.Х., Измайлов А.Г. Препараты пиримидинового ряда в экспериментальных и клинических исследованиях. // Вестник современной клинической медицины. 2013. - Т.6. - прил. 2. - С. 31-34.

7. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Гранкина В.П. и др. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. - Новосибирск: Гео, 2006. - 311 с.

8. Пономарева-Астраханцева Л.З. Фармакология раневого процесса. Фармакология патологических процессов: М. - Л. - 1951. - С. 171-226.

9. Плечева Д.В. Стимуляция репаративной регенерации кожи оксиметилурацилом. Автореферат. Уфа. 2004.

10. Соколов Р.А. и др. Опыт применения ксимедон содержащей композиции при лечении ожоговых ран у детей Сборник тезисов Вопросы регенеративной медицины в комбустиологии. 2013. - №49-50.

11. De Koning Р, Brakkee J.H, Gispen W.H. Methods for producing a reproducible crush in the sciatic and tibial nerve of the rat and rapid and precise testing of return of sensory function. Beneficial effects of melanocortins. // J Neurol Sci. - 1986. - V.74. - P. 237-246.

12. Berenberg K., Forman D., Wood D. et al. Recovery of peripheral nerve function alter axotomy: effect triodothyronine // Exp. Neurol. - 1977. - V. 57. - №2. - P. 349-363.

13. Bajrovic F., Srpcic M., Sketelj J. Schwann cell dependence of regenerating rat sensory neurons is inversely related to the quality of axon growth substratum // J. Neuropathol. Exp.Neurol. - 2001. - V.60. - №1. - P. 65-74.

14. Рагинов И.С., Вафин А.Ю., Хафизьянова Р.Х., Челышев Ю.А. Влияние лекарственных препаратов ксимедон и ноотропил на регенерацию периферического нерва // Российские морфологические ведомости. 1997. - №1(6). - С. 120-126.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии. Предложена фармацевтическая композиция, включающая 1,3-диметил-5-карбоксиурацил и глицирризиновую кислоту при мольном соотношении компонентов 1,3-диметил-5-карбоксиурацил:глицирризиновая кислота, равном 1:2, с выраженным стимулирующим действием на репаративную регенерацию эпителиальной, нервной и костной тканей. Технический результат: создание лекарственного средства для репаративной регенерации эпителиальной, нервной и костной тканей, при этом площадь повреждения эпителиальной ткани снижалась на 63,9% в отличие от самостоятельного применения 1,3-диметил-5-карбоксиурацила или глицирризиновой кислоты (они не показали достоверных улучшений против контроля - необработанной ожоговой травмы); расширение спектра используемых в клинике лекарственных средств. 4 табл., 3 пр.

Композиция для стимуляции репаративной регенерации эпителиальной, нервной и костной тканей, включающая в себя 1,3-диметил-5-карбоксиурацил и глицирризиновую кислоту при мольном соотношении компонентов 1,3-диметил-5-карбоксиурацил:глициризиновая кислота, равном 1:2.